Модуляция судорожной активности эндогенными каннабиноидами в модели височной эпилепсии

Шубина, Любовь Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Модуляция судорожной активности эндогенными каннабиноидами в модели височной эпилепсии
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Модуляция судорожной активности эндогенными каннабиноидами в модели височной эпилепсии"

На правах рукописи

Шубина Любовь Владимировна

МОДУЛЯЦИЯ СУДОРОЖНОЙ АКТИВНОСТИ ЭНДОГЕННЫМИ КАННАБИНОИДАМИ В МОДЕЛИ ВИСОЧНОЙ ЭПИЛЕПСИИ

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 МАР 2015

Пущино-2015

005560639

Работа выполнена в Лаборатории системной организации нейронов им. О.С. Виноградовой Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

Защита состоится «27» апреля 2015 г. в 13 час. 30 мин. на заседании Совета Д002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, и на сайте ИТЭБ РАН: http://web.iteb.psn.ru

Автореферат диссертации разослан «У » 2015 г.

Научные руководители: доктор биологических наук

Кичигина Валентина Федоровна

доктор физико-математических наук Алиев Рубин Ренатович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Хаспеков Леонид Георгиевич

(зав. лаб. Экспериментальной нейроцитологии ФГБНУ НЦН, г. Москва)

кандидат биологических наук

Бобкова Наталья Викторовна

(зав. лаб. Клеточных механизмов патологии

памяти ИБК РАН, г. Пущино)

учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук, г. Москва

Ученый секретарь диссертационного совета, к.ф.-м.н.

Н.Ф. Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Височная эпилепсия (ВЭ) представляет собой хроническое неврологическое заболевание с локализацией эпилептического очага в височной доле головного мозга. Этому заболеванию подвержено около 1% населения земного шара, при этом наблюдается ежегодное возрастание числа больных (Hesdorffer et al., 2013). До 80% пациентов с хронической эпилепсией страдают от когнитивных нарушений и, по некоторым исследованиям, около половины из них - нарушениями поведения (Helmstaedter et al., 2011). Одним из тяжелейших проявлений эпилепсии считается эпилептический статус (ЭС) - продолжительная самоподдерживающаяся судорожная активность, приводящая к серьезным повреждениям мозга и периферическим нарушениям, вплоть до летального исхода (Hauser, 1990; DeLorenzo et al., 1995). Более того, единичный эпизод ЭС может стать причиной эпилептогенеза и привести к развитию эпилептического очага (Lothman et al., 1993; Hesdorffer et al. 1998). ЭС является адекватной экспериментальной моделью исследования механизмов функционирования мозга не только при патологии, но и в норме, так как в первые часы после индукции ЭС в мозге ещё не наблюдается патологических изменений. В то же время, эта модель дает возможность изучения мозга в состоянии его гипервозбуждения и гиперсинхронизации, вызванных подавлением тормозных процессов.

Исследование механизмов ВЭ пока не привело к созданию средств, надежно защищающих от судорожных приступов. Около 40% пациентов обнаруживают резистентность к существующим методам фармакотерапии (Mayer et al., 2002; Treiman et al., 1998). Традиционно используемые препараты оказывают лишь симптоматическое, противосудорожное лечение. Новые препараты в некоторых случаях позволяют надежнее контролировать судороги, однако у многих из них обнаружены значительные побочные эффекты, включая психиатрические нарушения и депрессии (Szilagyi et al., 2014). Хирургическое удаление судорожного очага, само по себе являясь чрезвычайно травматичной процедурой, показано лишь ограниченному числу больных и в трети случаев не избавляет от судорог (Harroud et al., 2012). Таким образом, поиск новых более эффективных подходов к терапии данной патологии является чрезвычайно актуальной медико-биологической проблемой.

Одним из возможных путей управления судорожной активностью может стать воздействие на эндоканнабиноидную систему (ЭКС) мозга, представляющую собой часть комплексной системы естественных саморегуляторных процессов в

центральной нервной системе (Freund et al., 2003). Эндогенные каннабиноиды (ЭК) синтезируются и высвобождаются «по мере надобности» из постсинаптических окончаний в ответ на длительное возбуждение и ретроградно воздействуют на пресинаптические Gi/o-связанные каннабиноидные рецепторы первого типа (СВ1-рецепторы), которые, в свою очередь, ингибируют высвобождение нейромедиаторов, модулируя возбуждающую и тормозную нейрональную активность (см. Chevaleyre et al., 2006). Основной функцией ЭК в мозге является осуществление ретроградной синаптической коммуникации и нейромодуляции (Alger, 2002; Wilson, Nicoll, 2002). Однако физиологическая роль ЭКС в норме и патологии, а также ее терапевтический потенциал исследованы недостаточно. Изучение влияния модуляции активности ЭКС при нарушении баланса возбуждающих и тормозных процессов в нейрональных сетях эпилептического мозга может внести существенный вклад в представления о физиологической роли данной гомеостатической системы ЦНС.

Было показано, что как натуральные, так и синтетические каннабиноиды обладают антиконвульсантными свойствами на моделях эпилепсии (Wallace et al., 2001, 2003; Bahremand et al., 2008; Mason, Cheer, 2009; Kozan et al., 2009; Rizzo et al., 2009; Citraro et al., 2013). Однако применение непосредственно агонистов каннабиноидных рецепторов в качестве лекарственных средств ограничивается их психотропными свойствами, кроме того при данном подходе нарушается принцип действия ЭКС «по мере надобности». Поэтому одним из перспективных подходов может стать применение веществ, активирующих ЭКС опосредованно за счет продления действия ЭК в результате ингибирования их обратного захвата или энзиматического гидролиза. Однако, в отличие от действия натуральных и синтетических каннабиноидов, влияние ингибиторов обратного захвата или гидролиза ЭК на поведение и осцилляторную активность как в здоровом мозге, так и при различных нейропатологиях, в настоящее время практически не изучено.

Таким образом, исследование влияния модуляции активности ЭКС на поведение животных и электрическую активность различных структур мозга представляет значительный интерес для более полного выяснения функционирования данной системы в мозге, а также в качестве одного из перспективных подходов к управлению судорожной активностью.

Цели и задачи исследования

Цель работы заключалась в выяснении влияния эндоканнабиноидной системы (посредством ингибирования процессов инактивации эндоканнабиноидов и блокады СВ1 рецепторов) на эпилептический статус и последующий эпилептогенез.

Основные задачи исследования:

1. Оценка влияния эндоканнабиноидной системы на локальные полевые потенциалы в височных (гиппокамп, энторинальная кора) и базальных (медиальная септальная область, амигдала) отделах мозга.

2. Изучение влияния эндоканнабиноидной системы на острую судорожную активность (эпилептический статус).

3. Исследование влияния эндоканнабиноидной системы на изменения электрической активности в мозге при эпилептогенезе.

4. Анализ влияния эндоканнабиноидной системы на изменение морфологического состояния гиппокампа при эпилептогенезе.

Научная новизна

В настоящей работе впервые показано влияние модуляции активности ЭКС (посредством ингибирования процессов инактивации ЭК и блокады СВ1 рецепторов) на эпилептический статус и последующий эпилептогенез у морских свинок. Показана протекторная роль активации ЭКС в развитии этих патологических процессов. Детально изучены изменения осцилляторных процессов в четырёх структурах мозга: гиппокампе, медиальной септальной области .(МС), амигдале и энторинальной коре. Проанализировано влияние ЭКС на морфологические нарушения в гиппокампе при эпилептогенезе. Показана защитная роль активации ЭКС в выживании нейронов и сохранении нервных связей в этой ключевой для когнитивной деятельности мозга структуре.

Обнаружено отсутствие значимых длительных эффектов активации ЭКС на поведение и спонтанную суммарную электрическую активность в мозге.

Полученные результаты вносят определённый вклад в понимание механизмов работы мозга и развития височной эпилепсии.

Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты показали, что блокада инактивации ЭК снижает выраженность эпилептического статуса, препятствует последующему эпилептогенезу и морфологическим нарушениям в дорзальном гиппокампе. Таким образом, модуляция активности ЭКС посредством ингибирования транспорта ЭК, либо блокады фермента их деградации может стать альтернативным и более физиологически адекватным путем воздействия на судорожную активность. Результаты проведенного исследования могут способствовать использованию активации ЭКС в терапии эпилепсии и других нейродегенеративных заболеваний.

Исследование влияния блокаторов инактивации ЭК и антагонистов СВ1 рецепторов на осцилляторную активность различных структур мозга представляет интерес для выявления побочных эффектов каннабиноидных препаратов, в настоящее время уже использующихся в медицинской практике. Обнаруженное повышение мощности локальных полевых потенциалов (ЛПП) под действием антагониста СВ1 рецепторов АМ251 может указывать на то, что применение данного препарата следует проводить с осторожностью. С другой стороны, блокаторы инактивации ЭК существенно не изменяют ЛПП в MC, гиппокампе, энторинальной коре и амигдале, таким образом активация ЭКС может быть достигнута посредством ингибирования транспорта и деградации ЭК без нежелательных побочных эффектов, обычно наблюдаемых при прямой активации СВ1 рецепторов агонистами.

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены на конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009, 2014), всероссийской конференции с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология» (Пущино, 2009, 2012), Научной сессии НИЯУ МИФИ (Москва, 2010), конференции молодых ученых ИТЭБ РАН «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2010, 2011, 2012, 2014), 6-м международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2010), 8-м всемирном конгрессе IBRO по нейронаукам (Флоренция, Италия, 2011), 8-м форуме FENS по нейронаукам (Барселона, Испания, 2012), 45-м собрании EBBS (Мюнхен, Германия, 2013), а также на школах: «Современные методы флуоресцентной визуализации в биомедицинских и биотехнологических исследованиях» (Москва, 2010), «Building blocks of life: from biomaterials to living organisms» (Финляндия, 2012), «Data analysis in neurosciences» (Москва, совместно с Cold Spring Harbor, 2014). По материалам диссертации опубликовано 7 работ в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Работа изложена на 128 страницах, содержит 18 рисунков и 5 таблиц. Список литературы включает 417 источников отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В качестве объекта исследования использовались морские свинки (440-620 г, п=23). Все манипуляции проводились согласно нормам этического обращения с животными (Директива европейского Парламента 86/609/ЕЕ).

Нейрохирургическая операция. За неделю до начала экспериментов на животных под общим наркозом («Золетил», 18 мг/кг; ксилазин, 12 мг/кг) проводили стереотаксическую операцию по имплантации регистрирующих электродов и направляющей канюли для микроинъекций препаратов по заранее рассчитанным координатам (Rapisarda, Bacchelli, 1977). Электроды вживляли унилатерально (левое полушарие) в MC (АР=12.2, L=2, Н=7.5, угол 15°), поле CAI гиппокампа (Гип, АР=6.6, L=3, Н=5), энторинальную кору (Энт, АР=4.6, L=5.5, Н=10.5) и базальное ядро амигдалы (БА, АР=10.2, L=5, Н=12.2). Референтный электрод ввинчивали в затылочную кость над мозжечком. Направляющую канюлю для микроинъекций устанавливали над правым боковым желудочком (АР=8.6, L=2.5, Н=1.7).

Регистрацию локальных полевых потенциалов проводили одновременно из четырех структур мозга. В качестве предусилителя использовали микросхемы (LMC7101, National Semiconductor, США), далее сигналы усиливали (Grass Instruments, Model 12 Neurodata Acquisition System, США) и регистрировали в частотном диапазоне 0.1-300 Гц (с сетевым фильтром на 50 Гц). Запись оцифрованных (частота дискретизации 1 кГц) ЛПП проводили с помощью программы Datapac 2k2 (США).

Микроиньекции препаратов. Для модуляции активности ЭКС использовали ингибитор обратного захвата ЭК АМ404, селективный ингибитор фермента деградации анандамида URB597 и селективный антагонист СВ1 рецепторов АМ251. Данные вещества растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО). Все препараты вводились интрацеребровентрикулярно бодрствующим морским свинкам через направляющую канюлю с помощью микрошприца Гамильтона.

Моделирование височной эпилепсии. В качестве модели ВЭ был использован эпилептический статус, вызываемый каиновой кислотой (КК). Каиновую кислоту (0.4 мкг, О.бмг/мл физ. р-ра) вводили в правый боковой желудочек мозга, далее в течение 5-6 часов регистрировали ЛПП и поведение животных. Тяжесть поведенческих судорог оценивали по модифицированной шкале Райсина (Racine, 1972).

Гистологические исследования. По окончанию электрофизиологических экспериментов животным вводилась летальная доза наркоза (нембутал, 80 мг/кг). После интракардиальной перфузии (0,37% раствор Na2S, затем 4% параформальдегид) получали срезы мозга (15 мкм) для контроля морфологических повреждений в дорзальном гиппокампе (окраска по Нисслю) и выявления реорганизации аксонов гранулярных клеток зубчатоий фасции (окраска по Тимму). Окрашивание по Нисслю проводили в 0,1% растворе крезилового фиолетового. Для окрашивания по Тимму срезы инкубировали в 50% гуммиарабике (60 мл) с

добавлением цитратного буфера, гидрохинона (30 мл, 5,8%) и AgN03 (0,5 мл, 17%). После окрашивания проводили дегидратацию и обезжиривание препаратов в спиртах и ксилоле. Съемку проводили на микроскопе Leica DM6000B при увеличении 25Х, 100Х и 200Х (камера Leica DFC490, разрешение 2600 пикс/мм).

После окрашивания по Нисслю проводили количественный анализ числа клеток в полях CAI, САЗ и хилусе зубчатой фасции дорзального гиппокампа как левого, так и правого полушарий (ImageJ 1.43u, США).

Анализ ЛПП. Выраженность электрографических судорог во время ЭС оценивали, вычисляя частоту (количество за 1 час) и длительность судорожных эпизодов. Для оценки активности исследуемых структур мозга использовали спектральный анализ (специально разработанный алгоритм, Matlab 8.0, США). Мощность ЛПП на различных частотах (дельта 0.5-4Гц; тета 4-8Гц; альфа 8-12Гц; бета 12-40Гц; гамма 80-120Гц; высокочастотные осцилляции 120-300Гц) анализировали методом Уэлча (окно Ханна размером 4096 мс, 50%-ное перекрытие сегментов).

Статистический анализ. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. При анализе данных использовался непараметрический критерий Краскела-Уоллиса с апостериорным тестом Данна. При множественном сравнении с контрольной группой применяли попарное сравнение с использованием непараметрического [/-критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Для всех тестов использовали двусторонние альтернативные гипотезы. Различия считали статистически значимыми при р<0.05. Анализ производили в программе SPSS (США).

Схема эксперимента. 1) Регистрация спонтанной активности исследуемых структур; 2) регистрация ЛПП до и после введения АМ404 (40 мМ, 3 мкл), URB597 (2.4 мМ, 2 мкл), АМ251 (10 мМ, 2 мкл), либо соответствующего объема ДМСО; 3) инициация ЭС (введение каиновой кислоты, за 5 минут до и через 1,5 часа после которого вводились: АМ404 (40 мМ, 3 мкл), URB597 (2.4 мМ, 2 мкл), АМ251 (10 мМ, 2 мкл), либо эквивалентный объем ДМСО, в соответствующих группах животных; 4) в последующие 7 дней - ежедневные введения АМ404 (40 мМ, 2 мкл), URB597 (2.4 мМ, 1 мкл), либо ДМСО; 5) регистрация ЛПП еженедельно в течение 3-х месяцев после ЭС; 6) гистологическое исследование (рис. 1). В исследовании было 4 группы животных: «КК» (n=7), «АМ404» (n=6), «URB597» (п=5) и «АМ251» (п=5).

#4-

адаптация 5r v

1 T" i !

I I г I I I f I I I I I I | I I I l I i | i i i I I I | I I I I I I | I I I

рперац!Щ

Т 2 3

АМ404/ URB597/ АМ251/ ДМСО АМ404/ АМ251/ ДМСО

¡гистологические! Рис.1. Схема эксперимента. 1 исследования | фИГурНЫМИ скобками

обозначены ежедневные манипуляции, стрелками -разовые.

12 недели

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Спонтанная электрическая активность в медиальной септальной области, гиппокампе, энторинальной коре и амигдале

Локальные полевые потенциалы изучаемых структур мозга у животных в состоянии спокойного бодрствования включали осцилляции различной частоты, обычно не превышающие по амплитуде 0.4 мВ (0.25±0.08 мВ) (рис. 2А). В гиппокампе амплитуда активности была выше в более широком диапазоне частот (0.1-250Гц), по сравнению с другими изучаемыми структурами (0-150Гц для Энт, 0.1100Гц для МС и БА) (рис. 2Б, В). Дельта-активность была более характерна для МС и Энт, а мощность осцилляций в тета-, альфа, и бета-диапазонах была выше в гиппокампе. Высокочастотная активность также была в наибольшей степени

свойственна гиппокампу (рис. 2Б,В).

SO И) 100 12o 20 40 «О

Время, с Время, с

Рис. 2. Спонтанная активность исследуемых структур. А. Пример записи ЛПП в медиальной септальной области (МС), гиппокампе (Гип), энторинальной коре (Энт) и амигдале (БА). Б. Мощность ритмов исследуемых структур, нормированная к МС. В. Спектрограммы записи (А) в полосах частот 0.1-200 Гц (отсутствие активности в области 50 Гц вызвано использованием сетевого фильтра) (а) и 0-40 Гц (б).

2. Влияние АМ404,1ЖВ597 и АМ251 на активность исследуемых структур

Анализ влияний ингибитора обратного захвата ЭК АМ404, ингибитора фермента деградации ЭК 1ЛШ597 и антагониста СВ1 рецепторов АМ251 на электрическую активность исследуемых структур показал, что в первые 10 минут после введения веществ мощность ЛПП снижалась в широком диапазоне частот (0-40 Гц). Такое понижение мощности наблюдалось во всех экспериментальных группах, независимо от вводимого вещества (АМ404, 1ЛШ597, АМ251 либо ДМСО), было кратковременным (как правило, первые 10-20 минут) и не всегда достоверным (рис. 3). В поведении животных в первые 5-10 минут после интроцеребровентрикулярной инъекции отмечалось легкое беспокойство. После введения антагониста СВ1 рецепторов (группа «АМ251») через 20 минут наблюдалось некоторое повышение мощности ЛПП (рис. 3).

Рис. 3. Изменение мощности ЛПП в медиальной септальной области (МС), гиппокампе (Гип), энторинальной коре (Энт) и амигдале (БА) после введения ДМСО, АМ251, АМ404, либо 1ЖВ597 относительно фоновой активности (100%) (* достоверное отличие от фоновой активности, тест Манна-Уитни V с поправкой Бонферрони, р<0.05).

3. Влияние модуляции активности эндоканнабиноидной системы на эпилептический статус

Введение морским свинкам каиновой кислоты через 20-25 минут вызывало значительный конвульсивный эпилептический статус, длящийся, как правило, 4-5 часов. Характерными проявлениям ЭС являлись кружение с потерей позы и падением, а также эпизоды клонических и тонико-клонических судорог. Судорожные эпизоды регистрировались также и в электрической активности всех исследуемых структур мозга и представляли собой повторяющиеся комплексы синхронных высокоамплитудных высокочастотных спайков, длящиеся около двух минут (рис. 4Б). Иктальные разряды были наиболее выраженными в гиппокампе и энторинальной коре, тогда как в МС и амигдале характеризовались меньшей амплитудой и частотой. После судорожного эпизода обычно следовала депрессия, значительное снижение мощности ЛПП. Как правило, электрографические судороги редко совпадали во времени с сильными поведенческими нарушениями, наблюдалось лишь замирание, жевание, изолированные подергивания или двигательные автоматизмы (1-3 балла).

Совместное введение каината и АМ404, либо 1ЖВ597 препятствовало развитию поведенческого ЭС, у животных регистрировались только замирание, жевание, либо отдельные подергивания (1-2 балла). Более того, в группе «1ЖВ597» у 40% животных не регистрировались также и электрографические судороги (рис. 4В, 5А).

Ч-

Фон

.г,,.

I :

-t.....[■■■" ...................................

« '——-—--—

Каиновая кислота

БА IHlli l............... Iii И I ИНЧИ11ШИ «»HI'H»II»I»>>41«H»|I» |

10c, IMB 1С, 1MB

Рис. 4. Совместное введение URB597 с каиновой кислотой препятствует появлению электрографических судорог у 40% животных. ЛПП в медиальной септальной области (MC), гиппокампе (Гип), энторинальной коре (Энт) и амигдале (БА). А. Спонтанная фоновая активность. Б. Судорожный эпизод. В. Электрическая активность при совместном введении каината и URB597.

Антагонист СВ1 рецепторов АМ251 при использованной дозе не влиял на выраженность ЭС. Как и в контрольной (введение КК с ДМСО), в группе «АМ251» развивался конвульсивный ЭС (4-5 балла) с пароксизмальными кластерами в ЛПП всех исследуемых структур (рис. 5А).

Частота судорожных эпизодов во время ЭС (количество в час) достоверно не отличалась между экспериментальными группами, значительно снижаясь через три часа ЭС. Тем не менее, для групп «АМ404» и «URB597», имелась тенденция к снижению количества пароксизмальных кластеров (рис. 5Б). Судорожные эпизоды длились, как правило, около двух минут. Однако, если инактивация ЭК была блокирована с помощью АМ404 или URB597, электрографические судороги значительно сокращали свою продолжительность (рис. 5В).

А Б Частота / В Длительность

судорожных эпизодов судорожных эпизодов

10 икк ВДМ251 □ АМ404 СЦЖВ597 160 «КК "АМ251 ОАМ404 ОстВ597

Тяжесть судорог I 8 I | 120 II Т

время после начала ЭС, ч Время после начала ЭС, ч

Рис. 5. Введение АМ404, либо 1Л1В597 совместно с КК снижает поведенческие судороги (А), частоту (Б) и длительность (В) судорожных эпизодов во время ЭС (* достоверное отличие от группы «КК», тест Манна-Уитни и с поправкой Бонферрони, р<0.05).

4. Влияние модуляции активности ЭКС на изменения в мозге при эпилептогенезе, вызванном эпилептическим статусом

Влияние на электрическую активность. Спектральный анализ выявил разнонаправленное изменение мощности ЛПП исследуемых структур в течение трех месяцев после изолированного введения каината, либо каината совместно с модуляторами активности ЭКС (рис. 6).

Так, в МС, в группе с введением КК, наблюдалось значительное долгосрочное прогрессирующее снижение мощности ритмов (рис. 6). Такого снижения в МС не наблюдалось, если совместно с КК вводились модуляторы активности ЭКС, причем как «усилители» (группы «АМ404» и «1ЖВ597»), так и «блокатор» (группа «АМ251») (рис. 6). Более того, для данных групп можно было отметить даже некоторое повышение мощности ЛПП в определенных частотных диапазонах. Исключение составил лишь высокочастотный диапазон в группе «АМ404», в котором мощность ЛПП снижалась (рис. 6).

В гиппокампе через месяц после введения КК мощность всех ритмов была существенно повышена, возвращаясь в последующем практически к фоновым значениям (за исключением дельта-ритма) (рис. 6). Введение совместно с КК модуляторов активности ЭКС препятствовало подобной динамике изменений, повышение мощности в широком частотном диапазоне в группе «АМ404» являлось постепенным (рис. 6). Для гамма-ритма и ВЧО увеличение амплитуды ЛПП было достоверным в течение трех месяцев после введения веществ только в группе «АМ251» (рис. 6).

После введения КК на фоне активации ЭКС (группы «АМ404» и «1Л1В597») в энторинальной коре наблюдалось существенное увеличение мощности большинства ритмов (рис. 6). В то же время, когда КК вводилась совместно с антагонистом СВ1 рецепторов (группа «АМ251»), либо изолированно (группа «КК»), существенных

изменений в ритмической активности данной структуры обнаружено не было (рис. 6).

Осцилляторная активность амигдалы изменялась наиболее разнонаправлено. В целом, можно отметить тенденцию к снижению мощности осцилляций во всех группах, кроме «АМ404» (рис. 6). Однако динамика понижения мощности для разных групп отличалась. В группах «КК» и «АМ251» ему предшествовало некоторое повышение, тогда как в группе «1ЛШ597» после уменьшения амплитуды большинства ритмов, активность в дальнейшем практически возвращалась к фоновой (рис. 6). Максимум повышения мощности осцилляторной активности в группе «АМ404» наблюдался через два месяца после введения веществ, возвращаясь к практически первоначальным значениям к концу третьего месяца. Повышение мощности ЛПП происходило также в области ВЧО группы «КК» и в области гамма-ритма группы «АМ251» (рис. 6).

мс

300

120

80 40

КК

АМ251

АМ404

1ЖВ597

Гип

Энт

БА

0.5 300 120

=Г 8

Ч 4 а

& 0.5

о 300 а

X 120

80 40

0.5

300

120

80 40

12 8 4

* * * * * *

* * *

180 160 140 120° 100

1 * Г*- * * * * * 1-1 ^ 1 ф * 1

* * * * * * * _________ * * * * * * * * * * * * * __ ■ 1 * *

т * * * *

__я 1 * * * * * * * \ * * * * * * * * *

' * * * Я * * ■ ш

* * * * * -1-1_1_ и * * * 1 ■ * 1 * *

фон

фон 1

фон 1 2 3 фон 1 Время, мес

Рис. 6. Изменение мощности ЛПП в медиальной септальной области (МС), гиппокампе (Гип), энторинальной коре (Энт) и амигдале (БА) в течение трех месяцев после изолированного введения каината (КК), либо КК совместно с АМ251, АМ404, либо 1ЛШ597. Цветом показан процент изменения относительно фоновой активности (100%) (* достоверное отличие от фоновой активности, тест Краскела-Уоллиса с апостериорным тестом Данна, р<0.05).

Влияние на морфологическое состояние дорзального гиппокампа. Окрашивание по Нисслю через три месяца после ЭС выявило наибольшую степень повреждения в поле САЗа в группах «КК» (введение ДМСО совместно с КК) и «АМ251» (введение АМ251 совместно с КК) (рис. 7Б). Деградация пирамидного слоя в данной области достигала 71% и 63% для «КК» и «АМ251», соответственно (рис. 7Д). Также в данных группах наблюдалось значительное снижение количества клеток в хилусе зубчатой фасции (ЗФ, рис. 7А, В), полях САЗЬ (рис. 7Г) и CAI (рис. 7Е). В случае, когда ЭС был модулирован блокаторами инактивации ЭК, АМ404, либо URB597 плотность клеток в данных областях достоверно не отличалась от их плотности у животных без каких-либо воздействий («чистый контроль») (рис. 7).

Рис. 7. Введение модуляторов ЭКС АМ404 и URB597 совместно с каиновой кислотой препятствует развитию морфологических нарушений в дорзальном гиппокампе через три месяца после ЭС. Изменение количества клеток в хилусе зубчатой фасции (А, В), поле САЗ (Б, Г, Д) и CAI (Е) гиппокампа (* достоверное отличие от группы «Контроль», тест Манна-Уитни U с поправкой Бонферрони, р<0.05).

Окрашивание по Тимму выявило наличие спрутинга мшистых волокон во внутреннем молекулярном слое ЗФ гиппокампа у животных контрольной группы (введение ДМСО перед каиновой кислотой), а также у животных, которым перед каиновой кислотой вводился антагонист СВ1 рецепторов АМ251 (группа «АМ251») (рис. 8Б, Г). В то же время, в группах с активацией ЭКС (введение перед каиновой кислотой ингибитора обратного захвата ЭК АМ404, либо ингибитора фермента деградации ЭК 1ЛШ597), спрутинг мшистых волокон в гиппокампе не наблюдался (рис. 8В, Д).

URB5$7 ^ . ^ о -л Рис. 8. Влияние модуляторов активности ЭКС на

щЩЦ •развитие спрутинга мшистых волокон в зубчатой

ЩГ - фасции дорзальнго гиппокампа через три месяца

' '' ° ' после ЭС. Как и у интактных животных (А), при

■ ' ^^gie-fji^ ' —ч.-.^"-' . использовании АМ404 (В) и URB597 (Д) спрутинг мшистых волокон не выявлен. В группах «КК» (введение ДМСО перед каиновой кислотой) (Б) и «АМ251» (введение АМ251 перед каиновой кислотой) (Г) выявлен спрутинг мшистых волокон (отмечено стрелками).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Спонтанная электрическая активность в медиальной септальной области, гиппокампе, энторинальной коре и амигдале. Более высокая амплитуда активности в широком частотном диапазоне в гиппокампе и энторинальной коре вероятно, обусловлена тем, что благодаря их высокоорганизованной слоистой структуре, нейронная активность здесь легко синхронизируется (Bragin et al., 2002), что, в свою очередь, приводит к генерации более высокоамплитудных ЛПП, по сравнению с ядерными структурами (септум и амигдалой).

Высокая мощность дельта-осцилляций в энторинальной коре может быть следствием того, что данная активность, помимо таламического, имеет и кортикальное происхождение (Steriade, 1994; Lee et al., 2004). Значительная выраженность дельта-осцилляций в МС, по-видимому, обусловлена прямыми проекциями от энторинальной коры (Leranth et al., 1999), учитывая, что МС, в отличие от гиппокампа (Aggleton et al., 1986), не имеет мощного афферентного входа от тапамических ядер. В гиппокампе дельта-активность таламического

происхождения может быть подавлена, либо замаскирована более высокочастотными осцилляциями.

Влияние модуляции активности ЭКС на локальные полевые потенциалы исследуемых структур. В настоящем исследовании мы обнаружили непродолжительное (не более 10-ти минут) понижение мощности ЛПП в ответ на введение «активаторов» ЭКС АМ404 и URB597. В литературе показано, что как натуральные, так и синтетические каннабиноиды, как правило, приводят к достаточно продолжительному снижению мощности ЭЭГ, либо ЛПП разных структур мозга (Buonamici et al., 1982; Hart et al., 2001; Ilan et al., 2004; Robbe et al., 2006; Bocker et al., 2009; Robbe, Buzsaki, 2009; Hart et al., 2010; Goonawardena et al., 2011; Maier et al., 2012). Напротив, блокада путей деградации ЭК вероятно не обладает подобным эффектом. Так, было показано, что подобное воздействие не приводило к подавлению риппл-осцилляций (Maier et al., 2012) и не изменяло гиппокампальную нейрональную активность (Coomber et al., 2008). Обнаруженное нами снижение мощности ЛПП при модуляции активности ЭКС также было кратковременным и скорее всего было следствием реакции животного на процедуру введения, а также механического действия инъецирования, поскольку наблюдалось и для антагониста СВ1 рецепторов, и для ДМСО. Более того, ранее было показано, что введение физиологического раствора также кратковременно снижало амплитуду ЛПП (Синельникова, 2012).

Повышение мощности некоторых ритмов через 20 минут после введения антагониста СВ1 рецепторов может являться следствием усиления нейрональной активности, либо ее синхронности, что приводит к повышению амплитуды ЛПП. Действительно, генетическое удаление или фармакологическая блокада каннабиноидных рецепторов может облегчать или даже вызывать судорожную активность — состояние, характеризуемое повышенной нейрональной возбудимостью и гиперсинхронизацией (Marsicano et al., 2003; Braakman et al., 2009; van Rijn et al., 2011).

Таким образом, вещества, блокирующие инактивацию ЭК, в ряде случаев могут оказаться полезными при лечении заболеваний, осуществляя более избирательную реакцию организма, нежели введение агонистов СВ1 рецепторов. С другой стороны, согласно полученным данным, применение антагонистов СВ1 рецепторов в медицинской практике может иметь побочные эффекты и, по нашему мнению, должно проводиться с осторожностью.

Влияние модуляции активности ЭКС на острую судорожную активность. Введение каиновой кислоты у всех животных вызывало конвульсивный ЭС,

сопровождаемый электрографическими судорогами во всех исследуемых структурах.

В нашем исследовании электрографические судорожные эпизоды во время ЭС появлялись одновременно в МС, гиппокампе, энторинальной коре и амигдале. Отчасти такая закономерность может быть объяснена наличием прямых анатомических связей между данными структурами (Alonso, Kohler, 1984; Dudley et al., 1990; Calderazzo et al., 1996; Pitkanen et al., 1997; Sah et al, 2003; van Groen et al., 2003; Colom, 2006). Совместное введение блокаторов инактивации ЭК (АМ404, либо URB597) и каиновой кислоты снижало поведенческие проявления ЭС, а в некоторых случаях предотвращало также и электрографические судороги. Ранее было показано, что активация ЭКС как экзогенными, так и эндогенными каннабиноидами оказывает противосудорожный эффект в различных моделях эпилепсии (Ameri et al., 1999; Ameri, Simmet, 2000; Wallace et al., 2001, 2002, 2003; Shafaroodi et al., 2004; Deshpande et al., 2007b; Bahremand et al., 2008; Mason, Cheer, 2009; Kozan et al., 2009; Rizzo et al., 2009; Bhaskaran, Smith, 2010; van Rijn et al., 2010; Citraro et al., 2013). Ингибиторы обратного захвата ЭК и различные ингибиторы фермента деградации ЭК (FAAH) также могут облегчать тяжесть острой судорожной активности, вызванной КК (Marsicano et al., 2003; Wettschureck et al., 2006; Karanian et al., 2007; Naidoo et al., 2011, 2012), что согласуется с полученными нами данными. Совместное применение ингибиторов FAAH и обратного захвата ЭК (АМ374/АМ404) также достаточно эффективно препятствует эксайтотоксичности и нарушению поведения и памяти (Karanian et al., 2005). URB597, ингибитор FAAH, снижает вызванное КК повышение активности гиппокампальных нейронов (Coomber et al., 2008) и защищает от судорог, вызванных электрошоком (Naderi et al., 2008). В нашем исследовании АМ404 и особенно URB597 значительно снижали длительность судорожных эпизодов во время ЭС и длительность ЭС в целом, имелась также тенденция к снижению частоты электрографических судорог при применении данных препаратов. Известно, что эпилептические судороги являются следствием гиперсинхронизации нейрональных ансамблей. Было показано, что в гиппокампе каннабиноиды могут снижать синхронную активность нейронов (Robbe et al., 2006; Robe, Buzsaki, 2009; Goonawardena et al., 2011), а также препятствовать синхронизации их активности под действием КК (Mason, Cheer, 2009). Таким образом, уменьшение длительности электрографических судорог под влиянием АМ404 и URB597, а также антиконвульсантное действие ЭК в целом, может быть следствием снижения нейрональной синхронизации и возбудимости.

Ранее было обнаружено, что фармакологическая блокада СВ1 рецепторов может усилить судорожную активность нейронов головного мозга и их чувствительность к эксайтотоксичности (Wallace et al., 2002, 2003; Marsicano et al., 2003; Khaspekov et al.,

2004; Shafaroodi ét al., 2004; Monory et al., 2006; Deshpande et al., 2007c; Kozan et al., 2009; Citraro et al., 2013). Однако в настоящем исследовании не было выявлено усиления судорог, вызванных КК, при блокаде каннабиноидных рецепторов специфическим антагонистом АМ251. Вероятно, для выявления собственного влияния антагонистов на ЭС необходимо использовать субконвульсивную концентрацию КК, что предполагается исследовать в дальнейшем.

В целом приведенные выше данные указывают на потенциальную возможность блокаторов инактивации ЭК препятствовать распространению судорожной активности, предотвращая ее чрезмерные поведенческие проявления. Вероятно, это обусловлено подавлением активированными каннабиноидными рецепторами глутаматергической передачи (Marsicano et al., 2003; Monory et al., 2006).

Влияние модуляции активности ЭКС на эпилептогенез. Гистологические данные. В настоящей работе на каиновой модели ВЭ через три месяца после эпилептического статуса был выявлен спрутинг мшистых волокон во внутреннем молекулярном слое ЗФ. Это может указывать на то, что в применяемой нами модели ВЭ, аналогично другим исследованиям с использованием каината (например, Cronin et al., 1992; Buckmaster, Dudek, 1997; Wenzel et al., 2000; Shao, Dudek, 2005; Sloviter et al., 2006), формируется сеть рекуррентных возбуждающих связей, что является одним из механизмов эпилептогенеза (Dudek, Sutula, 2007) (рис. 9). В том случае, если совместно с каинатом вводился блокатор обратного захвата ЭК, либо ингибитор FAAH, спрутинга мшистых волокон в ЗФ гиппокампа через три месяца после воздействия выявлено не было.

Другим нарушением при использовании каиновой модели ВЭ была значительная гибель клеток в различных слоях дорзального гиппокампа и хилусе ЗФ. Через три месяца после ЭС наибольшая степень повреждения в дорзальном гиппокампе была характерна для поля САЗ, наблюдалась практически полная редукция клеточного слоя САЗа, ипсилатерально к месту введения КК. Эти результаты соответствуют литературным данным, согласно которым в каиновой модели ВЭ при внутримозговом введении конвульсанта, наиболее чувствительным является поле САЗ гиппокампа (см. Levesque, Avoli, 2013) (рис. 9). Подобная уязвимость этой области гиппокампа может быть обусловлена тем, что здесь выявлен самый высокий уровень экспрессии каинатных рецепторов (GluK2, GIUK4, GluK5) (Carta et al., 2014). Несмотря на то, что дегенерация пирамид поля САЗ с ипсилатеральной к введению КК стороны начинается уже через 1-3 дня после инъекции (Nadler et al., 1978), со временем повреждения нервной ткани могут только нарастать (Гордон и др., 2014).

Рис. 9. Схематическое изображение возможных механизмов изменения осцилляторных процессов в исследуемых структурах мозга во время эпилептогенеза. А. Здоровый мозг. Б. Эпилептический мозг. Гибнущие клетки обозначены снижением интенсивности цвета. КШ -коллатерали Шаффера, МВ - мшистые волокна, ЗФ - зубчатая фасция, ПП -перфорирующий путь, Энт - энторинальная кора, МС - медиальная септальная область, БА, ЛА, МА, ЦА - базальное, латеральное, медиальное и центральное ядра амигдалы соответственно. При эпилептогенезе в результате обширной гибели преимущественно тормозных нейронов, их влияние на активность проекционных возбуждающих клеток ослабевает. Это, наряду с формированием новых рекуррентных возбуждающих связей и увеличением количества спонтанно разряжающихся залповых нейронов, приводит к повышению нейронной возбудимости и гиперсинхронизации.

Амигдала

СА1 И-*

Амигдала

▼ возбуждающие терминали

▼ тормозные терминали

Углутаматергические ГАМКергические нейроны нейроны

^ АХ-нейроны ^

гранулярные клетки

нейроны ПВ*

интернейроны ССТ*

интернейроны

иные подтипы интернейронов

Вероятно, в данной модели ВЭ, деградация нейронов поля САЗ может приводить к последующей деградации нейронов в поле CAI (Гордон и др., 2014). Через три месяца после введения КК в правый боковой желудочек мозга мы обнаружили значительное снижение количества клеток в поле CAI как правого, так и левого дорзального гиппокампа. Подобные нарушения, наблюдавшиеся нами через длительный срок (больше 2 месяцев) после воздействия КК, были обнаружены и в других работах (Franck, 1984; Buckmaster, Dudek, 1997а; Carriero et al., 2012) (рис. 9). "Кроме того, для поля CAI показана значительная гибель парвальбумин- и соматостатин-содержащих интернейронов в ответ на интрацеребровентрикулярное введение каината (Best et al., 1993, 1994; Morin et al., 1998; см. Levesque, Avoli, 2013) (рис. 9). Данное нарушение может привести к снижению эффективности возвратного торможения пирамидных клеток (Lacaille et al., 1987; Maccaferri, McBain, 1995; Morin et al., 1998; см. Levesque, Avoli, 2013) и, вероятно, способствовать развитию хронической судорожной активности.

Помимо полей гиппокампа, мы также обнаружили существенное снижение плотности нейронов в хилусе ЗФ. Нейроны ЗФ, наряду с нейронами поля САЗ, чрезвычайно уязвимы к действию каината. Снижение количества клеток в хилусе ЗФ считается одним из маркеров ВЭ и наблюдается как через несколько часов, так и через несколько месяцев после введения КК (Nadler,1981; Cronin et al., 1992; Buckmaster, Dudek, 1997a; Buckmaster, Dudek, 1997b; Wonzel et al., 2000; Sloviter et al., 2006) (рис. 9). К числу погибших нейронов, вероятно, можно отнести как глутаматергические (мшистые клетки), так и ГАМКергические нейроны.

Обнаруженная в настоящем исследовании сохранность количества клеток в полях CAI, САЗ и хилусе ЗФ дорзального гиппокампа через три месяца после совместного с каинатом введения блокатора обратного захвата ЭК (АМ404), либо ингибитора FAAH (URB597), очевидно, является следствием снижения нейронной возбудимости во время ЭС, что может способствовать выживанию гиппокампальных нейронов в дальнейшем. В нейропротекцию, опосредованную модуляцией ЭКС, может вносить вклад также активация генов раннего ответа (c-fos, c-jun, zif268) и киназ, регулируемых внешним сигналом (Zhang et al., 2002; Marsicano et al. 2003), индукция нейротрофических факторов, например BDNF, (Zhang J. et al., 2002; Khaspekov et al., 2004), регуляция энергетического метаболизма (Benar et al., 2012), а также стимуляция нейрогенеза и усиление пролиферации нейрональных клеток-предшественников (Aguado et al., 2007).

По нашим данным, при блокаде каннабиноидных рецепторов во время эксайтотоксичности (группа «АМ251») в дальнейшем были выявлены

дегенеративные изменения и реорганизация возбуждающей передачи в гиппокампе, подобные изменениям при изолированным введении каиновой кислоты. Так, в группе «АМ251 » через три месяца после ЭС наблюдалась значительное снижение количества клеток в дорзальном гиппокампе и спрутинг мшистых волокон в ЗФ. Данный результат согласуется с литературными данными, показавшими, что подобное воздействие является проконвульсантным (Wallace et al., 2002, 2003; Marsicano et al., 2003; Khaspekov et al., 2004; Shafaroodi et al., 2004; Monory et al., 2006; Deshpande et al., 2007c; Kozan et al., 2009; Citraro et al., 2013) и "даже может вызывать судороги (Braakman et al., 2009; van Rijn et al., 2011).

Влияние модуляции активности ЭКС на эпилептогенез. Электрофизиологические данные. Описанная выше гибель клеток и реорганизация нейрональных сетей при ВЭ могут вызывать нарушения ритмогенеза в височных структурах мозга. Мы обнаружили через месяц после ЭС значительное увеличение мощности активности в поле СА1 гиппокампа во всем исследуемом частотном диапазоне, в дальнейшем возвращающейся к фоновым значениям (за исключением дельта-ритма). Подобная динамика изменений может быть следствием снижения торможения в поле СА1 (Ashwood, Wheal, 1986; Ashwood et al., 1986; Cornish, Wheal, 1989; Franck, Schwartzkroin, 1985; Meier et al,, 1992; Levesque, Avoli, 2013), a также повышения возбудимости и/или синхронности работы пирамидных нейронов (Meier, Dudek, 1996; Perez et al., 1996; Esclapez et al., 1999; Smith, Dudek, 2001, 2002; Shao, Dudek, 2004) в первый месяц после ЭС (Chen et al., 2011). Показано, что после ЭС многие из пирамидных нейронов поля СА1 обнаруживают залповую активность (Sanabria et al., 2001; Chen et al., 2011), что является одним из факторов, определяющих гиперсинхронизацию при эпилепсии (Szilâgyi et al., 2014) (рис. 9). Кроме того, повышению возбуждения в поле СА1 и в гиппокампе в целом может способствовать реорганизация нейрональных сетей с появлением новых возбуждающих синапсов на пирамидных клетках - спрутинг в ЗФ и в поле САЗ, а также гибель специфических групп интернейронов гиппокампа и окологиппокампальных структур (рис. 9). Так, например, способствовать развитию судорожной активности может гибель парвальбумин-содержащих корзинчатых клеток энторинальной коры (Drexel et al., 2011), тормозящих нейроны, дающие начало возбуждающему перфорирующему пути, и соматостатин-содержащих интернейронов в базальном и латеральном ядрах амигдалы (Pitkanen et al., 1998), контролирующих основные проецирующиеся к гиппокампу глутаматергические клетки, а также снижение дендритного торможения в ЗФ (гибель соматостатин-положительных интернейронов) (Buckmaster, Dudek, 1997а), контролирующего вход в

гиппокамп от энторинальной коры (рис. 9). На ослаблении тормозного контроля пирамидных клеток может влиять и увеличение эксперсии СВ1 рецепторов на терминалях интернейронов поля СА1 и ЗФ (Magloczky et al., 2010). С другой стороны, повышение количества рецепторов данного типа в полях СА1 и САЗ гиппокампа (Wallace et al., 2003), а также на терминалях спрутирующих мшистых волокон ЗФ (Bhaskaran, Smith, 2010) в более поздние сроки после ЭС, вероятно, снижает нейрональную возбудимость. «Нормализации» активности через два месяца после ЭС может способствовать частичное восстановление торможения благодаря повышению активности и спрутингу выживших интернейронов (Davenport et al. 1990; Mathern et al. 1995).

Повышение мощности активности на дельта-частоте при эпилептогенезе, помимо гиппокампа, наблюдалось нами в амигдале, что может объясняться усилением синхронизации в таламо-кортикальной сети и являться отражением патологического процесса (Walter, 1936).

Ранее было показано, что при эпилептогенезе происходит снижение мощности тета-ритма в гиппокампе (Arabadzisz et al., 2005; Colom et al., 2006; Dugladze et al., 2007; Kitchigina, Butuzova, 2009; Синельникова, 2012; Асташева, 2013; Astasheva et al., 2015) и MC (Синельникова, 2012; Асташева, 2013; Astasheva et al., 2015). В настоящем исследовании при эпилептогенезе, вызванном каиновым ЭС, мы не обнаружили подобного нарушения в гиппокампе, напротив, мощность активности на тета-частоте через месяц после ЭС была существенно повышена. Данное несоответствие может быть объяснено как разными моделями ВЭ с использованием разных видов животных, так и разными сроками и местами регистрации активности.

Обнаруженное для МС снижение мощности тета-осцилляций через месяц после ЭС, за которым происходило снижение мощности и в других частотных диапазонах, является, по-видимому, следствием десинхронизации ритмической работы септальных клеток (Мальков, 2011). Причиной подобных изменений может быть нарушение функционирования внутрисептального торможения (Мальков, Попова, 2011; Malkov, Popova, 2011), а также гибель значительной части ГАМКергических клеток (Colom et al., 2006) (рис. 9). Нарушение ритмогенеза в МС при эпилепсии в свою очередь, может влиять на процесс формирования синхронизации в гиппокампе, имеющей решающее значение в возникновении эпилептического очага (рис. 9).

Подобно МС, мы также обнаружили снижение мощности ЛПП амигдалы (базального ядра) через два месяца после ЭС. В норме ГАМКергические проекции МС тормозят активность амигдалы, а именно ее «стриарные» центральное и медиальное ядра (Dudley et al, 1990; Lee, Davis, 1997). Нарушение функционирования

ГАМКергической системы в МС, вероятно, приводит к снижению ее тормозного влияния на ГАМКергическую «стриарную» часть амигдалы. Таким образом, торможение активности глутаматергических «кортикальных» ядер (латерального, базального и дополнительного базального) усиливается, благодаря развитой системе внутренних связей между ядрами амигдалы (Рккапеп й а1., 1998) (рис. 9). Кроме того, в базальном и латеральном ядрах показана значительная гибель соматостатин-содержащих интернейронов (Рккапеп й а1., 1998), опосредующих дендритное торможение основных глутаматергических клеток, что также может играть роль в нарушении ритмогенеза амигдалы при эпилептогенезе (рис. 9).

Единственной структурой, в которой мы не обнаружили существенных изменений мощности ЛПП при эпилептогенезе, была энторинальная кора, в которой, однако, регистрировались сильные электрографические судороги во время ЭС. Можно предположить, что изменения активности данной структуры после ЭС, которые выявляются посредством спектрального анализа ЛПП, происходят вне временных точек, взятых в настоящем исследовании, а именно в первые недели, либо позднее трех месяцев после ЭС.

Обнаруженная нами иная динамика изменений электрической активности структур во время эпилептогенеза при пролонгации действия ЭК во время гиперактивации может быть следствием сохранности нейрональных популяций в различных структурах. Так, в гиппокампе групп «АМ404» и «1ЛШ597» не наблюдалось резкого значительного увеличения мощности осцилляций в первый месяц после ЭС, характерного для группы «КК» (без воздействия на ЭКС). Хотя в группе «АМ404» было обнаружено повышение мощности активности, но оно было постепенным, намного менее выраженным и не включало высокочастотные осцилляции. Важно также отметить, что в группах «АМ404» и «1ЖВ597» в первый месяц после ЭС не было значительного повышения мощности высокочастотных осцилляций, что в гиппокампе является одним из маркеров эпилептогенеза (51аЬа й а1., 2014). Вероятно, первый месяц после каинового ЭС является критическим в развитии патологической активности. Снижение возбудимости и нарушения синхронизации активности в данный период может препятствовать дальнейшему эпилептогенезу. Так, согласно нашим данным, в отличие от группы с изолированным введением КК, в группах «АМ404» и «ШШ597» не наблюдалось прогрессирующего нарушения осцилляторных процессов в МС.

Выявленное в наших экспериментах значимое увеличение мощности большинства ритмов в энторинальной коре в течение трех месяцев после введения КК на фоне активации ЭКС (группы «АМ404» и «иЯВ597») было несколько неожиданным,

поскольку без активации (группа «КК») и даже на фоне блокады СВ1 рецепторов (группа «АМ251») подобного изменения мощности J11111 не происходило. Можно предположить, что активация ЭКС во время эксайтотоксического действия КК в последствии способствует выживанию парвальбумин-положительных корзинчатых интернейронов энторинальной коры, являющихся центральными элементами в механизме генерации ритмической активности (Wang, Buzsaki, 1996; Hajos et al., 2000).

Несмотря на отсутствие изменений осцилляторной активности после блокады СВ1 рецепторов во время ЭС (группа «АМ251»), аналогичных изолированному введению каината, в данной группе на протяжении трех месяцев после ЭС в гиппокампе наблюдалось повышение высокочастотного диапазона осцилляций (выше 80Гц), что свидетельствует о развитии патологической активности в данной структуре. Наличие эпилептогенеза в группе «АМ251» подтверждается также обнаруженными нами в дорзальном гиппокампе спрутингом мшистых волокон в ЗФ и нейродегенерацией в полях CAI, САЗ и хилусе ЗФ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, впервые на бодрствующих животных при использовании регистрации электрической активности в септо-гиппокампальной системе, амигдале и энторинальной коре продемонстрировано, что блокаторы инактивации ЭК АМ404 и URB597 ослабляют эпилептический статус, вызванный каиновой кислотой, и препятствуют развитию эпилептогенеза, тогда как антагонист СВ1 рецепторов АМ251 подобным действием не обладает. Можно предполагать, что пролонгация действия эндоканнабиноидов во время ЭС препятствует развитию нейрональной гиперактивации и ее распространению в мозге за счет угнетения глутаматергической передачи.

Блокада механизмов инактивации ЭК во время эпилептического статуса имела также долговременные последствия. При использовании данного подхода через три месяца после ЭС не было выявлено нейродегенерации в дорзальном гиппокампе и спрутинга мшистых волокон в ЗФ, то есть, характерных нарушений, обнаруженных при изолированном действии КК и ее совместном действии с антагонистом каннабиноидных рецепторов АМ251. Более того, при применении АМ404 и URB597 не наблюдалось острого повышения мощности ЛПП в гиппокампе после воздействия конвульсанта, а также прогрессирующего снижения мощности активности в MC. Предполагается, что активация ЭКС во время эксайтотоксического воздействия способствует выживанию клеток и предотвращает реорганизацию нейронных сетей,

что, в свою очередь, препятствует развитию нарушений осцилляторной активности в течение длительного времени после ЭС.

Таким образом, блокада инактивации ЭК может являться физиологически адекватным способом контроля судорожной активности и представляет собой потенциальную мишень для лечения медикаментозно-рефрактерных форм ВЭ.

ВЫВОДЫ

1. Однократное введение блокаторов инактивации эндоканнабиноидов не изменяет активность исследованных структур мозга и поведение животных, тогда как антагонист СВ1 рецепторов повышает мощность осцилляций.

2. Блокаторы инактивации эндоканнабиноидов ослабляют эпилептический статус, вызванный каиновой кислотой, снижая его поведенческие проявления и длительность электрографических судорог. Антагонист СВ1 рецепторов подобным действием не обладает.

3. В течение трех месяцев после введения каиновой кислоты совместно с блокаторами инактивации эндоканнабиноидов изменений осцилляторной активности исследуемых структур, подобных изменениям при изолированном действии конвульсанта, не происходит. Введение каиновой кислоты на фоне антагониста СВ1 рецепторов приводит к усилению высокочастотных осцилляций в гиппокампе, что свидетельствует о развитии в нем патологических процессов в отсутствие регуляторного влияния эндоканнабиноидной системы.

4. Совместное введение каиновой кислоты с блокаторами инактивации эндоканнабиноидов препятствует нейродегенеративным процессам и реорганизации нейрональных сетей в дорзальном гиппокампе, обнаруживаемым через три месяца после изолированного введения конвульсанта, либо конвульсанта совместно с антагонистом СВ 1 рецепторов.

5. Предполагается, что активация эндоканнабиноидной системы при острых судорожных состояниях способствует восстановлению баланса возбуждающих и тормозных процессов в мозге, ограничивает патологическую синхронизацию нейрональной активности и, таким образом, может препятствовать дальнейшему эпилептогенезу, предотвращая дегенеративные изменения и реорганизацию нейрональных сетей.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (№№ 09-04-00261-а, 12-04-00776-а, 14-4403607, 15-04-05463-а) и Совета по грантам Президента РФ (НШ-850.2012.4, стипендия СП-6466.2013.4).

Список публикаций по теме диссертации.

1. Шубина Л.В., Кичигина В.Ф. Протекторное влияние агониста СВ1 рецепторов WIN55.212-2 при развитии судорожной активности в мозге на моделях височной эпилепсии in vivo // Журн. высш. нервн. деят. 2011, 61(1), 94-101.

2. Шубина Л.В., Кичигина В.Ф. Эндогенная каннабиноидная система мозга: Роль в регуляции судорожной активности // Усп. физиол. наук. 2012, 43(3), 21-37.

3. Шубина Л.В., Кичигина В.Ф. Влияние ингибиторов метаболизма эндоканнабиноидов на эпилептический статус у морских свинок // Фунд. исслед. 2012, 11(2), 321-325.

4. Kitchigina V., Popova I., Sinelnikova V., Malkov A., Astasheva E., Shubina L., Aliev R. Disturbances of septohippocampal theta oscillations in the epileptic brain: Reasons and consequences // Exp. Neurol. 2013, 247, 314-327.

5. Шубина Л.В., Кичигина В.Ф. Влияние каннабиноидных препаратов на полевую активность лимбических структур у морских свинок // Фунд. исслед. 2014, 9, 27032707.

6. Гордон Р.Я., Хуцян С.С., Шубина Л.В., Капралова М.В., Першина Е.В., Архипов В.И. Особенности нейродегенерации полей гиппокампа после действия каиновой кислоты у крыс // Цитология. 2014, 56(12), 919-925.

7. Shubina L.V., Aliev R.R., Kitchigina V.F. Attenuation of kainic acid-induced status epilepticus by inhibition of endocannabinoid transport and degradation in guinea pigs // Epilepsy Res. 2015, 111,33-44.

Тезисы докладов:

1. Шубина Л.В. Антиэпилептическое действие агониста СВ1 рецепторов WIN55,212-2 у морских свинок in vivo // Всероссийская конференция с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология», Пущино, 2009, с. 83.

2. Шубина Л.В. Агонист СВ1 рецепторов WIN55,212-2 блокирует инициацию острых судорог у морских свинок in vivo //13 Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21 века», Пущино, 2009, с. 129.

3. Кичигина В.Ф., Шубина Л.В. Низкая доза агониста СВ1 рецепторов WIN55,212-2 блокирует судороги и развитие эпилептического статуса на моделях височной эпилепсии // Научная сессия НИЯУ МИФИ, Москва, 2010, с. 244.

4. Shubina L.V. Anticonvulsant action of cannabinoid CB1 receptor agonist WIN 55,212-2 in the models of temporal lobe epilepsy // 6rd International Interdisciplinary Congress «Neuroscience for Medicine and Psychology», Sudak, Ukraine, 2010, p. 315.

5. Шубина Л.В. Противосудорожное действие агониста каннабиноидных СВ1 рецепторов WIN 55,212-2 in vivo // «Экспериментальная и теоретическая биофизика», Пущино, 2010, с. 8.

6. Shubina L., Kitchigina V.F. Modulation of endocannabinoid transport blocks Kainic acid-induced status epilepticus II 8th IBRO World Congress of Neuroscience, Florence, Italy, 2011,B430.

7. Шубина J1.B. Модуляция транспорта эндоканнабиноидов блокирует развитие эпилептического статуса // «Экспериментальная и теоретическая биофизика», Пущино, 2011, с. 24.

8. Шубина Л.В., Бондарь А.Т. Спектральный анализ внутримозговой ЭЭГ во время эпилептического статуса у морских свинок // VII Сибирский съезд физиологов с международным участием, Красноярск, Россия, 2012, с. 622-623.

9. Shubina L., Kitchigina V.F. Inhibitior of Endocannabinoid Metabolism Attenuates Kainic Acid-Induced Pathology // 8th FENS Forum of Neuroscience, Barcelona, Spain, 2012,6(152.06).

10. Шубина Л.В., Кичигина В.Ф. Повышение уровня эндоканнабиноидов ослабляет эпилептический статус и последующие нарушения у морских свинок // II Всероссийская конференция с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология», Пущино, 2012, с. 80-81.

11. Шубина Л.В. Влияние ингибитора метаболизма эндоканнабиноидов на эпилептический статус и последующие нарушения у морских свинок // «Экспериментальная и теоретическая биофизика», Пущино, 2012, с. 30.

12. Bondar А.Т., Shubina L.V. Spectrum dynamic of electrical activity of guinea pig brain structures during experimental status epilepticus // 9th International Interdisciplinary Congress «Neuroscience for Medicine and Psychology», Sudak, Ukraine, 2013, p. 89.

13. Shubina L.V., Kitchigina V.F. Repeated Injections of Endocannabinoid Metabolism Inhibitors Attenuates Kainic Acid-Induced Status Epilepticus and Further Alterations in Guinea Pigs // 45th meeting of the EBBS, Munich, Germany, 2013, P394.

14. Шубина Л.В., Кичигина В.Ф. Влияние ингибитора фермета деградации эндоканнабиноида анандамида на эпилептическиий статус и последующий эпилептогенез у морских свинок // 18-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2014, с.374.

15. Шубина Л.В., Кичигина В.Ф. Влияние каннабиноидных препаратов на активность лимбических структур мозга и эпилептический статус у морских свинок // «Экспериментальная и теоретическая биофизика», Пущино, 2014, с.87-88.

Список сокращений:

БА - базальное ядро амигдалы ЭК - эндоканнабиноиды

ВЭ - височная эпилепсия ЭКС - эндоканнабиноидная система

Гип - гиппокамп Энт - энторинальная кора

ДМСО - диметилсульфоксид ЭС - эпилептический статус

ЗФ - зубчатая фасция BDNF - нейротрофический фактор,

КК - каиновая кислота выделенный из мозга

ЛПП - локальные полевые потенциалы FAAH - гидролаза амидов жирных

МС - медиальная септальная область кислот, фермент деградации анандамида

Информация о работе