Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение распространенности и локализации мобильных элементов IS285 и IS100 в геномах иерсиний

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение распространенности и локализации мобильных элементов IS285 и IS100 в геномах иерсиний"

На правах рукописи

ГЛГПлг» *----- - - - —

_____..«.»«.ум^лм » иппалпсплм

изучение расш-остранечпости и локализации ¡¡обильных элементов 15285 и 13100 в геномах иер.синий

03. 00. 07 - микробиологии

Автореферат дассертг'яи на соискание учено:" кандидата медицинских наук

Саратов - 1995

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора ■ оссийской Федерации •

Научный руководитель: кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник A.A. ФИЛИППОВ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, гоофэссор, академик АЕН, Г.М. ШУБ, кандидат биологических наук Г.А. ЕРОШЕНКО

Ведущая организация: Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт .

Защита состоится " 1995 г. в _часов на

заседании Диссертационного Совета Л 074.32.01 при Российском научно -исследовательском противочумном институте "Микроб" Госкомса-нэпиднадзора Российской Федерации (410005 Саратов, Университетская. 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Автореферат разослан "

Учений секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук, профессор

Г. А. КОРНЕЕЬ

OSS/Л ХАРАКТЕРИСТИКА РАС О TL!

.СТУI1!; Гг LГ-"К.".;.! ТЗ-элечьдти продета:'':hlt с сбей наи-меж-яие по рчгчеру мобильные генетические элементы прскарио?. IS •г.лы.ячпь не несут иных генов, кроме тех. которые осуц&отзлявт г.роцеос транспозиции. Однако они мох'ут формировать составные

тр-.^ого-ш и пк cf.Mii"А играю"' сажную роль в гаспросгриргаи ге-:,ст:.е!;по.: устойчивости. утилйзаг,;:и сахзрои и рядя других. Эти вставочные последовательности участвуют в негативном и пози-

гинипи vnurnn по игга^чни лач тлшчу уоьло '»в г»?тлт лЛплчлпо«»»»«

.'■.инатсрних и прсмстсрпих последовательностей. а так:ке индуцируемых км и инсершюкных мутаций и вторичных перестроек типа делеций. инверсий, дупликаций. Изучение профилей распределения IS-элементов в бактериальных геномах позволяет выявлять эволюционные связи и различия между штаммами и осуществлять эффективное внутривидовое молекулярное типирозание (Galas, Chandler, 1989; Blrkenblhl, VleJmetter. 1989; Lawrence et al., 1989; 1992; Ngetal., 1990; feeda . • Ohtsubo , 1990; Sl™cn et, al., 1991; Blserclc. Gchman, 1993a; 1993b).

IS-эдементн патогенных бактерий принимают активное участие з регуляции вирулентности и и;...1уногенности, а также в перемещении и дпесемнкации генов лекарственной устойчивости и детерминантов па-тогенностп. IS-зондирование широко - используется в молекуляр-но-эппдбмиологкческих исследованиях, с целью вь>яснения связей штаммов возбудителей с очагами инфекций и внутривидового типиро-зания с высокой разграничительной способностью. Получены видоспе-цифичные IS-збнды для идентификации патогенных бактерий, проявляющие высокую чувствительность в силу многокопийности инсерционных последовательностей ч геноме (Marrs et al., 1988; Ни, Lee, 1988; Hailing, Zeitr; 1990. Hermans et al., 1990; Barbour et al.. 1991; Stanley et al.. 1992; ; van der Zea et al., 1993; Sokol At al., 1994).

Род Yersinia зклачэет.три §нда лг.тернй. патогенных дл.-; ч>: ■ Л5реха и животных: Yersinia pest Is - возбудитель 6убош:ой и легочной чуми, а та:с>:е У. psJUdotubercuiosnT и у. еп^пгсГ.Шсз -sHTf-ропатогеинке- передал, этиологические секторы пс(мсту:,у-'.у-' деза и кишечного иерсияиом. 3 настоящее время накоплено ?,ного •Данных о генетическом аппарате Патогенных н-зренннй, в 'чг-тностя.

о структуре и функциях генов, связанкж с выражением вирулентное ■1Л. Так. достаточно подробно изучены строен/е и эспрессия гене плазмиды калыд5!йзависи:.;ости, общей для возбудителей чумы, псепде туберкулеза и кишечного иерсиниоза. а таете специфичных дня \ pestis репликоноЕ пеотлцкногенности и синтеза ка:зулъного антнге на. Интексизно изучается хромосомный "остроз вирулентности" иер синий, гены которого осуществляют ассимиляцию железа макреоргг ннзма-хозяина (Brubaker, 1991; Straley et al., 1993a; 1993C Straley. Perry, 1995). В то ;::e врэмя получено недостаточно даннь: о структуре и функциях собственных мобильных элементов иерсиний особенно об их распространенности з геномах, роли а генетическо регуляции функций и эволюции энетическогс аппарата.

Ея".о показано, что геном возбудителя чумы содержит не мене двух IS-элементов, IS ЮС и IS285, которые отличаются по размерам структуре и специфичности встраивания. Эти мобильные элемент способны интегрироваться в ллазмиду pCad У. pestis и вызывать ин серционные мутации, приводящие к кальцийнезависимости и утрат вирулентности. IS10O обнаружен в бактериальной хромосоме и тре собственных плазмидах штамма £V (Fortnoy, Falkow, 1981; Филиппо ц др., 1990). Получены данные о том, что прямой повтор IS-подоб ного элемента (по всей" видимости - ISiOO) фланкирует 102-килобаз ную хромосомную область пигментации (b'ettierston et al.. 1992 1994). IS100 и IS2£5 были клонированы и секвенированы. компьютер ный анализ нуклеотидных последовательностей позволил отнест: ISIOO к группе IS21-подобных элементов, выявляемых у грамотрица тельных и грампалозкительных бактерий (Flllppov at al.. 1994а 1S9--10; Pouladchlkova е; al.. 1994). однако до настоящего времен, имеется л!ало сведений о распространенности ISIOO в геномах иереи к»1й. и практически отсутствует такая информация по отношению i IS2S5. Вместе с тем данные о распределении IS-элементов в генома: dti!x . патогенных бактерий важны для выяснения механизмов генеот чепкой регуляции вирулентности, выявления филогенетических связе] мж'ау ^т^ммани разл!:чного происхождения, разработки метода is-ти-гшрокакия возбудителей.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - игучить распространенность, копийиость и локализацию IS285 и TS1CO в геномах патогенных иерешмй.

О^ЯОРНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Изучить распространенность IS285 и IS100 в геномах иереи-

«Л г. других представителей сокъ':стза Еп1егог.ас1ег1асеае методом ибпиди^авдк 1 п.

X Ра основ" ахали:.- гх^хххзархохххх Г.~-хрг*и"г^ Оххт" : д^пих хрияосим штажиа «¡¿гогекньх кероиний определить количество схий ¿3 элементов. исследовать возмскмссть использования иного-кошку. последовательностей ггя первнчхон характеристики :;р-г;о-ом!!?.:х мутантов, обнаружения оволхнионнхх связей и различив ';ххду тамгами. внутривидового холэху"арного тилноохахня.

3. Провести сравнительный рестрш:ционнь.Т! анализ трех плазмид

ИиУЛВНТНОГ.ТМ ГпРяГ. ^.СТ'чЛ штячило а тм.ч

>еркулезного микроба; изучить их ¡З-проф.чли. локализовать и опре-;елить ориентации резидентных вставок 18235 и 1Б100. исследопать :озмокную роль миграции иьсерционных последовательностей в измен-швости рестршщионных профилей плазмид.

НАУЧНАЯ 'НОВИЗНА. Впервые проведено сравнительное изучение )аспр_остраненности мобильных элементов 1В285 и 13100 в геномах 1ерсиняй и других представителей семейства Еп1егсЬас1ег1асеае. ¡оказано, что эти иноерсонные последовательности трисутствув? а гномах всех изученных штаммов возбудителя "умы :: рггд иьсли"оз кевдотуберкулезного микроба.

Установлено, что элемент 13285 более широко распространен в генетическом аппарате иерошшй. чем 18100. Спредел-.ча к.опкГн^сгь 13235 к 1Б100 в хромосомах У. реэНэ и У. рвгийо•.иЬегсиКг:з. идентифицированы консервативные (общие для сбоих возбудителей в ля внутривидовых групп) v, вар'лдоельнне ХЗ-поячтив!«;-; £рагм»!г:н. Локазано, что количество чоксер&ативкых вставок 13263 в обоих геномах преобладает по сравнению с ШОО.

Е7.ервь,е устлиивлеки. что ссавнитехьнк'Я алдл. $ хоомо:ок.ч>: профш.ея распределения и ШОО является г^кх-иших аь-: в.ыявления эволщиожых связей и различий мекду втамгами У. раз£15 к рзе^йоЬиЬегси1о51я, которь."й дазт возможность выделять енз'т-рявидовне таксоны и проводить молекулярное ■;"г,нп?рз'',:е. Поуэз^но, чю 13235 позволяет бо^е чет1-; виявг.лтъ фхло: анемические сиз,: ,.:с;;:ду штамма»«!, а имеет преимущество в да^рсамруши

спзсоснс'стях при внутривидовом минировании У. ррв.'.'^.

Полудни ка&^е даххьх: о охети'-чехой древне";: о И'; отношению к 13100. о более высокой частоте транспозиции 15106 г

геноме У. pestis по сравнению с IS285, о наличии в геномах чумного и псевдотуберкулезного микробов изомерных форм IS-элементов, о том. что океанические штаммы возбудителя чумы произошли из континентальных.

Впервые определены копийность, локализация и ориентация резидентных вставок IS285 и IS100 в плазмидах кальцийзазиспмости штаммов У. pestis и У. pseudotuberculosis различного происхождения . а также в видоспецифршом решдк.оне чумного микроба pFra. Показано, что IS285 расположен в непосредственной близости от гена-регулятсра синтеза капсульного антигена, а два инвертированных копии ISlOO-элемента формируют трачспозоноподобную структуру размером около 40 тпн, включающую опероны кгпсулообразсвания .и токсигенностй. Эволюционные ■ связи меаду итаммами, выявленные на основании IS-зондирования pFra, согласуются с результатами хромо-ссмного JS-типировакия. Картирована инсзрция IS100 в плазмидах пестициногенности трех штаммов возбудителя чумы, показана консервативность этой области pPst и доказано, что этот репликон не содержит инсерции IS285.

Впервые установлено, что IS100 и IS285 могут служить маркерами перестроек в геномах У. pestis и У. pseudotuberculosis. Показано] что ISiOO-зондированке позволяет определять минимальную протяженность хромосомных перестроек чумного микроба к копийность инсерционной последовательности в мутантннх областях. Обнаружено, что различия в локализации 1Z285 и ISiOO являются основной причиной изменчивости рестрикции-щых профилей плгзмид кальцнйзависи-мости возбудителей чумы и псевдотуберкулеза.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Сконструирован зонд на основе внутреннего EcoRV-фрагмента мобильного элемента IS285. предлагаемый для молекулярного типирования штаммов У. pestis и У. pseudotuberculosis, выявления эволюционных связей между штаммами и выяснения роли IS в генетической регуляции бактериальных функций. В музее живых культур РосНйПЧИ "Микроб" депонирован авторский штамм Escherichia coli КМ52. несущи": рекомбгкаятную плгзмиду с клонированным 1Б285-зондом. Сконструированы молекулярные зонды IS100-1 и IS1C0-2. разработан оригинальный метод молекулярного типирования штаммов возбудителей чумы и псевдотуберкулеза с использованием IS285- и ISlOO-зондсв.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, БЬИОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Мобклыжс слемгн-.ц ÍSSS5 IS ico яг'/оутстпуйг в геномах сех изученных ктажоз возбудителя чум;*, рягз т,:зг, — '. о-; гк:зздоту~ эркулезнсго и о:д-;рч:?.г--л -з г:к; '.то: г:у:::'- -¡ггг*:п-«ser. семейства Entero:-23t3r;:iceae. IJiJJ Солее широкп р^спрост-анен в генетическом сгаратб У. pestts '•: i', pseuáotuberculnsíc. ем IS100.

2. Копийность IS100 и в хро::осомс чумного кпхиоба существенно выше, чем у псездотуберкулезгэго. Оба возбудит^;?, сс-.ержат консервативные и вариабельные вставки IS-элемонтов. Коли-естзо консервативных чнеерций 1S285 ~

С 1 Лг»

2. Установлены копийность. локализация и ориентация рези-[зитных вставок IS285 и IS100 в плазмкдах кэльцийзависимости юзбудителеп чумы и псевдотуберкулеза. а также в видоспецифлчном ¡ешшкоке чумного микроба pFra. IS285 расположен рядом с оперено:.; жоулообразозанкя. Две инвертированных копии IS100 образуют про-•якенную транспозонсподобную структуру. несущую опероны продукции ¡апсулы к мышиного токсина. Картирована инсэрция IS100 в плазмя-iax пестициногенносги трех штаммов возбудителя чумы. Плазмидз )Pst не" содержит IS285.

4. IS285- и ШОО-зокдкроЕанпе хромосом Y. pesrts и У. pssu-lotuberculosís, а также плазмиды pFra позволяет выявлять эволюционные связи М5нду штаммами возбудителей.

5. Разработан эффективна"! метод молекулярного тип':рсвания атаммов чумногс и псевдэтуберкулезного микробов различного происхождения на осноие анализа хромосомных IS285- и ТБЗОО-проФи.пзп.

6. IS100 и IS2S5 являются маркерами генетических перестроек з плазмидах кальцийзависимости У. nestts и У. pseudotubercuioy

i также б хромосоме возбудителя чумы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены и представлены на итоговой научной конференции РосНИПЧИ "Микроб" (1394): I съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов. 1994); Межгосударственной научной кс $ерешдо;. посвященной столетию открытия возбудителя чумы {Алматы. 1£'94к 7-ом Международно:-* конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологи:-. (Праге;. 1994).

ПУБЛИКАЦИИ. Основное содержание диссертации отражено з четырех опубликованных работах.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, пяти глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждение, а также заключения и выводов. Работа изложена ка /страницах машинописного текста и иллюстрирована 22 рисунками и 3 т.¿лицами. Список литературы содержит 1S5 цитируемых работ.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛЫ й МЕТОДЫ

В работе использовали 7, штаммов Yersinia pesits, 30 - У. pseud' '.abercuiosis, 10 - Y. enterocolitica. по два штамма непатогенных иерсиний. четыра клинических лзолята шигелл. пять - сальмонелл и девять лабораторных штаммов Escherichia coll.

Приведены использованные питательные среды, реактивы и методики. В работе применяли следующие молекулярно-генетические. методы исследования: плазмидный скрининг (Kado, Liu, 1981); препаративное выделение хромосомной (Mekalanos, 1983) и плазмидной ДНк iBirnbolm, Doly, 1979) с последующим ультрацентрифугированиём в градиенте плотности CsCl/EtBr (Маниатис и др.", 1984); Быделение фрагментов ДНК из агарозного геля (Kainz, ICalnz.. 1989. в модифи-■кации 'Лежн'ева, 1991); рестрикции ДНК (Маниатис и др., 1984) ; гибридизацию iп situ и блот-гябрвдшзацию по . Саузерну (Маниатис и др., 1934) с использованием зондов из внутренних участков IS-эле-ментов: IS285 (EcoRV-фрагмент размером 442 пн) и IS 100 (Pstl-Bglll-фрагмент - зонд 1ЫОО-1, 430 пн; . и. EcoRl-EcoRV - зонд IS100-2, 200 пн). Зонды сконструированы нами на основе результатов секвенирования ISiOO-И IS285 (Fillppov e.t al... 1994a; 1994b).

РЕЗУЛЬТАТЫ И •.ОБСУЖДЕНИЕ-;:

На первом; этапе изучали распространенность мобильных элементов IS285 и 15100 в геномах иерсиний/-сальмонелл, шигелл и эшери-хиП. Показано, что оба IS-элемента присутствуют.во всех исследо-ва' :ых штаммах возбудителя чумы, а также в 80 и 40% . изол. гов У. pseudotuberculosis соответственно и не выявляются в генетическом алг.ардте других представителей семейства Enterobacterlaceae. Эти

да:шке йог»? свидетельствовать о ьотлнкд'овегии IZ285 и îSiOO з га>:с'.;е лволэиионкого лредшестзэнника Y. pssiis и >'. pseudatuber-л стсутстг.лл ?:л миграции л лрллл^ лллл бл;гл ллл. Л'! чло-толл&г^ Брс-".е;;1; л геномах 4jто л чссллогл-л-лулеч-ого ^лчрлгл' не обнаружено собственных систем генетического обкена (Зеренков. Ь-34; Лоларадсклй, 1893). Отсутствие таких гкстек мсизт о.'жсктгь узино рамки распростр-яения ксследовси-:ыс; IS. Лолее ¿лрксая риса-ростракешшсть 13255 в г возбудителей чумм и ксееяогуборгу-ллла чоллт укягл'лл.т;: на его лллогснлтлчеокул ллоллсл-л по срп;:,:;т'-нию с IS100. Оба К-элекеьта чаце встречались в штатах I серова-

г.лол.тто^. îtt"li'—ic, „kwj uuoîiiu-m ди^т! hг• l'-îicc1-

mob I серовара ст обцрго предшественника возбудителей псзвлоту-берхулеза и чумы. На фоне- гнтенсивного свечения на радиоавтографах большинства IS-позитпвных образцов. ' ь некоторых случаях при сходной клеточпой нагрузка отмечали более слабые гибридизационкые сигналы. Было сделакс предположение о наличии в гекс.чах У. pseudotuberculosis :i У. .pesti'3 изомерных форм IS-злекентов.

Далее был проведгн сравнительный анализ хромосомных ггеофилай П'&р;шзадаи зтагаов возбудителей чу.'-'н и псевдотусл-ркулелл. ргл-лг,много происхождения. '«сеследси&ли -:эть.ре Зеоплазллллых континентальных штамма У. pe?-t is (1146, ЗЬЗ, 231 и РКРЛЗЯ) г >ра океанических (TV.'J, Java и EV). Кроме того, ьоадку. *гали ИНК 'лгух 1:?сгевных пар пигментиросппнюс и бвежгкечгдж ттамл?з: Y. и-¡ал ¿31 и 358. Для определи-.!:я корреляции кзуц'У про^/л.".«« IS и о ./о-тияом псевдотуберкулезного жкрооа изучали г.ягь гта тов I с v-.--.s-ра - I, 78. 85, ¿52 i: 347. а также изеляты дг;,тих :сроваре?: .з.'У aï). YPIII. 807 .<iV) и V. Бееплазждкые ярс«:-"30!ШК'е Y. pseudotuberculosis "Щ. 252 и SO7" 'олучены в настся-!;??. ра^ст:.

Показано, что срехнеэ копнчество юг,:?. ч TSW у, у : ¡.юооме чумного «пчрэСг отставляет соответстьенпо .ч и г&, ь хромосоме возбудителя псездотуберкулега - G и 1. йш'нтидацкговакн консервативные (общие дат обоих резб/аителей ил: лнутрн^лдо--л-у групп) и Елрпабельлле 15-г»с.г*тв!«'г -по::'! "мкч

ллпл^лватпвнлх л-vyov ; и л*? v; ;•> .- ч'ч.х

li-jaeBiOb / pesiis, k;ju,v3 1146, составило и» и V, соответственно. nyv'WHHiJ биллчо- кч:лл:л:?о лар.-ло-^'л чох ' л-'Лл.- г..-:-

;у ;; лг'п Лоллл гуосл-Л к.-'л-ч: vuTî.v ло р<чЛ' : л л

на белее высокую частоту транслезицик этого элемента в гено; возбудителя чумы по сравнению с JS285. В то же время колэтест! конезрзативннх вставок ISS85 (одинаковых у большинства штаммо! -возникеих. очевидно.- на 6oi.ee ранних этапах эволюции) в обоих р номах преобладало по сразнению с IS100. что свидетельствует пользу- нашего предположения о более древнем происхождении TS28;

Как известно, по общим локусам IS-элементов в различи! штаммах судят об их общем происхождение. Количество таких консе] вативных копий отражает степень родства (время дивергенции) ита мов. Следует отметить,' vio з процессе филогенеза бактерий сущес вует общая тенденция к увеличении копий мобйдьных элементов в р< зультате транспозиций и дупликаций. Используя эти критерии п] анализе IS-фингерпринтсв. мы' сделали несколько заключений, каса; щихск эволюционного родства изученных штаммов.. Так. среда изол: тов У. pseudotuberculosis штамм I имеет максимальное сходство 1 IS-профилям со штаммами возбудителя чумы, но более древнее прои! хождение по сравнению с кики, о чем свидетельствует меньшее кол: чество консервативных IS-фрагментов. Полевочий штамм У. pest 1145, имеющий минимальное число общих инсерций IS285 и ISÍOO. Я! ляется самым филогенетически древним из выборки возбудителя чум Показано, что штаммы, имеющие сходные IS-профили, демонстриру] определенную общность в географичеохом происхождении. При этом помощью IS285 можно как выявлять родство, так и дифференщюва' штаммы обоих возбудителей из разных очагов, в то время как ISíi более эффективен при разграничении штадооз У. pest is внутри оч< га. Содержащие подавляющее болыаикство одинаковых позиций IS-эл! ментов штамш У. pest is 231, 358 и PKR133'относятся к коктинй тальным к выделены на территории Центральной Азии' (Тянь-Шань, О верное приаралье и' Ирак, соатветстъоннс), Представители- друг* группы штаммов возбудителя чумы, показывающих сходный IS-типы Java. TWJ и EV - относятся к океаническим. Два первых ттамм: имеющие наибольшее сходство мегцу собой, выделены на острсзе Яв: a EV - на о. Мадагаскар. Шташы У. psemombsrautosls 76 и ¡ .первого серовара, д/я которых погсазакьг идентичные гибридизации ике профили,, выделены з течзние короткого периода .времени ¡ нлосгсозубых крыс, обптавеих ча одной «ибстнсводчеекз»? ферме Тур:

1лл п'атогенных г<ерсини# были тггае показаны и другие мето,

- и -

внутривидового дифференцирования. Guiyoule et ai. (1994) обнаружили 16 раз -глупых, риоотапоз в 7с ьзучешэс итя.дах. причем 65% всех аггаммов относилась к одному из двух р::бет;:поз. о наг*« случае были выяалеки в 15 стамулх pestts- я К. pse<"Jotul-srcutests различного происхождения 15 IS-типов. Таким образом, разграничительные возможности ISI00- и 1&га5-тапирэвания оказались значительно выше. Кроме того, с помощью различий в IS-профилях можно четко выявлять степень родства между атакками, чего не было показано при риботипироБании.

Сравнение IS-профилей изогеннэй пары Рет* - и Рр.тг -вариантов Y. cer.tin ачй по-?'1™"' раз.;.....-, „ .»«опии«» п«* jioKvuoH isjr/ii M»wny урогос"?.;?.:::: CCC о тшк? и mv не-пигментирозанного производного. Мутацил к Pgr?"- фенотипу сопровождалась уменьшением размера первого IS-позитивного ВатНХ-Фраг-мента и изменением интенсивности гибридизацнонных сигналов трех фрагментов. -Р&зкзр области, захваченной перестройкой, составил свыше^ 58 тпн .При этом профиль 13285 умутантного штамма не изменился. Хромосомная область пигментации возбудителя чуму включает помимо генов пигментации Охранения гекика) локус рецептора пестн-цкна и одновременно сидерч^зра керсикнабактича, а тачхе ген-;, кодирующие синтез сидерофоронезавискмгх белков транспорта ж&кэза (Perry et ai.-; 1990; Rakln et al.. 1994. 1995;. Эта ^о.паегь имеет протяженность 102 тпн. фланкирована прямкм повтором 13-яодооього элемента (предположительно - IS100) и подвергается долецккм длиной до ISO тпн, приводясь к утрате пигментации, рецептора пеоп;-иина я вирулентности (Perry et ai., 19Э0; b»cier, S^ubalier, I9S2, Fathers ton ei a}.. 1992, Fatherston. Perry. 5 994). Наши ,:зн;ше также ссидетельствуаг о значительной протяженности генетической перестройки, которая вызвала утрату пигкентзцкя У. vest's .'"Ч. Кроме того, эти результаты указывают па присутстьк*. в «ут;нтчоП области не менее ipsx ког.й I31QC. количество которых в Л'.мц^ссо перестройки не уменьшилось. Возможно, именно IS100 вызывает про-тякэнные генетические перестройки в облает;; пчг.'чеН ' ац;!'/! ь^зСуди -теля чумн. ' •

На следующем этале картировали резддепикг eiтавкч ::

lotOO в плазмдах' чужого н пиуадотуберчулегпого гнкробев. При .дгкгякзавга IS ь ич-гдосггецнфнчкой плачм;:;;е pPst (9.5 "¡и), кг,.:ру-зд eft синтез бактернзцнна аестиьина. г елка, Т!г.*му;«тгостг I. нем/ л а.;-

" HUicll. E-oRt \

vinca pM'

""V-M

Stul

EcoFU

Accl Acc<

OríV Ecor,V

Accl СЫ EeoRV

Рис, 1. Пскаллзацлп 13100 з плаз:.эде пестйцчкогеьно^'пг зсзбумш ля чумы. Карта pPst (p'íP) була опубликована ранее (Булгаков; 1991¡. обсггшр.ченкя: OriV ~ точка катала ве."ета1ИзноЯ решнкацш р:л. prt и pía - структурные генн. ксдцрущяо cmtraJ поетсгда fu.fi:;: иммунности к нему и активатора г^лааминйгена соответственн*

тквагорг плазк'шогска. б'.уш «сл:льзоздны v,.->Hon;:c.c".K.mR шгакк^г V npLqf.ts EV. 35? и 231. Pe^TTt'K'r^HHuS J«

позволил картировать гчсерцня г- :л ■•".""¡л" пг-г-т-х:;:-.

ьогеккости из всех трех ¿»оммоь на участк« с координатами /,Ь -9.5. удаленном от известных г гноя (рис. Наги результаты свидетельствуют с стабильности структура чтЛ сЪзаотх. что согласуется с недавно отг/'лнкавакньет д^якл/. дру.\:>; с-нтор^з (Poolacciú--Kova et al., которое локализовали ISírtO в том жэ районс-

илазмиды pPst штамма 106 Otten.

ПЯ ПППОГ1 mí ШЛ ri^n'PrMllyTlt/rtlTi-iTft ...илп,,« .. ТГ" -.---—— " ЛЛ--

НЦЯЧМи^и nUmínCiUTUA^Wl t*f\f-lr,rr " "СТ С ^Г. С С У."... Г. ■ ;

68-75 тпн). Прожгли рестрикции Ги.азкид каль„ийзависимости из всех тестированных штаммов У. pestis (EV. 353. 231. 1KG) и У. pseudotuberculosis первого серогара (78. 85. 995) имели значительное сходство е расположении EanHl-фрагментоз: обнаружено девять рест-риктов одинакового размера. IS285 выявлялся в одной копии, в составе первого или второго Bartíñ I-фрагмента pCad штаммов У. pestis 358 и 1146, а также всех кзолятов возбудителя псевдотуберкулеза. Определена точная локализация и ориентация этого элемента в плаз-миде pCad3ÍS (рис. 2).

Интересно, что фрагмеь; pCad358 о резидентной копией IS2S5 демонстрировал менее интенсивный гииридизационный сигнал, чем рестрикт с транснозированнсй копией этого элемента, что монет быть связано с неполной гомологией. Вероятно, копия, локализованная в составе исходной пдазмиды. является изомерной фор;.,ой полноценного транспонируемого IS285. Ранее была показана 64% гомология ДНК IS285 [Fillppoy et al.. 1994b) по отношению к последовательности pCad штамма псевдстуберкулэзтюго микроба YPII1. расчсло'::ен-ной во втором BareKI-фрагменте (Bolín. Woif-Watz. 19ЯЗ). Зто свидетельствует о наличии в плазмиде кальцийзависимости У. pseudotuberculosis ypiii резидентной копии изо-15285.

• IS 100 содержится во втором Bcmtíl-фрагменте вариабельного размера в плазмидах pCad штаммов Y. pestis EV. 231 и 1145. в плазмиде кальцийзависимости штамма EY уточнена область расположения копии IS100 по соавненюо с данными Portnoy. Falkov; (1п?1).

Нами показано, что распределение Ic-эт.ементов в peal i. pestis и У. pseudotuberculosis отличается вариабельностью. Различия в позициях IS-элемснтов являются основной причиной изменчивости

Hindlll

1 1 1 i 1

уор 4а IS28S EcoRV

EcoRV EcoRV

Hindlll

Рис. 2. Местоположение резидентной копии 15285 на карте плазмиды кальцийзависимости У. pest is 358. составленной ранее (Филиппов и др., 1991). Обозначения: 1сг (от англ. low calcium response) -область кальцийзавксимости; icrGVH - оперон синтеза V-антигена. ус, (от англ. Yersinia outer membrane proteins) - гены, .тветс-твеннне за синтез температуроиндуцибельных белков внешней мембраны. •

I ХМ I I ИОНУ, I |

сг» 1М ппн

'а'»: ; Еот 5|!| РьМ 1 ЕсоМ

Рис. 3. расположение коп:;й 13100 и 13235 в плазмицс ррга У. ргэ-ЕУ. Карта рП'я привечена в соответствии с данной, полученными ранее (Гончаров и др.. 1989; 1991: Каг1узУ1еу е1 а!.. 13й1). Обозначения: сс^ - гены олепона капсулсобразсванид, улЧ - структурный гея синтеза мышиного токсина.

реотрикционных профилей рСас!.

Местоположение IS-злементов в плазмиде чумного микроба pFra изучали с использованием штаммов EV, 358, 231 и 1146. Установлено, что высокомолекулярные плэзмиды капсулообразозания и токси-генности У. pestis EV. 358 и 231 несут две копии IS100 и одну -IS285. Определены локализация и ориентация IS-элемзнтов на карте pFraEV (рис. 3). Показано, что IS285 расположен в непосредственной близости от гена caflR - позитивного регулятора капсулообра-зования. Две инвертированные копии IS100 образуют структуру, характерную для составного транспозона, включающую опероны продукции капсулы и мыаиного токсина. Плазмида pFrall46 несет две копии IS285 и одну - IS100. 3 составе всех плазмид pFra обнаружена консервативная область, содержащая одну из копий IS100. Эволюционные связи между штаммами, установленные на основании IS-гондирования pFra, согласуются с результатами хромосомного IS-типирования.

ВЫВОДЫ

1. Мигрирующие генетические элементы IS285 и ISiOO содержатся в геномах всех 53 изученных штаммов возбудителя чумы из 22 природных очагов, ряда изолятов псевдотуберкулезного микроба и нэ выявляются б геномах других иерсиннй. а также сальмонелл, шигелл и эшерихий. Элемент IS285 более широко распространен в генетическом аппарате У. pesiis и У. pseudotuberculosis, чем IS.100.

2. Среднее количество "^пий IS2S5 и IS1DO в хромосоме чумного микроба составляет соответственно 14 и 19, • в хромосоме возбудителя псевдотуберхулеза - 8 ч 1. Идентифицированы консервативные (общие для обоих возбудительй или для внутривидовых групп) и вариабельные IS-позитизные фрагменты. Количество консервативных вставок IS285 в обоих геномах преобладает по сравнению с IS100.

3. Сравнительный анализ хромосомных профилей распределения IS285 и IS100 является эффективным методом установления эволюционных связей и различий между штаммами У. posits и У. pseudotuberculosis различного происхождения, позволяющим быдэлять внутривидовые таксоны и проводит^ молекулярное тнпированпе. 18565 позволяет более "етко выявлять филогенетические связи кекду штаммами, a IS100 обладает более выраженным!? дифференцирующими спосоС-костя::л при внутривидовом тнпкроБанаи У. pestis.

t. Картпрои?.-« резидентная встаека iSîOû-эпемента в плазмиде хестициногегнссти стак-.ов V. vestís EV. Г5с и 231 на участке с координатами 7,5 - Р.Г, уда пенная от их ес,; них Хеков, Отот учас-\ ;ч р? характер::'"-е.'ся значите."!-но;: нехоор: хти-х-'гсгьх Рлавмндз prsi, Ktä содержит инсерции IS235.

5. хлазнидн кахьцийзйзе.олмости штаммов У. pest is 353 и 1146, а такхе У. pseudotuberculosis 78, 35 и ¿95, содержат по одной ко-"X,! IS2S5. Определена локализация и ориентация резидентной встав-.••.и 1С?35 на карте pCad358. Плазмиды pOa.i ":таммов возбудителя чумы 231, EV и 1146 несут не менее едной кнеерпии IS100. Уточнена по-

X рСД™'.'. Г«^,,,-,,« о »тпиш.иип'нш :ч-,П0„01>™п or.-

"Х..ТС.Ч zz::zzkzT: umoZ намек ивости pt трикциснних профилей плазмиды кальцийзаЕИСямости.

6. IS100 и IS285 могут служить маркерами перестроек в геномах У. pestts к У. pseudotuberculosis. 13100-зондирование позволяет определять минимальную протяненность хромосомных перестроек чумного микроба и кепийноегь инсерционной последовательности в мутантнкх областях. Различия в локализации 1S285 и IS100 являются основнс? причиной изменчивости рестрикционных профилей плазмид кальцийзависимости возбудителей чумы и псевдотуберкулеза.

7. Плазмиды синтеза к.хсульнсго антигена штаммов У. pest is EV, 231 и 353 имеют в своем составе две копии IS100 и одну 1S235. Картированы янсериии обоих мибильных элементов в pí'raSV. IS2Ö5 расположен в непосредственной близости от гена-регулятора синтеза к&псульного антигена. Две инвертированно кошм I?,г^О-ъяеч&ата &ормкру»т транспозоноподебаум структуру ра-^ером ххоло 40 тпя, вклучаю'дую опероны капсудооб|»а.»еайния и тохекгев-яоети. Плагмияа pFra похевочьего птаммч 1146 содержит одну кипи» !Sí№ у. две - IS283. 3rsc.iiwuiî0i4Hua Связи м<;^ду этгчмзмп. уе;;чов х-ххх.;е >х: ocno^'iKíit IS- зондирования erra. сог^-су^гся о p-".x.x-x- : •гаки хрокосомного is-типирования.

Список- работ по теме дисбортазки:

i Socios .t.Г . -'илиапоь A.A.. npoííoüítr, O.A.

is-э тентов в хромосомах л пластах чум»: •,: ио.-г/.о

гу?.-; кулеза // ï-tartn. Хе.тасучдрсть - изуч "Ii;-.¿и.:;..?. и :.;ерь: борьбы с чумой". - ляиата. 1994. - С. 76

2. Филиппов А.А.. Олейников П.I'»., Бобров А.Г.. Мотан В.. Кокнов К. П.. Смирнов Г. Б. Сравнительное изучение структур; распространенности двух IS-элементов Yersinia pestis // Генетш - 1994. - Т.30 (приложение). - С.166.

3. Bobrov А. 3.. Flllppov А.А.. Olelnlkov P.N., Protser 0. A. Distribution of IS elements In genomes of Yersinia pest and Yersinia pseudotuberculosis // 7th Intern. Congr. Bacterlc and Appl. Microbiol. - Prague. 1994. - P. 35.

4. Бобров А. Г., Филиппов А.А. Исследование распространенно ти мобильных генетических элементов IS285 и ISJ00 в геномах во будптелей чумы и псевдотуберкулеза: Рукопись деп. в ВИНИТ 1995.-14 с.

\ Ш. Т. f'SC.