Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генетической структуры популяций двустворчатого моллюска DREISSENA POLYMORPНA водоема-охладителя Чернобыльской АЭС

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетической структуры популяций двустворчатого моллюска DREISSENA POLYMORPНA водоема-охладителя Чернобыльской АЭС"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н.И.Вавилова

РГ6 од

О фрЙ На правах рукописи

УДК: 575.174.4

СЛИПЧЕНКО ТАМАРА СТАНИСЛАВОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИЙ ДВУСТВОРЧАТОГО МОЛЛЮСКА !)КЕ155ЕКЛ РОЬУМОЯРНА ВОДОЕМА-ОХЛАДИТЕЛЯ ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ АЭС

Специальность 03.00.15 Генетика

Автореферат диссертации на соискание у ченой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Робота выполнена в лаборатории эколого-гснетического мониториш Института обшей генетики им. Вавилова РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор В. А. Шевченко ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук В.М. Захаров

кандидат биологических наук Б. А. Калабушкин

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

кафедра генетики и селекции Биологического факультета Московски Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится "_"_____ 1998 г. в _ часов I

заседании специали зированного Ученого совета Д002.49.01 в Институте обще генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 117809 Москва. В-333. у Губкина. 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Автореферат разослан "_" 1998 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Г.Н. Полу хина

Актуальность темы: Изучение популяционной структуры того или иного вида гидробионтов позволяет оценить уровень воздействия загрязнения на фауну водоема и, в какой-то степени, прогнозировать возможные изменения в природных популяциях при аварийной ситуации.

Использование метода электрофореза белков, как генетических маркеров, позволяет получить представление о структуре популяций, внутри- и межпопуляционной изменчивости, а также о связи аллельных частот с экологическими факторами (Левонтин, 1978).

Популяционно-генетический подход предполагает сопоставление результатов электрофоретических исследований белкового полиморфизма с изменчивостью по количественным и качественным признакам (Животовский, 1991).

Необходимость изучения количественных признаков объясняется тем, что, во-первых, большинство важных с разных точек зрения морфологии и физиологии признаков являются количественными, во-вторых, они являются индикаторами среды, в-третьих, за ними может стоять большое число генов, представляющих иную часть генома, чем изученные методом электрофореза локусы, в-четвертых, именно количественные признаки чаще всего связаны с адаптивными свойствами организма (Животовский, 1991).

В условиях возрастающего антропогенного загрязнения водных экосистем изучение воздействия на природные популяции как отдельных факторов, так и совместного нескольких, становится особенно актуальным.

После аварии на Чернобыльской АЭС в водоеме - охладителе возникло уникальное сочетание двух факторов: радиоактивного и теплового загрязнения. Водоем-охладитель уже на протяжении' белее десяти лет является своеобразным полигоном для изучения природных популяций гидробионтов, обитающих в условиях экологического стресса.

Цели и задачи исследования: Настоящяя работа посвящена изучению совместного действия радиоактивного и теплового загрязнения на генетическую структуру природных популяций двустворчатого моллюска £)гешеяа ро1утогрИа из водоемов зоны ЧАЭС, на основе анализа изменчивости качественных и количественных признаков. Основные задачи исследования:

1. Оценить изменчивость качественных (изозимная изменчивость и изменчивость по окраске раковины) и количественных (размеры раковины) признаков в условиях теплового и радиоактивного загрязнения.

2. Оценить роль экологических факторов в генетической дифференциации популяций.

3. Выявить особенности генетической структуры популяций в стрессовых условиях теплой части водоема-охладителя.

4. Изучить сопряженную изменчивость количественных и качественных признаков в разных экологических условиях.

Научная новизна: Впервые проведено популяционно-генетическое исследование природных популяций дрейссены, обитающих в водоеме-охладителе ЧАЭС. Исследования начаты через три года после аварии, изменения в генетической структуре популяций наблюдались в течение двух лет.

Показано, что тепловое загрязнения в водоеме-охладителе ЧАЭС вызывает увеличение морфологической и генетической и изменчивости и индуцирует направленный сдвиг аллельных частот в сторону увеличения частоты наиболее распространенного аллеля.

Радиоактивное загрязнение в рассматриваемых пределах не оказывает заметного влияния на генетическую структуру популяций.

Показано, что в популяциях дрейссены, обитающих в стрессовых условиях теплой части водоема-охладителя, наблюдается увеличение морфологической изменчивости с увеличением гетерозиготности.

Практическое значение работы: Полученные результаты могут быть использованы для решения проблем, связанных с прогнозированием изменений в структуре природных популяций гидробионтов в условиях экологического стресса.

Полученные данные позволяют рекомендовать дрейссену в качестве природного тест-объекта для эколого-генетического мониторинга водоемов предприятий атомной промышленности.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 108 страницах и состоит из введения, четырех глав, выводов, включает 11 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 139 наименований, в том числе 34 на русском языке.

Апробация работы: результаты исследований были представлены на конференции молодых ученых Института общей генетики им. Н.И.Вавилова (Москва, 1990), на I международной конференции "Биологические и радиоэкологические последствия аварии на Чернобыльской атомной станции" (Зеленый мыс, 1990), на межлабораторных семинарах по проблемам генетической безопасности Института общей генетики им. Н.И.Вавилова (Москва, 1994, 1998).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Объект исследования: Dreissena polymorpha (Pall.) (Bivalvia, Dreissenidae) является характерным представителем бентоса проточных водоемов европейской части страны, в том числе водоемов-охладителей тепловых и атомных электростанций. Ведет прикрепленный образ жизни, активный фильтратор. Дрейссены раздельнополы. В жизненном цикле имеется стадия планктонной личинки, что создает, при наличии свободноплавающих сперматозоидов в период размножения, высокие возможности для панмиксии популяций.

В водоеме-охладителе ЧАЭС, состоящем из теплой и холодной частей, на глубине около одного метра были собраны моллюски из пяти популяций. Схема отбора популяций в водоеме-охладителе показана на Риунке 1. Теплая и холодная части водоема разделены 8-км дамбой. В теплой части температура воды не опускается ниже 18 °С, а в холодной сохраняется естественная температура. Из теплой и холодной частей водоема весной 1989 г. были взяты популяции "теплая"-(ТЕП) и "холодная"-(ХОЛ). Расстояние по прямой через дамбу между ними около 20 м. На расстоянии 1 км, 3 км и 5 км от популяции ТЕП были отобраны моллюски из популяций (1КМ, ЗКМ и 5КМ). Популяции Зкм и 5км были собраны осенью, после аварийного сброса горячей воды, в результате которого произошла массовая гибель животных в популяциях ТЕП и 1КМ.

¿одохаЗе/3

Рис 1. Схема отбора популяций в водоеме-охладителе ЧАЭС: 1-"холодная", 2-"теплая", 3-"1КМ", 4-"ЗКМ'\ 5-"5КМ".

Радиоактивное загрязнение в местах отбора проб в водоеме было одинаковым и составило около 10"8-10"9 Ci/1 для воды и 10"6- 10"8 Ci/kg для придонных отложений.

Из реки Припять, к бассейну которой относится водоем-охладитель, на 12 км ниже по течению от водоема, взята популяция РЕКА. Радиоактивное загрязнение в реке на два порядка ниже, чем в водоеме. В северной части Киевского водохранилища была собрана популяция "водохранилище" -(ВДХ). Расстояние от водоема до ВДХ по прямой около 50 км. Популяции РЕКА и ВДХ были взяты как контрольные. Весной 1990 года был проведен повторный отбор проб из популяций ТЕП90, ХОЛ90, РЕКА90, 1км90. Всего было проанализировано около 1500 особей в 11 популяциях. Термин "популяции" в данном случае применен условно, т. к. водоем-охладитель, Припять и водохранилище связаны в единую водную систему, и личинки дрейссены хорошо перемешиваются.

Методы исследования: животных замораживали в лабораторных условиях при -20 °С. Мягкие ткани каждого животного гомогенизировали в 30% растворе сахарозы и центрифугировали при 10,000 об./мин. в течение 10 минут. Изоферментный анализ проводили с помощью электрофореза в ПААГ. Электрофорез проводили в вертикальной камере, в полиакриламид-ном гелевом блоке на 16-27 образцов, в системе трис-борат-ЭДТА при рН=8.3. Для гистохимического окрашивания белков использовали общепринятые методы (Shaw, Prasad, 1970; Корочкин и др., 1978).

Были проанализированы четыре ферментные системы (пять полиморфных локусов), отобранные в предыдущих исследованиях (Шевченко, Фетисов, 1989): эстераза-Д (локус Est-D), ацетилэстераза (локус Est), лейцинаминопептидаза (локусы Lap-1, Lap-2) и малик энзим (НАДФ+-зависимая малатдегидрогеназа) (локус Me).

Фенотипы Lap-1, Lap-2 и Est были однополосными для гомозигот и двуполосными для гетерозигот, что отражает мономерную структуру этих

белков. Фенотипы Me и Est-D выглядели однополосными для гомозигот и трехполосными для гетерозигот, что свидетельствует о димерной структуре соответствующих белков.

Был проведен морфометрический анализ раковины. У моллюсков измеряли длину (L), ширину (W) и высоту (Н) раковины и вычисляли два относительных показателя, характеризующих вытянутость (IW = W/L) и выпуклость раковины (Щ = H/L).

В зависимости от типа окраски раковины были условно выделены четыре морфы: к первой относили моллюсков с равномерно темной раковиной, ко второй - с концентрически полосатой, к третьей - с пестрой, к четвертой - почти с белой окраской.

Исходные данные, содержащие индивидуальные генотипы по пяти локусам, были обработаны с помощью пакета BIOSYS-1 (Swofford, Selander, 1981) для вычисления следующих популяционно-генетических характеристик: аллельных частот в каждой популяции; среднего числа аллелей на локус; F-статистик Райта (Wright, 1978); средних наблюдаемой (Но) и ожидаемой (Не) гетерозиготностей на локус с поправкой на малую численность (Nei, 1978); однолокусных и многолокусных коэффициентов генетического сходства Нею (Nei, 1978). Разделение общей изменчивости на меж- и внутригрупповые компоненты проводили с помощью показателя Gst.

Стандартную статистическую обработку данных проводили с помощью пакета SYSTAT. Процедуру неметрического многомерного шкалирования (Справочник по прикладной статистике, 1990) с использованием матриц генетических расстояний проводили с помощью пакета NTSYS.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Анализ генетической структуры популяций.

1.1. Анализ аллельных частот.

Все изученные локусы являются полиморфными, и аллели обозначены согласно их относительной электрофоретической подвижности (подвижность самого быстрого аллеля принята за 100). Частоты аллелей, среднее число аллелей на локус и результаты теста yj на гетерогенность аллельных частот в популяциях Dr. polymorpha приведены в Таблицах 1 и 2. АЦЕТИЛЭСТЕРАЗА: при анализе было выявлено по меньшей мере три зоны электрофоретической активности, но удалось прочитать только быстрый локус Est с двумя общими для всех популяций аллелями Est-92 и Est-88, и двумя редкими аллелями Est-100 и Est-76, идентифицированными в ТЕП и во всех популяциях 1990 года.

ЭСТЕРАЗА-D: было выявлено две зоны активности. Быстрый локус мономор-фен во всех популяциях, а медленный локус Est-D представлен пятью общими для всех популяций аллелями (Est-D-93, Est-D-85, Est-D-77, Est-D-70, Est-D-63), и четырьмя редкими аллелями ( Est-100, Est-D-55, Est D-48 и Est-D-41). Медленный аллель Est-D-41 обнаружен только в популяции 5км. ЛЕЙЦННАМИНОПЕПТИДАЗА: выявлено две зоны активности, относящиеся к разным локусам. Быстрый локус Lap-1 выявил пять общих для всех популяций аллелей (Lap-1-98, Lap-1-94, Lap-1-90, Lap-1-87, Lap-1-84) и два редких аллеля (Lap-1-100, Lap-1-80), первый из которых найден в популяциях 1км и 5км, а второй - в "холодных" популяциях ВДХ, ХОЛ, РЕКА и ТЕП90.

Четыре общих для всех популяций аллеля было определено для медленного локуса Lap-2 (Lap-2-100, Lap-2-96, Lap-2-92, Lap-2-88), и один редкий аллель Lap-2-84, обнаруженный в популяции 1км и во всех популяциях 1990 года, кроме 1км.

Таблица 1. Частоты аллелей пяти локусов в семи популяциях £)г. ро1утогр!ш 1989 года .

Локус аллели Популяцпи

ТЕП вдх РЕКА хол 3 КМ 5 КМ 1 КМ Р

ЕЛ (14) 163 из 114 89 115 111 123 **

ЕвЫОО .006 .ООО .ООО .ООО ООО .000 .000 х2 =41.15

.684 .580 .697 .584 .726 .694 .589

Ез1-88 .304 .420 .303 .416 .274 .306 .411 Р=0.00145

Е$1-76 .006 .000 .000 .000 .000 .000 ООО

ЕзЮ (N) 167 120 118 126 155 119 157 ***

ЕвЮ-ЮО .009 .008 .017 .000 .003 .000 .003 X2 =211.456

Е5ЬО-93 .137 ,162 .179 .115 .129 .155 .178 ОР=48

ЕБ1-0-85 .063 .100 .129 .194 .055 .025 .038 Р=0.00000

ЕзЮ-77 .193 .329 .283 .345 .197 .218 .201

Е51-Э-70 .128 .104 .125 .151 .142 .122 .124

Еэ^О-бЗ .438 .292 .250 .194 .429 .466 .446

Ея1-0-55 .018 .000 .008 .ООО .019 .004 .010

Ея-0-48 .015 .004 .008 .000 .026 .000 .000

Е$1-0-41 .ООО ООО .000 .000 .000 .008 .000

МЕ (14) 73 112 81 132 136 108 149 ***

МЕ-100 .171 .156 .123 .311 .224 .255 .268 х2 =220.103

Ме-91 .253 .147 .154 .178 .129 .162 .302 01=42

Ме-83 .260 .263 .241 .148 .213 .116 .235 Р=0.00000

Ме-74 .185 .210 .148 .174 .165 .093 .151

Ме-65 .123 .223 .333 .189 .235 .356 .044

Ме-57 .007 .000 .000 .000 .000 ООО .000

Ме-48 ООО .000 .000 .ООО .018 .019 .000

Ме-40 ООО .000 .000 .000 .015 .000 .000

Ьар-1 (N) 166 121 118 126 150 118 96 ***

Ьар-1-100 .ООО .000 .000 .000 .000 .004 .005 г =231.688

Lap-l-98 .069 .091 .102 .115 .130 .106 .120 БР=36

Ьар-1-94 .196 .293 .203 .278 .263 .169 .302 Р=0.00000

Ьар-1-90 .380 .500 .403 .496 .503 .581 .490

Ьар-1-87 .223 .095 .250 .103 .090 .136 .083

Ьар-1-84 .133 .012 .030 .004 .013 .004 .ООО

Ьар-1-80 .000 .008 .013 .004 .000 .000 .ООО

Ьар-2 (14) 111 118 118 85 137 117 97 ***

Ьар-2-Ю0 .405 .258 .195 .353 .369 .496 .309 X2 =114.757

Ьар-2-96 .369 .424 .347 .282 .332 .274 .474 ое=24

Ьар-2-92 .198 .301 .352 .294 .234 .197 .175 Р=0.00000

Ьар-2-88 .027 .017 .106 .071 .066 .034 .036

Ьар-2-84 ООО .000 .000 .000 .000 .000 .005

N5(9) 5.4 4.8 5.0 4.4 5.2 5.0 4.8

БЕ (0.7) (0.9) (1-0) (0.7) 0.1) (0.9) (0.8)

N4(3) 5.3 4.8 5.0 4.3 4.8 4.8 4.8

БЕ (0.9) (1.1) (1.3) (0.9) (1.3) (1.1) (1.0)

Таблица 2. Частоты аллелей четырех полиморфных локусов в четырех популяциях Иг. ро1утогр1ш 1990 года .

Ло!СуС Аллели Популяции

ТЕП 90 ХОЛЗО PEKA90 ХОЛЭО

Est (N) 158 115 118 134 ***

Est-100 .003 .000 .008 .004 X2 =32.425

Est-92 .690 .633 .619 .713 Df=9

Est-88 .304 .300 .373 .280 P=0.00017

Est-76 .003 .067 .000 .004

Est-D (N) 159 118 147 141 ***

Est-D-100 .009 .004 .020 .032 y2 =60.872

Est-D-93 .135 .140 .197 .160 Df=21

Est-D-85 .041 .072 .054 .057 P=0.00001

Est-D-77 .201 .318 .197 .213

Est-D-70 .138 .123 .088 .121

Est-D-63 .440 .343 .422 .408

Est-D-55 .028 .000 .000 .000

Est-D-48 .006 .000 .020 .011

Lap-1 (N) 157 120 139 139 **

Lap-1-100 .000 .000 .000 .000 y2 =35.148

Lap-1-98 .092 .092 .140 .129 Df=15

Lap-1-94 .188 .171 .205 .212 P=0.00234

Lap-1-90 .631 .542 .532 .550

Lap-1-87 .086 .162 .112 .104

Lap-1-84 .000 .033 .011 .004

Lap-1-80 .003 .000 .000 .000

Lap-2 (N) 113 118 137 138 ***

Lap-2-100 .385 .352 .442 .417 X2 =114.757

Lap-2-96 .261 .381 .288 .293 Df=24

Lap-2-92 .323 .246 .245 .290 P=0.00000

Lap-2-88 .031 .021 .026 .000

Nía) 5.3 4.5 4.8 4.8

SE (0.9) (0.6) (0.9) (0.9)

N - размер выборки; N(a) - среднее число аллелей на локус

Р - результаты теста хи-квадрат на гетерогенность аллельных частот:

(*) -0.01 <Р <0.05; (**) - 0.001<Р< 0.01 ; (***) - Р<0.001

Df - число степеней свободы.

МАЛИК ЭНЗИМ: для Ме выявлено пять общих для всех популяций аллелей (Ме-100, Ме-91, Ме-83, Ме-74, Ме-65), и три редких аллеля (Ме-57, Ме-48, Ме-40), выявленных в трех "теплых" популяциях ТЕП, Зкм, 1км. В популяциях 1990 года малик-энзим не анализировали.

Тест выявил пространственную гетерогенность аллельных частот как между популяциями 1989 года (Р=0.0000, В.¥.=126, х2 =599), так и между популяциями 1990 года (Р=0.0000, О.Р.=54, у} =149). Суммарный тест X2 на гетерогенность выявил достоверные (Р=0.00000, О.Р.=2Ю, =936), различия всех одиннадцати изученных популяций по частотам аллелей всех локусов.

Анализ аллельных частот показал, что, в группе "теплых" популяций (ТЕП, ТЕП90, 1км, 1км90, Зкм, 5км) по сравнению "холодными" (ХОЛ, ХОЛ90, РЕКА, РЕКА90, ВДХ) наблюдается увеличение среднего числа аллелей на локус (5.1 и 4.7 в 1989г. и 5.05 и 4.65 в 1990г. соответственно), что свидетельствует об увеличении генетической изменчивости под действием теплового загрязнения. Как в 1989, так и в 1990 году наибольшее среднее число аллелей на локус наблюдалось в популяции "теплая"-ТЕП (5,4), а наименьшее - в в популяции "холодная"ХОЛ (4,4).

НРА

0,7

0,5

0,:

О,

Ьар2-100

ТЕП

Ме-100

Рис. 2. Частоты наиболее распространенных аллелей (НРА) в теплых и холодных популяциях Эг. ро1утотрка.

Для выяснения вопроса об изменении распределения аллельных частот в условиях теплового загрязнения была посчитана F-статистика отдельно для группы "теплых" и группы "холодных" популяций.

Анализ результатов F-статистики показал, что по всем изученным локусам в "теплых" популяциях наблюдается тенденция увеличения частоты наиболее распространенного аллеля (HPА), которая является статистически достоверной (Р<0,05) для локусов Est-D и Lap-2 (Рис.2).

Вероятно, увеличение частоты определенных аллелей каким-либо образом отражает их адаптивную ценность в стресовых условиях.

1.2. Анализ частот генотипов.

Одной из характерных особенностей генетической структуры природных популяций двустворчатых моллюсков является дефицит гетерозигот.

Статистически значимый дефицит гетерозигот найден практически во всех популяциях для локусов - Est-D (кроме 5км) , Lap-2 (кроме 1км) и Me.

По локусу Lap-1 значимый дефицит гетерозигот обнаружен в трех популяциях - 5км (Р< 0.001), РЕКА90 и 1км90 (Р<0.01).

По локусу Est достоверный избыток гетерозигот обнаружен в четырех популяциях ХОД (Р<0.001), ВДХ, 1км и 1км90 (Р<0.01).

Отклонение эмпирических частот генотипов от теоретических широко используется в популяционной генетике как косвенное доказательство действия сил отбора (Levontin, 1974; Koehn et al., 1976). Такой подход требует многолокусного сравнения. Отклонение по нескольким локусам можно объяснить действием отбора, а отклонение по всем локусам, скорее всего, связано с неселективными силами (Gartwaite, 1986).

В Таблице 3 представлены результаты суммарной F-статистики для группы "теплых", группы "холодных" и объединенной выборки всех популяций. F-статистика позволяет оценить степень дифференциации по частотам аллелей (индекс F(ST) , а также отклонение частот генотипов от равновесия Харди-Вайнберга для каждого локуса (индекс фиксации F(IS)).

Положительные значения Р(18) свидетельствуют о дефиците, а отрицательные - об избытке гетерозигот.

Из результатов анализа суммарной Р-статистики следует, что наибольшая дифференциация популяций по частотам аллелей наблюдается по локусам Ме (Р(8Т)=0.021) Ьар-2 (Р(5Т)=0.021) и Еэ1-0 (Т(5Т)=0.019).

Эти же локусы характеризуются значительными отклонениями частот генотипов от распределения Харди-Вайнберга в сторону дефицита гетерозигот (Р(К)=0.305 для Ьар-2, Р(18)=0.163 для МЕ, Р(К)=0.118 для ЕбШ).

Анализ результатов Р-статистики выявил уменьшение уровня дефицита гетерозигот в теплых популяциях, по сравнению с холодными, по локусам ЕбЬЭ и Еар-2.

Таблица 3. Суммарная Р-статистика по всем локусам.

локус ПОПУЛЯЦИИ

холодные теплые все популяции

Р(5Т) Р(8Т) ^В) Р(ЭТ)

Еб! -.230 .011 -.074 .009 -.149 .013

ЕзЮ* .156 .016 .085 .002 .118 .019

Ьар-1 -.014 .013 .036 .021 .013 .018

Ьар-2* .367 .019 .251 .017 .305 .021

МЕ .165 .230 .163 .021

среднее .097 .015 .089 .012 .093 .018

Р(15) - индекс фиксации Ранта. Описывает внутрнпопуляииокные отклонения частот генотипов от распределения Харди-Вайнберга.

Р(5Т) - стандартизированная дисперсия аллсльных частот между попу ляциями. Характеризует степень гетерогенности популяций по частотам аллелей.

1.3. Особенности генетической структуры в условиях стресса.

Как уже упоминалось, наибольшему стрессу подверглись популяции теплой части водоема, особенно популяция "теплая"- ТЕП. Следовательно, именно в этой популяции мы можем ожидать наиболее значительные изменения генетической структуры.

Для выявления действия отбора в природных популяциях широко используется метод сравнения молодых и взрослых особей по частотам аллелей и генотипов (Milkman & Koehn,1977; Haag, Garton, 1995). При этом для оценки возраста моллюсков используют линейные размеры раковины. Разница в частотах аллелей и генотипов между молодыми (мелкими) и взрослыми (крупными) особями может свидетельствовать о существовании отбора.

В Таблице 5 представлены значения индекса гетерозиготности D по локусам Est и Lap-2 для трех размерных классов по длине раковины в популяции "теплая"- ТЕП.

При гомогенности аллельных частот между размерными классами, показано, что размерные классы демонстрируют разный уровень дефицита гетерозигот по локусам Est и Lap-2.

Если в неподразделенной выборке по локусу Lap-2 наблюдается дефицит гетерозигот (D=-0.238, Р<0.01), то в подразделенной выборке дефицит гетерозигот (D=-0.600, Р <0.001) обнаружен только у мелких особей, тогда как у средних и крупных распределение частот генотипов не отличалось от теоретического.

Таблица 5. Дефицит гетерозигот по локусам Est н Lap-2 в трех размерных классах по длине раковины в популяции ТЕПЛАЯ.

Локус Размерный класс L,mm L cp. N D P

Est L<16 13.3 60 0.284 *

16<=L<20 17.8 61 0.201 NS

20<=L 21.3 39 -0.340 *

Lap-2 L<16 13.3 56 -0.600 **#

16<=L<20 17.8 50 -0.141 NS

20<=L 21.3 38 -0.159 NS

D= (Но-Не)/Не, где Но-наблюдаемая, Не-сжидземая гетерозиготность (Seiander, 1970)

Для локуса Est наблюдалась обратная картина: при соответствии по этому локусу в неподразделенной выборке распределения частот генотипов ожидаемому, дефицит гетерозигот наблюдался среди крупных моллюсков (D=-0.340, Р < 0.05). При этом у мелких особей обнаружен достоверный избыток гетерозигот (D=0.284, Р < 0.05), а у средних особей распределение частот генотипов не отличалось от теоретического.

Кроме того, в популяции ТЕПЛАЯ наблюдается достоверное (Р=0.05) уменьшение доли гомозигот по локусу Lap-2 и увеличение доли гомозигот по локусу Est с увеличением длины раковины (Рис.З), что позволяет предположить существование отбора по данным локусам.

80

70

| 60

§ 50 о

ь 40

£

30 20

1

■ Est □ Lap-2

L<16 16<=L<20 20<=L

Рис. 3 Процент гомозогот локусам Est и Lap-2 в разных размерных классах по длине раковины в популяции ТЕПЛАЯ.

1.4. Роль экологических факторов в дифференциации популяций.

Для оценки уровня генетической дифференциации популяций были посчитаны генетические расстояния и сходство по Нею (Nei, 1978). На Рисунке 4 изображена кластерная диаграмма генетического сходства семи популяций 1989 года с использованием данных по пяти локусам.

_.92 .94_.96_.98 1.00

___ ТЕП

- 1 км

_I- 3 км

' 5 км .- ВДХ

- I-хол

-РЕКА

Рис. 4 Диаграмма генетического сходства популяций 1989 г.

Из диаграммы видно, что популяции можно разделить на группу "теплых", куда входят ТЕП, 1км, Зкм, 5км и группу "холодных", включающую ВДХ, ХОЛ и РЕКА.

Хорошо видно, что популяции ХОЛ и ВДХ генетически гораздо ближе друг к другу, чем к ТЕП, хотя географическое расстояние между популяциями ХОЛ и ТЕП гораздо меньше, чем между ХОЛ и ВДХ.

По уровню радиационного загрязнения популяции ХОЛ и ТЕП находятся в одинаковых условиях, поэтому генетические различия не могут быть связаны с действием радиации.

Так как в водоеме-охладителе находятся четыре теплые и одна холодная популяция, и личинки из всех этих популяций хорошо перемешиваются, то генетическое сходство теплых популяций является следствием схожих условий среды, а именно, повышенной температуры.

Кластерная диаграмма генетического сходства популяций 1990 года использованием данных по четырем локусам изображена на Рисунке 5.

В 1990 году также наблюдается дифференциация на "теплые" и "холодные" популяции, однако, она менее выражена, чем в 1989 году.

Большую дифференциацию популяций в 1989 году, можно объяснить более стрессовыми условиями, связанными с аварийными сбросами кипятка в теплую часть водоема-охладителя.

_.96_£7_.98_.99 1.00

__ ТЕП

- - 1 км

- РЕКА

__— ХОЛ

Рис. 5 Диаграмма генетического сходства популяций 1990 г.

Дифференциация популяций дрейссены хорошо видна на Рис. 6, где показано расположение всех изученных популяций на плоскости главных координат, полученное путем неметрического многомерного шкалирования на основе матрицы генетических расстояний. Группа теплых популяций выделена овалом.

Х(3)

1.5

1.0

0.5

0.0

-0.5

-1.0

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0

I-1 1-1 I-п

I- -I

X I

-I

рх а I

ь ^

I_I_I_I___I_и

Рис. 6. Проекция популяций на плоскость главных координат. Популяции: (в)-ВДХ; (р)-РЕКА; (Р)-РЕКА90; (т)-ТЕП; (Т)-ТЕП90; (х)-ХОЛ; (Х)-ХОЛ90; (1)-1км; (1*)-1км90; (З)-Зкм;; (5)-5км.

Разделение общей изменчивости на меж- и внутрипопуляционные групповые компоненты с помощью в-тсста выявило, что генетические различия между группой "теплых" и группой "холодных" популяций больше, чем межпопуляционные различия. Результаты в-теста показаны в Таблице 4.

Таблица 4. Результаты G-теста.

Различия между теплыми н холодными Различия мезкду всеми популяциями

Популяции 1989 г. 0.0081 0.0077

Популяции 1990 г. 0.0013 0.0009

Следовательно, генетическая дифференциация популяций связана с температурным фактором. Радиоактивное загрязнение в рассматриваемых пределах не оказывает заметного влияния на популяционную структуру.

Известно, что существенное изменение генетической структуры часто обнаруживается в условиях, когда стресс вызывает опасные изменения в биологических системах (Hoffman & Parsons, 1991).

В теплой части водоема-охладителя популяции дрейссены несколько раз подвергались температурному шоку, в результате чего произошла массовая гибель моллюсков. Поэтому не исключена возможность того, что действие радиации может быть «замаскировано» действием температурного фактора.

2. Анализ изменчивости по окраске раковины.

Частоты морф по окраске раковины в популяциях Dr. polymorpha, представлены в Таблице 5. В популяциях теплой части водоема - охладителя преобладают моллюски с пестрой раковиной (морфа-3), в РЕКЕ - с темной (морфа-1), а в водохранилище (ВДХ) все классы представлены более-менее равномерно. Моллюски с белой окраской раковины (редкая морфа-4) обнаружены в шести популяциях (как в теплых, так и в холодных).

Тест Хи-квадрат на гетерогенность выявил достоверные различия по окраске раковины между всеми популяциями (Р=0.0001, D.F.=27, х2=65,472).

Таблица 5. Частоты морф по окраске раковины в популяциях дрейссены.

морфа ВДХ река ХОЛ река* ХОЛ* 1км* Зкм 5км теп* теп

(И) 120 118 175 120 139 139 160 119 159 167

1 0.38 0.72 0.09 0.34 0.44 0.24 0.17 0.15 0.23 0.14

2 0.28 0.19 0.36 0.29 0.19 0.12 0.21 0.22 0.06 0.22

3 0.35 0.09 0.54 0.29 0.37 0.65 0.63 0.61 0.69 0.62

4 0.00 0.01 0.01 0.08 0.00 0.00 0.00 0.02 0.02 0.02

На Рис. 7 представлены результаты кластерного анализа сходства популяций по окраске раковины.

.50

.60

.70

.80

.90

1.00

ТЕП ЗКМ 5 КМ ТЕП90 1КМ ХОЛ ВДХ ХОЛ90 РЕКА90 РЕКА

Рис. 7 Диаграмма сходства популяций по окраске раковины.

Анализ диаграммы сходства выявил сходство теплых популяций водоема-охладителя по окраске раковины. Изученные популяции по окраске раковины можно разбить на две группы: теплые популяции водоема-охладителя, и холодные популяции.

Следовательно, дифференциация популяций дрейссены по окраске раковины также определяется повышенной температурой.

3. Сопряженная изменчивость количественных и качественных

признаков.

3.1 Связь гетерозиготностн с размерами раковины.

Для того, чтобы выяснить, как меняется гетерознготность у крупных особей по сравнению с мелкими, особи из группы "теплых" и группы "холодных" популяций были ранжированы на восемь размерных классов по длине. Для каждого класса была посчитана средняя гетерозиготность (Н) по четырем локусам (Est, Est-D, Lap-1, Lap-2). Значения H равны нулю, когда особь гомозиготна по всем локусам и равны единице, когда если гетерозиготна по всем локусам.

В "холодных" популяциях связь гетерозиготностн с длиной раковины отсутствует. А в группе "теплых" популяций наблюдается достоверное увеличение гетерозиготностн с увеличением длины раковины (коэффициент корреляции равен 0.805, Р=0.016). Это можно объяснить как большей скоростью роста, так и лучшей выживаемостью более гетерозиготных особей в стрессовых условиях теплового загрязнения.

н . 60

. 50

.70

о

10

20

30

L. mm

Рис 8. Связь многолокуснон гетерозиготностн (Н) с длиной раковины (Ь) в популяциях теплой части водоема-охладителя.

Связь гетерозиготностн с морфологической изменчивостью.

Теория генетического гомеостаза Лернера (Lerner, 1954) постулирует, что в популяциях бисексуальных организмов более гетерозиготные особи должны быть в большей степени гомеостазированы по морфологическим признакам, т. е. должны быть более близки к фенотипической норме, чем менее гетерозиготные особи.

Согласно теории Лернера, наблюдаемая гетерозиготность и дисперсия морфологических признаков должны отрицательно коррелировать. Следует отметить, что эта связь не является ясной или универсальной (Hanford, 1980; Booth, 1990).

В Таблице 6 даны значения дисперсии и коэффициенты вариации по длине раковины для особей с разной гетерозиготностью отдельно для группы "теплых" и группы "холодных" популяций.

Для увеличения объема выборки до п=10, были объединены две независимые выборки особей с разной гетерозиготностью по четырем и пяти локусам (каждая с п=5); и для этой объединенной выборки были посчитаны коэффициенты ранговой корреляции R.

Как видно из Таблицы 6, связь между гетерозиготностью и морфологической изменчивостью носит разный характер в теплых и холодных популяциях.

В холодных популяциях обнаружено уменьшение морфологической изменчивости с увеличением гетерозиготностн, т.е. наблюдается "прямой" эффект Лернера. Коэффициент корреляции между гетерозиготностью и коэффициентом вариации по длине раковины составил R—0.58 (Р<0.1). Коэффициент корреляции между степенью гетерозиготностн и дисперсией длины составил R=-0.94 (Р«0.01).

В теплых популяциях, напротив, происходит увеличение морфологической изменчивости с увеличением гетерозиготностн, т. е. наблюдается "обратный" эффект Лернера. Коэффициент корреляции между

гетерозиготностыо и коэффициентом вариации по длине составил 11=0.70 (Р<0,05). Коэффициент корреляции между гетерозиготностыо и дисперсией длины составил 11=0.85 (Р<0.01).

Таблица 6. Связь между степенью гетерозиготности и морфологической изменчивостью по длине раковины в теплых и холодных популяциях.

Параметр Степень гетерозиготности (количество гетерозиготных локусов на особь)

0 1 2 3 4 5 R

L Теплые noir уляции, локусы Est, Est-D, Lap-1, Lap-2

L ср. 13.95 14.35 13.83 15.01 13.86

Var. 5.23 10.85 9.62 13.32 10.23 0.85

CV 0.164 0.229 0.224 0.243 0.231 0.70

N 17 128 176 198 52

L Холодные популяции, локусы Est, Est-D, Lap-1, Lap-2

L ср. 18.88 16.62 17.50 16.63 16.60

Var. 39.46 22.50 17.62 16.90 13.01 -0,94

CV 0.293 0.285 0.240 0.247 0.217 -0,58

N 18 73 146 143 46

L Теплые популяции, локусы Est, Est-D, Lap-1, Lap-2, Me

Lcp. 12.37 12.96 13.49 12.87 13.51

Var. 2.46 5.88 10.86 6.10 11.07

CV 0.127 0.187 0.244 0.192 0.246

N 23 45 73 43 11

L Холодные популяции, локусы Est, Est-D, Lap-1, Lap-2, Me

L cp. 20.37 17.74 18.49 17.54 18.03

Var. 18.69 17.70 16.32 16.49 9.37

CV 0.212 0.237 0.218 0.231 0.170

N 25 54 94 53 18

Ь ср. средняя длина раковины; Уаг дисперсия I. ср. СУ коэффициент вариации: N размер выборки Я общий для обеих выборок ранговый коэффициент корреляции

22

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При изучении природных популяций популяций дрейссены, обитающих в стрессовых условиях теплой части водоема-охладителя ЧАЭС, обнаружено, что под действием теплового загрязнения происходит увеличение генетической и морфологической изменчивости и индуцированный сдвиг в распределении аллельных частот в сторону увеличения частоты наиболее распространенного аллеля.

Показано, что гетерогенность популяций по частотам аллелей пяти полиморфных локусов связана с гетерогенностью среды по температуре. Генетическая дифференциация популяций дрейссены обусловлена температурным фактором. Радиоактивное загрязнение в рассматриваемых пределах не оказывает заметного влияния на генетическую структуру популяций.

Полученные данные представили еще одно подтверждение существования дефицита гетерозигот в природных популяциях двустворчатых моллюсков. При этом установлено, что в условиях теплового загрязнения происходит уменьшение уровня дефицита гетерозигот по локусам Ьар-2 и ЕбЬБ.

Показано, что в условиях стресса меняется характер связи между гетерозиготностью и морфологической изменчивостью.

В холодных популяциях наблюдается уменьшение морфологической изменчивости с увеличением степени гетерозиготности.

В стрессовых условиях теплового загрязнения, напротив, наблюдается увеличение морфологической изменчивости с увеличением гетерозиготности.

23

ВЫВОДЫ.

1. Изучалось действие радиоактивного и теплового загрязнения на

генетическую структуру природных популяций двустворчатого моллюска

Огсшепа ро1утогрИа из водоемов зоны ЧАЭС.

1.1. Показано, что тепловое загрязнение водоема-охладителя ЧАЭС вызывает изменения генетической структуры популяций.

1.2. Радиоактивное загрязнение в рассматриваемых пределах не оказывает заметного влияния на популяционную структуру.

2. Под действием теплового загрязнения в водоеме-охладителе наблюдается увеличение среднего числа аллелей на локус и сдвиг аллельных частот в сторону увеличения частоты наиболее распространенного аллеля.

3. Показано, что дифференциация популяций Ог. ро1утогрИа по частотам аллелей пяти полиморфных локусов обусловлена тепловым загрязнением. Дифференциация происходит, в основном, по локусам ЕвЮ, Ьар-2 и Ме, обнаружившим значительный дефицит гетерозигот.

4. Установлено уменьшение уровня дефицита гетерозигот по локусам Ьар-2 и Еб^О в условиях теплового загрязнения.

5. Обнаружено сходство популяций теплой части водоема-охладителя по окраске раковины.

6. Показано, что в группе "холодных" популяций наблюдается уменьшение морфологической изменчивости с увеличением гетерозиготностн. В популяциях, обитающих в стрессовых условиях теплой части водоема-охладителя, напротив, наблюдается увеличение морфологической изменчивости с увеличением гетерозиготностн.

7. Полученные данные позволяют рекомендовать дрейссену в качестве природного тест-объекта для мониторинга теплового загрязнения водоемов предприятий атомной промышленности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Фетисов А.Н., Рубанович А.В., Слипченко Т.С. Структура популяций Dreissena polymorpha'm водоемов, примыкающих к Чернобыльской АЭС. Тезисы I международной конференции "Биологические и радиоэкологические последствия аварии на Чернобыльской атомной станции". Москва, 1990, С. 141.

2. Фетисов А.Н., Рубанович А.В., Слипченко Т.С., Шевченко В.А. Влияние температурного фактора на генетическую структуру популяций Dreissenapolymorpha (Bivalvia). //Генетика. 1990. T.26.N10. С.1770-1775.

3. Fetisov A.N., Rubanovich A.V., Slipchenko T.S., Shevchenko V.A. The structure of Dreissena polymorpha populations from basins adjacent to the Chernobyl atomic power station.//The Science of the Total Environment. 1992. V. 112. p. 115-124.