Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ ПУТЕЙ МЕТАБОЛИЗМА ВИТАМИНА А У ЖИВОТНЫХ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ ПУТЕЙ МЕТАБОЛИЗМА ВИТАМИНА А У ЖИВОТНЫХ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР Ордена Ленина Институт биохимии им. А. Н. Баха

Л-уЯЗ^

На правах рукописи

СОЛОВЬЕВА Нина Викторовна

ИЗУЧЕНИЕ ПУТЕЙ МЕТАБОЛИЗМА ВИТАМИНА А У ЖИВОТНЫХ

(Специальность 03.00.04 — биологическая химия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

[ , ■ . , ■

■ Москва—1976

АКАДЙ1ИЯ НАУК СССР Смене Ленине Инотитут бшохмиии мм. л.н. Вехе

ИЗГШКВ П7Т1Й МЛШОЛИаи ВКШ1ИНА А г животин

Юпецналькооп 08.00.01 - виодогячевкея мша)

• АВТОРЕФЕРАТ дновертвца* не вояоквня* дчеиов отвтата наймете бяолотчооких наук

Не правах рукописи

СОЛОВЬЕВА Нине йиксоровна

Москвв-1975

1 ^»иравыши-я:'-'^*^"11-'1 ' ... . ----------^ . . ■ ........ ^

Работе выполнена в Лаборатории вита им нов Ордена Ленина Института Сиокишш ни. Л.Н.Бахе АН СССР.

Научные руководители!

чдон-корреспондевт АН СССР, проф. В.Н.БУНИН кандидатбиологических наук А.А.Дкитровокий

Официальны в оппоненты:

Доктор биологических наук С.А.Бурнатева Доктор технических наук И.А.Рубцов

На официальны* отзыв работа направлена в Институт биологии . АН ЛатвССР.

Автореферат рааоолан " 1975 г.

Защита диссертации состоится " " 1975 г.

на аасвдавии Ученого Совета Ордена Ленина Института биохимии ■к. А.Н.Баха АН СССР (.Москва, В-71, Ленинский проспект,33).

С диссертацией можно «накопиться в библиотеке Института

"Ученый секретарь кандидат биологических наук

1Н.Н.Дьячков)

в в в д в ни в

Витамин А обладает широкий спектром биологического действия. Он принимав! участи« в процессах зрения, роста, размножения я эмбриогенеза llloor#,1957t Tftompeon,1969t *авв*пмп,Согг*<ШкО,1971| Труфенов, 1972; Катаноои, 1974). Вместе о тем, представяекня о биологической значимости витамине базируются в основной на результатах физиологических опытов. Значительно менее ясны биохимические процессы, лекацие в основе действия этого витамина, хотя в последние годы получен ряд интересных данных, указывавши на его роль в мембранах, синтезе глинопротвидов и балке I luoj,i969i LeLuoa,wolf ,1972) Леутский, 1974). Наибольшие успехи в об л вот* раскрытия молекулярного механизма действия витамина А достигнуты в области зрения. Установлено, что в форме П-цио-ретннеля витамин входит в состав родопсина и принимает непосредственное участие в процессах фотороаенции 1 Weld,1935,1968 ).

Ретиниль занимает центральное положение в цепи мегемолитических превращении витамина А в организма. Однако очень мало денных о присутствии его в каких-либо других органох помимо сетчатки глазе. Известно, что ретиналь является доминирующей формой в икре рыб, накапливается в яйцах птиц и рептилий, и количество его резко возрастает в крови рыб и кур в период размножения ^ Flack et el. ,1959»1963.1968). Имеются отдельные сообщении об обнаружении незначительных количеств ретиналя в печени нлекопи-тьсщих 1 Wlnteretaln.Hegidua,1960i Mahade-rfcn «t «1. ,1962 Я др.). По предположении Плека данная форма витвмино образуется в качестве промежуточного продукте в процессе превращений резервного фонда витамина А в организме. В связи с этим представляло интерес исследовать образование ретииеля у животных и выяснить, не может ли некоторое количество его образовываться из пищевого витамина А на начальных этапах усвоения в киеечнике.

Обнаружение Диитровским (Д961) энэииатического обрезаввняя в организме ретиноевоЯ кислот».имело важное значение для поиимения обмена витамине А, Ретиноевая кислоте не способна восстанавливаться в ретинальи ретинол,быстро разрушается и выводится из

организма, авлаяоь, фактически, эвкльчмтальньм необратимым эта-аои метаболизма денного витамина, который представлен ниже в виде следующе! с хеш;

Витамин 1 в -Каротин

1ацетат, пальмитат) I

I __ *

Ретинол " Ре тин в дь—«-Ратиноевап кислота

РОТИНИЛ-ЭфИрЫ

Учитывая широкое распространение в тканях ретинадьокисляю-цнх ферментов, потери организмом витамина А вследствие анзинати-чаского окисления ретиналя предотевляпоя довольно значительными. Несомненно важным быдо выяснить какое значение имеет процесс образования ратинов в ОН кислоты для усвоения витамина А.

Ретиноевая киолога проявляет выоокую биологическую активность в функции роота, но не обеспечивает функций эре нив ■ резин оженив 1 ОонИов,**1*1» 19601 в*ови1у, 1971 ). Открытие ее стимулировало поиск других биологически активных форы витаиина А* В этой отновании особенно интересный предотавляется изучение печени, поскольку в этой органе аккумулируется большая часть поступавшего о пищей витамина А, используемого в дальнейшем для обеспечения иетаболитических потребностей других тканей.

В ыаотоящей работе были поставлены следующие задачи:

I* Научить образование ретинала в организме животных.

2* Научить еоэиожнооти ингибированин энзим этического окисле-киа ретиналя в ретнноезу» кислоту с тем, чтобы использовать этот пуп для повышения усвоения витамине А.

Э. Исследовать метаболиты витамина А в печени резких животных.

маткрйш и методы

Пооуацавуе.^иолд^чееких орьтРу. Большая часть исследований выполнена на молодых белых крысах Висте ровского стада, гипо-витаминоэных по витамину А. Использованные в ряде опытов цыплята, кролики, хомяки, мили и морские свинки находились на обычном для них рационе вивария.

Образована ретицаля в организме изучалось в ди шинке поел« однократного скармливания ретинил-ацетата животным, предварительно голодавший в течение 18-24 tacoe,

1мрпалговз н дисуль^рвма! яэ^рвоекаа щивотйыцц.витеу^и? 4 иэу-чали но гиповитемнноэных крысах весом 70-100 г. Витания А я ' -каротин растворяли » подсолнечном масле» содеркеввем 0,2? витамина г. Иенадноя вводили я масле, дисульфирам - в крахмальном клейстере. Доза ингибитора рассчитывалась на 100 г весе* Препараты витамина А к ингибиторе сиермлнвали в течете б дквЯ; животных забивали декапитецией черег оутхи поело введения последней дозы препаратов. В опытах по усвоению витамина и ' -каротина каждая группа состонла из б животных. После определения содержания витамина i в печени кетдого животного рассчитывалась средняя величина по группе. Опыт с каждой до вой проводят и 8-5 поиторностях. В »той серия опытов Лтд о использовало о шло 1 600 крыо,

Злцдки? ментора и дисульfocena яа вктнврорть рртмиап-pKCHt^a киаечняка и печени крмо изучали путем »ведения ятих ингибиторов в течение 5 днеЦ животных вабиваяч черев 4 часе толе введения последнем до»« препарате*

fpftioapg опыт был посталяок uq молодых крысах весом 40-60 г* полу;евших диету йериана * 379 о добавлением витаминов Bj, Bg, РР и Л* Каждая группа состояла яз 13 »Hbotrux, поровну секцов я о емок. Bao крис определялся «хенедепео.

Препараты витамина А. Ретинил-ацетвт - оромыиденны! препарат, получаемый в СССР го методу проф.Г.К.Самохивлоав! ретинол получали путем омыления ретинил-вцетата; ретянзжь - окислением ретинола по Bojwj (В «II et «1. ,19*0), ретиноевуш khcíotj к мо-тидратиноат - из рстиналя по Баруа t B«m» ч!., 1969 )•

Содержание всех_фрри виуами^. А было рассчитав» ив основ а-нкм нх адсорбционных данных о использованием сдадуюилх коэффя-цивнтов экстиккции а этаноле): для ретикола - 1635 яра

3?5 имк, ретиведн - 1530 при 381 инк, ретанал-едетate - 1550 ups 325 мин, ретмпаевой кислоты - 1500 при 350 инк ( ко II «г, ВиЫа, i960). Ретинил-зфиры определялись в расчете на содержание в вид

ретинола. Спектры сникали не регистрируйте« спектрофотометра Брword UT-Vltí (Щр ).

Эзетракцвн липидов ,иа, iKfiBgfl* Печей, и кишечник экстрагировали смесьш га к сен-серна» эфир (Sil) после растирания ткани с безводным сульфатен натрия. К содержимому кишечника, полученному промывениеи кишечной трубки, прибавляли равный объем этаноле и экстрагировали reксенон. Лигшдные экстракты промывали водой, висувшвали сульфетои натриа и упаривали в вакууме на роторном ■опармтале при 95-40°. Остаток растворяли в генсека и хромато-грефировали на окиси алюминия.

Тонкослойную ХгоматогррФИР ÍTCX) применяли для разделения и очистки всех форм витании а А. Хроматографию проводили на стеклянных пластинках о незакрепленным слоен нейтральной окиси алюминия 1?еанвл), девактивирдаанноа добавлением 10£ воды, в темноте, при комнатной температуре. В качестве систеи растворителей иоподьаовали 5% раотвор эфире в гексене для раздиления ретинола и ретинил-вфиров; гептан-эфир-агенол (80:20:4) - для выделения ретикали и дополнительной очистки его от ретичид-ефнров. Для ре-тиваля на тканей часто использовали последовательную рехромато-графию в различных системах растворителей. Элицию проводили смесь» гансац-эфир

Для идентификации ретинадн из тканей жирных использовали УФ-спектри ъ геисене и этаноле; восстановление ретиналя в ретинол -бор гидридом натрия и адкогольдагидрогеназой из печени лошади ^Реанал) о последующей ТСХ и превращением ретинола в ангидро-вятеиин д; реакции в tíbClj к с тиобарбитуроао* кислотой.

Для накопления метаболита в препаративных целях 20-100 крысам обичво скармливали в течение 3 дней гю 20 мг ретинил-ацетвта и спусти z оуток животных забивали декепятециеВ. Экстракцию метаболита ив печени проводили либо после растирания ее о сульфатом натрия, либо обработкой сырой ткани смесь» гексан-этанол-вода tl2t4il). Препаративную хроматографе вели на колонках с окисью адшинкк. Фракцию между ратинил-пальмитатом и ретинолом собирали, упаривали и подвергали дальнейшей очистке о помощь» ТСХ в система растворителей гешан-афир-зтанол (.70:36:4) до соотношения максимумов 334:275 IB гексане) 2-2,2.

Метаболит идентифицировали по КГ, шмонгсо-жеятому цвету я красной нестойкой окраске о аьсл.^ . помимо мотодов, указанных для ретине л я, при изучении метаболите применяли гидролиз 1н КОН в 90& этанола (.85°' Ю мин.) и липазой поджелудочной железы свиньи; ИК-спектроскопию в четыре ххлори с том углероде не прибор) Ий-ю ^ГДР) и включение метки О18.

Еми К^^Ьт?^ Рааззи а я _1К>) .и ратднальгае^йВО[^ца$на^£Д) актив нооть тканей оп роде лилась в сунернатектах гоиогенвтов мукоаы кишечника и ткани печени в калий-фосфатном 0,054 буфера рН 6,5 (1:5), получен них центрифугированием при 16000 об/пик в течение чеоа при 4°, Реакционная смось содержала I мл источника ферменте» и 0,4 икЛ ретиняля в 0,1 мл димотилсульфоксида. Активность РД определяли по разнице в количествах ротиноевой кислоты, образующейся с добавлением 3 мкН НАД+ и без него.

определилось в форме ее метилового эфире, полученного реакцией с диааометеном»

РКЭУЛЬТАТи ИССЛЕДОВАНИЯ

Известно, что процесс адсорбции ретинил-ацетате в кишечнике животных сопровождается образованном свободного ретиноле и его эфнров. Неми было обнаружено, что при усвоении ретинил-ацетата, помимо укеэанных продуктов, в стенке тонкого кишечника крысы,кролика, мыши и цнпленке появляется ретинель 1тебл,1), причем его накопление увеличивается с повышением дозы ретинил-ацетата. Тек, при введении крысе 2,5 мг ретинил-ецетета накапливалось 1,9 мкг ^эетинадя, е при 15 иг - содержание ретиналя в кишечнике достигало 46,3 мкг. Изучение динамики образования различных форм витамина А в кишечника крысы после од некратного введения животному 15 мг рети ни л-ец от ат в показало, что максимальное количество ретинола <0,56-0,6В иг) появляется в течение двух первые часов адсорбции витамина, ретинил-пальмитата - через 2-4 часа 11,74-1,60 мг), а содерюнис ретикаля в стенке кивечника непрерывно увеличивалось на протяжении 4-х часов усвоения ретинил-ацетате. Однако при анализе кишечника через сутки были обнаружены только две формы витамина А - ретинол 'л ритянил-польиитзт ; ре тина ль в кишечнике отсутствовал.

I всех животных производился раздельным шин сценки а-мечник» х оодер«*«ого| »о »сех случаях ретнналь обнаруживался только в отенке, но ве в содержимом квкки. Это поаволяат считал, что смнтов ретикаля происходит толысо в станка кишки, тогда как гидролиз и ревете (ш фи нации ратинил-ацетата вдут также м в про-овете киаечнжка - ретинол и ретякил-оадьмитат постоянно находи« ли в фбеих фракциях кишечника напротнжании уововиия полученного животным антаияка.

Таблица I

Содержащее разных форм витамина & в тонком кишечника хиветшд после однократного введения ретинвл-ацетата"

АИД животного ¡Доза ретя-НК1- 1 ацетат |мг Время поола введения, чао ■ Станка тонкого кишечника ' него одного живот-

{Ретинахь, ] «кг ■Ретинол, | мкг 1 ■Ретинид валыш-¡тат.мкг -! Ретина»/ 1 Ретинол 1

2,5 I 1,9 52,8 65 1128

5,0 2 9,в 64,3 109 1:7

Крыоа 10,0 2 . 18,9 57,2 155 1:4

15,0 а 46,3 246,0 807 1:5

Ими 15,0 2 1.9 16,0 55 1:Л

1ролнк 120 4 49,5 780 1660 1:15

Цыпленок 80 4 15,1 36,0 2вг 1:2,4

* Ретяиил-ацетаг вероральио вводили животным в 0.2 их подсолнечного маола о 1кг .¿-токоферола! кролику витамин вводам ■ 2 приема па 60 мг/0(8 ил нас«« о "шнтервадом в I чао.

Ив *еб*г.1 видно, что ооотноавния ретинадь/ретинол. вяачятель-ло варьирую? 1 аависииооти от вида животного, доан ретинил-аца-хата я »рамени шолв «го введения, доотигая в случае крнои и амнаекка величия 1:2,4 я

Ротмваль, видаланш! и очищеншВ кз кииечника животных о помощью 1СХ на окиси алюминии, народ о типичными максимумами поглощении в УФ-свеха (.881 шк в атаноле я 965 нмк в гак сане), имел дополнительное поглощение в области 275 ммк, обусловленное, осавядно, примесями шла дно го характера, так как максимум

276 ш резко снижался после проведения мягкого щелочного гидролиза (,рно.1>.

Рис Л* Адсорбционные кривые ретиналя ив кичечника рваных кивотккх* I - крысы, г - то же после гидролиза КОН.

. 3 - мыши, 4 - цыпленка, 5 - кролика* Спектры 1-4 Даны в гекоена, 5 - в этаноле.

Помимо УФ-спектроскопии для идентификации ретиналя м кишечника животных были использованы реакции восстановления »го в ретинол бор гидридом натрия и алкогольдегидрогеназой в присутствии НАД-Н. Энэиматическое восстановление происходило только после дополнительной очистки ретиналя щелочным гидролизом. Всо продукты восстановления имели типичный спектр ретинола о максимумом 325 мих. При послевдсйей дегидратации ретинола получался енгидровитамии А,

В реакциях в и тиобербитуровой кислотой все образцы

ретинеля из кишечника животных показали типичные максимумы поглощения - 650 и 530 мик соответственно. Таким образом, на основании подученных результатов можно считать, что в процессе усвоении животными ретинил-ацетата в кишечнике нераду о ретинолом ■ ретшшл-пальмитатом образуется ретяналь. В связи о этим пред-

от&вляловь интересным изучат» реакцию анзиматичеокого окисления ретявалв в ретяноеод) к я ело ту м значение этого процесса для усвоениявитамина А.

Z* Э^зиидтнчедцоа .окисление ретиналя в ретиноев^ усвоения ^тащнц Д.» .

Изучение характере ферментативного окисления ретин ала в р«-тяиоезув кислоту проводили ж оупернатантах гомогенато» муко-«даль а ого сдоя кипочнякв и печени ирыо и цыплят. Опыты показали, что окисление ретин ал и значительно стимулируется яри добавлении НАД; причем в оулернетантах кишечнике образование ретин оевой кислоты i »том случае возрастало ъ 9-4 реве, в в случае печени -- я 1,5-2 рвав.

Обе реакции внэиматячаокого окисления ретиналя {т.е. о НАД и без neto) тормозились при добавлении в инкубационную ореду меяаднона я дксульфирама tтабл.2). При нци пи ел я ой основой иополь-зоваыия яеиадионе * диоульфирама для изучения роля внзиматичео-кого окяоления ретинам в метаболизме витамина А является то,что ш отличие от Ш01Б, вти ингибиторы на оказывают влияния из актнв-коот» ал кого льде гядро ген san.

Таблица 2

Действие менадаона и днеульфираиа на образована» ретияое-во» хисдоти в оупернатантах тканей ^активность выражена i от контроля, принятого за 100)

Ингкбятор ¡Концентра- | ЦИЯ,«Н ■¡Кииечник {Печень ¡Кишечник ¡ Печень Ijtgjcu ^ ¡|gucu^ ¡цыпленка {ципленка

На* 0 100 100 100 100 100 100

Меяад*ом 0,25 ■ 25 80 62 44 42 70

Дисужьфираи 0,32 60 51 52 40 26 49

Дополнительно к опытам ln-vltro 1табл.2) было проведено яаучение действия ингибиторов на окислительные ферменты в самом организме путс-i их скармливания крысам о последующий определением ферментативной активности в оупернатантах гомогенатов тканей о добавлением и беа добавления НАД.

Таблица 3

Дваотике мевэдаона к лвсулы^рвма в» ретииальокисля»-цув активность кишечника я печени ирю в о пытаНо у!***

Источник фермента 1супер-ватант гомоге-вата) | Ретииоевея кислота, ммиК/50 мг ткани/15 мин

Без добавлении НАД 5 С добавление)! НАД

¡Контроль!Какали-!дисуль-[ ¡он |$ираи !к<жтроль{мвяв- | |дисн ¡Дисуль-1 фи рам

Кннечкик 72 15 II 140 22 9

Печень 41 32 27 50 36 29

11 Животные получали по Z нг манадиона или дисульфираия в течение & дней.

Из представ лонных в табл.8 данных видно, что оба ингибитора снижает активность ретинальокисляюэдях ферментов в шивчкике иа 60-65%, а в почени - на гО-ЗЩ. Сопоставляя дек кие о накоплении ретикаля 1 иукоэе кишечника при усвоении ретинил-ацетата (.табл.!) о высоко! ретинальоксида&ноВ активность» «той ткани (.тэбл.Э), издалось логичким предположить, что снижение зтоВ активности под действием иенадиоиа я дисульфмраиа должно привести к повыяв-вив ^овоеижя витамина 1* результаты опытов, представленные и таблицах 4 и 5, подтверждает »то предположение.

Из табл.4 видно, что усвоена« красе« * -керотипа, ретине ля и ретинид-ацетата при добавлении к их растворам и масле жа-надиона увеличивалось в среднем на 80,60 я 55% соответственно, «.е. положительное действие менадиоиа проявлялось «о всей источниками витамина А. Введение врневм различных доз дисуаьфира-иа улучзало усвоение ретинмл-ацетатв не ЗС5». Ввиад отсутствия дополнительного накопления витамина А в печени крыс при высоких дозах дисулъ^ирша 150-150 мг> мож: ) сделать предположение, что кяаечннку, а не печени принадлежит ведущая рожь в окислительном превращении ретиноля в ретиноевуи кислоту у этих животных. Дополнительным подтверждением этого' являются результаты оштои о различными способами введения ингибиторов. Ввутришиечные инъекции ингибиторов, тыс же как и скармшввние менадиоае черев сутки

после введения витамина А оказывали всегда значительно меньшее действие не его усвоение, чек при одновременной введении витамина вместе о ингибитором. Значительное повышение усвоения витамина А у крыс при одновременном снижении ретинавьокиолщщей активное« тканей под действием манадиона и диоульЗирамв указывают на важность этого процаооа анаиматического окисления ретиналя и возможность повышения усвоения витамина А о помощью ингибиторов.

Таблица 4

Влияние скармливания менадиона на усвоение крысами витамина А и в -каротина

Суточней доза источнике витамина А, мг

Накопление витамина А в печени

Контроль и кг

С добавлением менадиона, мг/день

0,2-0,5 Л££_

1-2

мкр

каротин

Ретинель

Ретмнил-ацетат

0,5* 52,61 5,8

0,8 59,51 6«9

0,1 109 15,2

0,5 572 126,7

1,0 982 131,0

0,1 118,21

0,25 829 +24,9

0,50 661 +56,5

1,0 1600 +59,0

2,0 3220 178,5

64,51 3,2 122,8 82,71 7,Э 139*0

В средней 160,9

1321 4.6 Ш

¡848 1619

1941 6,3 485+22,5 1056111,5

5708148,0

170,8 147,4 159,6

1 20,5 146,а 1 192 154,8

В среднем 151,5

507 1 14,5 154Д

1081 1 64,6 168,7

2118 1 82,5 133,3

115,12171 195,8

В среднем 151,1 В среднем 147,0 * Продолжительность этого опыта - 9 дней, остальных - 5 дней

TadJiqi S

Влияние окармлявання диоудьфмрема яаусювни» крысами рвтиинл-ацвтата

Суточная доза Накопление витамина А в печени

дноульфирама, Контроль, икг С диоульфяремом

иг икг % к контрой

в 1680* 82,4 2ООО* 46,8 122,8

6 1668* 14,8 2062* 30,7 132,8

IS 1647*141 2234*106 135,2

60 1640*146 2238*165 185,8

ISO 140о£ 99 1740*128 124,8

В среднем 180,4

С цель» выяснения деКатвип ианадиока на уововние фяэкодоги-ческкх доз витамина А быв поставлен рэстовоЯ опыт на молодых А-авитаиинозншс крысах. Как можно видеть на рио*2 длительно^ V введение менедиоыа двум группам животных оказало положительным аффект, стимулировав примерно на 80% роот молодых врио.

Рмо.2. Прирост веоа крыо 1г) под влинняем витамина А при введении менаднона.

1-отрицательныК контроль)

2-ретинил-ацетат 0,25 икг/ /день{ З-то «а + менадиов

I мг/день( 4-ротивил-ацетат 0,75 мвг/день( 5-то же + менедяон X мг/день.

it ten

В гот ре»1*ыат 1 денных условиях опыта мЬхно расценивать как по-каватель улучжоиия усвояемости фиаиологяческиг доз витамаяа А а присутствии менадлона в отсутствие токсвчаокого эффекта послад-наго.

8» Научена» метаболитов витамине А в печепв

______вдетш_____

Состав мегаволитическ* активных форм вятаилна в печени * ве-риод усвоения его животным важен для понимепяя вдтей яспольвоаа-вия ватенина в организме.

В I оеряи опытов исследовали состав различим* форм витамина А в печени мыии на протяжении суток поола введении до» и рати-вил-вцетат» (рио.В*.

Рю.Э. Динамика разных форм витамина А в печени шел после однократного верорального введения 5 мг реги нал-ацетата. Время дано с момента введения витамина имам. Количества всех форм витвиияа А выреязно в расчете не печень одвого животного. I, ч-ретинал»5 С, 2-ратянол[ Я.З-ретинид-пальматат.

В печени мыши била обнаружены 8 формм витемнна А, причем динамика ретинеля заметно отличалась от динамики спиртовой к вфирноЬ форы витамина. Ретиналь »парные обкармливался i печена через 2 часе после »ведения ретиннл-ацетата, количество «го резко воя-рsotало к 3-4 часам, а через сутки, несмотря на зысокое содержание ретинола и ретинил-пальмитетз альдегидная форма витамина я» обнаруживалась. В опытах с двумя другими дозировками ретиннл-ацетата 110 и 15 мг) яаблсдалась та же ^конорменооть! максимум накоплении ретиналя в печени (Д 1,2-20,4 мкг> неизменно оонаружи-валоя к 3-му часу после введения витамина животному. В втст я» период в печени uveft &ли найдены оамые выоохяе количества свободного ретинола. Максимальные соотношения ретиналя к ретинолу достигали Itl,5, но на протяжении адсорбции ретинил-ацетата и» кишечника они значительно менялись, т.е. наблвдйяесь те же жар-тина, что и в стенке кишечника ари всасывании лицевого витамина Юм.табл.1). В опытах in vitro было показало (.дмитровский, Тепалцяи, 1ЭТ0), что концентрация ретиналя.» инкубационной среде определялась ¿оотноаеняам скоростей двух реекци», катализируемых аяькогольдегидрогеназой и ретинахьоксндазой. В условиях la vive действует помимо »того фактор комплексообразавания ретинам с различными соединениями. Этим, видимо, и объясняется вариации в соотношениях ретянехъ/ретинол, яайденкие в биологических объектах t Pi «к «ъ *1., 196* ).

Спектры образцов ретиналя из печени мыии (рио.4), снятие в гексаае я атаноле, ииели типичны» максимум» поглощения я П-све-те 136S и 381 ммк соответственна). Дополнительно ретияаль бмл идентифицирован по колориметрическим реакциям о треххлсристой сурьмой и тнобарбктуровой кислотой 1660 я 580 ммк)* В то жа вра-мн, при восстановлении ретиналя боргидридои натрии быв получен продукт, имеющий типичную флуоресценцию в Bt ретинола, но о сииумом в области 818 мяк. Дополнительная идентификация «того продукте воостаковленин да реакции Карр-Прейса (макс. 620 ммк), а также получение из него ангидровитамина А (кривея 4 рио.4), дающего в реакции с сурьмой продукт о максимумом 620 ммк, окончательно подтвердили, что при восстановлении ратжкяля ив почоня ыыяи образуется ретинол.

Ри о. 4. Адсорбционные кривы» ретиналя ив печени пиши и его - производных. Спектры1,4 даны в гексане* 2,8 - в атаноле. 1-ретинадь до гидролиза, 2-после гидролиза КОН, Э-после восстановления КлВЕц. , 4-ан гидровитанин кз ретиноле te 8.

В таблица 6 представлены результаты второй серии оштов -на кроликах, хомяках и морских свинках. Печень кролика Анализировалась на протяжении 8 суток после высокой нагрузки животных: ретинил-ацетатон;'ратинель яе Чыл найден нк в одной из обраацов печени, хотя концентрация ретинола достигала в ней 780 мнг.В печени двух представителей грызунов - хомяка и морской свинки -относящихся к тому яе отраду, что'и мывь, также были обнаружены только спиртовая я эфирная формы витамина.

При проведении Аналогичных опытов на крысах в печени животных наряду о ретинолом к ретинкл-падьмитатом била обнаружена новая форча витамина А, ранее ке описанная в литературе. Накопление этого метаболита в печени било пропорционально дозе ретинил-ацетета и времени его введенияЧтабл.7). Через 4-6 чаоов после однократного введения крысам витамина А »тот метаболит в печени обнаруживался лишь в следовых количествах, его накопление происходило через 15-24 часа, В хинечнике, почках и надпочечниках

«то* метаболит не бил найден* Нетаболит накапчивался M оечаш к после введения крысам ретиналя; va метхл-ратнноата оя ив оЗрвго-выазлси. Новая форма шташьи А была обнаружен» также > печени »»росли* крыо, оодержавжихоя ив обычном рациона вивария, но ив найдена у молодых А-гиполитекиноаишс животных.

Таблица в

Содержание метаболитов витамина 1 в печекж разных животных после однократного введения ретикил-ацетата

Вид ¡Дозе ретинил-! животного) ецетата,иг | Время после! введении, чао J Ретинол, ИХГ ретинил- , |пиьинтвт, иг

Хомяк 5 2,5 65.6 1,89

Морская 2,5 45.» 0,78

СВИННН S

Кролик ISÛ 2,0 270 8,2

ISO 4.0 440 22,0

ISO 24,0 700 84,0

170 72 824 56,7

Ретинил-вцетет iводили нероральяо в виде IQH раствора в подсолнечной масле, содержащем 1)1 л-токофероле. Содержание ретиноле и его в^ира даио в расчете на печен* одного животного*

Для изучения метаболизма новой формы витамина А в организма было проведено несколько опытов о введением ее авитаминозным крысам. Ори анализе кишечника и желудка »тих крыо никаких других форм витамина на Сию навдаво, а в печени обнаружат только новый метаболит (.тебл.вЬ В течение 7 оуток 57,2 миг метаболита полностью метабодизироаались. В просвета к стенке кишечника метаболит подвергался незначительному гидролизу. Содержание «а »того метаболита в печени крив спустя два педеля оооле окончания скармливания ретянил-ецетата оставалось примерно на одном уровне, что, видимо, овязаио о процессами его постоянного образования я рао-пада в печени.

Исследование физико-химических овойотв втого иатеболита крыо о применением И£-и УФ-спевтроекопии, вооотеновлеаия, гидролиза и других методов позволило »включить, что он содержкх квто-группу и сложно эфирную связь (.табл.э, рис.5) ; на в*ом основании

он вдевав пето-метаболитом витамина А. Спектры кето-иетвболитв и его производных в УФ—свете представлены не рис,в.

Таблица 7

Накопление метаболитов витамина А в печени крыс после скармливания различных форм витамина

■—■•——-■....... ■ х........."'

Форма витамина jДлитель-

А мг/лн. ность

л. нг/дн. |опытв,дни

I

-1-

Нехотение в печени

1

! Отношение Ыатоболи-

Ретннил-{))отабояит{Ретинол |i|TK°pe-! мхг 1 миг ¡тинолу "

4-

Л-

Л-

Рвтиаил-ацетм

Ретиноль

Цвтил-

ретиноат

--- I)

-----2)

0,2 5 0,43 2,0 1,6 1,25

2,0 5 1,95 к,о 12,6 1,28

5,0 5 б,га 34,2 30,6 1,12

10,0 1 1,78 24,Г, 9,3 2,60

16,0 I 2,62 47,0 £4,5 1,92

20,0 I 2,66 27,4 27,2 1,00

20,0 3 18,52 108,0 248,0 0,44

10,0 2 4,85 57,С 85,0 0,67

10,0 2 0 0 0 «р

■ - 0,24 7,7 7,8 1,0

- 0,017 0 Следы -

I - крысы 1250 г), содержавшиеся на стандартном рационе вивария.

Z - гяповитэминозние крысы (вес 40 г)

; 3№ ЗШ ЗШ }Ж тв 2tM ttOO tSOO *UV ItVO ЯЮ0 Cff'

Рис.5. Инфракрасный спектр кето-метаболита витамине А

Твоя ца 8

ЦвтаОолиам нового метаболита литамиаа А я органах крысы после однократного скерыливеяия »го в количестве 2 кг/0,2 ил наола

Время пос- Количество нового метаболита, икг

ле введе- Желудок ] Тоета кииечник Печень

ния ¡Содержимое { Стеки*

1,25 час а,6 286,6 88,9 0

2,50 чао 78,2 89,4 16,0 57,3

Э суток 0 0 О 87,0

7 суток 0 0 0 0

«) 38 30 И 32 Ю 2« 26 2*>«КМСИ

рио.6, Адсорбционные кривые кето-метаболите витамине А я его производных. Спектры даны в гекоеие, 8-6 -в этаноле. I - нето-метаболит после однократное хро-иатографии; 2,3 - то же после треххрвтно! хроматографии,* 4 - кето-мет-еболит после восстановлении I 5 - то-мет аба лит после гидролиза ЕВД.

Таблица 9

Фявико-хнмическяе свойства кето-метеболита и его производите

Форма ме-

Т660ЛИТ8

Обработка

Спектральная-Д»« рактарнстика

Покввагвли ТСХ па

Исходная

Т» к«

Походная

Восстановленная Та ив

Вохохяая

Гидродиао-ваяыан

То к«

ИдО^.О.би. К« неволе вьел.^ ТИГ к%он

V «ВВ^1ВОССТ8ИОВ-

аепжая форма)

КОН

8ЬС13

ИС1

Алкотолмешдро-гёнаэа

хф азо.гво ммк

при В50 ммк - II00

ИХ,1673)1748 СМ"1 М,164В{ 1678 (1719 1748 см

625-»- 480,6О мми На реагирует И»885 ммк

»,825 8&-1В00

-в облает ретя-аеля,авет желты!; темчы! в УФ,красная окраске о иьо13 То хе

81 -в области окемме раткналя:оранжеввя окраска с

В1 -в области рети-

Ы, 1748,9525 см"1 аола.хелто-аеленав флуоресцевция в УФ,

У* »825 ммк

61в ммк Ангидро форма ее о(1 разу от оя Ретжнал на образуется

синяя окраска овьс1} То же •

КШ,тапэ«а(,гидро4УФ 350,280 мин ллэовавнй форма

СН,С0С1

Ллви^

ИВ*1678,ВЬ30 см"1

УФ— 350,260 кик

УФ*325 ммк

к Спектры » УФ даны а атаволе, ИЯ - в

а* -в области ретинол», темпы Я в УФ, красива окраска с зъоц

а* -в облаотв рета-ааля,темный в УФ, краснея окраска о а(Ю13

Е-1- —в области ретм-кода.желто-эеленеа 5лу орвсценци.1, сиюга мера ска в

Суммированные в tacto.9 характер«емка кето-метаболита показывают, что он отличается от ранее известных природных форы витамина А. В пользу того, что найденное ссыдинение действительно является новое формой витамина А, а не артефактом, говорят следующие данные. Во-пцрвых, этот метаболит на обнаружен в печени других животных, даже таких близких в систематическом отномении и крысам как мышь. Во-вторых, он нейден в печени обычных взрослых крыс, получающих стандартный рацион вивария, что жошчает возможность рассматривать его в качестве вероятного продукта детокоикацки, образующегося при высоких нагрузках витамином А.

ЭШШШЕ

До последнего вреиенк считалось, что метаболизм витамина А в кижечнике сопровождается образованием ретинола и ретинил-поль-митата. Наши исследования показали, что наряду о «ткни формами нормальным метаболитом штанина А в кишечнике является также ре-тиналь. Это было прослежено на разных животных Upuoax, кроликах, мышах, цыплятах) и в разные сроки уовоения витемяна А.

Обнаружение ретинаяя в стенке тонкого нишечннка поставило в сво» очередь вопроо о степени его анзкмэтического окисления в ре-тиноевуш кислоту и значении этого процесса в обмене витамина а. Путем применения ингибиторов нам удалось подойти к рамени» »того вопроса. Оказалось, что при снижении ингибиторами ретинальокио-ляющеЯ активности тканей накопление витамина а > печени увеличивается до 1,5 раз . Исходя из атого можно думать, что и в нормальных условиях заметная доля поступающего в организм витаикня а превращается в ретиноеву» кислоту, которая хотя я обладает роот-отимулирующей активностью, но быотро удаляется ж* организме.

Помимо таких промежуточных продуктов метаболизма витамине А в организме как ретинол и его эфирная форма, ретина» к ратиное-вая кислота нами обнаружен ноърШ метаболит, образующийся » оачен* крыс в возрастающих количествах по мере увеличения два витамина А. Изучение этого метаболита о применением ПК- и УФ-спектроохопии, восстановления, гидролиза, включения метки (г8 показало, что он накапливается в форме эфира и имеет квто-группу. Кажяо надеяться, что новая форма окажется полезной при изучении механизма биологического действия витамине А у животных.

ВЫВОДЫ

I« Установлено, что в процесс» усвоения витамина А в отеи-ке тонкого кишечника разных животных, а у мыаей я в печени, происходит накопление ретиналя; отношения ретиналя к ретинолу достигали Itl,5 -

2. Ретиваль тканей животных идентифицировали nORf при тонкослойной хроматографии, спектрам поглощения, восстановлению в ретинол о последующим превращением его в аягидровитамин А, а также по реакциям о треххлористой сурьмой и тиобарбитуровой кислотой.

3. Исследование анзиматического окисления ретиналя в ретино-евую кислоту в бесждеточных акстрактах слизистой кишечника и печени показало, что ают процесо стимулируется при добавлении НАД соответственно в 1,5-2 и раза, и значительно мнгибируется не-надионом и дноульфирамои.

4. В опытах in viro при ингибированин ретинальокисляющих ферментов путем скармливания крыоам указанных ингибиторов усвоение витамина Ai ^ -каротина повышалось er 30-50$.

5. Изучение состава метаболитов витамина А в печени разных животных привело к обнаружению у крыс нового, неизвестного ранее метаболита, накопление которого возрастает по мере увеличения дозы атого витамина. При исследовании свойств нового метаболита витамина А различными физико-химическими методами установлено наличие у него кето-группы и сложно-эфирной связи. Этот метаболит найден и в печени здоровых взрослых крыс.

Проведенные исследования позволили выявить некоторые новые оторони метаболизма витамина А у разных животных.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

X. Дмитровский A.A., Соловьева H.B. 1973. Улучшение усвоения ^-каротина и ви там к на А о помощью менадиона (витамина 1С;) как ингибитора анзиматического окисления ретиналя. Вопросы совершенствования племенной работы и технологии в животноводстве. Сб. . научных трудов НВА им. К.И.Скрябина, 64, 73.

2« Соловьева Н.В., Дмитровский A.A. 1978* Окмслштельно-вос- . становительные превращения ретиналя i органиаив ■ IX роль в метаболизме витамина А. Фиэиолого-биотамические и генетячесхяа основы повышения эффективности использования корнов в хивотяовод-отва. Тезисы докладов и сообщений Всесоюзного совещания, 89. Боровск.

3. Дмитровокий A.A., Соловьева Н.В. 1973. Знаииаткчвеков . окисление ретиналя в ретиыоовую кислоту ж уовоение витемина А и

в -каротина. Прикладная биохимия я микробиология, 9, вып.3,418.

4. Соловьеве Н.В., Дмитровский A.A., Ермилова J.K. 1974. Накопление ретиналя в кишечнике животных лооаа пероральвого введения ретиннл-ацетата. Прикладная биохимия к микробиология, 10, вып.1, 99.

5. Дмитровский A.A., Соловьева Н.В., Ермилова Д.К. 1974. Новый природный метаболит витамина А. Прикладная биохимия и макробиология, 10, вып.8, 350.

6. Соловьева Н.В., Ермилова Л.К., Дмитровокий A.A. 1975. Обнаружение ретинальдегада в печени мши. Прикладная биохимия я микробиология, II, выа.1,'67.

7. Дмитровский A.A., Соловьева Н.В., Ермилова Л.К. I07S. Определение различных форм витамина А о использованием тонкослойной хроматографии. Методы современной биохимии, 88* йвд-во "Наука".

В. Дмитровский A.A., Соловьева H.B. 1975. Анализ различных форм витамина А меченых стабильными изотопами 0*® ■ Н2 о помощь» инфракрасной спектрофотометрин. Методы современной биохимии, 77. Изд-во "Наука".

Результаты исследований доложены!

1. На научной Конференции, посвященной повышения аффективно-сти кормления о.х. животных в Московской Ветеринарной Академии

им .К.И .Скрябина в мае 1972 г.

2. На научной конференции Институт« ояохиыии им.А.Н.Ееха АН СССР в декабре 1972 г.

3. На Всесоюзном симпозиуме "Научные основы сбалансированного кормления сельскохозяйственной птицы". Боровск, ¿1 июня 1973.