Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение когнитивных функций и механизмов их восстановления после повреждения гиппокампа каиновой кислотой

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение когнитивных функций и механизмов их восстановления после повреждения гиппокампа каиновой кислотой"

На правах рукописи

□□34 78571

Лебедев Денис Сергеевич

ИЗУЧЕНИЕ КОГНИТИВНЫХ ФУНКЦИИ И МЕХАНИЗМОВ ИХ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПОСЛЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ ГИППОКАМПА КАИНОВОЙ

КИСЛОТОЙ

03.00.13. - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

„ - 1 ОКТ 2009

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО 2009

003478571

Работа выполнена в Лаборатории экспериментальной нейробиологии Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН и Пущинском государственном университете

Научный руководитель: доктор биологических наук

Архипов Владимир Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Семенова Татьяна Павловна

кандидат биологических наук Безлепкин Владимир Георгиевич

Ведущая организация: Кафедра высшей нервной деятельности

Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится «2&_» ОуЗ^г^^Х 2009 г. в на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан «К » £^¿^^02009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета, //,

к.ф.-м.н. Н.ФЛанина

Общая характеристика работы. Актуальность проблемы.

Функции гиппокампа, выполняемые в процессах обработки и передачи информации, представляют собой предмет оживленных дискуссий, несмотря на многолетние интенсивные исследования этой области мозга. Выдвинуто множество предположений о том, какие функции выполняет гиппокамп в когнитивных процессах, таких как память, внимание, ориентация в пространстве [Bird, Burgess, 2008]. Они включают теорию декларативной памяти (Declarative Theory; L. Squire), согласно которой гиппокамп вместе с другими височными структурами критичен для всех форм осознанных процессов памяти (эпизодической и семантической, узнавания и процессов воспроизведения) в течение ограниченного промежутка времени. Теория множественных следов (Multiple-Trace Theory; L. Nadel, M. Moscovitch) предполагает, что эта структура является необходимой для воспроизведения деталей контекста, относящегося к эпизодической памяти. Теория двойного процесса (Dual Process Theory; J. Aggleton, M. Brown) предполагает осуществление гиппокампом связывания информации в модулях неокортекса, что дает возможность в новой ситуации воспроизводить или использовать соотношения между элементами обстановки в дополнение к воспроизведению самих элементов. Теория когнитивной карты (Cognitive-Map Theory; J. O'Keefe, L, Nadel), согласно которой главная роль гиппокампа млекопитающих состоит в конструировании и хранении аллоцентрических репрезентаций местоположения животного в пространстве. Заслуживает внимания представление о гиппокампе как компараторе сигналов и детекторе новизны, механизме внимания (Sokolov Е., Vinogradova O.S., Pribram К., J. Gray, McNaughton).

Таким образом, функции гиппокампа окончательно не определены и являются предметом активного исследования. Один из подходов, нацеленных на понимание этих функций, состоит в изучении последствий экспериментального повреждения структуры мозга. Способ повреждения гиппокампа в большой степени определяет характер нарушений в поведении животных, который заметно различается в случае повреждения ткани электролитически или нейротоксинами [Maren et al., 1997]. Электролитическое разрушение нервной ткани приводит к существенным нарушениям структуры, затрагивающим не только клеточные элементы в области разрушения, но и проходящие волокна. Тогда как введение нейротоксинов (иботеновая кислота, NMDA, каиновая кислота) вызывает локальную гибель нейронов, в меньшей степени затрагивая остальные элементы нервной ткани [Shigemoto et al., 1997].

Каиновая кислота (КК) - является селективным агонистом каинатных рецепторов (подтипом рецепторов возбуждающего нейромедиатора -глутамата) и широко используется в экспериментальных исследованиях в качестве нейротоксина. Локализованы каинатные рецепторы как пресинаптически, так и постсинаптически; они экспрессируются также и

глиальными клетками [Веп-Ап, СоББаЛ, 2000]. Была отмечена избирательная токсичность КК по отношению к гиппокампу при ее системном введении [Веп-Ап, 1985]. Показано, что при интрагиппокампальном введении малых (субконвульсивных) доз КК происходят, в основном, локальные повреждения структуры рЫдепкЛ), 1997].

Несмотря на многочисленные исследования гиппокампа, механизмы, участвующие в его восстановлении, а также в компенсации функций после повреждения, остаются недостаточно изученными. Решение задач разработки методов предотвращения и восстановления нарушений в метаболизме и функционировании гиппокампа, поможет найти новые подходы для компенсации гиппокампальных дисфункций.

Цель и задачи исследования.

Цель работы - изучение функций гиппокампа в механизмах обучения и памяти, условий нарушения и восстановления этих функций после повреждения дорсальной области гиппокампа нейротоксином.

Поставлены следующие задачи исследования:

1. Найти дозу КК, при введении которой в дорсальный гиппокамп происходит лишь локальное нарушение ткани, не приводящее к эпилептогенезу, но вызывающую долговременные изменения в поведении животных.

2. Выявить паттерн нарушений процессов памяти и обучения после повреждения дорсальной области гиппокампа нейротоксином, описать динамику восстановления гиппокампальных функций.

3. Охарактеризовать функциональное состояние митохондрий неокортекса и гиппокампа после повреждения дорсальной области гиппокампа каиновой кислотой.

4. При таком же воздействии на гиппокамп оценить изменения транскрипции некоторых генов, связанных с митохондриальными функциями.

Научная новизна.

В ходе исследования поведения животных было выявлено, что в зависимости от примененной дозы, введение КК в дорсальную область гиппокампа может приводить либо к развитию эпилептогенеза, либо к локальному повреждению гиппокампа. В последнем случае, нарушения (ухудшения выработки, хранения и воспроизведения декларативной формы памяти), обусловленные введением КК, могут частично компенсироваться. В результате исследования особенностей энергетического метаболизма отдельных структур головного мозга крыс впервые показано, что в ответ на введение КК в дорсальный гиппокамп, как в конвульсивной, так и в субконвульсивной дозах, изменения дыхания митохондрий развиваются не только в гиппокампе, но и в префронтальной области неокортекса мозга крыс.

Впервые определена динамика экспрессии генов синаптофизина {Бур), митохондриального разобщающего белка (1/СР2), метаботропного

глутаматного рецептора (т01иЯ5), субъединицы цитохром С оксидазы (СОХЗ) в гиппокампе и префронтальной коре через 3, 7 и 20 дней после локального повреждения дорсального гиппокампа каиновой кислотой. Было показано наличие пластических перестроек в префронтальной коре в ответ на повреждение гиппокампа.

Впервые показано, что степень нарушения предварительно выработанного навыка меньше, а восстановление его происходит быстрее, если животные начинают тесты воспроизведения через 3 дня, а не через 5 или 7 дней после повреждения гиппокампа, что указывает на важную роль самой когнитивной деятельности для восстановления функций мозга.

Практическое значение.

Локальное повреждение гиппокампа нейротоксином можно рассматривать как модель повреждения этой структуры в результате травмы или острой локальной ишемии. Изучение структурно-функциональных изменений в результате такого экспериментального воздействия расширяет возможности для разработки методов терапевтической компенсации возникающих повреждений. Так, например, выявленные в работе изменения функциональной активности митохондрий и экспрессии генов для ш01и115, синаптофизина, иСР2 в префронтальной коре, позволяют предположить важную роль этой структуры в механизмах компенсации функций нарушенного гиппокампа. Эти результаты могут быть применены для оптимизации процессов восстановления структуры и функций гиппокампа после его повреждений.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на конференциях: «Девятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей», 2006 (Санкт-Петербург); «Биология - наука XXI века. 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых», 2006 (Пущино);УИ международный симпозиум «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2006,2008); XX съезд физиологического общества имени И.П. Павлова, 2007 г., (Москва); Одиннадцатая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье», 2008 г. (Санкт-Петербург).

Публикации.

По результатам работы опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на/т^-страницах машинописного текста, содержит^, рисунков, таблиц и список литературы из2<?/£сылок.

Материалы и методы исследования.

Исследования проведены на 160 самцах крыс линии Вистар двухмесячного возраста, весом 160-180г. до начала эксперимента. Животных содержали в нормальных условиях со специальным режимом питания, согласно которому они получали пищу один раз в день во время поведенческих экспериментов и сразу после них. В период адаптации к экспериментальным условиям вес животных снижался не более чем на 20%.

Введение каиновой кислоты. Крысам производили однократное двухстороннее введение каиновой кислоты (КК, Sigma) в дорсальный гиппокамп под действием пентобарбиталового наркоза (30 мг/кг). Нейротоксин растворяли в изотоническом растворе хлористого натрия, контрольным животным вводили изотонический раствор хлористого натрия в том же объеме, что и опытным животным. Координаты двухстороннего стереотаксического введения вещества в дорсальную область гиппокампа: АР = -3,5, L = ±3, Н = 3,5 [Paxinos, 1998]. Введение КК осуществляли с использованием микрошприца ("Hamilton", Germany), раствор вводили в объеме по 1 мкл в левый и в правый гиппокамп. Контрольным животным вводили эквивалентный объем изотонического раствора хлористого натрия.

Исследование процессов обучения и памяти. Обучение крыс проводили в камере (60 х 80 х 60 см), имеющей стартовую площадку и несколько целевых полок расположенных на разной высоте (Рис. 1), на одной из которых находилось подкрепление (смоченный хлебный шарик). Для достижения полки с подкреплением животному необходимо подняться по небольшой лестнице. Перед началом обучения в течение 5 дней животные привыкали к экспериментальной обстановке. Кормление во время привыкания и обучения производили в экспериментальной камере один раз в сутки. Показателем обучения служило время (латентный период), затрачиваемое животным на прохождение пути от стартовой площадки до целевой полки. Выработка навыка продолжалась в течение пяти дней, в каждый из которых животные совершали по 10 побежек. За это время крысы начинали выполнять побежки к целевой полке с латентным периодом менее 10 с.

В первой серии экспериментов действие каиновой кислоты проверяли на процесс выработки навыка: необученным крысам вводили КК, а затем проверяли их способность обучаться по стандартной методике.

Во второй серии экспериментов заранее обученным крысам вводили КК, а затем изучали процессы сохранения/воспроизведения навыка. В этом случае после пятидневного обучения крысам вводили КК или контрольный раствор и через 3, 5 или 7 дней после введения КК производили тест на сохранение навыка. Для этого крыс контрольной и опытных групп запускали в экспериментальную камеру и регистрировали время выполнения побежек к целевой полке; дневная сессия, так же как и при обучении, состояла из 10-и побежек.

В третьей серии поведенческих экспериментов было изучено экспериментальное угашение (торможение) выработанного навыка (негативное обучение): на следующий день после того, как животные начинали безошибочно воспроизводить пищедобывательный навык. В течение двух дней животных запускали в камеру, но пищевое подкрепление они при этом не получали. Регистрировали время и число совершенных неподкрепляемых реакций. В каждый из дней животных запускали в камеру до тех пор, пока они не прекращали побежки к целевой полке (критерий -латентный период более 150 с три пробежки подряд). Кроме того, регистрировали число "автоматизированных" двигательных персевераций у животных в первый день угашения (последовательные реакции с латентным периодом менее 10 с, совершенные животными в первый день угашения).

В четвертой серии экспериментов крыс, полностью угасивших предыдущий навык, повторно обучали побежкам на другую целевую полку, оценивали динамику обучения и количество ошибочных реакций в дневной сессии из 10 побежек.

Исследование дыхания митохондрий. Через 2 недели после введения КК (доза 0,2 мкг или 0,75 мкг) или изотонического раствора хлористого натрия (контрольной группе крыс) исследовали дыхание митохондрий в различных структурах мозга (гиппокамп, префронтальная кора и мозжечок). Применяли полярографический метод с использованием закрытого платинового электрода Кларка в термостатированной (26°С) кювете объемом 1 мл при постоянной фиксированной скорости перемешивания. Использовали животных часть из которых прошла поведенческие тесты, часть животных этих тестов не проходила. Животных декапитировали, мозг быстро извлекали, помещали в ледяной изотонического раствор хлористого натрия, отмывали от крови, выделяли структуры мозга. Ткань, находящуюся в изотоническом растворе хлористого натрия, взвешивали, затем переносили в охлажденную среду выделения, промывали этой же средой и гомогенизировали. На 1г ткани добавляли 2 мл среды выделения, которая имела следующий состав: 125 мМ КС1; 10 mM HEPES-KOH, рН 7,4; 0,5 тМ EDTA; 1 тМ EGTA. Гомогенизацию проводили в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком при температуре 4°С. Для лучшего сохранения нативных свойств дыхание митохондрий измеряли в гомогенатах ткани {Кондрашова и соавт., 1997, Kondrashova et al., 2001]. Среда инкубации содержала: 125 мМ КС1, 10 мМ HEPES-KOH, рН 7,2, 2 мМ КН2Р04, 0,5 тМ EDTA. В кювету со средой инкубации добавляли субстрат окисления -янтарную кислоту (4 мМ), янтарную ксилоту + глутамат (2мкМ), либо пируват+малат (4 мМ + 4 мМ) или а-кетоглутарат + малонат (4 мМ + 1 мМ), АДФ - 200 мкМ, 2,4- динитрофенола (ДНФ) - 25 мкМ.).

Определяли следующие параметры дыхания митохондрий: Чг -скорость потребление кислорода в присутствии субстрата окисления и фосфата при отсутствии АДФ.

V3 -скорость дыхания митохондрий при окислительном фосфорилировании: потребление кислорода в присутствии субстрата окисления, ортофосфата и АДФ.

V4 - скорость дыхания митохондрий после использования АДФ, в присутствии субстрата окисления и ортофосфата. ДК по Чансу-дыхательный контроль состояния митохондрий: V3/V4. t<¡, - время фосфорилирования добавленного АДФ.

Уф - скорость фосфорилирования добавленного АДФ: отношение добавленного количества АДФ (мкмоль) ко времени его эстерификации (от момента добавления АДФ до момента его расходования). Уднф - скорость разобщенного дыхания MX: потребление кислорода митохондриями в присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования 2,4- динитрофенола (ДНФ).

Содержание белка в каждой пробе определяли по методу Лоури. Концентрация белка в кювете составляла 3,5 ± 0,5 мг/мл. Для измерения дыхания митохондрий в кювету вносили 100 мкл гомогената.

Исследование экспрессии генов. Экспериментальным животным вводили КК в дозе 0,2 мкг, контрольным - изотонический раствор хлористого натрия. Через 3, 7 или 20 дней после инъекций животных забивали и выделяли гиппокамп, префронтальную кору. Структуры мозга взвешивали и гомогенизировали, используя соотношение 100мг ткани на 3 мл буфера: 4М GITC, 25mM Na307C6H5 (цитрат Na), 0,5% N-Laurylsarcosine sodium salt (саркозил), 0,1M 2|3-меркалтоэтанол. Тотальную РНК выделяли из гомогенатов структур мозга с использованием метода гуанидин изотиоцианат-фенол-хлороформной экстракции [Chomczynski et al., 1987; Маниатис 1986] с некоторыми модификциями. Концентрация тотальной РНК измерялась спектрофотометрически (NanoDrop spectrophotometer). Качество РНК оценивалось с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле (130в/70А).

Реакцию обратной транскрипции проводили по стандартному протоколу приложенному к набору реактивов для обратной транскрипции ("Fermentas", Литва) с небольшими модификациями. При подборе праймеров оптимальным считали соотношение >50% G/C-nap в праймерах, а также отсутствие других мишеней в геноме комплементарных более чем 10-11 нуклеотидам на 3' - конце. Степень уникальности оценивали с помощью BLAST (NCBI): http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

Праймеры для исследованных генов: Sypl F-5'- ACAGGGTCCCTCAGTTCCTT - 3' Sypl R - 5'- TTTCTGGCTACAGCCGTGTT - З-

mGluR5 F - 5'- GATCCATCTACACAGCGTACCA - 3' mGluR5 R - 5'- AGTTCGTGAGCAATATGGGATT - 3"

UCP2 F-5'-TCCTCTCGTGCAATGGTCTT - 3' UCP2 R- 5'- CCTGGCAGGTAGCACCAC - 3"

СОХЗ F- 5'- GGTATGTTCCTTCACGGATGA - 3" C0X3 R-5'- ACCAAACCCATGCATACCATA - 3'

Количественную ПЦР в реальном времени проводили в детектирующем амплификаторе "ДТ-322" (ДНК-Технология, Россия) с использованием интеркалирующего в двуцепочечную ДНК красителя SYBR Green (Invitrogen, США). ПЦР-смесь содержала по 4пМ праймеров, 0,8мМ dNTP, 1 X Taq - буфер (67mM tris-HCl, pH 8,8,2mM MgCl2,15mM (NH4)2S04, 0,2% BSA), Taq ДНК-полимеразу (Fermentas, Литва), стерильную деионизованную воду. Объем реакционной смеси был равен 20 Качество и молекулярный вес ПЦР-продуктов оценивали электрофоретически в 5% ПААГ (230В/1 ЮмА). Опыты проводили не менее чем в 3-х кратном повторении

Статистическая обработка данных. Полученные результаты обрабатывали с использованием программы Excel и Statistica. Применяли двухвыборочный t-тест с разными дисперсиями или ANOVA, в некоторых случаях парный двухвыборочный t-тест для средних. Различия принимали как достоверные при Р < 0,05.

Результаты работы и обсуждение.

Введение каиновой кислоты. При ведении в дорсальный гиппокамп КК в дозе менее 0,25 мкг у крыс наблюдаются лишь временные проявления судорожной активности. При дозах выше 0,25 мкг у животных судорожная активность может со временем нарастать, что рассматривается как одна из моделей эпилепсии.

После введения 0,2 мкг КК у животных наблюдали судорожную реакцию во время выхода из наркотического состояния - подрагивание вибрисс, в некоторых случаях отмечены клонические сокращения передних лап (forelimb clonus), то есть слабые лимбические судороги в 1-2 балла (по Racine, 1972). Судороги продолжались недолго - в течение 20-30 минут. После чего судорожная активность не наблюдалась. При введении 0,75 мкг КК в каждую сторону гиппокампа, у крыс проявлялись преходящие судорожные явления лимбической природы величиной в 4-5 баллов и последующее развитие эпилептического статуса в течение нескольких дней. В связи с этим, поведенческие опыты проводили только с животными, которым вводили КК в дозе 0,2 мкг.

Выработка гшшедобывателъного навыка после введения каиновой кислоты. Обучение крыс начинали через 3 дня после введения КК в дозе 0,2 мкг. Динамика выработки навыка у крыс экспериментальной группы была хуже, чем у контрольных животных (Рис. 1Б). Хорошего выполнения реакции у животных с введением КК не удалось достичь и после 9 дней обучения. Отмечено высокое значение латентного периода первой побежки дневной серии (Рис. 1А), что не характерно для обучения крыс в контрольной группе.

Б

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Дни обучения

Рисунок 1. Динамика обучения крыс в экспериментальной (п=6) и контрольной (п=10) группах. А - средние значения латентных периодов отдельных побежек; Б -усредненные значения латентных периодов всех побежек за день ± стандартные отклонения.

* - Р < 0,01 по сравнению с контрольной группой.

Сохранность/воспроизведение навыка, сформированного до микроинъекгаш КК. Выполнение навыка, которому животные были обучены до повреждения гиппокампа (Рис. 2), проверяли у контрольных и экспериментальных животных через 3, 5 или 7 дней после введения КК (Группы ВЗ, В5 и В7, соответственно). Крысы контрольной группы при проверке через 2 или более дней после введения изотонического раствора хлористого натрия воспроизводили навык одинаково уверенно, лишь первая попытка у части крыс превышала 10 секунд; все остальные побежки совершались со временем менее 5 с. У крыс всех трех экспериментальных групп воспроизведение/сохранение навыка было хуже, чем у контрольных (Рис. 2).

Результаты выполнения навыка крысами Группы ВЗ, через 3 дня после введения КК, показали, что время начальных побежек у них достоверно больше, чем у контрольных крыс (Р<0,02). И на следующий день навык

уверенно воспроизводился не у всех животных этой группы, но в последующие дни они совершали побежки безошибочно (Рис. 2А). Группа В5 показала более выраженные нарушения (Рис. 2Б): в первый день теста крысы этой группы воспроизводили неуверенно не только первую, но и несколько последующих побежек. Особенно заметное отличие от контрольных они показали в последующие дни теста - навык в этой группе был нарушен у большинства крыс в течение нескольких дней. При проведении теста через 7 дней после введения КК (Группа В7) получен примерно такой же результат, как и в предыдущей группе, то есть навык нарушается на протяжении нескольких дней проведения теста (Рис. 2В).

Таким образом, у крыс экспериментальных групп степень нарушения навыка была разной, в зависимости от интервала времени между введением КК и началом проведения теста воспроизведения. В Группе ВЗ на 5-й день все животные успешно воспроизводили навык; если же тест начинали через 5 или 7 дней (группы В5 и В7) после введения КК, то выполнение навыка у большинства животных было нарушено в течение всех пяти дней проведения теста.

Дни после введения КК

Рисунок 2. Воспроизведение навыка, выработанного до повреждения гиппокампа каиновой кислотой. Указано время средних значений побежек в группах. А - начало теста через 3 суток (п =6), Б - через 5 суток (п = 7), В - через 7 суток после повреждения (п = 8) и Г - контрольная группа (п - 14); *- Р < 0,05 по сравнению с контрольной группой.

# - Р < 0,05 по сравнению с группой ВЗ, начавших тест через 3 суток после повреждения гиппокампа.

Экспериментальное угашение навыка (негативное обучение). После завершения теста на воспроизведение навыка у крыс проводили его экспериментальное угашение (через 2 недели после введения КК) в течение 2 дней. В начальный период теста животные всех групп совершали несколько быстрых побежек по стандартной траектории к полке с латентным периодом меньше 10 с, несмотря на отсутствие пищевого подкрепления. Животные контрольной группы совершали в среднем 2,9 + 0,6 таких персеверативных реакций. В отличие от этого их количество в экспериментальной группе было больше и составляло 6,3 ± 1,8 (Р < 0,01).

Динамика угашения в контрольной и экспериментальной группе также достоверно различалась; латентный период побежек увеличивался медленнее у крыс с введением КК, чем у контрольных животных (Рис.3). Животные с введением КК в первый день во время угашения совершали 22,7 + 5,5 побежек до момента прекращения выполнения неподкрепляемых реакций, в то время как животные контрольной группы 12,8 + 3,4 побежек (Р < 0,001). Отсутствие подкрепления при экспериментальном угашении у контрольных животных,

вызывает адаптивный ответ - переход к новой фазе поисковой активности, быстрее, чем у крыс с нарушениями гиппокампальной системы.

Показатели угашения навыка после введения КК (0,2 мкг)

КК (п=15) контроль (п=16) Р 1

Число персеверативных побежек 6,3 ±1,5 2,75 ±0,8 0,0000001 7,9

День 1 Число побежек до угашения 22,7+_5,5 12,8+_3,4 0,000004 5,9

День 2 Число побежек до угашения 8,8+_4,3 4,3+_3,4 0,07 1,9

Рисунок 3. Динамика угашения (негативного обучения) навыка у контрольных и экспериментальных животных, выработанного до повреждения гиппокампа каиновой кислотой. Указано время средних побежек в контрольной и экспериментальной группах ± стандартные отклонения.

Повторное обучение животных. После окончания угашения крыс обучали такому же навыку, как первоначальный, но с подкреплением на другой полке. Повторное обучение животных происходило значительно быстрее, чем первичное обучение. Время побежек стабилизировалось уже на 3-й день после начала обучения, и динамика обучения животных контрольной и экспериментальной групп не различалась (Рис. 4).

Рисунок 4. Повторное обучение крыс после экспериментального угашения (побежка на левую целевую полку). Указано среднее время в контрольной и экспериментальной группах ± стандартные отклонения.

Таким образом, показано, что локальное повреждение гиппокампа каиновой кислотой вызывает значительные и длительные изменения в когнитивной деятельности животных. Для решения вопросов, связанных с механизмами длительных специфических когнитивных нарушений у «гиппокампальных» животных, был поставлен вопрос о метаболических изменениях в структурах мозга, которые сопровождают такие нарушения. В связи с этим, в работе было предпринято изучение функционального состояния митохондрий в структурах мозга, непосредственно связанных с наблюдаемыми поведенческими нарушениями - в гиппокампе и во фронтальной области коры.

Исследование дыхания митохондрий. Параметры дыхания митохондрий в гомогенатах структур мозга определяли при наличии субстрата окисления янтарной кислоты, являющейся наиболее эффективным субстратом для энергообеспечения клеток и тканей. На Рис. 5 представлена скорость фосфорилирования добавленного АДФ. Наибольшая она в мозжечке и неокортексе, наименьшая в гиппокампе.

Через две недели после введения КК, когда наблюдаются выраженные изменения в когнитивной деятельности животных, исследуемые параметры дыхания митохондрий претерпели существенные изменения. После введения

0,2 мкг КК в гиппокампе наблюдалась активация дыхания митохондрий в состоянии 3 (фосфорилирующее дыхание) (Рис. 6). После введения в гиппокамп высокой дозы КК - 0,75 мкг в мозге животных произошли изменения, которые характеризовались уменьшением некоторых показателей функционального состояния митохондрий (Рис. 5, б). У крыс этой группы в гиппокампе произошло снижение как скоростей УЗ и Уф, так и скорости разобщенного дыхания УДНФ на субстратах: янтарная кислота и гшруват + малаг, по сравнению с экспериментальной группой животных, которым введена КК в дозе 0,2 мкг. В этой структуре также найдена тенденция к уменьшению Уф при сравнении с контрольными животными (Рис. 5). В префронталыюй коре происходило ингибироваиие дыхания митохондрий: происходило снижение скоростей У3 и Уф по сравнению с контролем (Рис. 5, 6).

0 контр Ш КК 0,2 И КК 0,75

Уф

гиппокамп

кора

мозжечок

Рисунок 5. Скорость фосфорцлировапия (Уф) добавленного АДФ в гомогенатах фронтальное коры, гиппокампа и мозжечка крыс через 14 дней после билатерального введения каиновой кислоты в дозе 0,2 мкг (группа КК_0Д) или 0,75 мкг (группа КК _0,75). Субстрат янтарная кислота. * - Р < 0.05.

В мозжечке под влиянием КК в обеих дозах каких-либо достоверных изменений параметров митохондриального дыхания обнаружено не было (Рис.5,6).

Два факта, полученные в этой части работы, заслуживают особого внимания: 1) противоположный характер изменения функционального состояния митохондрий в мозге, зависящий от дозы КК, и 2) реакция неокортекса на локальное введение КК в гиппокамп. Высокая доза КК (0,75 мкг) приводит к снижению дыхания митохондрий особенно заметному в префронталыюй коре. Это может быть связано с тем, что данное воздействие

необратимо повреждает мозговые структуры. Поведенческое выражение этого повреждения связано с развитием лимбических судорог и полной дезорганизации когнитивных функций. В отличие от этого, низкая доза КК привела к активации дыхания митохондрий в гиппокампе и префронтальной коре, хотя и такое воздействие характеризуется явным нарушением когнитивных функций животных - двигательными персеверациями, снижением тормозного контроля, дефектами в организации ориентировочно-исследовательского поведения. Вместе с тем, по-видимому, гиппокампальная система в этих условиях сохранила способность выполнять свои основные функции. Тот факт, что изменения параметров дыхания митохондрий происходят не только в гиппокампе, но и в префронтальной коре подтверждает представление о тесных взаимоотношениях этих областей мозга в когнитивной деятельности [Mogensen, 2005]. Можно предположить, что низкая доза КК, введенная в дорсальный гиппокамп, приводит не только к нарушению гиппокампальной системы, но также дезорганизует ее связи с другими областями мозга, в частности, с префронтальной корой. Этим можно объяснить затруднение перехода от одной фазы поведения к другой при выполнении теста экспериментального угашения, когда животные дольше демонстрируют двигательные персеверации, выполнение которых не относится к декларативной форме памяти [Squire, 1992].

контроль КК 0,2 КК 0,75

— 1———-

s 4Ь К 2 1

т ГС m * К С 35. . -. 1 1

Л ю 4 зп • • 1 1 а - ■' 1 ■1

j £ « 5 25- ■ ■ 1 1 ■ 1

О 3 " о О g й 20 i о 7 • 1 1 1 1 1 1 ■ 1 • 1

• 1 1 • 1 . 1

- ... 1--- 1 _ j

Кора Гиппокамп Мозжечок 1 мин

Рисунок 6. Дыхание митохондрий гомогенатов фронтальной коры, гиппокампа и мозжечка крыс через 14 дней после билатерального введения каиновой кислоты в дозе 0,2 мкг (группа КК_0,2) или 0,75 мкг (группа КК_0,75). Субстрат окисления янтарная кислота. По ходу диаграммы слева на право последовательно представлены следующие показатели дыхания: Уг - низкая скорость окисления субстрата до добавления АДФ; Уз - скорость после добавления АДФ - состояние 3 или фосфоршшрующее дыхание; У4 - сниженная скорость после исчерпания АДФ в результате фосфорилирования - состояние 4 или контролируемое состояние; Уднф -после добавления ДНФ - разобщенное дыхание. Каждое измерение проведено не менее чем на 4-х животных. Субстрат янтарная кислота.

Таким образом, введение КК в дорсальный гиппокамп приводит к изменениям в энергетическом метаболизме не только в самом гиппокампе, но и префронталыюй коре. Причем эти изменения являются пролонгированными и сохраняются через две недели после микроинъекции нейротоксина.

Несомненно, процессы восстановления и компенсации функций гиппокампа происходят и на уровне отдельных клеток поврежденной структуры мозга. Изучение молекулярно-кл сточных процессов, происходящих после локального повреждения гиппокампа, было предпринято нами на следующем этапе работы.

Экспрессия генов. Изучали транскрипцию белков, участвующих в регуляции синаптических процессов (синаптофизин, метаботропный глутаматный рецептор mGluR5) и митохондриальных функций (субъединица III цитохром С оксидазы, кодируемая митохондриалыюй ДНК - СОХЗ, и митохондриальный разобщающий белок - UCP2).

Синаптофизин - синаптический интегральный везикулярный белок. В исследованиях различного рода синаптофизин выступает в качестве маркера для изучения синаптических процессов, а также для изучения стадий жизненного цикла везикул. Установлена связь обмена синаптофизина с развитием ряда патологий [Valtorta, 2004].

Определение экспрессии синаптофизина показало, что в ответ на повреждение гиппокампа происходят длительные изменения не только в этой структуре, но и в префронталыюй коре. В гиппокампе через 3 дня после введения КК в дозе 0,2 мкг отмечено снижение уровня мРНК синаптофизина по сравнению с контрольными животными; и пониженный уровень мРНК сохранялся в последующие дни (Рис. 7). В префронталыюй коре у экспериментальных животных были обнаружены разнонаправленные изменения экспрессии синаптофизина: активация в начальный период, понижение уровня мРНК через одну неделю и возвращение к контрольному уровню через 20 дней

Можно полагать, что обнаруженное нами повышение уровня мРНК синаптофизина во фронтальной коре через 3 дня после воздействия на гиппокамп свидетельствует о пластических перестройках. Из литературы известно, что после стимуляции вибрисс у крыс происходит локальное увеличение экспрессии гена синаптофизина в соответствующих баррелах соматосенсорной коры [Yokoyama 0,2006].

Рисунок 7. Динамика изменений экспрессии синаптофизина в гиппокампе и прсфронтальной коре после повреждения дорсальной области гиппокампа каиновой кислотой в дозе 0,2 мкг. Данные экспрессии контрольных животных приняты за 100%.

* - Р < 0.05, ** Р < 0.01 по сравнению с контролем.

Экспрессия другого гена - метаботропного глутаматного рецептора т&иЯ5, также претерпела заметные изменения после повреждения гиппокампа. У экспериментальных крыс в гиппокампе уровень мРНК через 7 дней после введения КК оказался сниженным, а через 20 дней возвратился к контрольному значению. В префронтальной коре через 3 дня после введения КК экспрессия гена тС1иЯ5 активировалась у экспериментальных животных по сравнению с контрольными, через 7 дней уровень мРНК достигал нормальных значений, через 20 дней после воздействия - снижался (Рис. 8).

Рисунок 8. Динамика изменений экспрессии л1С7иД5 в гиппокампе и префронтальной коре после повреждения дорсальной области гиппокампа каиновой кислотой в дозе 0,2 мкг. Данные экспрессии контрольных животных приняты за 100%.

Р < 0.05, ** Р < 0.01 по сравнению с контролем.

Метаботропные глутаматные рецепторы находятся на поверхности клеток и благодаря своему взаимодействию с G-белками позволяют осуществлять тонкую настройку возбудимости нейрональных сетей мозга мозга [Pin, Duvoisin, 1995].- В гиппокампе mGluR5 локализованы на постсинаптических мембранах. Показана важная роль этих рецепторов в механизмах пластичности и памяти, эпилептогенеза, энергетического баланса. Блокада mGluR5 способствует выживаемости нейронов, а их активация - эпилептогенезу [Wong et al., 2005; Jesse et al., 2008].

Таким образом, результаты, полученные при изучении экспрессии генов синаптофизина и mGluR5, показали, что локальное повреждение гиппокампа вызывает длительные и разнонаправленные изменения в синаптических процессах, локализованных не только в самом гиппокампе, но и префронталыюй коре. Причем даже через 20 дней после повреждения гиппокампа, в префронталыюй коре не все нейрохимические процессы приходят к нормальному уровню, что видно из динамики экспрессии mGluR5

- в этот период отмечено снижение экспрессии этого гена. Активация экспрессии синаптофизина и mGluR5 через 3 дня после введения нейротоксина может быть обусловлена активными пластическими перестройками, вызванными каиновой кислотой.

Цитохром С оксидаза (СОХ) является конститутивным белком митохондрий и уровень ее транскрипции в клетке достаточно стабилен. После повреждения гиппокампа количество мРНК субъединицы 3 цитохром С оксвдазы (СОХЗ) было в пределах контрольных значений во все выбранные нами промежутки времени. Однако, уровень мРНК другого белка

- UCP2, который также участвует в митохондриальных функциях, значительно изменяется как в гиппокампе, так и в префронталыюй коре.

%

300 1 250 200 150 100 50

UCP2

-*- Преф.кора -й- Гиппокамп

контроль 3 дня 7 дней 20 дней

Рисунок 9. Динамика изменений экспрессии иСР2 в гиппокампе и префронталыюй коре после повреждения дорсальной области гиппокампа каиновой кислотой в дозе 0,2 мкг. Данные экспрессии контрольных животных приняты за 100%. * Р < 0.05, ** Р < 0.005 по сравнению с контролем.

Через 3 дня после введения КК никаких изменений в экспрессии этого белка не происходит в обеих структурах по сравнению с контролем. Через 7 дней наблюдается увеличение уровня мРНК UCP2 в гиппокампе, и он остается примерно таким же и через 20 дней. В префронтальной коре уровень мРНК практически не изменяется (Рис. 9). Экспрессия UCP2 увеличивается при различных повреждениях мозга, например, при ишемии, и этот белок способствует выживаемости клеток, ограничивая продукцию активных форм кислорода митохондриями [de Bilbao et al., 2004]. Активация его экспрессии показывает, что в гиппокампе через 7 дней после микроинъекции КК развиваются механизмы, защищающие нейроны от повреждения, а в префронтальной коре такой активации не наблюдается.

Заключение.

Введение КК в гиппокамп крысам в двух дозах: субконвульсивной (0,2 мкг) и приводящей к развитию эпилептического статуса (0,75 мкг) значительно различается как по поведенческим проявлениям, так и по функциональному состоянию гиппокампа и префронтальной коры. КК, введенная в высокой дозе, полностью дезорганизует поведение животных, причем, патологические проявления нарастают со временем. В основе этого лежит формирование эпилептического очага в гиппокампе, распространяющегося со временем и на другие структуры. Использованная нами субконвульсивная доза КК (0,2 мкг) приводит к локальному повреждению гиппокампа, которое способно отчасти компенсироваться. При этом поведенческие нарушения выявляются в тестах, характеризующих такие когнитивные функции животных как внимание, память и обучение.

Эпилептогенная доза КК приводит к некоторому подавлению энергетического метаболизма, а субконвульсивная а активирует дыхание в гиппокампе и префронтальной коре. Данные литературы подтверждают, что КК в определенных условиях может вызвать как активацию, так и ингибирование энергетического метаболизма в мозге [Kunz et al. 1999; Milatovic et al., 2001]. Например, показано, что через 1 час после внутрибрюшинного введения КК крысам в дозе 15 мг/кг (такая доза приводит к сильным лимбическим судорогам и нарастанию судорожной активности) происходит увеличение активности цитохром С оксидазы и субъединицы 4 этого фермента в гиппокампе и фронтальной коре. Впоследствии, через 3 и 7 дней после введения КК, когда происходят необратимые повреждения височных областей мозга, энергетические возможности митохондрий снижаются, что выражается в снижении активности цитохром С оксидазы [Milatovic et al, 2001]. Такая динамика изменений соответствует результатам, полученным в настоящей работе: низкая доза КК привела к активации энергопродукции в гиппокампе, а эпилептогенная доза КК - к снижению функциональных возможностей митохондрий. Сохранение параметров дыхания митохондрий, и даже их активация при действии субконвульсивной дозы КК, свидетельствует о

развитии процессов, способных, в определенной степени, восстановить и компенсировать вызванные повреждения.

Данные о динамике изменений экспрессии различных генов расширяют представление о' процессах, происходящих в гиппокампе и префронтальной коре в результате действия субконвульсивной дозы КК. Так, в гиппокампе происходит снижение уровня мРНК синаптофизина в ответ на действие КК, а в префронтальной коре, наоборот, через 3 дня экспрессия гена этого белка увеличивается. Участвуя в везикулярном цикле нейронов, синаптофизин способен повлиять на пресинаптические процессы и снизить чрезмерную активацию мишеней. В защите нейронов от гиперактивации участвует также и метаботропный глутаматный рецептор mGluR5; снижение экспрессии этого рецептора оказывает нейропротективный эффект [Wong et al., 2005]. Именно такое снижение в гиппокампе мы и наблюдаем через одну неделю после введения КК. Кроме того, в гиппокампе увеличена экспрессия гена митохондриального разобщающего белка UCP2, который участвует в нейропротекции, уменьшая продукцию активных форм кислорода митохондриями.

Исследование поведения животных после введения субконвульсивной дозы КК показало, что животные сохраняют способность к обучению и хранению следов памяти, хотя у них отмечаются явные дефекты когнитивных процессов. Эти дефекты проявляются, например, во время выполнения теста экспериментального угашения (негативного обучения) выработанного навыка. Экспериментальные животные демонстрировали двигательные персеверации, с трудом подавляя реакцию, которая потеряла биологический смысл; им потребовалось совершить большее число побежек, чтобы прекратить выполнение неподкрепляемого навыка. Это означает, что способность к ориентированию в пространстве у этих животных не нарушена, иначе определение местоположения целевой полки у них было бы затруднено и, в связи с этим, противоречит тому, что гиппокамп представляет собой пространственную карту. По нашему мнению, более адекватное объяснение следует из представления о важной роли гиппокампа в механизмах селективного внимания. Можно предположить, что усиление двигательных персевераций у крыс связано с затруднением в переключении внимания. Более того, характер нарушения при воспроизведении, также может рассматриваться, как неспособность крыс вовремя включить внимание на начальном этапе теста, что выражается в длительном времени первой побежки в дневной сессии.

Таким образом, наша работа подтверждает, что нарушения декларативной формы памяти, возникающие при повреждении гиппокампа, выражаются в основном в ухудшении селективного внимания, что может быть принято в качестве характерной черты этой формы долговременной памяти [Архипов, 1998].

Выводы

1. Локальное повреждение гиппокампа каиновой кислотой в дозе 0,2 мкг избирательно нарушает процессы формирования и воспроизведения декларативной формы (зависимой от селективного внимания) долговременной памяти у крыс.

2. Повреждение дорсальной области гиппокампа каиновой кислотой в субконвульсивной дозе (0,2 мкг) приводит к активации функций митохондрий в гиппокампе, а также в префронтальной коре.

3. Локальное повреждение гиппокампа каиновой кислотой вызывает длительные изменения экспрессии генов, направленные на нейропротекцию и пластические перестройки, как в гиппокампе, так и префронтальной коре.

4. Восстановление функций гиппокампа после его повреждения происходит благодаря нескольким механизмам, среди которых: активация митохондриального дыхания; изменение транскрипции генов, участвующих в нейропротекции и перестройке нейрональных сетей; вовлечение префронтальной коры в процессы компенсации.

Работа выполнена при поддержке грантов: РФФИ № 04-04-97277 «региональный» и № 04-04-48587; Аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы» № 2.1.1/3876 и №2.1.1/2280.

Список публикаций по теме диссертации. Тезисы:

Лебедев Д.С. Функциональное состояние митохондрий в структурах головного мозга крыс при каинатной модели эпилептогенеза. В сб.: Человек и его здоровье. Девятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей. 22 апреля 2006 г. Санкт-Петербург, с. 183-184.

Лебедев Д.С., Сирота Т.В., Архипов В.И. Функциональное состояние митохондрий в структурах мозга крыс после однократных судорог, вызванных пикротоксином. В сб.: Биология - наука XXI века. 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, 17-21 апреля 2006 г. Сборник тезисов. Пущино, 2006, с. 150.

Архипов В.И., Лебедев Д.С. Циклооксигеназы мозга в механизмах нейродегенерации. VII международный симпозиум «Биологические механизмы старения». Харьков, 2006, С. 27-28.

Архипов В.И., Лебедев Д.С., Сирота Т.В. Метаболические изменения в неокортексе и гиппокампе крыс после интрагиппокампального введения каиновой кислоты. XX съезд физиологического общества имени И.П. Павлова. Тезисы докладов. Москва, 2007, с. 128.

Шевченко A.A., Лебедев Д.С., Сирота Т.В., Архипов В.И. Влияние субконвульсивных доз каиновой кислоты на когнитивные функции крыс при совместном введении в гиппокамп и фронтальную кору. В сб. «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине», материалы международной научно-практической конференции, 10-12 октября 2007. Ростов-на-Дону, 2007, с. 72.

Лебедев Д.С., Шевченко А А., Архипов В.И. Вовлечение метаботропных глутаматных рецепторов в регуляцию энергетического метаболизма в гиппокампе и неокортексе при действии каиновой кислоты. В сб. «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине», материалы международной научно-практической конференции, 10-12 октября 2007. Ростов-на-Дону, 2007, с. 24-25.

Архипов В.И., Лебедев Д.С., Шевченко A.A., Изучение восстановления когнитивных функций при экспериментальном повреждении гиппокампа. 8 международный симпозиум «Биологические механизмы старения». Харьков Украина 2008.

Статьи:

Архипов В.И., Сирота Т.В., Лебедев Д.С. Влияние внутригиппокампального введения каиновой кислоты на поведение крыс и функциональное состояние митохондрий в структурах мозга. Известия РАН, сер. биологическая, 2007, № 5, с. 570-576.

Сирота Т.В., Шевченко A.A., Лебедев Д.С., Архипов В.И. Энергетический метаболизм в структурах мозга крыс при действии каиновой кислоты на фронтальную кору. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007, т. 144, №11, с. 510-513.

Arkhipov V, Kulesskaja N, Lebedev D. Behavioral perseveration and impairment of long-term memory in rats after intrahippocampal injection of kainic acid in subconvulsive dose. Pharmacol. Biochem. Behav., 2008,88,299-305.

Лебедев Д.С., Архипов В.И. Экспрессия генов mGluR5 и синаптофизина после повреждения дорсального гиппокампа каиновой кислотой. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2009, т.147, №2,197-200.

Подписано в печать:

06.07.2009

Заказ № 2312 Тираж - 90 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лебедев, Денис Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Основные представления о структуре и связях гиппокампа.

1.2. Функции гиппокампа.

1.3. Каиновая кислота.

1.4. Энергетические процессы в мозге.

1.4. Экспрессия генов в мозге.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Животные и их содержание.

2.2. Введение каиновой кислоты.

2.3. Методы изучения процессов обучения и памяти.

2.4. Исследование дыхания митохондрий в структурах мозга.

2.5. Исследование экспрессии генов в структурах мозга.

2.6. Статистическая обработка данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Исследование обучения и памяти животных.

3.2. Исследование функционального состояния митохондрий в структурах мозга.

3.3. Изучение транскрипции белков, участвующих в регуляции синаптических процессов и митохондриальных функциях.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение когнитивных функций и механизмов их восстановления после повреждения гиппокампа каиновой кислотой"

Функции гиппокампа, выполняемые в процессах обработки и передачи информации, представляют собой предмет оживленных дискуссий, несмотря на многолетние интенсивные исследования этой области мозга. Клинические и экспериментальные данные говорят о том, что при повреждении гиппокампа, как правило, не происходит изменений сенсорного анализа, моторных навыков, интеллекта, эмоциональной сферы и личности. Объем непосредственного запоминания и долговременная память может сохраняться, но процесс перехода из кратковременной в долговременную память нарушается [Milner et al., 1998]. Признается, что гиппокамп вовлечен в обработку информации о пространстве и времени, о взаимоотношениях стимулов окружающей среды, но его конкретная роль в этих процессах требует уточнения. Один из подходов, нацеленных для понимания этих функций, состоит в изучении последствий экспериментального повреждения структуры мозга. Способ повреждения гиппокампа в большой степени определяет паттерн наблюдаемых нарушений в поведении животных, что является одной из причин разногласий в определении функций гиппокампа. Например, показано, что эффекты разрушения различны в случае повреждения ткани электролитически или нейротоксинами [Maren et al., 1997]. Электролитическое разрушение или аспирация ткани приводит к существенным нарушениям структуры, затрагивающим не только непосредственно клетки гиппокампа, но и проходящие волокна. Локальное повреждение (таких же объемов ткани) с помощью нейротоксинов повреждает гиппокамп в меньшей степени и более селективно, что дает возможность изучать градуальные изменения нарушений функций гиппокампа [Shigemoto et al. , 1997]. Один из таких нейротоксинов, каиновая» кислота (КК) - является селективным агонистом каинатных рецепторов, подтипом рецепторов глутамата, основного возбуждающего нейромедиатора мозга. Высокая плотность каинатных рецепторов в мозге обнаружена в областях, САЗ и СА1гиппокампа; Локализованы эти рецепторы как на> пре-, так и постсинаптических мембранах; они экспрессируются также и глиальными клетками [Ben-Ari, Cossart, 2000]. Нейротоксин нашел широкое ■ применение в экспериментальной нейробиологии в качестве эпилептогенного и проапоптотического агента, однако, влияние субконвульсивных доз КК на мозг также используется для понимания пусковых механизмов : нейротоксичности, специфичной роли каинатного подтипа глутаматных рецепторов в клетке. Известно, что действие КК характеризуется высокой избирательностью по отношению к гиппокампу даже при системном введении вещества.

В настоящей работе: применяли; микроинъекции1 КК в дорсальную? область гиппокампа, крыс, чтобы достичь локального, повреждения: этой структуры. Предполагая уточнить функции, гиппокампа в когнитивной деятельности, в работе изучали поведение животных и некоторые показатели? функционального состояния митохондрий, и экспрессии генов, характеризующие мозговые структуры в целом. Результаты^ полученные при таком подходе, представляют также интерес при- анализе нарушений; и восстановления функций гиппокампа после* ишемических повреждений этой области мозга, при травмах, нейродегенеративныхзаболеваниях, нормальном старении. До настоящего времени? остаются неясными вопросы, связанные с нейрохимическими и молекулярно-клеточными механизмами таких нарушений, а также возможности компенсации и восстановления поврежденных функций, что является актуальной задачей:, решение которой может дать новые подходы для: профилактики и лечения нейрологических заболеваний^ а также для улучшения качества жизни и успешного старения.

Цель и задачи исследования.

Цель работы - изучение функций гиппокампа в механизмах обучения и памяти, условий нарушения и восстановления этих функций после повреждения дорсальной области гиппокампа нейротоксином.

Конкретные задачи работы:

1. Найти дозу КК, при введении которой в дорсальный гиппокамп происходит лишь локальное нарушение ткани, не приводящее к эпилептогенезу, но вызывающую долговременные изменения в поведении животных.

2. Выявить паттерн нарушений процессов памяти и обучения после повреждения дорсальной области гиппокампа нейротоксином, описать динамику восстановления гиппокампальных функций.

3. Охарактеризовать функциональное состояние митохондрий неокортекса и гиппокампа после повреждения дорсальной области гиппокампа каиновой кислотой.

4. При таком же воздействии на гиппокамп оценить изменения транскрипции некоторых генов, связанных с митохондриальными функциями.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Лебедев, Денис Сергеевич

5. ВЫВОДЫ.

1. Локальное повреждение гиппокампа каиновой кислотой в дозе

0,2 мкг избирательно нарушает процессы формирования и воспроизведения декларативной формы (зависимой от селективного внимания) долговременной памяти у крыс.

2. Повреждение дорсальной области гиппокампа каиновой кислотой в субконвульсивной дозе (0,2 мкг) приводит к активации функций митохондрий в гиппокампе, а также в префронтальной коре.

3. Локальное повреждение гиппокампа каиновой кислотой вызывает длительные изменения экспрессии генов, направленные на нейропротекцию и пластические перестройки, как в гиппокампе, так и префронтальной коре.

4. Восстановление функций гиппокампа после его повреждения происходит благодаря нескольким механизмам, среди которых: активация митохондриального дыхания; изменение транскрипции генов, участвующих в нейропротекции и перестройке нейрональных сетей; вовлечение префронтальной коры в процессы компенсации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лебедев, Денис Сергеевич, Пущино

1. Архипов В.И. Воспроизведение следов долговременной памяти, зависимой от внимания. Журн. Высш. Нервн. Деят., 1998, 48 (5): 836-845.

2. Архипов В.И., Сочивко Д.Г., Годухин О.В. Механизмы нарушения памяти в экспериментальных моделях эпилептогенеза. Успехи соврем, биол., 2001; 121(2): 211-222.

3. Архипов! В.И., Шевченко Н.А. Экспериментальное угашение навыка, как тест когнитивных нарушений, вызванных каиновой кислотой. Бюл. Эксп. Биол. Мед. 2002. том 133, №6, с. 640-642.

4. Архипов В.И., Шевченко Н.А. Изучение воспроизведения долговременной памяти при действии каиновой кислоты. Российский- физиологический журнал им. И.М, Сеченова, 2004, т. 90, №7, с. 849-856.

5. Виноградова О.С. Гиппокамп и память. Москва, Наука 1975.

6. Владимиров Ю.А. Нарушение барьерных свойств внутренней и наружной мембран митохондрий, некроз и апоптоз, Биологические мембраны, 2002, т. 19, №5, с. 356-377.

7. Ещенко Н.Д. Энергетический обмен головного-мозга В книге Нейрохимия г. Москва, Издательство института биомедицинской химии, 1996; стр. 145-190.

8. Зейгарник Б.В. Патопсихология, 1986. М.: Московский унив.

9. Кудряшова И.В., Ноздрачева Л.В. Длительные изменения энергетического метаболизма клеток гиппокампа в результате обучения. Нейрохимия, 1999, т. 16, №3,204-210.

10. Кондрашова М.Н. Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом, Москва, Наука, 1973, стр. 106-121.

11. Кондрашова М.Н., Сирота Т.В., Темнов А.В., Белоусова Ж.В., Петруняка В.В. Обратимая организация митохондрий в ассоциаты как фактор регуляции дыхания митохондрий. Биохимия. 1997. Т. 62. № 2. С. 154-163.

12. Мошарова И.В., Сапецкий А.О., Косицин Н.С. Общие физиологические механизмы воздействия глутамата на центральную нервную систему. Успехи физиол. наук 2004. Том 35, №1, с. 20-42.

13. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

14. Отмахов Н.А. Нейрональная сеть гиппокампа: морфологический анализ. Успехи физиол. наук, 1993, т.23, 79-101.

15. Погодаев К.И. Эпилептология и патохимия мозга. Москва, Медицина, 1986.

16. Семенова Т.П. Универсальная камера для обучения крыс. Информ.лист, Пущино, ОНТИНЦБИ, 1978.

17. Соколов Е.Н., Незлина Н.И., Полянский В.Б., Евтихин Д.В., Ориентировочный рефлекс: «реакция прицеливания» и «прожектор-внимания». Журн. Высш. Нервн. Деят., 2001, №4, 421-437

18. Сытинский И.А., Туровский B.C. Каиновая (Кислота средство, исследования головного мозга. Успехи соврем, биол., 1982; 93 (2): 253-269.

19. Хамильтон Л.У. Основы анатомии лимбичечкой системы. М.: Изд. Моск. Унив. 1984

20. Хансон К.П. Апоптоз: современное состояние проблемы. Известия ан. Серия биологическая 1998; №2б<с. 134-141.

21. Akaike К., Tanaka S., Tojo Н., Fukumoto S., Imamura S., Takigawa M. Kainic acid-induced dorsal and ventral hippocampal seizures in rats. Brain. Res., 2001, v. 900, 65-71.

22. Ames III A. CNS energy metabolism as related to function. Brain Res. Rev., 2000, V. 34, 42-68:

23. Andersen P., Bliss, T.V.P & Skrede, K.K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Exp. Brain. Res., 1971, 13, 222-238.

24. Andersen P., Soleng A. F., Raastad M. The hippocampal lamella hypothesis revisited; Brain research, 2000, v.886, 165-171.

25. Arkhipov V.I. Delayed impairment of response extinction after single seizures induced by picrotoxin. Behav. Brain Res. 2002. 128(1): 109-111

26. Arthur C.P., Stowell M.H. Structure of synaptophysin: a hexameric MARVEL-domain channel protein. Structure, 2007, V.15(6), P. 707-714.

27. Bast Т., Wilson A.I., Witter P.M., Morris R.G.M. From rapid place learning to behavioral performance: a key role for the intermediate hippocampus. PLoS Biol 7(4): el000089. doi: 10.1371/journal.pbio.l000089.

28. Bardgett M.E., Jacobs P.S., Jackson J.L., Csernansky J.G. Kainic acid lesions enhance locomotor responses to novelty, saline, amphetamine, and MK-801. Behav. Brain Res., 1997, V. 84, 47-53.

29. Bennett M.R., Hacker P.M.S. Perception and memory in neuroscience: a conceptual analysis. Progress in Neurobiology, 2001, v.65, 499-543.

30. Benkovic S.A., O'Callaghan J.P., Miller D.B. Sensitive indicators of injury reveal hippocampal damage in C57BL/6J mice treated with kainic acid in the absence of tonic-clonic seiures. Brain Res., 2004, v. 1024, Issues 1-2, 59-76.

31. Ben-Ari Y. Limbic seizure and brain damage produced by kainic acid: mechanisms and relevance to human temporal lobe epilepsy. Neuroscience, 1985; 14(2): 375-402.

32. Ben-Ari Y., Cossart R. Kainat, a double agent that generates seizures: two decades of progress. TINS, 2000, V. 23, No 11, 580-587.

33. Bindokas V.P., Lee C.C., Colmers W.F., Miller R.J. Changes in mitochondrial function resulting from synaptic activity in the rat hippocampal slice. J Neurosci. 1998 Jun 15; 18(12): 4570-87.

34. Bird C.M., Burgess N., The hippocampus and memory: insights from spatial processing. Nature reviews neuroscience, 2008, v.9, No 3, 182-194.

35. Bolanos A.R., Sarkisian M., Yang Y., Hori A., Helmers S.L., Mikati M., Tandon P., Stafstrom C.E., Holmes G.L. Comparison of valproate and phenobarbital treatment after status epilepticus in rats. Neurology, 1998, Vol 51, Issue 1, 41-48.

36. Brown-Croyts L.M., Caton P.W., Radecki D.T., McPherson S.L. Phenobarbital pre-treatment prevents kainic acid-induced impairments in acquisition learning. Life Sc.i, 2000; 67(6): 643-650.

37. Bradley J., Finkbeiner S. An evaluation of specificity in activity-dependent gene expression in neurons. Progress in Neurobiology, 2002, 67, 469-477

38. Buhot M.-Ch., Naili S. Changes in exploratory activity following stimulation of hippocampal 5-HT1A and 5-HT1B receptors in the rat. Hippocampus, 1995, V. 5, NO 3, PG 198-208

39. Buzsaki G. Theta rhythm of Navigation: Link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory, hippocampus 15: 827-840, 2005

40. Burgess N., Maguire E.A., O'Keefe J. The human hippocampus and spatial and episodic memory. Neuron, 2002, V.35, 625-641

41. Caspi A., Moffitt Т.Е. Gene-environment interactions in psychiatry: joining forces with neuroscience. Nature Rev Neurosci., 2006, V. 7, No 7, 583-590.

42. Cerqueira J.J., Mailliet F., Almeida O.F., Jay T.M., Sousa N. The prefrontal cortex as a key target of the maladaptive response to stress. J Neurosci., 2007, 27(11), 2781-7278,

43. Chomczynski P., Sacchi N. Single-stepo metthod of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem., 1987, V. 162, p.156-159.

44. Clavel S., Paradis E., Ricquier D., Richard D. Kainic acid upregulates uncoupling protein-2 mRNA expression in the mouse brain. Neuroreport. 2003 Nov 14; 14(16):2015-7.

45. Cohen N., Squire L. Preserved learning and retention of pattern analysing skill in amnesia dissatiation of knowing how and knowing that. Science, 1980; 210: 207209.

46. Conejo N.M., Gonzalez-Pardo H., Vallejo- G., Arias J.L. Changes in brain oxidative metabolism induced by water maze training. Neuroscience. 2007, 145(2), 403-412.

47. Derksen M.J., Ward N.L., Hartle K.D., Ivanco T.L. MAP2 and synaptophysin protein expression following motor learning suggests dynamic regulation and distinct alterations coinciding with synaptogenesis. Neurobiol. Learn. Mem., 2007, 87(3), P. 404-415.

48. Dietrich M.O., Andrews Z.B., Horvath T.L. Exercise-induced synaptogenesis in the hippocampus is dependent on UCP2-regulated mitochondrial adaptation. J. Neurosci., 2008, 28(42), P. 10766-10771.

49. Duchen M.R. Contributions of mitochondria to animal physiology: from homeostatic sensor to calcium signaling and cell death. J. Physiology, 1999, V. 516, No 1, 1-17.

50. Eckner R. p300 and СВР as transcriptional regulators and targets of oncogenic events. Biol Chem. 1996 Nov; 377(11): 685-8.

51. Elliott Robert C., Lowenstein Daniel H. Gene Expression Profiling of Seizure Disorders*. Neurochemical Research, Vol. 29, No. 6, June 2004, pp. 1083-1092

52. Eichenbaum H., Dudchenko P., Wood E., Shapiro M., Tanila H. The hippocampus, memory, and place cells: is it spatial memory or a memory space? Neuron, 1999; 23: 209-226.

53. Eichenbaum HI A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience, 2000, V.l. 41-50г

54. Erecihska M., Cherian S., Silver Г.А. Energy metabolism in mammalian brain during development. Progress in neurobiology, 2004; 73, 397-445.

55. Ergorul C., Eichenbaum H. The hippocampus and memory for "what;" "where," and "when". Learn Mem. 2004 Jul-Aug; 11(4):397-405. Epub 2004 Jul 14.

56. Farooqui A.A., Ong W.Y., Lu X-R., Halliwell B';, Horrocks L.A. Neurochemical consequences of kainat-indused toxicity in brain: involvement of arachidonic acid and prevention of toxicity by phospholipase A2 inhibitors. Brain Res. Rev., 2001; 38: 61-78

57. Fernandez G.,.Effem A., Grunwald Т., Pezer N., Lehnertz K., Dumpelmann Mi, Van Roost' D:v Elger C.E. Real-time tracking of memory formation in the human rhinal cortex and'hippocampus. ,Science, .1999; 285: 1582- 1585.

58. Fleury/C., Neverova M;,.Gollins S., Rai'mbault S;, Ghampigny Or, Levi-Meyrueis G., Bouillaud F., DeldimME., Surwit R.S;, Ricquier Di, WardemG.H:.Uncoupling^ protein-2: a novel gene linked to obesity and hyperinsulinemia. Nat Genet, 1997,. 15: 269-272.

59. Fletcher P C., Dolan R.J;, Frith C.D. The functional anatomy of memory. Experientia, 1995; 51(12): 1197-207.

60. Forman; H;J:, Torres M; Redox signaling in macrophages.// Mol. Aspects Med. 2001, V. 22. pp. 189-216

61. Frank B.Mi, Brown E.N., Wilson M. Trajectoiy encoding in the hippocampus and entorhinal cortex., Neuron, 2000, v. 27, 169-178

62. Filipkowski R.K., Hetman M., Kaminska, В., Kaczmarek L. DNA fragmentation in rat brain after intraperitoneal administration of kainate. Neuroreport., 1994 Jul 21;5(12):1538-40.

63. Jarrard L.E. Use of excitotoxins to lesion the hippocampus: update. Hippocampus. 2002; 12(3): 405-14

64. Jesse C.R., Savegnago L., Rocha J.B., Nogueira C.W. Neuroprotective effect-caused by MPEP, an antagonist of metabotropic glutamate receptor mGluR5, on seizures induced by pilocarpine in 21-day-old rats. Brain;: Res. 2008 Mar 10; 1198:197-203.

65. Jezek P., Zackova M., Ruzicka M., Skobisova E., Jaburek M. Mitochondrial uncoupling proteins—facts and fantasies. Physiol Res. 2004; 53 Suppl 1:S 199-211.

66. Hauser M.D. Perseveration, inhibition and the prefrontal cortex: a new look. Curr Opin Neurobiol. 1999 Apr; 9(2): 214-22.

67. Harris L.K., Black R.T., Golden K.M., Reeves T.M., Povlishock J.T., Phillips L.L. Traumatic brain injury-induced changes in gene expression and functional activity of mitochondrial cytochrome С oxidase. J Neurotrauma, 2001, 18(10), 993-1009.

68. Head E., Corrada M.M., Kahle-Wrobleski K., Kim R.C., Sarsoza F., Goodus M., Kawas C.H. Synaptic proteins, neuropathology and cognitive status in the oldest-old. Neurobiol Aging. 2007 Nov 12

69. Hunsberger J:G., Bennett Alica H., Selvanayagam E., Duman R.S., Newton S.S. Gene profiling the' response to kainic acid induced seizures, Molecular Brain Research, 2005, 141: 95 112

70. Gayoso M.J., Primo C., al-Majdalawi A., Fernandez J.M., Garrosa-M., Iniguez C. Brain lesions and water-maze learning deficits after systemic administration of kainic acid4o adult rats. Brain Res., 1994; 653(1-2): 92-100.

71. GerlaiiR. Behavioral tests of hippocampal function: simple paradigms complex problems. Behav. Brain Res., 2001, V. 125, 269-277.

72. Gilbert P.E., Kesner R.P. Memory for objects and their locations: the role of the hippocampus in retention of object-place- associations. Neurobiol Learn Mem. 2004 Jan; 81(1): 39-45.

73. Graindorge N., Jozet-Alves C., Chichery R., Dickel L., Bellanger C. Does kainic acid induce partial brain lesion in an invertebrate model: Sepia officinalis? Comparison^with electrolytic lesion. Brain Res., 2008, V. 1238, 44-52

74. Guldin; W.O., Markowitsch H.J. Epidural kainite, but not ibotenate, produces lesions in local and distant regions of the brain. A comparison of the intracerebral actions of kainic acid'and ibotenic acid. J.Neurosc. Methods., 1982, V.5, 83-93

75. Kaczmarek L., Siedlecki, J.A., Danysz, W. Proto-oncogene c-fos induction in rat hippocampus. 1988. Brain Res. 427, 183-186.

76. Kaminska В., Filipkowski R.K., Biedermann I.W., Konopka D., Nowicka D., Hetman M., Dabrowski M., Gorecki D.C., Lukasiuk K., Szklarczyk A. Kainat-evoked modulation of gene expression in rat brain. Acta Biochimica Polonica, 1997; 44(4): 781-790.

77. Kaori Takehara-Nishiuchi, Bruce L. McNaughton, Spontaneous Changes of Neocortical Code for Associative Memory During Consolidation. Science, 2008 Nov 7;322 (5903): 960-3.

78. Klingenberg M. Uncoupling protein a usefull energy dissipater. J. Bioenerg. Biomembr. 1999. V.31, N.5. P. 419-430.

79. Kryukov V.I. The role of the hippocampus in long-term memory: is it memory store or comparator? Journal of Integrative Neuroscience, 2008, Vol. 7, No. 1, 117184.

80. Kondrashova M.N., Fedotcheva N.I., Saakyan I.R., Sirota T.V., Lyamzaev K.G., Kulikova M.V., Temnov A.V. Preservation of native properties of mitochondria in rat lliver homogenate, Mitochondrion, 2001; 1,249-267.

81. Kubik S., Miyashita Т., Guzowski J.F. Using immediate-early genes to map hippocampal subregional functions. Learn Mem. 2007. Nov 14; 14(11):758-70.

82. Kudin A.P., Malinska D., Kunz W.S. Sites of generation of reactive oxygen species in homogenates of brain tissue determined with the use of respiratory substrates and inhibitors. Biochim Biophys Acta., 2008, 1777(7-8), 689-695.

83. Kunz W.S., Goussakov I.V., Beck Y., Elger C. Altered mitochondrial oxidative phosphorilation in hippocampal slices of kainite-treated rats. Brain research, 1999; May 1 :836 (2) : 236-242.

84. Kunz W.S. The role of mitochondria in epileptogenesis, 2002 Apr; 15(2): 179-84

85. Kunz W.S. Different metabolic properties of mitochondrial oxidative phosphorylation in different cell types — important implications for mitochondrial cytopathies, Exp Physiology, 2003, 88, 149-154.

86. Z., Okamoto K.-I., Hayashi Y., Sheng M.The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell, 2004, V. 119, 873-887.

87. Maesawa S., Kondziolka D., Dixon C.E., Balzer J., Fellows W., Lunsford L.D. Subnecrotic stereotactic radiosurgery controlling epilepsy produced by kainic acid injection in rats. J Neurosurg. 2000 Dec;93(6): 1033-40.

88. Maren S., Aharonov G., Fanselow M.S. Neurotoxic leions of the dorsal hippocampus and Pavlovian fear conditioning in rats. Behav. Brain Res., 1997, v. 88, P. 261-274

89. Medina J.Hi, Bekinschtein P., Cammarota M., Izquierdo I. Do memories consolidate to persist or do they persist to consolidate? Behav Brain Res. 2008 Sep l;192(l):61-9.

90. Mikati M.A., Tarif S., Lteif L., Jawad M.A. Time sequence and types of memory deficits after experimental'status epilepticus. Epilepsy Res., 2001, V.42, 97-101.

91. Mikulecka A., Krsek P., Mares P. Nonconvulsive kainic acid-induced seizures elicit age-dependent impairment of memory for the elevated plus-maze. Epilepsy Behav, 2000; 1(6): 418-426.

92. Milner В., Squire L.R., Kandel E.R. Cognitive neuroscience and the study of memory. Neuron. 1998. 20: 445-468

93. Morgane P.J., Galler J.R., Mokler D J. A review of systems and networks of the limbic forebrain/limbic midbrain. Prog Neurobiol. 2005 Feb;75(2): 143-60.

94. Mogensen J., Moustgaard A., Khan U., Wortwein G., Nielsen K.S. Egocentric spatial orientation in a water maze by rats subjected to transection of the fimbria-fornix and/or ablation of the prefrontal cortex. Brain Res. Bull., 2005, 65(1), 41-58.

95. Morris R.G., Garrud P., Rawlins J.N., O'Keefe J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature, 1982, 297:681-683.

96. Moser E., Moser M.B., Andersen P. Spatial learning impairment parallels the magnitude of dorsal hippocampal lesions, but is hardly present following ventral lesions. J Neurosci., 1993, 13(9), 3916-3925.

97. Moser M.B., Moser E.I., Forrest E., Andersen P., Morris R.G. Spatial learning with a minislab in the dorsal hippocampus. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 1995, 92(21), 9697-9701

98. Nadel L., Moscovitch M. The hippocampal complex and long-term memory revisited. TICS, 2001, v. 5, No 6, 228-230.

99. Nadel L., Bohbot. Consolidation of memory. Hippocampus. 2001; 11 (1): 56-60.

100. Negre-Salvayre A., Plirtz C., Carrera G., Cacenave R., Troly M., Salvayre R., Penicaud L., Casteilla L. A role for uncoupling protein-2 as a regulator of mitochondrial hydrogen peroxide generation// FASEB J. 1997. V.l 1. P.809-815.

101. Nadler J.V., Perry B.W., Cotman C.W. Intraventricular kainic acid preferentially destroys hppocampal pyramidal calls. Nature, 1978, v.271, N.5646, 676-677).

102. Nadler J.V., Perry В., Gentry C., Cotman C.W. Degeneration of hippocampal CA3 pyramidal cells induced by intraventricular kainic acid. J. Сотр. Neurol. 1980. 192, 333-359.

103. Nair A., Vaidya V.A. Cyclic AMP response element binding protein and brain-derived neurotrophic factor: molecules that modulate our mood? J Biosci. 2006 Sep;31(3):423-34.

104. Nakase Т., Yoshida Y., Nagata K. Amplified expression of uncoupling proteins in human brain ischemic lesions. Neuropathology. 2007 Oct;27(5):442-7.

105. Nedergaard J., Cannon B. The 'novel' 'uncoupling' proteins UCP2 and UCP3: what do they really do? Pros and cons for suggested functions. Exp Physiol. 2003 Jan; 88(1): 65-84.

106. Nair A., Vaidya V.A. Cyclic AMP response element binding protein and brain-derived neurotrophic factor: molecules that modulate our mood? J Biosci. 2006, Sep; 31(3): 423-34.

107. O'Keefe J., Dostrovsky J. Hippocampus and the spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rats. Brain Res., 1971; 5(6): 228-230.

108. O'Keefe J., Nadel L. "The Hippocampus as a Cognitive Map". Oxford University Press, 1978.

109. Olney J.W., Rhee V., Ho O.L. Kainic acid: a powerful neurotoxic analogue of glutamate. Brain Res., 1974; 77(3): 507.

110. Olney J.W. Excitatory transmitter neurotoxicity. Neurobiol Aging. 1994 Mar-Apr; 15(2): 259-60.

111. Paxinos G., Watson C., The rat brain in stereotaxic coordinates. Academic Press: Sydney, 1998.

112. Pin J.P., Duvoisin R. The metabotropic glutamate receptors: structure and functions. Neuropharmacology. 1995, Jan; 34(1): 1-26.

113. Racine R.J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol., 1972, 32(3): 281-94.

114. Ryan J.C., Morey J.S., Ramsdell J.S., Van Dolah F.M. Acute phase gene expression in mice exposed to the marine neurotoxin domoic acid. Neuroscience. 2005; 136(4): 1121-32.

115. Sakata J.T., Crews D., Gonzalez-Lima F. Behavioral correlates of differences in neural metabolic capacity. Brain Res. Rev., 2005, v.48, p. 1-15.

116. Sarkisian M.R., Tandon P., Liu Z., Yang Y., Hori A., Holmes G.L., and Stafstrom C.E. Multiple kainic acid seizures in the immature and adult brain: ictal manifestations and long-term effects on learning and memory. Epilepsia, 1997; 38 (11): 1157-66.

117. Schauwecker P.E., Differences in ionotropic glutamate receptor subunit expression are not responsible for strain-dependent susceptibility to excitotoxin-induced injury. Brain Res Mol Brain Res. 2003 Apr 10; 112(l-2):70-81.

118. Schwob J.E., Fuller Т., Price J.L., Olney J.W. Widespread patterns of neuronal damage following systemic or intracerebral injections of kainic acid: a histological study. Neuroscience. 1980; 5(6): 991-1014.

119. Schuchmann S., Buchheim K., Meierkord H., Heinemann U. A relative energy failure is associated with low-Mg2+ but not with 4-aminopyridine induced seizurelike events in entorhinal cortex. J Neurophysiol., 1999, Jan;81(l):399-403.

120. Sperk G., Lassmann H., Baran H., Kish S.J., Seitelberger F., Hornykiewicz O. Kainic acid induced seizures: neurochemical and histopathological changes. Neuroscience. 1983, Dec; 10(4): 1301-15.

121. Sperk G. Kainic acid seizures in the rat. Prog Neurobiol. 1994, Jan; 42(1): 1-32.

122. Squire L.R. Memory and hippocampus: a synthesis from finding with rats, monkeys, and humans. Psychol. Rev. 1992; 99: 195-231

123. Stubley-Weatherly L., Harding J.W., Wrightht J.W. Effects of discerete kainic acid-induced hippocampal lesions on spatial and contextual learning and memory in rats. Brain. Res., 1996, V. 716, №1-2, 29-38

124. Takahama S., Ichitani Y. Deficits of Morris water maze learning in rats with striatal kainic acid lesions. Shinrigaku Kenkyu. 2000 Feb;70(6):469-76

125. Tang Y., Zucker R.S. Mitochondrial involvement in post-tetanic potentiation-of synaptic transmission. Neuron. 1997, Mar; 18(3): 483-91.

126. Thierry A.M., Gioanni Y., Degenetais E., Glowinski J. Hippocampo-Prefrontal cortex pathway: anatomical and electrophysiological characteristics. Hippocampus, 2000, 10:411-419.

127. Tierney P.L., Degenetais E., Thierry A.M., Glowinski J., Gioanni Y. Influence of the hippocampus on interneurons of the rat prefrontal cortex. Eur. J. Neurosci., 2004, 20 (2): 514-524.

128. Tulving E. Episodic memory: from mind to brain. Annu Rev Psychol. 2002;53:1-25.van Strien, Cappaert N.L., Witter M.P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nat Rev Neurosci. 2009 Apr; 10 (4): 272-82.

129. Valtorta F., Pennuto M., Bonanomi D., Benfenati F. Synaptophysin: leading actor or walk-on role in synaptic vesicle exocytosis? Bioessays. 2004 Apr; 26(4): 44553.

130. Vorobyov N.A., Brown M.W. The topography of activity transmission between lateral entorhinal cortex and subfield CA1 of the hippocampus. Eur J Neurosci. 2008 Jun; 27(12): 3257-72.

131. Vinogradova O.S. Hippocampus as comporator: role of the two input and two output systems of the hippocampus in selection and registration of information. Hippocampus, 2001; 45: 523-583.

132. Wang G.W., Cai J.X. Disconnection of the hippocampal-prefrontal cortical circuits impairs spatial working memory performance in rats. Behav. Brain Res. 2006. 175(2): 329-336.

133. Wang Q., Yu S., Simonyi A., Sun G.Y., Sun A.Y. Kainic acid-mediatedb excitotoxicity as a model for neurodegeneration. Mol Neurobiol. 2005;31(l-3):3-16.

134. Wiedenmann В., Franke W.W. Identification and localization of synaptophysin, an integral membrane glycoprotein of Mr 38,000 characteristic of presynaptic vesicles. Cell'. 1985, Jul;41(3):1017-28.

135. Wright J.W., Murphy E.S., Elijah I.E., Holtfreter K.L., Davis C.J., Olson M.L., Muhunthan K., Harding J.W. Influence of hippocampectomy on habituation, exploratory behavior, and spatial memory in rats. Brain Res. 2004: Oct 8; 1023 (1): 1-14.

136. Williams J.M., Thompson V.L., Mason-Parker S.E., Abraham W.C., Tate W.P. Synaptic activity-dependent modulation of mitochondrial gene expression in the rat hippocampus. Brain Res Mol Brain Res. 1998: Sep. 18; 60(1): 50-6.

137. Wingender E. Classification of eukaryotic transcription factors, Mol Biol (Mosk). 1997: Jul-Aug; 31(4): 584-600.

138. Wong R.K.S., Bianchi R., Chuang S-C., Merlin L.R. Group I mGluR-induced Epileptogenesis: Distinct and Overlapping Roles of mGluRl and mGluR5 and Implications for Antiepileptic Drug Design. Epilepsy Currents, 2005, V. 5, No 2, 63-68

139. Wood E.R., Dudchenko P.A., Eichenbaum H. The global record of memory in hippocampal neuronal activity. Nature, 1999; 397 (6720): 613-616.

140. Wood E.R., Dudchenko P.A., Robitsek R.J., Eichenbaum H. Hippocampal neurons encode information about different types of memory episodes occurring in the same location. Neuron. 2000 Sep; 27(3): 623-33.

141. Wood E.R., Dudchenko P. A., Eichenbaum H. Cellular correlates of behavior. Int. Rev. Neurobiol., 2001, v.45, 293-311.

142. Yamaguchi S., Nakanishi S. Regional Expression and Regulation of Alternative Forms of mRNAs Derived from Two Distinct Transcription Initiation Sites of the Rat mGluR5 Gene. J. Neurochemistry, 1998, V. 71, 60-68

143. Yokoyama O., Kumashiro M., Iriki A., Ishibashi H. Tactile stimulation-induced rapid elevation of the synaptophysin mRNA expression level in rat somatosensory cortex. Mol Cell Biochem. 2006, Dec; 293 (1-2): 47-52.

144. Yin H., Bardgett M.E., Csernansky J.G. Kainic acid lesions disrupt fear-mediated memory processing. Neurobiol. Learn. Mem., 2002; 77(3): 389-401.

145. Zagulska-Szymczak S., Filipkowski R.K., Kaczmarek L. Kainate-induced genes in the hippocampus: lessons from expression patterns. Neurochemistry International 2001, 38: 485-501