Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение обмена витамина D3 в печени крыс при экспериментальном диабете

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение обмена витамина D3 в печени крыс при экспериментальном диабете"

&

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАІНИ ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ.О.В.ПАЛЛАДИА

на правах рукопйСу

СТЕФАНОВ Михайло Вікторович

Вивчення обміну вітаміну Б3 у печінці при експериментальному цукровому діабеті

03.00.04 - Біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ-1997

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у лабораторії медичної біохімії Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України.

Науковий керівник - кандидат біологічних наук

АПУХОВСЬКА Лариса Іванівна Науковий консультант - академік

ЛУК'ЯНОВА Олена Михайловна Офіційни опоненти : доктор біологічних наук, професор

ВЕЛИКИЙ Микола Миколайович доктор біологічних наук ФЕДОРОВ Олексій Миколайович Провідна установа - Інститут ендокринології та обміну речовин АМН України. Захист дисертації відбудеться " 24 " березня 1997 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.84.01, 252601; Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознойомитися у бібліотеці Інституту біохімії ім,О.В.Палладіна НАН України.

Автореферат розісланий "20 " лютого 1997 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої рада,

кандидат біологічних наук —, Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Дані літератури за останній час свідчать про значну роль ітаміну D3 у регуляції функціональної активності підшлункової залози. Вперше це при-ущення було висунуто у зв'язку з виявленням у ядрах р-клітин підшлункової залози т-окоспецифічних рецепторів щодо гормонально активних форм вітаміну D3 (Christacos t а!., 1979, 1981; Clark et al., 1980). Окрім того, було показано, що активні метаболіти злекальціферолу регулюють процеси проліферації та диференціації р-клітан (Clark et 1987), а також синтез інсуліну та його рецепторних білків (Cade et al., 1986, 1987).

На підставі зазначеного можна припустити, що D-дефіцигний стан організму мое негативно впливати на функціональну активність p-клітин підшлункової залози і П'И однією із можливих причин як ризику розвитку цукрового діабету, так і тяжкості іної патології.

З іншого боку показана здатність інсуліну виявляти стимулюючий вплив на ак-вність ферментативних систем, які здійснюють гідроксилювання холекальціферолу в іго біологічно активні форми (Levin, 1982; Ikeda et al., 1987). Один із етапів цієї тран-юрмації, а саме гідроксилювання холекальціферолу до 25-гідроксихолекальціферолу, (бувається у печінці (Dueland et al., 19S3; Бауман, 1989). Враховуючи те, що при цух-пом у діабеті порушується структурно-функціональні характеристики клітин багатьох ганів, в тому числі і печінки (Баранов, 1983), можна припустити, що однією із мож-вих причин зазначеної зміни вмісту активних метаболітів вітаміну D3 у сироватці зві при даній патології (Hougli et al., 1983), є порушення здатності печінки синтезува-25-гідроксихолекальціферол, який е транспортною формою холекальціферолу в ор-ізмі і служить субстратом для синтезу у нирках його більш полярних форм, що мають мональну активність (DeLuka, 1978).

Мета дослідження: Вивчення порушень обміну холекальціферолу у печінці за умов експериментального цукрового діабету, а також виявлення можливості корекції вітаміном Оз метаболічних порушень, що пов'язані з даною патологією.

Відповідно до поставленої мети вирішувались такі завдання:

1. Вивчити всмоктування вітаміну І)з в тонкому кишечнику щурів при експериментальному цукровому діабеті.-

2. Визначити механізм порушення процесу гідроксилювання холекальціферолу у печінці щурів за даної патології.

3. З’ясувати можливості застосування вітаміну Бз з метою корекції порушень вуглеводного обміну при експериментальному діабеті.

Наукова новизна. Виявлено, що за умов експериментального діабету зменьшується всмоктування холекальціферолу у кишечнику внаслідок зміни ліпідних компонентів клітин слизової тканини тонкого кишечника. '

Показано, що за умов зазначеної патології порушується обмін вітаміну О з в печінці внаслідок зменшення його поглинання цим органом, зміни розподілу холекальціферолу міх різними типами клітин печінки та інгібування активності ферментів печінки, які гідроксилюють вітамін О}.

Показало, що за умов експериментального цукрового діабету екзогенний вітамін Оз здіснює нормалізуючу дію на структуру та функції р-клітин підшлункової залози.

Практичне та теоретичне значення роботи. Одержані дані дозволяють розширити існуючі уявлення щодо механізму порушення обміну вітаміну Оз при цукровому діабеті.

Показана можливість використання вітаміну І)з для профілактики і корекції порушень вуглеводного обміну при експериментальному цукровому діабеті. Спосіб його використання оформлено у вигляді заявки на патент України (пріоритетна довідка В4602438).

Конкретний особистий внесок дисертанта. Автором дисертаційної роботи осо-Зисто здійснювалась підготовка та проведення експериментів, самостійно проаналізован іссь первинний матеріал, сформульовано положення і висновки роботи.

Апробація роботи. Матеріали роботи були представлені на Загальносоюзній конференції з клінічної вітамінології (Москва, 1991), Міжнародному симпозіумі "Витамины і здоровье Бслоруси и смежных регионов" (Гродно, 1995), науково-практичній конфе-»енції з неікфекційної патології тварин (Біла Церква, 1995), а також на семінарах лабо-іаторії медичної біохімії та Вченій Раді Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН Ук-іаїни.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті, тези доповідей конференцій та симпозіумів (три публікації), подана заявка на патент України.

Об’єм дисертації. Дисертаційна робота викладена на 137 сторінках друкованого ексту і складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини, заключен-я та висновків. Перелік літератури вміщує 394 найменування. Робота ілюстрована 6 аблицями та 16 рисунками.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вивчення поглинання та обміну вітаміну Бз в печінці, а також його всмоктуванії у кишечнику при експериментальному цукровому діабеті проводили на щурицях лінії %іат, які перебували на дієті віварію.

Дослідження проводили на алоксановій моделі цукрового діабету (Баранов та ш., 1983).

Вміст глюкози, концентрацію кальцію, рівень загальних ліпідів та активність ■жної фосфатази у сироватці крові визначали при використанні біотест-наборів фірми

"ЛАХЕМА” (Чехословаччина); неорганічний фосфор - за методом Діце (1973); концентрацію холестерику - за реакцією ЕМА (Kamel, 1976).

Визначення у сироватці крові інсуліну проводили за методом радіоімунологічногс аналізу за допомогою тест-набору РИО-ИНС-ПГ-125І (ОП ИБОХ АН, Білорусія).

Структуру острівкової тканини підшлункової залози і кількість p-клітин визначали методами гістохімічного аналізу (Баранов та інш., 19S3).

Вміст активних метаболітів вітаміну D3 визначали за методом радіоконкурентногс зв'язування після їх екстракції з об’єкту дослідження та хроматографічного розподіл) (Justova, 1982). Як зв'язуючу систему для 250HD3 та 24,25(OH)2D33 використовували сироватку крові щурів з D-гіповітамінозом, для 1,25(OH)2Dj3 - щітозольний білок слизової тканини тонкого кишечнику кроля (Duiikan, 1983).

Клітини печінки одержували шляхом її обробки колагеназою і проназою з на ступним розподілом клітин за методом диференційного центрифугування (Dueland et at. 1981). Чистоту одержаних фракцій контролювали гістохімічним методом після і послідовного фарбування гематоксиліном Бомера та еозином.

Інкубацію гепатоцктів з міченим вітаміном Dj проводили відповідно (Dueland е аі, 1981).

Вміст білку визначали за методом Лоурі (1951).

Статистичну обробку одержаних даних здійснювали загальновизнаними методамі (Ойвін, 1961). Дані вважались достовірними при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Експериментальна модель цукрового діабету. Експериментальну модель цукрово го діабету створювали шляхом внутрішньовенного введення піддослідним тваринам 4 мг алоксану на кг маси тіла. Введення цієї дози алоксану забезпечувало на 20-30 доб

досліду стійке підвищення рівня глюкози до 47,3 ± 3,1 ммоль/л в порівнянні з 6,50 ±

0,44 ммоль/л у цих тварин до введення алоксану.

Вміст інсуліну у сироватці крові тварин після ін'єкції алоксану знижувався до 1,60 ± 0,14 нмоль/л в порівнянні з 5,4 ± 0,4 нмоль/л у контрольних тварин. Гістохімічний аналіз підшлункової залози також показав на цей період часу зменшення кількості р-клітик порівняно з контролем з 60 ± 5 до 20 ± 3 одиниць (середнє значення кількості р-клітин у п'яте полях зору мікроскопу з п'яти препаратів підшлункової залози).

Введення меншої дози алоксану (20 мг на кг маси тіла) виявляло менш виражені зміни зазначених показників. Навпаки, використання більш високої концентрації цього хімічного агенту (75 мг на кг маси тіла) викликало критичне підвищення рівня глюкози іо 83,7 ± 7,4 ммоль/л та призводило до загибелі тварин.

Таким чином, дані біохімічних та гістохімічних досліджень свідчать про те, що за даов нашого експерименту введення 40 мг алоксану на кг маси тіла забезпечує на 20-30 їобу після його введення розвиток цукрового діабету у щуриць. Всі подальші дослідженні були проведені у цей період часу.

Порушення мінерального обміну та рівня активних метаболітів вітаміну Ря. Дані іітератури про порушення мінерального обміну при цукровому діабеті є досить суперечив!. Так, деякі автори показують зниження вмісту кальцію у крові лри цукровому .іабеті (КуотЬа, 1989), у той час як інші відмічають, що у хворих на цукровий діабет іівень кальцію у сироватці крові не відрізняється від середніх показників здорових лю-ей того ж віку (Хипмуи, 1988). У той хе час, у хворих на цукровий діабет відмічається озвиток діабетичної оетеопенії, однією із можливих причин якої можуть бути істотні орушення мінерального обміну (ВоиіІІои, 1987).

Проведені нами дослідження виявили, що за умов експериментального діабету піст кальцію у сироватці крові знижується у 1,5 рази порівняно з його вихідним рівнем

б

(Рис. 1). Можливо подібні зміни є наслідком зниження рівня активних метаболітів вітіміну Оз у сироватці крові тварин з експериментальним цукровим диабетом.

Дані літератури про зміну вмісту активних метаболітів вітаміну Вз у сироватці крові при цукровому діабеті нечисленні і часто суперечливі.

За даними деяких авторів при цукровому діабеті концентрація 250Н0з у сироватці крові не відрізнялась від такої у контрольної групи тварин ^уотЬа, 1985). Рівень загального І,25(ОН)гО} при даній патології знижувався (ЬІуотЬа, 1985), в той час як вміст вільного 1,25(ОНЬОз наближався до його рівня у контрольних тварин (Ріке, 1980; РаррепГіеітег, 1987).

Рисунок 1. Зміна рівня кальцію у сироватці крові щурів при алоксановому діабеті (М±т; п=8)

Неоднозначні також дані літератури щодо вмісту активних метаболітів вітаміну D3 у хворих на цукровий діабет (Frazer et al., 1981; Christiansen et al., 1982; Ishida et al., 1985).

Причина подібних розбіжностей, можливо, пов’язана з різною мірою тяжкості захворювання або індивідуальними, більш глибокими ураженнями печінки чи нирок, де відбуваються процеси гідроксилювання вітаміну D3.

Одержані нами результати по визначенню вмісту активних метаболітів вітаміну D3 у сироватці крові щурів з алоксановим діабетом наведені у Табл. 1.

Таблиця 1. Вміст активних метаболітів вітаміну D3 у сироватці крові щурів з алоксановим діабетом (М+т; и=5)

Умови досліду Активні метаболіти вітаміну D3, нг/мл

250Н D3 24,25(OH)2D3 l,25(OH)2D3

Контроль 5,3 ± 0,3 3,4 ± 0,3 0,16 ± 0,01

Діабет 2,3 ± 0,2* 1,3 ± 0,1* 0,080 ± 0,006*

" достовірно відносно контроля

Як видно із цих даних, у щурів експериментальної групи через ЗО днів після вве-іення алоксану спостерігається значне зниження всіх досліджуваних метаболітів іітаміну Оз. Необхідно зазначити, що найбільш вираженим є зменшення у сироватці :рові вмісту 250Нйз та 24,25(ОН)гВз, кількість яхих знижується на 59% та 60% ■ідповідно. Менш вираженою є зміна вмісту 1Д5(0Н)20з. Його рівень знижується на '0% по відношенню до його вмісту у контрольних тварин.

З нашої точки зору, можливими причинами зниження рівня активних метаболітів олекальціферолу у сироватці крові при експериментальному діабеті може бути як пору-

г

шення його всмоктування слизовою тканиною тонкого кишечника, так і порушенш процесів обміну вітаміну Оз в організмі.

Всмоктування холекальиісЬеролу у тонкому кишечнику. З метою вивчення всмоктування вітаміну Оз клітинами слизової оболонки тонкого кишечника тваринам контрольної групи і групі щурів з алоксаиоБИМ діабетом рег об вводили 9 пмоль міченого холе-кальціферолу і досліджували його надходження із тонкого кишечника у кровотік.

Рисунок 2. Накопичення [3Н]-холекальціферолу у крові щурів при його введенні тваринам per os (М± пі; п=7)

1 - контроль 2 - діабет

•1к видно із наведених на Рис. 2 даних, у контрольних тварин в інтервалі часу до 24 годен відбувається збільшення кількості сумарної радіоактивності з максимальним підви-ценням на б годину.

У щурів з алоксаноиим діабетом відмічається не тільки зниження у 2,7 рази вихо-іу міченого холекальціферолу у кровотік, але і спостерігається зміщення максимуму на-:оличення радіоактивності у крові щурів до 12 годин проти 6 годин у контрольних тва-іин. Подібний зсув максимуму накопичення [3Н)-холекальціферолу і зменшення іорівняно з контролем рівня вмісту радіоактивності протягом всього інтервалу часу у іурів експериментальної групи, очевидно, свідчать про зниження всмоктування ітаміну Оз слизовою оболонкою тонкого кишечника щурів за данної патології.

'аблиця 2. Зміна вмісту ліпідних компонентів слиіодої оболонки тонкого кишечника іурів при експериментальному цукровому діабеті (М±пі; п=8)

Група Ліпіди слизової тканини тонкого кишечника, мг/г сирої тканини

Загальні ліпіди Холестерин Фосфоліпіди

онтроль 8,10 ± 0,44 2,35 ± 0,04 2,79 ± 0,25

іабет 14,20 ± 0,97* 3,73 ± 0,10* 4,57 ± 0,40*

достовірно відносно контроля

Можливо, виявлене порушення всмоктування вітаміну Рз відбувається за рахунок ііни ліпідного складу слизової тканини тонкого кишечника щурів. При проведенні :алізу вмісту ліпідних компонентів слизової тканини тонкого кишечника щурів при спериментальному цукровому діабеті нами були виявлені зміни порівняно з контро-м (Табл. 2), які виражались у підвищенні рівня загальних ліпідів, загальних фос->ліпідів та холестерину відповідно на 75%, 64% та 58%.

Подібні зміни, як иідомо (Бауман, 1989), можуть призвести до модифікації структури мембран щіткової крайки і порушення їх транспортної функції. Вірогідно, що виявлені нами зміни ліпідного складу слизової тканини тонкого кишечника пояснюють порушення всмоктування холекальціферолу в цьому органі і це є однією із причин зниження забезпеченості організму активними метаболітами вітаміну Бз при експериментальному цукровому діабеті.

Обмін вітаміну Рі в печінці щурів. Відомо, що до 70% холекальціферолу із кровотоку поглинається печінкою фиеіапсі, 1952), де відбувається перший етап його гідрок-силювання у 25 положенні (Оапоп-Вагге, 1985). У той же час відомо, що при деяких захворюваннях печінки (цироз, жовтяниця) спостерігається порушення забезпеченості організму активними метаболітами вітаміну Бз (Маіуаг й аі., 1991), вірогідно, внаслідок

X

•г*Н

Е

О

Я

<11

«

о

а

а

п

*г!

т

К

2

'І

Рисунок 3. Накопичення рН]-холекальціферолу в печінці щурів (М ± ш; п=5)

1 - контроль 2 - діабет .

міни надходження холекальціферолу у печінку, та порушення його гідроксилювання в ьому органі. Тому наступним напрямком наших досліджень було вивчення механізмів :ожливого порушення обміну вітаміну Оз в печінці при експериментальному діабеті.

З метою вивчення поглинання вітаміну Оз печінкою контрольній групі та групі варин з алоксановим діабетом внутрішньовенно вводили 4,5 пмоль ]3Н]-холскальціфе-олу. Як видно із наведених -даних (Рис. 3), у контрольних тварин до 45 хвилини оглинається 72% холекальціферолу від введеної у кровотік радіоактивності, а на 105 вилину мічений холекальціферол практично повністю виводиться з печінки.

При алоксановому діабеті разподіл загальної радіоактивності в печінці істотно мінюється. Не звертаючи уваги на те, що максимум накопичення радіоактивності спос-;рігасться вже на 15 хвилину, кількість включеного вітаміну Оз у точці максимуму чижусться до 45%, шо свідчить про знгокення поглинання вітаміну Оз печінкою при кспериментальному діабеті на 27%. При цьому при даній патології більш, ніж вдвічі одовжується час обміну холекальціферолу у печінці. Якщо у контрольних тварин введ-ий у кровотік [3Н [-вітамін Оз метаболізуєгься протягом 105 хвилин, то за умов цукро-ого діабету на цей період часу більш, ніж 20% введоної у кровотік загальної радіоактив-ості лишається у печінці. Ці результати, напевно, свідчать про значне зниження інтен-ивності поглинання вітаміну Оз печінкою та його обміну у цьому органі за даної пато-згії.

При алоксановому діабеті також порушується і процес гідроксилювання холе-ільціферолу в печінці. Як видно із даних Рис. 4, максимум вмісту [3Н1-мекальціферолу в печінці контрольних щурів припадає на 30 хвилину після введення ідіоактивності. Вміст вітаміну Оз на цей період часу вдвічі вище, ніж вміст його дроксильоііаної форми. Але вже на 45 хвилині досліду частка [3Н|-25-гідроксихоле-ільціферолу складає 62% від загальної радіоактивності. Рівень негідроксшіьованої фори вітаміну Оз помітно зменшувався, і на 105 хвилину в печінці контрольних щурів роцес гідроксилювання [3Н]-.холекальціферолу практично завершується. У той же час,

в печінці щурів з експериментальним цукровим діабетом на 45 хвилину експозиції гідроксшшється не більше, ніж 20% вітаміну Вз- Причому, протягом всього досліджуваного часу процес перетворення вітаміну О} у 2501Шз в печінці тварин з алоксановим діабетом є уповільненим, і, навіть, на 240 хвилину більш, ніж 20% від загальної радіоактивності у цьому органі припадає на долю негідроксильованої форми холекальціферолу.

Рисунок 4. Вміст [3Н (-холекальціферолу (1) та [3Н]-25-гідроксихолекальціферолу (2) і печінці щурів (М ± т; п—5)

А - контроль Б - діабет

Проведені дослідження по обміну вітаміну Бз в печінці підтверджують дані пр. вміст холекальціферолу та 250НБз у сироватці крові (Рис. 5). Із наведених результаті видно, що у сироватці крові контрольних тварин через 15 хвилин після введення міче ного холекальціферолу основна його частина (біля 90%) припадає на долю вітаміну О; що корелює з даними про процес його гідроксилювання в печінці. На 45 хвилині експо зиції, коли в печінці більша частина радіоактивності представлена у формі [3Н]-250Н0

Рис. 4), у сироватці крові негідроксшіьована форма вітаміну Пз практично відсутня. Зсновка кількість сумарної радіоактивності у сироватці крові на 45 хвилині,а ,особливо, гіа 60 хв, представлена тільки у формі (3Н)-250Н0з.

Зменшення вмісту [3НІ-250Н0з у сироватці крові після 60 хв є наслідком того, ао на цей період часу переважна кількість

хвилини

Рисунок 5. Вміст [3Н]-холекальціферояу (1) та [3Н1-25-гідроксихолекальціферолу (2) у сироватці крові щурів (М ± го; п=6)

А - контроль Б - діабет

[3Н]-вітаміну Вз гідроксильована, а інтенсивність виходу гідроксильованої форми холе-кальціферолу із печінки у кровотік залишається незмінною. У той же час, при експериментальному діабеті зменшення вмісту [-Н]-вітаміну Оз у сироватці крові з 15 до 90 хв експозиції відбувається повільніше. На 90 хв, коли у іцурів контрольної групи у сироватці крові виявлений тільки [3Н]-250Ш)з, у тварин з експериментальним діабетом до 50% загальної радіоактивності припадає на долю [3Н]-холекаяьціферолу. При цьому,

вміст |3Н1-250Н0з на цей період часу становить тільки 40% від його рівня у контрольних тварин, що відпоиідає більш високому рівню вітаміну Бз в печінці.

Таким чином, результати досліджень, наведених на Рис. 4 та 5 підтверджують, що при експериментальному діабеті порушується процес гідроксшпованші вітаміну Вз у печінці.

хвилини

Рисунок 6. Поглинання [3Н]-холекальціферолу ретикулоцитами (1) та гепатоцитами (2)

(М ± т; п=5) ______

А - контроль Б - діабет

Однією із причин зміни процесу гідроксилювання вітаміну Оз у печінці, напевно, є порушення його транспорту у гепагоцити. Відомо, що вітамін Рз із кровотоку поглинається не тільки гепатоцитами, де відбувається його гідроксилювання (НоНи, 1990), але і ретикулоцитами, які виконують щодо холекальціферолу роль депо (Бисіапсі єі аі., 1981; Апухоїіська, 1991). Із одержаних даних видно (Рис. 6), що вміст радіоактивності у ретикулоцитах контрольних тварин на ЗО хвилину експозиції вдвічи вищий, ніж

гепатоцитах, але після цього періоду її рівень починає швидко знижуватись, а на 90 вилині мічений вітамін D3 у регикулоцитах практично відсутній. Враховуючи, як було азначено раніше, що протягом J05 хв весь вітамін D3, що був поглиненим печінкою, іетаболізується у 25-гідроксиштамін Dj, можна зробити заключення, що вітамін D3 із «тикулоцитів поступово транспортується у гепатоцити.

При експериментальному діабеті вміст міченого вітаміну D3 у гепатоцитах значно іенший, ніж у відповідних клітинах контрольних тварин. Можливо, зниження погли-іання вітаміну D3 печінкою при алоксановому діабеті, яке було показано раніше (Рис. і), відбувається за рахунок функціональних змін гепатоцитів. Окрім того, відсутність іираженого зменшення вмісту радіоактивності у регикулоцитах, як це спостерігається у сонтрольній групі, напевно, свідчить про порушення за данної патології транспорту йтаміну D3 із них клітин у гепатоцити.

Припущення про порушення за умов алоксанового діабету інтенсивності погли-іання гепатоцитами вітаміну D3 знайшло своє підтвердження у дослідах in vitro (Рис. 7). 1к видно із рисунку, інтенсивність поглинання радіоактивності гепатоцитами контрольних щурів значно виша, ніж включення міченого холекальціферолу у гепатоцити діабе-•ичних щурів. Так, максимальне поглинання [3Н]-вітаміну D3 у контрольній групі ірипадає на 60 хвилину інкубації, у той час, як гепатоцити щурів з алоксановим діабетом зв'язують максимальну кількість радіоактивності тільки на 120 хвилину. При цьому, сількість міченого вітаміну D3, що був поглинений гепатоцитами у цей інтервал часу,

і а 25% нижчий від рівня включення ізотопу, який спостерігався у цих клітин контроль--юї групи щурів. Одержані дані відповідають результатам дослідів in vivo (Рис. б), які гсж виявляють більш інтенсивне порівняно з еклериментальним діабетом поглинання 3Н]-холекальціферолу гепатоцитами щурів контрольної групи. Зміщення максимуму юглинання вітаміну D3 гепатоцитами, яке було виявлене нами як у дослідах in vivo,

Рисунок 7. Поглинання [ 3Н ]-холекальціф>сролу гелатоцитами контрольних (І) та дослідних тварин (2) в системі досліду hi vitro (M±m; n=5)

так і у дослідах in vitro, свідчить про лімітування процесу транспорту холекальціферолу у клітини, напевно, за рахунок структурних змій клітинних мембран.

Іще ОДНІЄЮ ІЗ МОЖЛИВИХ причин порушення обміну вітаміну Рз в печінці може бути зміна активності вітамін D3 25-гідрсксилазної системи печінки.

За даними літератури відомо, що процес гідроксилювання вітаміну D3 у гепато-цитах здійснюється двома ферментами, які локалізовані відповідно у мікросомальній та мітохондріальній фракціях і здатні реалізувати свою дію при різних концентраціях субстрату (Hollis, 1990). Вважають, що мікросомальна вітамін D3 25-гідроксилаза функціонує при фізіологічних концентраціях холекальціферолу і має високу спе-

ифічність, але низьку ємність зв'язування (МаЩюк, 1979). Вітамін Оз 25-гідроксилаза ітохондрій виявляє свій ефект при високих концентраціях вітаміну Оз і має низьку

ясунок 8. 25-Гідроксилювання вітаміну Оз гепатоцитамк контрольних (1) та діабетич-іх (2) щурів при різних концентраціях субстрату (М ± т; п=5)

іецифічність, але високу ємність зв'язування субстрату (В)огИіет, 1978). Нами також ла показана наявність цих ферментів у гепатоцитах контрольних тварин (Рис. 8).

Як видно із наведених даних, у контролі спостерігається два піки гідроксилазної тивності при концентраціях субстрату 25 та 200 нМ відповідно. Можливо, перший пік мовлений активністю ферменту, який розташований у фракції мікросом. Збільшення «центрації субстрату понад 25 нМ призводить до інгібування цього ферменту, кількі, за даними літератури, активність вітамін Оу 25-гідроксилази мікросом гулюється як концентрацією вітаміну Бз, так і продуктом свого синтезу (ЕІЬаг е( аі, 85). Другий пік ферментативної активності при 200 нМ, напевно, зумовлений дією

З.о

Е

5

-1------1---------1------------------1---- ((

10 50 100 11

200 " ^ 500 НМ

пмоль

мітохондріальної вітамін Оз 25-гідроксилази. Збільшення концентрації субстрату пона, 200 нМ супроводжувалось зниженням рівня процесу гідроксилюзання, яке, однак, н було достовірним. У випадку алоксанового діабету за умов нашого досліду не було вияв лено першого піку гідроксилазної активності, що дає підставу для припущення наяв-

5

ЕГ

О

н

«з

е

0)

и

0

1

о

7*

1*10° гепатоцитів

хвилини

Рисунок 9. 25-Гідроксил юванші вітаміну Бз гепатоцитами контрольних (1) та діабетичних (2) щурів у залежності від часу інкубації (Б) та кількості клітин у середовищі інкубації (А) (М ± іп; п=5)

асті більш вираженого за даної патології порушення активності вітамін D3 25-гідрокси-ізи мікросом. При експериментальному діабеті відмічається один максимум утворення 5-гідроксимтаміну D3 при концентрації субстрату 100 нМ. При цьому, на відміну від .тамін D3 25-гідроксилази мітохондрій контрольних тварин, активність цього ферменту ри алоксановому діабеті більше залежить від забезпеченості вітаміном D3, оскільки «скується при збільшенні концентрації субстрату понад 100 нМ. При розрахунку кіне-ичних параметрів цієї реакції було виявлено збільшення значення Кіп з 200 нМ у консольних тварин до 400 нМ у групі тварин з алоксановим діабетом, що свідчить про тбування при експериментальному діабеті також і вітамін D3 25'гідроксилази ітохондрій.

Зниження активності вітамін D3 25-гідроксилазної системи печінки при експери-іентальному діабеті підтверджується також результатами дослідження 25-пдроксилю-ання холекальціферолу гепатоцитами в залежності від часу інкубації та кількості клітин середовищі інкубації (Рис. 9).

Таким чином, можна сказати, що зниження рівня активних метаболітів холе-дльціферолу при алоксановому діабеті, напевно, пов'язане як зі зниженням інтенсив-юсті всмоктування вітаміну D3 слизовою тканиною тонкого кишечника, так і порушень іого гідрокси-яювання в печінці внаслідок порушення транспорту холекальціферолу в епатоцити та інгібування активності 25-гідроксилазної системи печінки.

На основі одержаних даних, а також за даними літератури про вплив вітаміну D3 іа структуру та функції (5-клітин підшлункової залози (Clmstacos et al., 1981; Cade et .1., 1987) виявилось доречним з'ясувати можливість холекальціферолу попереджувати або юслаблювати перебіг захворювання на цукровий діабет.

Таблиця 3. Вміст глюкози, інсуліну у сироватці крові, кількість р-клітин підшлунково залози щурів (М±т; п=15)

Умови досліду Вміст глюкози, имолй/л Вміст інсуліну, нмоль/л Кількість р-клітан , од.

Контроль 6,5 + 0,6 6,1 +0,5 63,0 ± 1,6

Діабет (48 годин після введення алоксану) 45,1 ± 2,5 1,9 ± 0,2 38,8 ± 1,8

Діабет (ЗО діб після введення алоксану) 38,4 ± 1,2 1,5 ± 0,1 22,3 ± 1,2

Діабет + 10 МЕ вітаміну Бз 7,7 + 0,7* 5,7 ± 0,4* 59,2 ± 1,7*

* достовірно відносно діабетичного стану на ЗО добу досліду

З мстою з'ясування протекторної дії вітаміну Оз щурам на другу добу після ін'єкції алоксану щоденно, протягом ЗО діб вводили ІО МЕ (фізіологічна доза) холе-кальціферолу (Табл. 3).

Представлені дані показують, що введення фізіологічної дози вітаміну Э; попереджує розвиток цукрового діабету у щурів, про що свідчить факт збереження на толерантному рівні концентрацій глюкози та інсуліну порівняно з групою тварин, які холекальціферолу не одержували. Окрім того, в групі щурів, які одержували вітамін О; не спостерігалось пошкоджень структури р-клітин підшлункової залози.

аблиця 4. Вміст глюкози і інсуліну у сироватці крові щурів (М ± т; 11=15)

мови досліду Вміст глюкози, ммоль/л Вміст інсуліну, нмоль/л

онтроль 6,8 ± 0,3 5,62 ± 0,48

іабет (30 діб після введен-я алоксану) 38,4+ 1,2 1,54+ 0,12

іабет (60 діб після введен-я алоксану) 37,9 ± 1,1 1,17+ 0,09

іабет + 80 МЕ Оз 20,7 ±2,1* 4,03 ± 0,21*

іабет + 2 МЕ інсуліну 16,7 ± 1,5* 4,81 + 0,39*

іабет + 80 МЕБз + 1 МЕ (суліну 17,0 ± 1,8* 3,84 ± 0,33*

достовірно відносно діабетичного стану на 60 добу досліду.

Для з'ясування можливості використання холекальціферолу для нормалізації груктури і функції р-клітин и підшлункової залози щурам з глибоким алоксановим іабетом, тобто через ЗО діб з часу введення алоксану, протягом ЗО днів вводили 80 МЕ іікувальна доза) вітаміну О і. Одержані дані показують (Табл. 4), що в групі тварин, які цержували вітамін Оз, відмічається зниження рівня глюкози і підвищення вмісту ісуліну у сироватці крові, шо наближується до подібних значень у групі тварин, яким водили 2 МЕ інсуліну.

При сумісному використанні вітаміну Пз та 1/2 дози інсуліну також відмічається орівняно з діабетичним станом достовірне зниження вмісту глюкози та збільшення івня інсуліну.

Одержані результати, напевне, дозволяють говорити про стимулюючу дік вітаміну Бз на р-клітин и підшлункоиої залози і про опосередкований через цю дік гіпоглікемічний ефект холекальціферолу.

ВИСНОВКИ

1. Показано, що при експериментальному цукровому діабеті порушується мінеральний обмін внаслідок зниження забезпеченості організму активними метаболітами вітаміну Бз: 25-гідроксііхолекальціферолом, а також 24,25- та 1,25-дигідроксихоле-кальціферолом.

2. Установлено, що при адоксановому діабеті відбувається зниження інтенсивності всмоктування холекальціферолу клітинами слизової оболонки тонкого кишечника щурів.

3. Виявлено, що за умов досліджуваної патології у слизовій тканині тонкого ки-шичника збільшується вміст загальних ліпідів, холестерину та загальних фосфоліпідів на 75%, 58% і 64% відповідно.

4. Показано, що при експериментальному цукровому діабеті на 36% знижується поглинання холекальціферолу печінкою щурів із кровотоку.

5. Установлено, що при адоксановому діабеті порушується розподіл холекальціферолу міх різними типами клітин печінки, і на 73% знижується його поглинання гепато-цитами.

6. Виявлено, що за умов досліджуваної патології порушується обмін вітаміну Вз в печінці: збільшується час і знижується інтенсивність його гідроксилювання у 250ІШз внаслідок інгібування вітамін Оз 25-гідроксилазної системи.

7. Показано доцільність використання вітаміну Бз у комплексній терапії цукрового діабету, яка обумовлюється його здатністю знижувати рівень глюкози і підвищувати концентрацію інсуліну у сироватці крові експериментальних тварин.

СПИСОК. РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Транспорт витамина D3 через кишечник и его обмен в печени крыс при алло-ановом диабете /Л.И.Апуховская, М.В.Стефанов, Л.В.Антоненко, Л.И.Омельченко // юбл. эндокринологии.- 1993.- N2,- С.43-46.

2. Влияние различных концентраций аллоксана на содержание глюкозы, кальция іктивность щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс / М.В.Стефанов // Укр. би-им. журн.- 1993,- N3. - С-107-110.

3. Особенности обмена витамина D3 в клетках печени при экспериментальном харном диабете / М.В.Стефанов, Л. И.Апуховская // Укр. биохим. журн.- 1996.-т.68,

1.- С.66-72.

Современные представления о механизме биологического действия витамина D3 в ганизме /Л.И. Апуховская, М.В. Стефанов, Л.И. Омельченко, Ю.Г. Антипкин // урн. Акад. мед.наук Украины - 1996. - №1. -С.15-32

5. Стефанов М.Б., Антоненко Л.В., Апуховская Л.И. Всасывание витамина D3 в шечнике и его 25-гидроксилирование в печени крыс с экспериментальным диабетом Всесоюз. науч. конф. "Клиническая витаминология" (Москва, июнь 1991г.): Тез.

кл,- М., 1991.- С.318-319.

6. Стефанов М.В., Апуховская Л.И. Обмен витамина D3 в клетках печени при ал-ксановом диабете и возможное его применение для профилактики и лечения данной тологии // Межд. симп. "Витамины и здоровье населения Беларуси и смежных реги-ов" (Гродно, 1995г.): Тез. докл. - Г., 1995,- С.175.

7. Апуховська Л.І., Стефанов М.В. Фізіологічна функція вітаміну D3 // Наук.-акт. конф. "Неінфекційна патология тварин" (Біла Церква, червень 1995 р.): Мат. на--практ. конф.- Б.Ц., 1995.- С.24-26.

Stefanov M.V. “Study of vitamin D3 metabolism in liver with experimental diabetes mellitu; The dissertation on degree of candidate of biological science, speciality 03.00.04 - biochemist A.V. Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine.

The results of experimental studies in rat liver vitamin D3 metabolism in experimen

diabetes melJitos are defended. The pathology tested revealed that vitamin D3 metaboli

disturbance bad place in the liver due to the liydroxylation process change in the organ, a:

consequence of cholecalciferol distribution injuiry in the hepatic cells, and its transport 11

liepatocytes, where the process its liydroxylation in the 25th position and inhibition of the li

vitamin D3 25-hyd'roxylase system activity took place. The data displayed provides for 1

statement about the vitamin D3 application advisability in the complex curative therapy diabetes mellitus, that have been claimed as an application for the patent of Ukraine.

Стефанов M.B. “Изучение обмена витамина D3 в печени крыс при экспсримгнталыг

диабете”. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

специальности 03.00.04 - биохимия. Институт биохимии им. А.В. Палладина Н/

Украины.

Защищаются результаты экспериментальных исследований по обмену гигами Dj в печени крыс с экспериментальным сахарным диабетом. Установлено, что п изучаемой патологии происходит нарушение обмена витамина D3 в печени, связанно изменением процесса его гидроксилирования в этом органе, вследствие нарушен распределения холекальциферола по клеткам печени, его транспорта в гепатоциты, і осуществляется процесс его гидроксилирования в 25 положении, и ингибировав активности витамин D3 25-гидроксилазной системы печени. Приведены результат которые позволяют говорить о целесообразности применения витамина D3 комплексной терапии сахарного диабета. Эти данные оформлены в виде заявки патент Украины.

Ключові слова: експериментальний цукровий діабет, вітамін D3, гепатоци вітамін D3 25-гідроксилазна система.