Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение особенностей структуры лизин-богатых гистонов пшеницы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение особенностей структуры лизин-богатых гистонов пшеницы"

Ыосеовсий ордена Ленина, ордена Октябрьской Реводгащи и ордена Трудового Красного Знамени государственннй университет им. М.В. Ломоносова

■ Биологический факультет

На правах рукописи

МЕШКОВА Лейла Арастунозза

УЖ- 577.112: 576.312

ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ СТРУКТУРЫ ЛИЗИН-БОГАШ ШСТОНОВ ШЕНИВД '

(03.00.03 - молекулярная биология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва- 1988

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии Еиоло-. Гического факультета Московского государственного университета " им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель - кандидат биологически: наук

И.А.Крашенинников

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

Г.И.Кирьянов

- кандидат физико-математических наук Б.О.Глотов

Ведущее учреждение - Институт биохимии им.А.Н.Баха АН СССР

3^

Защита состоится

" О^/Ло/гЛ 1988г. в часов

на заседании Специализированного ученого совета Д.053.05.70 при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119 899 Москва, Ленинские горы, Биологический факузпс тет МГУ.

Автореферат разослан « 1988г.

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат химических наук

В.Н.Кахраманов

- ■ Актуальность проблемы. Одной из основных проблем совремея-' "бУмюгии является вопрос о реализаций генетической информа--процессе дифференцировки и функционирования многоклеточных организмов. Генетический аппарат ядер клеток представляет собой многокомпонентную! слояноорганизованную структуру, нклю-чащую ДНК, РНК и белок. Естественно, что для выяснения механизма функционирования такой структуры на молекулярном уровне следует иметь по возможности полные сведения о составляющих её компонентах. Последним обстоятельством можно объяснить наблюдаемый за последние годы повышенный интерес к ядерным белкам. Наиболее полно изученными и интересными ядерными белками являются гисто-ны, которые можно определить как белки ядер клеток, имевшие сильно основной характер и участвующие в формировании нуклеосом.

Известно пять основных классов гистонов - Н1, Н2В, Н2А, НЗ и Н4. Четыре последних называют коровыми, так как они способны связываться друг с другом в специфические октамертше комплексы-нуклеосомше коры. В своп очередь нуклеосомный кор способен связывать ДНК с образованием нуклеосомы - дезоксирибонуклеопротеид-ной частица, компактизутадей до 200 пар нуклеотидов ДНК. Цели из повторявдихся нуклеосомных звеньев представляют собой первый уровепь структурной организации хроматина.

В формировании этого уровня наряду с коровыми гистонами участвуют также гистоны Н1, которые не входят в состав коровых нуклеосомных частиц, но играют важную роль в образовании и поддерживании высших уровней структуры хромосош.

Одним из подходов к выявлению механизмов функционирования гистонов является изучение ¡а структуры. Начиная с 70-х годов, были достигнуты большие успехи в исследовании первичной струк-т. гистонов.

Среди гистонов, наиболее вариабельными являются лизин-бо-

гатые гистоны Н1 и Н5. Определение аминокислотной последовательности ряда Н1 и Н5 позволило выявить общие черты строения их молекул. Во всех исследованных гистонах этого типа центральный участок молекулы обогащен гидрофобными аминокислотными остатками, а Ы- и С-концевые области характеризуются повышенным-содержанием основных аминокислот. Центральный фрагмент молекулы является наиболее консервативной областью белка. Концевые участки, по-видимому, взаимодействуют с линкерной ДНК, а центральная гидрофобная область обеспечивает правильную посадку гистона Н1 на кор нуклеосомы.

Гистоны НГ многих животных и растений представлены набором субфракций, различающихся по своему строению. Эти различия обычно относятся к Н- и С-концевым участкам. Подобные изменения структуры должны сказаться на конденсирующей функции отдельных субфракций. Центральная глобулярная область молекулы гистона III животных очень консервативна у разных субфракций. Вопрос о формах изменчивости структуры гистона Щ растений, представленного большим числом субфракций шло изучен. Среди высших растений особый интерес представляет злаковые, что связано о особенностями структуры хроматина у этой группы высших растений: хроматин у злаковых находится в очень конденсированном состоянии даже в интерфазных ядрах.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в выявлении общих закономерностей и особенностей первичной структуры глобулярных доменов субфракций гистона Н1 из зародышей пшеницы. Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

I. Выделение и характеристика субфракций гистона Н1 из зародышей шенины.

2. Выделение и характеристика глобулярных доменов из субфракцкй гистона Н1 зародышей пшеницы.

3. Сравнительное изучение структуры глобулярных доменов субфракций методом пептидных карт.

4. Определение аминокислотной последовательности глобулярного домена одной из субфракций гистона Н1 зародышей пшеницы.

Научная новизна полученных результатов. Впервые проведено сравнительное исследование первичной структуры глобулярных доменов субфракций гистона НХ зародышей пшеницы. Показано, что глобулярные домены из субфракций и Н^ не отличаются по размеру, заряду и расположению триптических пептидов на пептидных картах. Глобулярный домен из отличается меньшим размером и зарядом, а также отсутствием одного.триптического пептида. Установлена первичная структура большей части глобулярного домена субфракции Нр Сопоставление аминокислотной последовательности глобулярного домена субфракции с аналогичными участками тестонов Н^ и Н5 показало, что несмотря на индивидуальные различия, его строение . укладывается в общий план организации центральной части молекулы лизин-богатых гистонов.

^тактическая ценность. Работа имеет теоретическое значение, .вносит вклад в изучение строения и функций лизин-богатых гистонов, особой группы основных белков хромосом, ответственных за формирование высших уровней структуры хроматина.

Исследование белковых компонентов хроматина пшеницы имеет и определенное практическое значение, поскольку оно расширяет представление об организации генетического аппарата важнейшей сельскохозяйственной культуры.

Лпроба;з1Я работы. Основные результаты диссертацкошюЯ работы доложены т Всесоюзной конференции "Современные проблош йпо-

химии и физико-химической биологии" (Москва,1985г.), на конференции молодых ученых Биологического факультета ШУ (Москва, 1987г.)

Птбликашщ. По материалам диссертации опубликовано четыре работы.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, вклвчахщего 190 наименований. Работа изложена на страницах машинописного текста и иллюстрирована 20 рисунками и 8 таблицами.

В руководстве диссертационной работы принимала участие кандидат биологических наук, старший преподаватель Ерыохина Татьяна Михайловна.

Материалы и методы исследования

Объект исследования. Использовались коммерческие зародыши пшеницы (производство ПНР).

Выделение HI из зародышей пшениды осуществляли по модифицированному методу Джонса ( Johns , 1964). Предварительно ли. пиды удаляли путем экстракции зародышей детролейным эфиром при комнатной температуре. Все операции по отмывке хроматина от негис» тоновых белков и выделению лизин-богатой фракции проводили при 0-4° в присутствии ингибиторов протеолиза: ШСФ или ингибитора трипсина из сои. Для отмывки негистоновых белков использовали 0,9^-ный ЫаС1, содержащий 0,01 М цитрат натрия и 0,01 М ЭДТА. Лизин-богатые гистоны экстрагировали из хроматина 5^-ной НС10^.

Очистку и Фракционирование гистона HI зародышей пшениш проводили путем гель-хроматографии на акрилексе Р-60 ( "Reanal"),

и ионообменной хроматографии на КМ-цежшюзе и смоле Bio-Rex-70•

Пля ограниченного протеолиза лизин-богатыре гистонов трипсином использовали метод Хартмана с некоторыми модификациями (Hartman et al. ' , 1977). Соотношение фермент: субстрат для Ш тимуса теленка составляло 1:1000; а для Ш зародышей пшеницы -1:500. Реакцию проводили при 24° в течение 20 мин для гидролиза HI тимуса и при 24° и 37° в течение 40-20мин, соответственно, при тршсинолизе HI зародышей пшеницы.

Очистку устойчивых к действию трипсина Фтплентов гистона HI проводили на колонке с сефадексом G -75 ( at ) или ионообменной хроматографией на КМ-целлюлозе (КМЦ-52; КМЦ-32).

Расщепление субфракции Hj N-бромсукцинимвдом (ЫВЗ) проводили по модифицированному методу Бастина и Коула (Buetin, Cola , 1969), а расщепление бтомшаном. как описано ( DeLange, Vambrougb, 1968). Расщепление субфракции Hj пепсином проводили в стандартных условиях (Дэнини, Гергей, 1976).

Для препаративного выделения йгашентов оубФракшй гистона hi зародышей ршениш. полученных в результате обработки brcn, HBS и пепсином, использовали хроматографию на КМЦ-32.

Электрофрретический анализ белков и пептидов проводили по стандартным методикам (Johns , 1967, Fanyim ( Chalkley I9S9; Thomaa, Kornberg, 1975).

Для элшии белков из полиакриламидного геля использовали 0,05М Ыа-фосфатный буфер (pH 6,8), содержащий 0,1% ДЦС-Ы'а н Ю~% <ШСФ. Элюцшо проводили при 35° в течение 18 часов. Белок осаждали 18^-ной ТХУ.

Пептидные карты глобулярных фрагментов получали в тонком слое целлюлозы согласно (Карпова О.И. и др., 1983).

Концентрацию белка определяли по модифицированному методу Шафнера и Вейсмана (Горожанин П.П., и др., 1977) и спектрофото-метрически.

Гидролиз белков и пептидов для определения аминокислотного состава проводили по стандартным методам (Баратова Л.А., Беляно-ва Л.П., 1974).

Ы-кондевые аминокислоты белков и пептидов определяли дансильным методом, ДНС-аминокислоты идентифицировали при помощи хроматографии на полиамидных пластинках.

Дансилирование белков и пептидов проводили по модифицированному методу Хартли (Дэвени Т., Гергей Р., 1976).

Анализ аминокислотной последовательности пептидов выполняли, как вручную, так и автоматически.

Компьютерный анализ последовательности аминокислот проводили в соответствии с методом Кайта и Дулитла ( Kyto , Doolitfcle»

/

1982) с помощью микрокомпьютера Torch (Великобритания).

Результаты и их обсуждение

Выделение субфракций (Hj-Hj) гистонов зародышей пшеницы и

кх характеристика. Выделенные и очищенные субфракции гистона HI зародышей пшеницы были охарактеризованы по : I) электрофорети-ческой подвижности в присутствии ДДС-Ыа; 2) аминокислотному составу; 3) К-концевой, аминокислоте.

Злектрофорегический анализ показал: а) большую молекулярную гетерогенность гистона HI пшеницы (рис.1), б) выявил кажущиеся молекулярные массы субфракций. Они составляют 22,5 кД для субфракции Hp 24 кД - для субфракции Hj и 27 1<Д - для субфракции Hj.

Рис.1. Денситограмма гелей после электрофоретического разделения гистона Щ в 18^-ном ПААГ в присутствии MC-Na.

150 мм

Результаты аминокислотного анализа исследуемых субфракций (Hj-Hj) приведены в табл. I. Для сравнения приведен аминокислотный состав гистона HI зародышей кукурузы ( Hurley,stout, 1980) И HI тимуса теленка ( Kinkade , Cole , 1966).

Как видно, аминокислотный состав гистонов растений, заметно отличается от аминокислотного состава HI тимуса теленка. Сравнение •аминокислотного состава отдельных субфракций HI зародышей пшеницы показало, что они различаются по содержанию лизина, пролит ?

на, аланина, глицина. Следует отметить, что Hj и Н| близки по количеству этих аминокислотных остатков, а н| содержит меньше лизина и аланина. Одновременно исследуемые белки практически не отличаются по содержании гидрофобных аминокислотных остатков.

Дансильным методом было показано, что И-концевая аминокислота субфракций гистона HI заблокирована.

Выделение и характеристика устойчивых в действию трипсина" фрагментов стбсбракшй гистона Н1 затютшшй шатаны. ;,

Таблица I.

Аминокислотный состав субфракций пистона зароды-

шей пшеншщ, суммарных препаратов Н1 зародышей кукурузы и тимуса теленка, выраженный в молярных процентах

Амино- 1Субфракщш гистона Н1 зародышей ! Н1 тимуса 1Н1 зароды-кислоты! -г дщецицы-;-— I теленка !шей кукурузы

1 Н1 1 Ч 1 Нд 1 1_

I юл.% I юл.% I мол.% ! мол./5 ! мол.;?

Ьув 26,5 26,3 24,7 28,5 24,5

Н1в 1.2 1,2 1,4 - 0,8

Ахе 2,5 2,7 2,7 1,7 2,6

Хвх 2,9 2,4 2,4 2,2 3,0

ТЬг 5,0 4,9 5,0 5,6 4,6

Бег 3,9 4,0 4,2 6,5 4'1

ОН 3,5 3,2 3,8' 3,8 -5,1

Рго 11,5 12,2 10,2 8,8 12,2

01у 2,4 2,4 4,1 6,9 3,3

Ж1а 30,4 29,4 28,7 25,0 28,2

Та! 4,4 4,7 4,0 4,8 3,9

пег 0,7 0,7 0,4 - 0,3

Не 2,2 2,1 2,9 0,7 1,1

Хеи 2,7 2,9 2,7 4,3 - 4,1

Туг 0,9 0,9 0,9 0,4 1,1

РЬв 0,7 0,7 0,8 0,5 0,8

Отдельные субфракции гистона ЕЕ животных обычно шло отличаются друг от друга по первичной структуре (Von Holt et al», 1979). Консервативность прослеживается особенно в гидрофобном домене молекулы белка. Относительная консервативность представляет собой одну из наиболее примечательных черт гидрофобного домена молекулы гистона Ш даже у разных организмов. Структура гидрофобного. ядра гистона НГ высших растений шло изучена.

Устойчивый к действию трипсина фрамент был получен из суммарного гистона Ш зародышей пшеницы. Электрофоретический анализ выявил, что глобулярный фрагмент из суммарного препарата HI зародышей пшеницы состоит из двух полипептидов. Аналогичный участок, полученный из Ш тимуса теленка, в этих условиях электрофореза выявляется в виде одной полосы. Наличие двух полипептидов, устойчивых к действию трипсина, может быть связано с различиями в размерах глобулярной области молекулы у отдельных субфракций НТ зародышей пшеницы или существованием двух трипсинчувствительных сайтов вблизи глобулярного фраотента одной субфракции. Для выяснения этого вопроса были получены пептиды из каждой субфракции Ш зародышей пшеницы. Для очистки глобулярного фрагмента субфракций гистона HI после ограниченного протеолиза трипсином применяли ионообменную хроматографию на КМЦ-52 (рис. 2).

Рис.2. Хроматографическое разделение продуктов ограниченного протеолиза трипсином субфракций (Н^—Hj) гистона из зародышей пшеницы на колонке ШЦ-52 линейным градиентом 11С1 (0.071Л) в СН3С00ЫН4 буфере, pH 6,8.

<U> НА

- 10 -

Таким образом, методом ограниченного трипсинолиза показано, что субфракции гистона HI зародышей пшеницы содержат устойчивый к действию трипсина фрагмент. Условия его получения одинаковы для отдельных субфракций. Эти пептиды были очищены методом гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Сравнение этих участков с аналогичным участком HI тимуса теленка показало, что они имеют молекулярную массу около 10 HD,. Полученные пептиды были охарактеризованы в двух электрофоретических системах. Разделение проводили в 20$ ПААГ с ДДС-Ыа. Оказалось, что подвижность глобулярных фрагментов первой и второй субфракций одинакова, аналогичный участок третьей субфракции имеет большую подвижность. Применением электро-форетической системы, позволяющей разделить белки по величине их заряда, обнаружено, что полипептиды, полученные из первой и второй субфракций HI таете имеют одинаковую подвижность. Глобулярный фрагмент из третьей субфракции двигался с меньшей скоростью. Это указывало на близкую молекулярную массу и суммарный заряд пептидов Т 9

Н| и Н| субфракций, и, вероятно, на сходный аминокислотный состав, что было подтверждено дальнейшими исследованиями.

Определение аминокислотного состава полипептидов (табл.2) подтвердило, что они относятся к глобулярной части молекулы, так как в них сосредоточены практически все остатки гидрофобных и ароматических аминокислот. В этом заключается характерная особенность строения глобулярных доменов лизин-богатых белков. Сравнение аминокислотного состава устойчивых к действию трипсина фрагментов субфракций с соответствующим полипевтидом из HI тимуса теленка (Von Holt et al., 1979) показало, что они заметно отличаются, несмотря на общие черты сходства. При этом оказалось, что первая . и вторая субфракции HI очень близки по аминокислотному

Таблица 2.

Аминокислотный состав глобулярных фрагментов субфракций Щ из зародышей пшеницы и тимуса теленка (в иол.% я в количестве аминокислотных остатков)

Амино- ! Субфракции КГ зародышей пшенипц ! Тимуса теленка

кислоты! SI i 772 Г Ж Г

I I ! Н1 ! Ч_!______

1мол.$!ос- 1мол. loe- 1мол.^ !остат- !мол.$ !остат-! 1 татки! % !тат-! ! ки ! !ки

I ! ! ! ки ! ! I !

Ьуз 16,4 13 16,2 13 13,3 10 18,4 16

Hia 3,5 3 3,6 3 3,9 13 -. -

krg 2,7 2 » 2,9 2 2,7 2 2,3 2

lax 3,2 2 3,2 2 3,1 2 4,6 4

ЗЬг 7,1 5 • 7,1 5 6,3 5 5,8 5

Ser 5,7 5 5,8 5 7,4 6 11,5 10

Glx 7,2 6 7,2 6 7,6 6 5,8 5

Pro 6,7 6 7,1 6 7,1 6 3,5 3

Gly 3,6 3 no со 3 3,7 3 10,3 9

Ala 19,5 16 19,6 16 20,7 17 17,2 15

Val 5,6 5 6,0 5 5,3 5 5,8 5

Met 0,4 I 0,4 I 0,4 I - -

lie 4,7 4 4,7 4 4,5 4 2,3 2

Leu 8,8 7 8,4 7 9,0 7 10,3 9

Туг 2,0 2 2,1 2 2,5 2 1.2 I

Phe 2,5 2 2,5 2 2,6 2 1.2 I

- 12 -

составу, а аналогичный домен третьей субфракции отличается по содержанию лизина и серина. Исходя из данных аминокислотного состава. была рассчитана молекулярная масса пептидов. Она составляет около 9,6 1Д, для каждой субфракции.

В состав глобулярного домена первой и второй субфракций входит приблизительно по 82 аминокислотных остатка, аналогичный участок третьей субфракции содержит около 79 остатков.

Одним из критериев гомогенности выделенных препаратов является определение Ы-концевой аминокислоты. Было показано, что у •всех пептидов она является лизином.

Для более детального сравнения первичной структуры глобулярных фрашентов были получены их пептидные карты в тонком слое целлюлозы после исчерпывающего гидролиза трипсином. На рис.3 представлено распределение пептидов из первой, второй и третьей субфракций Ш зародышей пшеницы. Анализ данных на картах указывает, что первая и вторая субфракции при гидролизе трипсином дают по II пептидов. Аналогичный участок третьей субфракции содержит 10 компонентов. Пептиды хорошо отделены друг от друга.

Стандартные условия получения карт' позволили сопоставить их. Для наглядности была создана схема, на которой нанесены пептида, полученные для трех глобулярных доменов. Пептиды, имеющие сходную электрофоретическую и хроматографическую подвижность были объединены (рис. Зг). Оказалось, что глобулярные.фрагменты из трех субфракций гистона HI зародышей пшеницы рбнаруживают 10 триптических пептидов, имеющих одинаковую подвижность (рис.Зг). :

Следует отметить, что глобулярный домен из первой и второй субфракций гистона III зародышей пшеницы тлеет по одному трипти-ческому пептиду рис. Зг (незаштрихованный пептид), который не

- 13 -

обнаруживается в составе глобулярной области июлекулы третьей оубфракции.

Итак, применив метод пептидных карт в тонком слое целлюлозы, удалось разделить пептиды триптического гвдролизата глобулярных фратаентов субфракдай гистона HI. зародышей пшеницы. При сравнении пептидных карт обнаруживается значительное число пептидов, сходных по подвижности в обоих направлениях. Это указывает на возможное сходство аминокислотной последовательности этой области молекулы у различных субфракций гистона HI зародышей пшеницы.

Однако, для подтверждения этого необходимо определение первичной структуры глобулярных фрагментов. Вместе с тем по аминокислотному составу глобулярные фрагменты КГ растений сильно отличаются от соответствующих пептидов, ввделенных и исследованных из различных объектов животного происхождения (табл. 2).

Для выяснения структуры глобулярного домена И зародышей пшеницы было проведено его секвенирование.

Изучение первичной сттактата глобулярного Фрагмента суб-Фтекпии Hj гистона затодышей пшенипы. В данном исследовании для определения первичной структуры был выбран глобулярный домен третьей субфракции гистона КГ зародышей пшеница, так как эту субфракцию удавалось получить в количествах, достаточных для структурных исследований. Изучение первичной структуры первоначально проводили на целом фрагменте из н| . В результате работы была определена последовательность 24 аминокислотных остатков. Установленная последовательность имеет следухщий вид : -Ьуз-Thr-Pro--iaar-m.a-rro-Hie-TyT-Ala-i.ap-Met-Vel-3er-Gla-ila-Ile-A.la-Ála-Leu--Lya-GLü-Arg-Glu-Gly-

электрофорез

РйС.З. Схема пептвдных карт устойчивых к действию трипсина фрагментов субфракций гистона Н зародышей пшеницы, а) фраплент из ; б) фраплент из Н^, в) фрагмент из г) объединенная схема пептидных карт из н]=: % субфракций. заштрихованные пептиды, сходны по подвижности в двух направлениях.

Маркеры: М - метиленовый зеленый К - ксиленцианол I - лизин, 2 - лейцин

Аминокислотный анализ выявил, что в состав субфракции Н^ входит один остаток метионина, который как было показано находится в глобулярном домене. Б связи о этим субфракция н| зародышей пшеницы была подвергнута расщеплению ВгСН . Образувдиеся в ходе реакции фрагменты анализировали путем электрофореза в присутствии ДДС- На • Для получения и очистки фрагмента использовали ионообменную хроматографию на колонке с КМЦ-32 линейным градиентом ЫС1 (0-1,5)М в 0,02М МН^-ацетатном буфере, рН 6,8. Профиль элщии представлен на рис. 4. Определение Ы-концевой аминокислоты у пептида, соответствующего С-концевой половине молекулы после расщепления ВгСН , выявило валин. Установленная аминокислотная последовательность пептида имеет следующий вид:

-7а1-Звг-С1а-Д1а-11в-А1а-А1в-1.0и-1<у8-О1а-Ахе-С1ц-С1г-Звг-Звг-

-01<Н?Ье-А1а-11в-01у-

• Выделение и характеристика бтюмоткшшимшшнх ( квз ) фрагментов субфракции Нд- зародышей шценшщ. Аминокислотный анализ субфракции и глобулярного домена из этого же белка показали, что в их состав входят по два остатка тирозина. Было проведано исследование процесса расщепления изучаемого белка нвз . Показано, что на начальных стадиях реакция, идет по одному остатку тирозина. Размер! образующихся в ходе расщепления фрагментов оценили по электрофоратаческой подвижности в ПААГ с ДДС-Ыа. Увеличение количества добавляемого реагента, а так<ке продолжительности времени реакции приводило к более полное расщеплению гистона. Продукты исчерпывавдего расщепления субфракции мвэ . разделяли на колонке с КМЦ-32. Профиль элщии представлен на рис.5. Определение Ы-концевой аминокислоты показало, что у пептида она является изолейцином. По..,"ченная последовательность этого пептида тлеет следующий вид :_Ив-тьг-Ьви-л1а-А1а-Ьуз-Н1а-

—Lya-Le и-Рго-Аяр-Ser-Val-Lya-Ile-Le u-Thr-GlU-Il e-Lye-Lye-Leu--Val-Al a-Ala-Gly^-Lys-Le ц-Thr-Lys-

Выделение и характеристика фрагментов после растепления пепстщ субФрающ Hj зародышей шениш. Проводили частичный гидролиз субфракции Hj пепсином. Полученные пептиды были использованы для дальнейшей структурной работы. Выделение продуктов протеолиза проводили методом ионообменной хроматографии на колонке КМЦ-32 .Профиль алиции показан на рис.6. В качестве И-кон-цевой аминокислоты выявили фенилалаяга. Определили аминокислотную последовательность пептидов из I и 2-го пика. Для пептида из пика I она имеет следующий вид: -Phe-Pro-Leu-Lya-Ala-Pro-Ser--Ala-Ala-Ala-

а для пептида ИЗ пика 2 : -Phe-Ala-Ilö-Sly-Arg-Lys-Lya-GLM>-Ser-

TyT-Xle-Dri>-Leu-iJ.a-Ale-Xiys-Hia-Ly3-Lei>-Pro-Aap-Ser-Yal-IiyB-Ile-

Le ц-Thr-GlU-Ile-Lya-

Таким образом, изучая первичную структуру перекрывающихся пептидов, полученных в результате ферментативного гидролиза и химического расщепления оубфракции Hj гистона зародышей пшеницы, установили частичную аминокислотную последовательность глобулярного домена белка. Она представлена в табл. 3.

Сравнение аминокислотной последовательности глобулярной области (табл. 4) гистона HI зародышей пшеницы,. HI зародышей кукурузы ( Hurley , Stout ,1980), Н5 эритроцитов курицы.(Avilea et al, 1980), HI спермы морского а?л (Von Holt et al.rI979) и HI тимуса теленка (Kinkade ,Cole, 1966) выявляет следующее. Различия в первичной структуре этих доменов малы, и в большинстве случаев замены носят консервативный характер.

Проведен компьютерный анализ распределения гндро£юб:тх и гндрофидь5Щх аминокислотных остатков по отдельны,! у^сткам по-

Рис.4. Хроматографическов разделение продуктов гидролиза вгсн субфракции Н| зародышей пшеницы на ар колонке КМЦ-52. Элпцию проводили

линейным градиентом LiCl (0-1,5)М ^в 0.02М СН3С00ЫН4 буфере, рН 6,8.

де<рр<кцмч

4,15 Рис.5. Хроматографическое разделение NBS -фрагментов субфракции Hj зародышей пшеницы на колонке КМЦ-52, Ч1*линейным градиентом L1C1 (0-1,5)М в (Ш3С00НН4 буфере, рН 6,8.

о,*

«Я (7Í<ppQtOJ^U

Рис.6. Хроматографическое разделение на колонке КМЦ-52 линейным гра-^диентом LlCl (0-1,5)М в 0.04М

CHgCOOHH^ буфере, рН 6,8, продук-о^тГтов гидролиза пепсином субфракции Hj зародышей пшеницы.

о,« Ut f fvmu

В заштрихованных областях пиков элшруются пептиды, которые использовали в дальнейшем для структурного анализа.

- 18 -

липептидной цепи глобулярных доменов лизин-богатых гистонов (рис.7). Как видно из рис.7 картина для всех сравниваемых поли-пептздов сходна. При таком распределении первые 10-25 аминокислотных остатков по гидрофобности и гидрофильноеги мало отличается у большинства полипептидов (кроме Н1 тимуса теленка). Следует отметить, что большое сходство наблюдается у глобулярных доменов Ш зародышей пшеницы и кукурузы. Такая высокая консервативность первичной структуры глобулярных доменов гисто-на Н1 возможно связана с их исходной функциональной ролью.

Если вернуться к рассмотрению строения глобулярных доменов субфракций и зародышей пшеницы, то на основании всех по. лученных данных (аминокислотный состав, молекулярная масса, распределение триптических пептидов на пептидных картах) допустимо высказать предположение, что их первичная структура может оказаться идентичной с последовательностью аминокислот в Н^ за исключением небольшого участка полипептидной цепи. Возможно, это будет доказательством в пользу того, что субфракции гистона Н1 зародышей пшеницы отличаются,главным образом, строением и размером только И и С-концевых участков молекулы.

I.'

2.

а

3.

7?

А/

Г \

Рис.7. Профили гидрофобности глобулярных доменов лизин-богатые гистонов.

1. Н1 зародышей- пшеницы

2. Н1 зародышей кукурузы

3. Н5 эритроцитов курзгщ

4. Н1 спермы морского ежа .5. Н1 тимуса теленка

- 19 -

Таблица 3

Частичная аминокислотная последовательность глобулярного домена гистона Ш зародышей пшеницы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ю 11 12 13 14 15 1б 17 18 19 20 21 22 23

Н1

-5Г2

X---,-из ---

24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 33 39 40 41 42 . 43 44 45 46

—г

—;--ИЗ--I

I--И4 -■-

I-Н5-

47 48 49 50 51, 52 53 54 55 §6 57 53 59 60 61 62 63 64 65 66 ~Pro-Aap-Ssr-Vül-j^a-Ile-Lou-Íbj>-Glu-I

-Ы4-X

---Ы5-1 .

Val, Val)-Phe-Pro-Le u-Itya-Al a-Pro-Ser-Al a-AI в-Al a_И6...............- . ... __1

NI- и M2 - аминокислотная последовательность, полученная оиквенсом глобулярного домена субфракции Hjj ИЗ - последовательность, полученная сиквенсом ВгСЫ фрагмента н|; 114 - и Ы6 - аминокислотная последовательность, установленная исследованием пептидов, полученных при расщеплении субфракции Hj пепсином; N5 - последовательность, полученная при сиквенсе нвз фрагмента Hj.

к

- 20 - .

Таблица 4.

Глобулярные фрагменты лизин-богатых гистонов

5 10 15 20 25

1 )-K-T-P-A-H-P-H-Y-A~D-lI-V-S-Q-A-I-A-A-L-K-Q-R-Q-G-S-S-

2) -Y-A-Q-bl-V-S-Q-A-I-T-S-L-K-Q-R-T-G-S-S-

3) -H-P-T-Y-S-Q-H-I-A-A-A-I-R-A-Q-K-S-R-G-G-S-S-

4) -S-T-H-P-P-V-L-Q-M-V-Q-A-A-I-T-A-M-K-Q-R-K-G-Q-S-

5) -R-K-A-S-Q-P-P-V-S- G-Ir- I-T-K-A-V-A- -A-S-R-G-R-S-

30 35 40 45 50

2)-Q-P-A-I-A-K- -y-V-Q-D-K-H-K-D-K-L-

3)-R-Q-S-I-Q-iC-Y-I-K-S- -H-Y-K-V-G-H-D-A-N-L-Q-I-K-

4 5-S-A-A-K-I-K-S-Y-H-A-A- -D-Y-R-V-I>-M-K-V-A-P-H-V-H-R-

5 )-Q-V-S-I»-A-A-L-K-K~A-L-A-A-A-Q-Y-G- -R-H-H-S-R-I-K-

55 60 65 70 70

1 l-Ir-T-Q-I-K-K-L-V-A-A-G-K-L-T-i: -P-P-L-2VA-P-

2) -P-K- -P-

3)-L-S-I-R-R-Ir-L-A-A-G-V-L-K-Q-2?-K-G-7-G-A-S-G-S-P-R-L-

5 )-I#~L-Q-L-S--L-V-3-K-Q-T-L-V- G-T-K-G-G-T-Q-Q-A-S-G-S-

80

1)-S-A-A-A-20-S-T-3J-A-K-4J-V-

1). Ашнокислотная последовательность глобулярного домена субфракции Hj гистона зародышей пшенипы.

2). Частичная аминокислотная последовательность гистона HI зародышей кукурузы (Hurley, Stout 1980).

3). Частичная аминокислотная последовательность Н5 _ эритроцитов курицы (Aviles et al, 1978).

4). Частичная аминокислотная последовательность HI спермы морского е;ка (Strickland et al, 1980).

5). Частичная аминокислотная последовательность HI тимуса теленка (Kinkade, Cole, 1966). .

- 21 -

ВЫВОДЫ

1. Из хроматина зародышей пшеницы было выделено три субфракции гистона Щ, отличающиеся по молекулярной массе и аминокислотному составу.

2. Методом ограниченного протеолиза трипсином из этих белков были получены глобулярные домены. 1

'3. Показано» что глобулярные домены из субфракций и не отличаются по размеру, заряду и пептидным картам, а отличия глобулярного домена из субфракции Н^ связаны с отсутствием одного триптического пептида.

4. Определена первичная структура значительной части глобулярного домена субфракцин Нр

5. Сопоставление аминокислотной последовательности глобулярного домена субфракции с аналогичными участками гистонов Ш и Н5 показало,что.несмотря на индивидуальные различия, его строение укладывается в общий план организации центральной части молекулы лизин-богатых гистонов.

Список работ, опубликованных; по теме диосетэтадш

1. Меликова Л.А., Ермохина Т.М. .КрашенинниковИ.А. Структурные элементы хроматина растений. Консервативность первичной структуры глобулярных доменов субфракций гистона ИГ из зародышей пшеницы. - Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии". Москва,1985, стр. 74-75.

2. Меликова Л.А. Ермохина Т.М., Крашенинников И.А. Структурные элементы хроматина растений. Пептидные карты глобулярных доменов субфракций гистона Н1 из зародышей пшеница. - Тезисы докл. 18 научн.конф. молодых ученых бпол.факульт.МГУ, Москва, 1987, стр. 63-66.

3. Меликова Л.А., Ерыохина Т.Ы., Крашенинников И.А. Структурные элементы хроматина растений. Частичная аминокислотная последовательность глобулярных доменов гистона Н1 из зародышей пшеницы. - Тезисы докл. 18 научн.конф. молодых ученых биол.фак. МГУ "Проблемы современной биологии", Москва,1987, стр. 58-62.

4. Меликова Л.А., Ермохина Т.М., Крашенинников И.А. Частичная аминокислотная последовательность глобулярного домена из субфракции гистона Н1 зародышей пшеницы. - Известия АН Азерб. ССР, г.Баку, 1988, Л 2, стр. 12-18.

Подписано к печати 22;04.88 Формат 60x90 I/I6 Объем 1,5 п.л.

1,3 уч.изд.л. Тираж 100 Заказ 501 И Д-77254 Бесплатно_

Ротапринт Завода-втуза при ЗИЛе,109068,Москва,Автозаводская,16

МЕЛИКОВА ЛЕЙЛА АРАСТУНОБНА

Изучение особенностей структуры лизин-богатых гистонов пшеницы

(Автореферат )