Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нейропептиды (тиролиберин и кассинин) в регуляции судорожной активности мозга у крыс (электрофизиологические и поведенческие проявления)

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Нейропептиды (тиролиберин и кассинин) в регуляции судорожной активности мозга у крыс (электрофизиологические и поведенческие проявления)"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ни.

М.В .Ломоносова Биологический факультет

Р Н л я На праеах рукописи

ПРАХЛАД ЧАНДРА КУМАР ЧИЛАПАГАРИ

(Индия)

УДК: 612.822 + 616.853 + 577.122

НЕЙРОПЕПТИДЫ (ТИРОЛИБЕРИН И КАССИНИН) В РЕГУЛЯЦИИ СУДОРОЖНОЙ АКТИВНОСТИ МОЗГА У КРЫС (ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ)

03.00.13 - физиология

ЧСАОвГИ Я 2ЯИВ013ЫХ

Автореферат диссертации па соискание ученой стененн кандидат! биологических наук

Москва - 1993 г.

Работа выполнена на кафедре физиологии человека н животных Биологического факультета Московского Государственного университета ни. М.В. Ломоносова Зав. кафедрой академик РАМН И.П.Ашмари.ч

Научный руководитель : доктор биологических наук профессор С.А.Чсг;ур!юв

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор Н-А/Гуишалова

кандидат биологических наук

доцент В.Ю.Ц^еблаиов

Ведущее учреждение : Научно-Исследозательскин

Институт Нормальной Физиологии им. П.К. Анохина Российской Академии Медицинских Наук

Защита состоится 20 декабря 1993 года в 15— на заседании Специализированного Ученого Совета Биолспгчссхого факультета IV» I "У им. М.В.Ломоносоза по адресу: 117234 г. Москва. Воробьевы Горы, МГУ, Биологический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке. Биологического факультета МГУ км. М.В_Ломоносова

Автореферат разослан .. ноября, 1993 года.

Ученый Секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук Б.А.Умарова

Актуальность проблемы.

Эпилепсия - огромная медико-биологическая и социальная проблема, значение которой с развитием наших знаний о работе головного мозга, психофармакологии и нейрохирургии не уменьшается а возрастает!

Эпилепсия - тяжелое психоневрологическое расстройство, включающее собственно эпилепсию, эпилептические синдромы и заболевания, связанные с судорожной активностью (Сперанский,1932; Penfield, Jasper, 1958; Gastaut, FischerWilliams, 1959; Gloor, 1982; Давнденков, 1960; Болдырев, 1984; Карлов, 1990; Avoli, Gloor, Kostopoulos, Naquet, 1990; Селицкнй, 1991). Особенно тяжело она протекает у летен (Поповиченко, 1969; Зсмскова, 1971; Бэдалян, 1984; Бадалян, Таболин, Вельтищев, 1971; Яцук, 1985; Скворцов и др., 1986 Boenigk, 1987; Gross-Selbeck, 1989,1991).

Помимо снижения работоспособности существенным является развивающееся нарушение когнитивных функции ( Reinolds, Trimble,1988; Lezak,1991; Morston, Bezag, Binnie,Fowler, 1993), поэтому сложнейшей проблемой остается соотношение эпилепсии с психиатрическими заболеваниями ( М ajkoxski ,1993; Owczarek,

Majkowski, 1993).

Материалы последних конгрессов Международной Протиеоэпнлептической Лиги в Индии (1989) и в Норвегии (1993) показывают необходимость фундаментальных физиологических исследований механизмов генеза этого заболевания, разработку новых средств лечения.

40 миллионов больных эпилепсией в Мире нетрудоспособны, несмотря на проводимое медикаментозное лечение. По данным Лит ежегодно днагносцируется 30.000 новых больных эпилепсией, причем в 20% случаев приступы не удается контролировать, а 60% больных испытывают осложнения от ряда побочных эффектов лекарственной терапии. Особенно трудны случаи (обычно 2 из 10!), когда припадки не контролируются и резистентны к медикаментозной терапии

(Wolf, 1993).

По новейшим данным опроса (1993, ILAE, Oslo) ведущих специалистов Европы и Америки (на сегодня в Америке более 2,5 миллиона больных эпилепсией) - 77% и 59% (соответственно) видят перспективу борьбы с эпилепсией в углубленном физиологическом исследовании и понимании природы эпилепсии.

Применение и дальнейшая разработка новых противосудорожных средств основывается в основном на представлениях о классических тормозных ГАМК-ергнческих медиаторных системах и природе возбуждающих медиаторов. Вместе с тем 2, 0 новые данные о трансмиттерной функции

нейропептидов и "континууме" их физиологических функций (Ашмарин, 1982,1987) открывают новую возможность в изучении и регуляции судорожной активности мозга (Крыжановский, 1980, Шандра ,1985; Крыжа- иовский, Луценко, Карганов, Хлебникова, 1990; Чепурнов, Чеиурнова, 1985, 1993; Чепурнов, 1988; Шакдра, Годлевский, Мазарати, 1989, 1993; Вастьянов 1993). Иммунно-ферментный анализ пептидов в крови больных позволил открыть принципиально новый метод диагностики эпилепсии (Дамбинова,1992).

Применение пептидов, как противосудорожных средств, является частью общей проблемы подавления судорожной активности и моторных припадков с помощью веществ эндогенного происхождения, а также"включения" (активации) пептидами противосудорожных систем мозга.

Известно, что именно ликвор содержит "защитные" вещества, выделяющиеся мозгом при экспериментальном судорожном припадке (Tortella, Long, 1985; Snead,1986; Draganov, 1986, Kryzhanovsky et al., 1989) и эпилепсии (Джанелидзе, 1982; Хачатрян, 1989; Скворцов, 1990). В этой связи важно подчеркнуть неослабевающий интерес медиков и экспериментаторов к изучению спинномозговой жидкости здорового и больного человека и лнкворотерапии ( Фридман,1971; Макар з 1989; Einstein, 1982; Хачатрян, Рогулов, Яцук и др. 1989;, Васильева и др., 1989). Поэтому остается актуальным биологическое тестирования СМЖ и ее компонентов, применение фракций ликвора с лечебными целями.

Тиролибернн является важнейшим нейропептидом с большой перспективой расширенного применения в клинике (Ашмарии и др.,1992). Впервые в 1991г. на кафедре физиологии человека и животных МП/ были получены данные о его противосудорожном действии при интраназальном введении в условиях экспериментально вызванного судорожного синдрома у крыс (Ашмарии, Чепурнов-., Чепурнов, 1992). Что касается применения не СП, а пептидов семейства тахикинннов, то за исключением работ выполненных в МГУ по нейрокишшу и кассинину (Чспурнова, Аббасова, Кабанова, 1992; Кабанопа, 1993), и данных по галанину (Mazaratty, 1993) в литературе сведений не имеется. Поэтому было актуальным изучить возможность применена пептида данного семейства в качестве противосудорожного фактора.

Цель я задачи исследования.

Исходя из вышеизложенного целями работы были:

• выяснение противосудорожного действия нейропептидов тиролиберина и кассинина при экспериментально вызванной эпилепсии у живо г-

пых (пентилентетразоловая судорожная активность),

исследование протнвосудорожных свойств спинномозговой жидкости детен.больных эпилепсией, при ее внутрижелудочковом введении животным в условиях экспериментально вызванного судорожного синдромаЭто осуществлялось путем решения следующих задач:

1. Исследовать модификацию фармакологического шиллинга при дробном трехкратном введении пентилентетразола.

2. Исследовать противосудорожные свойства тахикииина - касса шина при его' системном зведении.

3. Исследовать противосудорожные эффекты тиролиберина при введении его интрапазалыю и при применении его в ультра малых дозах.

4. Исследовать возможность применения спинномозговой жидкости больных эпилепсией при ее внтурнжелудочковом введении в мозг как противосудорожиого фактора.

Научная новизна исследования.

Впервые выявлены противосудорожные свойства кассинина - пептида семейства тахикининов, обладающего широким спектром действия на висцеральные функции. Эффект проявляется при системном введении.

Доказано, что интраназальное введение тиролиберина в ультра малых дозах до введения эпилептогена оказывает протективное действий в отношении развития судорожной активности в ЭГ - пшпокампа и неокортехса. Оба ненропептида вызьтазот повышение судорожного порога у экспериментальных крыс, достоверно понижают выраженность моторной судорожной активности (в баллах по шкале П.Мареша).

Показано, что противосудорожные свойства ликвора больного эпилепсией человека сохраняются при достаточно длительном хранении и тестировании на животных с экспериментальным судорожным синдромом (пентилентетразоловые судорога)- Эффект ликвора (при его интравептрнкулярлом введении) углубляется при сочетанием действии с противосудорожными средствами карбамазепинового • ряда.

Теоретическое н практическое значение. В экспериментах на крысах предложена новая модель дробного последовательного введения эпилептогена (пентилентетразола) в подпороговых дозах. Применение данной модификации фармакологического киндлинга позволило более дифференцированно оценивать судорожные пороги у экспериментальных животных и получить новые показатели противо судорожной активности при сочетании эпилептогена н ненропептида.

Впервые показано, что кассиннн (кейропептид семейства тахикининов - не млекопитающих животных) обладает противосудорожным эффек

том при его системном введении; определены минимальные дозы его действия при внутрибрюшинном введении( < 100 т!^ ).

Эти собственные данные по кассинину и известный, впервые полученный Г.Н.Крыжановским и соав. (1988) противосудорожный эффект СП, позволяют считать тахикинины новой группой нейропептадов перспективной для дальнейшего исследования и последующего клинического применения при эпилепсии.

Впервые показано, что тиролиберин может оказывать противосудорожное действие на экспериментально вызванный судорожный синдром при интраназальном введении. ТРГ оказывает эффективное протнвосудорожное действие, определяемое как по судорожным моторным припадкам, так и по предшествующим им эпилептиформной ЭГ-актнвности гнппокампа и неокортекса у крыс.

Полученные данные, подтверждают принципиально новую концепцию академика И.П.Ашмарина об эндогенных регуляторах пептидной природы в организме, действующих в ультрамалых дозах. Впервые получены доказательства в отношении блокирования тиролиберином вызванной судорожной активности.

Исс. дованы в условиях экспериментальной эпилепсии роль карбамазепина в разные периоды его накопления и выведения из организма. Получены первые обоснования перспективы применения карбамазепина при ликворотрансфузни.

Апробация работы.

Предварительные результаты исследования были доложены на Учредительном Международном Конгрессе Патофизиологического общества в Москве (1991) и на Психофармакологической конференции Чешского и Словацкого

Фармакологических обществ в Есениках, Чехия (1992).

Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиуме по эпилепсии: "Эпилептический Очаг" в Канаде (1991); на Международной конференции по фармакологии памяти С.А.Аничкова "Фармакология на границе двух тысячелетий", Санкт-Петербург, (1992); Международном Конгрессе Пртнвозпилептической Лиги в Норвегии, Осло (1993); на Международном Конгрессе по ультрамалым дозам во Франции, Бордо,1993 и на Европейской Конф. Невропатол. Наук в Германии, Берлин, 1993.

Объем и структура диссертации.

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методик исследования, 4 2-х Оглав с изложением экспериментального материала, заключения и выводов. Общий объем составляет 144 страниц машинописного текста, включая 37 иллюстраций и 2 таблицы. Список литерату

ры включает 176 источников, в том числе 60 на русском, языке.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на беспородных белых хрысах- самцах массой 180-220 г. Всего использовано 250 животных. Вживление электродов проводили под глубоким наркозом, как и зфтаназию для морфологического контроля.

Экспериментальный судорожный синдром вызывали с помощью пснтилеьтетразола (ПТЗ) - в дозе 25 мг/кг I.P., ( отечественный коразол в ампулах) и кристаллический ПТЗ фирмы "Sigma". Применен модифицированный (Chepumov et al.,1988) метод "срочного" фармакологического киндлинга при дробном введении подпороговых доз (по Craig, Co!osanti,1989). Протокол эксперимента включал два обязательных экспериментальных дня с перерывом 1 или 2 суток. Каждый день ПТЗ вводили трижды с интервалом в 15 минут. Проводилось непрерывное наблюдение: поведенческая регистрация выраженности судорожной активности (Gale,1990). Опыт останавливали, как только она достигала максимального развития (5 баллов).

Шкала выраженности моторной судорожной активности в баллах по (P.Mares, M.Pohl, H.Kubova. 1983; P.Mares, H.Kubova, 1985):

0 - нет изменеиий в поведении

0,5 - анормальное поведение (периоды замирания, учащение дыхания, напряжение мышц пальцев и хвоста)

1 - изолированные миоклонические вздрагивания (myoclonic jerks)

2 - атипичные минимальные судороги (minimal seizures)

3 - мштмальные судороги (преимущественно клонического типа,

ограничивающиеся вздрагиванием головы и мышц передних конечностей)

4 - большие судороги без тонической фазы (major seizures)

судороги мышц всего тела, подъем на задние конечности в позе "кенгуру"

5 - полные большие, генерализованные тонихо-клонические

судороги с потерей выпрямительных рефлексов (generalized tonic-clonic seizures), животное падает на бок

Полученньш данные рассматривались как контроль к последующему дню, когда эпилехггоген вводили на фоне или после введения исследуемого противосудорожного средства.

Показателями эффективности противосудорожной активности служили:

1) данные индивидуальной изменчивости моторной судорожной активности,

2) количество животных, у которых на фоне исследуемого вещестза полностью или частично блокировалась судорожная активность, 3) изменение латентных периодов реакции, 4) процент различных стадий судорожной активности, регистрируемых в контроле, до, и на фоне воздействия антиэпилептогена. Результаты, полученные в 1-ый экспериментальный день позволяли сформировать с учетом судорожного порога однородные группы животных для последующего испытания антиэпилептогенов, распределить крыс по выраженности судорожного порога, предвидеть, у каких животных передозировка ПТЗ могла привести к летальному исходу. Контрольным животным вводили физиологический ра-р.

Крысы были адаптированы путем многократного хэндлинга. В экспериментальной норковой камере проводился их отбор по тесту "открытого поля".

Исследуемые вещества. Карбамазепин (КБЗ) применяли внутрибрюшшшо и интраназально в лекарствешюй форме "Timonil-retard" и "Nootop" фирмы "Gerot Pharmazeutika" (Wien). Тиролиберин (ТРГ) использовали в виде препарата "Рифотироина", (Институт Органического Синтеза, Латвия). Применяли субстанцию ТРГ, используемую для приготовления лекарственной формы с маннитом. Контрольные опыты с маннитом были проведены ранее К.Аббасовой и Е-Я.Турбовской (1992). ТРГ вводили интраназально в объеме не более 5 мкл в одну ноздрю в ультрамалых дозах : 10 М., 10 М., 10 М.

ТРГ вводили за 10 минут до введения эпилептогена. Контрольные животные получали в том же объеме интраназалыю физиологический раствор. Кассинин (КСН) был синтезирован OA. Кауровым и М.П.Смирновой ( Институт Особо Чистых Препаратов, Санкт-Петербург).

Спинномозговая жидкость (СМЖ) человека передавалась из Отделения нейрохирургии детского возраста (Руководитель докт.мед.наук С .Л. Я пук) Российского Научно - Исследовательского Института Нейрохирургии им. проф. А.Л.Поленова (Директор проф. В.П.Берснев(СанктПетербуог), СМЖ получали по медицинским показаниям у детей, находившихся на консервативном и нейрохирургическом лечении.

Ликвор через канюлю вводили в боковой желудочек мозга (по методу Paxinos, Watson, 1982) с использованием координат по Я.Бурешу и

соаат.(1962). Однократно СМЖ вводили в количестве 10 ыкл. Введение осуществляли за 10 минут до введения эпилептогена или в сочетании с внутрибрюшинным введением 1113. Введение проводили очень медленно на протяжении 2-х минут с помощью микрошприца фирмы Гамильтон.

Вживление электродов в структуры мозга, а также канюли для введения ликвора проводили под глубоким эфирным наркозом по стереотакснческим координатам : для коры: АР -1.0, Ь = 1.5, Н = 1.5; пшпокампа: АР +2.0. Ь = 1.0, Н = 3.3, канюли в латеральный жулудочек: АР 1.5, Ь = 1.0, Н = 3.5 (Буреш и др., 1962).

Использовали биполярные электроды из нихрома диаметром 250 мкм. в лаковой оболочке с расстоянием между кончиками 0,5 мм. Связь электродов с энцефалографом осуществлялась с помощью золоченых радиотехнических контактов. Суммарную ЭГ- активность коры и гиппокампа регистрировали не ранее чем через двое суток после операции в условиях свободного поведения с помощью 4-х канального электроэнцефалографа ЭЭГ-ПИ - 02 (Львов). Морфологический контроль локализации кончиков электродов проводили под глубоким эфирным наркозом. Серийные срезы приготавливали на замораживающем микротоме.

Выполненные серии экспериментов

количество животных

I. Анализ судорожной активности при введении ПТЗ 15

II. Наблюдения за поведением после введений ликвора 5

III. Исследование противосудорожного действия

тиролиберина ТРГ опьгт/контроль 53/52

IV. Исследование противосудорожного действия ликвора

поведенческие (СМЖ)/контролъ 25/25

электрофизнологическне(СМЖ)/контроль 10/ 4

V. Эффект комбинированного действия ликвора и

карбамазепина (КБЗ+СМЖ) опыт 4

VI Исследование эффектов ликвора и тиролиберина

на модели кобальтовой эпилепсии 26

VII Исследование эффектов кассинина

поведенческие КСН/контроль 24/25

электрофизиологические КСН/контроль 10/ 4 VIII.Исследование эффектов карбамазепина

поведенческие 20

электрофнзиологичесхие 2

Всего: 221

Статистический анализ результатов проводили по критерию Вилкоксона и Колмогорова-Смирнова. Использовали также стандартные программы статистического анализа для 1ВМ (критерий Фишера и Стьюдента).

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Влияние тиролиберина (ТРГ) на судорожную активность мозга у крыс.

Влияние ТРГ на формирование и развитие судорожной активности у крыс, вызванной пентилентетразолом было исследовано при следующих условиях: нейропептид вводилися интраназально, чем достигалась эффективность его центрального действия в ультра малых дозах. ТРГ вводили за 10 минут до введения эпилептогена, с учетом его максимального накопления в крови.

Совокупность показателей • латентный период припадка, выраженность судорожного ответа по поведенческим тестам и по ЭГ- активности коры и гиппокампа, количество крыс в экспериментальной группе . у которых судорожный порог повышался по сравнению с таковым в контрольной группе - служила достоверным критерием прстивосудорожного действия ТРГ. Контролем служили наблюдения в отдельной группе крыс, получавших ПТЗ три раза в дозе по 25 мг/кг. и данные по опытной группе за день до введения нейропептида.

100% крыс экспериментальной группы отвечали на ПТЗ судорожной активностью, а в контрольной - только 87%. На следующий день перед введением ПТЗ крысы опытной группы получали ТРГ интраназально и только 21,6% эти* крыс отвечали судорожным припадком на введение ПТЗ ( т.е. 4/5 были "защищены"). В контрольной группе на второй день применения ПТЗ все 100 % крыс отвечали судорожным припадком. Эта защита " сохранялась у крыс, получавших ТРГ, в 67% случаев и через сутки. Эти опта позволили сделать заключение о возможности с помощью ТРГ предотвращать развитие судорожного ответа мозга при введении эпилептогена.

Для крыс с относительно высоким судорожным порогом эффективность действия ТРГ определялась по изменению выраженности припадха. Для этой цели удобно сравнивать стадии судорожного ответа в баллах от 1 до 5 по шкале П.Мареша. В трех сериях опытов (п=107) сравнивали: сколько легких н тяжелых моторных припадков наблюдается в среднем в опытной группе крыс за период трехкратного введения ПТЗ до и после введения ТРГ, а также по сравнению с их числом в контрольной группе крыс, которая вместо ТРГ получала только

физиологический раствор или раствор маннита ( с которым готовится лекарственная форма ТРГ). Получены следующие результаты.

Достоверно увеличивалось время наступления припадка. Достоверно отличалось распределение структуры моторных припадков, определяемых по баллам шкалы Мареша. Опытная и контрольная группы крыс имели сходные судорожные пороги и на введение ПТЗ (трехкратное) отвечали в 11% случаев судорогой в 3 -балла, и 89% случаев - 4 балла (соответственно 6% н 88% о контрольной группе). Достоверные различия наблюдались между группами в день введения крысам опытной группы ннтраназально ТРГ в дозах 10 М., 10 М., 10 М. Только у 39% крыс развивалась судорога в 4-балла, у 44% крыс она была незначительной. Напротив, контрольные крысы в большинстве случаев (82%) отвечапли более вараженкыми клонико-тоническими судорогами в 5 баллов .

На третий день эксперимента судорожный приступ в 4 балла наблюдался в одинаковом числе случаев в контрольной (76,5%) и в опытней (75%) группах крыс. Но у крыс опытной группы, получавших ТРГ, никогда не развнзалась клоннко-тоннческая судорога (5 баллов), тогда как в контроле 19% крыс дали максимальную клонико-тсническую реакцию. Причем наблюдалась эта стадия с укороченным латентным периодом и при меньшей дробности дозы, т.е. не на третье, в на второе или даже первое введение ПТЗ.

Таким образом эти результаты показали, что в условиях видоизмененного фармакологического ПТЗ-киндлинга судорожная активность может быть бло ¡фована или предотвращена интраназальным введением ТРГ.

Исследование ЭГ-активности неокортекса коры лобной доли (фронтальный отдел) и сенсомоторонон коры, а также дорсального гиппокампа показало, что разработанная нами модификация экспериментально вызванного судорожного припадка характеризуется генерализованными реакциями в коре и пшпокамяе. Моторной судороги предшествует появление пиковой активности, пик-волновой активности, которая переходит в разряды последействия, а также веретена.

На ранних стадиях судрорбжные признаки ЭГ-активности развиваются в птяокампе. Торможение разрядов последействия в коре и гиппокмапе под' влиянием введения ТРГ является прогностическим признаком дальнейшего торможения или резкого ослабления моторной судорожной активности. Интересно отметить, что ТРГ, блокируя моторную судорогу можег перестраивать паттерн судорожной активности в коре, но при этом полностью их заблокировать не может.

Исследование противосудорожных свойств епкшюмозгозон жидкости

(больных эпилепсией) в условиях экспериментально вызванного судорожного припадка. Первоначально были проведены опыты на группе животных с целью выяснения возможного влияния СМЖ на спонтанную активность крыс,

которая отражала бы возникновение проэпнлептического статуса. Было показано, что ни процедура введения СМЖ, взятой у больных эпилепсией, ни сама СМЖ не вызывает судорожных последствий у крыс ни по поведению, ни по ЭГ-актизноети коры и гиппокампа.

Следующая серия опытов была проведена с целью исследовать возможность блокирования эпилептической активности у крыс, вызванной введением кобальта. Введение СМЖ крысам с вызванным введением кобальта судорожным статусом не привело к блокированию или предотвращению тяжелых эпилептиформных приступов. Удалось лишь увеличить продолжительность выживания животных н незначительное ослабление моторных припадков. Но в целом заключения о протизосудорожном влиянии СМЖ на вызванную кобальтом эпилепсию сделать не представляется возможным.

Основные результаты, подтверждающие блокирующий эффект СМЖ, получены В серии экспериментов, в которых в качестве эпнлептогена использовали ПТЗ, Причем сверхпороговая доза накапливалась постепенно в результате дробного введения препарата. Защитный эффект выявляли как по электрофизнологическнм показателям, так и по поведению животных в ответ на введение ПТЗ. Опыт длился всегда двое суток: в первый эксперментальный день вводили только ПТЗ. Число инъекций определялось выраженностью возникающего судорожного ответа. Если развивалась моторная судорога, оцениваемая баллами 4 или 5 и Б эг -активности развивались мощные продолжительные РПД введение ПТЗ прекращали. На следующие сутки за 15 мин до введения эпнлептогена животным внутрижелудочково вводили 10 мкл СМЖ. В некоторых случаях СМЖ вводили перед каждой инъекцией ПТЗ. Как правило, в первый экспериментальный день эпилептоген вводили 1 или максимум 2 раза, что приводило к развитию судорожного состояния. Блокирующий эффект СМЖ заключался в том, что при ее предварительном введении и после трехкратного введения ПТЗ эпилептиформная активность могла не развиваться или выраженность ее была значительно снижена: РПД, как правило, отсутствовали, резко снижалась частота пик-волн, резко снижалась и частота веретен. Защитный эффект проявлялся и по поведенческому тесту: на фоне введения СМЖ моторная судорога наступала с более длительным латентным периодом, оценивалась более

низким баллом, а при трехкратном введении СМЖ перед каждой инъекцией ПТЗ судорожная активность оценивалась баллом не выше 1.

hinreotecttveerrecrofcsf

гнои итюткм. а ш-d on пге m.¡xduced 180

jehlires w пи bat.

Рис. 1. Блокирование судорожной активности, вызванной пентилентетразолом (PTZI, PTZII, PTZIII) у дзух крыс с высоким судорожным порогом введением СМЖ больного эпилепсией (CSF). СМЖ вводится за 10 минут до первого введения зпилептогена и одновременно с каждым последующим. Приводятся: изменения частоты появления эпилептиформной активности в ЭГ-гиппскампа и выраженность судорожного припадка в баллах по шкале П.Мареша.

Врсхний ряд - контрольные дни с введением только ПТЗ , нижний - опытный день с введением CSF в дозе 10 мкл. Судорогкньш ответ практически отсутствует.

Влияние карбамазепина на судорожную активность у крыс, вызванную пентилентетразолом. Несмотря на то, что карбамазепин (КБЗ) в настоящее время является одним из наиболее распространенных средств при лечении эпилепсии, исследования его свойств продолжаются. Это связано, во-первых, с выявлением в крови его метаболитов, появляющихся в разные сроки после введения препарата и с открытием различных эффектов этих производных КБЗ. Во -вторых, идет поиск эндогенных пептидных субстанции, которые при сочетании их с КБЗ позволили бы снижать дозу вводимого лехарства.

Целью нашей работы было сравнить противосудорожные эффекты КБЗ в разные сроки после его введения и выяснить возможность сочетанного противосудорожного действия КБЗ и СМЖ.

В контрольных опытах было показано, что само введение карбамазепина и интраназально в дозе 10 мкг, и внутрибрюшннно в дозе 100 мкг не приводит ни к каким изменения ЭГ-активности гиппокампа и коры. В

экспериментах с использованием электрофизиологического метода регистрации ЭГ-активности мозга КБЗ вводили вместе с СМЖ. Во всех случаях показано блокирующее действие на эпилептическую активность у крыс, вызванную дробным введением ПТЗ, предварительного введения КБЗ и СМЖ: увеличивался латентный период развития судорожной активности при интраназальном введении КБЗ и отсутствовала эпилептиформная активность, если ПТЗ вводили после предварительной внутрибрюшинной инъекции КБЗ и внутрижелу-дочкового введения СМЖ.

Блокирующие эффекты многих препаратов были выявлены в опытах и без регистрации ЭГ-активности мозговых структур. Имеющиеся методики позволяют наблюдать за развитием эпилептического статуса по изменению поведения животного после введения эпилептогена и по развитию моторной судорожной активности. Существует ли корреляция между моторной и электрографически "выявляемой судорожной активностью? Мы провели наблюдение, которое позволило ответить на этот вопрос.С этой целью в период регистрации ЭГ-активности одновременно отмечали поведенческие проявления развития судорожного состояния. •

Эксперимент, как и во всех остальных случаях проводили в течение двух дней. В первый день вводили только ПТЗ и, как правило, уже после 1-ой, и тем более после 2-ой инъекций ПТЗ возникала судорожная активность, причем ее * выраженность в ЭГ-активности четко соответствовала судорожному состоянию крысы, оцениваемого по шкале Мареша: возникновение длительных РПД, в которых наблюдалась высокая частота пнк-волн, всегда приводило к моторной судороге в 4-5 балла. Такую же корреляцию мы наблюдали и на следующий день, когда ПТЗ вводили после предварительного внутрибрюшинного введения КБЗ. Отсутствие выраженной эпилептиформной активности по ЭГ-показателям соответствовало судорожному состояние, оцениваемому баллами 0.5-1. Таким образом, наблюдается отчетливое соответствие между степенью выраженности эпилептиформной активности, выявляемой по ЭГ коры и гиппокампа и уровнем судорожного состояния животного.

На отдельной группе животных было проведено исследование влияния КБЗ на моторную судорожную активность крыс (по шкале Мареша) при разных сроках его введения. КБЗ в одной и той же концентрации вводили во второй экспериментальный день, но в одном случае за 1 ч до введения ПТЗ, а в другом - за 4 ч. Таким образом, была сделана попытка выявить влияние не только самого КБЗ, но и его метаболитов, появляющихся в крови и достигающих максимума через 4ч. При введении КБЗ за один час до инъекции ПТЗ выявлен блокирующий эффект в 100% случаев: значительно удлинялся латентный период наступления судорожной активности и резко снижался балл судорожного состояния ( с 4-5 до 0.5-1). Защитный эффект в этом случае у некоторых крыс сохранялся и на следующие сутки. Введении КБЗ за 4 ч до введения эпнлептогена приводит к незначительному блокированию судорожной активности, что позволяет рекомендовать определенные сроки введения препарата при сочетании его с пептидами.

Влияние тахнкинннов (на примере кассинкна) при их системном введении па судорожную активность мозга крыс. Прежде чем исследовать противосудорожные эффекты кассинина, которые

первоначально были показаны в нашей лаборатории Н.П.Кабановой, мы провели специальное тестирование крыс в "открытом поле" с целью определения возможного влияния этого тахикннина на поведение животных. Достоверных различий поведения крыс опытной и контрольной групп не выявлено. Противосудорожные эффекты кассинина исследовали при системном введении в дозе от ЮОмкг. Как и в ранее описанных экспериментах, кассинин вводили во второй экспериментальный день за 10 мин до инъекции ПТЗ. Анализ ЭГ-активности коры и гиппокампа, регистрируемой в первый экспериментальный день, когда животным вводили только ПТЗ. и во второй экспериментальный день, когда ПТЗ вводили на фоне предварительного введения кассинина, убедительно указывает на полное блокирование эпнлептиформной активности, выражающейся в виде РПД, пик-волн и веретен. Проведены • исследования влияния кассинина и на моторную судорожную активность.

И в данном варианте экспериментов у всех крыс после введения кассинина ПТЗ вызывает резко ослабленную моторную судорожную активность (не более 2 баллов), а у многих крыс появляются лишь незначительные признаки судорожной готовности (0.5 балла). Таким образом, кассинин является протектором - пептидом с защитными свойствами в отношении развития судорожной активности. Его тормозное влияние развивается постепенно после введения, достигая максимума при 3-ем "предъявлении", то-есть с увеличением дозы эпнлептогена.

Касскнин - тахикииин, выделенный из кожи лягушки, его формула: АзрЛ/а!-Рго-Ьуз-Бег-Аф-СЬ-РЬеЛ^-^у-Ьеи-МеиГ^ТО. Характерной чертой действия кассинина при введении в организм теплокровного животного ' является его специфическое связывание с рецепторами СП в ЦНС теплокровных животных. Он находится в исключительно малых дозах в плазме крови крысы: от 0,84 до 0,95 мкг/л.(ТапаЬ, На*Ша, е1. а!., 1989). В работах В.М. Борзснкова (1992) показано, что кассинин при центральном действии не воспроизодит аффекты СП, обладая аналогичным противосудорожным действием. Наши опыты показали, что путь поиска новых антиэпилептических средств в пределах одного семейства тахнкининов может быть эффективным и тогда, когда исследуются пептиды позвоночных животных разных классов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Важнейшим фундаментальным исследованием в области природы судорожных процессов (и эпилепсии как заболевания в частности) является физиологическое объяснеь.е тех 20% случаев больных с полной резистентностью к медикаментозному лечению. Учитывая, что имеющиеся фармакологические средства былм созданы на основании результатов нейрохимических исследований процессов возбуждения и торможения нервной клетки , случаи резистентности можно рассматривать как феномен нарушения и внклеточного н внутриклеточного контроля за повшенной возбудмостью клетки. С другой стороны возможной причиной этого могут быть нарущения в обмене и секреции эндогенных регуляторов пептидной природы, которые сосуществуют с классическими медиатороамн и секретируются в ткани (и лнквор) как "защитные противоэпилептические средства" самого мозга. При этом допущении становится понятным, что успешная коррекция и нормализация процессов вероятнее всего достигается примененим регуляторных пептидов. «Поиск "щадящей фармакотерапии эпилептических больных" в этом нгаправлении оправдан также тем 6 что пептиды эндогенный регуляторы, их полифункциональность преполагает участие в одновременной нормализации нескольких процессов в деятельности мозга, его метаболизма и кровоснабжения.

В нашей работе показана возможность предотвращения развития судорожной активности с помощью нейропептидов : тиролиберина и кассинина. При интраназальном введении в ультра малых дозах тиролиберин повышает судорожный порог, полностью либо частично блокируя проявление моторной судороги.

Более эффективным является системное (внтурибрюшинное ) введение кассинина ( тахикнннна не-млекопитающих, который специфически связывается С СП-рецепторами), в дозах от ЮОмкг, при которых кассинин не оказывает значительного влияния на поведение по тесту открытого поля. Оба пептида различно регулируют развитие й проявление электрических паттернов судорожной активности: под их влиянием наблюдается диссоциация в блокировании пик-волновон активности, разрядов последействия (РПД) и судорожных веретен.

В обеих серях опытов получены данные, позволяющие прийти к заключению, что при данной модели вызывания судорожной активности с помощью ПТЗ наиболее манифестными являются поведенческие признаки, а о протнвосудорожной действии можно судить не только по порогу и дозе эпилептогена, вызвающего моторные припадки, ио и по изменению структуры самого припадка, по изменения также структуры и характера в гиппокампе локальных или генерализованных электрофизиологнческнх признаков судорожного синдрома. Единичные случаи применения ТРГ в клинике эпилепсии (Япония), указывают на перспективность разработки дальнейшего применения пептидов. В нашей работе уточняются пути введения ТРГ и дастся обоснование для его применения в дозах соизмеримыми с теми, в которых пептид существует в мозговой ткани и ликворе.

Применение СМЖ больных эпилепсией основано на экспериментальных данных о появлении в СМЖ животных, перенесших длительные судорожные припадки, "защитных противосудорожных веществ" пептидной природы и на соответствующем поиске пептидной фракции, ответственной за такое противосудорожное свойство ликвора (Кгугапоуэку е1 а!., ,1989). Есть основания предполагать, что она состоит из опнатных пептидов. Однако известнго, что последние в больших концентрациях могут провоцировать судорожный ответ, а в малых выступать в качестве защиты. Известно также, что эпилептический приступ вызывает эксперссию гена - прешественннка проэнкефалина и протахикининов в нейронах коры и других отделах мозга, поэтому особенно важна роль концентрации вводимого пептида с целью предотвратить развитие эпилептической активности.

Как при экзогенном введении пептидов, так и при ликворотерапии эффективные дозы и концентрации вводимых нами веществ так малы, что, повидимому, физиологическим механизмом их действия следует считать запуск

антиэпилептической системы мозга (Крыжановский, Шандра и др., 1992). Именно при полифункциональном действии пептидов в организме, за счет их связывавния с различными, а не только с опнатными рецепторами, возможно их комбинированное применение при лечении эпилепсии с другими лекарственными препаратами (карбемазепином, вольпраатом и другими).

Исследование карбамазепина, общепринятого средства для лечения парциальной, генерализованной, височной форм эпилепсии, а также некоторых психиатрических заболеваний показало, что его применение в малых дозах (интраназально) может . влиять на латентные периоды моторной реакции эпилептического синдрома, а системное (внутрибрюшинно) введение вызывает полную блокаду моторного припадка. Сочетанное действие карбамазепина и СМЖ не облегчается и не окклюзируется. Максимальный . эффект карбамазепина связан с его накоплением в крови и он не отмечается, если действие эпилептогена (в нашем случае - ПТЗ) приходится на период действия его метаболита.

ВЫВОДЫ

1. Тиролиберин при интраназальном введении в ультра малых дозах (10 М.) предотвращает развитие у крыс судорожной моторной активности, вызываемой внутрибрюшинным введением пентилентетразола. Тиролиберин при • этом пути введения ослабляет проявление генерализованной судорожной активности гиппокампа и некортекса, но не полностью снимает электрофизиологические корреляты эпилептического судорожного синдрома.

2. Кассинин (тахикинин) при системном в1ггурибрюшинном введении в дозе от 100 мкг блокирует развитие припадков, вызываемых пентилентетразолом, как малых, клонического типа, так н больших, клонико-тонического типа с нарушением выпрямительных рефлексов. Кассинин при исследованных дозах полностью блокирует пик-волновую активность и разряды последействия, но не всегда снимает возникновение судорожных веретен в ЭГ коры и гиппокампа.

3. Спинномозговая жидкость детей, больных медикаментозно-резистентными формами эпиелпсии с прогредиентным течением, проявляет при введении крысам, в латеральный желудочек мозга противосудорожное действие. При многократном введении (до 7 дней) это свойство СМЖ проявляется в повышении судорожного

порога. При ведении до пентнлентетраэола СМЖ значительно увеличивает латентный период всех стадий эпилептического синдрома.

СМЖ, ослабляя веретена в ЭГ-активности, полностью блокирует развитие пик-волновой активности в коре и гиппокампс на первое введение ПТЗ, вследствие чего электнрофизиологнчекие проявления судорожного синдрома проявляются при более высоких дозах ПТЗ.

4. Сочетанное введения СМЖ и карбамазепина (внутрибрюшинно) блокирует проявление моторной компоненты эпилептического синдрома. Показана возможность применения карбамазепина в значительно меньших дозах, по сравнению с рекомендуемыми в клинике, при его сочетании с внутрижелудочковым введением СМЖ.

Aknowlegments:

Приношу большую благодарность заведующему кафедрой академику И.П.Ашмарнну за внимание и поддержку нашей работы.

Благодарю доктора медицинских наук С.Л. Яцука за консультации по клиннке ■эпилепсии и предоставленную возможность исследовать ликвор эпилептических больных.

Сердечно благодарю доцента Н.Е.Чепурнову за соруководство моим исследованием и помощь в подготовке диссертации к защите. Благодарю также Кенуль Аббасову и Э.Я.Турбовскую за помощь и сотрудничество в работе.

Мы выражаем благодарность профессору Карлова Университета в Праге доктору мед. паук Павлу Марешу за предоставленный нам пентилентетразол, тестированный в исследованиях его лаборатории.

Мы благодарим фирму "Gerot Pharmazeutika", (Wien) за предоставленные нам препараты карабамазепнна "Timonil-retard" и "Nootop". Мы выражаем свою благодарность лично господину Д-ру Вальтеру Мерцу (Dr. Walter Merz ) за рекомендации и возможность работать над расширением дальнейшего применения этих препаратов.

Публикации по теме диссертации:

1. CHepumov S.A., Chepumova N.E., Obukhova M.F., Abbasova K.R., C.Prahlad Chandra Kumar, Ashmarin I.P. Imunization against the antidepressant inkazan. inhibits corasol and cobalt-induced seizures in the amygdala.//"Focus on Epilepsy". Cellular mechanism s and pharmacological approaches". International Symposium. Hotel Le Chantecler, Ste-Adele, QC. August 10-12,1991. Abstracts, p.15

2. Kreja I., Kasafirek E., Chepumova N.E., Lim T.M., C. Prachlad Chandra Kumar, Chepurnov S.A The pharmacology of "alaptid" - new analog of MIF.//"Neuropharmacology on the Boundary of two Centures". International Conference dedicated to the 100 anniversary of S.A-Anichkov's birthday. 6-8 October, 1992. Saint-Petersburg. Abstracts. Part I. p.102.

3. Chepumova N.E., Kabanova N.P., C. Prahlad Chandra Kumar, Tadepalli Vakula, Abbasova Kenul Rasim, Chepurnov S.A., Ashmarin I.P. Normalization of peripheral vegetative reflexes by neurokinin and kassinin during motor seizures and the preven .on of seizures by neuropeptides.// Abstracts from The 20th International Epilepsy Congress, July 3-8, 1993. Oslo, Norway.- Epilepsia. Vol 34, Supplement. 2. 1993, p. 51.

4. Chepurnov SA., Chepumova N.E., Prahlad Chandra Kumar, Abbasova K.R.-kyzy, Turbovskaya E. Ja., Ashmarin I.P. Thyrotropin releasing hormone (TRH) in ultra low doses decreases convulsion threshold in the rats.//In: International Congress on Ultra Low Doses. 30 September, 1993, Bordeaux, France 1993, p.

5. Chepurnov S.A, Chepumova N.E., Abbasova Konul, C.Prahlad Chandra Kumar, Jin Kiu Park. Cognitive functions and carbamazepine in experimental epilepsy.//1993 Meeting of The European Federation of Neurological Societies , Berlin, December 8-11,1993, Abstr. p.

6. C.Prahlad Chandra Kyumar, Chepurnov SA., Chepumova N.E., Kabanova N.P. Comparison of the different effects of the tachikinin family peptides (SP, neurokinin A, kassinin, galanin) on the electrocutaneous resistance during experimental epilepsy.// XVI International Congress of Biochemistry & Molecular Biology, New Delhi. India - in press.

Topic

NEUROPEPTIDE REGULATION (KASSININ TRH) SEIZURE ACTIVITY (ELECTROPHYSIOLOGICAL AND BEHAVIORAL

STUDIES)

NAME: C. PRAHLAD CHANDRA KUMAR

Conclusion.

1. Intranasal application of ahjrotropic releasing Hormone TRH in ultra low doses suppresses the motor seizure activity induced by PTZ.

TRH application suppresses the generalized seizure activity in EEG hippocampus and neocortex. But it does not completely suppress the electrophysiological correlates of the epileptic seizure syndrome.

2. I.P. administration of kassinin at the dose - 100 "mkg resulted in suppression of motorseizures induced by PTZ. Kassinin completely suppresses the cpike-wave activity and afterdischarges in the cortex and hippocampus, but do not suppress the spindles.

3. I.C.V. of CSF obtained from the epileptic children, significantly increases the latent period in all the stages of the epileptic syndrome. While suppressing the spindle expression completely suppresses the afterdischarges induced by PTZ in the cortex and hippocampus.

4. I.P. administration of CBZ 1 hour before the application of PTZ significantly increases the latent period and suppresses different types of seizure activity. It has

BHHHHMT