Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение новых целлюлолитических ферментов Clostridium thertnccellum, продуцированных в Escherichia соli.

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение новых целлюлолитических ферментов Clostridium thertnccellum, продуцированных в Escherichia соli."

"л \ /

!

российская академия наук институт г.иохими и физиологии микроорганизмов

На правах рукописи

УДК 577.152.3

равиндра нараян сингх

изучение новых целлюлолитических ферментов

Clostridium tliermoceUum, продуцированных в Escherichia coli

(специальность 03.00.04- биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

, Пушино - 1992 г.

Р/

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Научные руководители: д.б.н., проф. В.К.Акименко (ИБФМ) к.б.н., с.н.с. Н.П.Головченко (ИБФМ)

Официальные оппоненты: д.б.н., проф. Е.Л.Головлев (ИБФМ)

д.б.н., проф. Ю.В.Евтодиенко (ИТЭБ)

Ведущее учреждение: Институт биохимии им.Баха, РАН

Защита диссертации состоится 11 декабря 1992 г. в 14- час. Об мин. н заседании Специализированного совета Д 002.69.01 при Институте биохимии физиологии микроорганизмов РАН, г.Пущино, Московской области, 142292

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии физиологии микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан 10 ноября 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

В.М.Вагабов

г. 'л 1 ' r - —.....- * -

! 4 • '

Актуальность работы. Целлюлозу, наиболее распространенный растительный шсахарид, можно рассматривать как один из потенциальных источников :ргии. При этом важен тот факт, что целлюлоза быстро возобновима: скорость :интеза составляет около 40,000 млн. т. в год.

Целлюлоза может быть использована как субстрат брожения для анаэробных сроорганизмов с целью получения этанола и других химических продуктов. Невысокой стоимости процесс брожения целлюлозы пока не получил широкого |мышленного применения, однако многочисленные исследования, ведущиеся в й области, позволили в общих чертах наметить основные этапы, необходимые улучшения экономики процесса гидролиза целлюлозы. Прежде всего, 'бходимы знания о механизме действия ферментов целлюлазного комплекса, в тности, представление о механизме синергизма между отдельными его шонентами .

Считается, что целлюлазная система (целлюлосома), продуцируемая бактерией firidium thennocellum, является одной из наиболее эффективных природных гем [Johnson et al., 1982] вследствие ее высокой удельной активности и мостабилыюсти. Ее изучению уделяется большое внимание, однако до авнего времени выделение, а следовательно и изучение отдельных компонентов люлосомы были затруднены из-за ее высокой стабильности. Успехи в этом равлении были достигнуты лишь с использованием методов генной инженерии, позволило выделить индивидуальные компоненты комплекса из омбинантных клеток. Таким способом были выделены и охарактеризованы гие, но далеко не все компоненты целлюлосом C.thermocellum. I настоящей работе представлены результаты по выделению, очистке и чению свойств трех ранее не изученных целлюлолитических ферментов: двух эглиэканаз и целлобиогидролазы С.thennocellum. Чтобы лучше понять механизм иололизиса было проведено изучение синергизма между этими ферментами и цествлен делеционный анализ одного из целлюлазных генов, cell, [ели и объекты работы. 1 Представленная диссертационная работа хчедовала следующие цели:

Выделение, очистка и характеристика целлюлаз C.thermocellum, купированных в рекомбинантных штаммах Escherichia coli. . Сравнительный анализ субстратной специфичности очищенных ферментов. . Изучение синергизма между эндоглюканазами и целлобиогидролазой на воримых и кристаллических субстратах.

Делеционный анализ гена cell в целях идентификации различных ктурных доменов эндоглюканазы-1 и наблюдения эффекта делеции на вность и секрецию фермента.

ринятые сокращения: ЕС - эндоглюканаза; ВЬ35 - делеционный вариант Е01; [ - целлобиогидролаза; се1 - ген, кодирующий эндоглюканазу; сЬИ - ген, :рующий целлобиогидролазу; Д- делегированный ген; р1 - изоэлектрическая а; КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза; пНФЦ - пара-нитрофенил- £ -О-обиозид; пНФЛ - пара-нитрофенил-^-О-лактозид; ПААГ-полиакриламидный ; ДТТ - дитиотрейтол; ББЗ - додецилсульфат натрия; Мг - молекулярная а; кДа - кило Дальтон.

Новизна работы. Материалы, представленные в диссертации, являются новы; по следующим причинам:

1. Для выделения EG7 был использован эффект ее специфического торможен: при гель-фильтрации в условиях повышенной ионной силы среды. Благода] этому при сравнительно простой процедуре очистки получен гомогенный препар эндоглюканазы с высоким выходом (более 80 %).

2. Впервые было показано, что две эндоглюканазы Cthermocellum (EG1 и ЕС/ кодйруемые разными генами, имеют общие антигенные детерминанты.

3. Выделение целлобиогидролазы C-thermocellum из рекомбинантных клет' E-coli и обнаружение синергического эффекта с эндоглюканазами этого ; организма впервые однозначно подтвердило, что целлобиогидролаза являет компонентом целлюлазной системы C.thennocellum.

4. Было установлено, что уменьшенный размер целлюлаз, продуцированных гетерогенной системе, возникает как следствие N-терминального и i терминального протеолиза.

Практическая значимость работы. Разработанный нами метод очистки Е( может быть использован для легкой и быстрой очистки других гидрофобш белков. Высокая лихеназная активность при кислых рН, высок термостабильность, устойчивость к этанолу и отсутствие ингибирования продукт! в случае фермента EG7 могут быть полезными при его использовании в процес приготовления пива. Полученные результаты помогут понять механи взаимодействия целлюлаз с субстратом, роль в этом гидрофобных домене изучить оптимальные условия реакции и эффект различных факторов целлюлолизис. Все это вместе взятое внесет несомненный вклад в эффективное промышленного использования клостридиальных целлюлаз.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены "6-ом Международном Симпозиуме по генетике и индустриальш микроорганизмам", который проходил в августе 1990 г., в Страсбурге, Франция, на совместном семинаре лаборатории анаэробных процессов и лаборатор физиологии микроорганизмов ИБФМ РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы. Две рабо находятся в печати.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах учетне машинописного текста,, содержит 16 таблиц и 36 рисунков, состоит из введен] обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения выводов. Список литературы содержит около 200 источников.

Материалы и методы

Обьектом исследования служили целлюлазы Cthennocellum, продуцировании' рекомбинантных штаммах E.coli. Клонирование генов cell, се17, се15 и cb кодирующих ферменты EG1, EG7, EG5, СВНЗ соответственно, равно как условия выращивания рекомбинантных штаммов даны в работах [Аминов и ; 1990; Bumazkin et al., 1990; Tuka et al., 1990].

Очистка ферментов. Культивирование клеток и приготовление бесклеточт экстракта проводились как описано в статье [Bumazkin et al., 1990].

Стадии очистки ферментов EG7, EG5 и СВНЗ даны в табл.1, 2, соответственно. Все ферменты были очищены до гомогенного состояния использованием системы FPLC на конечной стадии очистки. 2

)пределение молекулярного веса и изоэлсктрическон точки. Молекулярные а ферментов были определены с помощью SDS-ПААГ электрофореза, согласно <ли [Laemmli et al., 1970]. Изоэлектрическая точка была определена с ользованием готовых пластинок Phast Gel IEF 4-6.5 на приборе Phast System harmacia" , Швеция) в условиях, рекомендованных фирмой-изготовителем . Субстраты и определение ферментативных активностей. КМЦ-азную доглюканазную), Авицелазную и активность с аморфной и природной люлозой измеряли по образованию редуцирующих групп в 0.1 М цитратном >ере, рН 6.5, при температуре 60°С (в случае EG7, в 50 мМ гистидиновом >ере, рН 5.5, при температуре 55°С). Концентрация субстратов - 1%. уцирующие группы Сахаров измеряли с реактивами Шомоди и Нельсона mogyi, 1952 и Nelson, 1944). Арил-глюканазные активности измеряли в тех же овиях при концентрации пНФ-глюкозида и пНФ-целлобиозида 5 мМ. (азующийся в реакции п-нитрофенол определяли при 410 нм, используя ффициент экстинкции 18.5 лМ"' см-' (Deshpande et al., 1984). За

иицу ферментативной активности (Е) принимали активность, расщепляющую А ¿J-глюканазных связей за 1 мин.

)предсленне белка. Белок измеряли согласно модифицированному методу дфорда [Read and Northcote, 1981].

коэффициент сорбции. Коэффициент сорбции был определен по методу сова [Klysov et al., 1983].

!ависимость активности от рН, температуры и термостабилыюсть. Активность различных рН и температуре была определена в 1 мл реакционной ги,содержащей 1% КМЦ и 0.1 Е фермента. Для получения профиля >ильности фермент инкубировали при различных условиях (рН и Т) 24 час без :трата, оставшуюся после инкубации ферментативную активность измеряли при шальных условиях.

1лияние на активность различных агентов. Эти эффекты были измерены при авлении ионов металлов и реагентов в концентрациях, указанных в табл.б. 1ммунологнческий тест. Реакция поликлональных антител против EG1 с EG7, i и СВНЗ была исследована с использованием двойного диффузионного теста :герлони (Ouchterlony, 1958).

(зучение синергизма. EG1, EG5 и СВНЗ были использованы для изучения :ргизма. К 1 мл 1 %-ного раствора КМЦ в 50 мМ цитратном буффере (рН 6.5) изличных комбинациях (табл.7) добавляти по 0.2 Е ферментов, смесь убировали в течение 10 мин при 60°С. В случае, когда субстратом служила ьтровальная бумага (50 мг/мл), брали 1 Е фермента и инкубировали 6 часов условиях, описанных выше. Результаты выражены в мг-эквивалантах тобиозы продуцированных в реакции.

^елеционный анализ гена cell. Молекулярно-генетические процедуры водились согласно руководству Маниатиса и др. [Maniatis et al., 1982]. клеточная локализация продуктов гена была проведена с помощью этического шока [Comellis et al., 1982]. Анализ белковых продуктов в иклетках E.coli проводился по Стокер и др. [Stoker et al., 1984].

Результаты и обсуждение 'чистка EG7. Этапы очистки EG7 представлены в табл.1. Процесс очистки о фермента включал следующие стадии: получение клеточного гомогената,

3

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

Рис.1. Гельфильтрация EG на колонке с суперозой. ЕС элюировалась в последне единичном пике.

24

40

Объем элюции (мл) Рис.1

Рис.2а

Мг kDa

EG7

1.5

EG7,

на

Р. 1

1.0 О • со С4 <

Рис.2б. SDS-ПААГ электрофорез . этого же препарата. EG7 содержит два компонента с Мг 49 и 47 кДа.

0.5

EG7

67 <& 45 С=а "

25 —-

Рис.2б

10 20 30 40 Объем элюции (мл)

1ждение сульфатом аммония, колоночную хроматографию с использованием yopearl HW-50 в качестве носителя и гель-фильтрацию с использованием :темы FPLC. Следует отметить,что при таком способе очистки нами был лучен высокий конечный выход продукта - 80%. Вероятно, эту цифру можно ьяснить специфическим поведением EG7 на стадии колоночной хроматографии с :им носителем как Superóse. Как видно из данных, представленных на рис.1, на понке с Superóse EG7 элюировалась в последнем единичном пике, что цетельствует о гидрофобной природе этого белка. Хроматофокусирование гивной фракции (рис.2а), полученой после Superóse колонки, и SDS-ПААГ :ктрофорез этого же препарата (рис.1б), показывают, что EG7-содержит два чпонента с молекулярной массами 49 и 47 кДа, что, вероятно, является ;дствием протеолиза. Наличие множественных форм белков наблюдалось и для /тх рекомбинантных эндоглюканаз и, вероятно, является широко :пространенным явлением.

блица 1. Очистка эндоглюканазы-7

Объем Общий Общий Уд.

>акция фракции белок КМЦаза акт. Выход

(мл) (мг) (Е) (Е/мл) (Уо)

могенат клеток 800 9016 2512 0.27 100

аждение сульфатом 50 2200 2275 1.03 90.5

аммония (50%)

оматография на 15 366 2175 5.90 86.5

Toyopearl HW-50 F

яьфильтрация на FPLC 62 16.1 2022 125 80.5

Superóse 12 HR 10/30

Очистка EG5. Очистка фермента EG5 включала следующие стадии: иготовление бесклеточного якстряктя т-ямгт»»» с™егттс:::::;::::с:.;, дьс. ú^m 1ждения сульфатом аммония, термообработка и две стадии ионообменной эматографии на носителях DEAE-Sepharose и Mono Q HR 10/10 (табл.2), адия осаждения стрептомицином была использована для удаления нухлеиновых пот, ассоциированных с белками. Ионные матрицы были выбраны исходя из •о, что исследуемый фермент не является гидрофобным.

Перед нанесением на ионообменные колонки фермент был обессолен на тонке с Acrylex. Предварительно колонка была уравновешена 25 мМ фосфотным |)ером (рН 7.2), содержащим 1 мМ ДТТ, 20 мМ таурина, 40 мг/л пМСФ. лонка с DEAE-Sepharose была уравновешена этим же буфером. После 1есения образца колонку промывали 150 мл все того же буфера, а затем ;ключали градиент концентрации хлорида натрия (0-0.35 М). Активные акции, сошедшие с колонки, собирали и концентрировали. Дальнейшая очистка iro фермента осуществлялась на высокоэффективной колонке Mono Q HR /10, с которой фермент EG5 элюировали с использованием градиента щентрации NaCl (0-0.35 М). Белок. EG5 сходил с колонки в виде двух пиков, ссимумы которых соответствовали фракциям 8 и 12. Поскольку активность

5

фракции-8 в несколько раз превосходила активность фракции 12, для дальнейших исследований нами была использована только эта фракция.

Таблица 2. Очистка эндоглюканазы-5

Объем Общий Общий Уд.

Фракция фракции белок КМЦаза акт. Выход

(мл) (мг) (Е) (Е/мг) С/о)

Гомогенат клеток 31.1 5298 1909 0.4 100

Осаждение стрепто- 31.3 1539 1834 1.2 96

мицином

Осаждение сульфатом 33.0 1435 1818 1.3 95

аммония (30%)

Осаждение сульфатом 6.7 871 1735 1.9 90

аммония (65%)

Термообработка 6.6 500 1405 2.8 /3

Ионообменная хроматография 50.0 250 1275 5.1 66

на DEAE-Sepharose (1.6x20)

Ионообменная хроматография

на FPLC Mono Q HR 10/10

фракция-8 3.3 19.8 577.5 29.1 30

фракция-10 9.0 10.8 207.0 19.1 10

EG5

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

Рис.За

12 24

Объем элюции (мл)

Рис.За. Гельфильтрация EG7 на колонке с Superóse. Объем элюции соответствует Mr 100 кДа.

Рис.36. SDS-ПААГ этого же препарата. 35 к Да.

электрофорез Mr EG5 равен

Рис.Зб

Mr

kDa«w—

67 j¿j¡f

« сэ

EG5

Чтобы проверить ее гомогенность, фракцию 8 пропускали через высокоактивную колонку с Superóse 12 HR 10/30. В этом случае EG5 сходила с ноционным обьемом 11.85 мл (рис.За), что соответствует Мг 100 кДа. Однако, ¡зультаты SDS-ПААГ электрофореза этой же фракции показали, что Mr ;следуемого белка равен 35 кДа (рис.Зб). Эта разница молекулярных весов эжет быть объяснена тем, что на колонке с Superóse EG5 дает агрегат из 3-х бьедиииц, в то время как в присутствии SDS агрегат диссоциирует на вдивидуалыше субьединицы. Агрегирование целлюлаз не новое явление, о нем ке ранее сообщалось в ряде публикаций [Wood et al., 1982; Bagnara et al., 19861.

Очистка СВНЗ. Вследствие гидрофильной природы белка СВНЗ, для его тетки применялась следующая стратегия: получение клеточного экстракта, аждение стрептомицином и термопреципитация, осаждение сульфатом аммония, ль-фильтрация с использованием носителя Toyopearl, две стадии ионообменной юматографии я гель-фильтрация с использованием Superóse (табл.3).

(блица 3. Очистка целлобиогидролаза-3

Фракция Объем Общий Общий Уд-

фракции белок КМЦаза акг. Выход

(мл) (мг) СЕ) (Е/мг) <%)

могенаг клеток 590 5190 765 0.14 100

репгомицин + 520 3120 704 0.22 92

термообработка

аждение сульфатом 60 2700 630 0.23 82

аммония (60%)

омагография на 90 810 399 0.50 52

Toyopearl HW 50-F

'нообменная хроматография 150 92 285 3.10 37

на DEAE-Sepharose (1.6 X 20)

нообменная хроматография 1 в л 1 11 г J.20 28

на №LC Mono Q HR 10/10

1ьфильтрация на 5 10 168 18.80 22

FPLC Superóse 12 HR 10/30

Теред нанесением образца колонку с DEAE-Sepharose уравновешивали 20 мМ гидиновым буфером (рН 5.5), содержащим 1 мМ ДТТ, 40 мМ таурина, 40 мг/л СФ. После нанесения образца колонку промывали 50 мл этого же буфера, а ;м подключали градиент концентрации NaCl (0 - 0.4 М). СВНЗ сходила с онки при концентрации хлорида натрия 0.225 М. Сошедшие с колонки иные фракции обессаливали и концентрировали до 10 мл. Далее полученный азец наносили на колонку, предварительно уравновешенную гистидиновым >ером вышеназванного состава. В качестве носителя на данном этапе оночной хроматографии был использован Mono Q HR 10/10. Исследуемый мент элюировали с колонки с использованием градиента концентрации NaCl

7

<0-0.35 М). Активные фракции, собранные с колонки, были подвергнуты гель фильтрации. Из данных, показанных на рис.4а,,видно, что в этом случае СВН: элюировалась с колонки Superóse в виде единичного пика, соответствующего М 80 кДа. SDS-ПААГ электрофорез этого же препарата дал одно пятне соответствующее Mr 78 кДа (рис.4б).

СБНЗ

100

W

Рис.4а. Гельфильтрация СВНЗ н колонке с суперозой. Объем элюцт соответствует Mr 80 кДа.

Рис.4б. SDS-ПААГ электрофорез этог< же препарата (СВНЗ). Полоса белк, соответствует Mr 78 кДа.

Mr

küa СВНЗ 97 —

45

25 —

Объем элюции (мл)

ntmziéi

Рис.4а

Рис.46

Величина pl ферментов. Было обнаружено, что чзоэлектрические точки 2-компонентов EG7 являются очень близкими 4.35 и 4.30. Подобные результат! были получены для другой эндоглюканазы из C.thermocellum [Головченко др. ,1991]. Для EG5 и СВНЗ определили, что pl равны 4.65 и 4.75 соответственно.

Субстратная специфичность. Субстратные специфичности очищенкы ферментов EG5, EG7 и СВНЗ даны в табл.4. Из результатов, представленных табл.4, можно заключить, что ферменты EG5 и EG7 являются глюканазами эндс типа, т. к. оба они слабо взаимодействовали с таким субстратом как пНФ целлобиозид. Напротив, СВНЗ проявлял активность как с КМД, так и с пНФ целлобиозидом, что указывает на его экзо-глюканазную природу. 8

аблица 4. Субстратная специфичность очищенных ферментов

Субстрат Удельная активность

EG5 EG7 СВНЗ

МЦ 29.1 125.5 16.8

ихенан 460.8 207.0 24.6

аминарин 0.001 0.002 0.003

вицел 0.03 0.06 2.1

силан 0.70 0.33 1.8

морфозная целлюлоза 0.11 0.19 1.4

НФЦ 1.10 8.72 18.7

НФЛ но но 18.0

)ильтровальная бумага - - + + + +

ловой апилок - - + +

лекролизованный еловой апилок - - + + +

логюк +

Все рассматриваемые ферменты проявляли очень низкую активность по тношению к таким субстратам как Авицел, ксилан, аморфная целлюлаза. Как идно из данных, представленных в табл.4, для любого из исследуемых ферментов ктивность с лихенаном была всегда выше, чем с КМЦ.

Исследования с использованием таких природных субстратов как шльтровальная бумага, хлопок, стружки показали, что в этом случае активность роявляла только СВНЗ, причем этот фермент был наиболее . активен с гальтровальной бумагой.

По отношению к субстрату специфичность EG7 подобна таковой для EG-C из 'Jhennocellum [Schwarz, et al., 1988], но EG7 более активна. Высокая активность с !МЦ и гиперактивность с лихенаном с одной стороны, и отсутствие активности с аминарином с другой в первую очередь может быть объяснено тем, что EG5 и :С>7 шешт телт.т'.с " ^=.t.'c5;;c5ü¿>í датт;. Целлобиазная вместе с

.'МЦ-азной активности, присущие СВНЗ могут быть объяснены на основании цинакового механизма действия, а именно освобождения целлобиозных единиц со гороны невосстанавливающих концов молекулы субстрата.

Ингибирование ферментов продуктом. Все изученные ферменты (EG7, EG5 и :ВНЗ) не ингибировались целлобиозой и глюкозой, когда концентрация эти «кторов не превышала 100 мМ. Как было обнаружено для EG5 и СВНЗ эффект тюкозы и целлобиозы становился ингибирующим только при концентрации более 00 мМ (определено с помощью вискозимигрического анализа КМЦ).

Оптимум реакционных условий. EG7 активна в очень узком интервале pH от 5 о 6 оптимумом pH 5.5. Как было показано, EG5 активна в широком интервале Н (от 5.5 до 7.5) с оптимумом pH 6.5. СВНЗ проявляла активность в интервале Н от 5 до 7.5 с оптимумом pH 7.

Фермент Ев5 оставался стабильным при всех исследованных значениях рН: от 3 до 10, стабильность фермента Ей7 начинала быстро падать при рН меньше 4.5; фермента СВНЗ - при рН больше 7.

Как было обнаружено, Ев7 наиболее активна при 55°С, при повышении же или понижении температуры наблюдалось резкое падение активности. ЕС5 была активна в широком диапазоне температур (от 55 до 75°С). СВНЗ более активна при 60°С. Активность СВНЗ резко падает при температуре выше 60°С.

Из трех ферментов ЕС5 является наиболее стабильной при повышенных температурах. При 70°С ферменты СВНЗ и Е07 полностью теряли активность за 1.5 и 2.5 часа соответственно, в то время как для полной инактивации фермента Ев5 требовалось 16 часов.

При 60°С ферменты СВНЗ и ЕС7 теряли до 30% активности за 6 часов, тогда как фермент Ев5 при этой же температуре сохранял практически 100% активности в течение нескольких дней. Термостабильность Е05 может быть сравнена с термостабильностью гидрофобного белка Е01 из СлкеппосеИит [Головченко и др., 1991]. Можно предположить, что гидрофобность белка не влияет на его термическую стабильность, по крайней мере в случае, когда целлюлазы не связаны с кристаллическим субстратом.

Измерение целлюлаза-целлюлозного взаимодействия. Целлюлаза-целлюлозное взаимодействие представляет собой первую ступень гидролиза кристаллической целлюлозы и характеризуется коэффициентом разделения (Кр), Кр ферментов Е07, Е05, Е01, СВНЗ и ВЬ35 в 50 мМ цитратном буфере (рН 6.5) и при использовании микрокристаллической целлюлозы (Ауюе1) в качестве субстрата даны в табл.5.

Таблица 5. Коеффициент разделения (Кр) целлюлаз

Фермент Кр Природа белка

EG7 0.128 гидрофобная

EG5 0.025 гидрофильная

СВНЗ 0.056 гидрофильная

EG1 0.101 гидрофобная

BL35 0.058 гидрофобная

Высокая степень адсорбции EG7 может быть связана с гидрофобностью этого белка и с возможным участием его целлюлозосвязывающего домена. Однако EG1 и его делеционный вариант BL35 (см. в разделе "Делеционный анализ гена cell") не содержат целлюлосвязывающего домена и в этом случае гидрофобное взаимодействие остается единственной причиной их целлюлазной адсорбции [Golovcheko et al., 1992Ь]. Кроме того, было обнаружено, что уровень целлюлазной адсорбции делеционного варианта BL35 снижается по сравнению с EG1, но не может быть полностью уменьшен до нуля, поскольку BL35 все гаки остается гидрофобным белком. Однако, в случае фермента СВНЗ его адсорбция на Авицел не может быть объяснена на основании гидрофобное™ (так как этот белок является' гидрофильным), а вот участие целлюлозосвязывающего домена в этом 10

учае не исключено. У ЕС5 коэффициент сорбции очень низкий, т.к. этот белок ляется гидрофильным, и кроме того, он,' по-видимому, не содержит ллюлозосвязывающего домена. Отметим, что образование агрегатов ЕС5, суждаемое ранее, не влияло на степень адсорбции этого фермента.

Эффект металлов и реагентов. Было показано, что все тяжелые металлы азывали отрицательный эффект на активность изучаемых ферментов (табл.6), к видно из данных, представленных в этой табл., денатурирующие агенты, пример ББЗ, также отрицательно влияли на все три фермента. Органические :творители (этанол, например) инактивировали ферменты в следующем порядке !НЗ»Е07»Е05. То, что органические растворители оказывали наименьший фект именно на ЕС5 можно обьяснить тем, что поверхность этого белка езвычайно гидрофилизирована [КИшеШ^ку й а1., 1991]. А из литературных иных известно, что отрицательный эффект детергентов и органических :творителей сводится именно к нарушению гидрагной оболочки белков, что, в 5Ю очередь, приводит к изменениям их третичной структуры.

блица 6. Действие металлов и реагентов на КМЦазную активность (в %)

>бавки Концентрация EG7 EG5 СВНЗ

г - 100 100 100

С12 10 шМ 77 89 94

С1з 10 шМ 20 31 57

so4 10 шМ 78 59 74

1C12 10 тМ 59 34 30

so4 10 тМ 117 77 135

;ci2 0.1 шМ 13 0 18

т 1 тМ 114 96 100

т 2 шМ 105 99 102

>s 2 шМ 82 8 17

'S 10 тМ 14 3 0

тлел ;с у0 (об/об) 52 77 47

анол 20 % (об/об) 45 75 17

Иммунологический тест. Нами было показано, что поликлональные антитела, тученные против EG1, в тесте Оухтерлони реагируют с EG7 , что щетельствует о наличие некоторых общих антигенных детерминаитных участков EG1 и EG7. Однако эти ферменты сильно отличаются по своим размеру и ,'гим физико-химическим и биохимическим свойствам. Аналогичные результаты ли получены для целлюлаз из Trichoderma reesei [Sirpa and Paloheimo, 1990]. Надо отметать, что рестрикционная карта гена се17, кодирующего белок EG7, не )екрывается с таковой для гена cell, кодирующего EG1. Кроме того, ДНК-ДНК ¡ридизация, также показала, что эти два гена являются различными. Поликлональные антитела против EG1 не давали кросс-реакции ни с EG5, ни с НЗ.

ДНК-ДНК гибридизация. Гибридизация ДНК генов се17, се15 и cbh3 i библиотеками се1-генов из Института Пастера и IAPGR Кэмбриджа, и также i геном cell, показала, что данные гены являются уникальными.

Изучение синергизма. Был изучен синергизм между целлобиогидролазо] (СВНЗ) и двумя эндоглюконазами (EG1 и EG5) Cthertnocellum, изолированным! из рекомбинантиых штаммов E.coli.

Из трех, выбранных для изучения синергизма ферментов, EG1 по своей природ! является гидрофобным белком (Golovchenko et al., 1992) и поэтому она могла бь способствовать взаимодействию субстрата и фермента. Выбор EG5 был также hi случайным, поскольку этот белок образует агрегаты; могло оказаться, чт( формирование агрегатов вовлечет и два других фермента.

Таблица 7. Синергизм на растворимый субстрат (КМЦ)

Добавки EG1 EG5 СВНЗ

(А) (В) (С) (А + В) (А + С) <В + С) (А + В + С)

1. нет 0.41 0.42 0.34 0.69 0.71 1.06 1.67

2. 10 шМ СаС1г 0.36 0.35 0.30 0.61 0.70 1.05 1.43

3. 2 mM ДТТ 0.49 0.40 0.32 0.69 0.71 1.05 1.54

4. (2 + 3) 0.37 0.39 0.31 0.66 0.71 1.08 1.57

Поскольку все 3 фермента при изучении оказались активными с КМЦ, то в ход| исследования явления синергизма прежде всего был использован этот субстра' (табл.7). Было обнаружено, что при совместном добавлении двух эндоглюкона: (EG1 и EG5), уровень гидролиза субстрата снижался до 83% проти! предполагаемых 100% в случае отсутствия всякого синергизма. Уровень гидролиз: не изменялся при добавлении ионов Са2 + и ДТТ (как отдельно, так и вместе) Это могло происходить вследствие конкуренции ферментов за субстрат и схожест) механизма их действия на растворимый субстрат. Природа же эндоглюкана; (гидрофобность, гидрофильность), по-видимому, не влияет на механизм гидролиз; этими ферментами растворимых субстратов. Когда СВНЗ добавляли к EG1 и EG5 присутствующим в реакционной смеси отдельно или вместе, синергизма № наблюдалось в случае комбинаций СВНЗ + EG1, но он имел место при сочеташн СВНЗ + EG5 и СВНЗ + EG1 + EG5. Это можно обьяснить тем фактом, что СВНЗ ¡ качестве субстрата использовал продукт реакции, катализируемой EG5, либо тем что вследствие образования агрегата менялся механизм действия фермента.

Таблица 8. Синергизм на кресталической субстрат (фильтровальная бумага)

Добавки EG1 EG5 СВНЗ

(А) (В) (С) (А + В) (А+С) (В + С) (А + В + С)

1. нет 0.2 0.5 4.8 0.7 5.7 8.4 9.9

2. 10 mM CaC¡2 0.2 0.5 4.6 0.7 5.5 7.9 9.5

3. 2 mM ДТТ 0.2 0.5 5.2 0.9 6.2 8.8 10.8

4. (2 + 3) 0.2 0.6 5.1 0.8 6.4 9.2 13.1

Ассоциация целлюлазной активности с белковым агрегатом не уникальна для ктерий Cthermocellum [Wu et al., 1988], это явление имеет место и у других :ллюлолитических анаэробов [Ljungdahl and Erikson, 1985]. Как видно из иных, представленных из табл.7, если КМЦ использовалась в качестве субстрата, |ны Са2 + и ДТТ не оказывали влияния на синергизм.

Когда EG1 и EG5 совместно или отдельно добавлялись к фильтровальной маге, активность была скорее незначительной, также никакого синергизма не |блюдалось в присутствии ионов Са2 + и ДТТ (табл.8). Когда к фильтровальной 'маге вместе с EG1 и EG5 добавляли СВНЗ, наличие целлобиозных единиц >зрастало до 180% против предполагаемых в случае отсутствия явления [нергизма 100%. Когда же к реакционной смеси, содержащей все три фермента, >бавляли и ионы Са2 + и ДТТ, уровень продуктов достигал 222%, однако в [учае внесения или только Са2+ или только ДТТ никакого изменения не 1блюдалось. Повышенная кооперативность между ферментами при добавлении >нов Са2 + и ДТТ была аналогична той, которая наблюдалась между EG |ктерий C.thermocellum и СВН Trichoderma koningii [Gow and Wood, 1988]. Кроме >го, роль ионов Са2 + и ДТТ может состоять в защите фермента от рмоинактивации, как, например, было обнаружено для S8-tr компонента ¡ллюлосом C.thennocettum [Moragetal., 1991].

Дслеционный анализ гена cell. Нами был сконстроруирован ряд делеционных фьюжированных вариантов гена cell (рис.5).

Из данных, представленных на рис.5, следует, что С-концевые делеции в ндоглюканяче(1) размером примерно до 50 аминокислотных остатков /щественного влияния на ее активность не оказывают. Лишь в вариантах с глециями около 100 аминокислотных остатков КМЦ-азная активность не пределялась, однако они оставались способными гидролизовать флюорогенный гбстрат метилумбеллиферил-целлобиозид, что, вероятно, связано с высокой увствительностыо второго способа измерения гидролазной активности. В миниклетках E.coli с плазмидами pUCE102 были обнаружены 2 типа пептидов молекулярной массой 52 и 42 кДа соответственно (рис.6). Ранее было показано, го белок с Mr 52 кДа представляет собой предшественник белка с Mr 42 кДа, оторый экскретируется в периплазматическое пространство клеток E.coli [Аминов др., 1990]. Миниклетки с плазмидами pKNE102, содержащими (Ъьюжиролпнный 1 -lacZ* ген, образовывали два белка с Mr 58 и 42 кДа. Различия в молекулярной ассе двух предшественников (52 и 58 кДа) в 2-х рассматриваемых опытах с иниклетками соответствуют прибавке молекулярной массы оС-пептида fi-ыактозидазы вектора. В то же время, белки, подвергшиеся процессингу, не тличались сколько-нибудь заметно ни по молекулярной массе, ни по другим >изико-химическим и энзиматическим параметрам, определенным после их ыделения из рекомбинантных штаммов методом, описанным ранее [Головченко и р., 1991]. Таким образом, в клетках E.coli наблюдается С-концевой осттрансляционный процессинг эндоглюканазы C.thermocellum.

Чтобы выяснить, идет ли N-концевой процессинг и для определения более очной локализации сайта С-хонцевого протеолиза, изучались другие делеционные фьюжированные производные гена cell. Плазмида pBL35, с делецией гена в 100 уклеотидов со стороны З'-конца, была способна синтезировать активный белок азмером 42 кДа, т.е. С-концевой сайт протеолиза при этом либо не затрагивался, ибо располагался в непосредственной близости от сайта делеции. В этом случае в

13

JDCS

BI— «El

-1-1-1-

Hill sm Hill

[DCS HIIX»Xb

eel X-gal »iUC

PKNE102

P. P J-ie _

Hill Sm Hill

mcs Hill-»PI

-1-Г

EI EX

acZ'

mcs Xb--»EI

oel X-eal WUC

pkne102bi

Hill Sm Hill

mcs

hiij--.fi

—I-r

EI EI

mcs

cel X-gal liUC

Hill Sm Hill

mcs H1II~»JI

if

mcs Xb—»EI

cel X-S'l VUC

pBL311

P, P JLat ■=

I -r

(Hill Sm Hill

mcs HIII~»fI

mcs Xb-»EI

cel X-sal BUC

•pKHE10a/12

P, * 1 g -1-

IIIII So Hill

mcs I1I1X--*PI

cel X-eal BJC

pKNSlог/в

Ii*«

1 I 1—I— IHIII Sm Hill

mcs Hill—»PI

iocs Xb-*EI

cel X-eal KUC

Рис.5. Плазмидные конструкции, содержащие делетированные и фьюжированные варианты гена cell. Стрелками обозначены последовательности лактозного (Plac) и целлюлазного (Pcel) промоторов. MCS - сайты рестрикции в полилинкере векторов клонирования. НШ - Hindlü, Р - Pstl, Xb - Xbal, BI - BamHI, Sm - Smal, EI - EcoRI. Утолщенной линией обозначены последовательности ДНК векторов клонирования. Стрелками на концах последовательностей обозначены трансляционные фьюжанты cell-lacZ'.

-шиклетках белок-предшественник не определялся.

В вариантах рКНЕ102/12 (Л-се1) и рККЕ102/8 ( Д-се1-1ас £') синтезируются )липептиды с Мг 36 и 42 кДа соответственно. В 'обоих случаях З'-концевая :леция была приблизительно того же размера (300 нуклеотидов). Однако, во ыожированных вариантах, размер белка был на 6 кДа больше, что как раз ответствует размеру /5-галактозидазы вектора. Это также подтверждает, что в ом случае удаляется С-концевой участок белка.

Mr kDa

97 ■ 67 •

43, ■

23.9« 20.1'

i г э 4 !

<гг!>

ис.6. Электрофоретический анализ полипептидов, синтезирующихся в миниклетках Ecoli на матрицах рекомбинантных плазмид. 1 - pUC18, 2 -pUCE102, 3 - pBL35; 4 - pBL311; 5 - pKNE102; 6 - pKNE102/12; 7 -pKNE102/8; 8 - pKNl.

Следует отметить, что, исходя из размеров делеции в 300 нуклеотидов, в ¡риантах pKNE102/12 и рКЕ102/8 можно было ожидать биосинтез глетированных предшественников с Mr 42 и 48 кДа соответственно. Однако, зличие только пептидов с Mr 36 и 42 кДа, подтверждает, что вместе с С-знцевым протеолизом (обсуждалось выше), имеет место и N-концевой протеолиз, валяющий фрагмент в 6 кДа. Так как мы знаем, что зрелый белок и его редшественник, кодируемые интактным геном cell (вариант pUCE102), гличаются по своим молекулярным массам на 10 кДа, то это означает, что с С-энца удаляет полипептид, размер которого равен 4 кДа.

На основании этого можно сказать, что процессинг Е01 СлНегтосеНит : клетках Е.соИ включает в себя удаление И-концевого полипептида размером 6 кД; и С-терминального полипептида размером 4 кДа. Иллюстрация этого процесса дл; всех изученных плазмидных конструкций дана на рис.7.

предшественник

б кДа 4 кДа (52 кДа)

42 кДа

__зрелый белок

36 кДа

сС-пептид

6 кДа

делегированный вариант PKNE102/12

фьюжированный вариант PKNE102/8 (42 кДа)

с(- пептид рККЕ102

_^_,1 |,,..„, 58 кДа(фьюжант-

6 кДа 4 кДа 6 кДа предшественник)

Рис.7. Модель посттрансляционного процессинга эндоглюканазы (1) в клеткам ЕсоИ. Стрелками указаны сайты протеолиза. Утолщенной линией обозначены аминокислотные последовательности ос-пептида дгалактозидазы в трансляционных фьюжантах се11-1ас£'.

Нами было обнаружено, что ни С-терминальное фьюжирование «с-пептида галактозидазы, ни его делеция не оказывали никакого влияния на локализацию фермента. Во всех случаях Ев1 всегда экскрегировалась в периплазматическое пространство Е.соИ. На основании этого можно заключить, что С-концевой протеолиз Е01 не связан с процессом ее секреции.

Выводы

1. Три фермента EG5, EG7 и СВНЗ C.thermocellum, выделенные и очищенные из Е.соИ, обладают физико-химическими и энзиматическими свойствами, отличными от таковых для других целлюлаз C.thennocellum, изученных в других лабораториях.

2. EG7 подобно EG1 по своей природе является гидрофобным белком и имеет некоторые общие с EG1 антигенные детерминантные участки, но по другим физико-химическим свойствам EG7 отличается от EG1.

3. EG5 образует агрегаты из трех пептидов, которые в присутствие SDS диссоциируют на отдельные компоненты. Возможно, что способность образовывать такие агрегаты защищает фермент при экстремальных условиях pH и температуры.

4. СВНЗ, в противоположность стандартному определению понятия целлобиогидролазы, активна с природными кристаллическими субстратами.

5. Нами было обнаружено, что между ферментами СВНЗ, EG1 и EG5 Cthennocellum существует синергизм. Кооперативность действия была наиболее 16

гтна при воздействии этих ферментов на природный кристаллический субстрат и наличие ионов Са2 + и ДТТ. Впервые установлен синергизм, действия эглюконаз и СВНЗ C.thermocellum, очищенных из рекомбинантных штаммов П.

. При гетерологической экспресии гена cell Cthermocellum в клетках Ecoli для ода белка в периплазму, наряду с N-терминальным процессингом белка-щественника, идет также его С-терминальный протеолиз. Поэтому, как ¡алось, число энзиматических форм целлюлаз в клетках чужих хозяев повышено. . С-концевая делеция не оказывает влияния на транспорт целлюлаз в ^ К coll.

. Делеция гидрофобных доменов приводит к снижению адсорбции фермента на :таллическом субстрате.

. Свойства эндоглюканаз (гидрофобность, гидрофяльность) не оказывает влияния ¡еханиз действия этих ферментов на растворимые субстраты.

овное содержание диссертации изложено в следующих публикациях: . Singh,R.N., Varma, А.К.(1988) Diverse nature of glycosidic activity of Penicillium zulosum/J Abstract, "International conference on Research in Plant Sciences and its ranee to future", Delhi, India, P.46.

, Singh, R.N. (1988) Glycosidic activity in Penicillium funiculosum// Absftacx, "Trends iological Research in J.N.U.", New Delli, India, P.8.

. Singh,R.N., Aminov.R.I., Golovchenco, N.P., Kataeva, I.A., Boronin, A.M., nenko, V.K. (1990). Heterologous expression of a Clostridium thermocellum tglucanase gene.// Abstract, 6th International Symposium of Genetics Industrial •oorganism, Strasbourg, France, c-23.

Б.Н.92г. Зак.51В5Р Тир.125 экз. Уч.-изд.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН