Изучение регуляции транскрипции генов бактериофагов во время инфекции хозяйской клетки

Климук, Евгений Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение регуляции транскрипции генов бактериофагов во время инфекции хозяйской клетки
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение регуляции транскрипции генов бактериофагов во время инфекции хозяйской клетки"

на правах рукописи

КЛИМУК ЕВГЕНИЙ ИВАНОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ БАКТЕРИОФАГОВ ВО ВРЕМЯ ИНФЕКЦИИ ХОЗЯЙСКОЙ

КЛЕТКИ

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 ЯНВ 2013

МОСКВА-2013

005048743

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Северинов Константин Викторович доктор биологических наук, профессор Гельфавд Михаил Сергеевич

Официальные оппоненты: Мирошников Константин Анатольевич,

кандидат биологических наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)

Четверина Елена Владимировна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка Российской академии наук (ИБ РАН)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИВФМ РАН)

Защита диссертации состоится "12" февраля 2013 г. в 11 час.00 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: г. Москва, ул. Вавилова дом 34/5, первый этаж.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН).

Автореферат разослан января 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук

Грабовская Любовь Сергеевна

Актуальность проблемы Различные литические бактериофаги в ходе своего развития в клетке бактерии-хозяина используют сходную стратегию развития. После проникновения в клетку фаговые белки выключают экспрессию бактериальных генов и запускают программу развития, которая включает несколько стадий, связанных с последовательной активацией и/или репрессией экспрессии временных классов генов фага. В регуляции транскрипции может быть задействовано как факторы, модифицирующие фермент транскрипции - РНК-полимеразу (РНКГГ) клетки-хозяина, так и РНКП, закодированные в геноме бактериофага. Детальное изучение конкретных каскадов регуляции в процессе инфекции различными бактериофагами позволит расширить наши представления как о механизмах временной регуляции экспрессии генов в целом и механизмах регуляции процесса транскрипции, так и о более общих процессах взаимодействия вирусов с клетками.

Цели работы Задача данной работы заключалась в исследовании механизмов регуляции транскрипции генов в ходе развития бактериофага Т5 Escherichia coli и phiKMV-подобных бактериофагов бактерий рода Pseudomonas.

В литическом цикле развития фага Т5 можно выделить три класса генов, различающихся по времени транскрипции: предранний, ранний и поздний. Транскрипция всех временных классов генов происходит с сильных а70"промоторов одним и тем же холоферментом РНКП. В связи с этим встает вопрос какие механизмы лежат в основе репрессии одних генов и активации других. На основании имеющихся данных можно предполагать, что они отличаются от тех механизмов, которые используют известные на сегодняшний день фаги, однако конкретные механизмы остаются неизвестны. В ходе работы предполагалось идентифицировать такие механизмы.

phiKMV-подобные фаги входят в суперсемейство Т7-подобных бактериофагов, для которых характерно наличие закодированной в геноме собственной односубъединичной РНКП. Для осуществления общей для суперсемейства стратегии развития Т7-подобным фагам необходимо наличие ингибиторов хозяйской РНКП. Для phiKMV-подобных бактериофагов таких ингибиторов известно не было и целью данной работы было идентифицировать и охарактеризовать фаговые ингибиторы РНКП бактерии-хозяина.

Научная новпзиа На классической модели бактериофага Т5 обнаружены десятки промоторов, принадлежащих к различным временным классам экспрессии генов бактериофага Т5 - предранним, ранним и поздним с максимальным уровнем транскрипции на 3-7 мин, 7-20 мин и 15-45 мин после заражения, соответственно. Биоинформатическим анализом в ранних промоторах выявлен мотив в «-10» элементе, который может быть ответственным за регуляцию ранней транскрипции.

Обнаружен новый белок, связанный с РНК-полимеразой в Т5-инфицированных клетках, продукт гена Т5.026 (gp26). Локализован участок РНКП Е. coli, с которым происходит связывание gp26. Показано значение gp26 для развития бактериофага Т5 - амбер-мутация в гене Т5.026 приводит к изменению профиля транскрипции и задержке развития фага.

Предсказаны ортологи ингибитора хозяйской РНКП - белка gp2 фага Т7 у нескольких phiKMV-подобных фагов: у LUZ19 - gp25.1, LKD16 - gp25.b, LUZ19 - gp25.1, у LKA1 -gp36. С целью проверки функциональной активности этих белков проведено клонирование кодирующих их генов в экспрессионные вектора. Протестирована способность gp2-подобных белков из phiKMV-подобных фагов взаимодействовать с РНКП Pseudomonas и Е. coli, а также с мутантами, у которых отсутствует участок взаимодействия с gp2. Показано, что несмотря на низкий уровень аминокислотного сходства идентифицированные белки phiKMV-подобных фагов действительно являются функциональными аналогами белка gp2 фага Т7.

Практическая значимость работы Полученные в работе результаты имеют в основном фундаментальное значение, однако некоторые из них могут найти и практическое применение. Изучение регуляции экспрессии генов бактериофагов во время их развития в клетке-хозяине расширяет наши представления о способах подавления жизнедеятельности бактериальных клеток, в частности за счет ингибирования транскрипции. В дальнейшем эти

знания могут быть использованы для создания противобактериальных препаратов, мишенью которых является бактериальная РНКГТ

Публикации и апробация работы Работа прошла апробацию на межлабораторных семинарах в МГУ им М.В. Ломоносова и Институте биологии гена РАН. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, включая 2 статьи в международных рецензируемых журналах. Результаты работы были представлены на 6 международных конференциях, в том числе на двух тематических международных конференциях "Viruses of Microbes" в разные годы и на FEMS конгрессе 2011 года.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения результатов и их обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков. Список литературы включает 122 источника.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛТДОВЛШШ IIIIX ОБСУ7КДЕ1 HIE

1. Подтверждение функциональной активности in vivo промоторов фага TS, выявленных в искусственных системах.

Ранее в опытах in vitro в предранней области генома бактериофага Т5 было идентифицировано два промотора - Pd/e2o и Ршг1. Еще несколько промоторов (перед генами hegG и Т5.011) были предсказаны биоинформатически. Для подтверждения этих предсказаний и картирования новых промоторов фага мы провели ряд экспериментов по определению 5'-концов вирусных мРНК, выделенных из клеток во время инфекции бактериофагом Т5, методом удлинения праймера с олигонуклеотидов-затравок 1-6 (рисунок 1Б). Для этого 5 мкг тотальной РНК инкубировали с 32Р-меченным по 5'-концу праймером в присутствии обратной транскриптазы. ПЦР-фрагмент, содержащий предполагаемую стартовую точку транскрипции, секвенировали с того же праймера, с которым проводили реакцию обратной транскрипции. Продукты обратной транскрипции и секвенирующих реакций анализировали электрофорезом в денатурирующих гелях с последующей визуализацией с помощью фосфоимиджера. В качестве примера на рисунке 1А представлены результаты определения 5'-концов мРНК Т5 с праймеров 1 и 3. Всего же было выявлено и картировано 7 5'-концов, часть из которых соответствует стартовым точкам транскрипции с предсказанных ранее промоторов. При множественном выравнивании нуклеотидных последовательностей, расположенных выше выявленных 5'-концов Т5 мРНК, нам не удалось выявить консервативных последовательностей. На основании этого нами был сделан вывод о том, что часть выявленных 5'-концов образовалась в результате процессинга и не соответствует стартовым точкам транскрипции.

С целью выявления точек начала транскрипции нами был использован метод "5'-RACE". Чтобы выявить точку начала транскрипции этим методом одна часть проб, содержащих мРНК, обрабатывается пирофосфатазой, а другая - нет. Затем обе пробы подвергаются лигированию с последующими обратной транскрипцией и ПЦР. Если 5'-конец РНК образовался в результате процессинга, то количество полученных продуктов в пробах, обработанных и необработанных пирофосфатазой, не будет различаться. В идеальном случае для истинной точки старта транскрипции в пробе, необработанной пирофосфатазой, не должно быть продукта. Однако в клетке происходит пирофосфоролиз, в результате которого трифосфаты, находящиеся на стартовом основании части РНК, преобразуются в монофосфаты. В связи с этим в пробах, необработанных пирофосфатазой табака, также наблюдаются продукты амплификации. Однако, количество этих продуктов в пробах, обработанных пирофосфатазой, увеличено. Использование этого подхода позволило нам показать, что промоторы Ртз и Р0ц функционируют in vivo (рисунок 1В). Интересно, что имеются жизнеспособные делеционные мутанты фага Т5, у которых отсутствует участок, содержащий промотор Pim. По-видимому, в этих случаях функционирует промотор Pd/eio.

Использование метода удлинения праймера позволило нам показать функциональную активность in vivo ряда ранних промоторов. Среди них промоторы перед генами pol, Т5.086, Т5.047, Т5.084, Т5.076, RNAX и phoH. Нами также идентифицированы поздние промоторы перед генами Т5.139, С1 и N4.

Следующим шагом работы было исследование временной динамики активности идентифицированных промоторов in vivo (рисунок 2А). С этой целью выделяли суммарную РНК из клеток, находящихся на разных стадиях инфекции Т5. Активность промоторов определяли методом удлинения праймера. Как видно из рисунка 2 этим методом удается надежно идентифицировать промоторы, соответствующие трем ранее определенным временным классам генов фага, которые исторически были названы предранние, ранние и поздние.

1 Gentz R, Bujard H. Promoters recognized by Escherichia coli RNA polymerase selected by function: highly efficient promoters from bacteriophage T5. J Bacteriol. 1985 C)ct;164(l):70-77.

А в А Т С бАТ С

; 1

б'-АОТТСбСОССАТАТААСбАТТААСАТТАТСТТЛА-З б-ТАбСССАТАСССТГГААСАТСТАСССАСТТССАТ-З'

Роео1

, 1 Г,

г-

- предсказанные промотор — -праймер

«5 №6 007 008 00» 010

^ - еьявпенный 5'-конец - открытая рамка считьеания

012 0!; 014 015 016 I

- терминатор

ТАР-шслая пирофосфатаза табака. М-маркер весов

Рисунок 1. Определение 5'-концов предранних мРНК. А. Выявление 5'-концов мРНК методом удлинения праймера. Представлены радиоавтографы гелей, на которых рядом нанесены продукты реакций секвенирования (¿АТС) и удлинения праймера. Под радиоавтографами приведены последовательности с указанием расположения 5'-конца РНК. Б. Схематическое представление всех выявленных нами 5'-концов предранних мРНК Т5. В. Выявление стартовых точек транскрипции Т5 методом "5'-ЛАСЕ" (описание в тексте).

Практически сразу после инфекции начинается транскрипция с предраннего промотора РН22 (продукты транскрипции идентифицируются с праймеров 1 и 3). Продукты предранней транскрипции сохраняются на протяжении всей инфекции. Для того чтобы ответить на вопрос отражает ли такая динамика предранних продуктов активность промотора РН22 или изменение стабильности этих транскриптов в ходе инфекции, на 5 минуте инфекции к клеткам был добавлен антибиотик рифампицин и проведен анализ изменений количеств предранних РНК на более поздних стадиях инфекции. Рифампицин блокирует транскрипцию бактериальной РНКП, что позволяет оценить скорость деградации предранних транскриптов в процессе инфекции. Из сравнения результатов, представленных на рисунке 2А и 2Б, видно что временная динамика предранних транскриптов не зависит от добавления рифампицина. На основании этих результатов можно сделать вывод о том, что после 5 минуты инфекции транскрипция предранних генов прекращается.

Через несколько минут после начала транскрипции предранних генов появляются ранние транскрипты, а затем и поздние. Ранее предполагали, что транскрипция с промотора перед геном СУ происходит на ранней стадии. Однако, из представленных на рисунке 2 результатов видно, что транскрипция этого гена, а также расположенного за ним гена лизоцима, происходит на поздней стадии инфекции.

А 0' 5' 10' 15' 20' 30' 40' 45' Б о' 5' 10' 15' 20' 30' 40'

ш <■» я» <ш ш — phoH

Ш Ш! ЯШ ШК -ш Ж "Ш ^ | «аи, -К 4- 1

«I • • 1

*...... pol •

я!- ÜÜI в®1 вШ 0Ш 3 . ш ^ * — 3

•• кш in Ü 139

:>.*,. , • - 016

* ' щ * *—

, С1

Рисунок 2. Анализ транскрипции генов разных временных классов фага TS методом удлинения праймера. А. Анализ количества фаговых мРНК, соответствующих предранним (1, 3), ранним (phoH, pol, 076) и поздним (139, N4, С1) генам, на разных стадиях инфекции. Б. Временная динамика разрушения продуктов предранних генов (1, 3) после добавления рифампицина на 5 минуте инфекции.

2. Биоинформатический анализ последовательностей промоторов Т5, принадлежащих к разным временным классам.

С целью выявления консервативных последовательностей в обнаруженных промоторах фага проводили их множественное выравнивание. Как уже было сказано ранее, нами обнаружено только 2 предранних промотора. Этого количества недостаточно для проведения статистического анализа промоторных последовательностей. Можно лишь утверждать, что они содержат «-10» и «-35»-элементы, характерные для сильных а70-промоторов. Кроме того присутствует аденин-богатая последовательность, расположенная левее «-35»-элемента.

Из результатов множественного выравнивания промоторных последовательностей ранних генов видно, что, для всех этих промоторов также характерно присутствие «-10» и «-35»-элементов и аденин-богатая последовательность, расположенная «левее» «-35»-элемента (рисунок ЗА). Кроме того, в промоторах генов pol и phoH присутствует "удлиненная" (extended) последовательность -10-области TGnTATAAT (где п - любой нуклеотид). Интересно, что «правее» -10-элемента все выявленные ранние промоторы содержат идентичную последовательность 5'-АТАТТ-3\ Возможно, именно эта последовательность необходима для ко-регуляции включения-выключения транскрипции ранних генов.

При множественном выравнивании последовательностей поздних промоторов были обнаружены лишь «-10» и «35»-элементы промотора, а также аденин-богатая последовательность левее «^»-последовательности (рисунок ЗБ).

pol

ичь

о:ь

RHÄ-K phoK

«-35»злемент

«-Южэлемент

---ÎPGATACGŒSAGCAAAÂCGTAÏ'

—rTGCÄGCüSGGICGASÄMÄli

XS'ZGÄCTGGGCtoÄrrrTTGTaÄT

-rCGGTTTA-CEÄGXTTCÄCAÄTT

T3SGÄTTTTCCB--CTSÄÄÄÄGI1.

—crrGATTGC^AGG5AG2TTT2C

-AATCCAATATCA-TAGGCTTÄTT

«-35»-элемент

«-10»-элемент

139 N4

Рисунок 3. Выравнивание промоторов разных временных классов фага Т5. А. Множественное выравнивание нукпеотидных последовательностей промоторов ранних генов, выполненное в программе GENEDOC. Б. Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей промоторов поздних генов, выполненное в программе GENEDOC.

3. Определение влияния мутаций в генах D5, D15 и С2 фага Т5 на транскрипцию генов разных временных классов.

Согласно результатам ранних работ мутации в генах D5, D15 и С2 приводят к изменению количества поздних генов2-3-4. В связи с этим предполагалось, что белки, кодируемые этими генами, влияют на транскрипцию поздних генов. Долго считалось, что ген С2 кодирует 90 кДа белок, связанный с РНКП во время инфекции, т.к. этот белок не детектировался в клетках, зараженных фагом с амбер-мутацией в гене С2. Однако сегодня, когда известна последовательность не только фага Т5 дикого типа, но и многих мутантных фагов, показано, что эта мутация находится в гене, кодирующем маленький белок размером 30 кДа. Аминокислотная последовательность этого белка гомологична фосфатазам. Этот ген является важным, так как фаги с мутацией в этом гене не образуют вирионов, однако этот дефект не связан с нарушением транскрипции генов фага, т.к. при сравнении профилей транскрипции генов разных временных классов фага с мутацией в гене С2 и фага дикого типа существенной разницы не наблюдается (данные не представлены).

Нами проведен анализ транскрипции фага, мутантного по гену D5. Продукт этого гена присутствует в инфицированных клетках в большом количестве и обладает неспецифической ДНК-связывающей активностью. Показано, что этот белок участвует в репликации ДНК. Существенного влияния на транскрипцию генов разных временных классов фага отсутствие белка D5 не оказывает (данные не представлены).

Продукт гена D15 является 5'-3'-экзонуклеазой, которая участвует в репликации генома фага Т5. В результате проведенного нами анализа транскрипции в клетках, зараженных фагом с мутацией в гене D15, существенных отличий от транскрипции в клетках, зараженных фагом дикого типа также не выявлено.

Chinnadurai, G. & McCorquodale, D. J. (1974). Dual role of gene D5 in the development of bacteriophage T5. Nature 247, 554-6.

Chinnadurai, G. & McCorquodale, D. J. (1973). Requirement of a phage-induced 5'-exonuclease for the expression of late genes of bacteriophage T5. Proc Natl Acad Sei U S A 70, 3502-5.

Szabo, C., Dharmgrongartama, B. & Moyer, R. W. (1975). The regulation of transcription in bacteriophage T5-infected Escherichia coli. Biochemistry 14, 989-97.

Таким образом, продукты генов D5, D15 и С2 не оказывают существенного влияния на транскрипцию фага Т5, по крайней мере по отдельности.

4. Определение влияния мутаций в генах Л1 и Л2 фага Т5 на транскрипцию генов разных временных классов.

Нами исследовано влияние мутации в предраннем гене А1 на транскрипцию фага Т5. В ранних работах было показано, что продукт этого гена - gpAl вовлечен в ряд процессов в ходе развития фага Т5. Этот белок необходим для инъекции второй части ДНК фага (SST-ДНК) в зараженную клетку, он участвует в деградации внутриклеточной ДНК и ингибирует синтез предранних белков3,6. На рисунке 4 представлены результаты исследования влияния мутации в гене А1 на транскрипцию предранних и ранних генов. Как видно, в отсутствие этого белка РНК ранних и поздних генов не наблюдается, что согласуется с тем, что gpAl необходим для инъекции SST-ДНК, которая кодирует гены, принадлежащие к этим временным классам. С другой стороны, при инфекции в отсутствии этого белка наблюдается накопление мРНК предранних генов в количествах, значительно превышающих те, что наблюдаются в ходе инфекции фагом дикого типа. На основании этих результатов можно сделать два предположения о механизме регуляции транскрипции фага. Одно из них заключается в том, что при введении SST-ДНК возможно происходит пассивное перераспределение РНКП с предранних на ранние промоторы. Это может быть следствием того, что количество ранних промоторов по крайней мере в десять раз больше количества предранних промоторов, а последовательности ранних промоторов содержат «-10-» и «-35»-элементы промотора, более близкие консенсусной последовательности сигма 70-промоторов. Второе предположение заключается в том, что gpAl может напрямую ингибировать транскрипцию предранних генов.

А Б

О' 5' 15' 25' 40' 5' 15' 25' 40'

*• «4Ш9*-1

v • iMpe 6

pol —»I

б—1

Рисунок 4. Анализ транскрипции в ходе инфекции фагом Т5 дикого типа (А) и фагом с мутацией в гене А1 (Б) методом удлинения праймера. Представлены радиоавтографы гелей, на которых нанесены продукты реакций удлинения гтраимера, соответствующие предранним (I, 6), ранним (ро!) и поздним (N4) промоторам. Инфицированные фагом Т5 клетки для выделения тотальной РНК отобраны на временных точках, отмеченных в верхней части рисунка.

5 Lanni, Y. T. (1968). First-step-transfer deoxyribonucleic acid of bacteriophage T5. Bacterid Rev 32, 227-42.

6 McCorquodale DJ, Lanni YT. (1970). Patterns of protein synthesis in Escherichia coli infected by amber mutants in the first-step-transfer DNA of T5. J Mol Biol. 48, 133-143.

Мы также исследовали влияние мутации в гене А2 на транскрипцию Т5. Продукт этого гена {%рА2), также как gpAl необходим для введения БЭТ-ДИК. Существуют также данные о том, что эти два белка взаимодействуют друг с другом, и что §рА2 обладает ДНК-связывающей активностью. Как видно из результатов, представленных на рисунке 5, в отсутствие gpA2 наблюдаемый профиль транскрипции очень похож на картину, наблюдаемую в клетках, инфицированных фагом с мутацией в гене А1. Во-первых, не происходит синтез ранних транскриптов и во-вторых, наблюдается накопление продуктов транскрипции предранних генов. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что оба белка gpAl и gpA2 необходимы для выключения транскрипции предранних генов.

А Б

О' 5' 15' 25' 40' 5' 15' 25' 40'

Рисунок 5. Анализ транскрипции фага Т5 дикого типа (А) и фага Т5 с мутацией в гене А2 (Б) методом удлинения праймера. Представлены радиоавтографы гелей, на которых нанесены продукты реакций удлинения праймера, соответствующие предранним (1, 6), ранним (076) промоторам. Инфицированные фагом Т5 клетки для выделения тотальной РНК отобраны на временных точках, отмеченных в верхней части рисунка.

5. Выявление и идентификация белков, связанных с кор-ферментом РНКП в инфицированных фагом Т5 клетках

Регуляция транскрипции часто осуществляется с помощью белковых факторов, взаимодействующих с РНКП. С целью выявления таких транскрипционных факторов, кодируемых фагом Т5, нами были получены препараты РНКП из неинфицированных клеток, а также из клеток, собранных на 3, 15 и 25 минутах после инфекции (рисунок 6). Было выявлено 3 белка (обозначены на рисунке цифрами 1, 2 и 3), которые присутствовали только в препаратах РНКП, выделенных из инфицированных фагом клеток.

Белки 1, 2 и 3 были идентифицированы масс-спектрометрическим анализом как продукты генов А1, Э20-21 и Т5.026, соответственно. Белок gpAl упоминался выше. Он ранее обнаруживался в препаратах РНКП, выделенных из зараженных фагом клеток, и ему приписывают множество различных функций от деградации геномной ДНК клетки-хозяина до регуляции экспрессии ранних белков фага Т5. Продукт гена 020-21 - это основной белок головки рЬ8, представленный самым большим числом копий (730) в вирионе. Маловероятно, чтобы этот белок выступал и в качестве транскрипционного регулятора. Скорее всего, рЬ8 неспецифически совыделяется с РНКП. Данных о gpT5.026 и его роли в развитии фага не имеется.

кДа время инфекции (мин)

О 3 15 25 О 3 15 25

Рисунок 6. Выделение РНКП на разных стадиях инфекции Е. соН /' бактериофагом Т5. Анализ препаратов РНКП проводили электрофорезом в 10% (А) и 17% (Б) ПААГ в денатурирующих условиях с последующим окрашиванием Кумасси 0-250 Белки, которые присутствуют только в препаратах РНКП из инфицированных клеток, показаны стрелками с номерами 1,2,3 справа от рисунка. Слева рисунка указаны молекулярные массы белков-маркеров, справа - субъединицы РНКП.

6. Взаимодействие gpT5.026 с кор-ферментом РНКП

Взаимодействие gpT5.026 с кор-ферментом РНКП было подтверждено дот-фар-вестерн-анализом. С этой целью ген Т5.026 был клонирован в экспрессионный вектор и получен очищенный препарат этого белка с сайтом для ,2Р-мечения белковой киназой А. Кор-ферменты РНКП из клеток Е. coli, Thermus thermophilus и Pseudomonas aeruginosa PAOl наносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали с 32Р-меченым gpT5.026. Как видно из результатов, представленных на рисунке 7, этот белок взаимодействует только с кор-ферментом РНКП из клеток Е. coli. Для того чтобы установить с какой из субъединиц РНКП осуществляется взаимодействие, 32Р-меченый gpT5.026 предварительно инкубировали с 10-кратным молярным избытком (5- или Р'-субъединиц Е. coli, а затем с иммобилизованными РНКП на мембранах. Значительное уменьшение радиоактивного сигнала наблюдалось только при инкубации с р-субъединицей (рисунок 7).

Ее. T.th. РА01

32Р-др26

32Р-др26 + р

32Р-др26 + р'

Рисунок 7. Анализ взаимодействия gpT5.026 с кор-ферментом РНКП методом «дот-фар-вестерн».

Мембраны, содержащие кор-фермент РНКП Е. coli (Е. е.), Т. thermophilus (Т. tin.) и Pseudomonas aeruginosa PAOl (PAOl) инкубировали только с 32Р-меченым gpT5.026 (32P-gpT5.026), а также в присутствие ß (32Р-

gpT5.026 + ß) или ß'-субъединиц (32P-gpT5.026 + ß') РНКП E. coli. Визуализацию результатов проводили радиоавтографией с помощью фосфоимиджера.

По-видимому, gpT5.026 связывается с ß-субъединицей, что делает его недоступным для взаимодействия с кор-ферментом РНКП, иммобилизованным на мембране.

7. Локализация мест взаимодействия gpT5.026 с кор-ферментом РНКП Е. coli

Места связывания gpT5.026 с субъединицами кор-фермента РНКП выявляли с помощью бактериальной двухгибридной системы. В этих экспериментах нами были использованы две совместимые плазмиды, одна из которых (pBRaLN-gpT5.026) кодирует N-концевой домен и линкер а-субъединицы РНКП Е. coli, слитый в одной рамке с gpT5.026. В составе другой плазмиды закодирован полноразмерный белок CI (регулятор транскрипции фага А,), который был слит с рядом фрагментов ß, ß' или а-субъединиц. Гибридные белки совместно экспрессировали в штамме Е. coli, содержащем эписому F' с репортерньш геном lacZ под контролем /ас-промотора и оператора 0L2 фага X. Гибрид из а-субъединицы и gpT5.026 входит в состав холофермента РНКП, а гибридный белок из CI и фрагмента субъединиц связывается с оператором Ol2. Взаимодействие между gpT5.026 и одним из фрагментов субъединиц способствует привлечению РНКП к /ас-промотору, что приводит к увеличению экспрессии гена ß-галактозидазы. Из гистограммы, представленной на рисунке

8, видно, что увеличение активности ß-галактозидазы наблюдается только при слиянии белка CI с некоторыми фрагментами ß-субъединицы, что подтверждает данные дот-фар-вестерн-анализа о взаимодействии gpT5.026 с этой субъединицей. Активность ß-галактозидазы увеличивается в присутствии плазмиды, кодирующей гибрид белка CI с 1-151 аминокислотными остатками (а. о.) ß-субъединицы. Увеличение фрагмента ß-субъединицы до 235 а. о. приводит к дальнейшему увеличению экспрессии ß-галактозидазы, тогда как его усечение с N-конца (а. о. 151-451) приводит к падению активности до фонового уровня. В связи с этим можно предположить, что gpT5.026 контактирует с аминокислотами ß-субъединицы в составе фрагмента 1-151, а присутствие дополнительных аминокислот (до 235) способствует более правильному сворачиванию соответствующего участка ß-субъединицы. Другой участок взаимодействия находится в центральной части молекулы (а. о. 703-795). Расширение указанного фрагмента в сторону N- и С-концов приводит к падению активности ß-галактозидазы (650-950 а. о. и 665-798 а. о.). Это можно объяснить тем, что участок взаимодействия gpT5.026 с ß-субъединицей оказывается экранирован в составе более крупных фрагментов.

2. 450 о

Рисунок 8. Выявление участков взаимодействия йрТ5.026 с субъединицами РНКП Е. соИ с помощью бактериальной двухгибридной системы. Активность |3-галактозидазы измеряли в экстрактах клеток,

содержащих гибридные белки. Эксперимент проведен в трех повторах. Фоновый уровень равен 100 ед. Миллера.

Таким образом, на основании представленных выше данных можно заключить, что gpT5.026 связывается с (3-субъединицей РНКГТ в двух участках 1-151 и 703-795. Интересно, что будучи удаленными друг от друга в первичной последовательности, эти участки расположены рядом в третичной структуре (рисунок 9).

Рисунок 9. Предполагаемое место связывания gpT5.026 с холоферментом РНКП. Кристаллическая структура холофермента РНКП Thermus aquaticus с ДНК с разрешением 6.5А°. ß', две а и ю-субъединицы опущены из структуры для лучшего восприятия. Нематричная и матричная цепи ДНК окрашены соответственно в голубой и красный цвета, сигма-субъединица - в розовый цвет (районы 1.2 и 3.1 выделены соответственно бледно- и темно-розовым); ß - в голубой цвет (1 - 151 а.о. (1-142 а.о. в Taq ß-субъединице) и 703-795 а.о. (582-667 а.о. в Taq ß-субъединице) выделены соответственно бледно- и темно-голубым цветом).

8. Влияние gpT5.026 на взаимодействие РНКП с промотором

Как было показано выше, gpT5.026 связывается с РНКП Е. coli. На основании этих результатов можно было предположить, что этот белок мог бы влиять на синтез РНК в ходе развития фага Т5. С целью проверки этого предположения нами было проверено влияние этого белка на транскрипцию in vitro с охарактеризованных промоторов AI фага Т7 и ггпВ PI. Однако gpT5.026 не влиял на транскрипцию с этих промоторов (данные не представлены). Кроме того, нами было также проверено влияние gpT5.026 на транскрипцию in vitro с промоторов фага Т5, относящихся к разным временным классам. В этих экспериментах нами также не было выявлено существенного эффекта. Тот факт, что gpT5.026 не оказывает видимого влияния на транскрипцию in vitro, согласуется с местом его

связывания на РНКП - на внешней стороне вдали от каталитического центра фермента. Участок р-субъединицы, с которым связывается gpT5.026, также удален от ДНК и от районов а70-субъединицы, участвующих во взаимодействии с основными промоторными элементами. С другой стороны в холоферменте РНКП участок связывания gpT5.026 находится вблизи участка 3.1 а™-субъединицы, который хоть и не оказывает прямого влияния на взаимодействие РНКП холофермента с промоторной ДНК, может модулировать взаимодействие РНКП с некоторыми промоторами.

Для выявления более тонких эффектов gpT5.026 нами был использован более чувствительный метод молекулярных маячков ("beacon assay"), недавно разработанный в нашей лаборатории. Этот метод использует о70-субъединицу, флуоресцентно меченую в районе 2.3, расположенном вблизи участка, участвующего в узнавании «-10»-элемента промотора. РНКП, содержащая меченую субъединицу, обладает незначительной способностью к флуоресценции, так как ароматические аминокислоты самой о70-субъединицы гасят сигнал. После взаимодействия такой РНКП с «-10»-элементом промотора происходит значительное увеличение флуоресцентного сигнала, так как разрушаются связи, гасящие флуоресценцию. Этот подход позволяет как оценить константу связывания лиганда с РНКП, так и установить элемент промотора («-10», «-35»-элементом или дискриминаторным участком) на взаимодействие с которым влияет изучаемый лиганд или транскрипционный фактор. В этих экспериментах мы использовали олигонуклеотид 5'-TATAATAGATTCAT-3', последовательность которого соответствует позициям с «-12» по «+2» нематричной цепи раннего промотора N25 фага Т5. Как показано на рисунке 10 gpT5.026 уменьшает сродство РНКП к этому олигонуклеотиду в 8 раз. В то же время gpT5.026 не оказывал влияния на связывание более короткого фрагмента ДНК, соответствующего положениям от «-12» до «-6» нематричной цепи промотора. Из этих результатов следует, что gpT5.026 уменьшает эффективность взаимодействия РНКП с одноцепочечным участком промотора, содержащим последовательность от -5 до +2 (этот район промотора носит название "дискриминатор" и важен для активности ряда клеточных промоторов).

Ингибирование связывания олигонуклеотида «-12/+2» может быть использовано для оценки константы диссоциации (Кд) gpT5.026 с РНКП. С этой целью проводили измерение интенсивности флуоресценции 1 нМ РНКП в присутствии 300 нМ олигонуклеотида без gpT5.026 и при добавлении 100 нМ, 20 нМ и 5 нМ gpT5.026. Как видно из результатов, представленных на рисунке 11, интенсивность сигнала достигает равновесного значения через 3 часа независимо от концентрации gpT5.026. Это означает, что 5 нМ концентрация gpT5.026 достаточна для полного насыщения РНКП. На основании этих результатов можно предположить, что gpT5.026 образует очень прочные комплексы с РНКП, характеризующиеся Кд менее 1 нМ.

2 -

-12 +2 ТАТААТАбАТТСАТ

■К (Р!МАР) = 0.16 цМ

С|

' М(РЗЫАР-др0.26) = 1.2 цМ

Олигонуклеотид (рМ)

Рисунок 10. Анализ влияния gpT5.026 на взаимодействие РНКП с модельным фрагментом промотора.

Титрование [211Цис-ТМК]-а70-холофермента и комплекса этого холофермента с ¡*рТ5.026 олигонуклеотидом «-12/+2». Соотношение флюоресценции в присутствии олигонуклеотида и без него отложено по оси ординат, концентрация олигонуклеотида — по оси абсцисс.

(РНКП + 0,3 мкМ «-12/+2») + дрТ5.026 5нМ дрТ5.026

100 нМ дрТ5.026

КМАР-др0.26

100 800 1200 Время (с)

■ //■ 1600 10800

Рисунок 11. Количественная оценка взаимодействия gpT5.026 с РНКП. Титрование [21 ЩИс-ТМЯ]- а70-холофермента с олигонуклеотидом «-12/+2» возрастающими концентрациями gpT5.026. Количество флюоресценции в присутствии разных концентраций §рТ5.026 отложено по оси ординат, время реакции в секундах — по оси абсцисс.

9. Роль gpT5.026 в регуляции транскрипции in vivo и развитии фага.

Для выяснения роли gpT5.026 в регуляции транскрипции in vivo нами получен амбер-мутант фага Т5 по гену Т5.026 ('Т5атТ5.02б). На первом этапе был исследован одиночный инфекционный цикл («one-step growth») этого мутанта в сравнении с фагом дикого типа. Из графиков, представленных на рисунке 12, видно, что латентный период во обоих случаях составляет около 50 минут, но выход частиц фага Т5атТ5.026 происходит медленнее. Количество фаговых частиц (ф.ч.), вышедших из одной инфицированной клетки («burst size»), в случае амбер-мутанта в 5 раз меньше (24 ф.ч.), чем у фага дикого типа (120 ф.ч.).

0,1"' 35

минуты инфекции

Рисунок 12. Одиночный цикл развития фагов TS и Т5атТ5.026. Культуру клеток Б. coli JF238 инфицировали фагами Т5 и Т5атТ5.026, образцы зараженных культур отбирали в указанные времена после начала инфекции и высевали в мягкий агар для определения количества инфекционных центров (ИЦ). По оси ординат приведено отношение количества ИЦ на соответствующей минуте инфекции к количеству ИЦ на 40 минуте инфекции. Количество ИЦ остается постоянным до 40 минуты (данные не представлены). Эксперимент повторяли три раза. Непрерывной и пунктирной линиями изображено изменение относительного количества ИЦ в ходе инфекции соответственно фагами Т5 и Т5атТ5.02б.

Транскрипционную активность Т5 промоторов в ходе развития бактериофагов дикого типа и мутанта оценивали с помощью метода удлинения праймера. С этой целью были выбраны несколько из ранее описанных промоторов фага. В экспериментах в одной реакционной смеси присутствовало шесть 32Р-меченых праймеров, позволяющих следить за мРНК, синтезируемых с шести отдельных промоторов. Из сравнения транскрипционных профилей фагов Т5 и Т5атТ5.026 видно, что в отсутствие gpT5.026 уровень транскрипции с ранних промоторов Pi5A и Рр0] существенно увеличивается (рисунок 13). Менее значительные изменения наблюдаются также в активности промоторов других временных классов: транскрипция с предранних промоторов Рп и Ртг - увеличивается, тогда как с поздних PG2s и Pis - уменьшается в несколько раз. Таким образом, присутствие gpT5.026 понижает транскрипцию ранних и, в меньшей степени, предранних генов и, в то же время, стимулирует синтез поздних транскриптов.

In vitro gpT5.026 не влиял на активность холофермента РНКП с указанных промоторов фага. Можно предположить, что для действия gpT5.026 необходимы другие фаговые и/или бактериальные белки, топология ДНК, или условия среды, отличающихся от стандартных условий in vitro транскрипции. Несмотря на то, что последствия делеции гена Т5.026 относительно невелики, они высоко воспроизводимы. Возможно именно понижение уровня

транскрипции поздних генов и приводят к существенному падению количества фаговых частиц, образующихся в ходе инфекции мутантным фагом.

Фаг TSivf Т5 атП.026

Минуты после ин фекции 0 5 15 20 30 40 50 5 15 20 30 40 50

Р,22 m ШФ ipil. # «жи т ш К

РрЫ * Ш! .iljfe Ш. Í ж ■ЩЖ; л

р„ ► >а щ - Ж •а »

— щ é im т

р* — « 1 Шi Ф •

Рисунок 13. Анализ транскрипции фагов Т5 и Т5атТ5.026 in vivo. РНК выделяли из неинфицированных (0) и инфицированных клеток на 5, 15, 20, 30, 40 и 50 минутах после инфекции. Выявление транскриптов с промоторов разных временных классов проводили методом удлинения праймера в мультиплексном режиме с использованием смеси 32Р-меченых праймеров. Продукты реакций разделяли в 6% денатурирующем ПААГе с последующей визуализацией с помощью фосфоимиджера. Продукты реакции удлинения праймера указаны стрелками с обозначением промотора, с которого был синтезирован соответствующий транскрипт.

10. Идентификация белков, кодируемых phiKMV-подобными бактериофагами, связывающимися с РНК-полимеразами бактерий-хозяев.

Многие бактериофаги кодируют факторы, ингибирующие активность бактериальной РНКП. В таком случае, в геноме бактериофага должны быть свои гены, продукты которых будут способны осуществлять транскрипцию генов бактериофага. К таким фагам относятся фаги обширной группы Т7-подобных фагов, входящих в семейство Podoviridae Основополагающим признаком этой группы является наличие Т7-подобной РНКП, закодированной в геноме бактериофага. Среди фагов этой группы выделяют несколько подгрупп или родов близкородственных вирусов, например, XplO-, N4-, phiKMV-подобных фагов, а также Т7-подобных фагов sensu stricto. Т7 и phiKMV - подобные роды близки друг другу и относятся к одному подсемейству Autographivirinae. Фаг N4 использует хозяйскую РНКП на поздней стадии инфекции, что отличает его от других Т7-подобных фагов. Его особенностью является также то, что он кодирует две собственные РНКП. Фаги Т7 и phiKMV используют хозяйскую РНКП на начальных этапах инфекции и кодируют только одну собственную РНКП.

На ранней стадии инфекции фага Т7 хозяйская РНКП транскрибирует ранние вирусные гены, среди которых находится и ген вирусной РНКП (Т7РНКП). Транскрипция средних и поздних генов осуществляется Т7РНКП. Очевидно, что необходимы механизмы, которые предотвращали бы взаимное влияние хозяйской и вирусной РНКП. В противном случае, например, более медленно движущаяся РНКП бактерии тормозила бы транскрипцию вирусной РНКП. Паузирование Т7РНКП, вызванное столкновениями с хозяйской РНКП

также может приводить к неправильной инициации упаковки вирусных геномов, которое в норме происходит в специальных местах остановки транскрипции вирусным ферментом. Одним из первых продуктов средних генов бактериофага Т7 и его ближайших родственников (например, ТЗ) является белок gp2, который связывается с хозяйской РНКГТ и эффективно ингибирует ее активность. На сегодняшний день известно, что gp2 связывается с районом "челюсть" ß'-субъединицы РНКП и ингибирует формирование открытых комплексов с промоторной ДНК. Показано, что существенную роль в ингибировании играют семь отрицательно-заряженных аминокислот, которые образуют своего рода тяж на одной из сторон gp2. Ген, кодирующий gp2, является существенным для развития фага: при его отсутствии нарушается упаковка геномной ДНК фага в частицы за счет индуцированного паузирования Т7РНКП, упомянутого выше. Биологически значимая роль Т7 gp2 сводится к ингибированию транскрипции только с одного из трех ранних промоторов фага - промотора A3.

В группу phiKMV - подобных фагов в настоящее время входят phiKMV, LUZ19, LKD16, LUZ19, РТ2, РТ5, LKA1 и phi2, инфицирующие различные штаммы бактерий рода Pseudomonas, а также фаг КР34 Klebsiella pneumoniaea. Эта группа фагов известна относительно недавно: геном фага phiKMV - первого представителя этой группы - был определен в 2003 году, а КР34 - только в 2011. Организация генома поздних генов phiKMV-подобных фагов очень похожа на организацию соответствующих генов фага Т7. Среди ранних и средних генов, однако, наблюдаются значительные различия. В частности, если ген РНКП у фага Т7 находится в области ранних генов, то у phiKMV и близких фагов - среди средних генов (рисунок 14). Тем не менее, логично было предположить, что при развитии phiKMV-подобных фагов также необходимо предотвратить транскрипцию хозяйской РНКП с ранних фаговых промоторов, т.е. можно ожидать наличие кодируемых этими фагами ингибиторов хозяйской РНКП. Однако, явных гомологов белка gp2 в геномах phiKMV-подобных фагов обнаружить до сих пор не удавалось.

5kb ЮкЬ 15кЬ 20kÖ 25кЬ ЗОкЬ 35кЬ 40kb

wmmmm,

- фаговая РНКП

- белки репликации

j - промоторы фаговой РНКП

- др2-подобные белки

- структурные белки

Рисунок 14. Сравнение организации геномов phiKMV-подобных и Т7-подобных фагов.

В конце 2011 года был опубликован геном бактериофага Pseudomonas phil5, который содержит аннотированный гомолог белка gp2 фага Т7, ингибирующего хозяйскую РНКП. Анализ генома phil5 показывает, что этот фаг относится к собственно Т7 фагам, а не к

phiKMV-подобным фагам. Интересно, что если в качестве основы для биоинформатического поиска гомологичных белков использовать §р2-подобный белок из фага phil5, то удается обнаружить несколько потенциальных гомологов у представителей phiKMV-подобных фагов: у LUZ 19 - gp25.1, LKD16 - gp25.b, LUZ 19 - gp25.1, PT2 и PT5 - gp25.1, LKA1 - gp36 (Рисунок 16).

(др2э. 15KSKICWCTRFHEr¡¡EGVRVIWAFLiERGIGVNYVTAYI™?AJF.'SHR2KSDVIL£riLP£^^^

MECISC.R,,,. • . у-^ИЛ. 1

A A ^

(CÍA) (C7A)

Рисунок 15. Множественное выравнивание последовательности Т7 gp2 с возможными гомологами из подгруппы phiKMV-подобных фагов. Последовательность Т7 gp2 представлена в верхней части, гомологичные последовательности из фагов (названия указаны слева) под ней. Выравнивание сделано с использованием программного обеспечения GENEDOC. Интенсивность фона соответствует степени консервативности. Для гомологов из LUZ19 и LKA1, стрелки указывают позиции, с которых начинаются короткие версии этих белков (см. текст). Также обозначены положение амбер-кодона в удлиненной версии gp25.1, и мест аминокислотных замен в цистеинах N-концевой части gp36 (см. текст ниже).

11. Проверка функциональной активности gp2-пoдoбныx белков phiKMV-подобных фагов in vivo.

Все различающиеся потенциальные гомологи Т7 gp2 были клонированы в вектор рЕТ19 под контроль промотора Т7 РНК-полимеразы. Полученные генетические конструкции были протестированы на способность комплементировать амбер-мутацию в гене 2 фага 11. Как известно, бактериофаг Т7 с амбер-мутацией в гене 2 не образует бляшек на газонах клеток Е. coli MG1655 дикого типа из-за сильно сниженного количества вирулентных дочерних частиц (Таблица 1). Мутантный фаг образует нормальные бляшки на газонах с клетками амбер-супрессорного штамма Е. coli IJ5I1 (Таблица 1). Если клетки Е. coli MG1655 содержат копии гена 2 фага Т7 на плазмиде (например, рЕТ19), формируются бляшки нормального размера (Таблица 1). Супрессия происходит за счет того, что T7 РНКП, произведенная на ранней стадии инфекции, транскрибирует плазмидный ген, в результате чего синтезируется недостающий gp2, который ингибирует клеточную РНКП и обеспечивает продуктивную инфекцию

Штамм, формирующий газон E.O.P Размер негативных колоний

IJ511 (Sil) Í -M-+

MG 1655 (wt) 0 -

MG 1655 + pET33-gp2 (T7) -1 +++

MG 1655 + pET19-gpl6 (phi 15) -1 +++

MG 1655 + pET19-gp25b (LKD16) 1 +++

MG1655 + pET19-gp25.1 (LUZ 19) -M-+

MG 1655 + pET19-gp25.1 short (LUZ 19) +++

MG1655 + pET19-gp25.1 SC (LUZ 19) 0 -

MG1655 + pET19-gp36 (LKA1) 0 -

MG1655 + pET19-gp36short (LKA1) -0.5 +

MG 1655 + pET19-gp36 C4A (LKA1) -0.5 +

MGI 655 + pET19-gp36 C7A (LKA1) -0.5 +

MG 1655 + pET19-gp36 C4AC7A (LKA1) -0.5 +

Таблица 1. Комплементация ампер-мутации в гене 2 бактериофага Т7 закодированными на плазмцдах Т7 gp2 и gp2-nojo6HUMii белками phiKMV-подобиых бактериофагов. Около 200 бляшкообразующих единиц амбер-муганта Т7 по гену 2 высевали на газон с разными штаммами Е. coli, содержащих указанные плазмиды (колонка 1), затем после роста в течение ночи при комнатной температуре фиксировали количество (колонка 2) и размер (колонка 3) фаговых бляшек. "-" Указывает на отсутствие видимых бляшек,"+" означает, что бляшки менее 1 мм в диаметре, "+ + +" означает, что бляшки диаметром более 3 мм.

Результаты, представленные в Таблице 1, показывают, что клетки, несущие плазмиду с генами, гомологичными гену 2 из фага Т7, из фагов phi 15, LKD16 и LUZ19, но не из LKA1, обеспечивают рост мутантного фага. Результаты таким образом показывают, что продукты этих генов из фагов phi 15, LKD16 и LUZ19 могут выступать в качестве ингибиторов РНКП Е. coli. Результат с белком из фага phi 15 предсказуем, так как этот белок очень похож на gp2-подобный белок из фага gh-1, ингибирующее действие которого было показано в нашей лаборатории ранее. Результаты с белками фагов LKD16 и LUZ19 дают основание полагать, что фаги подгруппы phiKMV также кодируют ингибитор хозяйской РНКП. Этот вывод, однако, не согласуется с тем, что белок gp36 фага LKA1, который, безусловно, гомологичен белкам фагов LUZ19 и LKD16, не комплементирует дефект Т7 мутанта. Анализ последовательности белка gp36 из фага LKA1 показывает наличие короткого N-концевого участка, который отсутствует в других белках этой группы. Мы предположили, что этот дополнительный участок может влиять на способность С-концевой части белка ингибировать РНКП бактерии-хозяина. Чтобы проверить это предположение, была создана плазмида рЕТ19, экспрессирующая укороченный вариант gp36 (начинается с метионина, соответствующего Leu 16 в полной копии белка). Клетки, содержавшие такую плазмиду частично комплементировали отсутствие gp2 фага Т7 (амбер мутант по гену 2 фага Т7 образовывал бляшки <1 мм в диаметре по сравнению с > 3 мм в диаметре для бляшек, которые образуются в клетках, экспрессирующих Т7 gp2). Анализ N-концевого домена gp36 выявил четыре остатка цистеина, которые могли бы связывать ионы металла, формируя структуру типа, цинкового пальца, который может взаимодействовать с ДНК и таким образом участвовать в регуляции транскрипции. Для проверки важности N-концевых цистеиновых остатков были созданы плазмиды, экспрессирующие версии gp36 с заменами остатков цистеина на аланин (С4А, С7А и двойной мутант С4А С7А) и проведены комплементационные тесты (Таблица 1). Как видно, клетки, несущие мутантный gp36 комплементируют мутацию в гене 2 фага Т7 в той же степени, как и клетки, экспрессирующие усеченный вариант белка. Таким образом, можно сделать вывод, что N-концевой домен gp36 модулирует его способность ингибировать хозяйскую РНКП и эта модуляция, возможно, зависит от способности gp36 хелатировать ионы металлов.

Если N-концевой домен влияет на способность белка gp36 ингибировать бактериальную РНКП, то необходимо обратить внимание на N-концевой часть gp25.1 из фага LUZ19, которая гораздо длиннее, чем у gp36. Не исключено, что наблюдаемая нами полная комплементация при использовании клеток, экспрессирующих gp25.1, вызвана синтезом более короткого белка, который может синтезироваться с внутреннего сайта инициации трансляции. Действительно, клетки несущие плазмиду с С-концевой частью gp25.1 ("gp25.1 короткий", аминокислоты 60-121) в полной мере комплементирует рост мутантного по гену 2 фага Т7 (Таблица 1). Для определения того, является ли краткий вариант gp25.1 действительно ответственным за комплементацию развития мутантного фага Т7 в клетках, содержащий плазмиду для экспрессии полной версии белка gp25.1, была создана плазмида, содержащая полную рамку считывание гена 29 LUZ19 и амбер-кодон вместо кодона 59. Стоп-кодон должен предотвратить синтез длинного полипептида gp25.1, но не должен оказывать влияния на синтез короткой версии белка, если такая версия существует. Как видно из Таблицы 1, наличие такой плазмиды не комплементирует рост мутантного фага Т7. Таким образом, именно полная версия gp25.1 ответственна за наблюдаемую комплементацию. Результат также указывает, что несмотря на свою значительную длину, N-концевая часть gp25.1 сама по себе не влияет на способность

ингибировать хозяйскую РНКГТ. Это соображение подтверждает идею о том, что модуляция ингибирующего действия gp36 происходит именно за счет образования специальной структуры, для поддержания которой необходимы остатки цистеина.

12. Функциональная активность gp2-noflo6Hbix белков phiKMV-подобных фагов in vitro.

Результаты экспериментов in vivo подтверждают биоинформатическое предсказание гомологии белков phiKMV-подобных бактериофагов белку gp2 фага Т7. Однако, комплементация роста амбер-мутанта фага Т7 по гену 2 может быть достигнута добавлением любого ингибитора хозяйской РНКП в конце ранней стадии инфекции, поэтому ингибирование хозяйской РНКП белками из phiKMV-подобных бактериофагов может происходить по механизму, отличному от механизма ингибирования РНКП белком gp2. Для проверки механизма ингибирования белками из phiKMV-подобных бактериофагов было протестировано влияние очищенных препаратов этих белков на реакцию абортивной инициации транскрипции, катализируемой РНКП Е. coli или Р. aeruginosa (рисунок 16).

2 3 4 5 6 7

47 97

ТФ дрзб дрЗб short дрЗб С4А

РНКП: ТФ 2 " j " i Ü 2 JO -

100 97 ЮТ

l 2 3 4 5 6 7 8

с I I

iO in if) If) £ СО

СО О) О) О) О) о. 1

ТФ др25 1 др25.1 short

РНКП: ТФ • * :о

Срдри-* % * • * CpApU-> т

%А I® 5 Ю S 49 9 93 3 100 93 S3 6 41 7 4

Рисунок 16. Ингибирование транскрипции белком gp2 фага Т7 и белками phiKMV-подобных бактериофагов. Кор-ферменты РНКП Е. coli (А) или PAOl (Б) преинкубировапи в течение 10 минут при 37 °С в присутствии Е. coli с70-субъединицы и 5-кратного избытка указанных фаговых белков. После этого в реакционную смесь добавляли фрагмент ДНК, содержащий промотор Т7 А1, и субстраты для инициации абортивной транскрипции (СрА и Y^-UTP). Реакционную смесь наносили на денатурирующий ПААГ. Остаточная активность РНКП указана снизу в % (100% - активность в отсутствии фаговых белков). На панелях В и Г представлены результаты ингибирования фаговыми белками при повышении их концентрации в реакционной смеси. Условия проведения реакции и анализ полученных результатов проводили, как описано выше.

Полученные результаты, представленные на рисунке 16, можно резюмировать следующим образом. Во-первых, gp2 фага Т7 эффективно ингибирует транскрипцию, осуществляемую и РНКП Е. coli, и РНКП P. aeruginosa PAOl (рисунок 16 АБ, дорожки 1 и 2). gp25 фага LKD16, а также короткие версии белков gp25.1 (фаг LUZ19) и gp36 (LKA1) эффективно (менее 10% остаточной активности) ингибируют транскрипцию, осуществляемую РНКП РАО1 (рисунок 16Б, дорожки 4, 6 и 8, соответственно). Эти белки оказались менее эффективными ингибиторами РНКП Е. coli (> 30% остаточной активности, рисунок 16А), что согласуется с уже опубликованными данными, полученными с гомологом gp2 из фага ghl, который взаимодействует с РНКП Pseudomonas сильнее, чем с ферментом из Е. coli. В условиях проведения эксперимента длинные версии белков gp25.1 и gp36 не ингибируют РНКП Е. coli (рисунок 16А, 5 и 7 дорожки, соответственно), но частично ингибируют РНКП PAOl. Несколько неожиданно, что gpl6 (фаг phil5), который наиболее

похож на gp2 фага Т7, относительно слабо ингибирует обе РНКП (рисунок 16 АБ, дорожка

3).

При более высоких концентрациях полноразмерного gp25.1 было достигнуто полное ингибирование РНКП PAOl (рисунок 16В). Увеличение концентрации полноразмерного gp36 до 50-кратного избытка над РНКП не приводило к заметному ингибированию транскрипции (рисунок 16Г). При этом короткая версия gp36, а также С4А мутант были активными.

Чтобы доказать, что gp2-noflo6Hbie белки из phiKMV-подобных бактериофагов связываются с тем же участком РНКП, что и gp2, была получена версия белка gp25 (фаг LKD16), содержащая сайт для протеин-киназы А на N-конце. Связывание gp25 с РНКП PAOl подтверждается образованием малоподвижной радиоактивно меченной полоски при анализе реакционной смеси, содержащей радиоактивно меченный gp25 и РНКП PAOl при помощи не денатурирующего ПААГ (рисунок 17, полоса 2). Подобный продукт не образуется, если реакционная смесь содержит только радиоактивно меченный gp25 (дорожка 1). Если в реакционную смесь помимо gp25 и РНКП PAOl добавить 5-кратный избыток немеченных gp2-noflo6Hbix белков, ингибирующих эту РНКП в реакции инициации абортивной транскрипции (Т7 gp2, phi 15 gpl6, или LKD16 gp25), то количество малоподвижного комплекса уменьшается и снова появляется радиоактивная полоса, соответствующая несвязанному белку gp25 (дорожки 3-5, соответственно). Этот результат показывает, что связывание этих трех белков происходит в одном месте, так как они конкурируют друг с другом. В условиях эксперимента, полноразмерные gp25.1 и gp36 неспособны конкурировать с радиоактивно меченным gp25 (дорожки 6 и 8, соответственно), что согласуется с результатами по ингибированию абортивной транскрипции in vitro. Однако, короткие версии этих белков способны вытеснять меченный gp25 из комплексов с РНКП не хуже, чем Т7 gp2, phil5 gpl6, или LKD16 gp25 (дорожки 7 и 9). В связи с этим, мы делаем вывод, что gp2-noflo6Hbie белки из phiKMV-подобных бактериофагов связываются с РНКП в том же месте, что и gp2 бактериофага Т7.

■с о

«Р.др25-Ео':

СО Ю -г- СМ

СП CT) Ю CD

СП СП О) О) О) О) С»

«м» —- im* *»»> шЛ «Í

»P-SP25 (Щ

lane 1 23456789

Рисунок 17. Связывание §р2-подобных белков с РНКП PAOl. 12Р-меченый gp25 (дорожка 1) разгоняли на ПААГ в нативных условиях в присутствии РНКП P. aeruginosa PAOl (дорожки 2-9). В дорожках 3-9 нанесены реакционные смеси, содержащие обозначенные в верхней части рисунка немеченные фаговые белки в 5-кратном избытке по отношению к 32Р-меченному gp25.

выводы

1) Показана функциональная активность in vivo трех временных классов промоторов бактериофага Т5. Идентифицировано два промотора, активных на предранней стадии инфекционного цикла, восемь ранних промоторов и три поздних промотора. Показано, что ранние промоторы бактериофага Т5 содержат идентичную последовательность 5'-АТАТТ-3' между «-10»-элементом и стартовой точкой транскрипции.

2) Показано, что мутации в генах D5, D15 и С2 бактериофага Т5 не влияют на профиль транскрипции генов фага. Продукты генов Al и А2 необходимы для ингибирования транскрипции предранних генов.

3) В препаратах РНКП, выделенных из клеток, инфицированных фагом Т5, обнаружен белок gpT5.026. GpT5.026 прочно связывается с РНКП Е. coli (Кд < 1 нМ). Взаимодействие с РНКП происходит за счет связывания с участками ß-субъединицы, расположенными между аминокислотными остатками 1-151 и 703-795. GpT5.026 ингибирует взаимодействие о70-холофермента РНКП с дискриминаторным участком промотора. В ходе инфекции gpT5.026 необходим для оптимального ингибирования транскрипции ранних и, в меньшей степени, предранних генов и стимуляции синтеза поздних транскриптов.

4) У phiKMV-подобных бактериофагов Pseudomonas биоинформатически предсказаны гомологи ингибитора бактериальной РНКП - белка gp2 бактериофага Т7. Функциональный анализ in vivo и in vitro подтвердил гомологию gp2-noflo6Hbix белков phiKMV-подобных бактериофагов и белка gp2 бактериофага Т7.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Тезисы конференций:

1) Климук Е.И. Изучение регуляции экспрессии генов бактериофагов E.coli Т5 и phiEco32 для поиска антибактериальных препаратов. Научно-техническая конференция «Биотехнологические аспекты фундаментальной науки. БиоНаноскопия». УРАН ИБГ РАН, Москва 2010.

2) Е. Klimuk, N. Akulenko and К. Severinov. Regulation of gene expression of bacteriophage T5 revisited. International conference "Viruses of Microbes", 2010, Paris, France.

3) E. Klimuk, N. Akulenko and K. Severinov. Regulation of gene expression of bacteriophage T5. International conference "Microbial Viruses: Genomics, Evolution and Applications in Ecology, Biotechnology and Medicine", 2011, Belfast, UK.

4) E. Klimuk, N. Akulenko and K. Severinov. Regulation of gene expression of bacteriophage T5. FEMS Congress'll, 2011, Geneva, Switzerland.

5) E. Klimuk, N. Akulenko, K. Makarova, K. Severinov. Identification and characterization of host RNA polymerase inhibitors encoded by phages of phiKMV-group. International conference "Viruses of Microbes", 2012, Brussels, Belgium.

6) E. Klimuk, K. Severinov. Identification and characterization of host RNA polymerase inhibitors encoded by phages of phiKMV-group. International conference "Postgenome 2012", 2012, Kazan, Russia.

Публикации в журналах:

7) Pavlova, О., Lavysh, D., Klimuk, E., Djordjevic, M., Ravcheev, D. A., Gelfand, M. S., Severinov, K., Akulenko, N., Temporal regulation of gene expression of the Escherichia coli bacteriophage phiEco32. J Mol Biol, 2012. 416(3): p. 389-99.

8) Evgeny Klimuk, Natalia Akulenko, Kira S Makarova, Pieter-Jan Ceyssens, Ivan Volchenkov, Rob Lavigne, Konstantin Severinov. Host RNA polymerase inhibitors encoded by phiKMV-like phages of Pseudomonas. Virology 436 (2013), pp. 67-74

Подписано в печать: 11.01.2013 Объем: 1,0 п л. Тираж: 100 экз. Заказ № 19 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Климук, Евгений Иванович

Обозначения и сокращения.

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы.

Цели работы.

Научная новизна.

Практическая значимость работы.

Публикации и апробация работы.

Литературный обзор.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Климук, Евгений Иванович

Выводы

3) В препаратах РНКП, выделенных из клеток, инфицированных фагом Т5, обнаружен белок gp26. gp26 прочно связывается с РНКП Е. coli (Кд < 1 нМ). Взаимодействие с РНКП происходит за счет связывания с участками ß-субъединицы, расположенными между аминокислотными остатками 1-151 и 703-795. gp26 ингибирует взаимодействие о70-холофермента РНКП с дискриминаторным участком промотора. В ходе инфекции gp26 необходим для оптимального ингибирования транскрипции ранних и, в меньшей степени, предранних генов и стимуляции синтеза поздних транскриптов.

4) У фКМУ-подобных бактериофагов Pseudomonas биоинформатически предсказаны гомологи ингибитора бактериальной РНКП - белка gp2 бактериофага Т7. Функциональный анализ in vivo и in vitro подтвердил гомологию gp2-noflo6Hbix белков фКМУ-подобных бактериофагов и белка gp2 бактериофага Т7.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Тезисы конференций:

1) Климук Е И Изучение регуляции экспрессии генов бактериофагов Е coli Т5 и phiEco32 для поиска антибактериальных препаратов Научно-техническая конференция «Биотехнологические аспекты фундаментальной науки БиоНаноскопия» УРАН ИБГ РАН, Москва 2010

2) Е Klimuk, N Akulenko and К Sevennov Regulation of gene expression of bacteriophage T5 revisited International conference "Viruses of Microbes", 2010, Pans, France

3) E Klimuk, N Akulenko and К Sevennov Regulation of gene expression of bacteriophage T5 International conference "Microbial Viruses Genomics, Evolution and Applications in Ecology, Biotechnology and Medicine", 2011, Belfast, UK

4) E Klimuk, N Akulenko and К Sevennov Regulation of gene expression of bacteriophage T5 FEMS Congress'11, 2011, Geneva, Switzerland

5) E Klimuk, N Akulenko, К Makarova, К Sevennov Identification and characterization of host RNA polymerase inhibitors encoded by phages of phiKMV-group International conference "Viruses of Microbes", 2012, Brussels, Belgium

6) E Klimuk, К Sevennov Identification and characterization of host RNA polymerase inhibitors encoded by phages of phiKMV-group International conference "Postgenome 2012", 2012, Kazan, Russia

Публикации в журналах:

7) Pavlova, О , Lavysh, D , Klimuk, E , Djordjevic, M , Ravcheev, D A , Gelfand, M S , Sevennov, К , Akulenko, N , Temporal regulation of gene expression of the Escherichia coli bacteriophage phiEco32 J Mol Biol, 2012 416(3) p 389-99

8) Evgeny Klimuk, Natalia Akulenko, Kira S Makarova, Pieter-Jan Ceyssens, Ivan Volchenkov, Rob Lavigne, Konstantin Sevennov Host RNA polymerase inhibitors encoded by phiKMV-like phages of Pseudomonas Virology 436 (2013), pp 67-74

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Климук, Евгений Иванович, Москва

1. Borukhov, S, and Nudler, E (2008) RNA polymerase the vehicle of transcription

2. Trends Microbiol 16, 126-134

3. McClure, WR (1985) Mechanism and control of transcription initiation in prokaryotes Annu Rev Biochem 54, 171-204

4. Gross, C A , Chan, C , Dombroski, A , Gruber, T , Sharp, M, Tupy, J , and Young, B1998) The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription Cold Spring Harb Symp Quant Biol 63, 141-155

5. Harley, CB, and Reynolds, R.P (1987) Analysis of E coli promoter sequences Nucleic Acids Res 15, 2343-2361

6. Ross, W , Gosink, K K , Salomon, J , Igarashi, K , Zou, C , Ishihama, A , Sevennov, K ,and Gourse, RL (1993) A third recognition element in bacterial promoters DNA binding by the alpha subunit of RNA polymerase Science 262, 1407-1413

7. Estrem, ST, Gaal, T, Ross, W, and Gourse, RL (1998) Identification of an UPelement consensus sequence for bacterial promoters Proc Natl Acad Sci U S A 95, 9761-9766

8. Barne, K A , Bown, J A , Busby, S J , and Minchin, S D (1997) Region 2 5 of the

9. Escherichia coli RNA polymerase sigma70 subunit is responsible for the recognition of the 'extended-10' motif at promoters EMBO J 16, 4034-4040

10. Dombroski, A J , Walter, W A , Record, M T , Jr, Siegele, D A , and Gross, C A1992) Polypeptides containing highly conserved regions of transcription initiation factor sigma 70 exhibit specificity of binding to promoter DNA Cell 70, 501-512

11. Nechaev, S, and Sevennov, K (2003) Bactenophage-induced modifications of host

12. RNA polymerase Annu Rev Microbiol 57, 301-322

13. Molmeux, I J 2006 The T7 group In "The Bacteriophages" R Calendar (Ed) Oxford University Press, NY Chap 20 pp 277-301

14. Garcia, L R and I J Molineux, 1995 Rate of translocation of bacteriophage T7 DNA across the membranes of Escherichia coli J Bacterid 177(14) p 4066-76

15. Kemp, P , L R Garcia, and I J Molineux, 2005 Changes in bacteriophage T7 virion structure at the initiation of infection Virology 340(2) p 307-17

16. Kemp, P, M Gupta, and I J Molineux, 2004 Bacteriophage T7 DNA ejection into cells is initiated by an enzyme-like mechanism Mol Microbiol 53(4) p 1251-65

17. Mark, KK and FW Studier, 1981 Purification of the gene 0 3 protein of bacteriophage T7, an inhibitor of the DNA restriction system of Escherichia coli J Biol Chem 256(5) p 2573-8

18. Studier, FW, 1975 Gene 0 3 of bacteriophage T7 acts to overcome the DNA restriction system of the host J Mol Biol 94(2) p 283-95

19. Walkinshaw, MD, Taylor, P, Sturrock, SS, Atanasiu, C, Berge, T, Henderson, RM , Edwardson, J M , Dryden, D T , 2002 Structure of Oer from bacteriophage T7, a protein that mimics B-form DNA Mol Cell 9(1) p 187-94

20. Sevennova, E, and Sevennov, K (2006) Localization of the Escherichia coli RNA polymerase beta' subunit residue phosphorylated by bacteriophage T7 kinase GpO 7 J Bacterid 188,3470-3476

21. Hesselbach, B A , and Nakada, D (1975) Inactive complex formation between E coli RNA polymerase and inhibitor protein purified from T7 phage infected cells Nature 258, 354-357

22. Nechaev, S, and Sevennov, K (1999) Inhibition of Escherichia coli RNA polymerase by bacteriophage T7 gene 2 protein J Mol Biol 289, 815-826

23. Shadnn A, Sheppard C, Sevennov K, Matthews S, Wigneshweraraj S, 2012

24. Substitutions in the Escherichia coli RNA polymerase inhibitor T7 Gp2 that allow89inhibition of transcription when the primary interaction interface between Gp2 and RNA polymerase becomes compromised Microbiology 158(Pt 11) 2753-64

25. LeClerc, JE, and Richardson, CC (1979) Gene 2 protein of bacteriophage T7 purification and requirement for packaging of T7 DNA in vitro Proc Natl Acad Sci U S A 76, 4852-4856

26. Ontell, MP and D Nakada, 1980 Rescue of abortive T7 gene 2 mutant phage infection by rifampin J Virol 34(2) p 438-45

27. Mooney, P Q , R North, and I J Mohneux, 1980 The role of bacteriophage T7 gene 2 protein in DNA replication Nucleic Acids Res 8(13) p 3043-53

28. Savaha, D , Robins, W , Nechaev, S , Mohneux, 1, Severinov, K , 2010 The role of the T7 Gp2 inhibitor of host RNA polymerase in phage development J Mol Biol 402(1) p 118-26

29. Qimron, U , Kulczyk, A W , Hamdan, S M , Tabor, S , Richardson, C C , 2008 Inadequate inhibition of host RNA polymerase restricts T7 bacteriophage growth on hosts overexpressing udk Mol Microbiol 67(2) p 448-57

30. Eom, S H , Wang, J , and Steitz, T A (1996) Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site Nature 382, 278-281

31. Raskin, C A , Diaz, G, Joho, K , and McAllister, W T (1992) Substitution of a single bacteriophage T3 residue in bacteriophage T7 RNA polymerase at position 748 results in a switch in promoter specificity J Mol Biol 228, 506-515

32. Ikeda, R A , and Richardson, C C (1987) Enzymatic properties of a proteolytically nicked RNA polymerase of bacteriophage T7 J Biol Chem 262, 3790-3799

33. Zhang, X 1995 T7 RNA polymerase and T7 lysozyme genetic, biochemical and structural analysis of their interaction and multiple roles in T7 infection PhD thesis, SUNY, Stonybrook, NewYork

34. Jeruzalmi, D , and Steitz, T A (1998) Structure of T7 RNA polymerase complexed to the transcriptional inhibitor T7 lysozyme EMBO J 17, 4101 -4113

35. McAllister, W T , Morris, C , Rosenberg, A H , and Studier, FW (1981) Utilization of bacteriophage T7 late promoters in recombinant plasmids during infection J Mol Biol 153, 527-544

36. McAllister, W T, and Wu, H L (1978) Regulation of transcription of the late genes of bacteriophage T7 Proc Natl Acad Sei U S A 75, 804-808

37. Zhang, X, and Studier, FW (1997) Mechanism of inhibition of bacteriophage T7 RNA polymerase by T7 lysozyme J Mol Biol 269, 10-27

38. Cheetham, G M, and T A Steitz 2000 Insights into transcription structure and function of single-subunit DNA-dependent RNA polymerases Curr Opin Struct Biol 10 117-123

39. Cheetham, G M, and T A Steitz 1999 Structure of a transcribing T7 RNA polymerase initiation complex Science 286 2305-2309

40. Zivin, R , Malone, C , and Rothman-Denes, L B (1980) Physical map of coliphage N4 DNA Virology 104 205-218

41. Schito, GC (1974) Development of coliphage N4 ultrastructural studies J Virol 13 186-196

42. Schito, GC , Satta, G, Pesce, A , and Romanzi, C A (1969) Sintesi macromolecolari m cellule mfettate con il colifago N4 Estratto da atti del XV Congresso Nazionale di Micrologia, Societa' Italiana di Microbiología

43. Rothman-Denes, LB, Haselkorn, R, and Schito, GC (1972) Selective shutoff of catabolite-sensitive host syntheses by coliphage N4 Virology 50 95-102

44. Schito, G C (1973) The genetics and physiology of coliphage N4 Virology 55 254265

45. Satta, G, Pesce, A , and Schito, G C (1969) Fate of the host chromosome during N4 coliphage replication G Microbiol 17 131-139

46. Falco, SC, Zehring, W, and Rothman-Denes, LB (1980) DNA-dependent RNA polymerase from bacteriophage N4 virions Purification and characterization J Biol Chem 255, 4339-4347

47. Kazmierczak, K M , Davydova, E K , Mustaev, A A , and Rothman-Denes, L B (2002) The phage N4 virion RNA polymerase catalytic domain is related to single-subunit RNA polymerases EMBO J 21, 5815-5823

48. Qucksmann, MA, Markiewicz, P, Malone, C, and Rothman-Denes, LB (1992) Specific sequences and a hairpin structure in the template strand are required for N4 virion RNA polymerase promoter recognition Cell 70, 491-500

49. Davydova, E K , and Rothman-Denes, L B (2003) Escherichia coll single-stranded DNA-binding protein mediates template recycling during transcription by bacteriophage N4 virion RNA polymerase Proc Natl Acad Sei U S A 100, 9250-9255

50. Willis, S H , Kazmierczak, K M, Carter, R H , and Rothman-Denes, L B (2002) N4 RNA polymerase II, a heterodimeric RNA polymerase with homology to the single-subunit family of RNA polymerases J Bacterid 184,4952-4961

51. Carter, R H, Demidenko, A A , Hattingh-Willis, S , and Rothman-Denes, L B (2003) Phage N4 RNA polymerase II recruitment to DNA by a single-stranded DNA-binding protein Genes Dev 17, 2334-2345

52. Cho, N Y , Choi, M , and Rothman-Denes, L B (1995) The bacteriophage N4-coded single-stranded DNA-binding protein (N4SSB) is the transcriptional activator of Escherichia coli RNA polymerase at N4 late promoters J Mol Biol 246, 461-471

53. Kazmierczak, K M a R -D , L B (2006) Bacteriophage N4 In The bacteriophages, R Calendar, ed (Oxford Oxford University Press)

54. Calendar, R ed (2006) The bacteriophages (Oxford Oxford University Press)

55. Jin, D J , Cashel, M , Friedman, D I, Nakamura, Y , Walter, W A , and Gross, C A (1988) Effects of nfampicm resistant rpoB mutations on antitermination and interaction with nusA in Escherichia coli J Mol Biol 204, 247-261

56. Lazinski, D , Grzadzielska, E , and Das, A (1989) Sequence-specific recognition of RNA hairpins by bacteriophage antiterminators requires a conserved arginine-rich motif Cell 59, 207-218

57. Modndje, J, Mali, T-F, Greenblat, J (1995) A protein-RNA interaction network facilitates the template-independent cooperative assembly on RNA polymerase of a stable antitermination complex containing the lambda N protein Genes Dev , 9, 28312845

58. Das, A (1992) How the phage lambda N gene product suppresses transcription termination communication of RNA polymerase with regulatory proteins mediated by signals in nascent RNA J Bacterid 174, 6711-6716

59. Burmann, B M, Schweimer, K , Luo, X , Wahl, M C , Stitt, B L , Gottesman, M E , and Rosch, P A NusE NusG complex links transcription and translation Science 328, 501-504

60. Bank, S, Ghosh, B, Whalen, W, Lazinski, D, and Das, A (1987) An antitermination protein engages the elongating transcription apparatus at a promoter-proximal recognition site Cell 50, 885-899

61. Friedman, DlaG, M (1983) Lytic mode of lambda development In Lambda II, R W Hendnx, Roberts, J W , Stahl, F W , and Weisberg, R A , ed (Cold Spring Harbor Cold Spring Harbor Laboratory Press)

62. Das, A , Pal, M , Mena, J G, Whalen, W , Wolska, K , Crossley, R , Rees, W , von Hippel, PH, Costantino, N, Court, D, et al (1996) Components of multiprotein

63. RNA complex that controls transcription elongation in Escherichia coll phage lambda Methods Enzymol 274, 374-402

64. Ptashne, M (1992) A Genetic Switch, 2 Edition, (Cambridge Cell Press)

65. Marr, M T , Datwyler, S A , Meares, C F , and Roberts, J W (2001) Restructuring of an RNA polymerase holoenzyme elongation complex by lambdoid phage Q proteins Proc Natl Acad Sci U S A 98, 8972-8978

66. Deighan P, Diez CM, Leibman M, Hochschild A, Nickels BE (2008) The bacteriophage lambda Q antiterminator protein contacts the beta-flap domain of RNA polymerase Proc Natl Acad Sci U S A 7,105(40) 15305-10

67. Miller, E S , Kutter, E , Mosig, G, Arisaka, F , Kunisawa, T , and Ruger, W (2003) Bacteriophage T4 genome Microbiol Mol Biol Rev 67, 86-156, table of contents

68. Nelson, HC, Finch, JT, Luisi, BF, and Klug, A (1987) The structure of an oligo(dA) ohgo(dT) tract and its biological implications Nature 330, 221-226

69. Mosig, G (1998) Recombination and recombination-dependent DNA replication in bacteriophage T4 Annu Rev Genet 32, 379-413

70. Tiemann, B, Depping, R, and Ruger, W (1999) Overexpression, purification, and partial characterization of ADP-nbosyltransferases modA and modB of bacteriophage T4 Gene Expr 8, 187-196

71. Sevennov K, Kashlev M, Sevennova E, Bass I, McWilliams K, Kutter E, Nikiforov V, Snyder L, Goldfarb A (1994) A non-essential domain of Escherichia coli RNA polymerase required for the action of the termination factor Ale J Biol Chem, 269(19) 14254-9

72. Truncaite, L, Zajanckauskaite, A, and Nivinskas, R. (2002) Identification of two middle promoters upstream DNA ligase gene 30 of bacteriophage T4 J Mol Biol 317, 179-190

73. Ouhammouch, M, Adelman, K, Harvey, SR, Orsini, G, and Brody, EN (1995) Bacteriophage T4 MotA and AsiA proteins suffice to direct Escherichia coli RNA polymerase to initiate transcription at T4 middle promoters Proc Natl Acad Sei U S A 92, 1451-1455

74. Ouhammouch, M, Orsini, G, and Brody, EN (1994) The asiA gene product of bacteriophage T4 is required for middle mode RNA synthesis J Bactenol 176, 39563965

75. Colland, F , Orsini, G, Brody, E N, Buc, H , and Kolb, A (1998) The bacteriophage T4 AsiA protein a molecular switch for sigma 70-dependent promoters Mol Microbiol 27,819-829

76. Sevennova, E , Sevennov, K , and Darst, S A (1998) Inhibition of Escherichia coli RNA polymerase by bacteriophage T4 AsiA J Mol Biol 279, 9-18

77. Herendeen DR, Wilhams KP, Kassavetis GA, Geiduschek EP An RNA polymerase-binding protein that is required for communication between an enhancer and a promoter Science 1990,278 573-578

78. Geiduschek EP, Kassavetis GA Transcription of the T4 late genes Virol J 2010,7 288-300

79. Gnbskov M, Burgess RR Sigma factors from E coli, B subtilis, phage SPOl, and phage T4 are homologous proteins Nucleic Acids Res 1986,14 6745-6763

80. Lonetto M, Gnbskov M, Gross CA The o70 family Sequence conservation and evolutionary relationships J Bacterid 1992,174 3843-3849

81. Lane WJ, Darst SA Molecular evolution of multi-subunit RNA polymerases structural analysis J Mol Biol 2010,395 686-704

82. Wong K, Kassavetis GA, Leonetti J-P, Geiduschek EP Mutational and functional analysis of a segment of the sigma family bacteriophage T4 late promoter recognition protein gp55 J Biol Chem 2003,278 7073-7080

83. Kassavetis GA, Geiduschek EP Defining a bacteriophage T4 late promoter bacteriophage T4 gene 55 protein suffices for directing late promoter recognition Proc Natl Acad Sci USA 1984,81 5101-5105

84. Kolesky SE, Ouhammouch M, Geiduschek EP The mechanism of transcriptional activation by the topologically DNA-hnked sliding clamp of bacteriophage T4 J Mol Biol 2002,321 767-784

85. Nechaev S, Kamali-Moghaddam M, Andre E, Leonetti J-P, Geiduschek EP The bacteriophage T4 late-transcription coactivator gp33 binds the flap domain of Escherichia coli RNA polymerase Proc Natl Acad Sci USA 2004,101 17365-17370

86. Riva S, Cascino A, Geiduschek EP Coupling of late transcription to viral replication in bacteriophage T4 development J Mol Biol 1970,54 85-102

87. Meijer, WJ, Horcajadas, J A, and Salas, M (2001) Phi29 family of phages Microbiol Mol Biol Rev 65, 261-287 , second page, table of contents

88. Vlcek, C , and Paces, V (1986) Nucleotide sequence of the late region of Bacillus phage phi 29 completes the 19,285-bp sequence of phi 29 genome Comparison with the homologous sequence of phage PZA Gene 46, 215-225

89. Salas, M (2006) Phage phi29 and its relatives In The bacteriophages, R Calendar, ed (Oxford Oxford University Press), pp 315-331

90. Camacho, A , and Salas, M (1999) Effect of mutations in the "extended-10" motif of three Bacillus subtilis sigmaA-RNA polymerase-dependent promoters J Mol Biol 286, 683-693

91. Barthelemy, I, Mellado, RP, and Salas, M (1989) In vitro transcription of bacteriophage phi 29 DNA inhibition of early promoters by the viral replication protein p6 J Virol 63, 460-462

92. Monsalve, M, Mencia, M , Rojo, F , and Salas, M (1995) Transcription regulation in Bacillus subtilis phage phi 29 expression of the viral promoters throughout the infection cycle Virology 207, 23-31

93. Camacho, A, and Salas, M (2001) Repression of bacteriophage phi 29 early promoter C2 by viral protein p6 is due to impairment of closed complex J Biol Chem 276, 28927-28932

94. Rojo, F, and Salas, M (1991) A DNA curvature can substitute phage phi 29 regulatory protein p4 when acting as a transcriptional repressor EMBO J 10, 34293438

95. Mencia, M , Monsalve, M , Salas, M , and Rojo, F (1996) Transcriptional activator of phage phi 29 late promoter mapping of residues involved in interaction with RNA polymerase and in DNA bending Mol Microbiol 20, 273-282

96. Elias-Arnanz, M, and Salas, M (1999) Functional interactions between a phage histone-like protein and a transcriptional factor in regulation of phi29 early-late transcriptional switch Genes Dev 13, 2502-2513

97. Calles, B , Salas, M , and Rojo, F (2002) The phi29 transcriptional regulator contacts the nucleoid protein p6 to organize a repression complex EMBO J 21, 6185-6194

98. Barthelemy, I, Salas, M, and Mellado, RP (1987) In vivo transcription of bacteriophage phi 29 DNA transcription termination J Virol 61, 1751-1755

99. Yuzenkova, J, Nechaev, S, Berlin, J, Rogulja, D, Kuznedelov, K, Inman, R, Mushegian, A, and Sevennov, K (2003) Genome of Xanthomonas oryzae bacteriophage XplO an odd T-odd phage J Mol Biol 330, 735-748

100. Semenova, E , Djordjevic, M, Shraiman, B , and Sevennov, K (2005) The tale of two RNA polymerases transcription profiling and gene expression strategy of bacteriophage Xp 10 Mol Microbiol 55, 764-777

101. Liao, YD, Tu, J, Feng, TY, and Kuo, TT (1986) Characterization of phage-XplO-coded RNA polymerase Eur J Biochem 157, 571-577

102. Rhoades, M (1982) New physical map of bacteriophage T5 DNA J Virol 43, 566573

103. Rhoades, M, and Rhoades, EA (1972) Terminal repetition in the DNA of bacteriophage T5 J Mol Biol 69, 187-200

104. Rogers, S G, and Rhoades, M (1976) Bacteriophage T5-induced endonucleases that introduce site-specific single-chain interruptions in duplex DNA Proc Natl Acad Sci US A 73, 1576-1580

105. Nichols, B P , and Donelson, J E (1977) Sequence analysis of the nicks and termini of bacteriophage T5 DNA J Virol 22, 520-526

106. Heller, KJ, and Schwarz, H (1985) Irreversible binding to the receptor of bacteriophages T5 and BF23 does not occur with the tip of the tail J Bactenol 162, 621-625

107. Letellier, L, Locher, KP, Plancon, L, and Rosenbusch, JP (1997) Modeling ligand-gated receptor activity FhuA-mediated ferrichrome efflux from lipid vesicles triggered by phage T5 J Biol Chem 272, 1448-1451

108. Lambert, O, Plancon, L, Rigaud, JL, and Letellier, L (1998) Protein-mediated DNA transfer into liposomes Mol Microbiol 30, 761-765

109. Herman, RC, and Moyer, R.W (1974) In vivo repair of the single-strand interruptions contained in bacteriophage T5 DNA Proc Natl Acad Sci U S A 71, 680684

110. Lanni, Y (1969) Functions of two genes in the first-step-transfer DNA of bacteriophage T5 J Mol Biol 44, 173-183

111. Bonhivers, M , and Letellier, L (1995) Calcium controls phage T5 infection at the level of the Escherichia coll cytoplasmic membrane FEBS Lett 374, 169-173

112. Herman, R C , and Moyer, R W (1975) In vivo repair of bacteriophage t5 DNA an assay for viral growth control Virology 66, 393-407

113. Killmann, H, Videnov, G, Jung, G, Schwarz, II, and Braun, V (1995) Identification of receptor binding sites by competitive peptide mapping phages Tl, T5, and phi 80 and cohcin M bind to the gating loop of FhuA J Bactenol 177, 694698

114. Gentz, R, and Bujard, H (1985) Promoters recognized by Escherichia coli RNA polymerase selected by function highly efficient promoters from bacteriophage T5 J Bactenol 164, 70-77

115. Wiest, J S , and McCorquodale, D J (1990) Characterization of preearly genes in the terminal repetition of bactenophage BF23 DNA by nucleotide sequencing and restriction mapping Virology 177, 745-754

116. Beckman, LD , Hoffman, M S , and McCorquodale, DJ (1971) Pre-early proteins of bacteriophage T5 structure and function J Mol Biol 62, 551-564

117. Snyder, C E , Jr, and Benzinger, R H (1981) Second-step transfer of bacteriophage T5 DNA punfication and charactenzation of the T5 gene A2 protein J Virol 40, 248257

118. McCorquodale, DJ, Chen, CW, Joseph, M K, and Woychik, R (1981) Modification of RNA polymerase from Escherichia coll by pre-early gene products of bactenophage T5 J Virol 40, 958-962

119. Decker, K , Krauel, V , Meesmann, A , and Heller, K J (1994) Lytic conversion of Escherichia coli by bacteriophage T5 blocking of the FhuA receptor protein by a lipoprotein expressed early during infection Mol Microbiol 12, 321-332

120. Pedruzzi, I, Rosenbusch, J P , and Locher, K P (1998) Inactivation in vitro of the Escherichia coli outer membrane protein FhuA by a phage T5-encoded lipoprotein FEMS Microbiol Lett 168, 119-125

121. Chinnadurai, G, and McCorquodale, DJ (1974) Regulation of expression of late genes of bacteriophage T5 J Virol 13,85-93

122. Sayers, J R, and Eckstein, F (1991) A single-strand specific endonuclease activity copunfies with overexpressed T5 D15 exonuclease Nucleic Acids Res 19, 4127-4132

123. Kaliman, A V , Kulshin, V E , Shlyapnikov, M G, Ksenzenko, V N , and Kryukov, VM (1995) The nucleotide sequence of the bacteriophage T5 ltf gene FEBS Lett 366, 46-48

124. Heller, K, and Braun, V (1982) Polymannose O-antigens of Escherichia coli, the binding sites for the reversible adsorption of bacteriophage T5+ via the L-shaped tail fibers J Virol 41,222-227

125. Heller, K J (1984) Identification of the phage gene for host receptor specificity by analyzing hybrid phages of T5 and BF23 Virology 139, 11-21

126. Heller, K, and Braun, V (1979) Accelerated adsorption of bacteriophage T5 to Escherichia coli F, resulting from reversible tail fiber-lipopolysacchande binding J Bactenol 139, 32-38

127. Ederth, J, Artsimovitch, I, Isaksson, L A , Landick, R , 2002 The downstream DNA jaw of bacterial RNA polymerase facilitates both transcriptional initiation and pausing JBiolChem 277(40) p 37456-63

128. Burgess RR, Arthur TM, Pietz BC 2000 Mapping protein-protein interaction domains using ordered fragment ladder far-western analysis of hexahistidine-tagged fusion proteins Methods Enzymol ,328 141-57

129. Altschul, SF, Madden, TL, Schaffer, A A, Zhang, J, Zhang, Z, Miller, W, Lipman, D J , 1997 Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of protein database search programs Nucleic Acids Res 25(17) p 3389-402

130. Edgar, R C , 2004 MUSCLE a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity BMC Bioinformatics 5 p 113

Информация о работе

Климук, Евгений Иванович
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Изучение регуляции транскрипции генов бактериофагов во время инфекции хозяйской клетки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы