Изучение роли белка Piwi в процессах самообновления стволовых клеток и репрессии мобильных элементов у Drosophila melanogaster

Соколова, Олеся Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение роли белка Piwi в процессах самообновления стволовых клеток и репрессии мобильных элементов у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли белка Piwi в процессах самообновления стволовых клеток и репрессии мобильных элементов у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

СОКОЛОВА ОЛЕСЯ АЛЕКСАНДРОВНА

Изучение роли белка РКу! в процессах самообновления стволовых клеток и репрессии мобильных элементов у Т)гоыорМ1а теЫпозаъгег

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 п:сн ¿013

005060978

МОСКВА-2013

; г

005060978

Работа выполнена в Лаборатории биохимической генетики животных Отдела молекулярной генетики клетки Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук.

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук

Михаил Сергеевич КЛЕНОВ

доктор биологических наук, академик РАН

Владимир Алексеевич ГВОЗДЕВ

доктор биологических наук, профессор

Николай Андреевич ЧУРИКОВ

Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

кандидат биологических наук

Ольга Борисовна СИМОНОВА

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук

Защита состоится «/- М<-^2013 г. в Н

СО

часов на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 при Федератьном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан2/"^> 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат химических наук

Анатолий Михайлович Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Терминальные стволовые клетки (ГСК) Drosophila являются важной моделью исследования стволовой клетки in vivo. Характерными чертами ГСК являются самообновление (образование новой стволовой клетки), способность продуцировать дифференцирующиеся терминальные клетки, а также длительная способность к пролиферации. Терминальные стволовые клетки контактируют с соматическими клетками ниши. Изучение взаимодействий между ГСК и клетками ниши в яичниках Drosophila заложило основы представлений о способах сигнализации, осуществляемых нишей и заставляющих прилегающие клетки оставаться стволовыми. Эти фундаментальные принципы одинаковы у Drosophila и млекопитающих. В результате деления стволовой клетки одна из дочерних клеток, примыкающая к клеткам ниши, получает от них сигнальные молекулы, блокирующие дифференцировку и остается стволовой. Другая дочерняя клетка, которая не контактирует с клетками ниши, начинает дифференцироваться в цистобласт, который после нескольких митотических делений формирует яйцевую камеру.

Ген piwi был впервые описан в связи с его ролью в самообновлении терминальных стволовых клеток, определяющем развитие семенников и яичников Drosophila melanogaster. Аналогичная функция ортологов Piwi была показана и у других организмов. Самки дрозофил, мутантные по гену piwi, теряют терминальные стволовые клетки в результате их дифференцировки без самообновления. Этот эффект объясняется тем, что белок Piwi, по-видимому, участвует в регуляции сигналов, исходящих из соматических клеток ниши и направленных на поддержание стволовых клеток. Молекулярный механизм влияния Piwi на сигнальную функцию клеток ниши остается неизвестным.

Piwi необходим также для подавления экспрессии мобильных генетических элементов (транспозонов). Мутации piwi приводят к их дерепрессии и транспозициям. Сайленсинг транспозонов осуществляется белком Piwi, находящимся в комплексе с piPHK (Piwi-interacting RNA), которые имеют длину 23-29 нуклеотидов и принципиально отличаются по механизму образования и функциям от других типов коротких РНК, таких как microPHK и siPHK. piPHK обнаружены в гонадах разных животных, включая млекопитающих, и активно изучаются в последние годы. Белок Piwi дрозофилы дал название подсемейству эволюционно консервативных белков PIWI семейства ARGONAUTE, которые взаимодействуют с piPHK. К подсемейству PIWI у Drosophila melanogaster относятся также белки Aub и Ago3. piPHK у дрозофилы образуются из транскриптов гетерохроматиновых областей генома (piPHK-кластеров), содержащих последовательности транспозонов. С

помощью вспомогательных белков р1РНК загружаются в РНП-комплексы с белками Р1\¥1, которые взаимодействуют с транскриптами мобильных элементов или р!РНК-кластеров по принципу комплементарное™, подавляя экспрессию транспозонов. Белок преимущественно локализуется в клеточных ядрах и подавляет мобильные элементы как в терминальных, так и в соматических клетках яичников, в отличие от белков АиЬ и А£о-3, которые функционируют только в цитоплазме терминальных клеток.

Непонятным остается механизм репрессии транспозонов с помощью значение

ядерной локализации этого белка и его роль в регуляции транскрипции и структуры хроматина. Неизвестно, каким образом белок влияет на процесс поддержания

терминальных стволовых клеток. Можно предположить, что нарушение поддержания стволовых клеток, наблюдаемое при отсутствии является следствием дерепрессии

мобильных элементов в клетках ниши. Также высказывались предположения, что Р1\\а с помощью р'[РНК в ядрах клеток ниши может не только подавлять экспрессию мобильных элементов, но и стимулировать транскрипцию определенных генов, которые влияют на формирование сигнала, поддерживающего стволовые клетки. Возможно также, что в клетках ниши имеет особую молекулярную функцию в процессе поддержания стволовых клеток, и эта функция не связана с р1РНК-сайленсингом.

Цели и задачи работы

Цель настоящей работы состояла в установлении роли ядерной локализации белка в процессах поддержания терминальных стволовых клеток и сайленсинге транспозонов, а также механизма репрессии мобильных элементов с помощью РКу! в яичниках ОгохорИНа те1апо%азег.

Работа включала следующие экспериментальные задачи:

• выявление молекулярной природы и фенотипических проявлений мутации

. .т

• исследование влияния мутации ртп на процесс поддержания терминальных стволовых клеток;

• определение тканевой и внутриклеточной локализации мутантного белка

• исследование р1РНК-зависимого подавления мобильных элементов в различных типах клеток яичников йго8орЫ1а и влияния мутации р/»7Л' на этот процесс;

• изучение влияния Р!\у! на структуру хроматина мобильных элементов в яичниках ОгохорИНа.

Научная новизна и практическая значимость работы

Охарактеризована новая мутация в гене piwi, приводящая к образованию белка, лишенного сигнала ядерной локализации. Показано, что белок Piwi, находящийся в цитоплазме, способен обеспечивать обновление и поддержание терминальных стволовых клеток, но полностью теряет способность к подавлению мобильных элементов. Таким образом, впервые показано, что эти две функции белка Piwi являются независимыми. В ходе работы установлено, что сайленсинг с помощью белка Piwi осуществляется в ядрах терминальных клеток и связан с модификациями хроматина. Отсутствие ядерной локализации Piwi приводит к возрастанию уровня гистона НЗ диметилированного по лизину в положении 4 (НЗК4те2) в хроматине мобильных элементов НеТ-А, HMS-Beagle, copia и MDG1 и уменьшению количества маркеров неактивного хроматина (H3K9me3/me2 и НР1) в хроматине ретротранспозона НеТ-А.

Результаты работы могут быть использованы при изучении процессов дифференцировки стволовых клеток и функций белков PIWI у других организмов, в том числе у млекопитающих, принимая во внимание эволюционный консерватизм этих процессов.

Апробация работы

Результаты, полученные в данной работе, были представлены на семинарах в отделе молекулярной генетики клетки (ОМГК) ИМГ РАН. Данные, представленные в работе, докладывались на Международном конгрессе по мобильным элементам (Сан-Мало, Франция, 2008); на Кейстоунском симпозиуме, посвященном функциям коротких РНК и механизмам РНК-сайленсинга (Канада, 2009); на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина (Москва, 2009); на XVI Всероссийском симпозиуме, посвященном структуре и функциям клеточного ядра (Санкт-Петербург, 2010); на VI микросимпозиуме, посвященном коротким РНК (Австрия, 2011).

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на 107 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков, 1 таблицу. Список цитирования литературы состоит из 192 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика мутации р/и>/л'

В настоящей работе охарактеризована мутация, приводящая к стерильности самок, в дальнейшем названная р1-н>1№ (Р1\У1 Ы-1гипса1ес1 - укороченный с М-конца).

Трансгетерозиготные мухи, несущие ртг" и оппозитную хромосому с делецией, нарушающей гены рю1 и аиЬ, были стерильны. Стерильность также наблюдалась в случае трансгетерозиготной комбинации ртР' с нуль-мутациями гена рм>1 (рт12 и рт13), но не в сочетании с мутацией аиЪ. Это позволило сделать вывод, что данная мутация нарушает ген рЬю1. Методом инверс-ПЦР было показано, что ген ртх укорочен с 5' конца вследствие встройки Р-элементного вектора в район первого экзона (Рис. 1). С помощью метода обратной транскрипции с последующим ПЦР (ОТ-ПЦР), используя праймеры к разным участкам гена, было выяснено, что в мутантных яичниках присутствует транскрипт генаргwi,

лишенный 5' концевой последовательности (Рис. 1). С помощью ОТ-ПЦР было показано, что

■ м ■ •

в яичниках самок с мутациеи ртг и в диком типе, количество транскриптов гена ртг

приблизительно одинаково (Рис. 1). 3'

старт транскрипции \flrt

АТС \лЛ

-1-

ехоп1

ОТ- ПЦР

Рис. 1. Мутация р'ш>Р' приводит к формированию транскрипта, который укорочен с 5'

конца. В результате встройки вектора Р 1ас7 в ген рт1 образовался укороченный транскрипт

ргч/?", у которого отсутствует первый экзон и часть первого интрона. Стрелками обозначены

праймеры, которые использовали для ОТ-ПЦР, чтобы проверить целостность транскрипта и

- -Л7 г- . .V/ / . .N1

подтвердить положение старта транскрипции в линии рм1 . Гомозиготы рпп /рпп

обозначены как рт>?', линия дикого типа - и'/.

Р1асг

Мог

старт . транскрипции р/ют

т^оп 1

Г АТС рШт

—V

ехоп 2

р4 рЗ

24ог

2 2-геу

1Тог/1-геу 24ог/2-геу

' ртР1 и? ' I р/м*" Ы

р4/1-геу рЗ/1-геу

р/и/Л' ряда*"

Методом 5'-КАСЕ-анализа определили, что старт транскрипции мутантного гена р'т1 находится в области первого интрона гена р'т1 дикого типа — на расстоянии 97 нуклеотидных пар до границы первого интрона и второго экзона. Положение старта транскрипции было подтверждено методом ОТ-ПЦР (Рис. 1). С помощью программы МсРготйег был предсказан криптический промотор в этом районе. Наличие кодона АТв на границе между интроном 1 и экзоном 2 гипотетически позволяет инициировать трансляцию укороченного белка без сдвига рамки считывания.

Методом Вестерн-блот-анализа было показано, что антитела к С-концевому и центральному участкам белка узнают укороченный белок Р1ш1№, в то время как

антитела к Ы-концу с ним не взаимодействуют (Рис. 2А).

C-Piwi

Piwi

N-Piwi

NLS

Piwi

PAZ Z PIWI □

Piwi

PAZip PIWI □

PiwiNt укорочен на 26 а/к

MADDQGRGRKRPLNEDDSSTSRGSGD

■лит т-тубулин

Рис. 2. Мутация piwf" приводит к формированию белка, который укорочен с N конца. (А) Антитела к С-концевой и центральной части Piwi детектируют укороченный мутантный PiwiNt (показано стрелкой), в то время как антитела к N-концу Piwi не выявляют мутантный белок. Внизу показан загрузочный контроль с использованием антител к у -тубулину (Б) Мутантный белок PiwiNt лишен двадцати шести аминокислот на N-конце, включая последовательность сигнала ядерной локализации (NLS), тогда как последовательности доменов PAZ и PIWI не нарушены.

В лизатах яичников мух линии piwi2 (нуль-мутация piwi) белок Piwi не детектируется при использовании всех типов антител (Рис. 2А), поскольку в данной линии белок не образуется. Белок PiwiNt имеет большую электрофоретическую подвижность в полиакриламидном геле, чем белок дикого типа, что объясняется уменьшением молекулярной массы на 3 кДа вследствие отсутствия 28 N-концевых аминокислот. Данные аминокислотные остатки кодируются первым экзоном гена piwi, включая сигнал ядерной локализации (NLS), кроме того, мугантный белок приобрел две дополнительные аминокислоты (M - Met и Q - Gin), кодируемые последовательностью первого интрона.

Ранее было показано, что в N-концевой части белка Piwi присутствуют несколько метилированных остатков аргинина. При отсутствии этого метилирования количество белка уменьшается, что, по-видимому, связано с нарушением его стабильности (Kirino et al. 2009). Следовательно, отсутствие метилированных остатков аргинина в N-концевой части белка PiwiNt может объяснять уменьшение его количества в сравнении с диким типом (Рис. 2А). Другим возможным объяснением снижения количества мутантного PiwiNt может быть менее эффективная инициация трансляции. Ненарушенная часть белка PiwiNt включает домены PAZ и PIWI, необходимые для связывания piPHK и нуклеазной активности, соответственно (Рис. 2Б). Таким образом, предполагается, что укороченный белок PiwiNt не способен проникать в ядро, вследствие потери сигнала ядерной локализации, но сохраняет способность связывать короткие piPHK.

Как укороченный белок, так и аномальный транскрипт не детектировались в яичниках мух дикого типа, а соответствующие последовательности не были обнаружены в доступных базах данных. Это позволило заключить, что в норме укороченная форма белка Piwi (PiwiNt) не образуется.

Белок обеспечивает самообновление терминальных стволовых клеток

Яичники имаго дрозофилы состоят из овариол, каждая из которых содержит гермарий и цепочку развивающихся яйцевых камер. Терминальные стволовые клетки (ГСК) располагаются в апикальной части гермария, контактируя с соматическими клетками ниши. После деления ГСК, одна из дочерних клеток остается в нише, другая дифференцируется в цистобласт, который затем претерпевает четыре неполных митотических деления, в результате чего образовавшаяся 16-клеточная циста покрывается слоем соматических фолликулярных клеток и образует яйцевую камеру. Одна из 16 терминальных клеток в каждой яйцевой камере развивается в ооцит. В каждой овариоле взрослых самок дикого типа содержится 6-7 яйцевых камер, которые непрерывно обновляются благодаря делениям терминальных стволовых клеток.

Самки нуль-мутантов рхи»г имеют несколько дефектных овариол, в которых происходит прямая дифференцировка всех терминальных стволовых клеток без самообновления. В результате овариолы нуль-мутантов р1пч либо совсем не содержат яйцевых камер, либо содержат не более 2-3 камер, что соответствует числу изначально существовавших стволовых клеток (Рис. ЗА).

Было обнаружено, что яичники гомозиготных мух трансгетерозиготных

линий рЫчх'/р1пч2 или р1пчк'/0/(21)ВБС145 содержат близкое к норме число яйцевых камер в составе овариолы (Рис. ЗА). Кроме того, мухи данных линий производили ооциты на протяжении жизни. Таким образом, в мутантной линии мух ртР'/рт?" не выявлялись дефекты оогенеза, вызванные потерей терминальных стволовых клеток, характерные для линий с нуль-мутациями в гене р 'т1.

Чтобы оценить количество и расположение стволовых клеток, провели иммуноокрашивание тотальных препаратов яичников гомозиготных мухр'т'^'/рьк?' и линии дикого типа («•/) антителами ю -спектрину, которые выявляют специфические для стволовых клеток структуры — спектросомы, расположенные в местах контакта стволовых клеток с соматическими кэп-клетками, формирующими нишу (Рис. ЗБ). В гермариях взрослых особей нуль-мутантов р/И7 (например рЫп2), практически полностью отсутствуют терминальные стволовые клетки. В то же время, гермарии мутантов ргу/Р' содержали терминальные стволовые клетки в нормальном количестве (две или три на гермарий) (Рис. ЗБ). Расположение спектросом в клетках мутантной линии /)Ш7Л|, оцененное с помощью а-спектрина, было таким же, как в линии дикого типа. Кроме того, в гермариях р/и>/Л' мутантов были обнаружены делящиеся стволовые клетки, содержащие фьюзомы - структуры, которые также выявляются антителами к -спектрину и представляют собой цитоплазматические мостики, соединяющие материнскую и дочернюю клетки (Рис. ЗБ). Таким образом, в

мутантной линии piwiN' сохраняется нормальный процесс обновления и поддержания терминальных стволовых клеток.

Гомозиготные самки piwiNI (piwiN'/piwiNl) в возрасте от одного до пяти дней содержали в среднем 4,3 яйцевые камеры на овариолу (п=120), а соответствующие гетерозиготные самки (p/wO - 6,2 яйцевых камеры на овариолу (п=150). Наблюдаемое незначительное уменьшение числа яйцевых камер в составе овариолы характерно для мутаций, нарушающих piPHK-сайленсинг, что, по-видимому, связано с задержкой митотических делений терминальных клеток.

У мух дикого типа ооциты располагаются на заднем полюсе яйцевой камеры. В мутантной линии piwiN' в большинстве случаев ооциты также имели правильное расположение на заднем полюсе. В небольшом числе овариол (2%) выявлялись нарушения фенотипа, такие как, слияние яйцевых камер, при этом в общей яйцевой камере наблюдалось два ооцита на переднем и заднем полюсах, а также увеличение количества питающих клеток.

Кроме того, были обнаружены ооциты с дефектами, характерными для мутаций в генах piPHK-пути. Характерной чертой данных мутаций является нарушение поляризации ооцита, как следствие неправильного расположения морфогенов, например, Oskar, который инициирует образование полярных гранул на заднем полюсе ооцита. Oskar привлекает белки, входящие в состав полярных гранул, присутствие которых определяет место формирования предшественников терминальных клеток эмбриона.

Иммуноокрашивание ооцитов поздних стадий развития линии piwiM антителами к белкам Oskar и Piwi выявило дефекты, характерные для линий с мутациями в генах piPHK-пути: нарушение локализации белков Oskar и Piwi на заднем полюсе ооцита. Только в 30% ооцитов мух piwiN' наблюдалась правильное (как в линии дикого типа) расположение Oskar и Piwi в полярной плазме (Рис. ЗВ). В 70% ооцитов piwi" выявлялись нарушения локализации белков Oskar и Piwi, характерные для мутаций в генах piPHK-пути: формирование нескольких зон полярной плазмы в среднем отделе ооцита (Рис. ЗВ).

Следует отметить, что белок PiwiNt, лишенный N конца, способен локализоваться в полярной плазме при наличии там белка Oskar. Таким образом, N конец белка Piwi не важен для его транспорта в полярную плазму, который направляется, по-видимому, другими участками белка.

p/W7M

Рис. 3. Яичники мух piwiN' содержат нормальное количество яйцевых камер и терминальных стволовых клеток, но имеют нарушения поляризация ооцита. (А)

Овариолы дикого типа (wt) и мутантов piwiNl содержат нормальное число яйцевых камер, в отличие от нуль-мутантов piwf. Овариолы окрашены антителами к цитоплазматическому белку Vasa (красный), который выявляет терминальные клетки, и DAPI (голубой). (Б) В гермариях мутантов piwiNl происходит поддержание и обновление терминальных стволовых клеток (ГСК). Гермарии дикого типа (wt) и мутантов piwiNt окрашены антителами к Lamin (зеленый) иа -spectrin (красный), который маркирует спектросомы и фьюзомы (Ф). Как в гермариях дикого типа, так и на фоне piwiN' выявляются терминальные стволовые клетки (ГСК), содержащие спектросомы вблизи зоны контакта с соматическими кэпирующими клеткам (КК). Делящиеся стволовые клетки (справа) соединены между собой фьюзомой. (В) Зрелые ооциты окрашены антителами к белкам Piwi (зеленый) и Oskar (Osk) - (фиолетовый). Показан дефектный ооцит мутантаpiwiN' с двумя зонами формирования полярной плазмы.

Локализация мутантного белка Р1\у1|>"

Иммуноокрашивание препаратов яичников мух р1м>?"/рЫмР' антителами к белку Piwi выявило нарушение ядерной локализации во всех клетках, в которых белок экспрессируется в норме, включая питающие клетки (ПК), развивающийся ооцит (РО) и соматические фолликулярные клетки (ФК) (Рис. 4). Это связано с отсутствием 1Ч-концевой части белка, содержащей N1^5, который необходим для транспорта белка в ядро. Белок Р1\у1№ накапливался в цитоплазме всех типов клеток яичников, но в основном локализован в цитоплазме питающих клеток, и в меньшем количестве в цитоплазме фолликулярных клеток (Рис. 4).

В гермариях дикого типа Р1\у1 интенсивно окрашивается в ядрах соматических клеток и терминальных стволовых клеток, слабее - в цистобластах и ранних митотических цистах, затем экспрессия Р1\у1 возрастает в поздних митотических и 16-клеточных цистах (Рис. 5А). Процесс поддержания терминальных стволовых клеток зависит от экспрессии Р1\у1 в соматических клетках ниши. Поэтому был проведен детальный анализ локализации мутантного белка в апикальной части гермария, который включает терминальные стволовые клетки (ГСК) и соматические клетки ниши (Рис. 5Б). Ниша включает клетки терминального филамента, клетки-спутницы (КС) и кэп-клетки (КК), которые не только окружают стволовые клетки, но и взаимодействуют с ними напрямую посредством системы межклеточных контактов, а также передают сигналы необходимые для поддержания. В терминальных стволовых клетках мух р1ш ' белок Р1ш1 детектируется в цитоплазме в виде отдельных скоплений или гранул. В соматических клетках ниши Р1\у1№ выявляется в цитоплазме кэп-клеток (КК) и клеток-спутниц (КС), при этом его значительная часть располагается неравномерно, в виде гранул, аналогично ситуации в ГСК (Рис. 5Б).

Таким образом, цитоплазматически локализованный белок способен выполнять функцию самообновления терминальных стволовых клеток. Несмотря на то, что является преимущественно ядерным белком. Ранее было показано, что белок Piw¡ присутствует также в цитоплазматических УЬ-тельцах, которые обнаружены в соматических клетках яичников, в том числе и в клетках ниши. Известно, что белок УЬ, являющийся ключевым компонентом этих телец, также необходим для поддержания терминальных стволовых клеток. Мутации в гене уЪ приводят к дефектам в развитии яичников, которые схожи с дефектами, наблюдаемыми при нуль-мутациях р;и>г. Вероятно белок Р1\у1, локализующийся в цитоплазме клеток ниши и взаимодействующий с белком УЬ, каким-то образом влияет на секрецию сигнальных пептидов, которые поддерживают самообновление терминальных стволовых клеток.

рш

№

0АР1 ФК , * ЯПК ■.-Г;.'. \ * - ' . " - /

Рглч - * * * • 1 •>■ 1 РО у - , * 1

наложение ? *#л •У ■аГ-;- ™ ••ГА*. , ■ . * ' --

рш

л/г

Рис. 4. Локализации белка в яичниках мух дикого типа (и^) и мутаитной

линии /ни>/л". (А) В овариолах яичников мух линии дикого типа (и</) белок Р1-ш (красный) находится в ядрах питающих клеток (ЯПК), развивающемся ооците (РО) и соматических фолликулярных клетках (ФК), которые окружают яйцевую камеру. В овариолах яичников мух линиимутантный белок PiwiNt локализован только в цитоплазме. (Б) Локализация белка в цитоплазме фолликулярных клеток.

А_М

В ГСК дц Я ГСК * дц

• ^ ^^Н наложение

Б ■ -N1 р/\мгг

1 ^

ггк / . : гск ' кб

Рис. 5. Локализация белка Р1>У1 (красный) в гермариях дикого типа и мутантной линии рги>/л". (А) В гермариях яичников мух мутантной линии белок Р1\У1№ детектируется главным образом в цитоплазме делящихся клеток цист (ДЦ), и при данных настройках детектора не выявляется в апикальной части гермария. (Б) Локализация Piwi в апикальной части гермария. Мутантный белок накапливается в виде гранул в цитоплазме соматических кэп-клеток (КК) и клеток спутниц (КС), которые формируют нишу.

Ядерная локализация Piwi необходима для подавления мобильных элементов

В яичниках мутантов piwi" наблюдается дерепрессия разных групп мобильных элементов (Рис. 6А). Специфичность влияний данной мутации на piPHK-сайленсинг была показана путем сравнения с помощью количественного ОТ-ПЦР уровней экспрессии транспозонов у мутантов piwi" с нуль-мутацией piwi2, а также с мутациями в генах aub, mael и armi, нарушающих образование других белков piPHK-системы. В яичниках гомозиготных мух piwf (piwi"/piwiNl) количество транскриптов ретротранспозонов Gypsy и MDG1 увеличивалось в 10-20 раз в сравнении с гетерозиготными особями piwi"/+ (Рис. 6А). Аналогичные эффекты на экспрессию этих элементов наблюдали у гомозигот piwi2 (piwi2/piwi2) и в трансгетерозиготной комбинации piwi2/piwiNt (Рис. 5А). В случае мутации aub и mael количество транскриптов Gypsy и MDG1 практически не увеличивалось (Рис. 6А). Методом РНК-гибридизации in situ было обнаружено, что транскрипты мобильного элемента MDG1 при нарушении гена piwi накапливаются преимущественно в соматических клетках яичников. Накопление транскриптов Gypsy, как было показано ранее, также происходит в соматических клетках яичников. Эти эффекты, по-видимому, объясняются наличием у транспозонов Gypsy и MDG1 регуляторных последовательностей ДНК, которые обеспечивают их тканеспецифичную транскрипцию в соматических, но не в терминальных клетках. Белок Piwi присутствует как в терминальных, так и в соматических клетках яичников, в отличие от белков Aub и Mael (и ряда других белков piPHK-системы), которые локализуются исключительно в терминальных клетках. В соответствии с этим, репрессия Gypsy и MDG1 контролируется геном piwi и практически не зависит от генов aub и mael.

Количество транскриптов транспозонов HMS Beagle и НеТ-А увеличивалось в 50-100 раз в гомозиготной линии piwiNl {piwiN,/piwi") в сравнении с гетерозиготными особями piwiN'/+ (Рис. 6Б). В случае гомозигот нуль-мутации piwi2 {piwi2/piwi2), а также в трансгетерозиготе piwi/piwi" наблюдали примерно такую же (в количественном выражении) дерепрессию этих мобильных элементов (Рис. 6Б). Мутации генов aub, mael и armi также приводили к значительному увеличению количества транскриптов HMS Beagle и НеТ-А, однако в случае НеТ-А эффекты мутаций сильно варьировали (Рис. 6Б). Методом РНК in situ гибридизации было показано, что транскрипты HMS Beagle накапливаются в развивающихся ооцитах и в терминальных питающих клетках яичников. Известно, что мобильный элемент НеТ-А также экспрессируется в терминальных клетках яичников.

g <u

l О

vi 20 si.

s x

г та

1 е- io

К to

m 5 0

250

та

5 200

¡3

S|150

So.

Я c

я = So.

0 J

Gypsy

% h 1 ■§ 1 ■a % i10 e

HMS Beagle

Ju I ш ~г г-Н

1 /. J

2- Ъ -о

st s S s. "

I элемент

| m

I -B, " s

Mdgi

.£ Я с*

a, .| a. 6

Hex-A

I 1

H| ;

. !

I 1

G элемент

г-н

e ■!£ та

Рис. 6. Мутация piwt' приводит к нарушению сайленсинга мобильных элементов, экспрессирующихся как в соматических (Gypsy и MDG1), так и в терминальных (HMS Beagle, НеТ-А) клетках яичников Drosophila. Представлены отношения количества транскриптов, оцененные методом количественного ОТ-ПЦР у гомозигот piwim, piwi2 и трансгетерозигот piwF'/piwi2, к их количеству у соответствующих гетерозигот piwiN'/+. Нормирование количества РНК в каждом образце проводили относительно генов домашнего хозяйства Adh и гр49.

Таким образом, можно выделить две группы мобильных элементов: транспозоны, которые экспреесируются преимущественно в соматических клетках яичников (например, MDG1 и Gypsy) и контролируются белком Piwi без участия белков Aub и Mael, и терминальные элементы, которые экспреесируются в терминальных клетках яичников (например, HMS Beagle и Het-A). Для репрессии последних наряду с белком Piwi необходимы другие компоненты piPHK-системы, такие как Aub, Mael и Armi. Подобные различия в стратегиях репрессии терминальных и соматических мобильных элементов, вероятно, связаны с тем, что в терминальных тканях экспрессируется большее число групп мобильных элементов, чем в соматических клетках. Поэтому система piPHK-пути в терминальных клетках яичников является более сложной и многокомпонентной и зависит как от белка Piwi, так и от других piPHK-связывающих белков (Aub, Ago3), а также от белков, входящих в состав перинуклеарной структуры нуаж (Mael, Spn-E и др.), которая присутствует только в терминальных клетках. Известно, что транскрипты мобильных элементов обоих типов (как терминальные, так и соматические) обладают способностью транспортироваться в ооцит и интегрироваться в его геном в виде ДНК-копий, в результате чего их инсерции могут наследоваться.

Мутации piwi" и piwi2 приводят к незначительной дерепрессии (в 1,2-2 раза) мобильных элементов I и G, в то время как в случае мутаций aub, mael и armi количество их транскриптов возрастает в 5-15 раз (Рис. 6В). По-видимому, комплементарные этим элементам piPHK находятся преимущественно в комплексах с белками Aub и Ago3, но не с Piwi. Данные элементы можно отнести к третьей группе транспозонов, репрессия которых практически не зависит от Piwi. Этот результат также указывает на то, что мутация piwi" не нарушает сайленсинга, осуществляемого белками Aub и Ago3 в цитоплазме терминальных клеток. Это согласуется с данными иммунноокрашивания, согласно которым локализация белков Aub и Ago3 не нарушается в яичниках мутантов piwiNt.

Суммируя результаты, можно заключить, что мутантный цитоплазматический белок PiwiNt полностью теряет способность осуществлять репрессию мобильных элементов как в терминальных, так и в соматических клетках яичников, поскольку дерепрессия различных

• -N1

транспозонов при мутации piwi происходит в той же степени, что и в случае полного отсутствия белка Piwi (нуль-мутация piwi2). В то же время, при нарушении других компонентов piPHK-системы уровень дерепрессии одного и того же транспозона может существенно варьировать.

Таким образом, исследование мутации piwi" позволяет сделать следующие выводы: 1. активация мобильных элементов не оказывает существенного влияния на процесс

поддержания стволовых клеток; 2. ядерная локализация необходима для осуществления сайленсинга транспозонов, но не для поддержания терминальных стволовых клеток.

Белок Р1\у1 осуществляет сиквенс-специфический подавление мобильных элементов за счет комплементрных р1РНК, связанных с транскриптами транспозонов. Можно предположить, что дерепрессия мобильных элементов при мутации р1вызвана отсутствием соответствующих р1РНК, которые по каким-либо причинам не могут включаться в состав комплекса с цитоплазматическим белком Р1уу11>". Для проверки этого предположения, с помощью Нозерн-блот-анализа были детектированы р1Р11К, которые находятся исключительно в комплексах с Р1\¥1. Такие р1РНК обнаруживались в яичниках мутантов рт!" и отсутствовали у нуль-мутантов ртч2. Похожие результаты, демонстрирующие связывание коротких РНК с белком Р1\у1, лишенного N1,8, были получены другими авторами с использованием культуры клеток яичников Ого$орЫ1а. Таким образом, цитоплазматический белок Р1\¥1 может находиться в комплексе с р1РПК, однако для осуществления эффекторной функции сайленсинга необходима локализация Р1\у1 в клеточном ядре.

Белок Р1\у1 необходим для формирования неактивной структуры хроматина мобильных элементов в яичниках

Р1\у1 - это единственный р1РНК-связывающий белок ОгохоркИа, который локализуется в клеточном ядре. Поэтому Р1\у1 представляется наиболее вероятным эффектором в процессе р1РНК-зависимого хроматинового сайленсинга. Ранее сообщалось о роли Р1\\т в формировании гетерохорматина в соматических клетках и о его непосредственном взаимодействии с белком НР1 (Вго\уег-То1апс1 е[ а1. ). Тем не менее, оставалось не известным, в какой степени сайленсинг транспозонов, осуществляемый белком Р1\у1, основан на регуляции хроматина.

Компактизация хроматина и подавление транскрипции ассоциированы с присутствием определенным образом модифицированных гистонов, в частности, три- и диметилированного по лизину 9 гистона НЗ (НЗК9теЗ/ше2), который узнается основным белком гетерохроматина НР1. В составе хроматина активно транскрибируемых генов гистон НЗ, как правило, несет диметилированный лизин в положении 4 (НЗК4ше2).

Фенотип яичников трансгетерозиготной линии р1лч2/р1пч^', близкий к дикому типу, позволил адекватно проанализировать влияние на структуру хроматина мобильных элементов. Ранее провести подобный эксперимент не представлялось возможным, так как у нуль-мутантов р1т практически полностью отсутствует терминальная ткань. Методом хроматин-иммунопреципитации (СЫР) сравнивали количество модифицированных гистонов

и хроматинового белка НР1 в яичниках трансгетерозиготных мух piwf/piwi1' и их гетерозиготных сестер (piwiN'/+ ; piwi2/+), полученных в том же скрещивании. Обогащения белками изучаемых генов и мобильных элементов рассчитывали относительно последовательности межгенного спейсера из района 60D. По данным базы modENCODE в данном районе в пределах 36 т.п.н. не обнаружены профили экспрессии каких-либо генов, поэтому присутствие там модификацированных гистонов и хроматиновых белков должно быть среднестатистическим.

Гены гр49 и light были проанализированы в качестве контрольных последовательностей, являющихся примерами соответственно транскрипционно активного и репрессированного состояния хроматина. Открытая рамка считывания активно транскрибируемого гена гр49, кодирующего рибосомный белок, была обогащена НЗК4те2, в то время как обогащения три- и диметилированными по лизину 9 гистонами НЗ (НЗК9шеЗ/ше2) и гетерохроматиновым белком НР1 были незначительны (Рис. 7). Степень обогащения гистоном НЗК4те2 в гр49 была приблизительно одинакова в трансгетеро- и гетерозиготных линиях. Хроматин открытой рамки считывания гена light, расположенного в гетерохроматине, практически не был обогащен модификацией НЗК4те2, в то время как модификация НЗК9шеЗ и белок НР1 присутствовали здесь в значительном количестве (Рис. 7). Это характерно для большинства гетерохроматиновых генов, которые демонстрируют обратный эффект положения - для их транскрипции необходимо наличие модификаций, характерных для репрессированного состояния хроматина.

В последовательности теломерного элемента НеТ-А при мутации piwf, по сравнению с гетерозиготами, наблюдалось увеличение количества гистонов НЗК4те2 и уменьшение количества маркеров неактивного хроматина H3K9me3/me2 и НР1 (Рис. 7). В хроматине нетеломерных ретроэлементов HMS-Beagle, copia и MDG1 при мутации piwf происходило увеличение количества модификации НЗК4ше2, в то время как значительных изменений в уровнях H3K9me3/me2 и НР1 не наблюдалось (Рис. 7). В то же время, мутация piwiNl не приводила к заметным изменениям количества как гистоновых модификаций, так и белка НР1 в хроматине мобильного элемента Gate, несмотря на то, что этот транспозон дерепрессируется при мутации piwf согласно данным ОТ-ПЦР и РНК-гибридизации in situ.

В целом представленные данные показывают, что белок Piwi участвует в подавлении мобильных элементов за счет изменения структуры хроматина. Такая регуляция может осуществляться в результате узнавания комплементарных последовательностей генома или транскриптов, находящихся вблизи соответствующих локусов с помощью piPHK в составе комплексов с Piwi. Предположительно, Piwi может привлекать к соответствующему участку генома метилтрансферазы гистонов, осуществляющие ди- и три- метилирование остатка К9

гистона НЗ, что, в свою очередь, может способствовать привлечению белка НР1 к этим участкам хроматина. Увеличение уровня модификации НЗК4те2 в хроматине транспозонов при отсутствии Р1\У1 в клеточном ядре может объясняться увеличением количества транскрипционных комплексов. Однако такой способ регуляции, по-видимому, не является универсальным для всех типов мобильных элементов, и нельзя исключать существование альтернативных механизмов ядерного сайленсинга с помощью Ртоь

а ш о

>s ф

>s и

X ф

К4те2 К9те2 КЭтеЗ НР1

гр49

го

s IT

го со

s ц

го

5 а

К4те2 К9те2 КЭтеЗ НР1

НеТ-А

К4те2 К9ппе2 КЭтеЗ

HMS Beagle

К4те2 К9те2 КЭтеЗ

light

H !

К4те2 К9те2 КЭтеЗ

гп

ИЫ

НР1

К4те2 К9те2 КЭтеЗ НР1

Gate

НР1

1piwiNth

copia

К4те2 K9me2 КЭтеЗ HP1 MDG1

Рис. 6. Влияние мутации на структуру хроматина мобильных элементов.

Приведены обогащения последовательностей генов и мобильных элементов гистоновыми модификациями и белком НР1 в яичниках трансгетерозиготных мух р1м/12/рт1т (темные столбцы) и гетерозиготных особей рШм/+ (светлые столбцы), оцененные методом количественного ПЦР. Обогащения рассчитаны относительно межгенного спейсера из района 6(Ю.

выводы

1. Охарактеризована новая мутация в гене piwi, приводящая к образованию белка PiwiNt, укороченного с N-конца и лишенного сигнала ядерной локализации.

2. Мутанты piwiM сохраняют способность к самообновлению терминальных стволовых клеток, в отличие от нуль-мутантов piwi.

3. При мутации piwf наблюдается дерепрессия мобильных элементов в той же степени, что и при полном отсутствии Piwi. Таким образом, ядерная локализация Piwi необходима для сайленсинга мобильных элементов, но не для поддержания терминальных стволовых клеток, которое осуществляется с участием цитоплазматического Piwi.

4. Показано участие Piwi в формировании неактивной структуры хроматина мобильных элементов. Отсутствие ядерной локализации Piwi приводит к возрастанию маркера активного хроматина НЗК4ше2 для мобильных элементов НеТ-А, HMS-Beagle, copia и MDG1 и уменьшению количества маркеров неактивного хроматина H3K9me3/me2 и НР1 для ретротранспозона НеТ-А.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. М. С. Кленов, А. Д. Столяренко, С. С. Рязанский, О. А. Соколова, И. Н. Константинов, В. А. Гвоздев (2007) Роль коротких РНК в регуляции экспрессии генов и мобильных элементов в герминативных клетках. Онтогенез 38: 213-227.

2. Н. В. Рожков, А. А. Аравин, Р. Сачиданандам, Г. Дж. Хэнон, О. А. Соколова, Е. С. Зеленцова, Н. Г. Шостак, М. Б. Евгеньев (2010) Система РНК-интерференции отдельных видов дрозофилы по-разному реагирует на присутствие одного и того же мобильного элемента .Доклады Академии Наук 431: 411-413.

3. М. V. Kibanov, К. S. Egorova, S. S. Ryazansky, О. A. Sokolova, A. A. Kotov, О. М. Olenkina, A. D. Stolyarenko, V. A. Gvozdev, L. V. Olenina (2011) A novel organelle, the piNG-body, in the nuage of Drosophila male germ cells is associated with piRNA-mediated gene silencing. Molecular Biology of the Cell 22: 3410-3419.

4. О. А. Соколова, E. Ю. Якушев, А. Д. Столяренко, E. А. Михалева, В. А. Гвоздев, M. С. Кленов (2011) Взаимодействие генов, репрессирующих транспозоны в терминальных клетках Drosophila melanogaster. Молекулярная биология 45: 633-641.

5. М. S. Klenov, О. A. Sokolova, Е. Y. Yakushev, A. D Stolyarenko, Е. A. Mikhaleva, S. А. Lavrov, V. A. Gvozdev (2011). Separation of stem cell maintenance and transposon silencing functions ofPiwi protein. Proc Natl Acad Sci USA 108: 18760-18765.

Тезисы докладов на научных конференциях

1. М. S. Klenov, A. D. Stolyarenko, О. A. Sokolova, Е. Y. Yakushev, V. A. Gvozdev. Studies of mobile elements expression in Drosophila. International congress on Transposable elements. April 20-23, 2008. Saint-Malo, France. Abstracts book, p. 24.

2. О. А. Соколова, M. С. Кленов, В. А. Гвоздев. Исследование новых компонентов РНК-сайленсинга у D.melanogaster. XV Школа: «Актуальные проблемы биологии развития». 19-24 октября, 2008. Звенигород, Россия. Сборник тезисов, стр. 103.

3. О. A. Sokolova, М. S. Klenov, Е. Y. Yakushev, A. D. Stolyarenko, V. A. Gvozdev. Dissection of piRNA-mediated silencing of mobile elements in germinal and somatic cells of Drosophila ovaries. Keystone Symposia: «The Biology of RNA Silencing». April 25-30, 2009. Victoria, British Colambia, Canada. Abstract Book, p. 106.

4. О. А. Соколова, M. С. Кленов, E. Ю. Якушев, А. Д. Столяренко, В. А. Гвоздев. Системы РНК-сайленсинга мобильных элементов в терминальных и соматических клетках яичников. Пятный съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Ч.Дарвина. 21-28 июня, 2009. Москва, Россия. Сборник тезисов, стр. 383

5. О. A. Sokolova, М. S. Klenov, Е. Y. Yakushev, V. A. Gvozdev. RNA-silencing is universal molecular machine for maintenances of genome integrity. Второй Международный Форум по нанотехнологиям. 6-8 октября 2009. Москва, Россия.

6. О. А. Соколова, М. С.Кленов, Е. КХЯкушев, Е. А.Михалева, В. А.Гвоздев. Изучение функционирования ядерного белка Piwi в терминальных клетках. XVI Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра». 5-7 октября 2010. Санкт-Петербург, Россия. Сборник тезисов.

7. М. S. Klenov, О. A Sokolova, Е. Y Yakushev, A. D. Stolyarenko, V. A Gvozdev. Segregation of stem cell renewal and silencing functions of Piwi protein. 6th microsymposium on small RNAs, May 16-18,2011. Vienna, Austria. Abstract Book.

Заказ № 19-р/05/2013 Подписано в печать 15.05.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай:zak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколова, Олеся Александровна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ РОССИЙСКОЙ

АКАДЕМИИ НАУК

на правах рукописи

04201357915

СОКОЛОВА ОЛЕСЯ АЛЕКСАНДРОВНА ,

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ БЕЛКА РШ1В ПРОЦЕССАХ САМООБНОВЛЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И РЕПРЕССИИ МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ У

ВЯО$ОРШЪА МЕЬАМОвА8ТЕК

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель: к.б.н. М.С. Кленов научный консультант: д.б.н., акад. В.А. Гвоздев

МОСКВА-2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...................................................................................................5

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ..................................................................6

1.1 Актульность темы......................................................................................................6

1.2 Цели и задачи работы................................................................................................7

1.3 Научная новизна и практическая значимость работы............................................8

1.4 Апробация работы.....................................................................................................8

1.5 Объем диссертации....................................................................................................9

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................10

2.1 Развитие терминальных тканей у самок Drosophila.............................................10

2.1.1 Герминальные стволовые клетки..........................................................................10

2.1.2 Оогенез Drosophila...................................................................................................11

2.1.3 Регуляция генов, запускающих дифференцировку ГСК........................................13

2.1.4 Межклеточная адгезия в нише герминальных стволовых клеток.....................16

2.1.5 МикроРНК в нише герминальных клеток..............................................................18

2.2 Функции белков PIWI в развитии герминальных тканей Drosophila.................18

2.2.1 Роль белка Piwi в поддержании герминальных стволовых клеток Drosophila. 20

2.2.2 Роль белка Piwi в формировании герминальных клеток Drosophila...................21

2.3 piPHK-сайленсинг в яичниках Drosophila.............................................................22

2.3.1 Транскрипция piPHK-предшественников..............................................................26

2.3.2 Первичный процессинг.............................................................................................26

2.3.3 «Пинг-понговая» амплификационная петля..........................................................29

2.3.4 Нуаж - потенциальный сайт «пинг-понговой» амплификацииpiPHK.............30

2.3.5 Р-тельца....................................................................................................................33

2.3.6 piPHK и закладка полярности ооцита..................................................................34

2.4 Белки подсемейства PIWI у различных животных...............................................39

2.4.1 Mus musculus.............................................................................................................41

2.4.2 Danio rerio.................................................................................................................42

2.4.3 Caenorhabditis elegans.............................................................................................43

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................................44

3.1 Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе.................................44

3.2 Использованные праймеры.....................................................................................45

3.3 Получение лизатов для электрофореза и Вестерн-блот анализа.........................47

3.4 Электрофорез в денатурирующих условиях и Вестерн-блот анализ..................47

3.5 Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов целых яичников.................48

3.6 Конфокальная микроскопия...................................................................................49

3.7 Антитела...................................................................................................................49

3.8 Выделение тотальной РНК ОгояоркИа..................................................................50

3.9 Нозерн-блот гибридизация коротких молекул РНК.............................................50

3.10 Обратная транскрипция...........................................................................................52

3.11 Полуколичественный ПЦР......................................................................................52

3.12 Количественный ПЦР в реальном времени...........................................................53

3.13 Инверс-ПЦР..............................................................................................................53

3.14 Выделение геномной ДНК......................................................................................54

3.15 Выделение ДНК из легкоплавких агарозных гелей.............................................54

3.16 Гибридизация РНК ия'/м........................................................................................55

3.17 5'-КАСЕ анализ........................................................................................................56

3.18 Иммунопреципитация хроматина (СЫР)..............................................................57

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ............................................................................60

4.1 Характеристика мутации ..............................................................................60

4.2 Белок Р1\\а№ обеспечивает самообновление терминальных стволовых клеток.65

4.3 Яичники мутантной линии р1м>1ы' проявляют фенотип, характерный для мутантов р1РНК-пути.........................................................................................................68

4.4 Локализация транскрипта генартп в линии рг\\>1т..............................................71

4.5 Локализация белка Р1\у1 в мутантной линии р1м>1т...............................................72

4.6 Ядерная локализация необходима для подавления мобильных элементов... ....................................................................................................................................75

4.7 Взаимосвязь Р1ш1 с другими компонентами ргРНК-пути в процессе репрессии мобильных элементов в яичниках.....................................................................................81

4.8 Влияние системы р1РНК-сайленсинга на экспрессию чужеродного мобильного элемента...............................................................................................................................84

4.9 Влияние системы р1РНК-сайленсинга на экспрессию мобильного элемента Мйа зависит от его местоположения в геноме.............................................................86

4.10 Белок необходим для формирования неактивной структуры хроматина мобильных элементов в яичниках.....................................................................................87

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................................................91

6. ВЫВОДЫ........................................................................................................................93

7. ЛИТЕРАТУРА...............................................................................................................94

8. БЛАГОДАРНОСТИ....................................................................................................110

Список сокращений

ГСК - терминальные стволовые клетки ПГК - примордиальные терминальные клетки

piPHK - короткие РНК, взаимодействующие с белками подсемейства PIWI (PIWI interacting RNA)

РНП (RNP) - рибонуклеиновые частицы (ribonucleoprotein particles)

ЦОМТ - центр организации микротрубочек

НМТ - гистон метилтрансфераза (histone methyltransferase)

NLS - сигнал ядерной локализации (Nuclear Localization Signal)

Да (кДа) - дальтон (килодальтон)

SDS - додецилсульфат натрия

SDS-ПААГ - полиакриламидный гель с добавлением SDS

PBS - фосфатно-солевой буферный раствор

DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол

п.н. - пар нуклеотидов

т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

PVDF - поливинилиденфторид

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией HS - гибридизационный буфер

НЗК9ше2 - гистон НЗ, диметилированный по остатку лизина К9 НЗК9теЗ - гистон НЗ, триметилированный по остатку лизина К9 НЗК4те2 - гистон НЗ, диметилированный по остатку лизина К4

1. Общая характеристика работы 1.1 Актульность темы

Drosoph.Ua melanogaster относятся также белки АиЬ и А£оЗ. р1РНК у дрозофилы образуются из транскриптов гетерохроматиновых областей генома (р1РНК-кластеров), содержащих последовательности транспозонов. С помощью вспомогательных белков р1РНК загружаются в РНП-комплексы с белками Р1\\Т, которые взаимодействуют с транскриптами мобильных элементов или р!РНК-кластеров по принципу комплементарности, подавляя экспрессию транспозонов. Белок Р1у\т преимущественно локализуется в клеточных ядрах и подавляет мобильные элементы как в терминальных, так и в соматических клетках яичников, в отличие от белков АиЬ и А§о-3, которые функционируют только в цитоплазме терминальных клеток.

Непонятным остается механизм репрессии транспозонов с помощью Р1лу1, значение ядерной локализации этого белка и его роль в регуляции транскрипции и структуры хроматина. Неизвестно, каким образом белок влияет на процесс

поддержания терминальных стволовых клеток. Можно предположить, что нарушение поддержания стволовых клеток, наблюдаемое при отсутствии является

следствием дерепрессии мобильных элементов в клетках ниши. Также высказывались предположения, что с помощью р1РНК в ядрах клеток ниши может не только подавлять экспрессию мобильных элементов, но и стимулировать транскрипцию определенных генов, которые влияют на формирование сигнала, поддерживающего стволовые клетки. Возможно также, что Р1\у1 в клетках ниши имеет особую молекулярную функцию в процессе поддержания стволовых клеток, и эта функция не связана с р1РНК-сайленсингом.

1.2 Цели и задачи работы

Цель настоящей работы состояла в исследовании значения ядерной локализации белка в процессах поддержания терминальных стволовых клеток и сайленсинге транспозонов, а также механизма репрессии мобильных элементов с помощью в яичниках ВгоьорН 'йа melanogaser.

Работа включала следующие экспериментальные задачи:

• выявление молекулярной природы и фенотипических проявлений мутации р1 м>1М';

• исследование влияния мутации р1 м/Р' на процесс поддержания терминальных стволовых клеток;

• определение тканевой и внутриклеточной локализации мутантного белка Р1\у1№;

• исследование р1РНК-зависимого подавления мобильных элементов в различных типах клеток яичников Вго$орЫ1а и влияния мутации рЫпш на этот процесс;

• изучение влияния Piwi на структуру хроматина мобильных элементов в яичниках

Drosophila.

1.3 Научная новизна и практическая значимость работы

Охарактеризована новая мутация в гене piwi, приводящая к образованию белка, лишенного сигнала ядерной локализации. Показано, что белок Piwi, находящийся в цитоплазме, способен обеспечивать обновление и поддержание терминальных стволовых клеток, но полностью теряет способность к подавлению мобильных элементов. Таким образом, впервые показано, что эти две функции белка Piwi являются независимыми. В ходе работы установлено, что сайленсинг с помощью белка Piwi осуществляется в ядрах терминальных клеток и связан с модификациями хроматина. Отсутствие ядерной локализации Piwi приводит к возрастанию уровня гистона НЗ диметилированного по лизину в положении 4 (НЗК4ше2) в хроматине мобильных элементов НеТ-А, HMS-Beagle, copia и MDG1 и уменьшению количества маркеров неактивного хроматина (НЗК9шеЗ/ше2 и НР1) в хроматине ретротранспозона НеТ-А.

1.4 Апробация работы

1.5 Объем диссертации

Материал диссертации изложен на 110 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков и 1 таблицу. Список цитированной литературы состоит из 194 работ.

2. Обзор литературы 2.1 Развитие терминальных тканей у самок Drosophila

2.1.1 Герминальные стволовые клетки

У самцов и самок животных герминальные стволовые клетки (ГСК) являются предшественниками гамет. ГСК располагаются в яичниках и семенниках и находятся в специальном микроокружении - нише стволовых клеток, - которое обеспечивают соматические поддерживающие клетки. В этой нише ГСК самообновляются для поддержания своей популяции, а также производят дифференцирующиеся герминальные клетки, которые покидают нишу. Эти дочерние клетки обычно претерпевают несколько циклов митотических делений, после чего вступают в мейоз и далее дифференцируются в зрелые гаметы (Kimble 2011). Сестринские клетки, являющиеся потомком одной стволовой клетки, образуют цисту терминальных клеток, которые развиваются синхронно (Greenbaum et al. 2011). Клетки в составе цисты соединены цитоплазматическими мостиками - фъюзомами, - что является консервативной чертой митотических делений терминальных клеток.

Коммуникация между терминальными стволовыми клетками и специализированными соматическими клетками играет важную роль как в поддержании стволовых клеток, их пролиферации и дифференцировке, так и в образовании ГСК из примордиальных терминальных клеток (ПГК) в гонадах. ГСК -это единственные стволовые клетки, передающие геном будущему поколению организмов; обычно они унипотентны и производят только дифференцирующиеся гаметы. Механизмы контроля делений ГСК существенно различаются между полами (Spradling et al. 2011).

Стволовые клетки терминальной линии являются одним из наиболее хорошо изученных типов взрослых стволовых клеток (особенно у Drosophila и Caenorhabditis elegans) и важной моделью исследования стволовой клетки in vivo. Характерными чертами взрослых стволовых клеток являются унипотенциальное, но относительно недифференцированное состояние и способность продуцировать как новые стволовые клетки (самообновление), так и дифференцирующееся потомство. Стволовые клетки отвечают за длительное поддержание и восстановление тканей, содержащих высокоспециализированные короткоживущие клетки, таких как кровь, кожа, эпителий кишечника и др. Дифференцированные клетки многих других тканей, включая молочные железы, легкие, скелетную мускулатуру, мочевой пузырь и предстательную

железу, также развиваются из стволовых клеток в ответ на физиологические сигналы или повреждения. Механизмы, регулирующие самообновление стволовых клеток и пролиферацию и дифференцировку их потомства, являются ключом к применению стволовых клеток в регенерационной медицине и к пониманию происхождения злокачественных опухолей. Многие виды рака затрагивают стволовые клетки, а накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что нарушения механизмов регуляции самообновления, пролиферации и дифференцировки стволовых клеток способствуют канцерогенезу (Spradling et al. 2011). Таким образом, изучение влияния локального микроокружения ниши стволовых клеток на самообновление и дифференцировку стволовых клеток терминальной линии имеет важное значение для фундаментальной биологии и медицины.

2.1.2 Оогенез Drosophila

У самок Drosophila в яичниках присутствует по 30-40 индивидуальных овариол,

на переднем конце которых расположен гермарий, содержащий 2-3 активные

терминальные стволовые клетки (рис. 1). Ниши появляются в яичниках ближе к концу

личиночной стадии, и в

Информация о работе

Соколова, Олеся Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Изучение роли белка Piwi в процессах самообновления стволовых клеток и репрессии мобильных элементов у Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изучение роли белка Piwi в процессах самообновления стволовых клеток и репрессии мобильных элементов у Drosophila melanogaster - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы