Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ ЛИТОПОЛИСАХАРИДОВ БАКТЕРИИ ГРУППЫ PSEUDOMONAS FLUORESCEMS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ ЛИТОПОЛИСАХАРИДОВ БАКТЕРИИ ГРУППЫ PSEUDOMONAS FLUORESCEMS"

J -ЗЭН2

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЬЫ НАРОДОВ АВДЗМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕН» ИНЛИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ им.Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

На правах рукописи

ШЗРЕМЕШНКО Станислав Никитович УДК 579.81(1.11.222

ИЗУЧЕНИЕ ЛИІ10П0ДИСАХАРВД0В БАКТЕРИИ ГРУППЫ

FSEUDOMOIJAS l'LUOttESCEHS

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степеня кандидата биологических наук

Киев - 1988

Работа выполнена в отдело биохимии микроорганизмов ордена Трудового Красного Знамени Института Микробиологии и Вирусологии им. Л.К.Заболотного АН УССР

Научный руководитель; Заслужений деятель науки УССР, профессор, доктор биологических наук И.Я»Захарова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Й.А.Киприанова

доктор медицинских наук, Э.П.Васоренко

Ведущая организация: Ленинградский химико-фармацевтический институт, кафедра микробиологии

•j ' )

Защита состоится А_I98$f г. в/^"чаз.

на заседании специализированного совета Д 016.06.01 по запите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических на/к при Институте микробиологии и .вирусологии им.Д.К.Заболотного АН УССР (2521*13, Киев-lit:), уд .Заболотного, 154, Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН УССР)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного Ail УССР

Автореферат разослан У.'/ " 1988 г.

v чый секретарь сг зированного совета

кандидат биоя*. мфзскмх наук .'/-•( Э.А.Ксваленко

ОбЬАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Род Рзеийотопаа объединяет более 260 видов сапрофитных, условно-патогенных, а такие патогенных для человека, животных и растений микроорганизмов. За исключением нескольких вцдоа, это относительно малоизученная группа. Согласно современной систематике род подразделяется на 5 свкииа, наиболее представительной из которых является секция I, или т.н. " РзеиДотопаз Пиогеэсепэ гомологии-группа" (Берги, 1984). Несмотря на выявляемое сходство по признакам, на основании которых сформирована эта группа, она гетерогенна, и целый ряд вопросов систематики этих бактерий требует- своего решения, Сходство и различия между видами, штаммами и их группировками не всегда являются коррелятивными, поэтому для совершенствования классификационных схем нужны всесторонние исследования культур, и в частности исследования с привлечением хемотаксономических критериев, одним из которых могут быть свойства лилополисахаридов (ЛПС). ЛПС, как известно, определяет серологическую специфичность микробной клетки, а состав и свойства отдельных структурных частей молекулы ЛПС (лилид А, нор, 0-цепь) могут использоваться в качестве признаков для дифференциации таксонов различного уровня, так как имеет разную степень консервативности, обусловленную эволюционным развитием бактерий.

Кроме Р.аеги^поза, являющегося важным агентом в патогенезе инфекционных заболеваний, из патологического материала все чаше выделяются представители других видов - р,/1иогезсекэ, Р.ей-саНаепеа, Р.рееи(1оа1са11.£епе8И др., которые могут вызывать инфекцию и летальный исход у живых существ с ослабленной иммунной системой, в том числе и людей, подвергшихся ожогам, ранениям, радиационным облучениям и т.д.. Усиленна роли этих никроорганиз-мов в патогенезе инфекционных заболеваний, очевидно, интенсифицируется применением широкого спектра антибиотиков и других , лекарственных препаратов. Для разработки методов борьбы с новыми, обычно более устойчивыми к лекарственным препаратам*, патогенами необходимы детальные их- исследования, и в том числе исследования 1ПС - важного структурного и функционального компонента наружной мембраны бактериальной клетки, который непосредственно контактирует с окружаидея средой и в значительной мере определяет характер взаимодействия микро- и макроорганизма в инфекционном процессе. Образуя комплексы о бодод&^одэтоЗксЯ'оболочки, ДЛС I 5 ! -

быполияпт и другие многочисленные функции, а также обладаю« широким спектром биологических свойств в изолированном состоянии, поэтому фундаментальныо исследования состава,« строения гликоконы) гат о в этого типа делает возможным понимание сложнейших биологических процессов с их участием на молекулярном уровне. ■ Из этого следует и научно-об основанный подход к п расти чес кому ис пользование полученных знания, например, дня создания вакцинных, диагностических и лекарственных препаратов,разработки биотехнологий получения уникальных сахаров.

Целью настоящей работы было изучить ли по полисахариды штаж-мов бактерий, представляющих виды; Р.Пиогевсепэ (.биовары А, В С, С, 1 ), Р.виг(ш1;1аса, Г.а1се11депеэ, Р.ряеи(1оа1са115епев и Р.Ггае!» выяснить закономерности их строения, а также взаимо связи между таксономическим положением штаммов и свойствами их £ПС. В задачу исследований входило:

1. Получить бактериальную массу и выделить АПС, определить компонентный состав.

2. Выделить к изучить препараты липида А, кора и О-специфи-ческого полисахарида.

3. Установить структуру повторяющегося эвена О-специфичес-ких полисахаридов некоторых представителей изучаемых бактерий.

Получить 0-сыворотки к исследуемым штаммам бактерий, изучить серологические взаимосвязи между ними и установить серологическую однородность групп, представителями которых они ивля-птоя, используя для этого другие штаммы.

5. Определить взаимное сходство исследуемых штаммов бактерии по'Количественным характеристикам строения и свойств их Я1С.

Научная новизна. Впервые изучены липополисахариды у ранее не исследованных в этом плане штаммов бактерии рода Раеийотопаа Обнаружена гетерогенность штаммов флюоресцирующих бактерий по компонентному составу ЛПС, тогда как представители нефлюорвсци-руювих видов по этому показателю были относительно подобны. Выявленная гетерогенность «таммов флюоресцирующих бактерии корродировала с отсутствием либо слабым проявлением серологических взаимосвязей между ними. Обнаружено серологическое родство между штаммами р.вигап*1аса и нефлпоресцируюяих видов, а также их близость с типовым штаммом Р,Г1иогеясепи. При сравнительном изучении отдельных составных частей макромолекулы ЛП0 исследуемых, бактерий обнаружена дивергенция их свойотв в порядке: липид А - кор - 0-иепь. Наибольшее расхождение наблюдалось по моноса-

хариднону составу О-епецифического пйлисахарида, все десять полисахаридов представляла отдельные хемотипы. На уровне компонентного состава ко ро во го олигосахарида выявлено меньшее расхождение (наблюдалось четыре хемотипа). При изучении дипида А выявлено еще меньшее различие рассматриваемых штаммов. За исключением р,г1иогевсеш> с 2?бз, препараты дипида А характеризовались практически одинаковым набором жирных кислот.

Впервые установлена структура повторяющегося звена О-спаци-фических полисахаридов Р.ацга)ги1аса 31 ц 1>.Г1иогеэсепа в 2763 * содержащих оригинальные по строении моносахариды: 2,4-днацетами-до-2,^,б-тридезокси- о-глпкозу (и- ацетилбациллозамин), Н-ацетилфукозамйн и б-деэокситалозу.

Впервые степень взаимного сходства исследуемых штаммов, бактерий рода Узеи4отопаз определена с помощью ЗВЫ по количественным характеристикам строения и свойств их ЛПО.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты исследования ЛПС бактерий рода Ра ей до то паз предстаьяяюг интерес с точки зрения применения их в систематике этих микроорганизмов в качестве хемотаксономического критерия, а также с позиции познания взаимосвязи между структурой и функцией этого важного ингредиента наружной мембраны.грамотрицатедьных бактерий. Данные о строении липида А, кора и 0-цепи представляют ценность для выяснения филогенетических взаимосвязей бактерий« а также является фундаментом для дальнейшего практического использования« например, при создании вакцинных и других медицинских препаратов, разработке биотехнологий получения уникальных Сахаров.

Впервые использованные нами в работе методические подходы и методики исследования могут быть применены при изучении ЛПС других микроорганизмов.

Выполненные исследования является частьв тематики ШВ АН УССР и входят в программы МЙТК "Биоген" и 0.74.05 "Физико-химическая биология и биотехнология."

Апробация работы. Основные результаты к положения работы представлялись на: X Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986} Научной конференции - "Биология возбудителей инфекционных заболеваний и их экспресс-диагностика" (Горький, 1906), Ш Международном симпозиуме по оахаридам (ЧС2Р, Братислава, 1966), X Украинском биохимическом съезде (Ивано-Ьранковск, 1987), ЯП Всесоюзной конференции "Химия и биохимия углеводов" (Тбилиси, 1987),

Международном симпозиуме по эндотоксинам (Япония, 1988). Диссертационная работа доложена на заседании научно-темат и ческой микробиологической секции Института микробиологии'и вирусологии АН УССР.

Публикaim и. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ.

Объем работы.Работа изложена на 170 страницах машинописного текста и иллюстрирована 23 таблицами и 16 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальной части» обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 103 источника, и з них 130 иностранных авторов.

ССЙЕРлАНИБ РАБОТУ

Материалы и методы. Объектами исследования являлись штаммы бактерир рода rseudomoriaa из музея живых культур отдела антибиотиков Института микробиологии и вирусологии /Шй/ АН УС^Р. Восемнадцать штаммов вида P.fluoreecena : типовой ИМИ 4125-АТСС 13525, ШВ V72, ИЯВ ГІ52 - биовар I (А); ИМЗ 1602, ИНі) 247, ИМВ 2108 - биовар 11(B), ИМВ 2125, ДМВ 2087, ИМЬ 2366 - биовар Ш(С)і ИМВ 2111, ШВ 1934, ЮШ 2401 - биовар II О' ); ¿1MB 2763, ИМВ 98, ИМВ 1176 - биовар Г (о ); ИМВ 2303, ¿1MB 19, ИМВ І9Л - биовар І» Биоаар і (группа атаммов бактерия, сиктезирующих фенаэии-І-карбоне ву ю кислоту) впервые охарактеризован в ИВ ЛИ У^ОР (Куприянова, 1980. Четыре штамма вида r.aurantlecat MB ЗІ, ИМЭ 367 (неотиповоп), ИМВ 2041, КМВ 2620.'Леэять штаммов нефлюоресцируы-шик бактерий: P.eloaliceneg - типовой ИМВ 4ІЗв=АТСС 14909, ВДВ 3055, ИМВ 3099; P.peeudoalcalicenes - типовой 4134>АТСС I744Q, ■ ИМВ 2523, ИМВ 276*1; p.tragi - типовой ІШ 4002-АГСС 4973, ИМВ 4196, ЙМЗ 1165. Всего в работе использовали тридцать один штамм бактерий.

Культуры бактерия выращивали на нясо-пеитонном агаре при' 28°С в течении 24 ч, клетки смывали физиологическим раствором, сушили ацетоном и эфиром. Дипополисахариды иэ сухой бактериальной массы десяти штаммов выделяли фенол-водной экстракцией (Westphal, 1954), очищали ультрацентрифугированием при 105000 g . Общее содержание углеводов в ЛПЗ определяли реакцией с фенолом и серкой кислотой (Захарова, Носенко,- 1982). і-осфор анализировали по реакции с молибдено во кислым аммонием ( Flake, 1929 ). fW) (2-кето-3-4еэоксиоктоновую кислоту) определяли по методу br'Ssv (1970).

Белок анализировали по методу Lowry (1951), нуклеиновые кислоты определяли по абсорбции при 260 кМ.

Восходящую бумажную хроматографию выполняли на бумаге fn-11 в системе н-бу;ганол;пирйДин;вода (Захарова, Косенко, 1982). Г1Х моносахаридов проводили на хроматографе "Chrom-5n (4JCP), ацетаты полиолов получали по методика Albershein (1967). Аминокис лоты анализировали на аминокислотном анализаторе "KLA-5" (Hitachi, Япония}. Анализ аминосахаров проводили по специально модифицированной нами методике на анализаторе LC-5001 (Biotrcmlk, ФРГ).

0-сиворотки к исследуемым штаммам бактерия получали иммунизацией кроликов (Захарова, Носенко, 1932). Специфичность и титр сывороток контролировали в реакциях О-агглютинации, серологическую активность ДПС реакцией кольцепреципитации по общепринятой методике И ДВОЙНОЙ иммунодиффузии В агаре (Quchterloni, 1948).

Препараты структурных частей макромолекулы АПС получали кис лотным гидролизом ЛПС с 1% СН3СООН. Л ил ид А отдаляли центрифугированием. О-специфический полисахарид и олигосахарид кора выделяли гель-фильтрацией углеводной составлявшей на колонке с сефа-дексом G-50 (Penson, 1970). Курные кислоты липида А анализирова ли на газовом, хроматографе "Ojirom-S"- (ЧССР), метилирование и трифторацетилирование выполнили по методике Ыозэ (1973). Окончательную идентификацию жирных кислот проводили методом ГЖХ-маос спектрометрии на приборе "Vari^n Mat Gnom III** (CillA), используя данные масс-спектров (Ьудзикевич. 1966; ttietchel, 1975} Rybage. I960). Строение моносахаридов и полисахаридов изучали методом и ^''(J-ЯМР—спектроскопии. Спектры снимали на приборах Wp-бо, Ш-250, Ali-300 (Bruker, ^РГ). При анализе использовали данные ЯМР-СПеюрОВ (Dmitriev, 1930, 1982t Kochstkov, 1984; Knirel, 1986; Липкинд. 1957; Janssen, 1987 и др.). Удельное оптическое вращение определяли на поляриметре ЕПО-1. Метилирование полисахаридов проводили по методу Хакомори (Захарова, Носенко, 1962). Сольволиэ безводным фтористым водородом выполняли как в работе.■ Книрель (1986). Частичный гидролиз полисахарида с I Н.СР^СООН и выделение его фрагментов на колонке с TS К НИ-4 О проводили'по отработанной нами методике. Дезацетидирование полисахарида осуществляли по модифицированной нами методике, используя т(мэтил-амин и гельфильтраци» на колонке с сафадекоом G-50. Взаимное сходство исследуемых штаммов бактерий по количественным характеристикам строения и свойств их ЛПС (предложено автором) опреде-

Дяди С помокь» ЭВМ. 3 качестве меры сходства МС использовали квадрат эвклидового расстояния, для их группирования применяли метод средней связи СЬеми, 1970).

Иммунохимическ&я характеристика ли по пол и сахари до и* ■ ■

Из сухой бактериальной массы фенол-водной экстракцией были выделены и очинены препараты ЛПС. При экстрагировании АПС распределялись в водном слое, за исключением Р.аигап11аса ЭЬ АПС которого распределялся главным образок в фенольном слое. Различные выход ЛИС, степень фосфорилнрования, а также количество белкового компонента и нуклеиновых кислот в отдельных препаратах ЯПС могут свидетельствовать о различиях в организации наружной мембраны исследуемых бактерий (табл.1).

Таблица I. Выход ЛИС (£ к сухому весу клеток) и химический состав к сухому весу ЛЛС)

Вид, биовар, ятамм Выход ¿ПС Углеводы Балок Нуклеиновые кислоты Фосфор

Р.Ниогеосепв

А 4125 0,6 36,б 2,3 сл 3,6

Б 1С02 3,0 28,0 1,6 сл 2,9

■ С 2125 г.4 23,0 3,0 сл. Э.о

Р 2111 4,5 32,6 3,3 2,7 5,6

0 276Э 2,4 40,0 сл сл 0,0

1 2303 0,7 27,0 1,3' 3,0 5.8 ■

' р.аигепИаса

31 3,7 10,0 3,3 сл 4,4

4130 2,0 20,1 4,1 0,5 3,9 -

Р.рэеис1оа1са- 1,8

НЕепеэ 4134 2.5 21,3 &.Э 3,1

Р.Ггаг1 4-002 0,8 19,6 .5,3 2,1 5,4

Обозначения: "ел " - следы •

"При постановке задачи и выполнении отдельных этапов исследований непосредственное учаотие принимала к.б.н., ст.н.сотр. ИМВ АН УС2Р Здоровейко Г.М.; с которой автор разделяет полученные результаты. Основные экспериментальные результаты исследований настоящей работы получены лично автором.

Таблица 2 Моносзхаридный состав ЛПС исследуемых бактерий

биовар % к сумме пиков яри ГИ : % к сухому весу препарата ЛПС

итамм КЬа Мея Гис «с аа1 Нер 6<Ше1;(ИАс)2 гце З:;Ас л Ас Иск Се1Н кю Л)

Р.Пиогеаеепе А 4125 93,5 СЛ 6,2 СЛ СЛ _ СЛ 20,0 - . 1,2 0,4 0,6

В 1602 92,4 СЛ - . СЛ СЛ сд 5,7 _ 2,6 16,0 4,3 -

. С 2125 38,0 11,5 20,0 5,6 8,4 8,4 - - - 25,0 2,3 3,4 5,3 -

Р 2111 • - 19,5 - 57,0 23,3 сд - - - 0,9 1.3 0,2 -

С 2763 - 36,5 - 19,0 12,4. 15,0 17,0 - - 4,8 6,0 - ■ -

1 2303 82,0 СЛ - 9,6 ■ СЛ 8,1 - 13,0 - 10,0 - М 13,0

Р.ацгап^аса 31 27,3 1,2 51,7 19,1 0,3 _ 23,0 - 36,0 5,9 4,0 0,2

?. а1 с а11£езев 4138 28,0 2,0 54,1 14,5 1,4 _ 4,0 3,2 3,8 _

Р.рзеи^оа1са-Нееиее 4134 5,5 7,1 _ 80,0 7,2 0,2 _ - _ 2,а 1,2 2,0 „

Р.^аг! 4002 16,6 сд - 45,8 37,6 СД - - 0,6 0,4 0,6 ■ -

Обозначения: ЕЬа - рамкоза; Цал - манноза; Рие - фукоза; 01с - глюкоза; Са1 ~ галактоза; Нер - гептоза; банеж - 6-деэоксигексоза; Вас(ВАс)2 - 2Д-диацетанкдо-2,4,6-тридезаксигл»коза; ^исЗПАс - 3-ац ет амидо-3,6-диде з о кси гад а кто з а; РиеЛАс - 2-ацетамидо-2,б-дидеэоксигалактоэа; С1сН - глккозамин; 0а1К - галактозамин; ИХ) - 2-кето-З-дезоксиоктоновая кислота; ХИ - неи-денгиЗицировашш аминосахар.

Таблица 3 Серологическая характеристика иссле-

дуемых штаммов по данным реакции 0-агглютинации

О-сыворотка к штаммам

Гомологичная реакция (титр)

Перекрестная реакция (титр)*

штамм

Р.Пиогвэсвпа А 4125

В 1602

С 2125

Р 2111

0 2763

1 2ЭОЗ

Р.аигалИвоа 387

Р.а1са11еэпев 4138

Р*ра»и6оа1с&11-веп»а 4134

Р.Ггав! 4002'

204 ЕЮ

2560

20460

20480

20460

20480.

204В0

5120

5120

2560

1152 472 2108 247 2366 2087 2401 1Э34 1178 36 1931 19

2680 2041 31

3099 3055

2764 2523 4196 4185

1230 40 1280 320 40 40 80 640 2560 2560 2560 2560

320 320 640

160 ео

1280 1280 40 . 40

* Реюшрокныв показатели

В препаратах сравнительно мало углеводов при определении их реакцией с фенолом И серной кислотой, что является характерной особенностью ЛПС многих видов Рвеийотопвз (Захарова, 19Й4). Компонентный состав 1ПС исследовали с привлечением ряда методов, включая ^С-ЯМР-спектроскопию и ГЖХ-масс-спекгромет-рию. Как видно из таблицы 2, штаммы флюоресцирующих бактерий являются гетерогенными по составу преобладай щи х компонентов ХПС, различных нейтральных- и аминосахаров.

Штаммы нефлюоресциру».дих бактерий <Р.а1сй11еепеа, Р.рэеи-Лоб1са11авпеа, РЛгае!) по составу ЛПЗ были относительно подобными; преобладавшими выявлены только нейтральные сахара (табл.2),

Моносахаридный состав ЛПО, как известно, определяет их 0-серологическую специфичность, а также специфичность микробной клетки в целом. Для оценки степени корреляции выявленных особенностей моносахаридного состава ЛПС с серологическими свойствами и выяснения взаимосвязей между исследуемыми штаммами бактерий к ним получены высокоактивные 0-сыворотки. Титр и специфичность сывороток определяли в реакциях О-агглютинавди. Для проведения перекрестной реакции О-агглютинации использовали дополнительно 21 штамм бактерий соответствующих групп, что давало возможность исследовать серологическую однородность изучаемых штаммов (табл.3). Было установлено, что наиболее серологически однородными являются г.Пийгеэсепа б ко вари (а, в, а, 1 ), а также Р.рзеи<1оа1са11£;еоеа. Серологическую активность препаратов АПЗ, которая отражает их принадлежность к 0-ангиге--нам исследуемых культур, анализировали реакцией коль цеп ре ци питании (титр с гомологичной 0-сывороткоп - 1:100000 4- 1:500000). Между отдельными штаммами выявлена серологическая взаимосвязь (табл.10.

. . Таблица ^

Серологическая взаимосвязь изучаемых бактерий на основе перекрестной кольцепреципитации их МС.

0-сыворотка к Серологическая взаимосвязь

птаммам штамм (титр)

I г

Р.Ниогеасепа

А 4125 2303(1:10000), 31Е1МОООО), 4134(1 110000)

в 1 боэ

Продолжение табл.<|

С 2125 Р 2111 С 27 63 1 2303

Р.аигапИаса

31

Р.е1са11йепев

413Э Р.рвви(1ов1са11-Бвпез 4134

Р.ггв«! 4002

2111(1:10000) 4125(1110000)

4125(1110000), 41ЗЙ(1¡50000), 4002(11100000)

4134(1120000), 4002(1)50000)

2111(1,40000), 4130(1!10000),4002(1(50000) 4130(1120000)

Обозначения: " - " -серологическая взаимосвязь на выявлена.

Реакцией иммунодиффуэии ?.ГЮ в агаровом геле обнаруживались 1-Э линии преципитации (см.рис.1), что указыздет на сложность О-ати генной структуры исследуемых втаммов.

Ъ. 1

пи «ПС Г-амамли МС

ни ОС ОЮ""

1Ш О «О чш ою *

ш$ о ю чш ою««

2лад ою »111 ою*<»

ая ою ¿1 О Ю

7П* ою ОЮ"Л

и ою «М1 ОЮ*'-»

чи о «о ОЮ«"

ИМ о «о ш* ою*»

ою

РиоЛ ихема иммунО' диффузии ЛПС в агаровом геле. Л- гомологичная реакция, Б - перекрестная реакция,- числами' обозначены штаммы бактерий (см. табл.1)

у представит алей различных групп отражающие уровень серологического

. В перекрестных реакциях выявлены общие детерминанты, родства.

Суммируя результаты серологических исследований (рис.2), можно заключить, что серологическая разобщенность бповаров вида Р.Пиогеасепа коррелирует с гетерогенностью штаммов по . ноносахаридному составу их ДПС и наряду с более выраженной серологической однородностью внутри отдельных биоваров» а также отсутствием родства с типовым штаммом Р.Пиогеаеепя Л 4125 может свидетельствовать в пользу возможности »идовой самостоятельности отдельных биоваров.

Штаммы р.аигапМвса, а также нефлюоресцирующих бактерий (Р.аХсаНёепев, Р.рзеийоа1оа11евпеа, P.fгagІ) проявляют серологическое родство и между собой и с типовым штаммом 1иогев~ еепе,что наряду о отсутствием взаимосвязи среди биоваров Р.*1ио-геасегш свидетельствует в пользу целесообразности их распределения.» Р.Г1иогеэсепэ - группе по свойствам их ЛИС.

Рис.2 Схема серологических взаимосвязей исследуемых бактерий на основе свойств их' ЛИС (стрелками указаны серологичеокие взаимосвязи)

Иооледование составных частей макромоде кул ы ЛПС.

Особенностью структурной организации макромолекулы ЛПС является то, что ее составные части (липид А, кор. 0-цепь), различающиеся структурно и функционально, имеют различнуюсте-пень консервативности, следовательно, представляют интерес для изучения филогенетических взаимосвязей микроорганизмов и их дифференциации. С этой позиции препараты структурных частей

макромолекулы исследуемых ЛПС были выделены» изучен их состав, оценено сходство и различия с учетом таксономического положения соответствующих бактерий.

Выход лип и да А составлял <)0-б5£ (к сухому весу JiDJ). При анализе жирных кислот липида А, за исключением P.fluoresceins О 2763,где идентифицированы З-OHJjjj.q и С|2-оЯВЛЯІ,ІЦИЄС!Я характерними для липида А энтеробактерий, в исследуемых препаратах выявлен практически одинаковый набор жирных кислот, характерных для бактерий рода rseudomoaas (табл.5), что может свидетельствовать о филогенетическом родстве изучаемых бактерий. Выявленные количественные различия жирнокислотного состава, очевидно, можно трактовать как начальный этап разноооразня, более ярко проявляющегося в свойствах эволюционно более молодых частей макромолекулы ЛПС - коре и О-споцифическом полисахариде.

Рис.3 Элвиионные профили гель-фильтрации углеводной части ЛІІС на колонке о і сефадек-сом о - 50. 1 А - фракция 0-специфического полисахарида; Е - корового олигоса-харида

У 1W 150 »1

Таблица 5 мирные кислоты в составе липида А ¿ги исследуемых бактерий

к сумме всех жирных кислот)

Вид, бизвар штамм с10:0 з-сл С10;0 С12:0 2-ОЛ С12:0 З-ОЛ С12:0 А "1и!1 С18:1 С1в!0 З-ОЛ сшо ■ з-он °15:0

?.Г1иогезсепа

А 4125 СЛ 7,г 14,3 12,6 12,0 13,3 . 23,7 13,0 2,9 0,0 0,0

Е 1602 сл 15,6 42,5 3,4 22,7 6,1 7,5 2,4 сл 0,0 0,0

С 2125 СЛ 10,2 23,6 20,3 :гз,4 6,6 11,1 4,2 сл 0,0 0,0

Р 2111 с*. 6,2 12,7. 40,0 20,5 7И 20,2 13,5 4,8 0,0 0,0

О 2763 сл СЛ 35,9 СЛ сл сл 0,0 0,0 0,0 52,1 12,0

1.2303 сл 10,2 . 17,5 26,7 27,1 . 4,4 5,4' 3,2 ■ 1,6 0,0 0,0

Р.ачгшгЫаса

31 й1 14,4 30,5 ■ 14,9 •24,4 3,9 . 9,9 1,6 0,4 0,0 0,0

Р,а1са11£епеа

4138 ' 14,0 12,9 39,9 сл 23,0 7,1 « 2,3 сл 0,0 0,0

?.рзеийоа1са-И^епеэ 4134 сл 23,7 42,2 0,0 23,7 2,6 . 4,1 3,1 сл 0,0 0,0

Р.Ггае! 4002. сл 7,3. 14,7 9,7 14,7 11,2 25,1 10,7 . 5,9 сл 0,0 '

Фракции О-апецифи ческа го полисахарида и ко ро во го одигосаха-рида получали гель-фильтрацией углеводной части ¿ПО на колонке С сефадексом Q-50 (рис.3). Штаммы отличались по характеру кривых злвции, У Ъдних н е вел и кос о держание высокомолекулярной фракции (О-специфический полисахарид), у других выявлена гетерогенность кора. У штамма P.fluorescena А 4125 фракция кора обнаружена в следовых количествах. Выявленные отличия злоиионных профилей отражают различное соотношение s- и R- форм молекул 1П0 в популяциях исследуемых штаммов бактерий, что, очевидно, является их индивидуальной характеристикой.

Препараты корового олигосахарида (выход 7,2-27i) характери-80 вались различным количеством фосфора (за ис клочен нем P.fluo-гевсвпа G 2763), углеводного и белкового компонента, в отдельных препаратах выявлена примесь нуклеиновых кислот - все это, вероятно, характеризует особенность связывания MC отдельных-штаммов со структурными компонентами клеточной оболочки. Анализ компонентного состава (табл.б) показал, что в них содержатся, обычные компоненты згой части молекулы 1ПС грамотрицательных бактерий в целом и Pseudomonas в частности (рамноза и аланин), при этом отдельные препараты различаются между собой по количественному и качественному составу, что свидетельствует о возможности их таксономической обособленности. Особенно в этом плаке выделяется штамм F.fluoresсена G 27бЗ , где не выявлены: рамноза, аланин, ВДО и фосфор.

Выход фракций О-споцифического полисахарида варьировал от 0,2 до 29i, все препараты проявляли высокую серологическую активность (титр в-реакции кольцепреципитации - 1:500000). Как видно из табл.7, О-специфические полисахариды флюоресцирующих бактерий, за исключением P.riuoresoens 2111 , характеризуются включением в их состав амин о Сахаров, в'том числе и уникальных, таких,как 3-Ацетамидо-3,б-дидезоксигалактоэа ( рисЗНАа ) к дя- N-ацвтклбациллозаник (b&o(NAc)2 ). В атом плаке исследуемые бактерии близки с Р.aeruginosa, в полисахаридах которых, как правило, содержатся аминосахара (Книрель, 1965). Выявленное сходство 0-цепи - составной части макромолекулы эндотоксина ■ (ДПС) коррелирует о учащавшимися случаями выделения втаммов p.lluoreeöens наряду о Р.aeruginosa из одной и той ие 3кони о« - патологического материала. В составе полисахаридов обнаруживается также и нейтральные .сахара, в том числе рамноза. Тенденция включения в состав 0-цепи лПС исследуемых бактерий

Таблица б Состав фракций корового одигосахаряда исследуеных ІП0

% к сумме шюшаден пиков при Ш

• к сухому васу препарата

Вид, Сиовар, атакм Sha 7.ел Ліс Ara Ule Gal Ifep Ole К ОаІП KDO Ala Р

г.їіяогезеепз

А 4125 . . 19,0 18,0 - 61,0 СЛ сл 1,0 0,4 0,63 2,0 3,6

В 1É02 21,0 18,5 - 14,3 33,3 12,3 сл сі 0,3 7,5 1,1 2,8

С 2125* 52,0 1,2 39,0 - 3,6 1,2 3,0 сл 6,7 4,6 1.8 3,7

Р 2111 3,3 17,3 - - 57,7 13,? сл сд 0.7 2,7 , г'в 5,2

.і 2303 39,0 сл - . - 41,4 19,S 7,2 ■ сл 0,2 3.5 .5,0

0 27ÉJ _ 1,2 _ сл 37, í 19,5 4i,a . 14,4 1,0 - - -

?.sureatlaca

31 (1> 41,0 M - - 49,0 9,9 0,3 5,9 4,0 0,2 4,4

P.aurantiaca

Зі (2) 12,3 o,s - - .49,0 33 CI 1,3 1,9 6,7 0,2 4,0

I.alcaligenes

4139 Сі) 0,6 CJ - - 35,3 сл 14,0 0,2 5,2 7,5 10,3 3,9

P.alcaligenes

4133 (2) 27,0 - - сл 39,2 2S,3 4,7 0,2 зи. 2,1 4,7 4,6

P.pseudoalca-

ligenes 4134 1.1 15,0 - сл 33,6 47,0 3,2 1.1 о, а 0,1 0,7 3,1

P.íragi. 4002 1,é 30.6 - 41,0 22,0 3,8 0,9 0.7 V,9 4,3 5,4

Обозначения; * фракция кора 1ПС тт.гі£5 зльировалаоь двумя ликами, состав которых бил практически идентичным; (I), (2) - фракции кора,в порядке следования (си.рис.3); Ara - арабиноза; Ala - алакин Р - фосфор; другие обозначения см. в табл.2.

Таблица 7 . Моносахариди в составе О-слецифических полиса--харидов 1ПС исследуемых штаммов бактерий

0-с пеии фи че с ки й полисахарид

Моносахарид {% к сухому весу полисахарида)

Р.Г1иогеесвне

А 4125 В 1602

0 2125 У 2111

1 гэоэ

О 2763 Р.аигвп'Иаса 31 Р.аісаіівепев

4138

Р,равиаол1св11-вепеа 4134

Р.Гга«! 4002

Шла (49), РисЗИАо (23)

1Ша (41), СаИАс (20), Вас(НАс)2 (II)

]Ша (16), ї^с (22), РисИАе (21)

01с (54)

КЬа (52), ОІсНАс (18),РисЗНАс (12), ХКАс (14)

Мал (44), бата1*(20), ОаН-ІАв (19) ЇЧлсМАс (57), Вас(11Ас)г (26)

ПІїй (51), Оаі (5)

віо (34), Саі (27)

ЕШа (11), Сіо (18), йаі (35)

Обозначения: Оа1НАс - к -ацетилголакгозамин; ШсНАс - к -ацетил-глюкозамин; бата1- б-деэокситаяоэа; ХИАс - нейдентифицированный н-ацетилировакный аминосахар; другие обозначения см. в табл. 2.

рамноэы наряду с аминосахарами наводит на мысль, что эти компоненты играют определенную роль в процессе обеспечения устойчивости бактерий рода РэеиЗотопаа к экстремальным условиям, а также в способности отдельных представителей этих бактерий к патогенезу.

НефлйОресцирушцие штаммы бактерия Р.а1са11еепеэ, Р.раеи-АоаЮаН^епеа, Р.Ггае!, а также Р.11иогввсепз 2111 отличаются от выше рассмотренных тем, что в их О-специ фи ческах полисахаридах присутствуют только нейтральные сахара, тенденция включения рам но вы сохраняется не у всех штаммов.

Изучение структуры повторяющегося звена О-слецифических полисахаридов Р.Пиогевсепв 0 2763 и Р.аигап41аса 31 *

Так как ЛПС Р.Пиогеэсепэ О 2763 оказался уникальным по компонентному составу (табл.2, 5, б), а данные 0-агглютинации (табл.Э) свидетельствовали о близости с другими штаммами этого таксона, важно было изучить строение его 0-иепи. Из спектра дезацетилированного полисахарида установлено, что полисахарид является регулярным и состоит из трисахаридных повторяющихся звеньев, включающих два остатка маннозы, и - ацотид-галактозамин и 6-дезокситалозу, конфигурация которой подтверждена также данными ^-НМР-спехтроскопии. В результате метилирования было показано, что б-дезокситалоза занимает терминальное положение бокового ответвления» Мягким кислотным гидролизом с СР^СООН и последующей голь-фильтрацией на колонке с ТЗК-40 были выделены фрагменты линейной части полимера и моносахарид 6-дезокситалоэа. Используя данные ^С-ЯМР-спектра, снятого без подавления О и Н взаимодействий, удельного оптического вращения, а также расчетного метода на ЗШ, установлена структура повторявшегося эвена О-специфического полисахарида:

I4 ' • I! ■

о Ас -5СЙ АсО-г)~и-1.-€<№а

Положение О-ацетильных групп СОАс), удаление которых приводило к потере серологической активности полисахарида, устанавливали по эффектам О-ацотилирования С Лапазоп, 1987 } путем анализа ^С-ЯМР-спекгр&. По имеющимся у нао данным, подобная структура О-цепи не обнаруживалась ранее у других бактерий, что является основанием для использования уникальности ее строения при дифференциации представителей Р.Пиогазсепз О,

Интерес к изучению структуры 0-специфического полисахарида Р.аигвпМаса 31 вызван тем, что в этом полисахариде были идентифицированы уникальные аминосахара (табл.7), чем он был похож на полисахариды Р,аегие1поаа,

* Изучение'структуры О-специфических полисахаридов проводилось на базе Института органической химии им. Н.Д.Зелинского ' АН СССР (г.Москва) совместно с к.х.н. Книрелем S.A. и Д.х.н. Шаиконач A.C., которым айтор снражаот глубокую благодарность.

^ОЯМР-слектр показал, что полисахарид является регулярным и-еостоит из трехчленных повторяющихся звеньев, включающих два остатка и -ацетил- ь-фукоэамина и уникальный аминосахар Н-аце-тнл-О-бациллозамин. Используя данные метилирования, солъволиза безводным фтористым водородом, *Н-НМР-спекгроскопии. удельного оптического вращения, а также анализ *эС-НМР-спектра с применением расчетного метода на ЭЩ (Липкивд, 1987), установлена структура повторявшегося звена:

Наличие метильных групп (семь на каждое повторяющееся звено) хорошо объясняет поведение ЛПС при экстракции клеток водным фенолом, в результате которой он переходит в менее полярную феноль ну ю фазу.

Таким образом, по строению О-специфической полисахарид ной цепи Р.аигапиаса 31 сходен с рядом полисахаридов Р.авгиа!-пова (КШге1, 19в6( Ст1Л)С±еУ, 19Э0), что может свидетельствовать об определенном родстве этих микроорганизмов и требует дальнейшего изучения.

Подводя итог изучении составных частей макромолекулы ¿ПС, следует отметить, что эти компоненты имеют неодинаковую степень сходства. Так, за исключением Р.Ниогеаеепа 2763, в липиде А исследуемых ЛПС выявлен практически одинаковый набор жирных кислот (табл.5).. На уровне компонентного состава корового олигоса-х&рида (табл.6) штаммы составляют более гетерогенную группу (выявляется четыре хемотипа). Наконец, по моносахаридному составу 0-цепи ХПС обнаружено значительное их различие, практически каждый штамм имеет характерный только для него хемотип 0-цепи (табл.7). Из этих £анных можно заключить, что обнаруженная дивергенция свойств составных чаете» макромолекулы ЛПС в порядке: липид А - кор - 0-цепь является отражением усложнения путей синтеза ЛПС в эволюционном процессе..Особенно ярко это демонстрируется на примере ЛЛЗ штаммов Р.Пиогеэсепэ (за исключением а 2763), где практически идентичные по жирнокяслотному составу лили да А штаммы приобретают отличающиеся по компонентному составу хоровые олигосахариды и индивидуальные 0-цепи.

Из данных о взаимном сходстве исследуемых штаммов бактерий, полученных на основании расчета коэффициента сходства их (рис.5), следует, что рассматриваемые штаммы бактерий проявляют высокую степень гетерогенности (уровень сходства варьирует в пределах- Это свидетельствует о таксономической обособ-

данности групп, представителями которых являются исследуемые втаммы бактерий. Особо выделяется Г.Пиогезсппа Б 2763 (сходство с другими штаммами - 41)1), что хорошо согласуется.с данными систематики (Берги, 1984), согласно которым биовар О объединяет штаммы, утратившие различное количество характерных для бактерий рода Рэоиаотопаэ признаков. Положение типового штамма г.!1иогезсвпа А 4125 по отношению к другим рассматриваемым штаммам (сходство 5<4-62?) согласуется с данными нумеричео-' кого анализа (Киприанова, 1979), согласно которым этот штамм выделяется в качестве "примыкающего". Тот факт, что Р.*1ногеа-сспа г 2111 проявляет с типовым ятаммок большее сходство, чем штаммы - представители других биоваров, может свидетельствовать в пользу правильности "укрупнения" вила Р.(1иогеэсвпа (Б^-п1ег, 1дйб), в результате которого штаммы вида Р.1ешопп1ег1 , рассма'1 риваются в качестве биовара Р вида Р.Пиогеасепа. Группирование Р.шгопИаса 31 с Р.Пиогеесепа В .1602 на уровне 65)С согласуется с иысокой степень» сходства этих бактерий по показателю гомологии Л:1К (Киприанова, 1935).

I з г ? i t s i s u

T

Рис.5 Схема взаимного сходства исследуемых итаммов бактерий на основе свойств JCflC, раочи-танного с помощью ЗШ . 1, 2, 3, 4, 5, 6 - втаммы p.fluorosoena (А 4125, В 1б02,,С 2125, Р 2111, i 2303, G 2763), 7 ~ ^B^ aurantiaea 31, 8 - P.&l-caligenes 4138, 9 - P. peeudoalcaligenea 4134, -10 - P.-Tragi 4002.

Уровень сходства штаммов нефпюоресцируюших бактерий ( Р.а1-сиИсепеа, Г.рвеи<1оп1сп11еепе8, Р.Хгад! ) С представителями флюоресцирующих видов (62-71?) позволяет говорить об определен--ной близости от их микроорганизмов и возможности их распределения в ОДНОЙ таксономической группе - Раеийотопаз «иогезсепз.

швода

I. Впервые изучены л и по поли сахариди штаммов бактерий рода 1 feвцdoтопаз. Обнаружена штамповая гетерогенность флюоресцирующих бактерий по компонентному составу ЛПС, тогда как представители нефлюоресцируюших видов ( F.slcalißenea, Р.pasudoalealige-naa, P.fregi' ) по этому показателю относительно подобны.

2* В гомологичных серологических тестах исследуемые препарати ЛПС проявляли высокую активность. Выявленная серологическая разобщенность штаммов P.fiuoreacens коррелирует о гетерогенностью втаммов по моносах аридному составу ЛПС и свидетельствует о возможности видовой самостоятельности отдельных биоьаров.

Э. Серологическое родство штаммов P.aurantiaca, а также нефхсоресцирукщих ВИДОВ Р.НІСaligenes , F.pseudoalcalißenes, Р.fragí между собой И С типовым втаммом P.fiuoreacens может свидетельствовать о целесообразности отнесения отих видов к Р.flúorescena - группе.

4. При изучении структурных частей макромолекулы ЛПС исследуемых штаммов обнаружена дивергенция ее свойств в порядке: липид А - кор - 0-цепь, Б липиде А, за исключением P.fluores-cena С 2763, выявлен практически одинаковый набор жирных кислот, характерных для этой части макромолекулы ЛПС бактерии рода Pseudomonas. На уровне состава корового олигосахарида рассматривав-, мыв штаммы составляют более гетерогенну» группу (выявляются четыре хемотипа, различающиеся содержанием отдельных компонентов). По ноносахаридному составу О-цепи все исследуемые ЛПС характеризовались индивидуальным хемотипом. Обнаружена тенденция включения в состав 0-uemt флюоресцирующих бактерий аминосахаров и рамнози, тогда как представители нефлюоресцирупвдих видов характеризовались наличием только нейтральных Сахаров.

5. p.fiuoreacens G В763 значительно отличался от других втаммов по всем показателям. Выявленные.в составе его липида А жирные кислоты CjgjO и нвляотся характерными для этее-робактерия; в коровом олигооахариде не обнаружены КДО, фосфор, рамноза и алакин,

6. Впервые установлена структура повторяющегося эвена О-спе-цифнческой полисахаридной цепи ЛПС P.fiuoreacens О 2763. В его составе идентифицированы D-манноэа, н-ацетил-іі -галактозамин,

а также уникальный моносахарид 6-деэокси-ь -талоза.

7,. Впервые установлена структура повторяющегося звена 0-опецифическоп полисах аридной цепи ЛПС Р. шг entinta 31 .состоящего

из н-ацетил- ь-4укозамина и ди~ н-ацетил- D-бациллоэанина (г,'» диацотамидо-2,4 ,6-тридвзокои- и-глюкоза).

6. Группирование исследуемых штаммов по свойствам 1ПС, рао-считанное с помощью ЭВМ, согласуется, с их таксономическим рангом, принятым в настоящее время.

• По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Здоровенко Г.М., Веремейченхо С.Н., Захарова И.Я. Но носах аридный состав и серологическая характеристика лилополисахаридов различных биотипов Pseudomonas fluorescein //J Всесоюз. биохим съезд (Киев, 1986): Теэ.дом.-М.: Наука, 1986.-С.317-318,

2. Здоровенко Г.М., Веремоиченко С.Н. Вивчення корового оліго-сахариду Pseudomonas fluoreocans //Г Укр.біохім. з'їзд (Івано-Франківськ, 1937): Тез.докл.-Київ, 1987,-0.322-323.

3. VeremeychenKo S'.tl., Zdorovenko ü.M., ¡Jakh'arova І.Ї. Lipopoly-sftcühwidos from differont Movaro <yt Pseudomonas fluorescein //3rd Jiratislava symposium on saccharides (Bratislava, 1996)t Abstracts, SlovcnskeJ akademic vied, Bratislava, 1936.-P.69»

Здоровенко Г.У., Ііеремейченко С.Н., Захарова,И«Я. Сравнительная характеристика липополнсахаридов различных штаммов Pseudomonas fІиогвясєпз //Никробиол,журн.-І987,-T.<l9,*4,-C* 12-17.

5. Веромейченко С.Н. Коро вые олигосахариды липополнсахаридов

. Pseudomonas fltioreaceng /Дам же.-1987.-T.<»9,ї5.-С.І8-22.

6. Здоровенко Г.М., Веремейченко С.Н., Захарова И.Я. Моносахарид ный состав и серологическая характеристика липополнсахаридов нефлюоросцирующих бактерий Pseudomonas fluoreseene группы-//Микр.биол.журн.-І967.-Т.49,#5.-С.ІЗ-І8.

7. Веремейченко С.Н., Здоровенко Г.М., Захарова И.Я., Книрель С.А., Аипкинд Г.М., Шадков A.C. Характеристика липополисаха-рида (ЛПС) Pseudomonas aurantiaca ИМВ ЗІ //Ii Всесоиэ. конф, "Химия и биохимия углеводов" (.Тбилиси, І987)і Тез.докя.-Пучино, 1987.-С.121-122.

8« Захарова И.Я., Веремейченко С.ІІ., Здоровенко Г.М., Книрель Ю. А., Характеристика л ил о полисахарида (ІПС)' Pseudomonas fluoresces биовар g ИМВ 2763 /Лам же- 1987.-С.122-123-9. Книрель С.А., Здоровенко Г.М., Веремейченко-С.Ы,, Липкинд Г.М., IllaniKOD A.C., Захарова И.Я., Кочетков Н.К. Антигенные

полисахариды бактерий. ЗІ. Структура О-с пе ци фи чео ко й полисах аридной цапи липо пол и сахари да Pseudoaonaa auremtlact. ИНВ ЗГ //Биоорг.химия.-І983.-Т.ІІ >3.-0.352-358.

10. Zdorovenko Q.U,jVeremeychenko S.1J.,Zakharova I.Y. Endotoxins Oí Pseudoraonaa flúorescena //Int. Symposium on Endotoxin (Japan, 1989) iProgram and abstrae te, Symp. Píen. Prese, Osaka,

,11. Здоровенно Г.М., Веремеяченко C.H., Захарова И.Я. Иимуно-химичеок&я характеристика липополисахарида Peeudomonas eur&atlaoa// Микробиология,-1988. (В печати).

12, Ввремейченко С.Н., Здоровенно Г.М., Захарова И.Я. Жирнокислотны* состав липяда A Pseudomon&a гlucresсens //Микробиология. 1968,- (В печати).

Подп. к леч.Л/./О /і БФa94g Формат Л1'/^ Бумаг Печ. офс. Уел, печ. л. f,3$ Уч.-язд. л. / . - Тираж/ДО За к. g-{Г/J у . Емллвтно. '

Кчшскпи muiKiia* типография шучиоП киягн, Киев, Репина, -