Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение морфофизиологических корреляций в развивающемся зародыше (на модельных системах Nelumbo Nucifera Gatrtn. и Daucus Carota L.)

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Изучение морфофизиологических корреляций в развивающемся зародыше (на модельных системах Nelumbo Nucifera Gatrtn. и Daucus Carota L.)"

РГ8 ОД

2 а пол 1033

российская акадеуея наук шваачЕскии институт и*. в.л.коюрш

Морозова Надеяда Михайловна

ИЗУЧЕНИЕ НОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ КОРРЕЛЯЦИИ

В РАЗВИВАВШЕЙСЯ ЗАРОДОТЕ (НА КОДЕЛЫШХ СИСТЕМАХ ИЕШВО КОСЕЕМ бйЕНТК. И ОАГ^ ШАТА I.)

03.00.05 - ботаника

Автореферат диссертации на соискание ученой, степени. - кандидата биологических наук

йэ прбвах ррописи

Санкт-Петербург !?33

Работа в;шолкена ь 0?д£ле »«¿риологш 35о*агагадок&ге езсга»

Научный ру'ло:,.-дл1-елъ - каидада? сИ:с. логическая наук

В.Е.Басилъева

Официальные оппонент!.!- доктор бисногкчоских наук

И.НоОрлова

¡баидддй? биологич1305ззк тук М,Л..,Еуеаковскай

Веское учреждение - Санкт-ПетерОургскиИ хкмика-$ар-

ШЦЗВТИЧеСКИЙ иконку?

Защлта состойся У^^фц^г/ЯЭЭ '¿асов на за-

седании специализированного сопста К„002о43,01 по защите диссертаций на соискшше уче?;.^ степени кщдадата биологических наук при Ботаническом гнс-титу го ш, В.Л.Комарова РАН во адресу: 197326, Сапкт-Иеуербург, ул0 ироф.Попова, 2, аьл Уча- ' кого совета.

С диссертацией мэнн» ознакомиться с библиотека Ботанпчза-кого института ям. В, 1.Кэмарош РАН»

Автореферат разослан ЧЛ." ^¿/¡Л 1533 г,

Ученый секретарь спец.совета 0,С.Юдина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТА

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В е«к экологических стоесссз все большее значение приобретает нэучвняе эмбриологических основ репродукции. как необходимой теоретнчесгсзй база для сочрзнекап генофонда. Один кз вазнкх аспактсз этой проблем - заявление регдляторннх нэ-хакязаов, обеспечивавших врекенную и простройстр8н.';ув координации роста, диффорэнцкации и метаболизма э риЗбивааеэися зароднае и, в конечном итоге, Формирование- норцглькик

Несмотря из огромный фактический матера по ь.чбрионалышу развития различных представителей семейств цветкояих анеется лишь ятдэльквз сведения о морфогенетических и «орфосчзаолсгйчесш яор-реедиах' с развитии зародыша. Практически :=з иззчзкн агитические периода эябрио- и змбриоидогеиеза, наиболее чувсштельчне к воздействия экологически факторов-

3 связи с зтий изучение гвдаг?нио5 рнтыики эмбриональных процессов, заявление причин а 'г.ризиаков-ме?кйров аномального развития зародыша имеет первостепенное значение дла разработка теории репродукции. Познай« закономерностей роста и раязиш зароднва ео взаимодействии с окрравцими тенями-и с внешней средой позволит подейтк к управлению различными типам!: 'репродукция я работать 'практические рвшзндаюш дл« сохранения генофонда растений, особенно редких, исчезащих и ^гяйственчо-цешшх зидяй.

5 связи с зтйы несомненная актуальность приобретает поиск га-кто методического подхода, который позволил бн приблизиться к по-шакка согласований всего слозного комплекса физизмго-биохими-чес^пх преобразований ?, развиваемся ззроднве с дозти^пяем н?об-Шйй'Ж козфошкческойг структура (батцгкно, 5333; бетнгина, Ва-СйГ.ьезз, 1983). Поэтому в- данной работе «к предпринял;! попытку оценить з наиболее обзеу виде в комплексе физиологические процесса я сбязаянае с «ими-процессы экбрчзналыше, уделив особое внимание поиску опткузльннх модельных систем для исследования данной ппоб-леин.

Цель я задачи исследования. Цель наетоя^й работы заключалось в заявление морсо-^изиологических корреляций, определяваих зренпи-ну^ и пространстсешщэ координации процессов роста, дифференциации и метаболизма в зибркональнои развитии растений. В связи с зп'к-были поставлеян слззуша задачи:

1 - Поиск- оптимального нетодического подхода и модельних систем для решения комплексной проблема морфо-физиологической координации развития зародыша,

2 - Исследование динамки балков, нуклеиновых каслот, растворимых сакаров, крахмала и гормона ЙБК - а) В развивавшемся зародн-ве и - б) в окрукавцих его структурах семени in vivo - на модельной снстемз Heluabo nucífera Gaertn.

3 - Исследование активности белоксинтезиррцей система растений при зм5ри0ген8тнческих процессах и 4 - Исследование роли мевк-л8точных взаиыодейсгБий в процессе формирований зародш - на мо-. дельной смсте - суспензионной культуре клеток и эмбриоидов моркови Daucus carota.

НАУЧНАЯ НОВИЗНЕ), Впервые проведено системное комплексное исследование последовательных стадий развития сеиени лотоса с момента оплодотворения и до стадии сформированного зародина. Выявлены критические периода в эибриогеиаэа лотоса к дана их-лорфо-фиэиологи-ческая характеристика. Показано различное значение гликоконъвгатов клеточной стенки растений в передаче информации при эмбриогенети-ческих процессах. Исследована особенности работи белоксинтезируа-цей система при змбриогенетических'процессах.

Практическая значимость 'работы. Результата исследований по , вншгниа морфофизиологическнх корреляций и критических периодов в развитии зародыша имеют принципиальное значение дла работ в области селекции и биотехнологии с применением энбриокультурн. Получен-. ныо данные могут быть использованы при чтении курса лекций по эмбриологии и физиологии растений и для составления практических рекомендаций по сохранений и размноаешш редких, исчезавших н хозяйственно-ценных видов.

Публикация результатов исследований. По ¡шериалаы диссертации опубликовано 8 работ.

АПРОБАЦИЯ PflEOTU.Результаты исследования долоаенн на Неадуна-роднем симпозиуме по половому воспроизведению высеих растений (Сиена, Италия, 1983),на Неадународнои симпозиуме по Зукарпии (Франция, 1992), Международном конгрессе по знбриологии растений (СИ, 1992), Молодежной конференции ботаников стран СНГ (Апатиты, 1993), а такте на заседаниях научного семинара отдела эмбриологии БИН РОН (С.-Петербург, 1992-1993.)..

Структура.-и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,. обзора литературы, двух экгпррииентальннх глав, эяключриия.и

емводов. Она изложена на лк^страницах иаяикописного текста и иллюстрирована 12 таблицами и 12 рисунками. Список литературы вклпчает<2Я^наименований, в том числе £04на иностранных языках.

' ОСНОВНОЕ ССДЕРЗАНКЕ РАБОТЫ 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУР»

Специфика поставленных в данной исследовании задач,а особенно ¡»ервой,вызвала необходимость особенно глубоко и подробно проанализировать литературу о механизмах рзгуляции эмбриогенеза и методах. их изучения.В связи с этим обзор литература имеет боль-вий,чег по принято обычно, объем и рклвчает анализ генной регуляции змбпио- и эмбриоидигенеза и анализ биохимических и иопфофигио-логических корреляции^ в развитии зародим.

Развивавшееся семя представляет собой слоянув ингегрироБзннуэ систему, механизмы согласованного развития которой до сих пор ос-тавтся неизвестными. Достижений молекулярной биологии и молекулярной генетики последних лет дали основания надеятся. что идентификация специфических генов, экспрессирупцкхся на определенных стадиях эмбриогенеза, стзет ™т'> охнет на »тот вопрос. 'В связи с этим нами был произведем подробный анализ литературных данных, накопленных к Настоящему времени по экспрессии генов в раннем эмбриогенезе растений, что составило самостоятельную теоретическую глазу данной диссертации.

Анализ лнтсратурйых данных показал, что достигнуты больсие успехи в определении и секвенировании генов, зкспрессирувзихся кз определенных стадиях эмбриогенеза у различкнх растений, что опре- . делалось по синтезу соответствующих белков, характерных для данной стадии - в случае применения иммуноскрининга экспрессионной библи-этеки (Seffens et al, 1390; Smith et al, 1988; Goaez et al, i338; i?'.ire et al, 1989 и др.) н по визуально наблюдаемым морфологическим йзн^нскизй в случае искусственного мутагенеза определенного гена (Helnks et al, 1989; Feldmann et cl,' 1989 и др.). Тек не #ь. ее/ объяснить, что включает и выключает определенные гены на определенных этапах и почему благодаря этому происходит формирование определенной, строго детерминированной морфн, - молекулярная биология и генетика ответа пока дать не могут. '

В связи с этим нами было предпринято комплексное морфофизио-

логическое исследование, позволяющее подойти к ревениз вопроса о координированной развитии зародыша с другой точки зр?ш, нсполь-зсьав для этого набор разнообразных методов» а также различные модельные системы,

2. зкспЕгшнгепьнйя часть

* Материалы и метода исследования

В качестве модельной системы, удсбноА для исследования '¿ор-фофнзиологичвских корреляций ь процессе развития зарсднь.а in vivo были взяты плодики лотоса орехоносного Helusbo nucífera Gaartn, изолированные на разных стадиях развития. Выбор-лотоса в качестве экспериментальной недели обусловлен болыш размером зародыиа, сравнительно шши сроками семяобразования, а таккэ ьисокой степенью издчшости, данного объекта с эмбриологической точки зрения <Батыгина и ар, !9G3: Титова, I960 и др.).

Для гистохимического•исследования материал фиксировали фиксаторами Карнуа и ФСУ. Препарат« окрашивали для определения ПК галлоцианином-хромовнуи квасцааи (Пирс, 1952),для определения белков и крахмала - проциоиозики красителями С Иванов,i982). Биохимическое определение белка плодили по методу Поури( Loury et а! 1951), крахмала - по методу .йгэнбович, Калинина ( 1952), растворных сахароь - при помочи тонкослойной хроматографии (Макаров. 1982),

Для анализа белков й-ля такгь использован иамуиозяектрофорез (Skvaril, 1961) и ДДС-Na электрофорез (Laeasli, 1970).

АБК определяли с поноцью ВЭ1Х. Г1Х и биотеста. Для более тонкого исследования корфофизиологических корреляций была взята модельная система, иироко используемая в аолекулзрно-биологических ■исследованиях - суспензионная культура шток и эибриоидов моркови Daucijs carota L. (Sung et al., 1984:Ноисеева и др., 198?,Wilds et al,.1988 и др.).

Индукция змбриоидогениза и фракционирование проводи шсь по методике Giuliano et al, (1983).

Определение гликоконг^гатов клеточной стенки проводилось с помочь!!! лектинов арзхиса и КОН fi, меченных ПТС и TRI ТС не. леки-несиентнон микроскопе (Дуцик; 1989).

Полисом^ из клеток ' и .эмбриоидов впделяли ыетодоы Дэвиса

íDaviss et al., 1972). Трансляции проводили в бесклеточкой системе (Roberts, Paterson, 1973 ) в присутствии меченого Нэ- лейцина. Радиоактивность меченых продуктов анализировали пи методике fens and Hove] 11(1961). Активность полисом измеряли 8 нйп/мя.ч * /^ь. полис ом.

2.2 Морфофизиологические корреляции, получзшше ка модельной системе Keluisbo nucífera 5

Изучение динамики различных веществ (нуклеиновых кислот, белка, крахмала, растворшш углеводов .ч гормона ЙБК) прозодкли в заро-дннй лотоса и окружающих его структурах (эндосперм?, нуцеллусе, внутренней и наругнои интегуненте, перикарпии)-на ранних стадиях развития зароднва (0-15 дней после опыления>. 0 точка соответствует стадии зрелости зародывевого мов,?а. 15 дней п/оп -стадии разси-тия зароднва, когда морфообразовательнне процессы в паи закончены,

В результате исследования в зародн?е лотоса ч в окруяавцкх его структурах плодика было выявлено несколько норфофлзиологичес-. кях корреляций, отрававщих функцкокальнув перестройку зародыша на определенных (критических) этапах эмбриогенеза.

Критический период представляет собой переяснннй момент г развитии организма, переход от одного его этапа к другому. Естественно, что при этом доляна происходить комплексная перестройка развития, то есть изменение как морфологических, так и биохимических параметров организма ( Васильева,оатигина,1981,Батнгинз и др.,1933)

Проведенноз нами исследование показало, что изненекие всех изучениях биохимических параметров в процесса эмбриогенеза имеет ярко храненный колебательный характер, с максимума«1,; и минимумами на определенных стадиях развития зародыва. Это подтверндает положение о наличии критических периодов в эмбриогенезе (Оатнгина,Васильева, 1973, Батыгйна.Бутенко,1331.Батнгина и др.,'1983),наиболее S32HHM из которых является период становления автономности за-родыга.т.е независимости его от материнского организма.Он являзтся таксоноспецифичннк и у зародыша лотоса соответствует стадии формирования пластинки 1-го листа почечки (10-11 день после опыления ). (Васильева,Батнгина,1931,Батыгина и др..1933) у

При изучении морфологии зародыша лотоса 5 развитии били получены данные. совпадавшие с данными Еатнгиной и др. (1983).

На основании анализа нуклеиновых кислот в зародыве и окррав-цих его тканях можно сделать следуюре заключения.

Во-первых, необходимо"отиетить, что многие ткани плсдика (зародив, эндосперм,нуцеллус, халазальная область) проявляют в ходе разьитиа ярко выраженную неоднородность в концентрации НК в разных зонах, чем и обусловлено выделение двух или даае трех обособленных участков в этих {канях.

Концентрации нуклеиновых' кислот во всех тканях плодика и их зонах имеют в ходе эмбриогенеза колебания, вырагенные в разных случаях в большей или ыеньвей степени. Их изменение описывается многовериинныки кривыми, величины максимумов которых уменьшаются о процессе эабриогзнеза.

Во многих работах (Fisher, Jensen, 1972; Chang, 19БЗ:Q1п et el.1389; и.др.) било показано, что в семенах и зародышах синтез РНК в клетках свивается в процессе эмбриогенеза. В противоположность этим, результаты наших исследований указывают, что этот процесс более сложний и по крайней мере у зародыша лотоса он сопровождается периодическими изменениями интенсивности синтеза НК.

При этом, те« не Ь'знее, наблюдается уменьшение интенсивности синтеза НИ от пика к пику (или же_уменьшение преобладания процессов синтеза НК над процессами распада).

При анализе распределения НК в зародыше было установле но,что разные его зоны неоднородна по этому показателю. Так растущие участки на концах лопастей семядоли, клетки,дифферен цируюциеся о корневой апекс ( по неупорядоченному типу) и, наконец, закладывающиеся приыордии 1-го,2-го и 3-го листьев почечки имеют более высокую концентрация НК, чем остальные части зародыва.

Изменения концентрации НК в меристематической ткани формирующейся почечки происходит одновременно с изменениями во всем зародыве, т. е качественно не отличаются от них. Од нако концентрация НН в этой ткани значительно выве во всех точках кривой Затухающий характер этой крн вой выражен в значительно меньшей степени, чем у кривой со ответствувчей всему зародышу.

Зародыи имеет 3 максимума концентрации НК - на 3-й день п/оп (сердечковидная стадия), на 8-й день - (8-9-й день - заловение примордия 2-го листа почечки) и на 12-й день - заложение прииордиз 3-го листа почечки);

Положения максимумов 'во всех остальных тканях и их зонах при-

ходятся на одни и те яе периода времени, а именно - на 2-3 день п/оп (глобулярный и ранний сердечковидный зародив) и на 6-8 дни п/оп (к 8-му дню происходит заложение принордия 2-го листа почечки). Однако необходимо отметить, что в обоих случаях ткани семени на один день опережают зародыш по максимуму концентрации НК.

Исключение составляет халазальная область, максимум НК в который точно соответствует максимумам в зародиае.Однако зта согласованность наруяается в период прохождения зародымем стадии автономности (10-11 день п.оц) Это позволяет говорить о том,что все структуры плодика лотоса функционируют согласованно в процессе развития.

Таким образом рассматривая совокупность описанных кри вых изменения концентрации НК в различных тканях иозно еде лать следув-цие заключения. .

Самая высокая концентрация НК отмечена в ткани зародыва (на сердечшидной стадии).В пределах зародыва больеуп концентрацию НК имеет почечка. Из тканей, окрциавцих

зародим, максимальную концентрации НК имеет халазальная об ласть, самую низкуп- срединные клетки нуцеллуса и эндосперма,

Интересным фактом является-наличие пнутри структур гра диента концентрации НК . В зонах с больвей физиологической активностью концентрация НК значительно выше ( например, в халазальной области и в зонах других структур, прилегающих к ней;е периферической зоне эндосперма) Кроив того при спав нении различных зон внутри одной ткани моано ответить, что во всех случаях более долгоаивуцимн является зоны с более высоким содергачием НК.Так, для нуцеллуса более долгозиву щиии являются клетки халазальной части, а для зндос-пермапериферической части, в которых, как уме было отмечено выое, концентрации НК намного превывают таковые з других зонах зтих тканей. Это мояно объяснить, исходя из функциональной значимости различных зон, Халазальная зона является зоной, через которую в зеро-дна поступавт питательные вещества, не обходимые для его роста и развития. Поэтому понятно, что уровень метаболизма в клетках этой зоны внве, чем в другихс одной стороны, и она функционирует дольше, чей микропиляр ная зона -с другой.Клетки периферической зон« эндосперма, по мнению Чочиа (1989), могут трансформировать вещества в форму,более доступную для зародыша.

Известно, что все ткани семяпочки (кроме зародняа и эндоспер-ка до стадии 5 дней п/оп) после оплодотворения растут б основном

растяненнем, а зоны делярхся клеток в них локальна или незначи- -тельны'по объему. Исключение составляет халазальная; область семяпочки, где митоткческая активность достаточно велика вплоть до конца исследуемого периода. Поэтому отмеченные колебания в концентрации НК ыоано связать с изменениями в белоксинтезируврй активности клеток данной ткани.

В связи с этим била исследована динамика белка в эмбри ональ-них структурах лотоса.

В результате исследования была выявлена динааика со держания белка в различных структурах плодика, а такие определенные зоны внутри структур, отличавшиеся по содержанию в них белка-.

Результаты исследования показали, что содержание белка во всех структурах и их зонах подвераены колебаниям, особенно ярко' выраженным в зародыше и перикарпии." По относительному содержанию белка наиболее богатой зоной оказалась.зона проводящего пучка, а затеы-халазальнаязона. Практически полное отсутствие белка обнаруживается в эндосперме, за ислючением периферических клеток, в которых, наоборот, содержание белка чрезвычайно высоко.

Чочка (1583), описывая клетки этой зоны как богатые содержимым, с развитым ЭР, выдвигает предположение, что в них происходил трансформация вецеств в форму, более доступную для зародыша.

В зародыше содержание бадка по мере развитья плодика имеет тенденцию к уменьшению, максимальное содержание белка в нем отмечается на концах лопостей растущей семядоли и в точках роста почечки.

Особый интерес представляют запасные белки, так как синтез кх . в развивающемся семени наряду с морфогенетическиаи процессами в нем является одним из основных факторов, определяющих метаболизм данного сенени.

Анализируя запасные белки плодика лотоса, мы выяснили, что основными запасными белками в нем являются солераствориыые белки-глобулины.

Спирторастворимые белки- проламины- в семени лотоса полностью отсутствуют, хотя серологические исследования Б1иоп (1970,1971) и морфологические исследования Титовой (1988) позволяли предположить наличие в лотосе также и этого типа запасных белков.

При изучении динамики растворимых белков (глобулинов и альбуминов) было показано что они присутствуй! во всех исследуемых структурах, начиная со стадии сформированной семяпочки (0 дней

п/оп) вплоть до 15 дня п/оп. Однако количество белка и его динамика в разных структурах различна.

Изменения содержания растворимого белка во всех структ урах имеют колебательный характер, и описываются, как правило, 3-х вер-гинной кривой, причем один максимум из 3-х зсагда сучественно больше остальных.В работе 01п е1 а1.(1989) описывается динамика белка в эмбриогенезе лотоса, в общих чертах сходная с полученной нами, но без пульсирующего характера кривой, что мояет быть связано с менее подробным ее анализом.

Сравнивая между собой максимум«, наибольшие в кагдой из описываемых тканей, можно отметить, что все они происходят-в период с 9 по 11 день п/оп (в зародыке - на 9-й день, во внутреннем иктегу-•¿енте - на 11, в наружном интегументе - на Ю-й-день И 6 плодовой оболочке - на . 9-10 дни п/оп). Морфологически зто соответствует стадии меяду закладкой 2-го и 3-го листовых примордиев (8 й 12 дни п/оп соответственно).

Несколько отличная картина происходит в эндосперяв, где нан-больЕий максимум отмечен на б-й день п/оп (после закладки прнмор-. дня 1-го листа), хотя на 10-й день п/оп такие имеется максимум.

Сравнивая различные структуры плодика по относительному (иг/г сырой массы) содержание белка, коано отметить наибольшее его со-дераание в наружном интегументе, где ка 7-й день п/оп оно составляет 15,3 мг/г с.м. В плодовой оболочке максимальное содержание белка приблизительно в.З раза ниве (5,22 мг/г.с.м.) и этот накси-нум приходится на !С-й день п/оп. 3 зародыме максимальное содержание белка составляет 3,4 мг/г. с.а. (9 день п/оп), однако на более ранний стадиях (б, 7 дни п/оп) зародив несколько превнвает плодо-вуо оболочку по содержания белка.

Сравнивая динамику относительного содержания НК к белка з прцессе эмбриогенеза, можно сделать вывод об изменений активности синтеза белка на разных стадиях развития.Так, анализ динамики этих веществ в зародаже позволил выявить корреляция между активацией синтеза белка и корфообразоЕгтельными процессам; формированием эмбриодермы, заложением примордиев 1, 2, 3 листьев почечки зароды-?а. Активация белкозого синтеза на этих стадиях происходит глзвннм стразом за счет увеличения количества рибосом з клетксх зародмса.

Из стадиях развития зародым. характеризующихся подготог- чой к физиологическим перестройкам. таким как:

- начальные этапы дифференциации глобулярного зародыяа, опрр-

дгяяваие всю будузув топографов его развития;

- становление кс-завискмостн зародыша от материнского организма по углеводному метаболизму;

- становление гормональной независимости заредыаа от материнского организиа,- такае происходит активация евнтзза белка, но В 'основном за счет увеличения Функциональной активности рибосом.

Таким образом, кош сделать вызод, что физиологические перестройки б клетках развивавшегося зародыма к корфообразовательные процессы в нем сопровождаются- различными типами механизма активизации белоксинтезиру*щей системы.Б случае комплексной ыорфофизио-логической перестройки используются сразу оба описанных механизм активации БСС,

Поскольку накопление запасных белков в самой зародыве является наиболее принципиалышн для понимания иорфофиэиологических процессов, происходящих в неь, нами были предприняты два дополнительных исследования:, иммунозлектофорез и ДДС-Na злектофорез бшксз зародыша лотоса.

Используя иммуиозлектрофорез было установлено что за пасныз белки, характерные для зародыша зрелого пледика начи каст откладываться в зародыше ка 14й день п/оп, как в семядо лях, так и в почечке. а следовые количества их отмечаются иве на 11 день после опыления.

Интенсивное накопление запасных белков происходит на 19 день • п/ап, после чего происходит дальнейшее увеличение его накопления вплоть до стадии зрелого плодима.

Зто согласуется со м^гчми литературными данным о той, что. отпохение запасных белков происходит на более поздних стадиях ( ■ Прокофьев f1968Э. Bain, Негсег, 1906).Однако,Соболеве 1985). обобщая большое количество работ по данному вопросу, заключает, что . есть ряд растений, у которых синтез запасных белков или их субеди-ниц начинается на самых ранних этапах развития семени.

При о.пектрифорезе белков, выделенных из.зародыша лотоса на различных стадиях его развития (7,10.11,15,20-25 дней после опыления), и из зрелого' зароднва были получены следующие результаты,

В зрело« зародыае ' представлйны в основном низкомолекулярные белки и отсутствуют белки высокомолекулярные. На ранних стадиях развития зародыша (7-15 дней п/оп.) присутствуют как низко-, так и высокомолекулярные белки. Сходная картина преобладания низкоыоле-кулярных белкоь в зрелом Зародыме, а высокомолекулярных - на более

- и -

■ ранних стадиях его развития отмечена и в других исследованиях СMandi et al,i5i?8: Dure et ai.i33S и др.)

Анализируя полученный спектр белков,мот выделить г яеч 4 группа белков. Белки, преобладание s зрелой се"?ни (43,5; о!,6; •3.6;17.3 кД), начинают накапливаться только при созревании зоро-дыиа, то есть »«являются в нчбольвнх количествах на 20-25-й день п/оп., но отсутствуют на более ранних стадиях.

Белки,содержание которых в зрелом семени второстепенно пп количеству, но та:;яе очень, существенно, начинают накапливаться на 7-10-й дань п/оп, к присутствует на всех исследованных стсдйзх зплоть до стадии зрелого зародяза, (40,5;15,0:14,! кД).*

Белки, присутствующие только на ранних стадиях (/,10, 11,13 дней п/оп.), за двумя исклвченкяни является вясококолекуяяр-нами: 94.0: 70,а; 07,0: 50,2; 50,1; 22.4: 13,2 кД).

Чатвертуя группу сзетавляат бе At: v., преобладающие Из 10 -11-1 день п/оп. (90,G; 94,0; 56,2; 47,9 кД), и етсушйунщиэ или практически отсутствующие на других стадиях.

Исключением из всех зт"» групп-ппляетса белок 20 кД. 1тот белок присутствует в значительном количестве на всех исследованная сташх:(?Л0, 11,15 дней п/оп. я з зрелой зароднве ), кромо стадии 20-25 дней п/оп., где он отсутствует. На стадиях 15 дней п/оп, « в зрелом зародите он является одним мз преобладавших белков.

Дзнннй анализ в сумм? с результатами, полученными метода» им-мунодиффузии, позволяет выделить определенные коитические периоды в развитии з?ро,1!1»а лотоса, Так, началом накопления запасных белков моано считать седьмой- девятый день после опыления, а стадией, на которой их синтез идет.особенно активно. - 20- 25-й день п/оп.

Иг стадии 10-11 дня п/пп. в зародыше лотоса происходит активней синтез белков, не связанна* с ф-учкциай запасания, Возможно, sto спззано с тем, что в этот период происходит становление автономности -зародим лотоса.

Динамика йБК была исследована с цветоложе; тканях завязи и интегумектах семязачатка до оплодотворения к в ззродние. эндосперме, интегументах и перикарпии - после оплодотворения зплоть до стадии зрелого плодика (приблизительно 30 дней п/о.и. То, что при определении P.DK мы не ограничились периодом морфообразосательнмк процессов в эародние, и прозодияи исследования вплоть до стадии зрелости, связано с известной из литературы спецификой этого гор-

иона, а такие с возможным влиянием его на синтез эапасннх белков, который; как было показано, происходит на Солее поздних стадиях эмбриогенеза. ■

Практически во всех исследованных случаях количество АБК в свободной и в связанной форме было л>:'о приблизительно равным, либо количество АБК в свободной форме превыиало его количество 8 связанной. Исключение составляет динамика АБК в тканях завязи до оплодотворения.

Полученные данные позволяют предположить, что подготов ка к процессу оплодотворения вызывает переход АБК из связанной формы в свободную в тканях завязи и транспорт ее в другие ткани развивающегося семизачатка.

В общем мокно отметить очень незначительное содержание АБК во всех структурах плодика как в свободной, так и в связанной форае, либо полное ее отсутствие (например, в эндосперме-в течение всего периода созревания плодика; во всех структурах плодика-на заключительных этапах его формирования вплоть до стадии зрелости, и др.)

В зародыше лотоса АБК обнаружено только наранних стадиях (2-5 дней п/оп.) и на стадии 17-20 дней п/оп.На остальных стадиях ЦБК в зародыае отсутствует, появляясь в очень небольших количествах и только в свободной Форме на 10-11 день п/оп.

Наличие ЙБК на ранних стадиях развития зародыма описано в литературе (Аскегзоп Я.С.,1384, Нзи, 1979 ), но в целом динамика АБК, описанная ь этих работах, иная. Кроме того, сопоставляя наши данные с известными из литературы об индукции синтеза запасных белков ПЕА-белкоз) семян гормоном АБК (Бошез е1 а1,1938;0иге е1 а!,1989 и др.), можно выдвинуть предположение о возможной взаимосвази появления АБК на 17-20 дни п/оп в зародыве с последующим (около 20 дня п/оп ) началом интенсивного синтеза запасных белков в нем. в тоже время, появление ЙБК в.зародыае в сеободной форме ка 10-11 день п/оп также коррелирует с возникновением в нем белков, характерных только для данной стадии и не являвшихся запасными.

Особый интерес представляет отсутствие АБК (как в свободной, гак н в связанной форме) во всех структурах зрелого, иокояцегося плодика. Как правило, именно в зрелых, покояцихса семенах большинства растений обнаруживается максимальное содержание этого гормона ( Дерфлинг.1985; Кефели,1989 и др.). Берестецкий и др. (1985) отмечают, что АБК в процессе созревания накапливаеися не только в покоящихся семенах, но и'в семенах не обладавших физиологический

покоем, хотя и е небольших количествах. К полному созреваннз количество ОБК у этих семян подает до низких значений, но не до нуля.

Возможно, именно отсутствием ЙЕН в зрелых плодиках обьясняет-сд их удивительная низнеспособнесь после нескольких сотен или тысяч лет хранения (Ohga.1923). В связи с этим нами было предпринято дополнительное игследование гормональной регуляции хранящихся I и 8 лет плодиков ( содержание в них АБК и цитокининов в свободной и связанной форме). Полное отсутствие обоих гормонов позволяет предположить, что жизнеспособность плодиков лотоса связана в первуш очередь особенностями их гормональной регуляции.

При исследовании локализации и динамики растворимых углеводов в"структурах плодика лотоса установлено, что их-качественный и количественный состав варьирует в зависимости от типа структура и от стадии развития.

Во всех изучаемых тканях обнаружены фруктоза, глакоза и сахароза. Кеныге распространена рамноза - она встречается а основной в эзродиве, наружном интегументе и плодовой оболочке, а в эндоспермы и внутреннем интегументе ее киличество очень незначительно и отмечено лиаь один раз за весь исследуемый период. Еце меньве распространена арабиноза - она обнаруживается Лиыь в плодовой оболочке, в зародыше на поздних стадиях м дважды - в наружном интегументе, причем количество ее во всех структурах очень мало.

Во всех вариантах динамика Содержания Сахаров в зависимости от стадии развития описывается многовершинной кривой.

Колебательный характер изменения содержания Сахаров опи сан для развивающихся семян и плодов многих растений (Stoddart.1964; Tanner et al., 1968; Meredith. Jenkins, 1973:Schubert. Radecke.1957).

При сравнении изменения содержания Сахаров в каздой структуре видно, что в больвинстве случаев положение максимумов всех пяти Сахаров одинаково для данной структуры, но различается между структурами плодика.

Так, в зародызе максимума соответствуй 8 и 11 дням посяе опыления - для всех Сахаров и 13 дне п/оп - для части из них (О день - стадия закладки 2-го примордия, 12 день - стадии закладки 3-го примордия).

Интересно, что различные структуры плодика отнечавтея по тону, какой сахар в них является преобладавшим. хотя это в достаточ-

ной степени условно.

Так. для зародыша, эндосперма и плодовой оболочки преобладзя-киии. являются глюкоза и Фруктоза, для наружного иптегумента -Фруктоза и сахароза, для внутреннего интегумента - глюкоза и сахароза.

Сравнивая относительное содержание Сахаров (в «г на г. сырой массы) в разных структурах можно отметить наибольшее количество всех Сахаров в зародыше на 7-8 день п/оп. Однако в среднем (по всей стадиям) для всех Сахаров характерно большее содержание их в нарузном.интегукенте, и *гньшее и приблизительно одинаковое количество в зародызе и п.половой оболочке. Исключение составляет сахароза, содержание которой о зародыше значительно превышает таковое в плодовой оболоч.:е. Сравнивая количества различных Сахаров между собой в структурах ллодика, кожно ответить, что в средней (из всех стадий) больше всего в плодике содержатся фруктозы , несколько меньше глюкозы и eçe аеныш. сахарозы . Содержание арабинозы и рай-козы гораздо меньше, чем этих 3-х сахарой.

Особый интерес предстазлает изучение сахарозы, которая явяс-етез транспортной Шоркай углеводов в растении. Во-первых, количество ее последовательно увеличивается, сначала в плодовой оболочке, затем'в покровах семени, и затей в зародыше - перед каждки максимумом содержания сахарен в нем.

Во-вторнх, максимума С'ЖьПзн'в зародаше каждый раз предшествует дифференциаций примордиев листьзь почечки. Так, максивукн сахарозы приходятся на 4, 8 и ¡1 дни п/оп, а Дифференциация прикор-диев 1-го, 2-го к 3-го листа почечки - на 5-й, 6-9-й и 12 дни п/оп соответственно.

Это согласуется с данными Бутенко (1S75) и йдавз et al «'ÎS73) о регуляторной роли зтого сахара в дифференцйровке клеток.

При изучении локализации и динамики крахмала в эмбриональных структурах лотоса било показано наличке з них двух форг крахмала: первичного (ассимиляционного) и вторичного (запасного) крахмала: откладывающегося в форма крахмальных зерен. Сравнение гистохимических и биохимических данных да*о возможность выявить баланс между эти формами крахмала в разных'структурах на разных стадиях развития плодика.

В частности,б зародыше первичннй крахмал начинает накапливаться с S-ro дня п/оп. а на 9й день Von честь'его начинает откладываться е виде крахмальных зерен.Интересно отметить большее.

чем в зароднзе в целом, содержанке крахмальных з'ерен в почечке и на концах лопастей семядоли, т.е. в местах с активными митотнчес-кими делениями.

Кроме того, было ' показано наличие первичного крахмала в эндосперме и нуцеллусе на 2-4 дни п/оп , в то вреая 'как гистохимическое изучение препаратов не вихляло крахмальных зерен в этих стриктурах,что совпадает с литературными данными (Батигина и др. 1333).

С точки зрения баланса разных адрм крахмала особо выделяется период с 9 по 11 день п/оп. На 9 день в зародыше и перекарпии происходит возрастание крахмала в первичной форме при кебольном количестве крахмальных зерен. На 11 день происходит снижение содержания крахмала, выявляемого биохимически, в этих структурах, при существенном увеличении крахмальных зерен в них. Зто моает говорить о том, что в период с 9 по 11 день п/оп большое количество крахна-ла синтезируется не для дальнейшего запасания, а для непосредственного использования зародышем в этот период. Сходнув закономерность можно отметить и в перикарпии на 4-5 день п/он. Оба описанных периода, кроме того, скоррелированы с появлением в клетках ха-лазальной области и проводящего пучка зерец крахмала, практически не обнаруживаемых в другие периоды.

Обобщая полученные данные, мсано отметить следующее. По относительному содержании крахмала( мг/г. сыр.массы) структурой, наиболее богатой им, является наружный интегумент.

Структуры семяпочки, выполняере'плательнуэ функция (эндосперм, нуцеллус) содержат крахмал на ранних стадиях развития заро-дыиа, когда накопление крахмала в нем самом отсутствует.

К моменту же отложения крахмала в зародыше (7-8 днл п/оп) содержание его в эндосперме равно нулю (и зто не изменится вплоть до конца наблюдений), а нуцеллус почти полностью разрушается,

В других структурах, окружающих зародыш (внутренний интегу-мент, наружный интегумент, плодовая оболочка) наиболее'интенсивное накопление крахмала наблюдается з период 10-11 дней п/оп. Интересно, что в зародызе в этот период, наоборот, отмечается спад содер-нания крахмала между двумя иаксикунл.';; 3-го и 12 дней п/опылення (стадия закладки 2-го н 3-го лист.: попочки соответственно),

В результате проведенного исследования можно охарактеризован критические периоды в эмбриогенезе лотиса,описанные в работе Бати-

гинпй и др.(1983) В то ке время,кетаболизм развивавшегося организма достаточно слоаен, и протекание взаимосвязанных прямо или косвенно процессов, мо«ет различаться по скорости, и, следовательно, пп ппловенип максимумов. Поэтому на основании проведенного, достаточно общего биохимического исследования, трудно выделить с точностью все критические периоды развития зародыша, за исключением наиболее важных, затрагивавших сразу практически все стороны «из-недеятельности зародыва.

Первый критическим периодом является заловение эмбриодермы (2-й день п/оп), характеризующееся значительной активацией синтеза белка.

Вторым критический периодом является переход от глобу лярной к сердечковидной стадии развития, т.е. инициация 2-х лопастей се-недоли-З-й день п/оп.Он коррелирует с ¡максимумом концентрации нуклеиновых кислот в зародыше: одним из максимумов содержания растеорииого белк<з в заредыве: одним из максимумов содержания крахмала в структура?, окруяашщих зародые; ваксимуаами содержания практически всех Сахаров в Оолыинстве изученных структур плодика.

Следующей валкой критической фазо?. является торпедовидная стадия! 5 дней п/оп). Эта фаза.характеризуется следующими параметрам: - семя приобретает способность расти в культуре на безгормональной среде (Васильева,Батнгнна , 1981): - в зародыне дифференцируется прммордий 1-го листа почечки.апекс корня, формируется проюдяцэя система в семядоле; - наблюдается максимальная относительная скорость роста зародкяа; - и максимума содериания практи-. чески всех Сахаров почти во всех изученных структурах плодика.

Четбертнк критическим периодом ыоано считать дифференци ацяз примордия 2-го листа почечки.(8-ой день п/оп. )При этой отмечаетей второй максимум содержания нуклеиновых кислот в зароднае к макси-. «ум суммы Сахаров в нем.

Наиболее йрко выраяенным является критический период, соответствующий формирование пластинки первого листа почечки, т.е. началу процесса органогенеза.(9-11 Д!'яа после опыпения). В это время в зародыве происходит становление автономности, то есть независимости его от материнского организма, что вирзгается в его способности продолгать рост и развитие и.? безгормональной среде в культуре ¡п уИго. Впервые это било показано ь работах Ратнгиной, Васильевой (1979). Проведенное исследование, покрало, что в этот период времени отмечайте? максимумы содераания практически всех изу-

ченных вечеств.При этой содержание растворимых белков и крахмала ииеет ярко выраженный максимум практически во всех структурах плп-дика,причем наблюдается переход крахмала из запасной его формы з первичнуз.Кроме того,в зародыие в этот период (10-11 день п/оп) происходит синтез определенных белков, харктерных только для данной стадики.Гормон ЙОК, отсутствующий в зародыие как до, так и после этого периода, также появляется в нем именно на 10-11 день п/оп.И. наконец, в период с 9 по 12 день п/оп происходит наруаение согласованности изменений концентрации нуклеиновых кислот в зародыше и в халазальной области, которая связывает его с тканями материнского организма. Это говорит о том, что в зародыие-в этот период происходят процессы, в результате которых он становится в некоторой степени независимым.от метаболизма материнского организма. Интересно отметить. что по литературным данным (Яковлев, Жукова, 1973> почечка зародыша приобретает в этот период йелто-зеленуз окраску, что свидетельствует о начале синтеза хлорофилла в пластидах почечки.

Проведенное нами пополнительное исследование показало, что Фотосинтез в почечке развивающегося зароднша 1п vivo идти не мояет из-за недостатка освещения. (Toyoda,1960), Таким образом, весь комплекс наблюдаемых морфофизиологических 'изменений не является следствием перехода на автотрофный тип питания, а наоборот, предваряет его. ■

Шестому критическому периоду' соответствует стадия зало жения примордия 3-го листа почечки;(12 дней п/оп.) Она характеризуется: - третьим максимумом концентрации нуклеиновых кислот в зародыве; -максимумом содержания крахмала в зародыие; - максимумами содержания белка, крахмала и растворимых Сахаров в окружающих зародив структурах.

Седьмым критическим периодом, не выделенным морфологи чески, можно считать стадию 17-20 дней п/оп, когда в зародыие начинается активный синтез запасных белков, скоррелированный с возникновением в нем АБК.

Корреляции в изменении нуклеиновых кислот,белка, крахмала, Сахаров и ОБК в различных структурах плода позволяют говорить о том, что весь плодик лотоса представляет собой единую смииув интегрированную систему (Uasilyeva et al.,1987).

2.3 Норфофиэиологические корреляции, полученные на модельной системе Daucus carota L

Активность работы белоксинтезирукщей системы

На основании многих исследований суспензий.культуры моркови было показано, что клёточная фракция, содержащая клетки и агрегаты клеток размером менее 120 мкм, обладает болыим эмбриогенным потенциалом, чем крупные конгломераты, клеток размером более 120 мкм. При соответствуюцем фракционировании исходных клеточных- суспензий, обладающих змбриогенньш потенциалом 0,01 - О,IX, эмбриогенный потенциал клеток отобранной фракции (< 120 мкм) повивался до 12 (Ио-исеева, 1981; Маг1 . 1980;.Fujlaura. Konaiine, 1979; Giuliano et al. 1983).

Нами была исследована, функциональная активность полисом в клеточных суспензиях г различным змбриогснннм потенциалом, а такие в мелкоклеточной и кр^пноклеточной фракциях этих, суспензий на 14-ый день после субкультивированна на среде, содержащей 2,4-д. Результаты исследований показании, что активность полисом в мелкоклеточной (с высоким 31'бриогенным потенциалом) фракции эмбриогенной суспензии значительно вы«е( в 44-4.7 раз), чек в крупноклеточной Фракции этой ве суспензии. D то же время в незмбриогенной клеточной суспензии разницы между активностью полисом, • выделенных из мелкоклеточной и крупно-агрегированной фракции практически не было, причем активность трансляции этих полисом близка к таковой в крупноклеточных агрегатах змбриогеннсй суспензии.

Таким образом, нави данные позволяют говорить о том. что клетки, потенциально способные к энбриогенетическиу процессам, но еще не приступившие к ним в виду отсутствия соответствующих условий, в присутствии 2,4-Д характеризуются значительно более высокой трансляционной активностью, чем клетки, значительно менее способные и совсем не способные к эмбриогенезу.

Клячко (1985) показала, что регуляция синтеза белка в клетках может осуществляться с помочью одного из следуврх механизмов или их сочетания:

1) за счет изменения содержания рибосом без изменения их активности в синтезе белка; '

1) за счет изменения доли активно работающих рибосомполисом

3) за счет изменения функциональной активности рибосом, Проведенное нами исследование показало, что увеличение активности синтеза белка в клетках, способных начать змбриогенети-ческие процессы, происходит за счет изменения функциональной активности рибосом без изменения общего содериания рибосом в клети-, и без существенных изменений доли активно работающих рибосом. Так, доля полисом во всех исследованных группах клеток было примерно одинаковой и составляла приблизительно 46-522.

Исследование активности полисом, выделенных из соматических змбриоидов на глобулярной стадии, показало, что она такае во много раз выие, чем во всех группах клеток, не способных или кало способных к эмбриогенезу, но немного (в 3,48 раза) ниже, чем у мелких клбток змбриогенной суспензии, "готовых начать -эмбриогенние процесс!;".

De Urles et al (1988), Hilde et al (1988) сообчаит, что при трансляции In vitro тотальной клеточной м-РНК и последующем анализе продуктов было выявлено очень небольшое число продуктов трансляции , присутствующих в эмбриогенных клетках и не присутствующих в незмбриогенных. В соматических зародышах на глобулярной стадии такие появляются только два новых белка.

Таким образом, моано сделать вывод, что подготовка к эмбрио-генетическим процессам заключается не столько в смене популяций м-РНК, сколько в обцей активации трансляции, которую вряд ли моано связать исключительно с трансляцией специфических генов эмбриогенеза. То ае самое справедливо и для морФообразовательных процессов на ранних стадиях соматического эмбриогенеза.

Динамика и роль гликоконъюгатов в эмбриоидогенезе

. При исследовании связывания с рецепторами клеточной стенки двух различных лектинов, связывающихся с разными рецепторами, были выявлены следующие закономерности: количество макнозных и глюкоз-ных (10:2) рецепторов, связывавшихся с Кон ft, возрастает в клетках, в которых происходят или долины произойти процессы дифферен-цировки. Так, основная масса каллуса до индукции эмбриоидогенеза обнаруживает значительно меньиее количество этих рецепторов, чем после индукции. В ти ае время меристематические очаги, заметные ь каллусе до индукции и даюцие впоследствии эмбриоиды, обнаруаивлпт каиеииальнр яркость свечения в лпмииесценпш микроскопе , чм

соответствует наибольиему из рассмотренных числу рецепторов в клеточной стенке. Единичные клетки ни до, ни после индукции не имеют свечения, а двухклеточнне змбриоидн светятся достаточно интенсив-, но, что монет служить подтверждением идеи, что ыаннозные (глюкоз-ние) рецепторы играют решающую роль в передаче информации между клетками, и как только этих клеток становится больве одной, они становятся необходимыми.

В двух- и четырех-иестиклеточных змбриокдах их количество (яркость свечения) возрастает, достигал максимума на стадии 8-12-клеточного змбриоица . Затем на следующей стадии (16 клеток) - снова слегка снижается и снова возрастает до максимума на стадии 32-хклеточного энбриоида, ка которой, повидимому, в клетках эыбрк-оида начинается заложение знбриодермк, которая визуально становится видна на следующей стадии (глобулярный змбриоид с эмбриодер-мой).

В случае аномального развития на этой стадии, когда глобулярный зародив продолжает свой рост, но дифференциации не присходит и мы наблюдаеа крупный глобулярный зароды» без змбриодермы, количество маннозных .рецепторов резко падает . .

Все это может говорить о мм, что именно процессы детерминации ь клетках^ приводящие к гндсления определенной части их' 5 ткани, отличаюцейсвя по своему морфогенезу от остальных клеток, нуждаются в активном обмене информацией ыежду клетками, и это, ь своа очередь,приводит к увеличению ;:пгла маннозных (глюкогных) рецепторов на их поверхности.

В дальнейшем, на глобулярной к сердечковилной стадиях набяв-дается небольшое уменьзьние свечения всего зародыва, но при этой максимальное свечение в тех областях, которые сопровождается активными морфогенетичсскими процессами - в межклеточных контактах между змбриодермой н субэкбриодерырй и в точках роста сердечковид-ного ггродыяа.

Все это подтверждает тезис о тон, чтовозрастакие. ианнозных (глюкозных) рецепторов клеточной стенки связано с детерминацией эмбриогенетических процессов и играет важную роль в обмене необходимой информацией между клетками..

К сожалению, объяснить этими же причинами максимум содержания этих рецепторов в 8-!2- клеточном эмбрио'иде трудно,так как впоследствии видимых морфологических изменений мы не наблюдаем. Тем не менее можно преодполохить. что данная стадия является критической

для зарсдааз в плане общей детерминации гсего его дальнейшего змб-рногенетического пути,когда закладывается программа согласованного координированного развития всех частей зародим и поэтому обмен информацией между ними особенно важен.

• Совершенно икая картина наблюдается в отношении галактозных рецептороь, связывающихся с лектином арахиса.

Прежде всего необходимо отметить, что единичные клетки в данном случае.обнаруживают свечение ( в отличие от рецепторов Кон А) - слабое до индукции и очень сильное после нее. Затем по мере развития зародыша интенсивность свечения (то есть количество соответствующих рецепторов в клеточных стенках) постепенно падает и практически исчезает у 8-12-клеточного зародыша (у рецепторов Г.ин Й 6 это ге время идет возрастание их количества*вплоть до максимума). В дальнейшем также нокно наблюдать сходную зависимость в изменении количества этих двух рецептрорв от стадии к стадии ( то естьтенденция к увеличений количества одного рецептора сопровоида-ется уменьшением другого и наоборот).

При рассмотрении описанного вайе случая с аномальным развитием зародим, проявляющемся в росте без дифференцировки глобулярного зародииа, для галактозн:« рецепторов выявлена следующая закономерность. Зародыш? на ранней глобулярной с?адии (32 кл.) до выделения эмбрибдермн при окраске лектином арахиса делятся на две группы, одна из которых обнаруживает очень слабое свечение, а вторая - наоборот, очень сильное.

Образующийся на следующей стадии аномальный глобулярный зародыш такае обнаруживает очень сильное свечение. Этот факт можно интерпретировать следующим образом: аномальность в развитии детерминируется на стадии, предшествующей ее морфологическому проявлению, и уже на стадии внутренней детерминации клеток те из них, что впоследствии обнаружат аномальное развитие, имеют увеличенное количество галактозных рецепторов. В таком случае моашз говорить о тон, ' что гиактизные рецепторы ыоано в определенных случаях расс-угм'рРБать как маркеры аномального развития зародыша.

По-видииому, схпднмчи «е причинами вызвана и резкая разнородность каллуса как до, так и после индукции эмбриоидогенеза, проявлявшаяся при его фракции с лектином арахиса. Так, в среде обкару-ьч:&автся Фр.ииенти каллуса, практически не светящиеся.а такае го слаб-;ш и с сильным свечений«, что соотьетствует различному коли-•ячву млактозних рецепторов в клетках различных, ло-вида'лоид.

-22 -

уже различно детерминированных Фрагментов каллуса.

На тех стадиях эмбриогенеза, где дифференцнровка клеток \ тканей проявляется морфологически (глобулярная, сердечковидная), свечение основной массы клеток зароднма достаточно велико , чтс является сходным для обечх типов рецепторов. Но в отличие от иан-нозных (глвкозннх) рецепторов,- количество которых в дифференцирующихся клетках и тканях еще больше (см. выве), количество галактоз-ных рецепторов, наоборот, резко снижается именно при дифференциации эмбриодермы и в точках роста зародыва.

Все это мояет говорить о .тон, что существует корреляция между уменьшением количества галактозных рецепторов и морфогонетическнми процессами в клетках и тканях зародыша. Неорганизованный рост клеток наоборот, сопровождается увеличении их числа, а нормальный рост клеток зародыва без диффереицнровки - умеренным количеством галактозных рецепторез. ■

В целом полученные результаты хороко согласуется с литературными данными о роли различных ГК плазмолемми клеток эмбрионов животных. Во многих работах i'Rlou et al, 1986, Ponder, 1983, Луцик, 1989) показало, что накоп^-чие рецепторов Кон fi приводит к иному пути развития клеток, нежели*како пление рецепторов лэктина арахиса. ■ ' . .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования позволило выявить некоторое аор^офя-зиологичеекке корреляции ь развитии зародква. На модельной системе Kelunbo nucífera Saertn. in vivo оило показано, что изменений многих биохимических параметров в процессе эмбриогенеза описываются кноговервинныаи кривыми с максимумами и минимумами на определенных (критических) стади.т/ развития зародыва. Кроме того, на этой модельной системе били выявлены корреляции в метаболизме зародыва и остальных структур развивающегося плодика.

На модельной системе-суспензионног культуре клеток и эмбриои-дов моркови были выявлены Солее тонкие регуляторные механизмы развития, зародыва (эмбриоида) , а- такяе^ индукции эмриоидогенеза.

Необходимо отметить совпадение результатов, полученных на разных модельных обьектах при поноци различных методов в тех случаях, когда они относятся к общем закономерностям развития зародыва. Примером может слуяить исследование активности белоксинтезиругоцего

ппарата растений ъ течение эмбриогенеза Heluabo nucífera Saerth n situ и эмбриоидогенеза Caucus carota in vitro.

С помощью биохимических и гистохимических методов в зн брио-екезе лотоса била выявлена корреляция между морфообразовательными роцессами и активацией синтеза белка,происходящей за счет увели-ения количества рибосом в клетках зародыша. На стадиях развития ародыва, характеризующихся подготовкой к физиологическим перестойкам, также происходит активация синтеза белка, но в основном за чет увеличения функциональной активности рибосом.

Такая же закономерность была получена при исследовании индук-ии и ранних стадий змбриоидогенеза в культуре клеток моркови. При омощи метода трансляции In vitro было показано, что при приобре-ении клетками способности к эмбриоидогенезу происходит резкое величение функциональной активности рибосом без увеличения коли -ества рибосом в клетке и без увеличения доли активно работавших ибосои - полисом.- То se самое, хотя и в меньшей степени, наблюда-тся и на стадии глобулярного энбриоида.

Суммируя полученные результаты, ноано заключить, что физиоло-«ческие перестройки в клетках развивающегося зародыва и энбриоида морфообразоватедьные процессы в нем сопровоздаются различными ипами механизма активизаций белоксинтезирув'щей системы,

lia основании проведенного'исследования можно сделать следуйте выводы:

1, Изменения содержания НИ, белка, крахмала, растворимых са-зроз и гормона АБК во всех структурах плодика лотоса имеют пуль-трувщий характер, что вероятно, отражает сложный многоступенчатый зоцесс дифференциации зародыша.

2, На основании выявленных норфофизиологических корреляций ша характеристика основных критических периодов в развитии зарода лотоса.

3, Установлены дополнительные ( к известным ранее) морфофизи-югические показатели становления автономности зародыиаг лотоса.

4, Выявлены особенности динамики гормона АБК в плодике лотоса процессе его формирования и особенности гормональной регуляции )елого плодика, что может леват'ь в основе его длительной аизнес-)собности.

5, Отложение запасных белков в зародыше лотоса происходит в :новном на поздних этапах -знСрлогенеза, после завершения всех ор-шогенетических процессов в нем.

0.Физиологические перестройки в клетках развивающегося заро-дыаа и эмбриоида и морфообразовательные процессу в кем сопрововда-якя различными типами механизма активизации белсксйнтезируюцей, сигтеми.

7. Возрастание количества ианнозных гликоконъюгатов в клеточной стенке связано с нормальными зибриогенетическиии процессами, претерпеваемыми данными клетками, а возрастание количества галак-тозных ГК-с неорганизованным (или аномальный) ростом клеток.

8. Проявление эмбриогенных потенций клеток обусловлено значительной активацией работы белоксиктезирукщей сиистемы и специфическим содержанием П! в клеточной стенке.

Работы, опубликованные по теме диссертации.

1. Васильева В.Е., Морозова KJ, Батыгина т.б. Пространственная к временная координация роста, дифференциации и метаболизма в развивавшемся смени лотоса Тезиса докладов IX Всесоюзного совещания по эмбриологии растении "Гаметогенез, оплодотворение и зморио-ген?з семенных растений, папоротников и мхов" Кивпнев, Чтиница" 1986 г. стр.182-183. " . ' .

2. Uasiljeve U.E., Kolessva б.Е,, Horozova К.П., Ersakov Г. P., Chochla ' K.fi. Ties and :Jpace concordance cf the growth, differericlatlon and reproduction of the higher plants.// Sexual reproduction in higher plants, Springer-Verlag.Berliti-Heldelbgrg -He« York-London-París-Tokio,ÍJOB p.487.

3.Uasiljeve U.E., Kolesova 6.E., Horozova K.fi., 'Ereakov I.P., Chechia K.fi. Tiae and space concordance of the growth, diff'erenciatlon and aetaboliza in the developing seed of the Nelusbo nucífera Gertn// Tenth International Syeposlua on Sexual Reproduction in Higher Plants: Abstracts,-Siena.1988.-p.127.

4.Морозова Н.Й..Ермаков И.П.,Экспрессия генов в ргннеы эмбриогенезе растений (обзор). Новости науки и техники, Сер.Биотехнология. вып. И, 1991. C.f-39.

5.Korozo«a H.K..KoIseeva K.fi..Translation In vitro of pollsoaes fros enbryogentc and nonsBbryofeonlc suspension cultures of Caucus carota //flbstr. Xlllth Euearpia Congress, July S-li, 1932,Angers.France, p.363-364.

6.horozova N.K..Uasiljeve U.E. Endogenic phytooraone contents nature fruitlets of Nelunbo nucifera £.// Absír.Xíl lnt.Congr.on Sexual Plants Reproduction.. Ciluesbus, Ohu>. USA, 1932,p.4-5.

?.Морозова О.Связь эмбриологических процессов с работой бе-локсинтезирувщей системы растений//Тез.молод.конф, ботаников стран СНГ Актуальные проблемы ботаники". Апатиты, 1993,с. 30-91,

0,Морозова П.Н..Васильева 8,Е. К вопросу о длительной аизнес-яособности плодиков лотоса// Оот.журнал,1993, т.78, 8,ст.47-50