Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение пространственной структуры доменов гистонов H1 и Н5

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение пространственной структуры доменов гистонов H1 и Н5"

*'; 'I С*

" ^ МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА,

ОРДЕНА ОКТЯБГЬСКОП РЕВОЛЮЦИИ II ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЯССКИН ФАКУЛЬТГГ

На правах рукописи УДК 577.112.823

АДЖУБЕЙ Иван Алексеевич

ИЗУЧЕНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ ДОМЕНОВ ГИСТОНОВ Н1 и Нб

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Москва -1992

ГыЗота выполнена на кафедра молекулярной Оиологт оиологическсго факультете Московского Государственной университета им. Ы.В. Ломоносова.

Научный руководитель -кандидат биологических наук, профессор И.А. Крашенинников

Официальные оппоненты доктор биологических наук Н.Б. Гусев, доктор (¡изико-ыатематичаских наук В.Г. Туманян

Ведущая организация -Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита диссертации состоится 8 декабря 1992 г. в Ю00 час. на заседании Специализированного совета Д.053.05.70 при МП имени Ы.В. Ломоносова по адресу: II9899 Москва, Ленинские горы, ИГУ, биологический факультет.

С диссертацией ыогно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.,

Автореферат разослан Нолйя 1992 г.

7"

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

ii..,¿i

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность пройдами. Исследования последних лэт посвященнне изучению генетического аппарата еукариотичвских организмов продемонстрировали ого уникальную структурами и функциональную

i

организации, оСэспечшшвдув храпэшю, репликацию и экспрессию наследственной информации. Важную роль а атпх процессах играет сложный нуклеопротеидЕшй кошлэнс хроматина, специфаческое строение которого поддергивается дас-солховыми д белок-белковими взаЕшдействкящ (Pelseaíold, 1992). Функционирование хроматина в кйзнешом цикла клетки подразумевает. ряд регулируемых структурных изменений (репликация, конденсация, деконденсацяя), затрагивавших как нукдаосомшй, так и надцуклеосомннй уровшг его оргашгаации. Эти измешиия могут прободать только с участием гистонов - основных бэлкових компонентов хроматина.

Особый интерес представляет груша лизин-богагах гистонов Щ и родственных ш гистонов HS. Если роль коровах ГИСТОНОВ Н2А, К2В, ИЗ и Н4, составлявших гистокошЗ скгекэр, форшруший кор-частяцу шш "сердцевину" нуклэосомм, которая является основной структурной единицей хроматина, хорошо изучена (Arente et al., 1991), то для гистонов групш HI/Ш механизм участия в поддерга-шш структуры хроматина менее понятен. Известно, что молекулы HI связываются с кор-частицей п с кежнуклоосошыми (линкершни) участками ДК в области их входя. и выхода из кор-частацн и спо-собствувт образовшмв соленоида, содержащего 6 г 'классом на шток, который формирует хроиатшюшо фабриллы, диаметром -около 30 ш, являшиеся главным элементом конденсированного хроматина (van Holde, 1989). Известно также, что транскрипционная активность участков хроматина связана с удалением части гистонов НГ (или Н5) и по крайней мере частичным разрушением фибрилл

(Qrunfitetn, 1990; Kamakaka and Thomas, 1990). Вопрос о том каким образом вовлечены гистоны Ш (наряду с другими.белковыми факторами) в регуляцию транскрипции оказывается таким образом весьма звжен для понимания механизма экспрессии еукариотического генома.

Строение гистонов группы ШУН5, как и других гистоновых белков, характеризуется аномальным аминокислотным составом и асснметричшм распределением аминокислотных остатков вдоль оси молекулы. Наличие выраженного разделения молекул Ш и Н5 на центральный глобулярный домен и сально обогащенные положительно заряженными аминокислотными остатка?.»: лизина .и вргишша концевые домагш приводив к мысли о том, что н-концвеой и протяженный с-концевой участки втпг гистонов взаимодействуют с ДНК, а центральный домен участвует в белок-белковых взаимодействиях. Действительно, С-концевой домен прочно связывается с ДНК и играет существенную роль в конденсации хроматина (Allan et al., 1985) а глобулярный домен mosst взаимодействовать с другими молекулами гистонов (fllotov et al., 1973; Boulila et al., 1980), с негистоновдда белкеш хроматина (Ring and Cole, 1979) и со специфическими сайтами ДНК (Маппаггааа aad Oikarinen, 1990). Роль короткого н-концевого домена мало изучена.

Дальнейшее выяснение функции гистонов Ш затрудняется, однако, крайней недостаточностью данных об их пространственной структур». До гих нор отсутствуют результаты рентгеноструктурно-го анализа глобулярного домена - едаастпгнрого фрагмента молекулы, который удалось кристаллизовать (Gra2iano et al., 1990), в построенная с помощью метода двумерной ВДР-спвктроскошш пространственная недель глобула Н5 (Clore et al., 1987) недостаточно подробна, показывая только взаиморасположение а-спиралыш

участков далипэптндпоИ цепи. Почта ничего да известно о пространственной структура концовах доменов молекул гистонов Ш а Ii, что затрудняет модедировшшэ' их взаимодействия о ДНК. Известно, что в структурном отношении докшш но зависят друг от друга и концеше учаотгси, по-видимому', но взаимодействуют о центральной глобулой (Barbero et al., 1982). Parné большинство авторов указывало на отоутсгвжэ третичной упаковки этих участков, что. интерпретировалось как -ах ' "неупорядоченность" (Огаш-ítobinaon anl Prívalo/, 1983). Такому взгляду, однако, дротиворо-чит регулярность в распре дэлешш различных аминокислотных остатков в еволщЕснлая консервативность аминокислотного состава этих участков (Ыаейег -and Eolwi, .1991).

Ряд данных позволял предположить, что конце шэ домены гистонов могут, иметь козформацюз вытянутой лавой спирали типа поли-Ь-яролин II (Есшоза я др., 1976; Рамы и др., 1979). В последнее время, стало ясно,, что st а вторачаая структура, типична но - только для фибриллярных домэнов коллагена и коллагеноподобншс белков, но встречается такке в гормонах белиовсЯ природу (Bluadaii et al., 19S1; к'акагот st al., 1SS4) и вироко раслространона в различных глобулярных балках (Wilncjt and, Tliarnton, 1990; Woody, 1992;). высказывались предположения, что левая спираль типа PPII, благодаря. своей гибкости и большой' ^информационной подвш-ности, может играть важную роль а спвцифнасйа взаимодействия:; биологических. макромолекул, в том числе в связывании балков с £Ш (Adshubai A.A. and Starnberg, 1992). '

Таким образом, получение ноинх данзвд о пространственной структура гистонов HÍ и НБ и in кокформашоншх еосмовкостях может пролить свот кок на структурные вспекта организации хроматина, так и на более общу» проблему изучения механизма роализа- .

цш генетической информации у аукариотических организмов. Цеди и задачи исследования. Цель настоящего исследования состояла в получении денных об осоСевностях распределения влементов пространственной структуры и конформационных возможностях трох-доменннх молекул гистонов Н5 и КГ, существенных для понимания их роли в регуляции структуры хроматина. Для этого были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) получить в препаративных количествах гомогенные образцы пептидных фрагментов молекул гистонов Н5 и Н1, соответствующих их структурным доменам;

2) провести комплексный анализ пространственной структуры этих фрагментов с помощью ряда методов - анализа рентгеновской дифракции, спектроскопии кругового дихроизма, сканирующей микрокалориметрии;

3) проверить предположение о естественной роли левоспираль-ной конформации типа шли-ь-пролин II в структурной организации гистонов и оценить распределение этой структура между тремя доменами молекул НГ/ЕБ; :

4) проанализировать конфирмационные и термодинамические свойства С-концевых доменов (фрагментов) гистонов Н5 и Н1, как наименее изученных участков молекулы, участвующих в связывании с ДНК.

Научная новизна работы. Получение препаратов ряда структурно-специфических фрагментов гистонов Н5 и Ш позволило подробно исследовать различия в пространственной структуре трех доменов Щ/Н5: Н-, С-концевых и центрального. Показано, что существенную роль в структурной организации молекул гистонов Ш/Н5 играет гибкая вытянутая конформация левой ' спирали типе поли~1г-пролин II, которая преимущественно локализуется в протя-

кэином С-кощбво!.! домена мол81сула. Наличие атой структуры, наряду о а-спиралшз, таю» выявлено в центральном глобулярном домэш ИБ.Устаяовдзпо, что шпшшм свойством нопформащш типа поли-ь-пролш II является лшэйная зависимость парциальной теплоемкости и кругового дахрокзма зю*220 им от температуры в диапазоне от б до 35-Б0°0, Сходство термодинамических и спектральных свойств вддешх растворов О-кощзвого дснена гистонов ШЛИ с такошшл для ряда левоетшрвлышх шлтвдшх гормолоп и {додольннх левоспиралышх полшептвдов позволяет' рассматривать эти свойства как обдзш для конформадаи тша пояя-ь-щюгш II в водной среде.

Практическая ценность "работы. Полученные рэзульгаты когут быть использованы в работах по генной'инженерии эукариот для исследования и учета роли различных дошнов гястошв групш ЯГЛШ в активации хрсматша, регуляции экспрессии генов и даф&эрешщров-ке клеток.

Апробация работы. Результаты работа били представлены на Первом Всесоюзном биофизический съезде (Москва» 1932), на 16-ой конференции Федерации европейских биошлгсосках обществ (Москва, 1984), да сйшозиуш "Сизш'.о-хза^чаские свойства биополимеров в растворе и клетках" .(Пущно, 1985),.па Второй международной конференции по биотердодшашке (Австрия, 1985)., додожош на заседании кафэдры молекулярной биологии- биологического (факультета МГУ км. М.В. Ломоносова. ' '

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 5 статей и тезисы 4-х сообщений. .

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литера-

tiрн. Работа наложена не_страницах машинописного текста,

экспериментальная часть содераиг II рисунков н 3 таблицы. Сшсск цитируемой литературы Еключает_наименований. '

материалы и методы исследования Выделение лизин-Согатнх гистонов из тимуса теленка проводили по мэтоду Джойса (I9S4) и гистон Ш очзщала ;С помощь» конооб-ыанной хроматографии нз ОП-сафадексе С-50. С-концевой фрагмент Ш (а.о, I2I-2II) получали специфическим расцеплением кодэкула Ш тромбином го аминокислотному остатку leys120 с послздуицэй очисткой ионообменной хроматографией на СП-сефадексе С-50. Фракции гистонов Щ/Н5 получали из врдарощхтов кур (киггау st ai., 196а) и гистон Кб очищали ионообменной хроматографией на КМ-цалгполозе СМ-32. И-ковдввой (а.о. 1-65) и С-концевой (а.о. 100189) фрагменты Н5 получали шгкш гидролизом молекулы по остаткам Аяр65. в leí" о разделенная продуктов реакции гелъ-фадьтрациай на сефадексе 0-755? и ионообменной хроматографией на Ш-целттозв,: ШнтрашшЙ фрагмент Н5 (а.о. 22-100) получали методом ограниченного протеолиза трипсином (Aviles et al., 1973) И очищали гель-фильтрацией. Анализ рентгеновской дифракцнц характеристического ОиЕц и СгКд излучения проводили съемкой при различной влажности образцов в вида порошка или планки, осаженной на стекло из водных растворов с различным pH, по катоду двоалЧйоррера шш в камере с плоской планкой. Круговой дихроизм измеряли на дихрографах JoMn-Vvon Kark Iti-s и Karle V при концентрации образцов 0,6-0,8 мг/мл и скорости прогрева образцом 0,Б°К/мин. Калориметрические вксперименты выполняли на сканирующем микрокалориметре дасм-1ы при скоростью прогрева 1°к/мии. Удельную теплоемкость полипептидов рассчитывали по (Privalov and

Kheohinaehvili, 1974). Для контроля за гомогенностью препаратов и отсутствием протеолитической деградации использовали электрофорез в I8S ПЛАТ в присутствии ДЦС-На' (Thomas and Korñberg, 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ЮС ОБСУЖДЕНИЕ Анализ распределения вероятностей трех регулярных типов конформацил полипепгядной цепи, проведенный нами для аминокислотных последовательностей гистонов Й и Н5 по методу Chou и Pasman (1978) с использованием относительных частот встречаемости копформации левой спирали типа поли-ь-пролин II (PPII), полученных А.А. Адаубеемс соавторами (1967), показал, что ассимзт-ричность первичной структуры молекул приводит к четкому разделение структурных потенциалов на три участка (рис. I). Центральный участии последовательности И и Н5 характеризуется сложным нере- ' гулярным распределением а-, р- и PPII-потенциалов с хорошим совпадением участков с Ра>1,00 с а-спиралями, выявляемыми по данным двумерного ЯМР (Clore et al., 1987). В N-концовой области центральных доменов Щ и Н5 виден значительный пик вероятности кон-формации PPII шириной около 8 в.о. и ряд менее выраженных участков с Рррп>1,0а. Ряд пиков с Р^>1,00 также характерен для центрального домена Щ/Н5, хотя p-структура не обнаружена в Ю и Ш. Обращает на себя внимание резкое и значительное повышение PPII-структурного потенциала в я- и С-концевых. доменах как гис-тона НЗ. так и Н5. В этих участках молекулы он превосходит пороговое значение Ррр11=1,00 почти на всем протяжении аминркислог-ной последовательности (рис. I, с)..Также заметно выше единицы a-спиральный потенциал концевых доменов, равномерно распределенный вдоль оси молекулы и уступащий по величине PPI 1-потенциалу,

Л

в \f V \J\ J • к * ' in 1 /1 *

с / и^ уу^Ллшъл 1. .. ImA^rA

£|Д!|.111 I Hill 1 ilHíyS!JllllÍlrIIJIl!¡JJIII

Г-Т " [I I J 111..... , (1)

О 20 40 60 60 100 120 140 160 180 200

A i 4 - л* : ' -i , ' -

» - -I - é ■'■'■' л - ' * - A * ' ' . . i .1 ft * \ 1 A A Д-l jyll ft. 1 1 ; -

y Vf Д_ i Il ■ » -1 1 |1Л U V , Ы/л т ;Г\ / \ очЛ-vJ Wbs Л г

D ; .tJIl, V ^VV ! ^ III IIIIII-.111-1 viili.ilJ V/ 1 « "V и ш in mus min и

1- IT « 1 1 ч Л - 1 ». ' " ». (2)

О 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Рис. I. Распределение ввропшосте» P.. (Chou and Faéman, 197в) a-спирали (А), ß-слоя (В) я левой спирали тала FFII (Я) вдом полипептадноВ цеш гистонов И (1) и Н5 (2). Нормализованные частота встречаемости остатков взяты из работы A.A. Адаубея с соавт. (1967), Оси абсцисс соответствуют значению Рп=1,00. Ю -схема распределения заряженных остатков (-г1-) и остэтше пролина (•). Пунктиром обозначены границы глобулярного домена.

одеако более варазкэнннй для О-ковдевой области гистова ЙБ (рис. 1.2, 0). Следует обратить внимание на тот факт, что все остатка продпяа тешга локализуются а кощены* доменах Щ и Н5 (рш, 1,0). Грехдоменноа строение молекул И и 1В сохраняется также в распределении заряхешшх ачинбкасдатиых остатков, более 3/4 которых (гочти асклотатальЕо золокатэльво варяшшнэ остатки лизша и аргинина) относительно равномерно размещена в кояцека дошнах,; Отеэиш, что арпшив, наряду с прожном, демонстрирует . яшбожшэе сродстз к дяшшш (бояад 4-х оотагкоэ) фрагмента* ЩГ (Atohubei A,A» and Sternberg, 1992). Все ЭТО ПОДТВерздавТ предполоээшш о том, что в даобданой то структурной организации молекула гистона IE/H5, сочетаодея элементы глобулярного и фибриллярного типа строения", существенную роль может играть конфор-гиаоия левой спирала типа шли-Ь-пролин II. Наиболее вероятными участкам ее локализации следует считать й- п С-ковцевне области колвкулЫк оботэшшз дродшюм, свринсм, лизином и арппдаом, а такяэ, bosmosho, некоторые участки центрального домена-, в частности его, и-нонцевув часть.

Для анализа характера регулярней спиральной копформащш цолипоптпдаой цепи нами било ^ проведено рештенограЯаческое исследование трех фрагментов гистона IS: а) н-концевого (КН5, а.о. 1-65), содержащего ir-кощэвой структурный домен я часть центрального глобулярного домена; б) центрального (GH5, а.о. 22-IQQ); и в) С-В01Щ9ВОГО (СШ, а.о. IQ0-IS9), чоответству-щего С-концевсму структурному домэну молекулы. На всех рентгенограммах обрпзцов фрагментов, полученных с использованием аморфного порошка полшюптада, осаадекпсго ацетоном из кислого (pli 3,0) водного раствора иаблэдалась характерная для регулярной спирали дифракционная картина: сальная дай&узная интерференция с.

ттюсхаствш расстоянием d»û,46 км, на фона которой выявляется рефлекс с дм),4 вм, широкий рефлекс с i в области 0,9543,98 им, вблизи которого, наблвдаатся рефлекс с <Ы,25 ш, и выявляемый m общем .фона сильный рефлекс с <1*0,3 нм. Сходная геометрия дкфрах™. иконной картины наблюдается при рентгенографическом анализа лио-4вдьно. высушенного порошка коллагена. Из трех регулярный спиральных стрртур хгалшэдтадаой цзш1 лшь ле^ая спираль • типа PPII даеёт щюакцию " остатка на ось спирали j окало 0,3 вы И: саатветащщзп тишавшая интерференция, опийшвзыая • функцией Басоеля нулевого порядка, будэт отвечать такому, îîqhuiockocïhk.w раостоящш, ;?£сже 1>ак и в случаз комагащ, увлашэпиэ образцов,' фр1а№е^в.№ 'прз1водзд0 {í увалрчэншй интенсивности ' рвфлэкаа с: ibQ.a им, что .'типично для ??Цгструктурц, ртабилизирундейся при' гидратациц,';;' !" ' .¡■-: ''•; : - .:.•■■■

. С йшсадо цё^асоздавдщ кеятидов спнртогд и ацетоном из щвлочшк водщг? раствора (рн 11-12) удалось подучить кристалл дачешша фора odpssùûp и О-концевих фрагментов HS, /дарре болзэ четкоэ к гадбако!? дола ште'^фзренцка. Значения мэкцлос-KOOTKUX расстояний для wîx, а. тшсх» для аморфного образца цент-; рального фрагмэнта, приведены в таблицах I п 2., Цода прэдполо-еить, !чт0,,щн10та3шзацр яеляется следствием частичной дцссоциа-цщ подогетельно заряг.эш1ыг боковых групп остатков янзкна* (рК 10,6) и аргинина (рК 12,6), ушвьшавдзй взаимное алзктроста-: тическое оттвлгл1гаиие спиральных фрагшнтов полхшептидной цешх при прецшштация.

Дифракционное картины для кристаллических форм образцов коено нроиндацировать на основе гексагональной ячейки (см. примечание I к табл. I а 2). Для С-концавого фрагмента СН5 значения (юотввтотвувдих медплоскостных расстояний хорошо совпадают с

экспериментальными значениями для поди-Ь-пролина II п со значениями, рассчитанными для модально® лэеой спирали с проекцией остатка на ось спирала 0,280 км и шагом спирали 0.98 им (табл. I). В случая Н-концэвого фрагмента НН5 и центрального фрагмента 0Н5 проекция остатка и шаг спирали несколько отличают-

Таблица I

Дашзнэ рентгеновского дифракционного анализа С-концевого (СН5, а.о. 100-189) фрагмента гистопа Нб

Меашюскостное расстояние,'нм Индексы? Ь к 1

наблюдаемое рассчитанное

СН5 тг3

0,980 ~ 0,380 0 0 2

0,590 0,580 0.587 1 I 1

,0,530 - 0,530 2 0 0

0,490 0,490 0,505 2 0 I

0,380 0,365 0,383 114

0,340 . 0,335 0,343 12 3

0,310 0,313 0,315 2 0 5

0,294 0,288 0,295 I 3 0

0,277 . 0,275 0,280 0 0 7.

0,257 0,271 0,283 3 0 5

Примочания: 1Гексагопальная. элементарная ячейка с параметрами а=ь=1,23 нм, о*1,96 нм. 2Для модели левой спирали с проекцией остатка на ось 0,27? нм и шагом 0,98 нм. 3поли-1г-Пролпн. II.

ся от CHS и раины соответственно 0,303 вы и 1,06 нм, также хорошо совпадая с соответствующей левоспиральной моделью <табл. 2). Параметр спирали для К~, С-концевнх и центрального фрагментов НБ постоянен я равен 3,5,

Таким образом рвнтгевогра$Егсеский анализ демонстрирует значительное присутствие конфорыации пша PPII в гистоне Н5. Эта

Таблица 2

Данные рентгеновского дифракционного анализа н-концевого (NH5. а.о. 1-65) и центрального (GH5, е.о. 22-100) фрагментов гистонв НБ

Ыэхплоскосгное рвсотояниэ, нм Индексы? h к 1

наблюдаемое 2 рассчитанное

ЯН5 GH5

1,060 0.960 1.060 0 0 2,

0,467 0,450 0,467 2 0 2

0,348 - 0,346 I I 5

0,330 - 0,329 2 0 5

0,303 0,310 0.303 0 0 7

0,270 0,270 0,270 117

0,362 0,260 4 0 1

0,241 , - 0.24U I ?. 7

Примечания: ^Гексагональная влементарная ячейка с параметрами а=ъ=1,20 нм, о=2,12 нм. 2Для модели левой спирали с проекцией остатка на ось 0,303 нм и шагом 1,06 нм.

структура локализуется преимущественно в С-концевом и, в зимот ном количестве, в М-концевом доменах молекулы, что соответствуй выводам, сделанным из анализа первичной структуры Н1 и НБ (рис. I). Мокко предположить, что центральный домэн 115 такгч содержит участки РРИ-конформации меньшей длины.

Рис. 2. Спектры кругового дихроизма водного раствора гистона 1(5 •» при различных рН: 5.5 (1), 6.0 (2), 6.5 (3), 7.0 (4), 7.5 (5), 8.0 (б), 8.5 (7), 9.0 (8). Стрелкой отмечено положение изобестической точки.

Очевидно, что пространственная структура Н5 сильно зависит от рН среда. Нами было проведено исследование влияния рН на кон-

1 I I . I_. I ■_I_I_I_и

190 200 210 220 230 240

Л, пш

формацию молекулы Н5 методом спектроскопии кругового дихроизме (КД). На рис. 2 представлено семейство спектров КД для водного раствора гистона Ш в диапазоне от 5,5 (рис. 2, I) до 9,0 (рис. 2, 8) единиц рН. Форма спектров гистона Н5 в кислой среда характеризуется наличием локального экстремума или "плеча", на длине волны 218-220 вм и глубокого минимума в области 198 нм. Такие спектры типичны для голшюптидов со значительным содержанием ррп-конфорлациа (Adzhubal A.A. et al., 1991? Woody, 1991). Повышение рН сопровождается уменьшение амплитуда минимума на 198 ш и нивелированием экстремума на 220 нм, что соответствует разрушению части левосшральных областей и образованию а-спирвлей (рис. 2). Наличие четко выраиенной изобестичэской точка на длине волны 20G нм указывает на то, что данное семейство спектров КД является линейной комбинацией двух спектров, т.е. при изменении рН происходит переход мэвду двумя состояниями. В данном случае один из втих базисных спектров, очевидно, соответствует спектру левоспиральной конформации пептидной цепи, а второй - спектру а-спиралькой конЗррыащги.

При анализа изменения емшштуды КД на 220 нм для гистона Н5 и его С-концэвого фрагмента (рио. 3) мокно видеть, что повышение рН вызывает структурный переход в молекуле гистона в диапазоне 6-9 единиц рН, причем падение интенсивности вращения, соответствующее образовании около 20? а-спирали, описывается сигмоидой (рио. С, тпдаяя кривая). Такой переход аналогичен сворачиванию центрального глобулярного домена молекулы при увеличении ионной силы раствора, фиксируемому по КД222 и п0 ^ (Crane-Robinson and Privalov, 1983). В то же время в С-концевом домене Н5 (СН5) лишь при повышении рН до.8 и более единиц можно наблюдать падение эллиптичности, меньшее по амплитуде и хорошо описыващееся

уравнением титрования (Хэвдорсона-Зйссэльбаха ), которое можно интерпретировать как образование 3-Б» а-слирали (рпо. 3, сергаля кривая).

2 3 4 5 6 7 8 0 10 11 13 рН

Рпо, 3. Зашснюсть молярного вращэгшя на дапшэ еолш 220 им от рН для водного раствора гастона 115 (i, шпшяя кривая) и его С-концевого Фрагмента СН5 (в, вэряшя крзвая). •

Эллиптичность СШ на. 133 цн, характеризувдея левую спираль типа PPIX, остается почта постояшоЗ в диапазоне рН 3-II оданиц (рас. Л, нижняя кризаа), что спидэтельствуот о пвизкэнности кон-формации этого фраплзпта, тогда как в кодекула гастона Н5 в диапазоне 5,5-9,0 единиц рЫ паблвдается лшюаанй рост вллштачкостй на 198 им, отрвжвщий падение содержания структуры типа PPII (рис. 4, верхняя кривая). Иозпо предположить, что при атом переходит в а-спиральнуп конфоркацив часть лешсшральпых фрагментов полипептидной цепи,' расположенная в центральном домене молекулы.

I

о

e v

г*

a

о ob •v

®

-1.5 -

2 -3.0-

)Z . з . 4, s: & 7 8 p ,10 11

; ■ : ph

Рас. 4. Завцсвдооть молярного враэднвд вд длине вода ?Э8 JE4 от рЯ для водного раствора гистона ]© (Д, верхняя кривая)' }{1 его С-концаеого фрагмента CHS (*, ишиш 'кривая),, '; ; : ■ ]■■

Таким образом мозар стлать вывод, что гиотон йр а; ¡водном раствора о щззоаш ирщой сижф и рИ содержи г участка конЗорма-щш типа PPII,.часть из коуорщ: локализована в центральном домена а ара повадшии рц caojoOsa переходам, в. а-сщрадъ, •' вызывая его сворачивание. При этом большая часть структуры типа , FPU, локализованная в О-конаввом домена Н5, остается стабильной.

Исходя из получбнгкх hslw. результатов видно, что структура С-концевого домэна молекул гистонов Ш и Н5, представляем ссбсй уникальный во длине (89-110 а.о.) фрагмент левой спирали типа PPII, стабильной как в водных растворах, так и в агрегированном состоянии. Информационные свойства атой структуры представляют большой гатарас, так как ранее изучались только на примерах син-

тетических шлипвптидшп. моделей (Faterllni et al., 1996: Drake et al., 1988) и но больших молекул полипептидных горюнов (Makarov et al., 1534). Наш было проведено исследование терма-стабильности пространственной структуры и термодинешческта параметров годных растворов С-конадвых фрагментов гистонов HI и Н5.

Известно, что левоспиральяая конформация типа PPII в растворе сильно стабилизируется при пошпювш температуры (Drake et

X, nra

Рис. 5. Спектры кругового дихроизма' С-концввых фрагментов гистонов Ш (СЩ) и HS (СН5) в, водном растворе (10 мМ HCl, pH 2;0) при различных температурах, CHI (а): Б°С (1), 60°С (2); СН5 <b): 6°С (1), 77°С (2).

•leal., 1988). На рис. Б представлены спектры НД водных растворов С-ковцевых фрагментов И (рис. Б, а) и Н5 (рис. 5, Ъ) при температуре около 5°с (рис. Б, I) и выше 60°С (рис. 5, 2). Видно, что пониженна температуры приводит к сильному увеличению характорис-

I, °с

Рис. 6. Зависимость молярной эллиптичности от температуры для водных растворов (10 мМ НС1, рН 2.0) С-концевых фрагментов гистонов К5 (1) «* К1 (2). Пунктирными линиями показана линейная экстраполяция участков кривых до и псе,™ области перегиба. Значения температуры области перегиба составляют 49±1°и для; СН5 (1) и 54±1°С для СН1 (2).

тического вкстрамуна в. области 218-220 нм, достигающего положительных значений.эллиптичности, и проявлению небольшого локаль-

кого минимума в области 23а на. Прн втсн спйктр КД приобретает форму, тшгаяуя для нигкотег'П'Зр атуриа спектров полп-Хг-дгекза и других левосгаральшп пептидов (Drata <st al,, 1983; V?oo4y, 1991). Слэдует огдатнт, что экстрэмуи пэ 220 т сохраняется п игле оглгжешого "шита" даго при высоких тошгоратурах, что говорит о вероятном сохранена! частя яевоспиральшх участков, причем повторное охлаядепае полностью восстанавливает нсюдзую форму спектров.

Результата регистрам изменения ешлзтуда КД на 220 на для йодного раствора Q-концешх фрагментов при непрерывном прогреве в терностатируемой ячейка, прэдставлешне на ряс. 6, показывает линейное ладешэ еллилпггаости в диапазона от Б до 49°0 для С-копцзвого фрагмента Кб (ряс. I, I) и от 5 до 64°С для 0-ковдевого фрагмента Ш (ряо. I, 2). Такая завис.шость КД в области 218-225 ш от температуры типична для конфордащш левой спирали (Hafcarcv at al, 1984J Есшова и др., 1984). В то ка время дальнейшее повышенна температуры приводят к отклокангаэ зава-сшости от линейной. Такой ш С£®номен обнаруживается и для водных растворов пептадних гормонов (НаКагоу ot al., 1992). Молно предположить, что перегиб; на дсривой плавления соответствует переходу большей часта полнпзютдаой; цапа в иепеэ регулярпуп (т.н. "высокотемпературную") ксв|ормаида, которая характерна для растворов шли-ь-лззнна при высоких температурах пла в присутствии БМ Had (Drake et al., .1983).

Конформационнне изменения, происходящие в водных растворах левосшральшх С-концевых фрагментов гистонов при повышали температуры, мокно объяснить исходя из определяющей ролл, которую играет в стабилизации конформации тша PPII гидратация полипэп-тадпоЛ цзгш., Лзввя спираль тягл РРП почти зд образует внутри- я.

иесдаликуляриоа сетей водородных связий, но при атом все водородные связи 00- и ин-груш юлипептидного остова занимают молекулы вода, сзОразущиэ регулярную гидратащюннуш ободочку. (Ailzhubei Л.A. and. Sternberg, 1992),

Наш было проведано исследование торадинашки систеш "вода - левоспиралнша полалопад" методом сканирующей дифференциальной микровалориштрии на примаро С-ковдевого фрагмента гас-; тона Н5. Зависимость парциальной теплоемкости родного раствора итого иолищптида от •гашературц имеет линейный вид в области от 20 до 60°С с последующи« выходом на плато (рио. 7, I). Величина.

20 ; 30 40 60 60 70 60

^ t, °с

Рис. 7. Зависимостьпарциальной ^теплоемкости водного раствора (10 ыМ UC1, рН 2.0) С-концавого фрагмента гистопа Н5 (СН5) от тоипературы. Эхспаринантальная 1фивая (1) и участок аппроксимации (2) расчетной величины [с) для денатурированного состояния СНБ по Иахатадза и Привалову (1990). Пунктирной линией показана ексграполяция горизонтального участка экспериментальной кривой.

удельной теплоемкости CIE при 20°0 значительно шли, а ход кривой плавления отличается от теоретических значений (рис. 7, 2), рассчитанных для денатурированного состояния этого полипептида по методу Махатадзе и Привалова (íiakhatatao and Prívalo v. 1990). Низков значнше 0 (табл. 3} говорит о ¡яенызем числа степе-

ней свобода в Системе "вода - пептид", т.е. в пользу упорядоченности гидратной оболочки, полгаептидпой цепи. Следует отметать, что область выхода на плато криво» плавления СН5 (табл.3) совпадает с точкой перегиба температурной за nncm.ro с га КД (рис. 6, I). Это свидетельствует о том, что наблюдаемый линейный рост теплоемкости раствора СН5 отражает некооперативное разрушение гидратационной оболочки, сопровоадапдееся постепэ1шым "разбалтыванием" и разрушением левоспиральной копфсрмации поли-пвптидной цепи.

2.4

оо

It 2.2 ó,

сГ 2.0

i_i

1.8

20 30 40 50 t, °С

Рис. 8. Зависимость парциальной теплоемкости водных растворов (pH 5.6) поли-ь-пролина (1) и поли-Ь-лизина (2) от температуры.

Сопоставление кривых плавлзния С-концевого фрагмента Н5 с (излученными нами аналогичными кривыми для водных растворов модэльвых лэвоспиральтгх шлвпептадов поли-ь-пролша (рис. 8,. ¡i поли-Ь-лизцна (рис. 8, 2) позволяет сделать вывод о сходство процесаа во'всэх трзх случаях,. особенно заметном для GH5 и полижите. Это вполне: понятно если учесть, что аминокислотная последовательность втогр: домэна Ш содаржт около 60$ . останов

' ':..v' -! : ' Таблица 3

; Териодаааьнмзские параметры плавления полипещадов .

Шлшштад . Молекулярная масоа, . Дк/нт ^Ь-юЗ, Область перегиба, °с

сш . • ' 99ЭБ i.euo.oa ' 9,2±0,8 49-53

poiy-I-Sro . 7сш 2,17*0,OS 13,8±0,4 30-40

poly-Ir-Lye ......, , - | i" ... Ц . .. ""вооо ; - I.ÜBSQ.GS . 4,&±0,4 33-38

i

kycu-Arg it 9% Pro., .При этой тар&здинашчаскиэ параметра .плавлеюш мл. '.СЙ5, меад . .аначапиями . дай; тли-ь-пролина и

ЮЛИ-Ь-ЛИЗИНВ '(т,8бл.:3). ■.,■'; "У

В ааюшченае мокво отметь, что линейный ход 'температурной £.&шсеыости,КЙ и удельной теплоемкости в водных растворах цссле-„човошшд солшептидЕшх фрагментов гцстоцов хорош согласу--егся с кзкоошрз-швнш характером пцратиьцк клштаптЕдаоа; цепи ь конформации •гша.РРН и,, как следствие., нехсооперативностьв ви клавлоная. 'Результаты нашей работы позволяют рассматривать, ату особенность копформацш тша FPU как ее характерное .'свойство, ;.итс])оо миаат играть'Еакнув {юль при взаимбдайбтвии лоьоспираль-■¡.л диттт гиотоноа с ДНК.

- гз -

ВЫВОЗ J

1. Показано, что существенную роль в структурной организации молекулы гистонов ИЗ/Но играет гибкая вытянутая коиформация левой стирали типа поли-Ь-пролш II, .которая преимущественно локализуется в протяженном С-кокцэвсгд домене молекулы.

2. Показано, что в водном раствора с тзюоаг рН и ионной силой часть конфоряанпя типа PPII локализована в центральном домоно молекула гистона ГО и при говнвэши рН способна переходить в а-спираль, вызывая его сворачивание.

3. Установлено, что пространственная структура. С-копцэеыз: доменов гистонов HI a IS определяется преобладанием . кокфориацип левой спирали типа PPII, стабильной в даровом спэктрэ условий среды.

4. Подтвервдено,'что характерным свойством пояшептядов в конфзрмации типа PPII является лилейная зависимость парциальной теплоемкости и кругового дихроизма в области 220 т от тетера-тура в диапазоне от 5 до 35~50°С.

5. Сходство тартдоашческих и сгоктральшх свойств вбдпых растворов С-концэвого доыепа гистонов Ш и Н5 о таковыми для ряда левосниральных понтидаых гормонов й модельных левоапираль-пых полапептадов позволяет рассматривать эти свойства как общее для конформавдш типа пола-ъ-пролщ II в водной среде.

Список публикаций по тема диссертации.

1. Eoipova И.О., QrlgoläTa МЛ., Adzhubei I.A.», Adzhubei A.A.. Reara ЕЛ. Left-lialioal polypeptide conformation and ША-protein ooœbining // Studia Biopiiya.- 1982.- Y.87.- P.169-170.

2. Григолава M.B., Рогуленкова В.H,, Есипова Н.Г., Аддубей A.A., Адаубей И.А. Исследованиз структуры коллагенов и некоторых дево.спиралыщ белков. // Первый Всесс|ш. биофизический съезд: Таз. докл. ц стащи сосбд,- М.- 1982,- Í.I.- 0.42.

3. Гркголава М.В., Адаубей И.А., Макаров A.A., Есипова Н.Г,, Крашенинников И.А. Конфорлаадя типа поли-ь-пролин II в дошцах гкотопа 115 // 16-я конференция Садорацин европейских биоишичес-lau обществ: Таз. докл.- Ы.- IS84.- Р.332.

4. Макаров A.A., Протасевич И.К., Платонов А.Л., Лобачав В;Ы., Адаубай И.А., Щшвшшншсов И.А., Панков Ю.А., Есипова Н.Г» . Терлоданадачаскт свойства додидаптвдсз в ковфэрмеции лавой спирали типа подн-Ь-пролш II //Сшлтозиум "Физико-хишчеокш свойства биоподишров-в раствора и клетках": Тез, докл. / С38.~ Пуццно.- I9S5.- С.100. '

Б, Ыакагоу A.A., Protasavioh I.I., Platonov A.I., Lobaohov У.Ы., Adzhïib3i I.A., Pankov Yu.A., Esipova И.О.,' Krasheninnikov I.A. Thermodynamic properties of polypeptides in tha left-handeü helioal conformation of poly-L-prolina II • type // Proo, of íi-.г 2n<l International conference on biothenso-djnamioa.- Austria, 1985.- 1.16.

6. UakapoB A.A., Нротасевич И.И., Адаубей И.А., Есипова Н.Г. Уакрокалориыетраческое иссладование полипептидов в конформации левой спирали типе поли-Ь-пролин II // Биофизика.- 1989.- Т.34.~ С.521-524.

_ гь -

7. Лобачев В.Ы., Макаров i.A., Шубзй И.А., Есхшова Н.Г. Исследование конфордационша сеойств С-ковшавых фрппаэнтов гистонов Ш, Нб и р-эндорЦша. методом кругового .дихроизма // Биофизика.- 1992,- Г.37,- С.ЭЗФ-ЗЗб.

8. Makarov A.A., Lobaoluw Т.К., Adxhubol I.A., Eaipova H.a. Natural Polypeptides in lett-handad hollcal oonfonnation. A oir~ oudar diohroiem study оt tha Ifrtfcer hiötorwe' 0-terminal frag-nents and ß-endorphin // PZBS ЫП.- 1992.- Y.306.- Р.63-65.

9. Kakarov A.A, Adzhubei I.A., ffrotaeerioh I.I.,

Lobaoho7 V.M., Eaipova И.О. Soasn£a$ miorooalorimstry and oirou -lar diobroism atudy of nwlfcing off tiw natural polypaptidsa in tha loft-handed helioal ooaiormafcion // J. Protein Qhea.- 1992.-Y.11.- P.522-531.

Лодп. к печ. 27-10.92 г. Тир*« ГОО эи». Э*ка»'* 1120

Централизованная типографий ГА "Сосзстройивгериалоа"