Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ионной силы раствора на структуру минимальных нуклеосом

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние ионной силы раствора на структуру минимальных нуклеосом"

v,-

& и

о

российская академия наук

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

Гавин Игорь Михайлович

УДК 576.316.3.

ВЛИЯНИЕ ИОННОЙ СИЛЫ РАСТВОРА НА СТРУКТУРУ МИНИМАЛЬНЫХ НУКЛЕОСОМ

03.00.03. - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН.

Научные руководители:

доктор химических наук, академик

кандидат биологических наук

А.Д. Мирзабеков С.Г. Бавыкин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В,В. Бакаев

кандидат физико-математических наук И.В. Смирнов

Ведущая организация:

Институт иммунологии Минздрава РФ

Защита диссертации состоится ...... 1992 г.

в часов на заседании специализированного совета Д 002.79.01

при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984 г. Москва, В-334, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан . . /Ф. ......... 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

А.М. Крицын

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время бурно развиваются исследования, связанные с поведением нуклеосом как субьедениц хроматина в процессах репликации, транскрипции и регуляции экспрессии генов. С целью выяснения механизмов функционирования нуклеосом в процессах матричного синтеза и при конденсации хроматина были проведены многочисленные эксперименты, направленные на выяснение динамических возможностей нуклеосом. Для этого изучалась температурная денатурация ДНК-гистоновых комплексов, взаимодействие нуклеосом с низкомолекулярными лигандами, взаимодействие с антибиотиками и другими лекарственными веществами, влияние модифицированных гистонов на структуру нуклеосом, разворачивание нуклеосом под действием рН и в мочевине. Электростатические взаимодействия положительно заряженных аминокислотных остатков гистонов и сахарофосфатного остова нуклеосомной ДНК играют важную роль в поддержании структуры нуклеосом. Конденсация хроматина, по-видимому, также в значительной степени определяется электростатическими

взаимодействиями. Влияние ионной силы раствора на структуру минимальных нуклеосом представляет собой удобную модель для изучения этих взаимодействий. В настоящее время существует большое число разногласий по поводу того, в чем заключаются зарегестрированные конформационные изменения, к каким последствиям они приводят, и в какой ионной силе наблюдается тот или иной конформационный переход.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Основной целью настоящей работы является поиск различных возможных конформационных состояний минимальных нуклеосом. Для этого были поставлены модельные эксперименты по влиянию ионной силы раствора на структуру нуклеосомного кора, используя метод картирования гистоновых контактов вдоль нуклеосомной ДНК с помощью ДНК-белковых сшивок, индуцированных диметилсульфатом.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Используя данный метод, были получены карты ДНК-гистоновых контактов в минимальных нуклеосомах (первичная организация минимальных нуклеосом) с высоким разрешением, что позволило изучить тонкие изменения в структуре нуклеосомного кора в зависимости от ионной силы раствора. В данной работе был обнаружен ряд новых конформационных состояний минимальных

нуклеосом в растворах с различной ионной силой. Было впервые показано, что взаимодействие ДНК-связывакдцих доменов гистонов с нуклеосомной ДНК может локально изменяться без нарушения ДНК-гистоновых взаимодействий в других участках нуклеосомного кора. Два из обнаруженных в данной работе конформационных перехода затрагивают области резких изгибов нуклеосомной ДНК, один из которых (в участке ^1) контактирует с Ы-концевым фрагментом гистона Н4, играющим принципиальную роль в экспрессии ряда генов. Кроме того, впервые было показано, что освобождение концевых фрагментов гистонов нуклеосомного кора также приводит к конформационному переходу в минимальной нуклеосоме. Существование указанных конформационных состояний было подтверждено в других работах по изучению структуры нуклеосом в зависимости от суперструктуры хроматина, проведенных в нашей лаборатории. Кроме того, в результате изучения ступенчатой диссоциации нуклеосом в высокой ионной силе был предложен механизм стабилизации частицы, образующейся после освобождения димеров (Н2А, Н2В) из состава минимальных нуклеосом.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены на 14 Международном биохимическом конгрессе в Праге в 1988 году. СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, ~ выводов й списка цитируемой литературы. Работа изложена на 93 страницах машинописного текста и содержит 12 рисунков и 3 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Характеристика метода определения первичной организации минимальных нуклеосом с помощью ДНК-гистоновых сшивок.

Для изучения первичной организации минимальных нуклеосом в растворах с различной ионной силой проводили ковалентное связывание ДНК с гистонали минимальных нуклеосом, входящих в состав высокорепрессированного хроматина эритроцитов цыпленка. Этот метод и основанный на нем способ локализации контактов гистонов на нуклеосомной ДНК был ранее подробно изложен в работах (Ьеу!па е1 а1.1981; КПгжаЬекоу е! «1., 1978; М1ггаЬекоу е1 а1, 1989). Необходимо отметить, что распепление ДНК с фиксированной длиной по месту сшивки позволяет точно определить положение контактов гистонов с одной нитью нуклеосомной ДНК, измеряя длину 5'-концевого фрагмента ДНК, ковалентно связанного с молекулой белка.

Для определения порядка расположения контактов гистонов на ДНК и примерной оценки длины 5'-концевых фрагментов ДНК, сшитых с каждой фракцией гистонов, в данной работе использовался один из вариантов двумерного гель-электрофореза (М1ггаЬекоу е1 а 1., 1978; КЛггаЬекоу е< а1., 1989). При электрофорезе в первом направлении меченные гистоны, ковалентно связанные с ДНК, фракционируются

в соответствии с размерами как ДНК, так и гистонов. После расщепления ДНК кислотным гидролизом по Бартону в геле освобожденные гистоны фракционируются во втором направлении. Положение пятен в этом двумерном геле соответствует последовательности расположения контактов гистонов на нуклеосомной ДНК. Однако, этот метод позволяет провести лишь примерную оценку длины фрагментов ДНК, сшитых с гистонами, используя ранее полученные данные (5Ыск е1 а 1 , 1980; ВаууЫп е1 а1., 1985; ВаууЫп е1 а!., 1988; Бавыкин и соавторы, 1988).

Ранее, используя метод ДНК-гистоновых сшивок, была установлена первичная организация минимальных нуклеосом из различных источников ($1пск е1 а1., 1980; БаууЫп ег а1. , 1985; Вауукт е1 а I., 1988; Бавыкин и соавторы, 1988). Используя

Таблица 1.

Расположение контактов гистонов вдоль ДНК минимальных нуклеосом.*

Источник, номер ссылки

Н4

Н2В

НЗ

Опублико

ванные

данные

45 55 65 88 98

25 35 48 95 105 115 125185 95 135 145

I

_I_

Реконструированные частицы

, !10> Эмбрионы

дрозофилы

(108 )

Спермии

морского

ежа (8 )

Печень

крысы

(108)

57 66 93 103

49 57 66 93 103 60 68 94 104 47 57 66 93 103

54 100 110 119 129189 99 I I I I

38 52 98 109 119 129189 98 I I

98 109 119 1291 98 I I

38 53 98 109 120 190 97 _I

Приведенные

значения

48 57 66 93 103

38 53 98 109

I

119 129189 98 _I

Пояснения к таблице 1.

(*) Сканирование концевых контактов гистонов Н2А и НЗ не было прове, из-за низкого разрешения пятен в этих областях, в скобках ука номера ссылок, приведенных в диссертации.

лазерное сканирование авторадиограмм двумерных гель электрофорезов, полученных в этих работах, были определены точны положения контактов гистонов кора вдоль нуклеосомной ДНК, соответствии с уточненными размерами маркерных одноцепочечны фрагментов ДНК. Эти данные приведены в таблице 3. Как видно и таблицы, положение пятен, соответствующих определенным контакта индивидуальных гистонов в составе нуклеосом из различны организмов, различаются на 1 - 2 нуклеотида - в полно соответствии с опубликованными данными (БЫск е1 а1., 198С ВаууЫп е1 а 1 . , 1985; Ваууклп е1 а1. , 1988; Бавыкин и соавторь 1988). Однако, точное значение размеров фрагментов ДНК, коваленть связанных с гистонами, несколько отличается от величиь приведенных в зтих работах.

2. Конформационные изменения в минимальных нуклеосомах в растворах с низкой ионной силой (0.4 - 30 мМ).

Идентичность первичной организации минимальных нуклеосом в 0.7, 2 и 10 мМ NaCl (рис. 1 (b)-(d)) указывает на то, что ДНК-гистоновые взаимодействия в нуклеосомной коре остаются неизменными в этом диапазоне ионных сил, что предполагает сохранение структуры участков взаимодействия гистонового октамера с нуклеосомной ДНК. Эти данные противоречат моделям, согласно которым нуклеосома находится в развернутом состоянии в ионной силе ниже 10 мМ (Weintraub et al., 1976; Oudet et al., 1978; Gordon et al., 1978; Gordon et al., 1979; Libertini 4 Small, 1982), а также моделям, в которых происходит значительное изменение количества супервитков нуклеосомной ДНК (Wu et al. , 1979; Schiessinger et al., 1982; Uberbacher et al . , 1983). Значительное ослабление контактов гистона Н4 в 0.4 мМ (рис. 1 (а)) по-видимому также не приводит к разворачиванию частицы, так как все контакты остальных гистонов остаются неизменными. Однако, появление фона может говорить о некоторой дестабилизации нуклеосомного кора в этой ионной силе: На структурные перестройки гистонов Н4 в составе нуклеосомного кора в растворах с низкой ионной силой, не приводящих к значительным структурным изменениям, также указывают данные, полученные Берчем и Мартинсоном (Burch & Martinson, 1981) и Чангом и Льюисом (Chung & Lewis, 1986а; Chung & Lewis, 1986b).

Структурные переходы в минимальной нуклеосоме, связанные с изменением контактов гистона Н4 с нуклеосомной ДНК наблюдаются также в 30 мМ NaCl, где усиление интенсивности пятна Н4(66) сопровождается появлением нового контакта Н2В(129) (рис. 1 (е)). Аналогичная картина наблюдались в нуклеосомах в составе ядер, в то время как в развернутом хроматине, не содержащем гистон HI, в ионной силе выше 30 мМ эти контакты значительно ослаблены (Shick et al., 1980; Belyavsky et al., 1980; Karpov et al., 1982; Bavykin et al., 1985; Bavykin et al., 1988; Бавыкин и соавт., 1988).

Взаимодействие гистона Н4 с 57-м, 66-м и 93-м нуклеотидом от 5' конца нуклеосомной ДНК осуществляется главным образом через единственный кластер положительно заряженных аминокислотных

Рис. 1. Авторадиограммы двумерных гель-электрофорезов ДНК-гистоновых комплексов, сшитых в составе минимальных нуклеосом в низкой ионной силе. Значения ионных сил указаны в правом верхнем углу авторадиограммы. Вертикальные линии показывают положение контактов индивидуальных гистонов, отмеченных горизонтальными линиями. Цифры обозначают положение контактов от 5'-конца нуклеосомной ДНК (в парах оснований). Звездочка соответствует пятну, не обнаруженному на диагональном варианте гель-электрофореза и, возможно, появляющемуся вследствие распада димеров гистонов НЗ во втором

Рис. 2. Схема расположения постоянных (Н4(57); Н4(93) и Н2В( 129)) и вариабельных (Н4(66); Н2В(119) и Н2В(129)) контактов гистонов Н4 и Н2В на одном супервитке нуклеосомной ДНК, рисунок которого приведен из работы (Richmond et al., 1984). Цифры с внешней стороны суперспирали обозначают количество витков нуклеосомной ДНК от ее центра. Пунктиром указаны вариабельные контакты.

остатков, расположенных в основании его N-концевого домена (Ebralidse & Mirzabekov, 1986; Ebralidse et al., 1988) (рис. 2). Эти контакты расположены вблизи сайтов нуклеосомной ДНК, в которых наблюдается резкий изгиб ДНК (Richmond et al., 1984; Uberbacher Sl Bunick, 1989; Hogan et al., 1987), предположительно вызванный сильным взаимодействием с кластером положительно заряженых аминокислотных остатков гистона Н4 (Ebralidse et al, 1988; Manning et al., 1989). Гистон H2B также взаимодействует с нуклеосомной ДНК в основном областью в основании N-концевого фрагмента, состоящей из аминокислотных остатков лизинов и аргининов, имеющих положительный заряд (Lambert & Thomas, 1986; Гущин и соавторы, 1991). Контакты гистона Н2В: Н2В(109 ); Н2В(119) и Н2В(129 ) также располагаются вблизи сайтов резкого изгиба ДНК -4 (Richmond et al., 1984; Uberbacher & Bunick, 1989). To, что похожие изменения в контактах гистонов Н4 и Н2В с областями резкого изгиба нуклеосомной ДНК происходят практически в одинаковых ионных силах позволяет предположить, что единый

механизм лежит в основе этих процессов. Флюоресцентные измерения показали, что в области ионных сил, где происходят эти изменения, структура гистонового октамера минимальных нуклеосом не меняется (Dieterich et al., 1979; Libertini к Small, 1980; Libertini & Small, 1982; Chung & Lewis, 1986a; Chung & Lewis, 1986b), что указывает на существенную роль нуклеосомной ДНК в данных конформационных изменениях.

3. Влияние различных ионов на конформационные изменения минимальных нуклеосом.

Для того, чтобы определить, связаны ли конформационные изменения минимальных нуклеосом, наблюдаемые в 30 мМ NaCl, с нейтрализацией отрицательных зарядов ДНК, были проведены эксперименты по ДНК-гистоновой сшивке в составе нуклеосомного кора в растворах, содержащих разные соли металлов в разных концентрациях. При этом, усиление контактов Н2В(129) и Н4(66), наблюдаемое при повышении концентрации одновалентных катионов до 30 мМ, происходит уже в 0.1 мМ СаС^ (рис. 3 (Ь)) и в 0.1 мМ ZnC^

Рис. 3. Авторадиограммы двумерных гель-электрофорезов ДНК-гистоновых комплексов, сшитых в составе минимальных нуклеосом в присутствии 5 мМ ЙЕРЕБ, рН 7.0 и разных концентраций двухвалентных ионов, указанных в правом верхнем углу авторадиограмм.

(рис. 3 (d)), что согласуется с ранее полученными данными о том, что соли двухвалентных металлов вызывают такие же конформационные изменения в минимальных нуклеосомах, как и соли одновалентных металлов, но при концентрациях на два порядка величины меньших (Wu et al., 1979; Libertini & Small, 1982).

Полученные результаты по определению первичной организации минимальных нуклеосом свидетельствуют о том, что указанные изменения в контактах гистонов Н4 и Н2В не зависят от типа катионов, но существенно зависят от их заряда. В то же время, заряд анионов не влияет на эти конформационные переходы. Эти данные находятся в полном соответствии с данными по флюоресценции тирозиновых остатков гистонов нуклеосомного кора (Libertini & Small, 1982) и подтверждают предположение о том, что изменения в контактах гистонов Н2В и Н4 с нуклеосомной ДНК являются следствием нейтрализации отрицательно заряженных фосфатных групп сахарофосфатного остова ДНК. В соответствии с полиэлектролитной теорией Маннинга (Manning et al . , 1978) эффекты, связанные с нейтрализацией фосфатов ДНК зависят от заряда противоионов и должны наблюдаться при гораздо меньших концентрациях ионов двухвалентных металлов, чем одновалентных катионов. Понижение ионной силы приводит к электростатическому отталкиванию нескомпенсированных зарядов ДНК и, как следствие, к увеличению ее жесткости (Manning et al., 1978). При этом, заметное увеличение персистентной длины свободной ДНК происходит при концентрациях двухвалентных катионов ниже 0.1 мМ, тогда как аналогичные изменения наблюдаются ниже 10 мМ NaCl (Hagerman, 1988). Увеличение жесткости суперспирали нуклеосомной ДНК, образованной вследствие нейтрализации фосфатов с прилегающей к поверхности октамера стороны ДНК (Mirzabekov & Rich, 1979; Manning et al. , 1989) может приводить к пространственному разделению ее участков в области 129-го и 66-го нуклеотида от 5'-конца и ДНК-связывающих доменов гистонов Н2В и Н4 соответственно, что вероятно и приводит к ослаблению этих контактов.

Присутствие двухвалентных катионов также вызывает усиление контактов Н4(66) и Н2В(129) в нуклеосомах в ядрах дрожжей, где гистон HI не найден в значительных количествах (Бавыкин и соавт., 1988 ).

Идентичность конформационных изменений в минимальных нуклеосомах в растворах солей одновалентных и двухвалентных металлов предполагает одинаковый механизм влияния этих катионов на нуклеосомную структуру. В соответствии с нашими предположениями, причиной такого конформационного перехода, наблюдаемого при повышении концентрации катионов, является увеличение гибкости нуклеосомной ДНК за счет эффективной нейтрализации зарядов сахйрофосфатного остова. Это подтверждается данными гидролиза микрококковой нуклеазой -Н1-хроматина в растворах с разными концентрациями СаС^ (рис. 4). Увеличение концентрации ионов Са+ до 1 мМ и выше резко стабилизирует частицу, что приводит к уменьшению доступности микрококковой нуклеазы к концевым фрагментам нуклеосомной ДНК и сильному увеличению времени гидролиза, необходимого для получения минимальных нуклеосом (рис.

А С

В О

12 3 12 3

Рис. 4. Электрофоретическое фракционирование хроматина, не содержащего гистон Н1, в полиакриламидном геле после гидролиза микрококковой нуклеазой. (А), (С) - электрофорез однонитчатых фрагментов ДНК в денатурирующих условиях. (В), (0) электрофорез ДНК-белковых комплексов в неденатурирующих условиях. Гидролиз проводили в присутствии 3 мкг микрококковой нуклеазы на 1 мг ДНК и 0.3 мМ СаС12 ((А), (В)) или 1 мМ СаС12 ((С), (й)), время

гидролиза: 1-20 мин., 2-40 мин., 3-80 мин.

4 (С), (D)). Вероятно, это является результатом того, что ДНК становится более гибкой, что позволяет гистоновому октамеру взаимодействовать с дополнительными 20 парами нуклеотидов на концах нуклеосомной ДНК, приводя к появлению частиц с фрагментами ДНК длиной 155 и 165 пар оснований. Эти данные согласуются с результатами, полученными при мягком гидролизе микрококковой нуклеазой реконструированного -HI-хроматина в средней ионной силе, основным продуктом которого являются нуклеосомы с длиной ДНК 167 пар оснований (Ruiz-CarriIlo et al., 1979), а также с данньми по влиянию концентрации NaCl на кинетику гидролиза -Н1-хроматина микрококковой нуклеазой (Weisehet et al., 1979). Увеличение гибкости линкерной ДНК в 20 мМ NaCl по сравнению с 1 мМ наблюдали также Яо и соавторы (Yao et al., 1990). Кроме того, эксперименты по ДНК-гистоновой сшивке нуклеосом в составе хроматина в физиологической ионной силе показали, что в этих условиях гистоны нуклеосомного кора взаимодействуют с линкерной ДНК (Belyavsky et al., 1980; Bavykin et al., 1990).

С другой стороны, при более низких концентрациях двухвалентных металлов, линкерная ДНК растянута (Thoma et al., 1979), а концевые фрагменты нуклеосомной ДНК становятся более доступны для действия микрококковой нуклеазы, что приводит к появлению субнуклеосом с длиной ДНК 105 и 125 пар оснований (рис. 4 (А), (В)). Это может объясняться тем, что вследствие увеличения жесткости ДНК гистоновый октамер при этих условиях плохо защищает концевые фрагменты нуклеосомной ДНК от действия микрококковой нуклеазы. Аналогичные данные были получены при гидролизе -HI-хроматина микрококковой нуклеазой в растворах с различной концентрацией NaCl (Weisehet et al., 1979).

Данные о том, что понижение ионной силы раствора моделирует изменение первичной организации минимальных нуклеосом при деконденсации хроматина, подтверждают недавно выдвинутые предположения об электростатическом механизме компактизации хроматина (Clark 4 Kimura, 1990). Кроме того, в соответствии с предположениями Убербахера и Буника (Uberbacher к Bunick, 1989), основная роль в формировании суперспирали нуклеосомной ДНК принадлежит гистонам Н4, которые как спицы колеса удерживают ее супервитки. Потеря одного из контактов гистона Н4, а также гистона

Н2Б должна приводить к дестабилизации частицы при сохранении ее общей структуры во время декомпактизации хроматина в процессах матричного синтеза, что облегчает процессы, связанные с перераспределением нуклеосом во время транскрипции и репликации. В этом отношении важен факт ослабления связывания как тетрамера (НЗ,Н4)2, так и димеров (Н2А,Н2В) с нуклеосомной ДНК, так как недавно проведенные исследования указывают на то, что в процессах матричного синтеза димеры и тетрамер действуют как самостоятельные еденицы (в качестве обзора см. работы: Laskey et а 1. , 1989; Freeman & Garrard, 1992; Gruss к Sogo, 1992; Morse, 1992; van Holde, et al., 1992).

Ослаблением контактов гистона Н4 с нуклеосомной ДНК возможно объясняются данные по влиянию N-концевого фрагмента гистона Н4 на активацию (Durrin et al., 1991) и репрессию (Kayne et al., 1988; Johnson et al., 1990; Aparico et al. , 1991; Roth et al., 1992) некоторых генов. Делеция или неконсервативная замена аминокислотных остатков гистона Н4, взаимодействующие с 57-м, 66-м и 93-м нуклеотидом от 5'-конца нуклеосомной ДНК (Ebralidse et al . , 1986; Ebralidse et al., 1988), дестабилизирует нуклеосомы, прилегающие к комплексу репрессор-оператор а2 дрожжей (Roth et al., 1992) и активирует HML и HMR гены дрожжей, возможно ослабляя связывание нуклеосомной ДНК с гистоновым октамером (Kayne et al., 1988; Johnson et al., 1990).

4. Первичная организация минимальных нуклеосом в растворах со средней ионной силой (100 - 600 мМ).

В диапазоне ионных сил 100-400 мМ никаких существенных изменений в первичной организации минимальных нуклеосом не наблюдается (рис. 5 (а)-(с)). Это подтверждается данными, полученными с использованием кругового дихроизма, рассеяния рентгеновских лучей и гидролиза ДНКазой I (Greulich et al., 1985; Dong et al., 1990); флюоресцентных методов (Libertini & Small, 1980; Libertini &. Small, 1982) и ДНК-гистоновых сшивок (Zayets et al., 1981).

В 600 мМ NaCl наблюдается заме,тная делокализация

Рис. 5 комплексов, Обозначения

. Авторадиограммы сшитых в составе см. рис. 1.

двумерных гель-электрофорезов ДНК-гистоновых минимальных нуклеосом в средней ионной силе.

ДНК-гистоновых контактов и увеличивается фон вдоль полос индивидуальных гистонов (рис. 5 (d)). В этой ионной силе происходит диссоциация нуклеосомной ДНК с гистонового октамера в пределах 10 % (Ausio et а 1. , 1984; Yager & van Holde, 1984; Yager et al., 1989). При этом, суперспиральная организация ДНК частично релаксирована, что было показано в экспериментах по гидролизу минимальных нуклеосом ДНКазой I (Dong et al., 1990). Эти данные указывают на заметное ослабление ДНК-гистоновых взаимодействий. Однако, эксперименты по малоугловому рассеянию рентгеновских лучей показали, что при этом радиус вращения нуклеосомной ДНК не меняется (Greulich et al., 1985), хотя эффективный гидродинамический радиус частицы растет (Wilhelm & Wilhelm, 1980; McGhee et al., 1980; Eisenberg & Felsenfeld, 1981; Ausio et al., 1984; Yager к van Holde, 1984). Ослабление ДНК-гистоновых взаимодействий может приводить к "проворачиванию" или "скольжению" нуклеосомной ДНК на поверхности гистонового октамера и делокализации основных ДНК-гистоновых контактов при сохранении радиуса вращения суперспирали ДНК.

В диапазоне ионных сил 300 - 600 мМ происходит диссоциация N-и С- концевых участков гистонов (Сагу et al., 1978; Ichimura et al., 1982; Walker, 1984; Oohara & Wada, 1987). Присутствие основных контактов в нуклеосомной коре в 400 мМ и в 600 мМ NaCl (рис. 5 (с), (d)) является прямым свидетельством того, что неструктурированные N- и С-концевые домены гистонов практически не влияют на структуру нуклеосом, что было показано с помощью многих методов (Whit 1ock & Stain, 1978; Morse & Cantor, 1986; Ausio et al., 1989; Hayes et al., 1991). С помощью ДНК-гистоновых сшивок (Stefanovsky et al., 1989), ЯМР (Walker et al., 1984) и температурной денатурации нуклеосомной ДНК (Ausio et al., 1989), было показано, что ниже 300 мМ "хвосты" гистонов взаимодействуют с ДНК. По данным Гущина и соавторов, гистон Н2А пришивается к нуклеосомной ДНК в основном через аминокислотные остатки в пределах С-концевого домена (Гущин и соавторы, 1991). Резкое ослабление контакта Н2А( 77) в 400 и 600 мМ NaCl (рис. 5 (с), (d)) может объясняться освобождением этой области гистона Н2А от взаимодействия с нуклеосомной ДНК. В самом деле, недавно проведенные эксперименты по ДНК-гистоновой сшивке в минимальных

нуклеосомах с удаленными "хвостами" гистонов показали, что, за исключением отсутствия контакта Н2А(77) никаких изменений в первичной организации нуклеосом не происходит (Бавыкин, персональное сообщение). Присутствие сильного контакта Н2А (145) в 600 мМ соли указывает на то, что этот участок нуклеосомной ДНК вероятно взаимодействует с лизином-119, расположенным в глобулярной области гистона Н2А.

Результаты наших экспериментов исключают возможность существования "развернутой" нуклеосомной структуры в этой области ионных сил, наличие которой предполагается в ряде ранних работ (Dieterich et al. , 1979; Wilhelm к Wilhelm, 1980). Значительные изменения в структуре гистонового октамера (Dieterich et a I. , 1979; Whit lock, 1979; Chung it Lewis, 1986a; Chung & Lewis, 1986b) также должны существенно изменять карту расположения ДНК-гистоновых контактов. Анализ спектров кругового дихроизма показал, что в диапазоне средних ионных сил не происходит изменений во вторичной структуре гистонов нуклеосомного кора (Dong et al., 1990). Принимая во внимание эти данные, можно сделать предположение, что указанные конформационные изменения не приводят к значительным изменениям в структуре гистонового октамера и, если и происходят, то внутри него, практически не затрагивая областей, взаимодействующих с нуклеосомной ДНК.

5. Ступенчатая диссоциация нуклеосомного кора в высокой ионной силе (0.8 - 2.5 М).

В 0.8 М NaCl наблюдается дестабилизация структуры минимальных нуклеосом (рис. 6 (о)), но основные области взаимодействия индивидуальных гистонов с нуклеосомной ДНК сохраняются. Это согласуется с тем, что уровень диссоциации ДНК при этих условиях не превышает 20 - 3096 (Stacks & Schumaker, 1979; Russev et al., 1980), и нуклеосомы видны под электронньм микроскопом вплоть до 1 М NaCl (Germond et al., 1976; Vassilev et al., 1981). данными о диссоциации димеров (Н2А,Н2В) от комплекса тетрамера

Дальнейшее увеличение ионной силы до 1 М приводит к ослаблению контактов Н2А и Н2В (рис. 6 (Ь)), что согласуется с данными о диссоциации димеров (Н2А,Н2В) от комплекса тетрамера

Рис. 6. Авторадиограммы двумерных гель-электрофорезов ДНК-гистоновых комплексов, сшитых в составе минимальных нуклеосом в высокой ионной силе. Обозначения см. рис. 1.

(НЗ,Н4)7 с ДНК в этой ионной силе (Burton et al., 1978; Oohara & Wada, 1987). Распределение контактов гистонов вдоль нуклеосомной ДНК становится более равномерным. Возникающий при этих условиях контакт гистона 114 с З'-концом нуклеосомной ДНК - Н4(145) (рис 6 (Ь)) вероятно является следствием диссоциации гистонов Н2А и Н2В, в норме контактирующих с этим участком, с последующим частичньм перераспределением на З'-конецевой фрагмент ДНК через супервиток гистона Н4, взаимодействующего с участками, прилегающими к центральной области нуклеосомной ДНК (рис. 7). Это может

А

В / \ С

Рис. 7. Модель возможного механизма стабилизации комплекса тетрамера с нуклеосомной ДНК в ионной силе 1 - 1.2 М. (А): Схема расположения контактов гистонов Н4 (заштрихованная лента) и Н2А (лента без штриховки) вдоль ДНК нуклеосомной кор-частицы в физиологической ионной силе. (В, С): перераспределение гистона Н4 через супервиток на концевые фрагменты нуклеосомной ДНК после диссоциации димеров (Н2А,Н2В) с сохранением формы частицы (В) или ее развернутой структуры в виде "запятой" (С).

дополнительно стабилизировать комплекс тетрамера с ДНК, который способен организовывать 120 пар оснований ДНК в структуру, подобную нуклеосоме (Camerini-Otero et а 1., 1976; Bina-Stein & Simpson; 1977; Hayes et al . , 1990) и ее частично развернутый вариант в виде "запятой", наблюдаемый под электронным микроскопом в 1.1 М NaCl (Russev et al., 1980) (рис. 7 (С)). Способность гистона Н4 взаимодействовать через супервиток с концами

нуклеосомной ДНК была также продемонстрирована при определении первичной организации минимальных нуклеосом из ядер спермиев морского ежа (Bavykin et а 1 ., 1985 ) и нуклеосом, содержащих ДНК длиной 167 пар оснований (Davies & Lindsey, 1991) в средней ионной силе.

Диссоциация димеров (Н2А,Н2В) завершается в 1.2 М соли (рис. 6 (с)) и картина ДНК-гистоновых свивок с резко ослабленными контактами гистонов Н2А, Н2В по сравнению с НЗ и Н4 сохраняется вплоть до 1.6 М NaCl. Дальнейшее повышение ионной силы до 1.8 М понижает эффективность сбивки за счет диссоциации тетрамера (НЗ,Н4)2 с ДНК (Burton et al., 1978; Oohara & Wada, 1987). При этом ослабляются контакты НЗ и Н4 по сравнению с Н2А и Н2В (рис. 6 (d)). Этот процесс продолжается вплоть до 2.5 М NaCl, но даже в этой соли гистоны еще контактируют с ДНК (рис. 6 (е)). Присутствие ДНК-гистоновых контактов в ионной силе выше 1.5 М согласуется с ранее полученными данными, что небольшое количество гистонов связано с ДНК даже после нескольких экстракций хроматина 2 М NaCl (Hadlaczky et al., 1981).

Ooxapa и Вада, используя данные кругового дихроизма и флюоресценции тирозмновых остатков гистонов показали, что диссоциация тетрамера (НЗ,Н4)2 происходит в 1.45 М NaCl (Oohara к Wada, 1987). Эта ионная сила несколько ниже, чем концентрация соли, при которой этот процесс начяяЭДтся в наших экспериментах. Кроме того, данные Бартона (Burton et &!•• 1978) о полной диссоциации гистонов с ДНК в 2 М NaCl также не соответствуют нашим результатам. Гель-фильтрация, используемая в этих экспериментах, может значительно сдвигать равновесие реакции диссоциации и занижать величину ионной силы, в которой гистоны полностью диссоциированы с нуклеосомной ДНК.

- 19 -6. Основные выводы.

1 . Используя метод ДНК-гистоновых сшивок были получены карты ДНК-гистоновых контактов минимальных нуклеосом с высоким разрешением, что позволило обнаружить ряд стабильных конформационных состоянии частиц в растворах с различной ионной силой.

2. Анализ первичной организации минимальных нуклеосом в растворах с ионной силой 0.4, 30 и 400 мМ показал, что взаимодействие ДНК-связывающих доменов гистонов Н2А, Н2В и Н4 с нуклеосомной ДНК может локально изменяться без нарушения ДНК-гистоновых взаимодействий в других участках нуклеосомного кора.

3. Было показано, что конформационный переход, зарегестрированный по изменению контактов гистонов Н2В и Н4 с нуклеосомной ДНК определяется изменением гибкости ДНК.

4. Предложен механизм стабилизации комплекса тетрамера гистонов (НЗ,Н4)2 с нуклеосомной ДНК после диссоциации димера (Н2А,Н2В) из состава минимальной нуклеосомы.

По материалам диссертации опубликована следующая работа:

Savykin, S.G., Ebralidse, K.K., Grachev, S.A., Gavin, I.M., Usachenko, S.I., Pruss, D.V., and Mirzabekov, A.D. (1989), Nucleosomes* structure and their organization in chromatin, in: "Highlights of Modern Biochemistry" (ed. by A. Kotyk, I. Skoda, V. Pacer and V. Kostka), VSP Intern. Sei.Publish., Zeist, pp. 115-127.