Изучение механизмов присоединения НеТ-А элементов к концу хромосомы у Drosophila melanogaster

Кан, Татьяна Геннадьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение механизмов присоединения НеТ-А элементов к концу хромосомы у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов присоединения НеТ-А элементов к концу хромосомы у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

УДК 575.22:595.773.4.

РГБ ОД

КАН ТАТЬЯНА ГЕННАДЬЕВНА , ,.......

Изучение механизмов присоединения НеТ-А элементов

к концу хромосомы у бкоборпна меытслбтея

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва

2000

Работа выполнена в лаборатораи регуляции генетических процессов Института биологии гена РАН

Научный руководитель:

Чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор ПХ. Георгиев Официальные оппоненты:

чл.-корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор Л.И. Корочкин, кандидат биологических наук Н.Г. Шостак.

Ведущая организация:

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Защита диссертации состоится "_3_" ноября 2000 года в 11.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334; Москва, ул. Вавилова, 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан " 3 " октября 2000 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

канд. фарм. наук

Е ОЧО-Лб^в

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Эукариоты имеют линейные хромосомы, концы которых образованы ДНК-белковыми структурами, названными теломерами. В последнее время появляется все больше фактов, свидетельствующих о многообразии функций теломер. Теломеры необходимы для правильной репликации ДНК концов линейных хромосом, они защищают концы хромосомы от деградации, препятствуют лигированию концов хромосом между собой, а так же предотвращают действие репарационной системы, узнающей двуцепочечные разрывы в ДНК. Недавно было показано, что укорочение теломер является одной из причин старения клетки. Образование раковых клеток также контролируется длиной теломеры. У большинства организм ов длина теломеры строго регулируется. Поэтому одной из важных проблем современной молекулярной биологии является изучение механизмов контроля длины теломеры.

У большинства эукариот теломеры состоят из коротких повторов и удлиняются с помощью специального рибонуклеопротеинового комплекса - теломеразы (Blackburn, 1990). Однако у некоторых насекомых в клетках отсутствует теломераза, а удлинение теломер происходит либо посредством генной конверсии, либо в результате транспозиции мобильных элементов. Так, у Drosophila melanogaster теломеры состоят из множественных копий мобильных элементов НеТ-А и TART, при этом НеТ-А элементы составляют 80-90%. Эти мобильные элементы относятся к классу ретро-элементов без длинных концевых повторов типа LINE (Biessmann, Mason, 1997 Biessmann et al, 1997). Элементы НеТ-А и TART располагаются на теломерах всегда в одной ориентации - "голова-хвост" (Levis et al., 1993). Существующие литературные данные предполагают, что удлинение теломер дрозофилы

происходит в результате транспозиции мобильных элементов (Biessmann et al., 1992а, Biessmann et al., 19926). На основе этой гипотезы был сделан вывод, что регуляция длины теломер определяется уровнем экспрессии НеТ-А и TART мобильных элементов. Однако известные экспериментальные исследования по определению частоты присоединений мобильных элементов к концу хромосомы, не позволяют сделать окончательных выводов как о механизме присоединения мобильных элементов к концу хромосомы, так и об их частоте. Одной из причин является отсутствие генетических систем для анализа частоты присоединения мобильных элементов к концу хромЬсомы.

Основной задачей данного исследования было создание удобных генетических моделей для изучения частоты и механизмов присоединения НеТ-А элемента к концу хромосомы. Полученные результаты позволили существенно изменить общепринятую концепцию механизмов контроля длины теломер у Drosophila melanogaster.

Цель работы

Основная цель данной работы состояла в изучении механизмов присоединения НеТ-А элемента к концу хромосомы.

Задачи исследования

1. Получение модельных генетических систем на основе локуса yellow для определения частоты и изучения механизмов присоединения НеТ-А элемента к концу хромосомы.

2. Изучение структуры НеТ-А элементов, присоединенных к концу хромосомы.

Научная новизна и практическое значение работы

В работе показано, что промотор гена yellow активен на самом конце хромосомы в случае терминальной делеции Х-хромосомы,

затрагивающей 5'-регуляторную область гена yellow, для его работы достаточно 70 п.н. до конца хромосомы. Показано, что ДНК З'-конца НеТ-А элемента длиной около 400 п.н., присоединенного к концу хромосомы с терминальной делецией, удаляющей промотор гена yellow, компенсирует отсутствие этого промотора. Эти факты были использованы для создания модельной генетической системы, которая впервые позволила визуально наблюдать и определить частоту присоединений НеТ-А элемента к концу хромосомы с терминальной делецией, имеющей проксимальную точку разрыва в районе локуса yellow, а также частоту увеличения числа копий НеТ-А элементов, присоединенных к концу хромосомы с такой терминальной делецией. Изучение структуры "новых" ДНК показало, что увеличение числа копий НеТ-А элементов на конце хромосомы происходит не только в результате присоединения мобильного элемента, как считалось ранее, но и с помощью других механизмов, таких как генная конверсия и рекомбинация. Результаты работы можно использовать при дальнейшем изучении механизмов регуляции длины теломер у дрозофилы, а также при исследовании белков, защищающих концы хромосом.

Апробация работы

Основные научные результаты диссертационной работы были представлены на конференции молодых ученых ИБГ РАН, Москва, 1999 г.; на 40-й и 41-й Ежегодных конференциях по исследованию на дрозофиле (Чикаго, 1999 г., Питсбург, 2000 г.); на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии", Пущино, 2000; на международной конференции "Актуальные проблемы молекулярной геиетики и клеточной биологии" ИБГ РАН, Москва, 2000 г.

Публикации

Материалы диссертации опубликованы в трех печатных работах.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на гр страницах, и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Библиография включает в себя источников.

Работа проиллюстрирована // рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Результаты

1. Получение модельной системы для изучения механизмов транспозиции НеТ-А элементов на конец хромосомы

Был определен минимальный размер 5' области перед промотором гена yellow, необходимый для его работы на конце хромосомы. С этой целью были выбраны терминальные делеции X-хромосомы с проксимальной точкой разрыва в регуляторной области гена yellow. Линии мух, несущих такие терминальные делеции, были названы jeZ/ow-terminal-deficiencies (yTD) (Mikhailovsky et al., 1999). Ген yellow расположен почти на самом конце Х-хромосомы, близко к теломере, но дистальнее его находятся жизненно важные гены, поэтому

7*0 7D TD

гомозиготные самки у /у и самцы у не выживают. Для сохранения хромосом с терминальными делециями их поддерживали в гетерозиготном состоянии с хромосомами, несущими делецию всего района yellowrac, но содержащими последовательности всех жизненно важных генов, удаляемых в уги. Отсутствие последовательности гена yellow на гомологичной хромосоме исключает возможность удлинения конца хромосомы с терминальной делецией по механизму генной конверсии, как было показано ранее (Mikhailovsky et al., 1999), т.к. для

ее инициации необходимо наличие гомологичной матрицы. В отсутствие гомологичной матрицы происходит лишь деградация двуцепочечного конца ДНК в результате концевой недорепликации, хромосома при этом теряет примерно 70-80 п.н. в каждом поколении (Biessmann and Mason, 1988; Biessmann et al., 1990a: Biessmann et al., 19906; Biessmann et al., 1992a; Biessmann et al., 19926; Levis, 1989; Sheen and Levis, 1994).

Были выбраны четыре линии с терминальными делециями, удаляющими 5' регуляторную область гена yellow, и, соответственно, энхансеры тела и крыльев. От точки начала транскрипции гена до конца хромосомы оставалось 300-400 п.н. (рис. 1). Мухи этих линий имели фенотип у2 (щетинки черные, тело и крыловые пластины желтые), т.е.

юнец

терминальной ~ делеции У

-32 П-н. -25пн АТАТАААА

ATG (+171п.н.)

У < -70П.Н. •70п.н* у"< -140 п.н. У2> -140 п.н.

?у

Выделение ДНК (6-8?)

+ t

?у"-»-?у'

+ I +

Выделение ДНК (6-8?)

Рис. 1. Промоторная область гена yellow на конце терминальной делеции X-хромосомы. (А) Схематическое изображение гена yellow на конце терминальной делеции. Указаны варианты фенотипов. Черным прямоугольником обозначен первый зкзон гена yellow. Представлена нуклеотидная последовательность и расположение промотора гена. Стрелкой изображена точка начала транскрипции. Указан первый кодон трансляции. Тонкими горизонтальными линиями обозначены районы yellow, в которых были картированы концы хромосом в линиях уТО, указаны соответствующие фенотипы. Толстой линией изображен фрагмент геномной ДНК ВатН\-Крп\, используемый в качестве зонда для Саузерн-блот анализа. Обозначения эндонуклеаз рестрикции: В - ВатН\, К — Крп\. (Б) Схема эксперимента по изучению корреляции между структурой ДНК и фенотипом yellow.

ген все еще активно экспрессировался в щетинках в результате активации промотора соответствующим энхансером, который находится в интроне гена yellow. Такие терминальные делеции были обозначены

л-угч ?7П

как у . Самок у /у ас скрещивали индивидуально с самцами у ас. Через несколько поколений среди самок с фенотипом у2 появлялись самки с вариабельной пигментацией щетинок (фенотип yv) в результате деградации последовательности ДНК на конце хромосомы (рис. 1). Самок / и их у2-подобных сестер индивидуально скрещивали с самцами у ас. В потомстве самок yv появлялись самки у и у; (тело, крыловые пластины и щетинки желтые), обозначенные как yITD. В следующем поколении все потомство приобретало фенотип у1. Молекулярную организацию 5' области гена yellow у мух с такими фенотипами изучали с помощью Саузерн-блот анализа. Результаты анализа показали, что у у2-подобных самок от точки начала транскрипции до конца хромосомы оставалось более 140 п.н., у у "-подобных самок - от 140 до 70 п.н., а у у1-подобных самок - менее 70 п.н. (рис. 1). Таким образом, для работы промотора гена yellow на конце хромосомы необходима 5' область размером не менее 70 п.н.

У самок у'т происходила дальнейшая деградация конца хромосомы, фенотип обычно не изменялся. Однако очень редко среди самок У™ возникали самки с фенотипом у2. Всего было получено Неподобных самок среди 6,900 самок yITD, просмотренных в течение трех поколений, т.е. с частотой около 2 х 10"3. Поскольку возможность удлинения конца хромосомы в результате генной конверсии в нашей генетической системе отсутствовала, мы предположили, что восстановление фенотипа может быть вызвано присоединением НеТ-А элемента на конец хромосомы. Полученные производные были обозначены как У™ (НеТ-А healed terminal deletions) и пронумерованы от 1 до 14.

Для подтверждения нашего предположения ДНК из этих у2-подобных мух была проанализирована с помощью Саузерн-блот гибридизации, Геномную ДНК гидролизовали экзонуклеазой рестрикции Nrul, которая имеет сайт узнавания в положении +1835 относительно точки начала транскрипции гена yellow и обычно не имеет сайтов узнавания в ДНК НеТ-А элементов (Biessmann et al., 19906; Biessmann et al., 1992a; Biessmann et al., 19926). Гидролизованную ДНК гибридизовали с фрагментом ВатШ-Kpnl из кодирующей части гена yellow (рис. 2А). Во всех линиях у'т бьш обнаружен дополнительный

1 т.п н.

НЕТ-А элемент j

CACCAGTCGT TACCGCGCCA CGGTCCACAG AAGAGGATTA ААААААТАТС ACACAGCCGA

AGGCTAGAGA AGAACCCCCT ATAGCTGAAC АТАТАТАААС

к. t +

ССААСАСАСТ TTGGCTTAAG TGTTAAGAGT GATTGTCAGC

АААТАТАТТТ TTTTTTATTG * ±

TTAGAGCTAA GTGCAATGTT

Рис. 2. Транспозиция НеТ-А элемента на конец терминальной делеции в гене yellow. (А) Схематическое изображение присоединения НеТ-А элемента к регуляторной области гена yellow. Черным прямоугольником показан первый экзон гена. Толстой линией изображен фрагмент геномной ДНК BamH\-Kpn\, используемый в качестве зонда для Саузерн-блот анализа. Стрелками обозначены праймеры, использованные для амплификации ДНК Обозначения эндонуклеаз рестрикции: В - BamHI, К - Kpn\, N - Nru\. (Б) Первичная структура транскрибируемой нетранслируемой области гена yellow. Изогнутой стрелкой отмечена точка начала транскрипции. Первый кодон трансляции подчеркнут и выделен жирным шрифтом. Маленькими стрелками обозначены места присоединений НеТ-А элементов. Большой стрелкой выделено место присоединения НеТ-А элемента в линии yhTD3. Одно или два адениновых основания могут принадлежать либо к последовательности гена yellow, либо к последовательности поли-А на 3'-конце присоединенного НеТ-А элемента.

фрагмент ДНК, примыкающий к ДНК частично делетированного гена yellow. Размер "новой" ДНК колебался в пределах от 1,4 до 6,6 т.п.н.

Для детального изучения участков присоединения НеТ-А элементов перекрывающие их фрагменты ДНК амплифицировали с помощью ПЦР. Была определена первичная структура таких фрагментов для восьми линий. Во всех случаях на границе между геном yellow и присоединенным НеТ-А элементом присутствовала последовательность поли-А. Последовательность нуклеотидов в НеТ-А элементе, следующая далее (5' CCTCCACCAGCAAAGTT 3'), была строго консервативна и подобна описанной ранее первичной структуре З'-конца НеТ-А элемента (Biessmann et al., 19906; Biessmannet al., 1992a; Biessmann et al., 19926).

В семи случаях присоединение НеТ-А элемента произошло в пределах короткого района длиной 32 п.н. (от +140 до +170 п.н.) непосредственно перед ATG кодоном гена yellow (рис. 2Б), и одно присоединение НеТ-А было обнаружено вблизи промотора yellow в положении +23 п.н.

Таким образом, З'-конец НеТ-А элемента компенсирует терминальную делецию промотора гена yellow, что можно наблюдать визуально по восстановлению пигментации щетинок. Этот факт был использован при создании модельной системы для определения частоты присоединений НеТ-А элементов к концу хромосомы. Поскольку при деградации конца хромосомы полный переход фенотипа у2 в фенотип у' у самок с терминальной делецией происходит в районе положения -70 п.н., а присоединение НеТ-А элемента проксимальнее +171-го нуклеотида (положение первого кодона трансляции) не восстановливает пигментацию щетинок из-за нарушения кодирующей части гена yellow, поэтому присоединение НеТ-А элемента можно определять визуально в

1TD

потомстве самок у , несущих терминальную делецию с точкой разрыва в интервале между -70 п.н. и +171 п.н. Так как хромосома укорачивается

в каждом поколении примерно на 70-80 п.н., то можно ожидать, что деградация последовательности в интервале от -70 п.н. до +171 п.н. произойдет в течение трех поколений.

2. Частота присоединений НеТ-А элемеитоп к концу терминальной делецнн в тень yellow зависит от генотипа линии

Описанную выше модельную систему использовали для определения частоты присоединений НеТ-Л элементов. Были взяты еще восемь независимых линий y2TD/y ас, которые имели терминальные делеции с точкой разрыва в районе 300 п.н. перед точкой начала транскрипции. Терминальные делеции в этих линиях произошли, как описано ранее (Mikhailovsky et al., 1999), от одиночных самок после скрещивания с различными лабораторными линиями, такими как y'w, у ас w, у ас или Oregon-R. Полученные таким образом линии не были изогенными.

Линии y2TD/y ас вели в течение нескольких поколений до перехода у2т/у ас з y'TD/y ас. Возникающих в результате деградации промоторной области у'-подобных самок скрещивали индивидуально с самцами у ас в течение трех поколений. Было просмотрено от 6,000 до 14,000 самок yITD в каждом поколении каждой линии (всего было просмотрено около 65,000 мух). Появление у2-подобных самок в потомстве самок yITD не было обнаружено ни в одной из восьми линий. Таким образом, частота присоединений в этих линиях была менее 0,2 х 10"5. Разница в частотах присоединений НеТ-А элементов к концам хромосом в предыдущем и настоящем экспериментах предполагает, что частота транспозиций НеТ-А элементов сильно зависит от генотипа линии.

3. Определение минимального размера ДНК НеТ-А элемента, необходимого для поддержания экспрессии гена yellow в щетинках

С этой целью, были выбраны две сублинии укТВЗ, несущие на конце Х-хромосомы с терминальной делецией примерно по 500 п.н. из З'-конца НеТ-А элемента. Самки таких мух имели фенотип у2. Переход фенотипа у2 в у1 был определен по схеме, описанной выше (см. п. 1). Самок с фенотипом у2 , yv или у1 отбирали для Саузерн-блот анализа (рис. 3). Из результатов анализа видно, что у мух с фенотипом у2 сохраняется более 400 п.н. от З'-конца НеТ-А элемента, а у мух с фенотипом у1 - менее 300 п.н. (рис. 3). Таким образом, для поддержания нормальной экспрессии гена yellow в щетинках необходима ДНК НеТ-А элемента длиной более 400 п.н.

НЕТ-А элемент

1 т.п.н.

У < 300 п.н. 400 П.Н. > yv > 300 п.н.

?У

Выделение ДНК (6-8$) t t

?У

2 - ¥У*-i

■ЧУ

?У"-* ¥У'—*-?У \ i \ Выделение ДНК (6-8?)

У" > 400 п.н.

Рис. 3. Минимальный размер З'-конца НеТ-А элемента, который необходим для компенсации делеции промотора гена yellow на конце хромосомы. (А) Схематическое изображение компенсации делетированного промотора гена yellow последовательностью З'-конца НеТ-А элемента. Указаны варианты фенотипов гена yellow. Черным прямоугольником обозначен первый экзон гена yellow, а светлым прямоугольником - НеТ-А элемент. Тонкими горизонтальными линиями обозначены последовательности НеТ-А элемента, в которых были картированы концы хромосом в линии у"703, указаны соответствующие им фенотипы. Толстой линией изображен фрагмент геномной ДНК ВатИ\-Крп\, используемый в качестве зонда для Саузерн-блот анализа. Обозначения эндонуклеаз рестрикции: Н - Sph\, В -SamHI, К - Крп\. (Б) Схема эксперимента для изучения корреляции между длиной концевого НеТ-А элемена и фенотипом ye/fow.

4. Удлинение концов хромосом, несущих НеТ-А элементы

Для наблюдения за поведением ДНК НеТ-А элемента, присоединенного к концу терминальной делеции, были выбраны четыре независимые сублинии yhTD3, обозначенные буквами А, В, С и D. В начале эксперимента все четыре сублинии несли примерно по 400 п.н. от З'-конца НеТ-А элемента, присоединенного к последовательности гена yellow в положении +152 п.н. и, как результат, у2-подобный фенотип. В этих сублиниях отбирали возникающих j'-подобных самок (yhTD3/y ас) и скрещивали индивидуально с самцами у ас в течение трех последовательных поколений. Было просмотрено около 14,000 мух каждой линии (всего было просмотрено 53,500 мух). Во всех сублиниях появлялись самки, имеющие ^-подобный фенотип, причем эти события возникали и как одиночные (31 событие), и пучками (10 событий). Таким образом, средняя частота этих событий составляла примерно 0,8 х 10"3.

Из потомства отобранных самок у2 была выделена ДНК и проведен Саузерн-блот анализ. Для гидролиза ДНК использовали следующие эндонуклеазы рестрикции: Крп\ и EcoRl (имеют сайты узнавания на 3'-конце большинства НеТ-А элементов), Spei и EcoRV (имеют сайты узнавания в центральной части НеТ-А элементов), и Nrul (не имеет сайтов узнавания в НеТ-А элементах). Транскрибируемая часть гена yellow имеет сайты узнавания для всех указанных эндонуклеаз вблизи места присоединения НеТ-А элемента (рис. 4). Фрагмент ВатШ-КрпI из гена yellow использовали в качестве зонда (рис. 4).

Во всех случаях было обнаружено увеличение размера НеТ-А элемента на конце хромосомы. В большинстве случаев "новая" ДНК имела сайты узнавания для Крп\ и ЕсоШ на З'-конце, что является типичным для З'-конца НеТ-А элементов (рис. 5). Размер "новой" ДНК

1 т.п.н.

hl hl

HET-A олемент

В E SK

H N

Рис. 4. Удлинение ДНК концевого НеТ-А элемента. (А) Схематическое изображение увеличения длины НеТ-А элемента на конце терминальной делеции. Белым прямоугольником изображена ДНК оригинального НеТ-А элемента, присоединенного к гену yellow в линии yhTD3l а серым прямоугольником - "новая" ДНК. Черными прямоугольниками обозначены экзоны гена yellow. Указаны положения сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции в ДНК гена yellow, использованных для Саузерн-блот анализа. Обозначения эндонуклеаз рестрикции: В - ßamHI, Е - EcoRV, S - Spei, К -Kpn\, Н - Sphl, N - Nru\, R - EcoRI. Стрелками обозначены места расположения праймеров. Толстой линией изображен фрагмент геномной ДНК ВатН\-Крп\, использованный в качестве зонда для Саузерн-блот анализа.

колебался в широком диапазоне - от 0.7 т.п.н. до 20 т.п.н. и более. В случае больших присоединений определить размер "новой" ДНК оказалось невозможно из-за ограниченной разрешающей способности Саузерн-блот анализа. Все события были разделены на два класса исходя из размеров "новой" ДНК: 1 - от 0,5 до 10 т.п.н. (рис. 5А); 2 -более 10 т.п.н. (рис. 5Б).

В пяти пучках индивидуальные линии у2 имели идентичную рестриктную карту в пределах каждого пучка. Это указывает на то, что удлинение конца хромосомы может происходить на премейотических стадиях в клетках зародышевого пути.

Таким образом, вторичное удлинение ДНК НеТ-А элементов на конце хромосомы перед геном yellow можно также наблюдать визуально по восстановлению пигментации щетинок, что дает возможность для изучения механизмов этого процесса.

5. Механизмы удлинения концов хромосом

Для изучения механизмов удлинения концов хромосом фрагменты ДНК, перекрывающие точку перехода исходного НеТ-А

A L

S.N.E,R

E.S.N ■

(ВИЧ

E.S.N«

(6кЬ)

S.E.R«

(7U>|

S.E.R«

(7k»|

S.E.R«

171«

N,E

(9W>)

N.E.S

(Skb)

N.E.S

(5MJ>

N.S.E ■

n.r.e-

RK I I

N.R.E -

N,R -N,R N,R ■ N.R

N.E.R E.R.N -N.E.S —

S.N.R

N.E.S -

R К

_l_L_

R К

1A2

2АЭ2 2A4 2A11 3A12 3A13 3A4 1D1 1B2 3B1 382

3B31 3B32 3B33 3B34 3B4

1C1 1C2 2C2 2C3 3C4 1D11 1D12 1D2 1D3 2D1

S,E «1—

(16« to)

S.N.E «—

(15Л2Ч H4 |

S,E «— (12« kb) | 5,E -«—

(12J6K&)

E (12 to)

S.N.R ■*—

(15/12/B tof

S.E.N •*— раклщ

E,N «—

(16« kC) £

E,N ---

(20/10 kb) p g

E «I--1-

(15 to)

E.S.N

(20/10/13 Kb)

E.S.N

(20/1V13U))

S,E (20 kftf

(I3kb>

S.N.E

(15/ачкЬ)

R К

1A1 1A3

3A3 1b3

2D2 2D3

Рис. 5. Рестриктные карты ^-подобных производных линии yhTD3, полученные на основе данных Саузерн-блот анализа. Производные из одного пучка объединены вертикальными линиями. Начало карт соответствует положению сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции BamHI в гене yellow, расположенного на растоянии 39 п.н. от места присоединения НеТ-А элемента в линии у" . Представлены рестриктные карты присоединений

ДНК определенного размера (А) и неопределенного размера Обозначения эндонуклеаз рестрикции такие же, как для рисунка 4.

(Б).

элемента в "новый", были амплифицированы с помощью ПЦР. Для амплификации использовали два праймера из ДНК гена yellow и два праймера из ДНК НеТ-А элемента, расположенные в консервативном районе между положениями 330 п.н. и 460 п.н. относительно его

R К

350 Т6СС*СССССТАССТОААААТАААТС*ААТСАААСААТвТТАСТСТТААА ЬТИЗ

^ АССТСААААТАААТС*ААТСАААСААТ6ГТАСТСТТААА ЗА4

ТССС*СССССТАССТСАААА*дААаСаААТ1АААСААТаТТАаТСсТААА ЗС4

ТСССдСССССТАССТаАААА*дААТС*ААТСААдСААТСТТА6ТСТТААА ЗВ2

300 ТСТТААТСТТТТТ*СТААААТТАТТТАААТТСТТААААССТАААСАААСС ЬТЭЗ

ТСТТААТСТТТТТ*СТААААТТАГТТАААТТСТТААААССТАААСАААСС ЗА4

TtTcAATGTTTTTtGTAAAATaATTTAAATTGTT*AAAtGTAAACAAgCC ЗС4

TaTcAATGTcTTTgGTAAAATaATTTt*ATTtaTAAAAtGTAAACAcAaC ЗВ2

250 СТССААТАТСАТТАТетТАССА5АССАТСТТАСТСТСТААДАССТАА*СТ ЬТОЗ

СТ6СААТАТ6АТТАТСТТАССА9АССАТСТТАСТСТСТААААССТАА*СТ ЗА4

-► ТСТААААССТАА*СТ 201

«6СААТАТС1;ТаАТСТТАССА61:ССАТСсТАСТ6ТСТААААССсАА*6а ЗС4

аТаСААТдТСАТаАТ6ТТАССАС^САТСГТАСТСТСдААААсСсАА1СТ ЗВ2

200 ТТАСАААААААААААААТАСТ*А*ТТТТАСАААСТААТТСАССА****** ЬТЭЗ

Т Т АС ААААААААААА * *ТАСТ*А*ТТТТАСАААСТА1;ТТСАССА* ***** ЗА4

ТТАСАААААААААААА* ТАСТ * А * * аТТА! АААСТААсТСАССА* ***** 2Э1

а Т АС АААААА * ****** ТАСТ* А* *aTTAtAAACTAAcTCACCA* ***** ЗС4

ТТАСААААА* ****** *TACTtAcTTTTA*AtAtTAAT* *ActAaatcta ЗВ2

150 ССТССАТАССССАААСТСАССССАТСТААТСГААСАСТСАААААСТСААА ЬТЭЗ

CGTCCATACCCCAAACTCACCCCATGTAAcGTAACACTCtAAAACTCAAA ЗА4

CGcCCAagCCCCAAACTCACCCCATGcAATGTtAaACctAtAAAtTCAgA 201

CGcCCAacCCCCAAACTCACCCCATGcAATGTtAaACctAtAAAtTCAAA ЗС4

tGTCCAatCCCCAAACTCACCCCAcGcAATGTA*CtCTCAAAAAtTCAAA ЗВ2

100 ТААТТСТАССТАТАТАТТбСАСССАСТСТААТСАААВССААААТАААТАС ЬТБЗ

ТААТТСТАССТАТАТАТТССАСССАСТСТААТСАААавСААААТАТ^АТАС ЗА4

TAATTGTACCTATATATTGCACatACTGTAATCAAAGGCAAAATAAATAG 201

TAATTGTACCTATATATTGCACatACTGTAATCAAAGGCAAAATAAATAG ЗС4

TtATTGTACCTAcATATTGCAtaCtaTGTAATCAAAGGCAAAATAAATtG ЗВ2

50 ТССАТССССААСАСААТТТАТТСТСТСТССвТАССТССАССАССАААНТТ (А13) ЬТОЗ

ТСвАТСССвААСАБААТТТАТТСТвТСТССвТАССТССАССАССАААСТТ (А13) ЗА4

ТССАТССЕСААСАСЗААТТТАТТСТЙТСТСССТАССТССАССАССАААвТТ (А13) 201

ТБвАТССССААСАбААТТТАТТСТвТСТСССТАССТССАССАССАААСТТ (А13) 3С4

ТввАТССС<ЗААСАаААТТТАТТСТСТСТССвТАССТССАССАССАААСТТ (А13) ЗВ2

Рис. 6. Выравненные последовательности нуклеотидов в ДНК НеТ-А элементов из оригинальной линии улгаз и четырех /-подобных производных. Представлены первые 350 нуклеотидов от З'-конца НеТ-А элемента. Последовательность ДНК представлена в ориентации 5' - 3'. Маленькими буквами обозначены замены нуклеотидов в последовательности ДНК, звездочками -. делеции нуклеотидов, стрелками - З'-концы новых НеТ-А элементов, жирным шрифтом - последовательность нуклеотидов в ДНК оригинального НеТ-А элемента и идентичная ей последовательность нуклеотидов в ДНК из НеТ-А элементов /-подобных производных.

> _к ¿04 к г ...

А0,21А6ТЛААТС ШШШР А13 ЗВ31 (0.7 кЬ)

_ССАдСАМСД^> а 2-3 1АСАДДСТ ^>А13 2А32(6кЬ)

_V 3-6 у

ссабсааастт > А,,.,, 1АААСТТ > А,, ЗВ1 (3.7 кЬ)

ССАбСААЛСтф 1сад А2.3 1АССТ6АА Ча1Я «11 (5 №)

_К ДЗ_85-86 у

ссапсаааптт>а-.1 ссайсааа6са^> дА з_4 |АСТ6ТААТ >Лп ЮЗ (1 кЬ)

> 278-279_у

А5.6 IАТГТАА АТ А13 1А1 (>16 кЬ)

ССА6САААСТТ^>А;I ССА6СААА5са^>А3 61АААСТАА"Г~^>А1 ^ 2А12 (>12 кЬ)

> 135-138 К

А12.15 [ЛААСТСАС~> А13 2В2 (>20 кЬ)

>119_^

А1 1ТСАААААС ">Ац 2В4 (>20 кЬ)

-К _К ЗС11 (>20 кЬ)

ССАвСАААаая > Ав.9 |А6СААА0ТТ >Ац ЗС12 (>2о кЬ)

ф> А6 ЗС2 (>20 кЬ)

ССАССАААаТа

__V 166-169_V

ссаксааагстт^> Ас.» IАААСТААТ 203 (>15 кЬ)

Рис. 7. Диаграмма, иллюстрирующая увеличение ра НеТ-А элементов к последовательности концевого НеТ-А элемента в линии у,,таз. В скобках указаны размеры "новых" ДНК. Стрелками указана ориентация НеТ-А элементов. Жирными стрелками обозначены последовательности нуклеотидов из ДНК оригинального НеТ-А элемента. Цифры над стрелками указывают номер последнего или первого нуклеотида из представленной последовательности, нумерация начинается от первого нуклеотида с 3'-конца ДНК оригинального НеТ-А элемента линии у" (рис. 6). Адениновые основания в месте перехода "старого" НеТ-А элемента в "новый" могут относиться и к ДНК "старомго" НеТ-А элемента, и к поли-А последовательности "нового" НеТ-А элемента. Маленькими буквами показаны замены нуклеотидов в консервативной части З'-конца НеТ-А элемента.

З'-конца. Была определена их первичная структура (рис. 6, 7). Точку перехода "старого" НеТ-А элемента в "новый" обнаруживали при сравнении первичной структуры НеТ-А элементов полученных у2 производных с первичной структурой оригинального НеТ-А элемента, присоединенного к гену yellow в исходной линии У'гш.

В двух линиях У (ЗВ2 и ЗС4) между исходным и "новым" НеТ-А элементом отсутствовала последовательность поли-А и консервативный З'-конец нового НеТ-А элемента (рис. 6), но были обнаружены небольшие делеции и множество точечных замен по сравнению с последовательностью нуклеотидов оригинального НеТ-А элемента. В линиях 2D1 и ЗА4 была обнаружена последовательность поли-А между "старым" и "новым" НеТ-А элементом, однако последовательность нуклеотидов, расположенная проксимальнее З'-конца "нового" НеТ-А элемента, содержала много нуклеотидных замен по сравнению с последовательностью нуклеотидов в ДНК оригинального НеТ-А элемента. В линиях 1А2 и 1В1 "новый" НеТ-А элемент имел такую же структуру, как и оригинальный (рис. 5А). Размер "нового" НеТ-А элемента во всех перечисленных линиях не превышал 3 т.п.н., что соответствует среднему размеру конверсионного тракта, определенного ранее при изучении механизма генной конверсии в локусе yellow на конце хромосомы (Mikhailovsky et al., 1999).

В линии 3B31 последовательность нуклеотидов в ДНК НеТ-А элемента, идентичная оригинальному НеТ-А элементу линии yhTD\ заканчивается в положении 104 п.н. (нумерация нуклеотидов начинается от З'-конца НеТ-А элемента) (рис. 7). Далее следует последовательность нуклеотидов от 291 п.н. до 319 п.н., соответствующая другому НеТ-А элементу, два Т нуклеотида и З'-конец третьего НеТ-А элемента. Размер новой последовательности не превышает 0.7 т.п.и.

В двух линиях 2А31 и ЗВ1 между старым и новым НеТ-А элементами была обнаружена последовательность поли-А различной

длины (рис. 7). Структура З'-конца новых НеТ-А элементов (5'-CCAGCAAAGTT-3') в этих линиях оказалась такой же консервативной, как в случаях транспозиции НеТ-А элементов к ДНК гена yellow при терминальной делеции.

В двух независимых линиях (1D11 и 1D3) в месте соединения НеТ-А элементов была обнаружена более сложная структура. В линии 1D1 три пары нуклеотидов Т/А представляют собой поли-А, между поли-А и консервативным З'-концом нового НеТ-А элемента находится дополнительная последовательность нуклеотидов TCAG (рис. 7). В линии 3D1 "новая" ДНК начинается с повтора, состоящего из двух 3'-концов НеТ-А элемента (рис. 7). Первый З'-конец очень сильно усечен, длиной всего 21 п.н. с двумя нуклеотидными заменами в самом начале (Gca вместо GTT). Размер "новой" ДНК в обеих линиях составляет 5 и 1 т.п.н. соответственно.

Семь линий (1А1, 2А11, 2В2, 2В4, 2D3, ЗС11 и ЗС2) имели большие и точно не определенные размеры "новой" ДНК (рис. 5Б). Во всех случаях она начиналась с последовательности поли-А и консервативного З'-конца "нового" НеТ-А элемента. Сравнение первичной структуры показало наличие нескольких пар А/Г в месте присоединения "нового" НеТ-А элемента. Они могут либо принадлежать к последовательности поли-А "нового" НеТ-А элемента, либо являться-продолжением "старого" НеТ-А элемента. Во всех случаях ДНК "нового" НеТ-А элемента имеет различные нуклеотидные замены в З'-концевом консервативном триплете GTT.

Обсуяеденне результатов

Транспозиции НеТ-А элементов на конец терминальной делеции Х-хромосомы. Присоединения НеТ-А и TART элементов к терминальным делениям хромосом можно рассматривать как настоящие

транспозиционные события, поскольку удлинение ДНК с помощью генной конверсии требует наличия гомологии между последовательностью мобильного элемента и его сайтом-мишенью для присоединения в гене yellow. (Mikhailovsky et al., 1999) Во всех случаях в местах присоединения НеТ-А элементов была обнаружена последовательность поли-А, что подтверждает транспозиционный механизм присоединений. Эти результаты согласуются с описанными ранее данными (Biessmann et al., 19906; Biessmann et al., 1992a; Biessmann et al., 19926). Присоединение элементов НеТ-А или TART к концу терминальной делеции всегда происходит только З'-концом. Это объясняется моделью терминальной транспозиции мобильных элеменов, согласно которой выступающий З'-конец хромосомы используется в качестве праймера для инициации обратной транскрипции (Biessmann et al., 19906; Biessmann et al., 1992a; Biessmann et al., 1997a; Levis et al., 1993; Pardue et al., 19966; Sheen et al., 1994; Traverse et al., 1988). Такая модель объясняет одинаковую ориентацию копий НеТ-А и TART элементов, выделенных из нативной теломеры.

Генетическая система, описанная в. данном исследовании, позволяет селективно отбирать фенотипически видимые присоединения только НеТ-А элементов. TART элементы не содержат промотор на 3'-конце (Danilevskaya et al., 1999) и, по-видимому, их присоединения не приводят к активации транскрипции гена yellow. Было показано, что ДНК из З'-конца НеТ-А элемента размером 590 п.н. отвечает за полную промоторную активность в культуре клеток дрозофилы (Danilevskaya et al., 1997). Мы показали, что для активации экспрессии гена yellow в щетинках достаточно 400 п.н. из З'-конца НеТ-А элемента. Таким образом, промотор НеТ-А элемента на конце хромосомы сохраняет свою активность, как и промотор гена yellow (Biessmann, Mason, 1988). Промотор НеТ-А элемента активирует транскрипцию гена yellow только в щетинках. Возможно, это объясняется наличием энхансера щетинок в

нитроне гена yellow и полным отсутствием энхансеров тела и крыльев, в норме находящихся в 5'-регуляторной области гена yellow. Согласно нашим данным, частота транспозиций НеТ-А элементов на конец хромосомы к последовательностям гена yellow относительно низка и очень сильно зависит от генотипа конкретной линии.

Увеличение числа копий НеТ-А элемента на конце хромосомы может осуществляться разными способами. В качестве альтернативного или дополнительного способа удлинения теломер рядом авторов рассматривается рекомбинация по повторам на теломерных концах (Biessmann, Mason, 1997; Biessmann et al., 1998; Blasco et al., 1999; Cohn et al., 1999; Li, Lustig, 1996; Lopez et al„ 1996; McEachem, Blackburn, 1996; Pardue, DeBaryshe, 1999; Pluta, Zakian 1989; Roth et al., 1997; Wang, Zakian 1990). Существуют непрямые доказательства того, что теломеры Chironomus и Anopheles gambiae наращиваются с помощью механизмов рекомбинации и генной конверсии, используя длинные комплексы терминальных повторов (Biessmann, Mason, 1997; Cohn, Edstrom, 1992; Lopez et al., 1996; Roth et al., 1997). Этот способ был детально изучен на дрожжах. Теломеры дрожжей в норме удлиняются с помощью теломеразы, а рекомбинация или генная конверсия используются в качестве дополнительного механизма удлинения теломер, когда теломераза инактивирована (Blasco et al., 1999; Bosco, Haber, 1998; Li, Lustig, 1996; Pardue, DeBaryshe, 1999). Кроме того, предполагают, что механизм рекомбинации используется для поддержания длины теломер в некоторых линиях иммортализованных клеток человека, которые не имеют теломеразной активности (Blasco et al., 1997; Bryan et al., 1995, 1997; Greider, 1996, 1998; Stoppler et al., 1997; Strahl, Blackburn, 1996). Таким образом, у многих организмов механизмы, основанные на рекомбинации, используются в качестве альтернативного способа нерегулируемого

удлинения теломер (Pardue, DeBaryshe, 1999). По-видимому, в норме рекомбинационный способ может блокироваться специальным классом белков, связывающихся с теломерами, и регулироваться в течение репликации ДНК.

Ранние исследования (Biessmann et al.( 19906; Biessmann et al., 1992a) и наши наблюдения показали, что транспозиции НеТ-А элемента к концевому НеТ-А элементу происходят с более зысокой частотой, чем транспозиции к концам хромосом с терминальными делециями. Однако в отличие от предыдущих наблюдений, нами было обнаружено, что увеличение числа копий НеТ-А элемента на конце хромосомы может осуществляться с.помощью разных механизмов, а не только в результате транспозиции мобильных элементов на конец хромосомы.

Удлинение концевого НеТ-А элемента в среднем до 5 т.п.н. происходит, по-видимому, с большей частотой в результате наращивания ДНК с помощью генной конверсии, при этом в качестве матрицы могут использоваться гомологичные последовательности любых НеТ-А элементов, расположенных где-либо на теломерах. Средний размер конверсионного тракта, образованного таким способом, соответствует-данным, полученным в ходе экспериментов по изучению механизма генной конверсии на конце хромосомы (Mikhailovsky et al., 1999).

В некоторых случаях была обнаружена нуклеотидная последовательность З'-конца НеТ-А элемента очень близко от начала конверсионного тракта. Этот факт, скорее всего, отражает структуру теломер в том районе, который использовался при генной конверсии в качестве гомологичной матрицы для синтеза ДНК. К настоящему моменту была клонирована и определена первичная структура лишь двух теломерных районов (Danilevskaya et al., 1998а; Levis, 1993; Pardue et al., 19966). Теломерный район A 4-4, например, содержит короткие фрагменты З'-конца НеТ-А элемента длиной 288 п.н. Вероятно, такие

усеченные копии НеТ-А элементов длиной всего 200-400 п.н. от З'-конца в норме встречаются на теломерах и формируют тандемные повторы. Таким образом, присоединение следующих друг за другом 3'-концов НеТ-А элементов к концевому НеТ-Л элементу так же свидетельствует о конверсионном механизме этих событий.

Модели транспозиции НеТ-Л элементов удовлетворяет структура лишь двух обнаруженных нами присоединенных фрагментов, обладающих всеми характерными для этого механизма признаками, описанными ранее (Biessmarm et al., 1990): наличие последовательности поли-А в месте присоединения и консервативного участка ДНК на 3'-конце нового НеТ-А элемента, а также соответствие размера присоединенного фрагмента ДНК размеру транскрипта НеТ-А элемента. Таким образом, настоящая транспозиция происходила не так часто, как ожидалось.

Во многих случаях удлинение конца хромосомы достигало более 20 т.п.н., что в несколько раз превышает длину полноразмерного транскрипта НеТ-А элемента (Danilevskaya et al., 1998а; Pardue, DeBaryshe, 1999). Интересно, что такие события происходили с большей частотой. Среди четырех описанных ранее независимых присоединений НеТ-А элементов к концам деградированных НеТ-А элементов два присоединения имели длшгу более 14 т.п.н. (Biessmarm et al., 1992а). В нашем исследовании подобных событий было 13 из 33.

Второй особенностью этого класса событий является наличие нуклеотидных замен в первом триплете З'-конца НеТ-А элемента. Во всех рассмотренных нами случаях настоящих транспозиций НеТ-А элементов к ДНК гена yellow наблюдалась строгая консервативность З'-конца, что, возможно, свидетельствует о необходимости первых нуклеотидов НеТ-А элемента для транспозиции. Все эти наблюдения исключают возможность присоединения больших фрагментов транспозиционным механизмом. Однако, существование небольшого

количества РНК большого размера, гомологичного НеТ-А (Danilevskaya et al., 1999), не может исключать возможность транспозиции длинных фрагментов ДНК, состоящих из нескольких НеТ-А элементов. Считается, что РНК такого большого размера может образовываться при считывают с тандема НеТ-А элементов (Danilevskaya et al., 1999). Однако кажется маловероятным, что ненормально длинные транскрипты могут быть гораздо более эффективными для транспозиции по сравнению с полноразмерными или укороченными транскриптами.

Более удачным объяснением наблюдаемой картины представляется присоединение ДНК большого размера в результате сайт-специфической рекомбинации между несколькими адениновыми нуклеотидами НеТ-А элемента на конце терминальной делеции и нуклеотидами последовательности поли-А НеТ-А элемента, расположенного на какой либо теломере. В результате, большие фрагменты теломерных последовательностей переносятся на конец хромосомы.

Анализ первичной структуры НеТ-А элементов показал, что некодирующий З'-конец НеТ-А элементов очень консервативен. Существует лишь- несколько подсемейств НеТ-А элементов (Danilevskaya et al., 1998а; Danilevskaya et al., 19986). Такую консервативность невозможно объяснить транспозиционным механизмом удлинения теломеры через РНК-посредника. Для многих мобильных элементов, использующих для транспозиции РНК-посредник, было показано наличие случайных нуклеотидных замен (Drake, 1993). Консервативность последовательности НеТ-А элементов объяснялась ограниченным количеством репликативно активных копий (Danilevskaya et al., 1998а). В этом случае основное количество элементов в геноме должно отличаться от транскрипционно активного НеТ-А элемента лишь на один шаг обратной транскрипции. Другим объяснением может быть то, что гомогенность последовательностей

НеТ-А элементов была установлена механизмами конверсии/рекомбинации. Этот же механизм, возможно, объясняет градиентную гомогенизацию концов хромосом в дрожжах (Bosco, Haber, 1998), у которых последовательности на концах хромосом имеют наиболее вьюокую степень гомологии, а с удалением от конца эта гомология уменьшается. Возможно, оба механизма отвечают и за консервативность НеТ-А элементов и за удлинение теломер.

Выводы

1. Впервые показано, что промотор гена yellow сохраняет свою активность, находясь на расстоянии 70 п.н. от конца хромосомы.

2. Впервые продемонстрировано, что промотор НеТ-А элемента, присоединенного З'-концом к 5'-транскрибируемой нетранслируемой области гена yellow, компенсирует делецию промотора гена yellow. Для поддержания нормальной экспрессии гена достаточно 400 п.н. от З'-конца НеТ-А элемента.

3. Доказано, что присоединения НеТ-А элементов к концу хромосомы с терминальной делецией являются настоящими транспозициями, о чем свидетельствует консервативный З'-конец присоединившегося НеТ-А элемента и наличие последовательности поли-А в месте присоединения. Частота транспозиций очень низка и сильно зависит от генотипа линий.

4. Впервые показано, что у Drosophila melanogaster удлинение конца хромосомы, несущего НеТ-А элемент, может происходить разными способами: в результате транспозиции, генной конверсии или рекомбинации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Kahn Т., Savitsky М., Georgiev Р. 2000. Attachment of НеТ-А sequences to chromosomal termini in Drosophila melanogaster may occur by different mechanisms. // Mol. Cell. Biol. V. 20. P. 7634-7642.

2. Кан Т.Г., Селезнева Т.Б, Георгиев П.Г. 2000. Модельная генетическая система для анализа присоединений НеТ-А элементов к терминальным делециям у Drosophila melanogaster. // Генетика. Т.36. № П. С. 1515-1519.

3. Георгиев П.Г., Мельникова JI.C., Кан Т.Г., Кравчук О.И., Михайловский С.С., Савицкий М.Ю. 2000. Различные механизмы регуляции длины теломер. // Молекулярная биология. Т. 34. № 5. С. 743-754.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кан, Татьяна Геннадьевна

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1 Л. Белки, контролирующие функции теломер у млекопитающих и дрожжей

1.2. Альтернативные пути удлинения теломер млекопитающих и дрожжей

1.3. Необычная структура теломер некоторых насекомых

1.4. Гипотезы об эволюционной связи между теломерами ОгозоркИа melanogaster и теломерами, использующими теломеразу

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Генетические методы

2.1.1. Мутации и линии ВгозорНИа melanogaster, использованные в работе

2.1.2. Генетические скрещивания

2.2. Молекулярные методы

2.2.1. Трансформация бактериальных клеток плазм идами

2.2.2. Выделение и очистка ДНК

2.2.2.1. Выделение ДЬЖ дрозофилы

2.2.2.2. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса

2.2.2.3. Выделение фрагментов ДНК из геля и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций

2.2.3. Саузерн-блот анализ

2.2.3.1. Рестрикция, электрофорез и мобилизация ДНК на мембрану *

2.2.3.2. Гибридизация ДНК на мембране с радиоактивными зондами

2.2.4. Амплификация ДНК

2.4.5. Сиквенс ПЦР-продуктов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Получение модельной системы для изучения • механизмов транспозиции НеТ-А элементов на конец хромосомы >

3.1.1. Определение минимального размера 5' области перед промотором гена уеНом', необходимого для его работы на конце хромосомы

3.1.2. Присоединение НеТ-А элемента к концу хромосомы с терминальной терминальной делецией компенсирует делецию промотора гена ;ие//о^

3.2. Частота присоединений НеТ-А элементов к концу хромосомы с терминальной делецией в гене yellow зависит от генотипа линии

3.3. Определение минимального размера ДНК НеТ-А элемента, необходимого для поддержания экспрессии ген yellow в щетинках

3.4. Удлинение концов хромосом, несущих НеТ-А элементы

3.5. Механизмы удлинения конца хромосомы

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Транспозиции НеТ-А элементов на конец Х-хромосомы с терминальной делецией

4.2. Удлинение конца хромосомы у Drosophila melanogaster может осуществляться разными способами

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизмов присоединения НеТ-А элементов к концу хромосомы у Drosophila melanogaster"

У большинства эукариот теломеры состоят из коротких повторов и удлиняются с помощью специального рибонуклеопротеинового комплекса - теломеразы (Greider, Blackburn, 1985; Blackburn, 1990,

1992). Однако у некоторых насекомых в клетках отсутствует теломераза, а удлинение геломер происходит либо посредством генной конверсии или рекомбинации, либо в результате транспозиции мобильных элементов (Biessmann, Mason 1997). Так, у Drosophila melanogaster теломеры состоят из множественных копий мобильных элементов НеТ-А и TART, при этом НеТ-А элементы составляют 80-90% (Mason, Biessmann, 1995; Biessmann, Mason 1997). Эти мобильные элементы относятся к классу ретро-элементов без длинных концевых повторов типа LINE (Mason, Biessmann, 1995; Biessmann, Mason, 1997; Biessmann et al, 1997). Элементы НеТ-А и TART располагаются на теломерах всегда в одной ориентации - "голова-хвост" (Levis et al.,

1993). Существующие литературные данные предполагают, что удлинение теломер дрозофилы происходит в результате транспозиции мобильных элементов (Biessmann et al., 1992а, 19926). На основе этой гипотезы был сделан вывод, что регуляция длины теломер определяется уровнем экспрессии НеТ-А и TART мобильных элементов (Mason, Biessmann, 1995). Однако известные экспериментальные исследования по определению частоты присоединений мобильных элементов к концу хромосомы, не позволяют сделать окончательных выводов как о механизме присоединения мобильных элементов к концу хромосомы, так и об их частоте. Одной из причин является отсутствие генетических систем для анализа частоты присоединения мобильных элементов к концу хромосомы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Кан, Татьяна Геннадьевна

выводы

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кан, Татьяна Геннадьевна, Москва

1. Ashburner М. 1989. Drosophila: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.

2. Bianchi A., Smith S„ Chong L., Elias P., deLange T. 1997. TRF is a dimer and bends telomeric DNA. EMBO J. V. 16. P. 1785-1794.

3. Biessmann H., Mason J. M. 1988. Progressive loss of DNA sequences from terminal chromosome deficiencies in Drosophila melanogaster. EMBO J. V. 7. P. 1081-1086.

4. Biessmann H., Carter S. В., J. M. Mason J. M. 1990a. Chromosome ends in Drosophila without telomeric DNA sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USAV. 87. P. 1758-1761.

5. Biessmann H., Mason J. M., Ferry K., d'Hulst M., Valgeirsdottir K., Traverse K. L., Pardue M. L. 19906. Addition of telomere-associated HeT-A DNA sequences "heals" broken chromosome ends in Drosophila. Cell V. 61. P. 663-673.

6. Biessmann H., Champion L. E., O'Hare K., Ikenaga K., Kasravi В., Mason J. M. 1992a. Frequent transpositions of Drosophila melanogaster Het-A transposable elements to receding chromosome ends. EMBO J. V. 11. P. 4459-4469.

7. Biessmann H., K. Valgeirsdottir A., Lofsky C., Chin В., Ginther R. W., Levis M. L., Pardue. 19926. Het-A, a transposable element specificallyinvolved in healing broken chromosome ends in Drosophila melanogaster. Mol. Cell. Biol. V. 12. P. 3910-3918.

8. Biessmann H., Kasravi В., Bui Т., Fujiwara G., Champion L.E., Mason J.M. 1994. Comparison of two active HeT-A retroposons of Drosophila melanogaster. Chromosoma. V. 103. P. 90-98.9. BiessmanH. 1995.

9. Biessmann H., Walter M. F., Mason J. M. 1997. Drosophila telomere elongation. Ciba Found Symp. V. 211. P. 53-67.

10. Biessmann H., Mason J. M. 1997. Telomere maintenance without telomerase. Chromosoma. V. 106. P. 63-69.

11. Biessmann H., Kobeski F., Walter M. F., Kasravi A., Roth C. W. 1998. DNA organization and length polymorphism at the 2L telomeric region of Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. V. 7. P. 83-93.

12. Bilaud Т., Koering C.E., Binet-Brasselet E., Ancelin K., Pollicee A., Gasser S.M., Gilson E. 1996. The telobox, a Myb-related telomeric DNA binding motif found in proteins from yeast, plants and human. Nucleic Acids Res. V. 24. P. 1294-1303.

13. Blackburn E.H. 1991. Structure and function of telomeres. Nature. V. 350. P. 569-573.

14. Blackburn E.H. 1992. Telomerases. Ann. Rev. Biochem. V. 61. P. 113129.

15. Blasco M. A., Lee H. W., Hande M. P., Samper E., Lansdorp P. M., DePinho R. A., Greider C. W. 1997. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell. V. 91. P. 25-34.

16. Blasco M. A., Gasser S. M., Lingner J. 1999. Telomeres and telomerase. Genes Dev. V. 13. P. 2353-2359.

17. Bosco G. Haber J. E. 1998. Chromosome break-induced DNA replication leads to nonreciprocal translocations and telomere capture. Genetics. V. 150. P. 1037-1047.

18. Boulton S.J., Jackson S.P. 1998. Components of the Ku-dependent nonhomologous end-joining pathway are involved in telomeric length maintenance and telomere silencing. EMBO J. V. 17. P.l819-1828.

19. Bryan Т. M., Marusic L., Bacchetti S., Namba M., Reddel R. R. 1995. Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity. EMBO J. V. 14. P. 4240-4248.

20. Bryan Т. M., Englezou A., Gupta J., Bacchetti S., Reddel R. R. 1997. The telomere lengthening in telomerase-negative immortal human cells does not involve the telomerase RNA subunit. Hum. Mol. Gen. V. 6. P. 921-926.

21. Bryan T.M., Sperger J.M., Chapman K.B., Cech T.R. 1998. Telomerase reverse transcriptase genes identified in Tetrahymena thermophila and Oxytrichia trifallax. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 95. P. 8479-8484.

22. Colin M., Edstrom J. E. 1992. Telomere-associated repeats in Chironomus form discrete subfamilies generated by gene conversion. J. Mol. Evol. V. 35. P. 114-122.

23. Collins K., Ghandi L. 1998. The reverse transcriptase component of the Tetrahymena telomerase ribonucleoprotein complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 95. P. 8485- 8490.

24. Danilevskaya O., Lofsky A., Kurenova E.V., Pardue M.L. 1993. The Y chromosome of Drosophila melanogaster contains a distinctive subclass of ЯеГ-^-related repeats. Genetics. V. 134. P. 531-543.

25. Danilevskaya O., Slot F., Pavlova M., Pardue M. L. 1994. Structure of the Drosophila HeT-A transposons: a retrotransposons-like element forming telomeres. Chromosoma. V. 103. P. 215-224.

26. Danilevskaya O. N., I Arkhipova. R., Traverse K. L., Pardue M. L. 1997. Promoting in tandem: the promoter for telomere transposon Het-A and implications for the evolution of retroviral LTRs. Cell. V. 88. P. 647655.

27. Danilevskaya O. N., Lowenhaupt K., Pardue M. L. 1998a. Conserved subfamilies of the Drosophila HeT-A telomere-specific retrotransposon. Genetics. V. 148. P. 233-242.

28. Danilevskaya O. N., Traverse K. L., Hogan N. C., DeBaryshe P. G., Pardue M. L. 1999. The two Drosophila telomeric transposable elements have very different patterns of transcription. Mol. Cel. Biol. V. 19. P. 873-881.

29. Dionne L., Wellinger R.J. 1998. Processing of telomeric DNA ends requires the passage of a replication fork. Nucleic. Acids Res. V. 26. P. 5365-5371.

30. Drake J. W. 1993. Rates of spontaneous mutation among RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V 90. P. 4171-4175.

31. Erlich H. A. 1989. PCR technology. Stockton Press, New York, N. Y.

32. Fanti L., Giovinazzo G., Berloco M., Pimpinelli S. 1998. The heterochromatin protein 1 prevents telomere fusions in Drosophila. Mol. Cell. V. 2. P. 527-538.

33. Garvik В., Carson M., Hartwell L. 1995. Single stranded DNA arising at telomeres in cdcl3 mutants may constitute a specific signal for the RAD9 checkpoint. Mol. Cell Biol. V. 15. P. 6128-6138.

34. Geyer P. К., Spana С., Corces V. G. 1986. On the molecular mechanism of gy/wy-induced mutations at the yellow locus of Drosophila melanogaster. EMBO J.V. 5. P. 2657-2662.

35. Geyer P.K., Corces V. G. 1987. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster. Genes and Dev. V. 1. P. 996-1004.

36. Greenberg R.A., AllsoppR.C., Chin L., Morin G.B., DePinho R.A. 1998. Expression of mouse telomerase reverse transcriptase during development, differentiation, and proliferation. Oncogene. V. 19. P. 1723-1730.

37. Greider C.W., Blackburn E.H. 1985. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. V. 43. P. 405413.

38. Greider C.W., Blackburn E.H. 1987. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell. V. 51. P. 887-898.

39. Greider C.W., Blackburn E.H. 1989. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature. V. 337. P. 331-337.

40. Greider C. W. 1996. Telomere length regulation. Ann. Rev. Biochem. V. 65. P. 337-365.

41. Greider С. W. 1998. Telomerase activity, cell proliferation, and cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 95. P. 90-92.

42. Greider C.W. 1999. Telomeres do D-loop-T-loop. Cell. V. 97. P. 419422.

43. Griffith J.D., Comeau L., Rosenfield S., Stansel R.M., Bianchi A., Moss H., deLange T. 1999. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell. V. 97. P. 503-514.

44. Haber J.E. 1999. DNA repair. Gatekeepers of recombination. Nature. V. 398. P.665-667.

45. Kamnert I., Nielsen L., Edstrom J-E. 1998. A conceitedly evolving region in Chironomus, unique within the telomere. J Mol. Evol. V. 46. P. 562-570.

46. Krauskopf A., Blackburn E.H. 1996. Control of telomere growth by inretactions of RAP1 with the most distal telomeric repeats. Nature. V. 383. P. 354-357.

47. Kirk K.E., Harmon B. P., Reichardt I.K., Sedat J.W., Blackburn E.H. 1997. Blok in anaphase chromosome separation caused by a telomerase template mutation. Science. V. 275. P. 1478-1481.

48. Lendvay T.S., Morris D.K., Sah J., Balasubramnian В., Lundblad V. 1996. Senescence mutants of Saccharomyces cerevisiae with a defect in telomere replication identify three additional EST genes. Genetics. V. 144. P. 1399- 1412.

49. Levis R. W. 1989. Viable deletions of a telomere from a Drosophila chromosome. Cell. V. 58. P. 791-801.

50. Levis R. W., Ganesan R., Houtchens K., Tolar L. A., Sheen F.-M. 1993. Transposons in place of telomere repeats at a Drosophila telomere. Cell. V. 75. P. 1083-1093.

51. Li В., Lustig A. J. 1996. A novel mechanism for telomere size control in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. V. 10. P. 1310-1326.

52. Lin J.-J., Zakian V.A. 1996. The Saccharomyces CDC13 protein is a single-strand TG1-3 telomeric DNA-binding protein in vitro that affects telomere behavior in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 93. 1376013756.

53. Lindsley D. L., Zimm G. G. 1992. The Genome of Drosophila melanogaster. Academic Press, New York.

54. Linger J., Cech T.R. 1996. Purification of telomerase from Euplotes aediculatus: requirement of a primer 3' overhang. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 93. P. 10712-10717.

55. Linger J., Hughes T.R., Shevchenko A., Mann M., Lundblad V., Cech T.R. 1997. Reverse transcriptase motif in the catalytic subunit of telomerase. Science. V. 2276. P. 561-567.

56. Lopez С. C., Neilsen L., Edstrom J.-E. 1996. Terminal long tandem repeats in chromosomes from Chironomus pallidivittatus. Mol. Cel. Biol. V. 16. P. 285-3290.

57. Luan D.D., Korman M.H., Jakubczak J.L., Eickbush Т.Н. 1993. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: a mechanism for non-LTR retrotransposition. Cell. V. 72. P. 592-605.

58. Lundblad V., Blackburn E.H. 1993. An alternative pathway for yeast telomere maintenance rescues est Г senescence. Cell. V. 73. P. 347-360.

59. Lundblad V., Szostak J.W. 1989. A mutant with a defect in telomere elongation leads to senescence in yeast. Cell. V. 57. P. 633-643.

60. Martin M., Y Meng. В., Chia W. 1989. Regulatory elements involved in the tissue-specific expression of the yellow gene of Drosophila. Mol. Gen. Genet. V. 218. P. 118-126.

61. Mason J. M., Biessmann H. 1995. The unusual telomeres of Drosophila. Trends Genet.V. 11. P. 58-62.

62. McEachern M. J., Blackburn E. H. 1995. Runway telomere elongation caused by telomerase RNA gene mutations. Nature. V. 376. P. 403-409.

63. McEachern M. J., Blackburn E. H. 1996. Cap-prevented recombination between terminal telomeric repeat arrays (telomere CPR) maintains telomeres in Kluyveromyces lactis lacking telomerase. Genes Dev. V. 10. P. 1822-1834.

64. Mikhailovsky S., Belenkaya Т., Georgiev P. 1999. Broken chromosome ends can be elongated by conversion in Drosophila melanogaster. Chromosoma. V. 108. P. 114-120.

65. Nakamura T.M., Morin G.B., Chapman K.B., Weinrich S.L., Andrews W.H., Linger J., Harley C.B., Cech T.R. 1997. Telomerase catalytic subunit homologues from fission yeast and human. Science.V. 277. P. 955-959.

66. Nugent C.I., Hughes T.R., Lue N.F., Lundblad V. 1996. Cdcl3p: a single-strand telomeric DNA-binding protein with a dual role in yeast telomere maintenance. Science. V. 274. P. 2249-252.

67. Nugent C.I., Lundblad V. 1998. The telomerase reverse transcriptase: components and regulation. Genes Dev. V. 12. P. 1073-1085.

68. Nugent C.L., Bosco G., Ross L.O., Evans S.K., Salinger A.P., Moore J.K., Haber J.E., Lundblad V. 1998. Telomere maintenance is dependent on activities required for end repair of double-strand breaks. Curr. Biol. V. 8. P. 657-660.

69. Pardue M. L., Danilevskaya O. N., Lowenhaupt K., Slot F., Traverse K.L. 1996a. Drosophila telomeres: new views on chromosome evolution. Trends Genet. V. 12. P. 48-52.

70. Pardue M. L., Danilevskaya О. N., Lowenhaupt K., Wong J., Erby K. 19966. The gag coding region of the Drosophila telomeric retrotransposon, HeT-A, has an internal frame shift and a length polymorphic region. J. Mol. Evol. V. 43. P. 572-583.

71. Pardue M. L., Danilevskaya O. N., Traverse K. L., Lowenhaupt K. 1997. Evolutionary links between telomeres and transposable elements. Genetica. V. 100. P. 73-84.

72. Pardue M. L., DeBaryshe P. G. 1999. Telomeres and telomerase: more than the end of the line. Chromosoma. V. 108. P. 73-82.

73. Price C.M. 1999. Telomeres and telomerase: broad effects on cell growth. Curr Opin Genet Dev. Curr. Opin. Genet. Dev. V. 9. P. 218-224.

74. Pluta A. F., Zakian V. A. 1989. Recombination occurs during telomere formation in yeast. Nature. V. 337. P. 429-433.

75. Roth C. W., Kobeski F., Walter M. F., Biessmann H. 1997. Chromosome end elongation by recombination in the Mosquito Anopheles gambiae. Mol. Cel. Biol. V. 17. P. 5176-5183.

76. Sandel L.L., Zakian V.A. 1993. Loss of a yeasr telomerase: arrest, recovery, and chromosome loss. Cell. V. 75. P. 72229-739.

77. Sheen F. M., Levis R. W. 1994. Transposition of the LINE-like retrotransposon TART to Drosophila chromosome termini. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 91. P. 12510-12514.

78. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a Laboratory Manual. Ed2 Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor NY.

79. Shippen-Lentz D., Blackburn E.H. 1990. Science. V. 247. P. 546-552.

80. Van Steensel В., deLange T. 1997. Control of telomere length by the human telomere protein TRF1. Nature. V. 385. P. 740-743.

81. Stoppler H., Hartmann D. P., Sherman L., Schlegel R. 1997. The human papilloma virus type 16 E6 and E7 oncoproteins dissociate cellular telomerase activity from the maintenance of telomere length. J. Biol. Chem. V. 272. P. 13332-13337.

82. Strahl C., Blackburn E. H. 1996. Effects of reverse transcriptase inhibitors on telomere length and telomerase activity in two immortalized human cell lines. Mol. Cell. Biol. V. 16. P. 53-65.

83. Traverse K. L., Pardue M. L. 1988. A spontaneously opened ring chromosome of Drosophila melanogaster has acquired He-T DNA sequences at both new telomeres. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 85. P. 8116-8120.

84. Wang S. S., Zakian V. A. 1990. Telomere-telomere recombination provides an express pathway for telomere acquisition. Nature. V. 345. P. 456-458.

85. Yu G.L., Bradley J.D., Attardi L.D., Blackburn E.H. 1990. In vivo alteration of telomere sequences and senescence caused by mutated Tetrahymena telomerase RNAs. Nature. V. 344. P. 126-132.

Информация о работе

Кан, Татьяна Геннадьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.26

Диссертация

Изучение механизмов присоединения НеТ-А элементов к концу хромосомы у Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы