Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение некоторых сторон механизма ростостимулирующей активности кормовой добавки медиаторного действия - сальгима

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение некоторых сторон механизма ростостимулирующей активности кормовой добавки медиаторного действия - сальгима"



На правах рукописи

ЗЮЗИН Сергей Александрович

ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СТОРОН МЕХАНИЗМА РОСТОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ МЕДИАТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ - САЛЬГИМА

03.00.13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Ярославль 2005

Работа выполнена на кафедре общей зоотехнии ФГОУ ВПО «Ярославская государственная сельскохозяйственная академия»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор С.И Сальникова.

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.К. Бобылев.

доктор биологических наук, ст. науч. сотр., зам. директора ВНИИЖ Фомичёв Юрий Павлович

кандидат биологических наук, доцент Лебедев Игорь Алексеевич

Ведущая организация:

Костромская государственная сельскохозяйственная академия

Защита состоится октября 2005 г. в /5 часов на заседании диссертационного совета Д.212.307.02 в Ярославском государственном педагогическом университете имени К.Д. Ушинского (150000, г. Ярославль, ул. Республиканская, д. 108).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ярославского государственного педагогического университета им К.Д. Ушинского.

Автореферат разослан "23 " Ú3f&~J?¿>!¿¡# 2005

года.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

И.А. Тихомирова

4W20

3

J ~7 ? JT О /

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность и практическая значимость работы. В сельском хозяйстве для стимуляции мясного животноводства широко используются разнообразные кормовые добавки (Мозгов И.Е., 1964; Евдокимов П.Д., Артемьев В.И., 1967), различные по эффективности, механизмам действия и экономической значимости.

За последние 15-20 лет широкое распространение за рубежом получили высокоактивные препараты периферического симпатомиметического механизма действия: анилинового типа (кленбутерол, циматерол, цимбутерол и др.), фенольного типа (сальбутамол, тербуталин) (Bahers N., Sommer M., Quirke J.F., 1988; Eng К., 1990; Gamsen G J., Hoving-Bolink A.H., Verplanke J.C., 1992). Эти препараты, возбуждая рецепторы рибосомальных мембран, повышают синтез белка, тормозят его катаболизм, усиливая тем самым аккрецию белка в организме животных; ускоряют липолиз и мобилизацию жира из жировых депо, позволяя получать мясо с низким содержанием жира; улучшают конверсию кормов; не куммулируют в органах и мышечной ткани; проявляют быстрый (2-3 месяца откорма) и существенный ростостимули-рующий эффект в низких дозах (мкг/кг живой массы), не обладают видовой чувствительностью. И хотя за последние 2 года в отечественной литературе встречаются публикации о токсичности для человека мяса, полученного с использованием р2-агонистов, которые относятся, главным образом, к применяемым в высоких дозах р2-агонистам, производным анилина (кленбутерол, циматерол, бромбутерол) (Комаров A.A., 2002), интерес к этой группе БАВ не ослабевает. Поэтому изучение механизма ростостимулирующего действия у животных веществ Рг-рецепторной активности представляет практический интерес. Работа выполнена в рамках программы НИР Ярославской государственной сельскохозяйственной академии по поиску и изучению новых БАВ.

Цель: изучение механизма ростостимулирующей кормовой добавки из группы фенольных р2-агонистов - сальбутамола гемисукцината, — условно названного сальгимом. (Препарат представлен ОАО ВНЦ БАВ (п. Ст. Купавна, Моск. обл.) и не имеет аналогов зал; '

Задачи:

1. изучить белково-анаболическую активность сальгима in vitro (на культуре ткани);

2. проследить возможное антиоксидантное влияние сальгима на модели индуцированного алкоголем перекисного окисления липидов in vitro;

3. изучить некоторые механизмы установленной антиоксидантной и протекторной активности сальгима в опытах in vitro;

4. изучить белково-анаболическое и антиоксидантное действие сальгима в опытах in vivo Сна свиньях).

Научная новизна исследования. Впервые в опытах in vitro изучены и in vivo подтверждены некоторые стороны механизма ростостимулирующей активности производного сальбутамола гемисукцината - сальгима.

Показано, что препарат является потенциальным стимулятором роста сельскохозяйственных животных, ингибирует перекисное окисление липидов, является активным мембранопротектором.

В связи с изложенным на защиту выносятся следующие положения:

1. механизм белковоанаболической активности сальгима. Его влияние на азотистый обмен;

2. антиоксидантное и мембранопротекторное действие сальгима и его значение для реализации белковоанаболической активности;

3. подтверждение полученных данных в опытах in vivo на целостном организме при использовании сельскохозяйственных животных. Апробация результатов работы. Основные положения работы доложены на научных конференциях молодых учёных в Ярославской государственной сельскохозяйственной академии (Ярославль, 1997, 2001, 2004 г.г.), на научной конференции "Теория и практика использования биологически активных веществ в животноводстве" (Киров, 1998 г), на областной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Современные проблемы естествознания" (Ярославль, 1999 г.), на международной научной конференции "Современные проблемы животноводства" (Казань, 2000 г.), на межвузовской научно-методической конференции "Селекционные и технологические основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных" (Ярославль, 2000), на международной научно-практической конференции "Перспективы развития животноводства в северо-западном регионе"

(Калининград, 2002 г), на международной научно-методической конференции профессорско-преподавательского состава (Ярославль, 2004 г).

Публикации: Материалы диссертации отражены в 11 публикациях.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 117 страницах компьютерного текста и включает 13 таблиц, 3 рисунка, 168 источников литературы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы по изучаемому вопросу, 2 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературных источников.

Обзор литературы раскрывает перспективы использования кормовых добавок белково-анаболической активности в целом и (32-агонистов для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных. В сравнительном плане описаны положительные и отрицательные стороны влияния ростостимулирующих веществ при использовании их в мясном животноводстве. Дана подробная характеристика медиаторных симпатотропных веществ в сравнении с широко известными кормовыми добавками.

Вторая глава посвящена краткому описанию объекта и методов исследования, использованных при проведении экспериментов Они представлены физиологическими, биохимическими методами и методами математической статистики. Всего в работе применено 20 методов исследования.

В третьей главе приведены результаты опытов in vitro на культуре пер-вичнотрипсинизированных клеток куриного эмбриона 10-дневного возраста. Поставлено более 100 опытов. Описаны результаты изучения влияния саль-гима на основные механизмы белкового синтеза и катаболизма белков.

Приведены данные исследования антиоксидантной активности сальги-ма при спонтанном, ферментативном и аскорбатиндуцированном перекисном окислении липидов (ПОЛ), а также алкогольной индукции ПОЛ.

Четвертая глава включает научно-хозяйственный опыт по изучению белково-анаболического действия сальгима в опытах in vivo (на хрячках крупной белой породы). Проведён анализ зоотехнических, биохимических показателей влияния сальгима на азотистый обмен животных в динамике 2-месячного скармливания с кормом. Приведены показатели контрольного убоя животных и химического анализа мяса Определена окупаемость корма продукцией.

В «Обсуждении результатов» проведён анализ полученных данных в сравнительном плане опытов in vivo и in vitro.

Сделаны выводы.

ОРГАНИЗАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе представлены результаты изучения механизма ростостимули-рующей активности сальбутамола гемисукцината (сальгима).

Приготовление первичной культуры клеток из тканей эмбриона курицы проводили по стандартной методике (Соловьёв В.Д., Бактемиров Т.А., 1963).

Малоновый диальдегид определяли с помощью тиобарбитуровой кислоты (Колб В.Г., Камышников B.C., 1976).

Изучение ферментативного и неферментативного ПОЛ. Интенсивность НАДФЬГ - зависимого ПОЛ определяли в среде состава: 100 мл трис-НС1 буфера (рН=7,4), 1мМ НАДФН, 4мМ АДФ и 14 мкМ соли Мора (Ю.А. Владимиров., А.И. Арчаков, 1972). При неферментативном (аскорбатиндуци-рованном) ПОЛ среда содержала 1 ООмМ трис-HCl буфера, 0,5мМ аскорбата, 12мкМ сернистого железа. При расчётах использован молярный коэффициент экстинции ТБК-окрашенного продукта: 1,56-105М"'см''.

Восстановленный глютатион определяли, используя реактив Эллма-на. Оптическую плотность раствора определяли спектрофотометрически при 412 нм (Суворов Н.Н., Шашков B.C., 1985).

Расчёт проводили по калибровочному графику, построенному по растворам различной концентрации восстановленного глютатиона (от 0,3 ммоль/л до 1,5 ммоль/л).

Определение содержания цитохрома Р-450 проводили по стандартной методике. По разнице экстинкций, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 91-103 см"'М"'. рассчитывали содержание цитохрома Р-450 (Копылова Т.Н., 1984).

Определение содержания гидроперекисей. Для определения количества гидроперекисей в мембранах клеток 100 мкл суспензии клеток, 100 мкл бутилированного гидрокситолуола, 200 мкл ДДС (8,1%), 1500 мкл ТБК

(0,8%) и 600 мкл воды инкубировали 60 мин при 95°С. Затем пробирки охлаждали, добавляли 600 мкл воды и 4000 мкл бутанола, центрифугировали при 2000 об/мин. Бутанольную фракцию спектрофотометрировали при 532 нм против контроля, в который вместо суспензии клеток добавляли равное количество среды хранения (питательной среды). При расчёте использовали молярный коэффициент экстинкции ТБК-окрашенного продукта 1,56-105 М" 'см"1 (OnKawa М., Ohshi N., 1979).

Определение общего белка по Лоури. Метод Лоури сочетает в себе биуретовуго реакцию (на пептидные связи) и реакцию Фолина (на тирозин и цистин белковой молекулы). Последняя состоит в восстановлении смеси фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот (реактив Фолина) с образованием комплексного соединения синего цвета.

Содержание белка рассчитывали по калибровочному графику, для построения которого использовали стандартный раствор сывороточного альбумина (Колб В.Г., Камышников B.C., 1976).

Определение свободного аминного азота в питательной среде. Содержание азота определяли колориметрически (по интенсивности окрашивания с нингидриновым реактивом). Оптическую плотность замеряли на ФЭКе, при зелёном светофильтре (длина волны 536 нм). Расчёт производили по калибровочной кривой, построенной по азоту аланина (Колб В.Г., Камышников B.C., 1976).

Определение остаточного азота проводили по методу Раппопорта-Эйхгорна (Колб В.Г., Камышников B.C., 1976).

Определение скорости включения 14С-гидролизата белка хлореллы в клетки in vitro. При посеве культуры ткани в опытные и контрольные пробирки добавляли по 0,1 мл глицина-2См удельной радиоактивностью 492100 имп/мин. В опытные пробирки ДЪбавили 0,3 мл стерильного раствора саль-гима (из расчёта 100 мкг/л). После двух суток инкубации из пробирок удаляли питательную среду и подсчитывали радиоактивность монослоя культуры клеток на жидкостном сцинтилляционном счёгчике «Mark - 2».

Определение Са, К, Na методом пламенной фотометрии. Определение проводили на пламенном фотометре по стандартной методике.

Метод научно-хозяйственного опыта. Научно-хозяйственный опыт проведён на базе сельскохозяйственного производственного кооператива «Курба» Ярославского района на хрячках полусибсах крупной белой породы.

Кровь на анализ брали из хвостовой вены в конце первого месяца опыта и перед убоем. В пробах крови анализировали показатели, отражающие режим азотистого обмена в организме: азот мочевины по С.Г. Гасанову после реакции с раствором гипохлорида натрия, остаточно - азотистую фракцию по В.Н. Узбековой с нингидриновым реактивом, общий белок в крови и в мясе длиннейшей мышцы спины по Лоури после обработки реактивом Фо-лина. Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием t-распределения Стьюдента

Определение мочевины крови уреазным методом по реакции с реактивом Несслера. Принцип метода основан на разложении мочевины крови или сыворотки ферментом уреазой с последующим определением колориметрическим способом (с использованием реактива Несслера) образующегося в результате реакции аммиака. Содержимое перемешивали и колори-метрировали на ФЭКе при синем светофильтре.

Зоотехнические методы изучения ростостимулирующей активности сальгима. Весовые показатели. Взвешивание животных проводили в полдень до кормления с точностью до 0,1 кг. Определяли абсолютный и относительный прирост.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты опытов in vitro по изучению белковоанаболической активности сальгима показали (табл. 1), что скорость включения радионуклида |4С-гидролизата белка хлореллы в культуру ткани под действием сальгима превышала таковую в контроле на 46,3%. Содержание азота свободных аминокислот в питательной среде в опытной партии проб снижалось по сравнению с контрольной партией на 18,3%, что привело к увеличению образования белка в опытных пробах на 9,7% больше контрольного. Содержание остаточного азота в опытных пробах составило 72%, т.е. на 28% ниже, чем в контрольных пробах, что свидетельствует о выраженном антикатаболическом влиянии сальгима.

Полученные на клеточном уровне данные позволяют заключить, что сальгим обладает белково-анаболической активностью, одновременно проявляет существенный антикатаболический эффект, что в итоге повышает ретенцию азота в ткани и синтез белка.

Таблица 1

Влияние сальгима на азотистый обмен in vitro на культуре ткани куриного

эмбриона

Показатели Контроль Опыт % к контролю

Скорость включения радионуклида 14С-гидролизата белка хлореллы, имп/мин 9632 ± 286 14094±507** 146,3

Общий белок, мг% 0,82 ± 0,03 0,89 ± 0,04 109,7

Азот САК в питат.среде, мг% 4,49 ±0,19 3,67 ±0,10** ! 81,74

Остаточный азот, мг% 78,1 ±7,4 56,2 ± 6,4* 71,96

** Р < 0,01; * Р<0,05

Продолжением исследований на культуре ткани явилось изучение предполагаемой протекторной активности сальгима.

Модель индукции перекисного окисления липидов и усиления его разрушающего действия на цитоплазматические мембраны вызывали введением в питательную среду культуры клеток 15%-го этилового алкоголя в количестве 0,3 мл. Алкоголь вводили в момент посадки культуры. Опыт проводили по схеме (табл. 2).

Таблица 2

Схема опыта по изучению антиоксидантной активности сальгима т

vitro на культуре ткани куриного эмбриона

Группа опытов Количество проб Характеристика проб

Интактная 60 Питательная среда + культура клеток

Контрольная 60 Питательная среда + культура клеток + алкоголь 15% 0,3 мл

Опытная 70 Питательная среда + культура клеток + алкоголь 15% 0,3 мл + саль-гим 100 мкг/л

Показателем, характеризующим интенсивность процессов пероксида-ции липидов, выбран малоновый диальдегид (МДА), содержание которого

определяли в культуре ткани; о цитолизе мембран судили по активности ала-нин- и аспартат - аминотрансфераз (табл.3).

Таблица 3

Влияние сальгима на индуцированное перекисное окисление липидов и

цитолиз

№ Иссле- Анализируемая проба

дуемый интактная опытная контрольная

показа- абс. в% абс. в%к абс. в % к ин-

тель конт. такту

1 МДА, ммоль/л 2,92±0,11 100 3,31± 0,15*** 80,5 4,11± 0,09*** 140,8

2 АлАТ, ммоль/г/ мк 1,75+0,02) 100 2,05± 0,039*** 68,1 3,01± 0,025*** 172,0

3 АсАТ, ммоль/г/ мк 0,99±0,001 100 1,73± 0,09*** 86,5 2,00± 0,062*** 202,0

*** -Р<0,001.

Результаты эксперимента, представленные в таблице 3, имеют высокий (*** . р< 0,001) уровень достоверности и свидетельствуют о том, что сальгим активно ингибировал индуцированное алкоголем ПОЛ, предотвращая его разрушающее действие на клеточные мембраны: содержание МДА снижалось в 1,2 раза, активность АлАТ - в 1,5 раза, АсАТ - в 1,15 раза.

Для достоверного решения вопроса о характере антиоксидантного действия сальгима проведено измерение скорости накопления малонового ди-альдегида in vivo при введении сальгима 30 интактным белым беспородным мышам массой 25-30г. Сальгим вводили в дозе 350 мкг/кг в течение 5 дней через день. Содержание МДА при спонтанном (естественном) ПОЛ в гомо-генатах печени опытных животных определяли на следующий день после очередного введения и сравнивали с контрольными (30 гол), которым вводили дистиллированную воду (рис. 1).

3 25 2

<

f 1.5 1

05 О

2 4 6 8 10

время (сутки) убоя животных

Рис.1. Динамика накопления МДА при спонтанном ПОЛ при введении сальгима in vitro

Из рисунка следует, что сальгим не влияет на спонтанный уровень пе-роксидации липидов здоровых животных, поскольку содержание МДА в опыте не отличается от контрольного. Данный факт, на наш взгляд, повышает значимость сальгима как фактора антиоксидантной защиты.

Выяснение механизма антиоксидантной защиты проведено также в опытах на культуре клеток куриного эмбриона. Отдельно изучено влияние сальгима на неферментативное (аскорбатиндуцированное) индуцирование ПОЛ и ферментативное (НАДФ-РГ-индуцированное) Результаты приведены в таблицах 4, 5.

Из таблиц следует, что возбуждение перекисного окисления липидов в культуре клеток аскорбатом в сочетании с Fe++ и НАДФЬГ вызывало существенное напряжение факторов естественной антиоксидантной защиты: восстановленного глютатиона (катализирующего превращение гидроперекисей свободнорадикальных реакций) и цитохрома Р-450 (основного субстрата метаболизма химических веществ).

Следствием этого явилось существенное увеличение содержания первичных и конечных продуктов пероксидации. Причём при ферментативной индукции усиление пероксидации было значительно активнее. При введении сальгима в питательную среду в концентрации 350 мкг/л нормализуется уровень гидроперекисей; содержание МДА снижается в 1,3 раза, также соответствуя исходному. Антиоксидантная активность сальгима проявляется через

- контроль

- сальгим

Таблица 4

Антиоксидантная активность сальгима при неферментативной индукции ПОЛ в культуре клеток

АСКОРБАТИНДУЦИРОВАННОЕ ПОЛ

Анализируемая проба Содержание МДА Содержание восстановленного глютатио-на Содержание цитохрома Р-450 Содержание гидроперекисей

Ммоль/л %% к ИНТ. Ммоль/л %% к инт. Нмоль/мг/белка %% к инт. Нмоль/мг/белка %% к инт.

Интакт (культура клеток + питательная среда) 1,79±0,053 100 0,72±0,061 100 98,7± 11,0 100 0,32±0,011 100

Контроль (культура клеток + питательная среда + аскорбат + РеБО,,) 2,40 ± 0,072*** 134,1 0,50 ± 0,011*** 69,4 49,3 ± 5,70*** 49,9 0,48 ± 0,032*** 150,0

Опыт (культура клеток + питательная среда + аскорбат + РеБО.) + саль-гим 350 мкг/л) 1,80 ± 0,02*** 100,6 0,62±0,09 86,1 63,5+9,70 64,3 0,38 ± 0,017** 118,8

** -Р<0,01; *** - РОДНИ.

Таблица 5

Антиоксидантная активность сальгима при ферментативной индукции ПОЛ в культуре клеток

НАДФ-Н* индуцированное ПОЛ

Анализируемая проба Содержание МДА Содержание восстановленного глютатио-на Содержание цитохрома Р-450 Содержание гидроперекисей

Ммоль/л %% к ИНТ. Ммоль/л %% к ИНТ. Нмоль/г белка %% к ИНТ. Нмоль/мг белка %% к ИНТ.

Интакт (культура клеток + питательная среда) 5,21 ±0,072 » 100 0,69±0,066 100 85,2±15,30 100 0,35±0,071 100

Контроль (культура клеток + питательная среда + НАДФН") 9,73 ± 0,10*** 186,8 0,35 ± 0,09** 50,7 41,0 ± 8,11* 48,1 0,59 ± 0,029** 168,6

Опыт (культура клеток + питательная среда + НАДФНГ + сальгим 350 мкг/л) 9,29 ± 0,05*** 178,3 0,32±0,06 46,4 42,11±5,99 49,4 0,57±0,081 162,9

* - Р<0,05; ** - Р<0,01; *** - Р<0,001.

повышение содержания цитохрома Р-450 и восстановленного глютатиона, т.е. посредством активации естественных факторов антиоксидантной защиты в клетках в условиях неферментативной индукции ПОЛ

Табл 5 иллюстрирует антиоксидантную активность сальгима в условиях ферментативной индукции ПОЛ. Как следует из таблицы, сальгим не влияет на уровень гидроперекисей и МДА в культуре клеток, т е. не проявляет антиоксидантную активность и не изменяет факторы естественной защиты организма животных от токсического действия продуктов ПОЛ.

Продолжением экспериментов in vitro, для подтверждения полученных результатов явились опыты in vivo на хрячках полусибсах крупной белой породы сельскохозяйственного производственного кооператива «Курба» Ярославского района.

Поросят, отобранных для опыта по принципу аналогов делили на 2 группы по Ю голов в каждой. При постановке на опыт подопытные животные имели среднюю живую массу тела 52,6±0.9 кг. Опыт проведён по схеме (табл. 6).

Таблица 6

Схема опыта по изучению белково-анаболической и ростостимулирующей

активности сальгима на сельскохозяйственных животных

Группа животных Количество голов I Характеристика кормления

Контрольная 10 Основной рацион (ОР)

Опытная 10 ОР + 350 мкг/кг живой массы с кормом

Условия кормления и содержания животных были аналогичными. Животных содержали в клетках, кормление было двухразовое из общих кормушек Рацион кормления состоял из полнорационного комбикорма, составленного в соответствии с нормами ВИЖ (Калашников А.П., ] 993) с учётом возраста животных, их продуктивности и химического состава компонентов. Сальгим добавляли в корм в первое кормление.

Наблюдения показали (табл. 7), что за двухмесячный период откорма сальгим стойко понижал содержание свободных аминокислот в крови опытных животных в среднем на 23% по сравнению с контрольным уровнем Ан-тикатаболическое действие проявилось уменьшением уровня остаточного

азота и основного составляющего компонента - мочевины также на 23% в сравнении с контролем.

Таблица 7

Биохимические показатели азотистого обмена сыворотки крови свиней при

скармливания сальгима

Сроки Показатели Группа животных

опыта контрольная опытная в % к

(п=10) (п=10) контролю

Общий белок, мг% 7,31+0,29 8,03±0,09 109,8*

1-й Азот мочевины, мг% 15,2±0,98 12,2±0,99 80,3*

месяц Азот свободных амино-

кислот, мг% 7,47±0,81 4,75±0,21 63,6*

Остаточный азот, мг% 32,40±1,54 26,70±0,90 82,4**

2-й Общий белок, мг% 8,55±0,37 9,49±0,44 110,99

месяц Азот мочевины, мг% 15,0±1,01 11,0±1,09 73,3**

Азот свободных амино-

кислот, мг% 13,0±0,33 11,65±0,11 89,6**

Остаточный азот, мг% 32,30±0,92 24,13±0,75 74,7***

Содержание белка в ске-

летной мышце, мг% 7,31 ±0,29 8,11 ±0,08 110,9*

* - Р<0,05; ** - Р<0,01; *** - Р<0,001.

Белково-анаболическая активность сальгима ¡n vivo проявилась достоверным увеличением содержания белка в скелетных мышцах (табл. 7). Саль-гим существенно улучшал показатели роста животных. Из табл 8 следует, что скорость роста опытных животных превосходила контрольных на 13,4% в первый месяц и на 19,2% - во*второй месяц откорма. В конце откорма живая масса животных была на 5,9 кг выше контрольных и составила 91,9 кг против 86,0 кг в контроле. За весь период откорма (60 дней) абсолютный прирост живой массы в опытной группе составил 39,1 кг против 33,6 кг в контроле, что на 16,4% выше. Высокая скорость роста животных опытной группы оказала влияние и на оплату корма продукцией: затраты корма на 1 кг прироста живой массы тела составили 3,9 кг, что на 13,3% ниже, чем в контрольной группе (4,5 кг).

Таблица 8

Зоотехнические показатели откорма, в расчёте на 1 голову

Сроки Показатели Группа животных %к

опыта контрольная опытная кон-

(п=10) (п=10) тролю

Начало Живая масса при постанов-

опыта ке, кг 52,4±0,9 52,8±0,8

1-й Живая масса, кг 68,8±0,90 71,4±1,0** 103,8

месяц Прирост живой массы, кг 16,4 18,6 113,4

(30 дн) Среднесуточный прирост, г 547,0±16,5 620,0±17,3** 113,4

опыта Потреблено комбикорма, кг 73,5 75,0 102,0

2-й Живая масса, кг 86,0±0,7 91,9±0,9** 106,9

месяц Прирост живой массы, кг 17,2 20,5 119,2

(30 дн) Среднесуточный прирост, г 573,0±17,2 683,0±17,6** 119,2

опыта Потреблено комбикорма, кг 77,0 78,0 101,3

За весь Прирост живой массы, кг 33,6±0,6 39,1+0,7* 116,4

период Среднесуточный прирост, г 560,0±16,8 652,0±17,4 116,4

откорма Потреблено комбикорма, кг 150,5 153,0 101,7

Затраты корма на 1 кг при-

роста, к.ед 4,5 3,9 86,7

* - Р<0,05; ** - Р<0,01; *** - Р<0,001.

Результаты контрольного убоя животных приведены в таблице 9.

Из табл. 9 следует, что в сравнении с контрольными животными у опытных возросла масса туши (на 9,3%); снизилось на 38,1% количество внутреннего жира; количество подкожного жира над 6-7 грудными позвонками уменьшилось на 10%. Поскольку содержание мышечной массы увеличилось на 16%, соотношение «мясо:внутренний жир» у опытных животных превысило контроль почти в 2 раза.

Химический анализ скелетной мышцы (табл. 10) показал что липоли-тическое действие сальгима не проявляется на морфологическом составе мышечных тканей. Это позволяет полагать, что мясо опытных животных по вкусовым и питательным свойствам будет соответствовать нормативным требованиям.

Таблица 9

Показатели контрольного убоя животных

Показатели Группа животных % к кон-

контрольная опытная тролю

(п=5) (п=5)

Предубойная живая масса, кг 86,5±0,5 92,1±0,7** 106,5

Сохранность животных, % 100 100 100

Масса туши, кг 56,9±0,5 62,210,6** 109,3

Убойный выход, % 65,8 67,5 102,6

Внутренний жир, кг 2,1+0,2 1,310,2** 61,9

Мясо, кг 34,1±0,7 39,510,9** 115,8

Внутренний жир, кг 9,8±0,3 8,9+0,4 90,8

Отношение мясо/ внутренний

жир 16,2 30,4 187,7

Кости, кг 10,2±0,6 11,3±0,3 110,8

Масса сердца, кг 0,45+0,09 0,40±0,03 88,9

Масса печени, кг 1,54±0,20 1,50±0,40 97,4

Масса почек, кг 0,37+0,01 0,33±0,02 89,2

** - Р<0,01

Таким образом, результаты опытов по изучению биологической активности сальбутамола гемисукцината как in vitro, так и in vivo выявили досто-

верную белково-анаболическую активность последнего.

Таблица 10

Химический состав длиннейшей мышцы спины, %

Показатели Группа животных % к контролю

контрольная (п=5) опытная (п=5)

Общая влага 71,3210,80 71,8211,02 100,7

Протеин 21,44±0,63 23,0310,58 107,4

Жир 5,90±0,57 5,8510,57 99,2

Зола 1,19+0,10 1,2010,03 100,8

Вместе с тем, препарат обладает антиоксидантным действием при условии провокации ПОЛ путём повышения активности естественных факторов зашиты. Очевидно, учитывая белково-фосфолипидную структуру клеточных

мембран, определённую роль при этом имеет белково-анаболическое действие препарата. Полученные данные опытов in vivo согласуются с данными аитературьт о возможности использования сальгима как высокоэффективной кормовой добавки для ускорения производства постного свиного мяса.

ВЫВОДЫ

1 В опытах in vitro и in vivo на сельскохозяйственных животных изучены следующие стороны механизма миотропно-анаболической активности сальбутамола гемисукцината:

- установлено, что in vitro вещество ускоряет процесс включения свободных аминокислот в клеточную культуру и стимулирует синтез белка;

- основной показатель белкового катаболизма - остаточный азот -под влиянием сальбутамола гемисукцината in vitro достоверно снижается, что указывает на ингибирующее действие вещества на ресинтез белка.

2. Показана способность сальбутамола гемисукцината ингибировать пе-рекисное окисление липидов. При этом вещество проявляет активность при неферментативной индукции перекисного окисления липидов, восстанавливая защитное действие естественных факторов: цитохрома Р-450 и глютатиона.

3. Сальбутамол гемисукцинат не оказывает корректирующего влияния при ферментативной (НАДФЬГ) индукции перекисного окисления липидов.

4. Антиоксидантная активность и способность активировать белковый анаболизм позволяют предположить наличие у сальбутамола гемисукцината цитопротекторной активности, что подтверждается реакцией ферментов цитолиза в культуре клеток.

5. Опыты in vivo при введении сальбутамола гемисукцината в дозе 350 мкг/кг живой массы свиньям полностью подтвердили миотропноана-болическую активность вещества, установленную in vitro.

6. Ростстимулирующее влияние сальбутамола гемисукцината in vivo проявляется достоверным увеличением среднесуточного прироста массы (на 13%), убойного выхода, массы туши (на 10%). Существенно (на 16%) повышался выход мяса. Жиросжигающее действие сальбутамола гемисукцината значительно снижало содержание внутреннего жира и подкожного сала в туше.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты, а также способность сальгима улучшать конверсию корма и снижать затраты кормовых средств на 1 кг прироста, позволяют заключить, что после углублённого специфического изучения миотроп-ноанаболического действия в научно-хозяйственном и производственном опытах сальбутамол гемисукцинат может быть рекомендован в качестве кормовой добавки в сельскохозяйственном животноводстве РФ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Зюзин СЛ., Ошкина Г.К. Новое направление в применении стимуляторов роста в кролиководстве // Сборник докладов 1 -й научной конференции молодых учёных ЯГСХА. - Ярославль. - 1997. - С. 18-19.

2. Сальникова С.И., Зюзин С.А., Ошкина Г.К. Стимуляторы мясной продуктивности в животноводстве // Теория и практика использования БАВ в животноводстве. Тезисы докладов научной конференции - Киров. - 1998.-С. 75.

3 Сальникова С.И., Зюзин С.А., Ошкина Г.К. Производные сальбутамо-ла - новые стимуляторы мясной продуктивности животных в животноводстве // Теория и практика использования БАВ в животноводстве. Тезисы докладов научной конференции - Киров. - 1998. - С. 76.

4. Зюзин С А. Мембранозащитная активность производного сальбутамола И Современные проблемы естествознания- биология и химия. Сборник тезисов областной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных. - Ярославль. - 1999. - С. 12.

5. Зюзин С.А., Сальникова С.И., Епихин В П. Стимуляция синтеза белка производными сальбутамола // Ветеринария. - 2000. - №6.

6 Сальникова С.И., Ошкина Г.К., Зюзин С.А. Сальгим - один из эффективных путей решения мясной продуктивности в животноводстве // Селекционные и технологические основы повышения продуктивности с.-х. животных. Материалы межвузовской научно-методической конференции. - Ярославль. - 2000. - С.60-64.

7. Зюзин С.А. Мембранозащитная активность сальгима // Селекционные и технологические основы повышения продуктивности с-х животных. Материалы межвузовской научно-методической конференции. - Ярославль. - 2000. - С 65-67.

8. Зюзин С.А., Сальникова С.И. Механизм мембранозащитной активности сальгима // Современные проблемы животноводства. Материалы международной научной конференции. - Казань. - 2000. - С 271-272

9. Зюзин С.А., Сальникова С.И. ПОЛ как один из ведущих механизмов заболеваний сельскохозяйственных животных и перспективы коррек-

ции его аналогами (3-агонистов // Материалы межвузовской научно-методической конференции. - Ярославль. - 2001. - С. 92-95.

Ю.Зюзин С.А. Мембранозащитная активность сальгима // Перспективы развития животноводства в северо-западном регионе. Материалы международной научно-практической конференции. - Калининград. - 2002 - С. 224-226.

11. Сальникова С.И., Ошкина Г К., Зюзин С.А. Изучение биологической активности замещённых амидов 2-антрахинонсукцинаминовой кислоты // Сборник научных трудов. Юбилейный выпуск. - Ярославль. -2002. - С.247-251.

12. Зюзин С.А., Сальникова С.И Использование БАВ сальгим в качестве лечебного фактора в ветеринарной медицине // Селекционные и технологические основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. - Ярославль. - 2003. - С.214-217.

13. Зюзин С.А. Перспективы использования кормовых добавок в животноводстве России // Материалы международной научно-методической конференции профессорско-преподавательского состава. - Ярославль. -2004.-С.34-36.

Лицензия ИД № 04135 от 27.02.01 г. Подписано в печать 15.09.05. Бумага белая

Условных печ. листов 1.0. Тираж 100 экз. Заказ № 37.

Типография ФГОУ ВПО «Ярославская государственная сельскохозяйственная академия» 150042, г. Ярославль, Тутаевское шоссе, 58.

:r 1 J V i>

РНБ Русский фонд

2006-4 14580

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зюзин, Сергей Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика биологически активных веществ (БАВ).

1.2. Роль анаболических стероидных гормонов в обмене веществ.

1.3. Применение кормовых антибиотиков в животноводстве.

1.4. Участие в обмене веществ макро- и микроэлементов.

1.5. Разновидности тканевых препаратов.

1.6. Специфические сыворотки - стимуляторы обмена веществ.

1.7. Бактериальные препараты для стимуляции пищеварения.

1.8. Особенности р2-агонистов и механизм их взаимодействия с тканями.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение некоторых сторон механизма ростостимулирующей активности кормовой добавки медиаторного действия - сальгима"

В животноводстве большое внимание уделяется проблеме повышения мясной продуктивности животных, которая неразрывно связана с сохранением их функциональной работоспособности. В связи с этим резервом получения дополнительной мясной продукции и особенно сокращения её себестоимости является применение биологически активных веществ (БАВ), оказывающих ростостимулирующие влияние на организм животного и снижающих потери продукции от заболеваний. С этой целью были исследованы и внедрены в сельское хозяйство многочисленные группы химических веществ. К ним относятся: препараты синтетических аминокислот (лизин, метионин, триптофан); жирорастворимые витамины (каротин, А, Д, Е, К) [11, 13, 16]; водорастворимые витамины (В1.В12, С, Н, F, U); соли дефицитных микроэлементов (Fe, Си, Zn, Mn, Se, Mo) [21, 29, 30]; ферментные препараты (амилосубти-лин, протосубтилин, целловиридин, пектофоэтидин, лизоцим) [33, 57, 58]; антиоксиданты (этоксихин, дилудин, сантохин, бутилокситолуол, лецитин, ксонтофил) [61, 62]; кормовые антибиотики (биомицин, ба-цитрацин, тилезин, фрадизин, кормогризин); гормональные препараты (эстрон, прогестерон, кортизон) [65, 79, 110].

Для большинства из названных препаратов характерно активное влияние на состояние обмена веществ в организме, повышение резистентности молодняка, заметно выраженное анаболическое действие, активизация иммунной системы и, как следствие, повышение сохранности поголовья молодняка, продуктивности животных, оптимизация воспроизводительных функций.

Известно, что проблема регулирования мясной продуктивности сельскохозяйственных животных с давних пор и по настоящее время решается с трёх качественных позиций метаболизма белка в скелетной мышце - синтеза, распада и аккреции [29, 32, 38].

Известно, также, что скелетная мышца представляет собой орган, функция которого полностью зависит от иннервации. Достаточно вспомнить, что нарушение нервно-мышечной связи (болезнь или экспериментальное воздействие), приводит к полной или частичной потере специфичности мышечных белков. Кроме того, дифференциация и специфичность белков в скелетной мышце прямо зависит от скорости метаболизма его в органе [38].

Опыт специалистов, занимающихся данной проблемой, свидетельствует, что наиболее реальный путь аккреции белка в органе - это изменение скорости его синтеза и деструкции. Именно с учётом данного теоретического положения проводится практический поиск биологически-активных веществ, способных влиять на метаболизм белков в организме.

Целью нашего исследования является комплексное изучение механизма белковоанаболической активности кормовой добавки сальгима (сальбутамола гемисукцината) в культуре ткани куриного эмбриона и на сельскохозяйственных животных, а также изучение его антиоксидант-ного и протекторного влияния на модели индукции перекисного окисления липидов в клетках культуры ткани куриного эмбриона.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые в России изучено биологически активное вещество с медиаторным механизмом действия, являющееся агонистом (32-адренорецепторов. Изучено влияние сальгима на азотистый обмен в клетках. Определено его анаболическое и антикатаболическое действие.

Впервые изучено антиоксидантное и протекторное влияние сальгима посредством изучения уровня пероксидации липидов и цитолиза мембран. Проведено изучение механизма антиоксидантной защиты сальгима в опытах на культуре клеток куриного эмбриона. Отдельно изучено влияние препарата на ферментативно и неферментативно индуцированное перекисное окисление липидов.

Впервые изучено влияние сальгима на рост и развитие растущих, откармливаемых свиней в опыте in vivo.

Актуальность и практическая значимость исследования состоят в том, что при достоверном выявлении у сальгима сочетания росто-стимулирующей активности с антиоксидантным (протекторным) действием, препарат может найти применение в качестве кормовой добавки с V лечебными свойствами. Полученные данные подтверждают возможность использования сальгима в качестве стимулятора мясной продуктивности, а также существенно расширяют возможности его применения благодаря установленной антиоксидантной и мембранопротектор-ной активности.

В задачи исследования входило:

1. изучить белково-анаболическую активность сальгима in vitro (на культуре ткани);

2. проследить возможное антиоксидантное влияние сальгима на модели индуцированного алкоголем перекисного окисления липидов in vitro;

3. изучить некоторые механизмы установленной антиоксидантной и протекторной активности сальгима в опытах in vitro;

4. изучить белковоанаболическое и антиоксидантное действие сальгима в опытах in vivo (на свиньях).

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Зюзин, Сергей Александрович

ВЫВОДЫ

1. В опытах in vitro и in vivo на сельскохозяйственных животных изучены следующие стороны механизма миотропно-анаболической активности сальбутамола гемисукцината:

- Установлено, что in vitro вещество ускоряет процесс включения свободных аминокислот в клеточную культуру и стимулирует синтез белка;

- Основной показатель белкового катаболизма — остаточный азот - под влиянием сальбутамола гемисукцината in vitro достоверно снижается, что указывает на ингибирующее действие вещества на ресинтез белка.

2. Показана способность сальбутамола гемисукцината ингибировать перекисное окисление липидов. При этом вещество проявляет активность при неферментативной индукции перекисного окисления липидов, восстанавливая защитное действие естественных факторов: цитохрома Р-450 и глютатиона.

3. Сальбутамол гемисукцинат не оказывает корректирующего влияния при ферментативной (НАДФ-Н*) индукции перекисного окисления липидов.

4. Антиоксидантная активность и способность активировать белковый анаболизм позволяют предположить наличие у сальбутамола гемисукцината цитопротекторной активности, что подтверждается реакцией ферментов цитолиза в культуре клеток.

5. Опыты in vivo при введении сальбутамола гемисукцината в дозе 350 мкг/кг живой массы свиньям полностью подтвердили мио-тропноанаболическую активность вещества установленную in vitro.

6. Ростстимулирующее влияние сальбутамола гемисукцината in vivo проявляется достоверным увеличением среднесуточного прироста массы (на 13%), убойного выхода, массы туши (на 10%). Существенно (на 16%) повышался выход мяса. Жиросжигающее действие сальбутамола гемисукцината значительно снижало содержание внутреннего жира и подкожного сала в туше.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты, а также способность сальгима улучшать конверсию корма и снижать затраты кормовых средств на 1 кг прироста, позволяют заключить, что после углублённого специфического изучения миотропноанаболического действия в научно хозяйственном и производственном опытах сальбутамол гемисукцинат может быть рекомендован в качестве кормовой добавки в сельскохозяйственном животноводстве РФ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зюзин, Сергей Александрович, Ярославль

1. Абдрашитова С.А. Влияние арсенина на перекисное окисление липидов и жирнокислотный состав клеток Alcaligenes eutrophus // Микробиология. 1988. - Т.57. - Вып. 2. - 231 с.

2. Аишко В.К., Шевченко М.И. Мембраны и жизнь клетки. Киев, 1987.- С. 21-22.

3. Бакалова Р. Стабилизирующее действие оксибензимидазола и его производных на биологические мембраны при активации перекисно-го окисления липидов // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. 1987. - Т.104. - №9. - С. 304.

4. Барабой В.А., Брехман И.И., Голотин В.Г. Перекисное окисление и стресс. С.-Пб., 1992.-118 с.

5. Брухман Э.Э. Прикладная биохимия // Лёгкая и пищевая промышленность.- М.: 1981.- 296 с.

6. Бурлашова Е.Б., Джалябова М.И., Твахария В.О. и др. Влияние липидов мембран на активность ферментов. — В кн. Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. М.: Наука, 1982, - С. 113-140.

7. Владимиров Ю.А., Арганов А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972.- 252с.

8. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физиологические свойства липидного слоя биологических мембран // Биофизика. 1987. - Т.32. - Вып. 5. - С. 830.

9. Голубев Д.Б., Соминина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. Медицина, 1976. - С. 17-45.

10. Гуляева Н.В. Ингибирование свободнорадикального окисления липидов в механизмах срочной и долговременной адаптации к стрессу // Науч. докл. высш. шк. биол. науки. 1989. - №4. - С. 5-14.

11. Евдокимов П.Д., Артемьев В.И. Витамины, микроэлементы, биостимуляторы и антибиотики в животноводстве. Лениздат, 1967.199 с.

12. Заварзин А.А., Харазова А.Д. Основы общей цитологии. Ленинград, 1982.- С. 94-95.

13. Зернов B.C. Теория и практика использования биологически активных веществ в животноводстве.- Киров, 1998.- С. 3-4.

14. Зорин В.П., Черенкевич С.Н. Роль продуктов перекисного окисления липидов в реакции культивируемых клеток на изменение рН среды // Цитология. 1984. - Т.26. - №9. - С. 1069.

15. Зюзин С.А. Мембранопротекторная активность производного сальбутамола // Современные проблемы естествознания: Сборник тезисов областной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных. Ярославль, 1999.- С. 12-13.

16. Зюзин С.А., Сальникова С.И., Епихин В.П. Стимуляция синтеза белка производными сальбутамола // Ветеринария.- 2000, №6.

17. Карышева А.Ф., Карышев С.В. Эффективная основа питательных сред для культивирования клеток // Ветеринария.- 1995.- № 9.- С. 34.

18. Кожевников Ю.И. О перекисном окислении липидов в норме и патологии (Обзор) // Вопросы медицинской химии.- 1985.- Т. 31, № 5.-С. 2-7.

19. Козлов А.Г. Адренергическая регуляция: молекулярные механизмы. Киев: Техника, 1993.- С. 94-98.

20. Колб В.Г., Камышников B.C. Клиническая биохимия. Минск: Беларусь, 1976.- С. 59-62.

21. Кольчик Ю.А., Дроганов И.Ф. Использование гормонально активных биостимуляторов для повышения мясной продуктивности крупного рогатого скота. М.- 1994.- С. 22-25.

22. Левчук А.А. Влияние канцерогенных метаболитов ароматических аминокислот на окислительные процессы в липидах in vitro и in vivo // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. — 1987. Т. 104. -№7. - С. 77.

23. Ленинджер А. Биохимия.- М.: Мир, 1974.- 976 с.

24. Малахов А.Г. Биохимия сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1984.-С. 196-198.1. V>

25. Малышев В.В., Ощепкова О.М. Ограничение гипероксидации ли-пидов и предупреждение стрессорных повреждений сердца производными глицина // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1996. - Т. 59. - № 5. - С. 23-25.

26. Меныпенин В.В., Лавченко Е.Г. Питательные среды для промышленного культивирования. М.: «Колос», Ветеринария. - №3. — 1997. - С. 27.

27. Мид Дж. Свободнорадикальные механизмы повреждения липидов

28. Чч и их значение для клеточных мембран. В кн. Свободные радикалы вбиологии, т.1, Пер. с англ. М.: Мир. 1970. - С. 68-87.

29. Мозгов И.Е. Фармакология.- М.: Колос, 1979.- С. 104-105.

30. Мозгов И.Е. Фармакологические стимуляторы в животноводстве. -М.: Колос, 1964.-367с.

31. Ошкина Г.К., Зюзин С.А. Новое направление в применении стимуляторов роста в кролиководстве // Сборник докладов 1-й научной конференции молодых учёных ЯГСХА. Ярославль, 1997. - С. 181. 20.

32. Правила по организации государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения, Приказ Минсельхозпрода России.- 1999. 18 августа. - №604.

33. Разумовская И.И. Роль нервной системы в регуляции синтеза мышечных белков // В кн.: Нервный контроль структурно-функциональной организации скелетной мышцы. Ленинград, 1980.-С. 69-83.

34. Сальникова С.И., Зюзин С.А. Стимуляторы мясной продуктивности в животноводстве // Теория и практика использования биологически активных веществ в животноводстве: Тезисы докладов научной конференции. Киров, 1998.- С. 75-76.

35. Сергеев П.В. Стероидные гормоны. М.: Наука, 1984.- 240 с.

36. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л. Рецепторы. М.: Медицина, 1987.- С. 113-129.

37. Соловьёв В.Д., Бектемиров Т.А. Тканевые культуры в вирусологии. М.: Московская правда, 1963.- С. 76-96.

38. Степанов В.И., Михайлов Н.В. Практикум по свиноводству. М.: Агропромиздат, 1986.- 256 с.

39. Тюпаев И.М. Закономерности биосинтеза белков мышечной ткани сельскохозяйственных животных и механизмы регуляции этого процесса// Сельскохозяйственная биология. 1995.- №4.

40. Хаджай Я.И. О графическом способе определения эффективной дозы и её доверительных границ при учёте реакций в градированной форме // Фармакология и токсикология. 1965. - № 1. - С. 118-122.

41. Хухо Ф. Нейрохимия. Основы и принципы.- М.: Мир, 1990.- С. 241-242.

42. Чекман И.С. Биохимическая фармакодинамика. Киев: Здоровье, 1991.- С. 31-42.

43. Чечёткин А.В. Биохимия животных.- М.: Высшая школа, 1982.-511с.

44. Agergard N., Oksbjerg N., Jorgensen H., Fernandez J. Acute and chronic effects of salbutamol, a б-adrenergic agonist, on plasma metabolites and hormones in finishing female pigs. Proc. 45th Annual Meeting EAAP. Edinburgh, UK, 1994. - 341 p.

45. Anderson J.R., Dillon J.L., Hardaker J.B. Agricultural decision analysis. The Iowa State University Press, 1977. - P. 67-89.

46. Baxter G., Connor O., Haughey M. i.e. A. Evaluation of an immuno-biosensor for the on-site testing of veterinary drug residues at an abattoir. Screening for sulfamethazine in pigs. -Analyst, 1999. P. 1309-1314.

47. Boisen SSterre sikkerhed for foderets faktiske energivirdi. Hyologisk nr.9,1994.-P. 32-33.

48. Boisen S., Fernandez J.A. Prediction of the apparent ileal digestibility of protein and amino acids in feedstuffs and feed mixtures for pigs by in vitro analyses. Anim Feed Sci. Technol. 51,1995. - P. 29-43.

49. Boisen S., Fernandez J.A. Prediction of the total tract digestibility of energy in feedstuffs and pig diets by in vitro analyses. Anim Feed Sci. Technol., 1997.-P. 277-286

50. Brambilla G., Cenci Т., Franconi F. i.e. Clinical and pharmacological profile in a clenbuterol epidemic poisoning of contaminated beef meat in Italy. Toxicology Letters 114,2000. - P. 47-53.

51. Council Directive 96/22/EU. Off J. European Commission, 1996, L 125.-P. 3-9.

52. Council Directive 96/23/EU. Off J. European Commission, 1996, L 125.-P. 10-32.

53. Dahl S.G., Edvardsen O., Kristiansen K., Sylte I. Bioinformatics and the molecular mechanisms of psychotropic drugs and brain receptors (Invited review). Biotechnology Annual Review, 2000. - 156 p.1. У**

54. Dahl S.G., Allain P., Marie P.J. Incorporation and Distribution of Strontium in Bone, 2000. P. 99-112.

55. Dahl G., Gram L.F. Treatment of anxiety and depression. (Invited review). In European Textbook of Clinical Pharmacology, McGraw-Hill Series of Clinical Medicine, 2000. - P. 289-299.

56. Danielsen V., Fernandez J.A., Jorgensen H. Grovfoder til swer og slag-tesvin. Ekologisk og udenders svineproduktion. Hvor ster vi Temamede pe Danmarks JordbrugsForskning 21. Intern Rapport nr. 145,2001. - P.3538.

57. Danfar A., Boisen S., Fernandez J.A. Developments in the prediction of nutrient availability in pigs. 47th Ann. Meet of the EAAP, Lilleham-mer, Norway, 1996. - 13 p.

58. Danfar A., Fernandez J.A. Developments in the prediction of nutrient availability in pigs: a review. Acta Agric. Scand., Sect. A, Anim. Sci. 49, 1999.-P. 73-82.

59. De Groot M.H. Optimal Statistical Decisions. McGraw-Hill, New ki York. 1970.

60. Dijkhuizen A.A., Kristensen A.R. Optimal replacement of mastitis cows determined by a hierarchic Markov process // Journal of Dairy Science, 1995.-P.2975-2993.

61. Dourmad J.Y., Sive В., Latimer P. i.e. Nitrogen consumption, utilization and losses in pig production in France, The Netherlands and Denmark. Livest. Prod. Sci. 58, 1999. - P. 261-264.

62. Dourmad J.Y., Sive В., Latimer P. i.e. Nitrogen consumption, utilisation and losses in pig production. 48th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, Vienna, 1997. - 332 p.

63. Elliot C. Fast automated screening systems for veterinary drug residues. EuroResidue 5, 2000. - P. 54-62.

64. Emery P.W. Chronic effects of beta-adrenergic agonists on body composition and protein synthesis in the rat. Biosci. Rep, 1984. - P. 83-91.

65. Enting J., Huirne R.B., Dijkhuizen A.A. A knowledge-integrated computer system to support health management on pig farms. Computers and Electronics in Agriculture, 2000. - P. 13-35.

66. Europeen Commission. Measures concerning meat and meat products (hormones), panel report. World Trade Organization. Documents WT/DS26/R/USA and WT/DS48/R/CAN. Geneva, 18-1-1998.

67. Europeen Commission. Measures concerning meat and meat products (hormones), panel report. World Trade Organization. Documents WT/DS26/AB/R and WT/DS48/AB/R. Geneva, 16-1-1998.

68. Fernandez J.A. Vurdering af foder til svin hvor er vi pe vej hen Hy-ologisk Tidsskrift. - 5, 2000. - P. 26-28.

69. Fernandez J.A. Suministro de aminoacidos esenciales a lechones (8-20 kg) en dietas con contenido proteico reducido. XVII Reuniyn de la Asociaciyn Latinoamericana de Producciyn Animal (ALPA), Cuba, 20. -23. November, 2001. - 67 p.

70. Fernandez J.A. Calcium and phosphorus metabolism in growing pigs. I. Absorption and balance studies. Livest. Prod. Sci. 41, 1995. - P. 233241.

71. Fernandez J.A. Calcium and phosphorus metabolism in growing pigs. III. A model resolution. Livest. Prod. Sci. 41,1995. - P. 255-261.

72. Fernandez J.A. Calcium and phosphorus metabolism in growing pigs. II. Simultaneous radio-calcium and radio-phosphorus kinetics. Livest. Prod. Sci. 41,1995. - P. 243-254.

73. Fernandez J.A., Batterham E.S. The nutritutive value of lupin-seed and dehulled lupin-seed meals for growing pigs as evaluated by different techniques. Anim. Feed Sci. Technol. 52,1995. - P. 279-296.

74. Fernandez J.A. Prediction of energy and protein digestibility. Proc. fra NJF-seminar no. 274. Energy and protein evaluation for pigs in the Nordic countries. Nordisk Jordbrugsforskning Nr. 2, 1998. - Vol. 80. - P. 128.

75. Fernandez J.A. Deposition and content of N, P and К in slaughter pigs. In: Poulsen, H.D., Kristensen, V.F. (eds.). Standard values for farm manure. DIAS Report no. 7, Danish Institute of Agricultural Sciences, 1998. -P. 97-107.

76. Fernandez J.A., Poulsen H.D., Boisen S., Rom H.B. Nitrogen and phosphorus consumption, utilisation and losses in pig production. Denmark. Livest. Prod. Sci. 58, 1999. - P. 225-242.

77. Fernandez J.A. Commission on Pig Production. Livestock Production Science 60, 1999. - P. 193-195.

78. Fernandez J.A. Nuevos conceptos en la alimentaciyn de cerdos en el Norte de Europa. Proc. Jornadas Tficnicas, Andersen s.a, Madrid, Barcelona, 1999. - P. 5-20.

79. Fernandez J.A., Fuller M.F. Nitrogen and phosphorus nutrition of the pig. Special issue, EAAP publ no 1/99. Livest. Prod. Sci, 1999. - 58, no. 3.

80. Fernandez J.A. Erneringsmessig vurdering af grovfoder og fiberrige fodermidler til svin. Temamede vedr. Grovfoder og fiberrige fodermidler til svin. Danmarks JordbrugsForskning, Intern Rapport nr. 117, 1999. -P. 30-33.

81. Fernandez J.A. Prediction of energy and protein digestibility. NJF-seminar no. 274, Research Centre Foulum, Denmark. NJF-report no. 119, 1997.-P. 59-70.

82. Fernandez J.A. Aflejring og indhold af N, P og К hos slagtesvin. I: Poulsen, H.D., Kristensen, V.F. (red.). Normtal for husdyrgedning. Beret-ning736, 1997.-P. 102-112.

83. Gilks W.R., Richardson S., Spiegelhalter D.J. Markov Chain Monte Carlo in Practice. Chapman, Hall, London, 1996. - 78 p.

84. Gram L.F., Dahl S.G. Depressionsbehandling (Invited review). In Basal og Klinisk Farmakologi, Ed. J.P. Kampmann, K. Brosen, F. Niel-sen-Kudsk and N.C.B. Nyborg. FADLS's forlag, Copenhagen, 1999. - P. 517-524.

85. Hahn B.N. Systemic lupus erythematosus. In: Harrison's Principle of Internal Medicine/Eds. A.S. Fauci e.a. 14th edition. MacGraw-Hill, N.Y., 1998.-P. 1874-1880.

86. Hohle M., Jorgensen E., Nilsson D. Modeling with LIMIDs Exampli-fied by Disease Treatment in Slaughter Pigs. - In Proc. from International

87. Symposium on Pig Herd Management Modelisation. Lleida, Spain, September 18-19,2000. P. 17-26.

88. Hogeveen H., Thiesson В., Thysen I., i.e. Mastitis pathogen diagnosis using Bayesian belief networks. In H. Hogeveen, Knowledge-based methods for automated mastitis diagnosis on dairy farms. Ph.D. thesis, 1994.-P. 129-144.

89. Huirne R.B., Dijkhuizen A.A., Backus G.B. Validation of an integrated decision support and expert system for analysis of individual sow-herd performance. Computers and Electronics in Agriculture, 1991. - P. 7186.

90. JECFA-Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, Residues of Some Veterinary Drugs in Animals and Foods. Food and Nutrition Paper №41. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Roma, 1998.-P. 24-41.

91. Jensen K.H., Sorensen L.S., Bertelsen D. Management factors affecting activity and aggression in dynamic group housing systems with electronic sow feeding a field trial. - Animal Science, 2000. - P. 535-546.

92. Jensen F.V. An introduction to Bayesian Networks. UCL Press. Jorgensen, E. Calibration of a Monte Carlo Simulation Model of Disease Spread in Slaughter Pig Units. Computers and Electronics in Agriculture, 1996. - P. 245-259.

93. Jorgensen E. Decision support systems in animal production. a bayes-ianfuture Danish Institute of Agricultural Science, 1997. - P. 43-46.

94. Jorgensen E. Elements of Bayesian network specification in an animal health research project. Internal report, Biometry Research Unit, Danish Institute of Agricultural Sciences, 2000. - P. 1-24.

95. Jorgensen E. Monte Carlo Simulation Models: Sampling from the joint distribution of 'State of Nature'-parameters // Economic modelling of Animal Health and Farm Management. November 23-24,2000. - 49 p.

96. Jorgensen E., Toft N. A Bayesian network based monitoring system for sowmanagement. Computers and Electronics in Agriculture, subm, 1999. -43 p.

97. Jorgensen E. Fra Registrering til Information. Dyrlegeregningens stor-relse afspejler sundheden i en kvegbesetning. Indleg ved Dansk Boolo-gisk Selskabs forarsseminar, 2001. - P. 78-89.

98. Jorgensen E., Sollested T.A., Toft N. Evaluation of SIR epidemic models in slaughter pig units using Monte Carlo simulation in Proc. from International Symposium on Pig Herd Management Modelisation. Lleida, Spain, September 18-19,2000. - P. 27-36.

99. Jorgensen E. Calibration of a Monte Carlo simulation model of disease spread in slaughter pig units. Computers and Electronics in Agriculture, 2000. - P. 245-259

100. Jorgensen E. Elements of Bayesian network specification in an animal health economy research project. Internal Report 2000-02. Biometry Research Unit. Danish Institute of Agricultural Sciences, 2000. - 24 p.

101. Jorgensen H., Gabert V.M., Fernandez J.A. Influence of nitrogen fertilization on the nutritional value of high-lysine barley determined in growing pigs. Anim. Feed Sci. Technol, 1999. - P. 79-91.

102. Jorgensen H., Fernandez J.A. Chemical composition and energy value of different fat sources for growing pigs. Acta Agric. Scand., Sect. A, Animal Sci., 2000. - P. 129-136.

103. Jorgensen E. Monte Carlo simulation models: Sampling from the joint distribution of'State of Nature-parameters, 2000. P. 73-84.

104. Kristensen A.R., Jorgensen E. Multi-level hierarchic Markov processes as a framework for herd management support. -Annals of Operations Research., 2000. P. 69-89

105. Kristensen A.R. Hierarchic Markov processes and their applications in replacement models. European Journal of Operations Research, 1988. -P. 207-215.

106. Kristensen A.R. Bayesian updating in hierarchic Markov processes applied to the animal replacement problem. European Review of Agricultural Economics, 1993. - P.223-239.

107. Kristensen A.R. Markov Decision Programming Techniques Applied to the AnimalReplacement Problem. Doctoral Dissertation. Dina KVL, In-stitut for Husdyrbrug og Husdyrsundhed, Kobenhavn, 1993. - P. 43-49.

108. Kristensen N.B., Pierzynowski S.G., Jungvid H., Fernandez J. Portal recovery of enteral supplied alpha-ketoglutaric acid in growing pigs. -Anim. Sci. 79 (Suppl. 1), 2001. 321 p.

109. Kristensen A.R., Jorgensen E. Multi-level hierarchic Markov processes as a framework for herd management support. Annals of Operations Research, 2000. P.69-89.

110. Larsen Т., Fernandez J.A., Engberg R.M. Bone turnover in growing pigs fed three levels of dietary calcium. Can. J. Anim. Sci. 80 (4), 2000. -P. 547-557.

111. Larsen Т., Engberg R.M., Fernandez J.A. Turnover of bone in growing pigs supplied with three levels of dietary calcium. Calcified Tissue International 66, suppl. 1,2000. - 80 p.

112. Larsen V.A., Jorgensen E. Reproductive performance of outdoor sow herds described by level and variability. Submitted to Livestock Production Science, 2001. - P. 373-349.

113. MacRae J.C. The action of the beta-agonist clenbuterol on protein and energy metabolism in lattening whether lambs. Br. J. Nutr., 1988. - P. 457-465.

114. Madsen T.N., Ruby V. An application for early detection of growth rate changes inthe slaughter-pig production unit. Computers and Electronics in Agriculture, 2000. - P.261-270.

115. Madsen T.N. A model for detection of changes in drinking behaviour of young pigs. In Proc. International Symposium on Pig Herd Management Modelisation. Lleida, Spain, 2000. - P. 1-10.

116. Maistro S., Chiesa E., Angeletti R., Brambrilla G. Beta blockers to prevent clenbuterol poisoning . Lancet 346, 1995. - 180 p.

117. Mena M.A., Arriaza C.A., Tchernitchin A.N. Early postnatal androge-nization imprints selective changes in the action of estrogens in the rat uterus. Biol. Reprod., 1992. - P. 1080-1085.

118. Mol R.M. Description of a detection model for oestrus and disease in dairy cattle based on time series analysis combined with a Kalman filter. -Computers and Electronics in Agriculture, 1999. P.171-185.

119. Murthy N.S., Hiremath S.R. Formulation And Evaluation Of Controlled Release Transdermal Patches Of Theophylline Salbutamol Sulphate. - The Internet Journal of Pharmacology, 2001. - P. 13-19.

120. Nilsson D., Jorgensen E. Representing and Evaluating POMDP's with Limited Memory, abstract Beyond MDPs: Representations and Algorithms. Workshop at the Conference Uncertainty in Artificial Intelligence, 2000.-P. 39-43.

121. Oksbjerg N., Fernandez J.A., Jorgensen H. Effects of salbutamol on protein and fat deposition in pigs fed two levels of protein. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 75,1996. - P. 1-12

122. Pedersen C., Boisen S., Fernandez J.S. The influence of dietary protein level on the amino acid composition of ileal endogenous protein losses in pigs. Abstract from 8th Symposium on Digestive Physiology in Pigs, Uppsala, Sweden, 2000. - 55 p.

123. Poulsen H.D., Fernandez J.A., Boisen S. Den teoretiske og praktiske baggrund for at minimere kvelstofudskillelsen fra svineproduktionen. -HusdyrForskning 1, 1995. P. 16-18.

124. Poulsen H.D., Fernandez J.A., Jongbloed A.W., Latimier P. Phosphorus consumption, utilization and losses in pig nutrition. 48th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, Vienna, 1997.- 334 p.

125. Poulsen H.D., Jongbloed A.W., Latimier P., Fernandez J.A. Phosphorus consumption, utilization and losses in pig production in France, The Netherlands and Denmark. Livest. Prod. Sci., 1999. - P. 251-259.

126. Pulce С., Lamaison D., Keck G. Collective Human Food Poisonings by Clenbuterol Residues in Veal Liver Vet Hum. Toxicol, 1991. - P. 480481.

127. Randy E. Ergogenic Aids: What Athletes Are Using—and Why. The physician and sportsmedicine, 1997. - vol. 25. - №. 4. -P.78-80.

128. Ravna A.W., Sylte I., Dahl S.G. Molecular modeling of the Escherichia coli Na+/H+ antiporter. Receptors and Channels, 2001. - P. 319-328

129. Reeds P.J. Stimulation of muscle growth by clenbuterol: lack of effect on muscle protein biosynthesis. Br. J. Nutr., 1986. - P. 249-258.

130. Salleras L., Dominguez A., Mata E., i.e. Epidemiologic Study of an Outbreak of Clenbuterol Poisoning in Catalonia Spain. Public Health Reports 110,1995. - P. 338-342.

131. Schindler F. Surface Plasmon Resonance (E was steckt dahinter). La-borpraxis, 2000. - P. 38-42.

132. Sehested J., Breinhild K.K., Swegaard K. Gresningssystemer og swers gresoptagelse pe friland forelibige resultater fra Rugballegaard. - DJF Intern Rapport nr. 117,1999. - P. 14-20.

133. Smith S.B. Elevation of a specific mRNA in longissimus muscle of steers led ractopamine. J. Anim. Sci., 1989. - P. 3495-3502.

134. Sprensen P., Fernandez J.A. Dietary effects on the composition and turnover of pig manure N and С. 11th N-Workshop. Book of abstracts. INRA, Reims, Frankrig, 2001. - P. 209-210.

135. Stark K.D.C. Systems for prevention and control of infectious diseases in pigs. Ph.D. thesis. Massey University, Palmerston North, New Zealand, 1998.-P. 33-79.

136. Studnitz M., Jensen K.H., Jorgensen E., Jensen K.K. The effect of nose ringing on explorative behaviour in gilts. Submitted to Animal Welfare, 2001.-P. 145-178.

137. Studnitz M., Jensen K.H, Jorgensen E. Explorative behaviour in outdoor nose ringed and unringed gilts exposed to different tests. Submitted to Applied Animal Behaviour Science, 2001. - 214 p.

138. Studnitz M., Jensen K.H., Jorgensen E., Jensen K.K. The effect of nose ringing on exploratory behaviour in gilts. Proc. 25th Congress of ISAE, 4-9 August, California, USA, 2001. - 55 p.

139. Takai H., Zhang G., Dahl P., i.e. Full-scale model experiments on airborne particle transport between pigs in a room. Proc. 6th int. symp. on livestock environment, Kentucky, USA. ASAE publ. 701P0201,2000. - P. 571-578.

140. Thomsen M.G., Bersting C.F., Fernandez J., i.e. Kvilstofudnyttelse og -tab hos husdyr. Intern rapport nr. 62 SH, 1995. - 47 p.

141. Thysen I., Enevoldsen C. Visual Monitoring of Reproduction in Dairy Herds. Preventive Veterinary Medicine, 19, 1994. - P. 189-202.

142. Toft N., Kristensen A.R., Jorgensen E. A framework for decision support related to epidemic disease in slaughter pig production. Submitted to European Journal of Operations Research, 2001. - P. 291-299.

143. Toft N., Jorgensen E. Estimation of farm specific parameters in a longitudinal model for litter size with variance components and random dropout. Submitted to Livestock Production Science, 2001. - 43 p.

144. Toft N., Jorgensen E. Estimation of farm specific parameters in a longitudinal model for litter size with variance components and random dropout. Livestock Production Science, subm., 2001. - P. 214-241.

145. Van Vyncht., Preece S., Gaspar P. Gas and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for the multiresidue analysis of 0-agonists in biological matrices. Journal of Chromatography A., 1996. - P. 43-49.

146. West M., Harrison J. Bayesian forecasting and dynamic models. -Springer-Verlag, New York, second edition, 1997. P. 113-156.

147. Williams P.E. Effect of bets-agonist (clenbuterol) on growth, carcass composition, protein and energy metabolism of veal calves. Br. J. Nutr., 1987.-P. 417-428.