Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизмов ограничения активности энхансеров D. melanogaster

ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов ограничения активности энхансеров D. melanogaster"

На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4

ДАВЫДОВА АННА ИГОРЕВНА

Изучение механизмов ограничения активности энхансеров Т).те1апо£а$1ег

Специальность 03.01.07 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 3 НОЯ 2011

Москва 2011

4858416

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Учреждение Российской Академии Наук Институт биологии гена РАН (ИБГ РАН)

Научные руководители:

Академик РАН, доктор биологических наук, профессор Георгиев П.Г. Кандидат биологических наук Четверина Д.А.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Любомирская Н.В.

Кандидат биологических наук Тидлиб C.B.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится ноября 2011 года в 77часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан л/ октября 2011 года.

Ученый секретарь Диссертационного сов—

канд.фарм.наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Уровень транскрипции генов высших эукариот зависит от статуса ДНК-регуляторных элементов: промотора гена, на котором собираются белки основного транскрипционного комплекса, и энхансеров, которые, посредством регуляторных белков, усиливают транскрипцию.

Проведенный полногенномный анализ модификаций нуклеосом и связывания регуляторных белков с ДНК, совмещенный с функциональными экспериментами на активность регуляторных элементов, предполагает, что энхансеры являются типичным и фундаментально важным классом ДНК-элементов, необходимым для создания клеточного разнообразия, дифференцировки и развития организма в целом. Энхансеры способны активировать гены на больших расстояниях, достигающих нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов. В некоторых случаях они могут активировать транскрипцию генов, расположенных на других хромосомах. Эти регуляторные элементы действуют вне зависимости от положения и ориентации относительно направления транскрипции гена. Существует несколько моделей функционирования энхансеров; большинство из них предполагает, что белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с белками, собранными на промоторе, а ДНК между ними выпетливается. Энхансеры практически не обладают специфичностью действия, следовательно, у высших эукариот должны были выработаться механизмы, контролирующие и ограничивающие способность энхансеров к активации генов, направляющие энхансер на стимуляцию только определенного промотора, и, таким образом, определяющие специфичность его действия.

Результаты последних работ свидетельствуют, что большая часть генома транскрибируется, и что лишь небольшой процент этих транскриптов приходится на белок-кодирующие последовательности. В настоящее время считается, что многие белок-некодирующие транскрипты могут выполнять функциональную роль, влияя на активность регуляторных элементов. В частности, было продемонстрировано, что некодирующая транскрипция способна регулировать функционирование репрессорных участков генома - сайленсеров. При этом для некоторых репрессорных белков была показана способность непосредственно взаимодействовать с молекулами некодирующих РНК.

Также довольно давно известно о существовании некодирующих РНК в регуляторных районах генома, содержащих энхансеры. Вполне вероятно, что один из механизмов органичения активности энхансеров может быть основан на участии некодирующией транскриции.

Второй, более изученный механизм ограничения активности энхансеров, основан на

свойствах регуляторных элементов другого класса - инсуляторов. Считается, что главная роль

инсуляторов заключается в модулировании взаимодействий между энхансерами и промоторами.

Основным свойством всех инсуляторов является способность блокировать энхансеры только в том

1

случае, если инсулятор находится между энхансером и промотором гена. Существует две наиболее согласующихся с экспериментальными данными модели действия инсуляторов. Данные модели не являются взаимно исключающими и могут дополнять друг друга.

Первая модель объясняет механизм действия инсуляторов наличием стабильных взаимодействий между разными инсуляторами, что играет определяющую роль в контроле коммуникации между энхансерами и промоторами. Показано, что взаимодействия между инсуляторами могут приводить как к изоляции энхансера от промотора, так и к их сближению, что зависит как от типа инсулятора и его ориентации, так и от расстояния между всеми регуляторными элементами (энхансерами, инсуляторами и промоторами) в модельной системе.

Вторая модель, «ловушка», предполагает, что инсуляторы способны непосредственно взаимодействовать с энхансерами, что приводит к изоляции энхансера от промотора. Постулируется, что инсуляторы являются структурно сходными с промоторами элементами. Аргументом модели является то, что некоторые инсуляторы (ses, ses', IdefixU3, Faswb) включают предпромоторные и промоторные последовательности. Показано также, что некоторые промоторы генов Srt/гогас-комплекса обладают инсуляторной активностью в эмбрионах Drosophila.

Альтернативно, в нашей лаборатории было предположено, что свойства инсуляторов могут объясняться их способностью напрямую взаимодействовать с промоторами генов. Данная способность была подтверждена для двух инсултяоров дрозофилы: 1А2 и Wari. Было продемонстрировано, что 1А2- и Wari-инсуляторы взаимодействуют с промоторами генов yellow и white, соответственно.

Данная работа посвящена изучению механизмов ограничения активности энхансеров. Исследован эффект некодирущей транскрипции на способность энхансеров тела и крыльев гена yellow и энхансера глаз гена white стимулировать транскрипцию генов-мишеней. Изучена способность 1А2- и Wari-инсуляторов взаимодействовать с промоторами разных генов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основной целью работы явилось изучение механизмов ограничения активности энхансеров D.melanogaster. В работе были поставлены следующие задачи:

1) Выяснить возможность влияния некодирующей транскрипции на активность энхансеров генов yellow и white.

2) Проверить возможность стабилизации активности энхансеров в составе трансгена терминаторами транскрипции.

3) Протестировать способность инсуляторов взаимодействовать с разными промоторами.

4) Определить зависимость обогащения инсуляторных белков на промоторе от присутствия инсулятора в трансгене.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА II ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. В работе впервые показано, что некодирующая транскрипция, проходящая через энхансеры генов yellow и while, инактивирует их способность стимулировать транскрипцию гена-мишени. Продемонстрировано, что данный эффект не зависит от расстояния между регуляторным элементом и геном-мишеныо. Кроме того, в данной работе продемонстрировано, что 1А2- и Wari-инсуляторы функционально взаимодействуют с разными промоторами. Методом иммунопреципитации хроматина подтверждено взаимодействие 1А2-инсулятора с промотором гена even-skipped в трансгеиной системе. Результаты данной работы имеют также практический интерес. В частности, было показано, что фланкирование трансгенной конструкции терминаторами транскрипции стабилизирует активность регуляторных элементов внутри системы. Данный результат может быть использован при создании конструкций для экспрессии различных рекомбинантных белков.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты диссертационной работы были представлены на 13-ой (Пущино, 28 сентября-2 октября, 2009), 14-ой (Пущино, 19-23 апреля, 2010) и 15-ой (Пущино, 1822 апреля, 2011) Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых; на международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011» (Москва, 11-15 апреля, 2011); на международных конференциях 35th FEBS Congress "Molecules of Life" (Gothenburg, Sweden, 26June-l July, 2010) и 36th FEBS Congress «Biochenistry for tomorrow's medicine» (Torino, Italy, 25-30 June, 2011); на международном симпозиуме "Control of gene expression and cancer" (Moscow, 21-25 June, 2010).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ. Из них статей -2, тезисов устных и стендовых сообщений на конференциях - 9.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 100 страницах, содержит 20 рисунков и 3 таблицы, состоит из Введения, Обзора литературных данных, Материалов и методов, Результатов исследования, Обсуждения, Выводов и Списка литературы, включающего 104 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА I. Изучение влияния транскрипции на активность энхансеров генов yellow и white. 1) Некодирующая транскрипция влияет на активность энхансеров гена yellow, расположенных на дальнем расстоянии от промотора.

Исследование влияния транскрипции на активность энхансеров проводилось на модельных системах в трансгеных линиях D. melanogasler. Для этого генетические конструкции, содержащие необходимый набор регуляторных элементов, были фланкированы 5'- и З'-концами Р-элемента,

з

включающими концевые инвертированные повторы, необходимые для интеграции конструкций в геном путем микроинъекции плазмидной ДНК в эмбрионы D.melanogaster.

На первом этапе было проверено влияние некодирующей транскрипции на активность тканеспецифичных энхансеров гена yellow. Ген yellow отвечает за пигментацию кутикулярных структур личинки и имаго. В работе использовались тканеспецифичные энхансеры гена yellow, отвечающие за высокий уровень экспрессии данного гена в кутикуле тела и в крыловых пластинах (далее энхансеры тела (В) и крыльев (W)). Изменения в экспрессии гена yellow легко оценивать фенотипически: уровень пигментации кутикулярных структур оценивается по пятибалльной шкале, где 5 соответствует уровню пигментации дикого типа (энхансер-зависимая экспрессия гена yellow), 2 соответствует базовому уровню пигментации (экспрессия гена yellow в отсутствие энхансера), 1 соответствует отсутствию пигментации (у1 аллель - полная инактивация гена yellow), 3 и 4 - частичная активация энхансерами базовой транскрипции.

В первой конструкции, GEWY (рис. 1А), энхансеры тела и крыльев располагались на расстоянии 4,7т.п.н. от промотора гена yellow. В качестве линкера в данной конструкции использовался ген white, который был встроен между энхансерами и геном yellow. Для направленной транскрипции через энхансеры использовался минимальный промотор гена теплового шока hsp70, перед которым находились пять сайтов связывания для дрожжевого белка-активатора GAL4 (UAS-промотор). Данный промотор был встроен с 5'-стороны от энхансеров. Минимальный промотор гена теплового шока 70 лишен сайтов связывания для фактора теплового шока и обуславливает слабый уровень транскрипции. Для индукции высокого уровня транскрипции через исследуемые энхансеры, трансгенные линии скрещивались с линией, несущей ген GAL4-aKTHBaTopa под контролем сильного тубулинового промотора. Таким образом, данная система позволяет оценить влияние как слабой, так и сильной транскрипции на активность изучаемого регуляторного элемента. Энхансеры тела и крыльев были фланкирован FRT-сайтами для сайт-специфической рекомбиназы Flp, UAS-промотор - LOX-сайтами для сайт-специфической рекомбиназы Сге. Данный подход позволяет in vivo удалять выбранные фрагменты ДНК и сравнивать экспрессию генов в присутствии и в отсутствие ключевых элементов в модельной системе в одном и том же месте генома, что необходимо для оценки их влияния на наблюдаемый уровень транскрипции маркерных генов.

В результате трансформации конструкции в эмбрионы дрозофилы было получено 9 независимых трансгенных линий. Во всех трансгенных линиях мухи имели желтую пигментацию тела и крыловых пластин, соответствующую базовому уровню экспрессии гена, что свидетельствует о неспособности энхансеров стимулировать транскрипцию гена yellow. При активации транскрипции с UAS-промотора, проходящей через энхансеры, уровень экспрессии гена yellow не изменялся. Отсутствие активации гена yellow энхансерами в исходных линиях, возможно, связано с тем, что даже низкого уровня транскрипции с минимального промотора гена

4

теплового шока 70 (без дополнительной стимуляции ОАЬ4-активатором) достаточно для того, чтобы полностью блокировать работу энхансеров. Однако делеция UAS-промотора из трансгенной системы не привела к изменению пигментации, что свидетельствует о неспособности энхансеров стимулировать транскрипцию гена yellow и в отсутствие проходящей транскрипции. Отсутствие активации гена yellow энхансерами, было также подтверждено их делецией из трансгенной системы.

Из литературных данных известно, что некоторые промоторы генов Bithorax-комплекса обладают инсуляторной активностью в эмбрионах Drosophila, таким образом, мы предположили, что в конструкции GEWY промотор гена white функционирует как инсулятор по отношению к энхансерам тет yellow, конкурируя с промотором гена yellow за сигнал энхансера.

Для проверки данной гипотезы, а также для адаптации модельной системы для изучения влияния некодирующей транскрипции на энхансеры, была сделана конструкция GEdWY (рис. 1Б). В этой конструкции энхансеры тела и крыльев были отдалены от гена yellow также при помощи гена white, но в данном случае промоторная область гена white была делегирована. Индукция транскрипции, как и в предыдущей конструкции, запускалась с UAS-промотора.

В результате трансформации конструкции GEdWY было получено 9 независимых трансгенных линий. Пигментация тела и крыловых пластин в 4-х трансгенных линиях соответствовала частичной активации энхансерами промотора гена yellow, в 5-ти - базовому уровню экспрессии гена yellow. Однако удаление UAS-промотора из системы привело к усилению пигментации тела и крыловых пластин во всех линиях (фенотипы мух соответствовали энхансер-зависимой экспрессии гена yellow). Данный результат свидетельствует о том, что в отсутствие промотора гена white энхансеры гена yellow функционально активны, а также, что минимальный промотор гена теплового шока hsp70 в отсутствии индукции влияет на активность энхансеров гена yellow. Индукция сильной транскрипции в исходных линиях привела к полному ингибированию способности энхансеров активировать транскрипцию, что было подтверждено делецией энхансеров.

В конструкции GEWY с полноценным геном white, отделяющим энхасеры от промотора гена yellow, наблюдали эффект конкуренции промоторов за взаимодействие с энхансерами. В GEdWY, кроме промотора гена yellow присутствует промотор UAS, с которого через энхансеры запускается транскрипция. Таким образом, полученный результат, возможно, объясняется конкуренцией более близкого к энхансеру UAS-промотора. Чтобы исключить данную возможность, была сделана конструкция GREdWY (рис. 1В), в которой UAS-промотор располагался с 5'-стороны от энхансеров, но был направлен в противоположную сторону, чтобы транскрипция шла от энхансеров, а не через них. При такой ориентации транскрипция с UAS-промотора не должна влиять на активность энхансеров, если важна проходящая транскрипция, а

не наличие в системе активного промотора. Энхансеры тела и крыльев, как и в предыдущей конструкции, были отдалены от гена yellow геном white с делегированным промотором.

4

4.6 Ith

white

i] ]№limt'

5 4 3 2 1

■ GEWY

^ +GAL • álox

L д/rt L+gal

Ш 9

Ш 0/9

Ш 0/9

GO 0/9

Ш 0/9

В

frt frt

) white |-[ yellow

1 УеШ

5 4 3 2 i iii/ni>

GRF.dWY rrn 4

+GAL ш 1/4

Álox гтп 0/4

Ь/,1 Ш 4/4

+GAL Ш 0/4

fri frt 5 4 3 2 1 "зли.

I GEdWY um 9 Ш 4/9

• Ate 14 ; 4 ll 9/9

•i Д/" Ш 4/9

'--G.M. Ш 0/9 4.6 lib

fax fax

25M bp linker 1

fn

) white f-| yellow

5 4 3 2 1 И1Л1р

UI2500EdWY 16 -> ll 9

+GAL GD 8/5

Álox rrn 8/S

Aßt GD 8/s

+GAL GD (И

Рис.1. Некодирующая транскрипция инактивирует способность энхансеров гена yellow активировать транскрипцию на дальнем расстоянии. Конструкции: А - GEWY, Б - GEdWY, В - GREdWY, Г -G12500Ed\VY. (А-Г) Сверху представлена схема конструкции, под схемой суммированы результаты по анализу фенотипов трансгенных линий мух в теле и в крыловых пластинах, несущих данную конструкцию и ее производные. Обозначения: серые круги - тканеспецифичные энхансеры гена yellow, обеспечивающие высокий уровень экспрессии в крыльях (W), теле (В); G4 - пять сайтов связывания дрожжевого белка-активатора GAL4; серый и белый прямоугольники с длинными горизонтальными стрелками сверху - гены yellow и white, соответственно; белый прямоугольник с короткой горизонтальной стрелкой - минимальный промотор гена теплового шока 70; горизонтальные стрелки указывают направление транскрипции. Вертикальными стрелками отмечены сайты frt и 1ох для сайт-специфических рекомбиназ Flp и Сге, соответственно. "+ GAL" - результат скрещивания трансгенных линий мух с линией, экспрессирующей белок-активатор дрожжей GAL4. При скрещивании трансгенных линий мух с делецией UAS-промотора с линией, экспрессирующей GAL4, изменений не наблюдалось ни в одной из линий (во всех протестированных конструкциях в данной работе).

Пигментация тела и крыльев, зависящая от уровня экспресии гена yellow. 1 - отсутствие пигментации; 5 -уровень пигментации, соответствующий энхансер-зависимой экспрессии гена; 2-4 - промежуточные уровни. Цифры в строках - число линий с соответствующей пигментацией. Из/Пр - отношение числа линий, в которых наблюдалось изменение (Из) пигментации при скрещивании с линией мух, экспрессирующей ОАЬ4-активатор, или при удалении исследуемого элемента, к общему числу проанализированных (Пр) линий. Серым курсором на цифровой панели указано среднее значение фенотипов в проанализированных линиях мух.

В результате трансформации были получены 4 независимые трансгенные линии. Пигментация тела и крыловых пластин трансгенных линий соответствовала энхансер-зависимой экспрессии гена yellow. Стимуляция транскрипции с UAS-промотра не привела к снижению уровня экспрессии ie.\a yellow. Отсутствие влияния транскрипции с минимального промотора гена

теплового шока было подтверждено делецией UAS-промотра.

6

Таким образом, некодирующая транскрипция с близко расположенного промотра влияет на способность энхансеров тела и крыльев активировать транскрипцию па дальнем расстоянии от промотора гси-л yellow.

Известно, что активные гены характеризуются специфическим гистоновым кодом, т.е. наличием характерных посттрансляционных модификаций нуклеосом. При этом существуют разные модификации гистонов вблизи промоторных участков и в транскрибируемых областях, удаленных от промотора. Энхансеры, в свою очередь, также обладают особым гистоновым кодом, важным для их активности. В описанных выше конструкциях энхансеры располагаются в непосредственной близости к UAS-промотору, с которого через них запускается транскрипция. Таким образом, чтобы проверить, что в предлагаемых конструкциях важна проходящая транскрицпия, а не специфические модификации гистонов вблизи промотора, была создана генетическая конструкция G12500EdWY (рис. 1Г). Расположение основных элементов в системе соответсвовало конструкции GEdWY, но расстояние между индуцибельным промотором и энхансерами было увеличино до 2500 п.н. линкером из кодирующей области гена LacZ.

В результате трансформации данной конструкции было получено 9 независимых трансгенных линий. Пигментация тела и крыловых пластин в 8 из 9 трансгенных линиях соответствовала экспрессии гена yellow выше базового уровня. Индукция сильной транскрипции в исходных линиях привела к полному ингибированию способности энхансера активировать транскрипцию. Делеция UAS-промотора из системы привела к усилению экспрессии гена yellow в большинстве линий, свидетельствуя о том, что слабый уровень транскрипции с минимального промотора гена теплового шока также частично ингибирует активность энхансеров. Делеция энхансеров подтвердила их функциональную активность в системе.

Таким образом, некодирующая транскрипция с удаленного на 2,5т.п.н. промотора влияет па способность энхансеров тела и крыльев активировать транскрипцию на дальнем расстоянии от промотора гена yellow.

2) Некодирующая транскрипция влияет на активность энхансера гена white, расположенного на дальнем расстоянии от промотора.

Механизм регуляции активности разных энхансеров не обязательно должен быть одинаковым. Следовательно, эффект некодирующей транскрипции на их активность также может отличаться. Чтобы проверить, насколько общим является ингибирование активности энхансеров посредством некодирующей транскрипции, было решено протестировать влияние некодирующей транскрипции на активность энхансера другого гена. В качестве модели был выбран тканеспецифичный энхансер гена white. Уровень экспрессии гена white, так же как и гена yellow, легко оценивать фенотипически по пигментации глаз: красная окраска является пигментацией глаз мух дикого типа (энхансер-зависимая экспрессия гена white)', желтая и темно-желтая окраски

7

представляют собой средне-статистическое проявление базовой пигментации (экспрессия гена white в отсутствие энхансера), белая окраска глаз наблюдается в отсутствии пигментации (у мух с инактивированным геном white).

Для изучения влияния транскрипции, проходящей через энхансер гена white на дальнем расстоянии, была создана конструкция GEYW (рис. 2А), содержащая расположенные друг за другом гены yellow и white. Энхансер гена white, фланкированный FRT-сайтами, был встроен между энхансерами гена yellow перед промотором гена yellow. При этом энхансер глаз гена white располагался на расстоянии 7,1 т.п.н. от промотора гена white. Для направленной транскрипции через энхансеры, как и в предыдущих конструкциях, использовался UAS-промотор. Данный промотор, фланкированный LOX-сайтами, был встроен с 5'-стороны от энхансеров.

В результате трансформации данной конструкции было получено 8 независимых трансгенных линий. Пигментация глаз трансгенных линий мух, несущих конструкцию, была выше уровня базовой экспрессии гена white и соответствовала пигментации при неполной активации гена тканеспецифичным энхансером. Индукция сильной транскрипции привела к полному ингибированию способности энхансера активировать транскрипцию, что было подтверждено делецией энхансера. Делеция UAS-промотора из системы привела к значительному усилению пигментации глаз практически во всех линиях, что свидетельствовало о том, что, как и в случае с геном yellow, транскрипция с неиндуцированного промотора частично ингибирует активность энхансера гена white.

Анализ конструкции GEYW, также как и результат использования данной системы в других работах, свидетельствуют, что энхансер гена white эффективно стимулирует промотор гена white на расстоянии гена yellow. Тем не менее, чтобы проверить возможность потенциального влияния промотора гена yellow на интенсивность взаимодействия между энхансером и промотором гена white и на наблюдаемый эффект по влиянию транскрипции, была сделана контрольная конструкция GEdYsW (рис. 2Б), в которой промотор гена yellow бьи удален. Ген white содержит IRES-подобный элемент (IRES - Internal Ribosome Entry Site, внутренний сайт инициации трансляции), который позволяет экспрессировать функциональный белок с независимых промоторов, расположенных выше гена white. Для того чтобы полностью исключить данный эффект, в дополнении к внутреннему терминатору гена yellow, в положение -327 относительно старта транскрипции гена white был встроен коровый фрагмент терминатора SV40.

В результате трансформации данной конструкции бьио получено 6 независимых

трансгенных линий. Пигментация глаз большинства трансгенных линий мух, несущих

конструкцию GEdYsW, была выше, чем в конструкции GEYW, однако также соответствовала

неполной активации гена тканеспецифичным энхансером. Индукция сильной транскрипции

привела к полному ингибированию способности энхансера активировать транскрипцию, что было

подтверждено делецией энхансера. Делеция UAS-промотора из системы привела к существенному

8

усилению пигментации глаз практически во всех линиях, что свидетельствовало о том, что, как и в случае гена yellow, транскрипция с неиндуцированного промотора частично ингибирует активность энхансера гена white.

Таким образом, приеутсвие промотора гена yellow в конструкции GEYW не влияет на эффект проходящей через энхансер гена white транскрипции.

fit Jrl

white I—

к-р iKiptoipTOp Op Ж сЖ Itillf,

| GEYW nm 8

ugal со s/8

• Ate ll i 2 1 ii 7/8

• Л//'/ co 8/8

l -hgal co 0/8

[(axaij-Qvi в ¡в>

/(iv hx

fri fit

THE

while

K|) iKiipKop iQp Op i /K Ж сЖ и*/Пр

GEdYsW П~Г

»+GAL

Дto 1.4 "Г 21

Aßt

+GAI.

ZD гт

rm ES

7.1kh

6 6/6 56 6/6

0.6

]S<a>r^ME)B>

lo.x lo.x

white Ц (^E^)-1 yel1<т Й Zhite h

frl fil

K]1 тк'орЬ'пртОр Op гЖ Ж c'/K Ht/llp

■ GREY\V I I 3 1~T1

+GAL 12 4 17 1 ^ i to ГГТТТ1

9

2'9

0/1

Vp тКпрКортОр Op IЖ Ж гЖ 11I llp

■ GI2500EVW II I 1 4 Я

Wml mm

> ¿to и i ¡ 4

• л fit II T"4I

l. +GAL И 1 41

9

9'9 1/9 В 0/8

Д _7.1 kb_

' KZ kb *

-1 yellow Й white [—

iü\ iox

_Kp rKiipKiiplOp Op гЖ Ж [Ж И |/Пр

,. GE"Y\V И i-.S i I 9

L+GAL II 4 41 И

• +GAL Ate I 3 1 I II

Pnc.2. Некодирующая транскрипция инактивнрует способность энхансера гена white активировать транскрипцию на дальнем расстоянии. Конструкции: А - GEYW, Б - GEdYsW, В - G EYW, Г -G12500EYW, Д - GERYW. (А-Д) Сверху представлена схема конструкции, под схемой суммированы результаты по анализу фенотипов трансгенных линий мух в глазах, несущих данную конструкцию и ее производные. Обозначения: Е - энхансер глаз гена white\ SV40 - терминатор транскрипции SV40, Пигментация глаз, зависящая от уровня экспрессии гена white: Кр - красный; тКор - темно-коричневый; Кор - коричневый; тОр - темно-оранжевый; Ор - оранжевый; тЖ - темно-желтый; Ж - желтый; сЖ -светло-желтый, Б - белый. Остальные обозначения как на рис.1.

Дополнительно было проверено, что наблюдаемый в предыдущих конструкциях эффект не связан с конкуренцией UAS-промотора с промотором гена white за сигнал энхансера.

В конструкции GrEYW (рис. 2В) расположение энхансеров и генов соответствовало конструкции GEYW, но UAS-промотор был направлен в противоположную сторону, чтобы транскрипция шла от энхансера гена white.

В результате трансформации было получено 9 независимых трансгенных линий. Пигментация глаз трансгенных линий соответствовала энхансер-зависимой экспрессии гена white. Более того, индукция транскрипции не повлияла на способность энхансера глаз активировать промотор гена white. Отсутствие влияния транскрипции с минимального промотора гена теплового шока hsp70 было подтверждено делецией UAS-промотора. Таким образом, присутствие UAS-промотра в системе, транскрипция с которого идет от энхансера глаз, не влияет на активность энхансера.

В следующей конструкции, G12500EYW (рис. 2Г), было проверено, влияет ли инсерция линкера длинной 2500 п.н. между промотором и энхансером на ингибирование энхансера посредством транскрипции. В результате трансформации было получено 9 независимых трансгенных линий. Пигментация глаз трансгенных линий мух, несущих конструкцию, была выше базового уровня экспрессии гена white. Индукция транскрипции снижала пигментацию глаз до уровня, соответствующего базовой экспрессии, что было подтверждено делецией энхансера. Следовательно, инсерция линкера не влияет на негативный эффект проходящей через энхансер транскрипции.

Дополнительно было проверено влияние ориентации энхансера внутри системы на его ингибирование транскрипцией. Анализ трансгенных линий мух с конструкцией GERYW (рис. 2Д) показал, что некодирующая транскрипция ингибирует активность энхансера вне зависимости от ориентации последнего.

Таким образом, некодирующая транскрипция ингибирует способность энхансера гена white стимулировать транскрипцию на дальнем расстоянии.

3) Некодирующая транскрипция влияет на активность энхансеров генов yellow и white, расположенных на близком расстоянии от промотора гена-мишени.

На следующем этапе было проанализировано влияние транскрипции, проходящей через энхансерный элемент, в случае небольшого расстояния между энхансерами и промотором гена-мишени.

В конструкциях GEYW (рис. ЗА), GREYW (рис. ЗБ), описанных выше (рис. 2А и 2В), энхансеры тела и крыльев расположены на близком расстоянии (1,2т.п.н.) от промотора гена yellow. Пигментация тела и крыловых пластин в трансгенных линиях, несущих конструкциию GEYW, соответствовала уровню экспрессии гена yellow при неполной активации гена энхансерами. Пигментация тела и крыловых пластин в трансгенных линиях, несущих конструкциию GREYW, соответствовала частичной (3,4) или полной (5) активации гена yellow

ю

энхансерами. Делеция UAS-промотора из трансгенных линий GEYW привела к усилению экспрессии гена yellow в большинстве линий, свидетельствуя о том, что транскрипция с минимального промотора гена теплового шока частично ингибирует активность энханссров. Данный эффект отсутствовал при делеции UAS-промотора из трансгенных линий GREYW, в которых UAS-промотор встроен в противоположном направлении. В то же время индукция сильной транскрипции в исходных линиях конструкции GEYW не приводила к снижению активации. Данный эффект может быть объяснен тем, что ОАЬ4-активатор способен стимулировать транскрипцию гена yellow, если его сайты связывания расположены на относительно близком расстоянии от промотора. Действительно, в конструкции G12500EYW (рис. 2В), где GAL4-aicnmaT0p отодвинут на 2,5 т.п.н., при индукции транскрипции происходило ингибирование активности энхансеров генауе/low.

7.1 Hi

7.1 lib

1.2 kh

1.2 kh

-1 yellow Й white I— -1 ye/1«» Й white. h" Jrt Jrt [Pc/fe^. ' fit fit

5 4 3 2 1 5 4 3 2 1 Hi/llp

I GEYW I? j II 8 WGAL I I 6 I I 4/8 ** Л lux I 5 I I II 5/8

C"EYW I j "4" 11

+gal 14 4 11

Alox I i 1 I I 7.1 Ы)_

9

1/9 0/9

1.2 kh

-(wjTjS)-1 yellow "Vl white >

,n/r'\y,gfc^

5 4 3 2 lHj/Пр

C12500EYVV RTTI

-ioxeSJ

+gal A lox

248 bp rv 1

n~m »

E3 9/9

Jrt fit

5 4 3 2 1 илгр

1.3 kl)

gXiiflji«,.fщ№ >

Jn fi t

. GllOOOKYlTTT

Ug.

gal еш 9/9

A lox GD 7/9

Ajr, Ш 8/8

----__

Кр 1 Кор Кор Юр Ор тЖ Ж сЖ и illp

GUOOOF.SW 17' 1 1 8

4GAL 1 1 .Ч_|. 21 8/8

Aim 1р 1 1 0/6

A fit 1ГГЗ"Э1 8/8

Рнс.3. Некодирующая транскрипция инактивирует способность энхансеров генов yellow и white, расположенных на близком расстоянии от промотора. Конструкции: А - GEYW, Б - GREYW, В -G12500EYW, Г - G11000EY, Д - G11000ESW. (А-Д) Сверху представлена схема конструкции, под схемой суммированы результаты по анализу фенотипов трансгенных линий мух в теле, в крыловых пластинах и в глазах. Обозначения как на рис.2.

Дополнительно была сделана контрольная конструкция G11000EY (рис. ЗГ), в которой UAS-промотор был отодвинут от энхансеров тепа yellow за счет линкера из кодирующей области гена LacZ на расстояние 1 т.п.н. Энхансеры тела и крыльев были встроены в непосредственной близости от промотора гена yellow (248 п.н.). В результате трансформации конструкции в эмбрионы дрозофилы было получено 9 трансгенных линий. Пигментация тела и крыловых пластин всех линиях мух, несущих конструкцию, была выше уровня базовой экспрессии гена yellow и соответствовала частичной (3,4) или полной (5) активации гена yellow энхансерами. Индукция сильной транскрипции в исходных линиях привела к снижению уровня экспрессии гена yellow практически до базового, что свидетельствует об ингибировании активности энхансеров. Делеция UAS-промотора из системы привела к полному восстановлению энхансер-зависимой экспрессии гена yellow во всех линиях. Делеция энхансеров подтвердила их функциональную активность в системе.

Для тестирования влияния некодирующей транскрипции на способность энхансера гена while стимулировать транскрипцию на близком расстоянии была сделана конструкция G11000ESW (рис. ЗД). UAS-промотор также был расположен перед энхансерами на расстоянии линкера длинной 1 т.п.н. Перед промотором гена white дополнительно был встроен полноразмерный терминатор транскрипции SV40. В результате трансформации данной конструкции было получено 8 независимых трансгенных линий. Пигментация глаз трансгенных линий мух, несущих конструкцию, была выше уровня базовой экспрессии гена white и в большинстве линий соответствовала полной энхансер-зависимой экспрессии гена white. Однако при индукции транскрипции с UAS-промотора пигментация трансгенных линий мух снизилась практически до базового уровня, что было подтверждено делецией энхансеров.

Таким образом, некодирующая транскрипции влияет на способность энхансеров генов yellow и white стимулировать транскрипцию на близком расстоянии.

4) Терминаторы транскрипции стабилизируют активность энхансеров генов white и yellow в составе трансгенных конструкций.

Полученные данные свидетельствуют, что в трансгенных линиях взаимодействия между энхансерами и промоторами генов могут нарушаться за счет проходящей через трансген транскрипции. Это в свою очередь предполагает, что терминаторы транскрипции должны стабилизировать активность энхансеров в составе трансгенов. Чтобы подтвердить данное предположение были сделаны следующие конструкции GSEdWY (рис. 4А) и GSEsY (рис. 4Б), в которых между UAS-промотором и энхансерами гена yellow был встроен терминатор транскрипции вируса SV40.

В конструкции GSEdWY энхансеры гена yellow располагались на расстоянии 4,6 т.п.н. от

промотора, в качестве линкера выступала кодирующая область гена white. В результате

12

трансформации было получено 8 независимых трансгенных линий. Пигментация тела и крыльев трансгенных линий соответствовала энхансер-зависимой экспрессии гена yellow. Индукция сильной транскрипции не повлияла на способность энхансеров активировать транскрпцию. Отсутствие влияния транскрипции с минимального промотора гена теплового шока hsp70 в присутствии терминатора в системе была подтверждена делецией UAS-промотора. После делеции энхансера пигментация тела и крыльев трансгенных мух снизилась до базового уровня, что подтвердило их функциональную активность. Таким образом, присутствие 8У40-терминатора в системе стабилизирует способность энхансеров гена yellow активировать промотор гена, находящийся на большом расстоянии.

Во второй конструкции, GSEsY, энхансеры тела и крыльев были встроены на расстоянии 1,4т.п.н. от промотора гена yellow. В данной конструкции сайтами для сайт-специфической рекомбиназы Flp был фланкирован SV40 терминатор, встроенный с 5'-стороны от энхансеров. На расстоянии 1,2т.п.н. от терминатора располагался UAS-промотор. В результате трансформации было получено 9 независимых трансгенных линий. Пигментация тела и крыльев трансгенных линий соответствовала энхансер-зависимой экспрессии гена yellow. Индукция сильной транскрипции, как и в конструкции GSEdWY, не повлияла на способность энхансеров активировать транскрпцию. В то же время, индукция транскрипции с UAS-промотора в линиях мух с удаленным 8У40-терминатором (Д fit), привела к резкому падению экспрессии гена-мишени до базового уровня. Это свидетельствует о том, что 5У40-терминатор эффективно блокировал транскрипцию, приводя к стабилизации активности энхансеров в трансгене.

Дополнительно стабилизация активности энхансера терминатором транскрипции была проверена для энхансера глаз гена white. В конструкции GSEdYW (рис. 4В) расстояние между энхансером глаз и геном white составляло 6,9 т.п.н. В качестве линкера был использован ген yellow с делетированной промоторной областью. 5У40-терминатор был встроен с 5'-стороны от энхансеров. Промотор UAS находился перед терминатором на расстоянии линкера из кодирующей области гена GFP. В данной конструкции энхансер глаз гена white был фланкирован FRT-сайтами, терминатор транскрипции - LOX-сайтами. В результате трансформации было получено 8 независимых трансгенных линий. Пигментация глаз трансгенных линий соответствовала энхансер-зависимой экспрессии гена white. Индукция транскрипции с UAS-промотора в присутствии терминатора в системе не привела к снижению пигментации. В отличие от этого, при индукции транскрипции после удаления терминатора, пигментация во всех линиях снизилась практически до базового уровня, что свидетельствует о том, что в исходных линиях терминатор транскрипции эффективно стабилизировал активность энхансера. Функциональная активность энхансера была подтверждена его делецией.

_ЕГ 7 Т ■ ...... .

Н г"™ h

5 4 3 2 1 Н*/И||

. GSEdWY [Т] 1- +GAL Ш 8

0/8

• Д/м Ш 0/8

S A/rt ^ +GAL Ш 8/8

Ш м 3.1 Ub

В ' 0.7 kl)

5 4 3 2 I И|/)||| 9

0/9 0/9 0/9

Ш от

. GSEsvcg

LIGAL GQ

ilm Ш

ду» ш

+GAL

^ ifrl

71» tip Z22 lip.------—

E EH' •") yellow *lti

fox lox frt ft 7

WhU,--—-

k'p itoipKop 1<>р ОртЖ Ж сЖ Hj/Пр

, GSEdYW 16 1 II WiAL 16 111

'. Д hi A'

^+GAL • iJH +GAL

14 1 1 Л

НИ

ш

EO

8 0/8 2/8 8/8 8/8 0/8

Рис.4. Исследование влияния терминаторов в системе на стабилизацию активности энхансеров генов yellow и white. Конструкции: А - GSEdWY, Б - GSEsY, В - GSEdYW. Остальные обозначения как на рис.2 и 3.

Таким образом, терминатор транскрипции эффективно предотвращает негативное влияние некодирующей транскрипции на активность энхансеров.

ГЛАВА II. Изучение специфичности взаимодействия инсуляторов с промоторами генов.

1) 1А2- и Wari-нсуляторы взаимодействуют с промоторами разных классов.

В геноме 1А2-инсулятор находится в непосредственной близости от З'-кодирующей области гена yellow. Wari-инсулятор был обнаружен с З'-конца гена white. Ранее было показано, что 1А2- и Wari-нсуляторы функционально взаимодействуют с промоторами генов yellow и white, соответственно. Несомненно, что способность инсуляторов взаимодействовать с промоторами генов может играть важную роль в энхансер-блокирующей активности регуляторных элементов данного класса. Для дальнейшего изучения роли инсуляторов в модулировании активности энхансеров посредством их взаимодействия с промоторами является важным исследование специфичности данных взаимодействий и способности инсуляторов взаимодействовать с промоторами разных классов.

Поэтому следующей задачей было протестировать способность 1А2-инсулятора взаимодействовать с промотором гена white, а Wari-инсуляторэ - с промотором гена yellow. Промоторы генов yellow и white относятся к разным типам. Так, промотор тепа yellow относится к

14

группе ТАТА-содержащих промоторов, в то время как промотор гена white содержит только коровые последовательности Inr и DPE.

Для тестирования были созданы конструкции YG4(Wari) (рис. 5А) и WG4(1A2) (рис. 5Б), основанные на разработанной ранее модельной системе. Данная модельная система базируется на неспособности белка-активатора дрожжей GAL4 стимулировать промотор гена-мишени в случае, если его сайты связывания находятся на большом расстоянии от промотора. С 3'- стороны от генов были встроены 10 сайтов связывания белка-активатора GAL4. 1А2- (или Шап^инсулятор, фланкированный LOX-сайтами, был расположен за геном white (или yellow) и сайтами для белка-активатора дрожжей. В данной системе в случае наличия функционального взаимодействия между тестируемыми парами регуляторных элементов, ОАЬ4-активатор будет приближаться к промотору гена и активировать транскрипцию.

В результате трансформации конструкции YG4(Wari) было получено 18 независимых трансгенных линий. Пигментация тела и крыльев трансгенных линий была на уровне базовой экспрессии гена yellow. Введение ОАЬ4-активатора привело к усилению пигментации практически во всех трансгенных линиях, т.е. ОАЬ4-активатор эффективно стимулировал транскрипцию гена yellow. Делеция Wari-инсулятора показала, что наблюдаемая активация зависит от присутствия инсулятора в системе.

В результате трансформации конструкции WG4(1A2) было получено 16 независимых трансгенных линий. Пигментация глаз трансгенных линий мух, несущих конструкцию, была на уровне базовой экспрессии гена white. Введение ОАЬ4-активатора привело к значительному усилению пигментации глаз во всех протестированных линиях. В отсутствие 1А2-инсулятора эффективной активации не наблюдалось.

Таким образом, инсулятор 1А2 может функционально взаимодействовать с промотором гена white, a Wari - с промотором гена yellow. Интересно, что делеция 1А2 инсулятора в трансгенных линиях мух, несущих конструкцию WG4(1A2), привела к значительному снижению пигментации глаз в большинстве трансгенных линий, что свидетельствует о том, что 1А2-инсулятор поддерживает базовую активность промотора гена white.

Дополнительно была проверена способность данных инсуляторов взаимодействовать с

промотором гена yellow в глазах. Для этого были сделаны конструкции pryWG4(Wari) (рис. 5В) и

pryWG4(lA2) (рис. 5Г), в которых 1А2- и Wari-инсуляторы располагались с З'-стороны от гена

white и сайтов ОАЬ4-активатора, при этом ген white находился под контролем промотора гена

yellow. Результат фенотипического анализа показал, что GAL4 активировал экспрессию гена white

с промотора гена yellow. Делеция инсуляторов привела к значительному снижению активации

транскрипции в присутствии ОАЬ4-активатора. Таким образом, оба инсулятора способны

взаимодействовать с промотором гена^/слу в глазах. Важно отметить, что, как и в конструкции

WG4(1A2), делеция любого из инсуляторов приводила к снижению транскрипции, что

15

свидетельствует о том, что оба инсулятора поддерживают базовый уровень активности промотора тtmyellow в глазах.

5 4 3 2 1 "JJHp

i yg4(w3n) +gal

■'GAL

18

ims

tS 0/18 ЕШ m%

Kp iknp KopTOP 'l|i I'm 'Ж c'A hi N y lllt

I pry VVG4(Wari) +GAI, iTTT"

'I Д tox ^ 4-ПА1

з:

ЛЗ 1« 18/18 Т~Л 17/18

ггттт1 14:16

white [С^Ф—rZSi--

lar lax

Kp rKop Kti|l rO|l Op 1Ж Ж сЖ Bi'.i Я ; l I |i

_L

I WG4(1A2) +GAL II Г 7 I i

ТП

A lax

•+GAL

16 16/16 WW

€.3 21 9/10

while ¡-<нйЗ)——-

—~—lt>x lax

тлг

Kp тКорКрр I Up Op -|'Ж Ж сЖ KiM и i/ihi

I pryW04( IA2)

-gal dh

i й bx

WgaI..

19

19/19

I; ■ I'd'CI is/is

I3„.6,;;,2 Л 14/14

Рис.5. 1A2- и Wari-инсуляторы функционально взаимодействуют с промоторами генов white иyellow, соответсвенно. Конструкции: А - YG4(Wari), Б - WG4(1A2), В - pryWG4(Wari), Г - pryWG4(lA2). Обозначения: 10xG4 - десять сайтов связывания дрожжевого белка-активатора GAL4; серым и черным прямоугольниками обозначены инсуляторы Wari и 1А2, соответственно; pry-y-white - ген white, находящийся под контролем промотора гена yellow. Остальные обозначения как на рис.2.

Таким образом, 1А2- и Wari-инсуляторы взаимодействуют с промоторами разных классов.

2) Белки инсуляторного комплекса, СР190 и Mod(mdg4)-67.2, детектируются на промоторе гена even-skipped только в присутствии 1А2-инсулятора в трансгене.

Белки Su(Hw), CP 190 и Mod(mdg4)-67.2 ответственны за активность 1А2 инсулятора. В случае физического взаимодействия инсулятора с промотором можно ожидать, что инсуляторные белки будут детектироваться на промоторе методом иммунопреципитации хроматина (X-ChlP). Однако ранее было показано, что белки Su(Hw), СР190 и Mod(mdg4)-67.2 связываются с 1А2 инсулятором, но не обнаруживаются на промоторе гена yellow в эмбрионах Drosophila. Также недавно в нашей лаборатории было показано отсутствие белков Mod(mdg4)-67.2 и СР190 на промоторе гена yellow на стадиях личинки и куколки Drosophila дикого типа. Отсутствие обогащения компонентами инсуляторного комплекса было показано и для промотора гена yellow в составе трансгена, содержащего 1А2 с З'-стороны от гена yellow.

Наиболее вероятным объяснением отрицательного результата является тканеспецифичная экспрессия гена yellow только в клетках эктодермы, которые составляют незначительную часть от общего числа клеток, взятых в анализ. Можно предположить, что взаимодействие между инсулятором и промотором в клетках с неактивным геном yellow отсутствует и чувствительности метода X-ChIP не хватает для идентификации статистически значимого повышения связывания инсуляторных белков с промоторной областью гена yellow.

Мы протестировали обогащение разных промоторов белками основного транскрипционного комплекса: RNAPII и ТВР. Хроматин был иммунопреципитирован с использованием антител против данных белков, либо против неспецифических антител. Результаты экспериментов X-ChIP детектировались с помощью метода ПЦР в реальном времени (рис. 6). Во всех приведенных данных сигнал преципитации с неспецифическими антителами вычтен из представленных результатов. Действительно, иммунопреципитация с использованием антител против RNAPII и ТВР показала только слабое или полное отсутствие обогащения этих факторов на промоторе гена yellow. В то же время, промотор гена even-skipped был достаточно активен для детекции RNAPII и ТВР на промоторе методом X-ChIP.

Следовательно, в случае, если промотор гена even-skipped взаимодействует с 1А2-инсулятором, то он является подходящим для тестирования взаимодействий инсуляторов с промоторами данным методом.

А

RNAP II

эмбрионы

L.

hsp70 eve у (IT)

TBP

эмбрионы

ЛИЧИНКИ

1

I

1 sp!0 eve Y eve

С)

hsp'O eve Y eve

(to

Ыр70 eve У eve

W

Рис.6. Связывание RNAPII и ТВР с промоторами генов yellow и even-skippeel на эмбриональной стадии развития и стадии личинки Drosopliila. Результаты X-ChlP анализа с антителами к (A) RNAPII и (Б) ТВР. На диаграммах представлены результаты ПЦР в реальном времени после X-ChIP анализа (среднее значение четырех экспериментов; вертикальной линией обозначается стандартоное отклонение). Обозначения: hsp70 - эндогенный промотор гена теплового шока 70; eve (tr) - промотор гена even-skipped в конструкции preveYG4(l А2); Y - эндогенный промотор гена yellow, eve - эндогенный промотор гена even-skipped .

Для проверки способности промотора гена even-skipped взаимодействовать с 1А2-инсулятором была сделана конструкция preveYG4(lA2) (рис. 7), в которой 1А2-инсулятор был встроен с З'-стороны от гена yellow, находящегося под контролем промотора гена even-skipped. Сайты связывания йАЬ4-активатора находились между геном yellow и инсулятором. В результате трансформации конструкции preveYG4(lA2) было получено 22 независимых трансгенных линии. Пигментация тела и крыльев трансгенных линий была на уровне базовой экспрессии гена yellow. Введение ОАЬ4-активатора привело к усилению пигментации в 20 линиях. Данная активация зависела от присутствия 1А2-инсулятора в системе, что было подтверждено его делецией.

Таким образом, промотор гена even-skipped функционально взаимодействует с 1А2-инсулятором.

■ШШШШФа>

5 4 3 2 1 и>ш,>

I preveYG4(lA2) О 22

-K3AI. II 9.|0 21 20/22

Мох И 0/21

+GAL ЕШ 3/21

Рнс.7. 1А2-инсулятор функционально взаимодействует с промотором гена even-skipped. Конструкция preveYG4(lA2). Обозначения: preve-yellow - ген yellow, находящийся под контролем промотора гена even-skipped. Остальные обозначения как на рис.5.

На следующем этапе методом Х-СЫР было подтверждено наличие белков RNAPI1 и ТВР на промоторе гена even-skipped в составе трансгенной конструкции preveYG4(l А2) (рис. б).

Далее мы проанализировали связывание белков CP 190 и Mod(mdg4)-67.2 на промоторе гена even-skipped в двух трансгенных линиях, несущих конструкцию preveYG4(lA2). В качестве положительного контроля была выбрана описанная в других работах область 62D, содержащая три сильных сайта связывания для белка Su(Hw), в качестве отрицательного - кодирующая область гена Rpl32 (рис. 8).

Как и ожидалось, СР190 и Mod(mdg4)-67.2 взаимодействовали с промотором гена even-skipped на стадии личинки (рис. 8). Кроме того, при делеции 1А2-инсулятора обогащение белков СР190 и Mod(mdg4)-67.2 на промоторе гена even-skipped исчезало, что свидетельствует о том, что данный сигнал опосредован присутствием 1А2-инсулятора в составе трансгена. Сходный результат был получен и в двух трансгенных линиях на эмбриональной (0-16 часов) стадии развития. Эти результаты подтверждают наличие физического взаимодействия инсуляторов с промоторами генов. Кроме того, корреляция присутствия инсуляторных белков и основных

факторов транскрипции предполагает, что инсулятор-промоторные взаимодействия являются транскрипционно-зависимыми.

А

preveYG-HIA2 1 _

cvc у-со<1 1А2 62В RpL32 Mod(intlg4)-67.2

prcvcYG4

cvc y-cod 62Т> RpL32

eve y-cod 1A2 62DRpL32

02D RpU2

Pnc.8. Взаимодействие CP190 и Mod(mdg4)-67.2 с промотором гена even-skipped в трансгенных линиях в присутствии и в отсутствие 1А2-инсулятора в системе. Представлен результат X-ChIP анализа с использованием антител к (А) СР190 и (Б) Mod(mdg4)-67.2 в одной из двух протестированных гомозиготных трансгенных линий на стадии личинки. Для X-ChIP анализа использовался материал из трансгенной линий yacw"18, несущих конструкцию preveYG4(lА2) в отсутствии эндогенного 1А2-инсулятора и гена yellow. На диаграммах представлены результаты ПЦР в реальном времени после X-ChIP анализа (среднее значение четырех экспериментов; вертикальной линией обозначается стандартоное отклонение) в одной из двух протестированных линий на стадии личинки. Обозначения: eve - промотор гена even-skipped ; y-cod - кодирующая область гена yellow, 1А2 — 1А2 инсулятор; 62D - область, содержащая три сильных сайта связывания для белка Su(Hw), положительный контроль; RpL32 -кодирующая область гена Rpl32, отрицательный контроль; Д1ох - материал был получен из трансгенной линии с делецией 1А2-инсулятора.

Таким образом, методом X-ChIP продемонстрировано, что с промотором гена even-skipped при наличии инсулятора в конструкции связываются инсуляторные белки СР190 и Mod(mdg4)-67.2.

ОБСУЖДЕНИЕ

I. Влияние некодирующей транскрипции на активность энхансеров.

В данной работе впервые был проведен анализ влияния транскрипции, проходящей через энхансеры, на их активность. Была создана модельная система, в которой через хорошо известные

тканеспецифичные энхансеры генов yellow и white запускалась транскрипция разной степени интенсивности. В результате было установлено, что проходящая транскрипция может нейтрализовать активирующее действие энхансеров. При этом сильная транскрипция приводила к полной или почти полной нейтрализации энхансера, тогда как минимальная транскрипция влияла менее выражено. Было продемонстрировано, что расстояние между промотором, с которого инициируется некодирующая транскрипция (UAS-промотор), и энхансером не влияет на инактивацию последнего. Вместе с тем при изменении направления транскрипции, идущей с UAS-промотора, энхансер продолжал нормально функционировать. Это подтверждает, что именно некодирующая транскрипция, а не конкуренция промоторов за сигнал энхансера, нейтрализует его активность.

В активности энхансеров выделяют две составляющие: способность активировать транскрипцию и взаимодействовать с промотором гена-мишени на больших расстояниях. В данной работе было показано, что некодирующая транскрипция может нейтрализовать активность энхансеров, находящихся как на близком, так и на дальнем расстоянии от промотора гена-мишени. Следовательно, можно предположить, что проходящая через энхансер транскрипция нарушает активирующее действие энхансера.

Установлено, что присутствие терминатора транскрипции стабилизирует работу энхансеров в составе трансгена. Этот факт может быть использован при создании трансгенных животных или клеточных линий, создаваемых для экспрессии рекомбинантных белков. Так, фланкирование трансгенной конструкции терминаторами транскрипции позволит нормализовать активность используемых регуляторных элементов.

Исходя из полученных данных, можно предложить несколько объяснений влияния

нскодирующей транскрипции на работу энхансеров. Наиболее очевидная, на первый взгляд,

возможность состоит в том, что в процессе транскрипции через регуляторный элемент «проходит»

огромный транскрипционный комплекс. Этот комплекс может физически «сбрасывать»

регуляторные белки, связанные с энхансером. Однако с этой версией не согласуется тот факт, что

множество энхансеров находятся в интронах активируемых ими генов. Через ДНК-

последовательности таких энхансеров идет сильная транскрипция, но при этом они продолжают

нормально функционировать. Одним из объяснений способности энхансера функционировать в

интроне является наличие сайтов связывания для не идентифицированных пока белков,

нейтрализующих негативное влияние проходящей транскрипции. Другим возможным

объяснением может быть быстрая деградация интронной РНК. Необходимо упомянуть, что в

последнее время появляется все больше данных о наличии РНК-связывающих доменов в белках,

контролирующих транскрипцию. В частности, такие домены обнаружены у ряда репрессорных

белков. Возможно, некоторые белковые факторы способны узнавать некодирующие РНК,

проходящие через энхансерные элементы, связываться с такими участками генома и

20

нейтрализовать активность энхансеров. Также нельзя исключать, что на активность энхансеров могут влиять модификации нуклеосом, вносимые транскрипционным комплексом при проходящей транскрипции.

II. Специфичность инсулятор-промоторных взаимодействий

В данном исследовании на разработанной ранее модельной системе был проведен анализ специфичности инсулятор-промоторных взаимодействий. В результате было показано, что инсуляторы Wari и 1А2 способны взаимодействовать с разными промоторами в различных тканях Drosophila.

Методом иммунопреципитации хроматина было установлено, что инсуляторные белки, также как и РНК-полимераза II и ТВР, детектируются на промоторе гена even-skipped, но не на промоторе гена yellow. Это дает возможность предположить, что инсулятор-промоторные взаимодействия носят транскрипционно-зависимый характер.

В геноме 1А2-инсулятор находится за геном yellow, Wari-инсулятор за геном white. Таким образом, взаимодействие данных инсуляторов с промоторами генов-мишеней может приводить к образованию «генной» петли, сближая терминатор с промотором гена. В настоящее время образование транскрипционно-зависимой «генной» петли (сближение 5' и 3' некодирующих областей генов) было продемонстрировано у дрожжей, человека, и HIV провируса. В дрожжах было показано, что для формирования «генной» петли нужен основной фактор транскрипции TFIIB и белки Ssu72 и Ptal, участвующие в З'-процессенге. Вполне вероятно, что данный механизм является консервативным для эукариот и что взаимодействие между инсуляторами и промоторами необходимо для формирования «генной» петли и/или ее стабилизации.

Предполагается, что формирование «генной» петли необходимо для рсинициации транскрипции, способствуя эффективному переносу РНК-полимеразы II от терминатора к промотору, а также в сопряжении транскрипции с экспортом мРНК и терминации транскрипции.

Также в данной работе было продемонстрировано, что взаимодействие инсуляторов с промоторами необходимо для базовой активности, в отсутствие энхансера, промоторов генов yellow и white в глазах мух. Таким образом, возможно, что кроме потенциальной роли «генной» петли в сопряжении транскрипции с экспортом мРНК и в терминации транскрипции, инсуляторы могут рекрутировать белки комплексов ремоделинга хроматина, стабилизируя связывание TFIID комплекса.

ВЫВОДЫ

1) Показано, что некодирующая транскрипция негативно влияет на активность энхансеров генов white и yellow.

2) Продемонстрировано, что терминаторы транскрипции стабилизируют функционирование энхансеров генов white и yellow в составе трансгенов.

3) Установлено, что 1А2- и Wari-инсуляторы функционально взаимодействуют с промоторами разных классов.

4) Выяснено, что обогащение белков СР190 и Mod(mdg4)-67.2 на промоторе гена even-skipped зависит от присутствия 1А2-инсулятора в трансгене.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах:

1. Давыдова А.И.. Ерохин М.М., Георгиев П.Г., Четверина Д.А. Дистанционные взаимодействия между энхансерами и промоторами D.melanogaster опосредуются фланкирующими трансген 8и(Н\у)-инсуляторами. Генетика. 2011. 47(8):1037-1043

2. М. Erokhin, A. Davydova, О. Kyrchanova, A. Parshikov, P. Georgiev, D. Chetverina. Insulators form gene loops by interacting with promoters in Drosophila. Development. 2011. 138(18):4097-4106.

Тезисы конференций:

1. D. Chetverina, A. Davydova. M. Erokhin, P. Georgiev.Transcription affects enhancer activity in D.melanogaster. 36th FEBS Congress «Biochenistry for tomorrow's medicine». Torino, Italy. 25 - 30 june, 2011.

2. M. Erokhin, A. Davydova. P. Georgiev, D. Chetverina.Insulators form gene loops by interacting with promoters in Drosophila. 36th FEBS Congress «Biochenistry for tomorrow's medicine». Torino, Italy. 25 -30 june, 2011.

3. Давыдова А.И.. Четверина Д.А., Ерохин M.M., Георгиев П.Г. Анализ влияния некодирующей транскрипции на активность энхансеров D.melanogaster. 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, Россия. 18-22 апреля, 2011.

4. Четверина Д.А., Ерохин М.М., Давыдова А.И.. Георгиев П.Г. Анализ взаимодействия 1А2- и Wari-инсуляторов с промоторами генов yellow и white D. melanogaster. 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, Россия. 18 - 22 апреля, 2011.

5. Давыдова А.И. Некодирующая транскрипция влияет на коммуникативную активность энхансеров генов white и yellow D. melanogaster. Материалы международного научного форума «Ломоносов 2011». Москва, Россия. 11-15 апреля, 2011.

6. М. Erokhin, A. Davydova, P. Georgiev and D. Chetverina. Interaction of Insulators with Promoters results in gene looping in Drosophila melanogaster. 35th FEBS Congress "Molecules of Life". Gothenburg, Sweden. 26 june-1 july, 2010.

7. A. Davydova, D. Chetverina, P. Georgiev. Transcription affects communicative activity of enhancers in D.melanogaster. The international symposium "Control of gene expression and cancer". Moscow, Russia. 21-25 June, 2010.

8. Давыдова А.И.. Четверина Д.А., Георгиев П.Г. Транскрипция, проходящая через энхансеры генов white и yellow D. melanogaster, влияет на их коммуникативную активность. 14-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, Россия. 19-23 апреля, 2010.

9. Давыдова А.И.. Четверина Д.А., Георгиев П.Г. Транскрипция через энхансер гена white D. melanogaster влияет на его активность. 13-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, Россия. 28 сентября - 2 октября, 2009.

Заказ № 77-р Подписано в печать 18.10.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таН:т/о@с/г.ги

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизмов ограничения активности энхансеров D. melanogaster"

Актуальность проблемы.8

Цель и задачи исследования.10

Научная новизна и практическая ценность работы.11

Апробация работы.11

Публикации.12

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Давыдова, Анна Игоревна

выводы

1) Показано, что некодирующая транскрипция негативно влияет на активность энхансеров генов white и yellow.

2) Продемонстрировано, что терминаторы транскрипции стабилизируют функционирование энхансеров генов white и yellow в составе трансгенов.

3) Установлено, что 1А2- и Wari-инсуляторы функционально взаимодействуют с промоторами разных классов.

4) Выяснено, что обогащение белков CP 190 и Mod(mdg4)-67.2 на промоторе гена even-skipped зависит от присутствия 1 А2-инсулятора в трансгене.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Давыдова, Анна Игоревна, Москва

1. Ashe HL, Monks J, Wijgerde M, Fräser P, Proudfoot NJ. (1997) Intergenic transcription and transinduction of the human beta-globin locus. Genes Dev. ll(19):2494-509.

2. Barski A, Cuddapah S, Cui K, Roh TY, Schönes DE, Wang Z, Wei G, Chepelev I, Zhao K. (2007) High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell.l29(4):823-37.

3. Bartkuhn M, Renkawitz R. (2008) Long range chromatin interactions involved in gene regulation. Biochim Biophys Acta. 1783(11):2161-6.

4. Bartolomei MS, Zemel S, Tilghman SM. (1991) Parental imprinting of the mouse H19 gene. Nature. 351(6322):153-5.

5. Bertone P, Stole V, Royce TE, Rozowsky JS, Urban AE, Zhu X, Rinn JL, Tongprasit W, Samanta M, Weissman S, Gerstein M, Snyder M. (2004) Global identification of human transcribed sequences with genome tiling arrays. Science. 306(5705):2242-6.

6. Birney E, Stamatoyannopoulos JA, Dutta A, Guigö R, Gingeras TR, Margulies EH, Weng Z, Snyder M, Dermitzakis ET, Thurman RE, Kuehn MS et all. (2007) ENCODE Project Consortium. Nature. 447(7146):799-816.

7. Blanton J, Gaszner M, Schedl P. Protein:protein interactions and the pairing of boundary elements in vivo. Genes Dev. 2003 Mar l;17(5):664-75.

8. Brand AH, Perrimon N. (1993) Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118(2):401-15.

9. Brasset E, and Vaury C. (2005) Insulators are fundamental components of the eukaryotic genomes. Heredity. 94: 571-576.

10. Bushey AM, Dorman ER, Corces VG (2008) Chromatin insulators: regulatory mechanisms and epigenetic inheritance. Mol. Cell. 32:1-9

11. Butler JE, Kadonaga JT. (2001) Enhancer-promoter specificity mediated by DPE or TATA core promoter motifs. Genes Dev. 15(19):2515-9.

12. Butler JE, Kadonaga JT. (2002) The RNA polymerase II core promoter: a key component in the regulation of gene expression. Genes Dev. 16(20):2583-92.

13. Cai H, and Shen P. (2001) Effects on eis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. Science. 291: 493-495.

14. Capelson M, Corces VG. (2006) SUMO conjugation attenuates the activity of the gypsy chromatin insulator. EMBO J. 25(9): 1906-14.

15. Capelson M. and Corces V. (2005) The ubiquitin ligase dTopors directs the nuclear organization of a chromatin insulator. Mol. Cell. 20: 105-116.

16. Capelson M. and Corces V.G. (2004) Boundary elements and nuclear organization. Biol. Cell. 96: 617-629.

17. Carthew RW, Sontheimer EJ. (2009) Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136(4):642-55.

18. Chopra V.S., Cande J., Hong J.W., Levine M. (2009) Stalled Hox promoters as chromosomal boundaries. Genes Dev. 23(13):1505-1509.

19. Clemson CM, McNeil JA, Willard HF, Lawrence JB. (1996) XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132(3):259-75.

20. Conte C, Dastugue B, and Vaury C. (2002a) Coupling of enhancer and insulator properties identified in two retrotransposons modulates their mutagenic impact on nearby genes. Mol. Cell Biol. 22: 1767-1777.

21. Conte C, Dastugue B, Vaury C. (2002b) Promoter competition as a mechanism of transcriptional interference mediated by retrotransposons. EMBO J. 21:39083916

22. Core LJ, Waterfall JJ, Lis JT. (2008) Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322(5909): 1845-8.

23. De Santa F, Barozzi I, Mietton F, Ghisletti S, Polletti S, Tusi BK, Muller H, Ragoussis J, Wei CL, Natoli G. (2010) A large fraction of extragenic RNA pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biol. 8(5):el000384.

24. Deng X, Koya SK, Kong Y, Meller VH. (2009) Coordinated regulation of heterochromatic genes in Drosophila melanogaster males. Genetics. 182(2):481-91.

25. Ernst P, Wang J, Huang M, Goodman RH, Korsmeyer SJ. (2001) MLL and CREB bind cooperatively to the nuclear coactivator CREB-binding protein. Mol Cell Biol. 21(7):2249-58.

26. Erokhin MM, Georgiev PG, Chetverina DA. (2010) Effects of functional interactions between nonhomologous insulators Wari and Su(Hw). Genetika. 46(1): 18-25.

27. Gaszner M, and Felsenfeld G. (2006) Insulators: Exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nat. Rev. Genet. 7: 703-713.

28. Gerasimova TI, Corces VG. (1998) Polycomb and Trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. Cell 92: 511-521.

29. Geyer PK, Clark I. (2002) Protecting against promiscuity: the regulatory role of insulators. Cell Mol Life Sci. 59(12):2112-27.

30. Geyer PK. (1997) The role of insulator elements in defining domains of gene expression. Curr Opin Genet Dev. 7(2):242-8.

31. Golovnin A, Birukova I, Romanova O, Silicheva M, Parshikov A, Savitskaya E, Pirrotta, V and Georgiev P. (2003) An endogenous Su(Hw) insulator separates the yellow gene from the Achaete-scute gene complex in Drosophila. Development 130: 3249-3258.

32. Golovnin A, Melnikova L, Volkov I, Kostuchenko M, Galkin AV, Georgiev P. (2008) 'Insulator bodies' are aggregates of proteins but not of insulators. EMBO Rep. 9:440-445.

33. Golovnin A., Melnick E., Mazur A., Georgiev P. (2005)-Drosophila Su(Hw) insulator can stimulate transcription of a weakened yellow promoter over a distance. Genetics. 170(3):133-1142.

34. Hallikas O; Palin K, Sinjushina N, Rautiainen R, Partanen J, Ukkonen E, Taipale J. (2006) Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124(l):47-59.

35. He H.H., Meyer C.A., Shin H:, Bailey S.T., Wei G., Wang Q., Zhang Y., Xu K., Ni M., Lupien M., Mieczkowski P., Lieb J.D:, Zhao K., Brown M:, Liu X.S. (2010) Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nat Genet. 42(4):343-7.

36. Heintzman ND, Stuart RK, Hon G, Fu Y, Ching CW, Hawkins RD, Ban-era LO, Van Calcar S, Qu C, Ching KA, Wang W, Weng Z, Green RD, Crawford GE,

37. Ren B. (2007) Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39(3):311-8.

38. Hogga I, Karch F. (2002) Transcription through the iab-7 cis-regulatory domain of the bithorax complex interferes with maintenance of Polycomb-mediated silencing. Development. 129(21):4915-22.

39. Jack J, Dorsett D, Delotto Y, Liu S. (1991) Expression of the cut locus in the Drosophila wing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer. Development. 113(3):735-47.

40. Jin C, Felsenfeld G. (2007) Nucleosome stability mediated by histone variants H3.3 and H2A.Z. Genes Dev. 21 (12): 1519-29.

41. Knezetic JA, Felsenfeld G. (1989) Identification and characterization of a chicken alpha-globin enhancer. Mol Cell Biol. 9(3):893-901.

42. Kong, S., Bohl, D., Li, C., and Tuan, D. (2007) Transcription of the HS2 enhancer toward a cis-linked gene is independent of the orientation, position, and distance of the enhancer relative to the gene. Mol. Cell. Biol. 17, 3955-3965

43. Kravchenko E., Savitskaya E., Kravchuk O. et al. (2005) Pairing between gypsy insulators facilitates the enhancer action in trans throughout the Drosophila genome. Mol. Cell Biol. 25(21): 9283-9291.

44. Kuhn EJ, Hart CM, Geyer PK. (2004) Studies of the role of the Drosophila scs and scs1 insulators in defining boundaries of a chromosome puff. Mol Cell Biol. 24(4): 1470-1480.

45. Kuhn, E.J., and Geyer, P.K. (2003) Genomic insulators: Connecting properties to mechanism. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 259-265

46. Kurshakova M, Maksimenko O, Golovnin A, Pulina M, Georgieva S, Georgiev P, Krasnov A. (2007) Evolutionarily conserved E(y)2/Susl protein is essential forthe barrier activity of Su(Hw)-dependent insulators in Drosophila. Mol Cell. 27:332-338.

47. Kyrchanova O, Chetverina D, Maksimenko O, Kullyev A, Georgiev P. (2008) Orientation-dependent interaction between Drosophila insulators is a property of this class of regulatory elements. Nucleic Acids Res. 36:7019-7028.

48. Kyrchanova O, Toshchakov S, Podstreshnaya Y, Parshikov A, Georgiev P. (2008b) Functional interaction between the Fab-7 and Fab-8 boundaries and the upstream promoter region in the Drosophila Abd-B gene. Mol Cell Biol. 28(12):4188-95.

49. Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, Devon K, Dewar K. (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409(6822): 860-921.

50. Ling J, Baibakov B, Pi W, Emerson BM, Tuan D. (2005) The HS2 enhancer of the beta-globin locus control region initiates synthesis of non-coding, polyadenylated RNAs independent of a cis-linked globin promoter. J Mol Biol. 350(5):883-96.

51. Lomvardas S, Barnea G, Pisapia DJ, Mendelsohn M, Kirkland J, Axel R. (2006) Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice. Cell. 126(2):403-13.

52. Mahmoudi T, Katsani KR, Verrijzer CP. (2002) GAGA can mediate enhancer function in trans by linking two separate DNA molecules. EMBO J. 21(7): 177581.

53. Majumder P, Cai HN. (2003) The functional analysis of insulator interactions in the Drosophila embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5223-5228.

54. Maksimenko OG, Georgiev PG. (2007) A study of the structure of 1A2 insulator of Drosophila melanogaster. Dokl Biochem Biophys. 416:252-5.

55. Matsui M, Sharma K, Cooke C, Wakimoto BT, Rasool M, Hay worth M, Hylton CA, Tomkiel JE. (2011) Nuclear Structure and Chromosome Segregation in Drosophila Male Meiosis Depends on the Ubiquitin Ligase dTopors. Genetics. 2011 Sep 6. Epub ahead of print.

56. Melnikova L, Kostuchenko M, Silicheva M, Georgiev P. (2008) Drosophila gypsy insulator and yellow enhancers regulate activity of yellow promoter through the same regulatory element. Chromosoma. 117(2): 137-45.

57. Muravyova E, Golovnin A, Gracheva E, Parshikov A, Belenkaya T, Pirrotta V and Georgiev P. (2001) Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. Science 291: 495-498.

58. Narlikar L, Ovcharenko I. (2009) Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. BriefFunct Genomic Proteomic. 8(4):215-30.

59. Nègre N., Brown C.D., Shah P.K. et al. (2010) A comprehensive map of insulator elements for the Drosophila genome. PLoS Genet. 6:el000814.

60. Pai C, Lei C, Ghosh D, Corces V. (2004) The centrosomal protein CP 190 is a component of the gypsy chromatin insulator. Mol. Cell. 16: 737-748.

61. Parnell TJ, Geyer PK. (2000) Differences in insulator properties revealed by enhancer blocking assays on episomes. EMBO J. 19(21):5864-74.

62. Parnell TJ, Viering MM, Skjesol A, Helou C, Kuhn EJ and Geyer PK. (2003) An endogenous suppressor of hairy-wing insulator separates regulatory domains in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 13436-13441.

63. Pekowska A, Benoukraf T, Zacarias-Cabeza J, Belhocine M, Koch F, Holota H, Imbert J, Andrau JC, Ferrier P, Spicuglia S. (2011) H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers. EMBO J. doi: 10.103 8/emboj.2011.295.

64. Petruk S, Sedkov Y, Riley KM, Hodgson J, Schweisguth F, Hirose S, Jaynes JB, Brock HW, Mazo A. (2006) Transcription of bxd noncoding RNÀs promoted1 by trithorax represses Ubx in cis by transcriptional interference. Cell. 127(6): 120921.

65. Preker P, Nielsen J, Kammler S, Lykke-Andersen S, Christensen MS, Mapendano CK, Schierup MH, Jensen TH. (2008) RNA exosome depletion reveals transcription upstream of active human promoters. Science. 322(5909):1851-4.

66. Ptashne M. (1986) Gene regulation by proteins acting nearby and at a distance. Nature. 322(6081):697-701.

67. Rada-Iglesias A, Bajpai R, Swigut T, Brugmann SA, Flynn RA, Wysocka J. (2011) A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470(7333):279-83.

68. Rodin S, Georgiev P. (2005) Handling three regulatory elements in one transgene: Combined use of cre-lox, FLP-FRT, and I-Scel recombination systems. Biotechniques 39: 871—876.

69. Sandmann T, Jakobsen JS, Furlong EE. (2006) ChlP-on-chip protocol for genome-wide analysis of transcription factor binding in Drosophila melanogaster embryos. NatProtoc. l(6):2839-55.

70. Schuettengruber B, Chourrout D, Vervoort M, Leblanc B, Cavalli G. (2007) Genome regulation by polycomb and trithorax proteins. Cell. 128(4):735-45.

71. Seila AC, Calabrese JM, Levine SS, Yeo GW, Rahl PB, Flynn RA, Young RA, Sharp PA. (2008) Divergent transcription from active promoters. Science. 2008 322(5909): 1849-51.

72. Stamatoyannopoulos G. (2005) Control of globin gene expression during development and erythroid differentiation. Exp Hematol. 33(3):259-71.

73. Talbert PB, Henikoff S. (2010) Histone variants-ancient wrap artists of the epigenome. Nat Rev Mol Cell Biol. 11(4):264-75.

74. Tie F, Banerjee R, Stratton CA, Prasad-Sinha J, Stepanik V, Zlobin A, Diaz M0, Scacheri PC, Harte PJ. (2009) CBP-mediated acetylation of histone H3 lysine 27 antagonizes Drosophila Polycomb silencing. Development. 136(18):3131-41.

75. Tuan D, Kong S, Hu K. (1992) Transcription of the hypersensitive site HS2 enhancer in erythroid cells. Proc Natl Acad Sci USA. 89(23): 11219-23.

76. Valenzuela L, Kamakaka RT. (2006) Chromatin insulators. Annu. Rev. Genet. 40: 107-138. .

77. Vaquerizas JM, Kummerfeld SK, Teichmann SA, Luscombe NM. (2009) A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet. 10(4):252-63.

78. Vazquez J, Schedl P. (2000) Deletion of an insulator element by the mutation facet-strawberry in Drosophila melanogaster. Genetics. 155: 1297—1311.

79. Visel A, Blow MJ, Li Z, Zhang T, Akiyama JA, Holt A, Plajzer-Frick I, Shoukry M, Wright C, Chen F, Afzal V, Ren B, Rubin EM, Pennacchio LA. (2009) ChlP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457(7231):854-8.

80. Wallace J.A., Felsenfeld G. (2007) We gather together: insulators and genome organization. Curr. Opin. Genet. Dev. 17(5):400^Ю7.

81. Wang Z, Zang C, Rosenfeld JA, Schönes DE, Barski A, Cuddapah S, Cui К, Roh TY, Peng W, Zhang MQ, Zhao К. (2008) Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40(7):897-903.

82. Wei W, Pelechano V, Järvelin AI, Steinmetz LM. (2011) Functional consequences of bidirectional promoters. Trends Genet. 27(7):267-76.

83. West AG and Fraser P. (2005) Remote control of gene transcription. Hum. Mol. Genet. 14: 101-111.

84. Wu C, Bingham PM, LivakKJ, Holmgren R; Elgin SC. (1979) The chromatin structure of specific genes: I. Evidence for higher order domains of defined DNA sequence. Cell. 16(4):797-806.

85. Xu Z, Wei W, Gagneur J, Perocchi F, Clauder-Münster S, Camblong J, Guffanti E, Stutz F, Huber W, Steinmetz LM. (2009) Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast. Nature. 457(7232): 1033-7.

86. Zhao H, Dean A. (2005) Organizing the genome: enhancers and insulators. Biochem Cell Biol. 83:516-524.

87. Zhou J, Barolo S, Szymanski P, Levine M. (1996) The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo. Genes Dev. 10: 3195-3201.

88. Zinzen RP, Girardot C, Gagneur J, Braun M, Furlong EE. (2009)-Combinatorial binding predicts spatio-temporal cis-regulatory activity. Nature. 462(7269):65-70.