Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли перекиси водорода в функциональном ответе макрофагов

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли перекиси водорода в функциональном ответе макрофагов"

РГ6 од - 3 опт 1936

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА В ФУНКЦИОНАЛЬНОМ ОТВЕТЕ МАКРОФАГОВ

• 03.00.25-. клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

КЛЮБИН Игорь Владимирович

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа вьшолнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

Защита состоится "

кандидат биологических наук

И.А.Гамалей,

Институт цитологии РАН,

Санкт-Петербург.

доктор биологических наук, профессор

В.И.Воробьев.

Институт цитологии РАН,

Санкт-Петербург,

доктор биологических наук О.ЕЛебедев.

Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург.

Санкт-Петербургский государственный технический университет.

> года в_ч.

на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института

цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Реферат разослан "// " е.еА^/п&гОЬЗ- ! 996 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

д.б.к.

Л.И.Писарева

нахальность проблемы

Перекись водорода (Н2О2) относится к ряду веществ, которые называются обирательным термином активные метаболиты кислорода (АМК) и являются ильными окислителями клеточных компонентов. АМК образуются в различных имических реакциях (как в живых, так и в неживых системах) при дноэлектронном восстановлении молекулярного кислорода.

Профессиональные фагоциты животных и человека после «ответствующей стимуляции генерируют АМК и окружающую среду за счет хтавацин локализованной в плазматической мембране НАДФН оксвдазы; этот [роцесс получил название окислительного взрыва. НАДФН оксидаза является гсновным биологическим источником H2Ö2, а ее активация обеспечивает геспецифическую защиту организма от инфекционного поражения (Baggiolini, .984, Langermanse et а!., 1994), поскольку АМК в больших концентрациях убительны для клеток. Литература, посвященная цитотоксичеркоку действию ШК, весьма обширна; исследования сфокусированы на анализе повреждения >азличных функциональных систем и структур клетки под влиянием высоких концентраций АМК, а также биохимическим1 системам защиты клеток от зазрушения (см., например, обзор: Fridovich, 1976).

Существенно меньше литературных данных о действии на клетки малых неповрежда ющнх) концентраций АМК, с^стоянно присутствующих и )ргаиизме. Однако уже известно, что Н2О2 активирует К*-каналы тлазматической мембраны (Kuo et al., 1993, Krippeit Drews et al., 1994, 1995), ускоряет выход органических анионов из макрофагов (Гамалей и др., 1991), участвует в биосинтезе тироидных гормонов (Dupuy et al., 1991, Derne et al., 1994), стимулирует звдоцитоз эадотелиальных клеток (Sundqvist, Liv _ 1993, Liu, Sundqvist, 1995).

Резко возросший в последние годы интерес к проблеме влияния на клетки малых доз Н2О2 связан еще и с тем, что клетка имеет довольно емкий восстановительный буфер, защищающий ее от действия окислителя. Выяснение путей и механизмов действия к алых редокс молекул необходимо для понимания роли окислительно-восстановительных сил, участвующих в нормальном функционировании клетки. Проблема приобретает еще большую остроту в связи s открытием во многих типах нефагоцитирующих клеток (эндотелиальные клетки, тромбоциты, фибробласты и др.) ферментативной снстс мы, генерирующей АМК и сходной с НАДФН оксидазой фагоцитов (Jones et al., 1993). В этой связи новые данные о возможной активирующей и регуляторной

роли палых концентраций перекиси водорода несомненно представляю' научный интерес.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы - показать, что Н2О2 в малых • (неповреждаю щих количествах способна активировать макрофага. Были поставлены следующш экспериментальные задачи.

1. Более детально изучить свойства НАДФН оксидазы макрофагов ! различных физиологических условиях: при действии ингибиторов гликолиза I ганглиозида вШ, меняющего текучесть плазматической мембраны.

2. Изучить влияние малых доз Н2О2 на следующие функции фагоцитов: хемотаксис, фагоцитоз и окислительный взрыв.

3. В модельных экспериментах изучить диффузию перекиси водорода е условиях, приближенных к биологическим.

4. Попытаться обнаружить непосредственное действие неповреждаю ших доз Н2О2 на внутриклеточную ионную сигнализацию макрофагов (мембранный потенциал и концентрацию свободного Са2* ([Са2+];)).

5. Исследовать кинетику и ионный базис изменений мембранного потенциала и [Саг+]4 при активации клеток перекисью водорода.

Научная новизна полученных результатов

Впервые бьи показан модулирующий эффект Н2О2 на фагоцитоз макрофагами частиц опсонизированаого латекса, активирующее действие очень низких концентраций гакглиозида вМ1 на процесс генерирования Н2О2 макрофагами, а также продемонстрирована способность Н2О2 вызывать хемотахеие мышиных перитонеальных нейтрофилов. Показано дозозависимое усиление перекисью водорода активности НАДФН оксидазы макрофагов. Активация клеток перекисью водорода в настоящей работе всеща сопровождалась изменением мембранного потенциала и кратковременным дозозависимым увеличением [Са2т]1. Полученные данные позволили сделать косвенный вывод о том, что во многих случаях Н2О2 может участвовать как во внутриклеточной, так и в межклеточной передаче сигнала.

Практическая ценность работы

Поскольку Н2О2 является окислителем по отношению ко многим клеточным компонентам, то полученные в работе данные важны для выяснения:

механизмов подцержания баланса окислительно-восстановительных сил, обходимого для нормального функционирования клетки, 2) причин изменении >го баланса в развитии патологических процессов в организме и 3) понимания 1можных побочных эффектов применен™ антиоксидантов при лечении (личных заболеваний. Получено еще одно подтверждение верности концепции зецепторного, в обычном понимании, действия редокс биомолекул, которая (яется новым взглядом на метаболические пути, регулирующие различные >роны функционирования клетки.

робация работы

По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Материалы диссертации докладывались на симпозиуме стран СНГ "Пути зедачи внеклеточного сигнала" (Звенигород, Россия, 1993), Европейском ягрессе по клеточной биологии (Прага, Чехословакия, 1994), конференции по ¡точной биологии (Санкт-Пегербург, Россия, 1994), летней конференции 5ЕВ "Антиокснданты в клеточной биологии" (Сакстон Ривер, США, 1995), :ждународном конгрессе "Свободные радикалы: здоровье и заболевания" гамбул, Турция, 1995), конференции молодых физиологов н биохимиков 1СШ1 "Биохимические и биофизические механизмы физиологических нкций" (Санкт-Петербург, Россия, 1995) н на научных семинарах моратории физиологии клетки и Лаборатории ионных каналов клеточных чбран Института щгголопш РАН.

ъем и структура диссертации

Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и годов, Результатов экспериментов, Обсуждения результатов, Заключения, водов и Списка цитируемой литературы (394? публикаций). Работа изложена ['^Гстрашшах машинописного текста и нллюстр«5?ована 12-ю рисунками и 2-мя лицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

лучение мышиных перитонеальных макрофагов и иентрофцлои

Резидентные перитонеальные макрофаги мышей линии СС57Л\' эучали стандартным промыванием брюшной полости. Клетки культивировали

2 суток при 37°С г монослое на покровных стеклах в пенивдллино! флаконах (10б клеток на 2 ял среды). Индуцированные перитонеалы макрофаги получали аналогичным образом, но через 48 ч по иктрапернтонеального введения мышам раствора пептона (1 мл/1 мышь). Кле' культивировали 2 ч при 37°С в специальных измерительных кюветах (0,5x1 1,5x10е клеток в 1-ой кювете) для последующего измера хемилюминесценции (ХЛ). Перитонеальные нешрофилы мышей получали че 7-10 ч после интраперитснеальной инъекции стерильного 5%-ного раств казеината натрия.

После всех опытов жизнеспособность клеток проверяли путем окра их трипановым синим. Индуцированные клетки использовались только в опы по измерению XJI (макрофаги) и хемотаксиса (нейтрофилы).

Цитофлуориметрические измерения одиночных клеток

Флуориметрнческая установка состояла из люминесцентн микроскопа, снабженного ртутной лампой постоянного тока ДРШ-25( необходимыми светофильтрами и фотометрической насадкой ФМЭЛ-1А самопишущим прибором.

Фотометрическая камера представляла собой плоский капищ верхней плоскостью которого являлось покровное стекло с клетка обращенными вниз. Использовали объектив Н1 100х (Карл Цейсс, Üei Необходимую температуру (37°С) поддерживали нагревательио-охлаждакш столиком (Карл Цейсс, Йена). Подробности цитофлуориметрических измере! на одиночны^ клетках описаны в работе Гамалей и др. (1989).

Мембранньп"! потенциал одиночных макрофагов измеряли с помои анионного флуоресцентного зонда бис (1,3-дибутирилбарбиту{ триметиноксанола (diBAC4(3)) (Molecular Probes, США). Флуоресцени возбуждали при 540 им, изменение интенсивности флуоресценции наблюдал области 580 нм. Зонд использовался в концентрации 200-450 иМ. • окрашивание (15 мин), и опыт производили при 37°С, Для связывания [Сэ применяли флуоресцентный зовд Квин-2АМ (Molecular Probes, США) концентрации 50-100 мкМ.

помощью флуоресцентного зонда fura-2 АМ (Molecular Probes, США). Кле окрашивались 30-45 мин при 37°С в среде с 5 мкМ зонда. Бескалщиевую ср получали добавлением к раствор)', не содержащему СаСЬ, 0,1 мМ EG' Флуоресценцию fura-2 поочередно возбуждали светом с длинами волн 340 и

с помощью ксеноновой лампы ДКСШ-150, а регистрировали при 520 мм. 1 определения [Са"+], использовали отношение флуоресценции при длинах 1Н Р^о/Рзяо (Сггупйеиигг е£ а1.. 1985). Эксперименты проводились при •щатной температуре.

эедслштн по изменению флуоресценции НгСК-чуво: вителыюго зонда Т,Т-шорофлуоресщш диацетата (НзОСР-ОА) (Са^сап е1 а!., 1984). Зонд мяьзовался в концентрации 4 мхМ. Флуоресценцию возбуждали светом 490 нм, истрировали - при 520 нм.

милюмимесцентные измерения

ХЛ регистрировали с помощью люминометра, работающего в режиме гта импульсов. ХЛ измерялась в растворе Хенкса с добавлением 50 мкМ минола и 0,2%-го бычьего сывороточного альбумина.

феаеление фагоцитарной активности макрофагов

Для определения фагоцитарной активности макрофагов использовали сошпированныс частицы латекса (диаметром 1,23 мкм) при соотношении стица/клетка, равном 5000/1. После 20-минутного фагоцитирования при 37"С етки фиксировались 96%-ным этанолом 1511!..шн и окрашивались 10%-нмм створом Гимза 10 мин. Фагоцитарный ивдек? (Р1) рассчитывался как ношение (Ах1)/100, где А - количество частиц латекса в клетке, 1 -личество клеток, содержащих частицы латекса из 100 клеток на одном «ровном стекле.

ценка хемотактической активности макрофагов

Хемотаксис мышиных перитонеальных нейтрефыов измерялся с шощью метода миграций клеток под агарозой (№1?оп е( а* 1975). В ¡ециально приготовленном и охлажденном агарозном геле (в 40 мм чашках етри) нарезали 4 серии из Ъ лунок (диаметром 2 мм и на расстоянии 2 мм ;жду собой) я каждой чашхе. В среднюю лунку каждой серии добавляли 5 мкл 'спензин клеток (5хЮ7 клеток/мл). В одну из крайних лунок добавляли стнруемое вещество, а в другую - контрольную среду. Для выяснения влияния .георотки на хемотаксис нейтрофилов онз была заменена на 1% бычьего .шороточного альбумина в агарозной среде.

Заполненные чашки инкубировались 3 ч при 37°С, затем клетки нкснровались 96%-ным этанолом 30 мин и 47%-ным формалином 12 ч, после

чего гель вынимали и зкрашивали клетки 10%-ным раствором Гимз1» 10 ми Для определения хемотактического индекса (А/Б) измеряли расстояни покрыгое,' клетками в направлении хемотактического агента (А) и в направлен! контрольной среды (Б).

Измерение градиента перекиси водорода в агарозном геле

Коэффициент диффизии Н2О2 в агарозном геле проводили в отсутстви клеток. В одну из лунок добавляли 5 мМ раствор Н2О2, а в другую - раство Хенкса. Концентрацию Н202 в обеих лунках измеряли спектрофотометрически мет'-цом, основанном на катализируемом пероксидаз^й хрена окислени фенолового красного в присутствии Н2О2 (Pick, Keisari, 1980). Концентрате Н2С>2 определяли по изменению поглощения фенолового красного при 610 нм помощью спектрофотометра Specord UV VIS (Карл Цейсс, Йена). Кажду] пробу калибровали по растворувс известной концентрацией Н2О2.

Исходя из предположения, что Н2О2 не взаимодействует с arap030t коэффициент диффузии Н2О2 определялся с помощью уравнения, полученног из второго закона Фика (Handbook of Chemistry and Physics, 1990-1991):

KL = (4 Dtf't)1'2 ехр[тш].

где c0 - начальная концентрация, с - концентрация вещества на расстоянии х момент времени t, D - коэффициент диффузии.

Результаты исследования Характеристики окислитель ного взрыва макрофагов

Зависимость величины и продолжительности окислительного взрыва о' действующего агониста

Окислительным взрывом макрофаги отвечают на действие различны: веществ, природа которых определяет величину и длите :ьность этоп функционального ответа. Рис. 1, а показывает, что хемотактический пептт fMLP вызывает быстрое, 2.0-2.5-мш1утное увеличение люминолзависимой XJI Подобный по кинетике, но несколько меньший по величине, ХЛ отве: макрофагов наблюдается при действии фактора активации тромбоцитов PAF Зимозан вызывает увеличение интенсивности XJ1 через 1.0-1.5 мин посл< стимуляции макрофагов; максимум этого процесса достигается через 9-15 мин i

i •(!»!:!;<(.-: •.r.n.'c'iiju"! 'í/, i :"<;;., ш Hn.eíi.c;..' i. . pe;i4t"" ó ii: '

t-;;,¡t. ■Ti:í,'yÍ■ — i-c...;;зíír. : '^¡'Cj ;

ipfioawiru'twyr'nrraro*' PMA "! -t рам > i 'Y.'iMÍ! K':4T M,u UlMaiI.il) ч: i'CHCiirüOCT:, ;СЛ smr ;>í!¡ct;;íü. i'AÍI.<- дсч:;c" >, -v-'г 'S-¡'.: m:ü;.

¿фкмешаша ¿¡¡угриклло-тош НгОг-зависимого флуооесиентного чоипа

i'.ivüi:;'- гклт/м'.т- bt¡''HTi-iíUiiüu с- !I.:;:i"'!í.T:4':7: Hü;¡y¡i):; ¡: i-, o:¡¡ м cíi.U'í.h' 1

■,■-■_<■., ivum к'.ытаи:» ííAii'\>!í a.cn:<;:-,¡.\ ¡>oj¡vk':!(u,:t' p;v;,.,r\¡i: veiim-.-.H (рпо. ! új. Сравнение кривых рис. 1, а показывает, что наибольший по величине и

(WOrrTinv-niun/-™ íiuÍ3bíoaK't См Ч*и1ИНИМИ

пупы** qraro'HT^fjwírít т.г^сфаг^.::;, a кротсиикиназы С ¡-мл.

этом и проявляется неспецифическая иммунная защита организма, ¡разование существенно меньших количеств Н2О2 'л в среде, и внутри клетки при гствии таких активаторов, как.ГМЬР и PAF, требует уже другого объяснения.

i

Процесс генерирования НаСЬ макрофагами зависит не только от природы «ствугощего агента, но и дожет модулироваться в различных физиологических ювиях. Мы продемонстрировали это на примерах влияния ингибиторов жолчза и ггипкгозтягп GMl, mchswiskiv гекл-чесп. мембран» i, на ак импост;

ЩФН сксидазы макрофагом K?. Gv;u.-r показы.« ниже, проиехцряшие im-! tCTßitii огнл вещесги нзмсиешм сошна ib«- иаргботаниои INO» к отпет на ierrate ахпнмторов меялт иртишнгь к суняччлчтмч irotei гениям qryinamoiiíUMioi с. ¡erti макрофагов.

няние шнибпторо» гликолиза нп пгдввиесть КАДФК оксииаз:.»

Влияние 10 mív; ксутилизируомо! о аналои» ijüokoíi.s ?>nr«wrci' • и-глки.ош Э Г) на кинетику изменения люмннотшшеимой XJ1 при стимуляции цуцированяых макрофагов fMLP показано на рис. 2. 30-минутная инкубация крофагов в среде 199 увеличкяает мленмул» лготпяголзяппсимоП МЛ ип шулягош fívlLP на 10% (рис 2, б\. Однако уровень ХЛ макрои«« о--стимулированных fMLÍ'¡ уменьшав res ua Ш1, если клетки инкубировались в' :де 199 с добавлением ДОГ. На рис 2, г показано, что 30-минутная инкубация цущфованных макрофагов в растворе Хенкса с добавлением ДОГ шггибирует s максимум ХЛ при стимуляции клеток fMT Р (и» 55й?-), таг тт увоаси: минопзаписимой Xji щ-.стимулироьашцлл мдкрофдяж (па Л01;< ■

Другой неутшшзнруемый аналог глкп:очк, „'-0-метил;;иокоза (ОМГ/, шипе, чем ДОГ- Ю-минутпа?. инк>бамия макрофагов я среде 199 .: Завлениен 10 мМ ОМГ ¡тт^ироьп :i ляминт.-аниснм)«" У,"

55001

с 2

-5- 4500-

к

| 3500-§

g 2500-

2 Q к s 2 a> X

к с;

a £ S b o

t

ts §

X §

и <D ■q

С в

1500" 500500" 4003002001000

a

2 мин

1 î ! PMA fMLP PAF

T

X

контроль fMLP

PAF

Рис. 1. Окислительный взрыв индуцированных мышиных перитонеальш макрофагов стимулированных различными активаторами: 03 опсонизированиый зимозан (200 мкг/мл); РМА - форболмириствтацетатом (I1 нМ); fMLP - хемотактический пептид (1 мкМ); PAF - фактор актива« тромбоцитов (25 мкг/мл).

а: люминолзависимая XJI 0.5х106 прикрепленных к стеклу клеток; по о ординат - интенсивность, имп/с; по оси абсцисс - время, мин. В кажд> варианте приведен репрезентативный результат из не менее чем 5 независим! экспериментов.

б: Изменение интенсивности флуоресценции одиночных клеток в среде HiDCF-DA при действии РАР или fMLP. Препараты 10 мин находились в сре с 4 мкМ HiDCF-DA после чего добавлялся исследуемый агент.

естнмулированных клеток, и максимум ХЛ при стимуляции макрофагов ГМ1.Р зезультаты не показаны).

Данные таблицы демонстрируют влияние различных условий инкубации ндуцированных макрофагов на их ХЛ. Видно, что наибольшее значен.1С и ровня ХЛ нестимулированных макрофагов, и максимум ХЛ при стимуляи: ч ЧЬР достигается при инкубации клеток в среде 199. Люминолзависнмая ХЛ естнмулированных макрофагов уменьшалась на 55% после 30-минутной шсубащщ клеток в растворе Хенкса и на 70% - после такой же по родояжительности инкубации в растворе Кребса (солевой раствор без тгокозьг). Инкубация индуцированных макрофагов в растворах Хенкса и Кребса меньшала максимум ХЛ при стимуляции клеток 1МЬР на 20 и 30%, оответственно, по сравнению со значением этой величины, полученной при нкубации макрофагов в среде 199.

1 Таблица Влияние условий инкубации индуцированных макрофагов на их

люминолзависимую ХЛ

Условия инкубации8 Концентрация глюкозы, мМ ХемилюминесценцияЮ? имп/сб~

нестиму/тро- . ванные макрофаги" макрофаги, стимулированные 0.5 мкМ ШЬР"

"реда 199 5.6 2.28±0.Р 5.23±0.27

'аствоя Хеккса 5.6 0.96±0.06 4.24М.20

'аствор Кребса 0 0.71 ±0.04 3.60Ю.19

1.5x10е клеток 30 мин инкубировались в указанных средах. А: ±5'-.

Приведено значение максимума ХЛ.

В данной работе нас интересовал гликолитический путь, потому что 1яутрюслен>чные запасы од-ого из субстратов НАДФН оксидны НАДФН юполняются за счет ответвления гликолиза - гексозо-монофосфатного шунта ГМФШ). Полученные в настоящей работа данные говорят о том, что для максимальной активации НАДФН оксид азы при всех остальных равных условиях необходимо наличие в цитоплазме максимально возможной юнцентрации гаюкозо-6-фосфата, которья? может бьггь использован при истивации ГМФШ.

L 4

тщ

в

Й

1Щ

г!»

га

n'J

1мин

Рис. 2. Кинетика изменения люмшюлзависимой ХЛ индуцированных макрофагов

при их активации fMLP в различных средах. По горизонтали - время в мин, по вертикали - интенсивность XJI (0.5х103 имп/с). Стрелками указаны моменты добавления fMLP (0.5 мкМ). 1 - уровень шума прибора, 2 - уровень люминолзависимой ХЛ макрофагов, не стимулированных fMLP. 1.5х!06 клеток 30 мин ннкубиропатн в среде 199 (а), в среде 199 с добавлением 10 . ¡М ДОГ (5;, в растворе Хенкса (в), в растворе Хенкса с добавлением ¡0 мМ ДОГ (г), затем измеряли люмннолзависимую ХЛ. В каждом варианте привело?« репрезентативный результат 1 из не менее чем 7 независимых экспериментов.

ютия!н»* ¡¿»глнозидэ ПМ1 на окислительный взрыв

Л.пи-.вояи «Mi (И)" ' - 10*) не вызывает ХЛ ответа, однако оказывает выраженный стичулирующтй эффект (340% от контроля) на •«»рокгиную PMA (30"' Ч) активацию НАДФН okci,'.азы мышиных .а-очччмшаяьиых макрофагов, Максимальный эффект ганглиозияа GMt ня ХЛ ответ т.гзтсрпфагоп наблюдался при его концентрации 10'l2-M'l! М, при более <-7siL4 (Ю- N5; и более ншкнч ПО" ,\i) концентрациях GMi его зффект ■Jlûî .„.wKc достоверным, но менее выраженным (50-150% от контроля), а при концентрациях 10"15 - lft'14 M npsrrjrrccai in. шаазшея.

Crp-.Auie.iijiiO umwi"»'" сф-тцгслпг.иды - ганглиозиды являются подходящим инструментом для изучения влияния поверхностного заряда мембраны на активацию НАДФН оксидазы, так как они способны встраиваться в лишщный бислой и увеличивать отрицательный заряд мембраны.

В настоящей работе показано, что ганглиозид GM1 в наномолярвых концентрациях оказывает модулирующий эффект на образование AM К макрофагами при действии активатора протеинкиназы С РМА. Мы предполагаем, что увеличение отрицательного заряда мембраны потенциирует связывание цптсплаз.матических фгхтегоп оксидазы с мембраной при аг.тнмшш фгрмен-<а. Обнаруженную бнмодалыюсть действие пшглиозпда можно пя&тюдап. и яри дечетши многих жирных кислот: высокие концентрации .!!!гибир\!ОТ НАДФН окендлзу, я шпкие - актшшпугог ее (Kadn Ilassani et а!., 1995).

"зкякпле мо^иранногэ потенциала и [Ca',+]i во врглм окислительного »зрьпм

Процесс .чктивашш НАДФН оксидазы представляет собой сложную цепь глугриклеточяой передачи сигнала, рашшми этапами в которой после ¡лвання лшацда с рецептором являются изменения мембранного потенциала [Са*+];. ' ...

Мембранцый потенпиал. При добавлении 1 чкМ fMLP s среду инкубации мачрофа:or. предварительно окрашенных <JiBAC.i(3S, наблюдается двухфазное л:«пс!1ие интенсивности флуоресценшш клеток (рас. 3, а): деполяризация плазматической мембраны (в среднем на 40% в максимуме и длительностью 2-4 ' • мин) сменяется продолжительной пгперполярнзациёй. Подобные изменения мембранного потенциала наблюдались и прн действии лругогс гдспгЕ-.тора Т?ДДФГС о«сс!Е№к 25 мкг/мл PA.F (рис. 3, а). В безпатриевой среде деполяризация частично снимается, отсутствие Ca"f в среде не меняет эффекта, а связывание внутриклеточного Са~+ Кянно:.г-2АМ полностью или частично редуцирует гиперполярнзаиионную фазу (результаты не показаны).

Рис 3. Изменение мембранного потенциала и [Са2+]1 при стимуляции окислительного взрыва макрофагов ШЬР (1 мкМ) и РАР (25 мкг/мл). а: Изменение интенсивности флуоресценции макрофагов в среде с потенциал-чувствительным зондом <йВАС4(3). Концентрация ёШАСДЗ) в среде - 450 нМ. б: Изменение [Са2+]| макрофагов. Клетки, нагруженные Лга-2, инкубировали 10 мин при 37°С, а затем добавляли агонист.

Стрелками указан момент введения стимулятора. Макрофаги во время измерения находились в растворе Хенкса. Каждая кривая • репрезентативный результат измерения одной клетки. Представлены результаты измерений на не менее чём 5 клетках из 6 посевов макрофагов.

Изменение [Ca"+]j. На рис. 3, б показаны изменения уровня внутриклеточного [CaI+]i при активации макрофагов 1 мкМ fMLP или 25 мкг/мл PAF. Оба агониста вызывали транзиториое повышение [Са241ь которое не предотвращалось инкубированием клеток в бескальциевой среде с добавлением 0.1 мМ ЭГТА.

Таким образом, мы показали, что одним из ответов макрофагов на действие активаторов является генерирование HjCb за счет активации специфического фермента - НАДФН оксидазы. Этот процесс не всегда связан с фагоцитозом и поражением клеток вследствие образования больших количеств Н1О2, а зачастую является кратковременным и не может привести к гибели клетки, поскольку концентрация образованной Н2О1 как внутри, так и вне клетки не является повреждающей. Поэтому бьшо исследовано влияние малых (неповреждающих) количеств Н2О2 на различные функции макрофагов.

Перекись водорода как активатор макрофагов и возможные ионные механизмы ее действия

Модуляция перекисью водорода окислительного взрыча макрофогов

Предварительная инкубация индуцированных перитонеальных макрофагов с 0,2-20 мкМ Н0О2 увеличивает их люминолзависимую XJI в ответ на 0,5 мхМ fMLP. Эффект зависит как от концентрации FbCb, так и от продолжительности инкубирования. Из рис. 4, а видно, что ХЛ ответ макрофагов при добавлении fMLP сразу после ЬЬО? (кривая 2) больше, чем в контроле на 33+3%, в то время как выдерживание макрофагов с 10 мкМ Н2О2 20 мин приводит к 70+8% увеличению этого ответа (кривая 3). Увеличение ХЛ макрофагов при добавлении Н2О2 (рис. 4, а,' кривая 2) связано с присутствием клеток и не наблюдается при добавлении Н2О2 к раствору лгоминола. В интервале концентраций Н^СЬ 5-20 мкМ наблюдается прямопропорциональное увеличение ХЛ макрофагов, вызванной fMLP. Заметим, что одинаковый по величине активирующий эффект Н2О2 можно получить, варьируя ее концентрацию и инкубационный интервал: инкубирование макрофагов в среде С 0,1-0,2 мкМ Н2О2 30 мин приведет к такому же увеличению ХЛ ответа макрофагов, как и 2-минутное инкубирование в 5-40 мкМ HjOi (результаты не показаны).

с 5

5:

ск

5: 3" X

си =Г

О ф

X

2 §

2 ф

X

4000 3000200010000

5000 4000 -3000 2000 -100 о

о

2 мин

X.

X

Т

~> контроль 5 10 20 Н202 [цМ]

Рнс. 4. Влияние НгО^ на люминолзависимуго ХЛ макрофагов, а: ХЛ ответ макрофагов на 0,5 мкМ ШЬР (1), 0,5 мкМ МЬР сразу после добавле1ШЯ 10 мкМ Н2Ог (2), 0,5 мкМ ШЬР через 20 мин после добавления Н2О2 (3). Приведены репрезентативные результаты 1 из ке менее чем 5 экспериментов.

б: Концентрационная зависимость эффекта Н^Оа на МиР-вызванный ХЛ ответ макрофагов. Клетки инкубировались 20 ¡мин при 37°С с различными. концентрациями Н2О2, а затем добавляли 0,5 мкМ МЬР. Контрольные клетки не обрабатьгеались НгСЬ.

Влияние перекиси' водорода на фагоцитоз макрофорами частиц опсонизнрованного латекса

Эффект Н2О2 на фагоцитоз резидентными макрофагами частиц опсонизироваиного латекса в диапазоне концентраций 5-5г мкМ оказался бимодальным (рис. 5). Предварительное инкубирование макрофагов в среде с 10 мкМ Н2О2 усиливало фагоцитоз приблизительно на -100%. Концентрации Ч2О2 меньше, чем 2 мхМ, не влияли на этот процесс. Не удалось обнаружить различие в активирующем действии Н2О2 на фагоцитарную активность между концентрациями 5 и 10 мкМ. 50 мкМ Н202 ингибировала фагоцитоз приблизительно на 20%, хотя IT2O2 в таких концентрациях еше не является шпготоксичной. Для сравнения мы сопоставили эффект Н2О2 с действием популярного активатора макрофагов fMLP. 0,5 мкМ fMLP усиливал фагоцитоз приблизительно на 80%.

Хемотактическая активность макрофагов в ответ на перекись водорода

Концентрационная зависимость хемотаксиса мышиных перитонеальных нейтрофилов в ответ на H2Oz показана на рис. 6, а. Максимальный эффект наблюдался при действии 10 мкМ Н2О2 (2,4 раза по сравнению с контролем).

Расстояние, покрытое клетками, мигрирующими под а-арозой к Н2О2 и буферу, составило 520+195 и 220+25 мкм, соответственно.- Для сравнения: расстояние, покрытое клетками, мигрирующими к 10"8 М fMLP равнялось 590+25 мкм.

Поскольку известно, что хемотяктичеехпе факторы могут образовьшаться "сл,л;'СТБпе перекисного окисление липидов плазмы крови (Shingu, Nobunaga, ¡?34), мы заменил сьгеоротку на бычий сывороточный альбумин в агарозной среде (рис. 6, б). Замена сыворотки на альбумин не сказалась на характере концентрационной зависимости хемотаксиса нейтрофилов к Н2О2 (результат не показан), хотя" максимальный хемотактическин ответ на 10 мкМ Н2О2 был несколько меньше (рис. 6, б).

Н^СЬ-ти.пЕатшый хемотактическин ответ нейтрофилов ингибировался ¡саталазой, причем этот ннгибируюший эффект был больше в агарозной среде, содержащей альбумин (80%). В агарозной среде с сывороткой катапаза' ингибировала НгОг-вызванный хемотактическин ответ нейтрофилов на 65%. Сама катал аза не влияла ни на спонтанную миграцию, ни на хемотаксис нейтрофилов к 10"8 М fMLP (ряс. б, б), что говорит о способности Н1О2 быть хемотактнческим агентом.

зоо n

ос

g. 250

х о

со

о £

о

I— <£ в

200

150-

100

50

Р

i

si IS

S «

0 10 50 fMLP Hj02 (miM)

Рис. 5. Влияние Н2О2 на фагоцитоз макрофагами частиц опсонизированяого латекса.

Макрофага инкубировались 20 мин при 37°С с различными концентрациями Н2Ог или 0,5 мкМ Й£Р, затем добавлялся опсони-зированный латекс (20 мин 37°С). В контроле клетки инкубировались без Н2О2.

Градиент HjOi в агарозе

Рассчитанный с помощью полученных кривых изменения концентрации Н2О2 в агарозных лунках коэффициент диффузии этого вещества при 37°С получился равным (1,7x10'3 см2/с). Это значение хорошо согласуется с коэффициентом диффузии Н2О2 в растворе (l,8xlO'J cmVc) (van Stroe-Biezen et al., 1993). Присутствие .сыворотки в агарозной среде не влияло на изменение концентрации Н2О2 в обеих лунках. Таким соразом, полученные данные демонстрируют, что градиент концентрации НгОг в агарозе сохраняется по крайней мере 3 ч после добавления Н2О2.

Изменение мембранного потенциала и [Са**! при действии перекиси водорода

Мембранный потенциал. Рис. 7, а показывает, что Н2О2 в концентрации 0,3 мкМ вызывает двухфазное изменение мембранного потенциала (кратковременная деполяризация сменяется продолжительной гиперполяризацией); действие же 1-10 мкМ НгОг приводит только к

3-

o 4-i

i¿ ф

d X

s

s u

Ш X

s

ü я

o 1-

Ф X

o

a

"I—1—I—I—

rv7 m-5

буфер

2-

—т—i

10"' 10° 10'3 H202 fMLP H202 fMLP

Концентрация H202 (M) Сыворотка Альбумин

1

I

¡ i - каталаза

G—i + каталаза

1

I

Pite. 6. Хемотаксис мышиных перитонеальных нейтрофшов под агарозой к Hi02.

а: Зависимость хемотактического индекса нейтрофилов от концентрации Н2Ог.

б: Влияние каталазы на хемотаксис нейтрофилов к Н202. Агарозная среда содержала либо 10% инактивированной бычьей сыворотки (сыворотка), или I %-ньш бычин сывороточный альбумин (альбумин). Каталаза (2 500 ед/мл) добавлялась к клеткам до их помещения в агарозу. fMLP (10'п М) б л использован как позитивный контроль хемотактического ответа.

гиперполяризации плазматической мембраны. Предварительная обработка макрофагов хелатором Са2+ Квином-2АМ полностью блокирует влияние Н202 на мембранный потенциал.

Изменение ГСа"*],. Кинетика изменения [Са2<1| макрофагов в ответ на действие Н202 зависила от ее концентрации (р(-.с. 7, б). Концентрации Н202 меньшие, чем 50 м::М, кратковременно повышают [Са~ ], мякрофагов с

3

а

I в

600-

с — 400-

и

О 200-

1 мМ

350

1 тт 300- К

А * 250-

1 . 50 цМ 1 10 цМ

1 ГШП

А

Рис 7. Изменение мембранного потенциала и [Са2+^ при действии Н2О2. а: Изменение интенсивности флуоресценции макрофагов в среде с потенциал-чувствительным зондом ШВАСДЗ). Концентрация <ИВАС((3) в среде - 450 нМ. б: Изменение [Са2+]] макрофагов. Клетки, нагруженные йиа-2 инкубировали 10 мин при 37°С, а затем добавляли агонист.

Стрелками указан момент введения Н2О2. Макрофаги во время измерения находились в растворе Хенхса. Каждая кривая - репрезентативный результат измерения одной клетки. Представлены результаты измерений на не менее чем 5 клетках из 6 посевов макрофагов.

озвращеннем до базального уровня через 1-2 мни. Увеличение же [Са"+]ь ызвалное большими концентрациями Н202 (0,1-1 мМ) было необратимым даже осле замены среды на раствор, ие содержащий Н202. Концентрации Н2О2, иже, чем 100 мкМ, не влияли на выживаемость клеток. В лучае действия еповреждающих концентраций Н2О2, увеличение [Са:+]; макрофагов не зависит т содержания ионов Са в среде: измерения, проведенные в бескальциевом астворе в присутствии 0,1 мМ ЕСТА, дали те же результаты. По-видимому, оны Са высвобождаются под влиянием Н2О2 из внутриклеточных депо.

Итак, показано, что Н2О2 з малых концентрациях способна амостоятельно активировать или модулировать различные функции клеток. Эти езультаты в совокупности с появившимися в последнее время литературными энными можно трактовать в поддержку предположения о том. что Н2О2 (как, прочем, и другие АМК) во многих случаях может играть роль посредника как о внутриклеточной, так и в межклеточной передаче сигнала. Основаниями для акого утверждения является: 1) АМК образуются в клетках не только как обочные продукты дыхания, но и с помощью специфических ферментативных истем (одной из которых является НАДФН оксидаза), существующих в азличных типах клеток; 2) 1ЬСЬ способна диффундировать в биологических истемах и в малых концентрациях активировать клетки; 3) все укариотические клетки содержат системы, позволяющие быстро деградировать кМК. Таким образом, Н2О2 удовлетворяет важному критерию в определении торичного мессенджера - концентрация ее в клетке может быстро вгличиваться и уменьшаться. Однако все вышесказанное применимо только для овольно узкого диапазона концентраций Н2О2, поскольку в больших онцентрациях это вещество токсично для клеток.

Выводы

1) Изучена кинетика НАДФН оксвдаза-зависимого образования перекио водорода (Н2О2) макрофагами. Оценивалось и экстраклеточное накоплена Н2О2. и изменение ее внутриклеточной концентрации.

2) С помощью гликолитических ингибиторов показано, что да максимальной активации НАДФН оксидазы при всех остальных равны; условиях необходимо наличие в цитоплазме клеток максимально возможно! концентрации глюкозо-6-фосфата, который может быть использован дои пополнения запасов внутриклеточного НАДФН.

3) Показано, что ганглиозид GM1 в наномолярных концентрация} модулирует образование AM К макрофагами при действии активатор; протеинкиназы С форболового эфира. Эффект объясняется увеличение», отрицательного заряда мембраны вследствие встраивания в нее ганглиозид а, чтс потешширует связывание цитоплазматических факторов оксидазы с мембрано! при активации фермента.

4) Обнаружено, что Н2О2 в узхом диапазоне концентраций наряду с другими известными активаторами макрофагов (fMLP, PAF и др.) может бьгп самостоятельным стимулятором различных клеточных функций.

5) Изучено влияние малых, неповреждающих клетку, доз Н2О2 (1-50 мкМ] на функциональный ответ макрофагов. Впервые показано, что Н2О2 может усиливать фагоцитоз и окислительный взрыв макрофагов.

6) Показана способность Н2О2 вызывать хемотаксис мьщщньн перитонеальных нейтрофилов. Измерен коэффициент диффузии Н2О2 в среде миграции клеток.

7) Показано, что все исследованные функциональные ответы клеток ш Н2О2 сопровождаются гиперполяризацией плазматической мембраны к транзиторным повышением [Са2+];.

8) Предполагается, что во многих случаях Н2О2 может бьггь посредником как во внутриклеточной, так и в межклеточной передаче сигнала.

Публикации по теме диссертации

1. Клюбин И.В. Влияние ингибиюров утилизации глюкозы на милгоминесценцшо и флуоресценцию мышиных перитонеальных макрофагов Цитология. -1992. Т. 34. - С. 53-62.

2. Аврова Н.Ф., Иванова В.П., Тюрин В.А., Гамалей И.А., КлюОнн И.В., 1епеткин И.А., Борунов Е.В., Тюрина О.Ю. Модуляция сверхмалымн ишентрамиячи ганглиозияа GM!'окислительного взрыва макрофаюв мыши и мтрофилов человека // Бюл. Экспер. Бнол. Мед. - 1994. - Т. 1. - С. 44-40.

3. Гамалей И.А., Клюбин И.В., Кирпичникова K.M. Стимулирующее йствне перекиси водорода на макрофаги и фибробласты // Цитология. - 1995. 37. - С. 365.

4. Gamaley I.A., Kirpiciinikova K.M., Klyubin I.V. Activation of murine »crophages by hydrogen peroxide // Cellular Signalling - 1994. - Vol.>6. - P. 949-957.

5. Gamaley I.A., Klyubin I.V., Kirpichnikova K.M. Hydrogen peroxide as an tivator of macrophages // Cell Biology International - 1994. - Vol.'18. P. 494.

6. Gamaley I.A., Klyubin I.V., KirpichiiiLova K.M. Evkioncc of direct mulatory effects of ibO? on macrophages and fibroblasts // 1995. - Abstracts to vSEB Summer Research Conference: Antioxidants nutrients in cell biology of xlth and disease. Saxlons River, USA.

7. Klyubin I.V., Kirpichnikova K.M., Gama'-y I.A. Hydrogen peroxiili'-iueed Chemotaxis of mouse peritoneal neutrophils // !:nr. .!. Ceil Biology. - 1996. ■ >1. 70. - P. .347-

Отпечатано в типографии ПИЯФ

Зак. 380, тир. 100, уч.-изд. л I; 30/VII-I99C» г Бесплатно