Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генетического разнообразия рабдовирусов низших позвоночных и разработка методов их диагностики с помощью полимеразной цепной реакции и гибридизации нуклеиновых кислот

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетического разнообразия рабдовирусов низших позвоночных и разработка методов их диагностики с помощью полимеразной цепной реакции и гибридизации нуклеиновых кислот"

На правах рукописи

003444В05

Попова Анастасия Геннадьевна

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ РАБДОВИРУСОВ НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ИХ ДИАГНОСТИКИ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ И ГИБРИДИЗАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ

КИСЛОТ

03 00 03 - «молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове-2008

003444805

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научный руководитель к х н С Ф Орешкова

Официальные оппоненты

д б н, профессор Загребельный Станислав Николаевич к б н Бабкина Ирина Николаевна

Ведущая организация

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск

Защита состоится «_»_мая_ 2008 года в _9_ часов на заседании диссертационного совета

Д 208 020 01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел (383)336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан «_»_апреля_2008 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

Л И Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

История аквакультуры насчитывает тысячи лет, беря свое начало в государствах Древнего Востока Однако, за последние 20-25 лет в ее развитии произошли революционные изменения, вызванные истощением биологических ресурсов океана и континентальных пресных вод, издавна служивших человеку источником высокоценных пищевых объектов Будучи сегодня самым перспективным и быстрорастущим сектором сферы производства продуктов питания, аквакультура все больше замещает промышленный промысел гидробионтов в дикой природе

Серьезным препятствием на пути успешного развития аквакультуры являются болезни объектов культивирования, при этом основной ущерб наносят вирусные инфекции рыб Несмотря на то, что современная ихтиовирусология - сравнительно молодая наука, уже обнаружено около 350 вирусов гидробионтов Список открываемых вирусов, как правило, пополняется после введения в аквакультуру новых объектов разведения (Щелкунов И С, 2006)

Рабдовирусы составляют группу особо значимых вирусных патогенов культивируемых видов рыб Наиболее интенсивно изучались вирусы, инфицирующие лососевые породы, такие как вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани (ИНГТ, 1НЫУ) и вирусной геморрагической септицемии (ВГС, УШУ), так как именно эти патогены имеют наибольшее экономическое значение для мирового производства рыбы В России, наряду с ИНГТ, весьма масштабной проблемой является весенняя виремия карпа (ВВК), вызываемая вирусом ЯУСУ

В последнее время большое внимание уделяется разработке методов молекулярно-генетической диагностики вирусных инфекций рыб, основанных на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР) Эти методы обладают рядом очевидных достоинств, среди которых быстрота получения результата, высокая чувствительность и специфичность, возможность осуществления генетического типирования изолятов

Для создания эффективной системы ПЦР-диагностики очень важны данные по изменчивости геномов патогенных штаммов вируса, выделенных от хозяев из разных географических областей Эти данные необходимы для создания тест-систем, способных различать генетические варианты вируса и, тем самым, прослеживать пути распространения инфекции

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования был о создание эффективных диагностических тест-систем на вирусы SVC и IHN на основе методов ПЦР и молекулярной гибридизации, изучение генетического разнообразия данных патогенов, а также разработка методов их генотипирования с помощью молекулярно-биологических методик

В ходе работы решались следующие задачи

1 Разработка метода ОТ-пгПЦР для выявления вирусов весенней виремии карпа и инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых

2 Конструирование зондов и создание системы детекции IHNV с помощью гибридизационного анализа

3 Определение чувствительности и специфичности разработанных методов идентификации SVCV и IHNV в зараженной культуре клеток и в клиническом материале от инфицированных рыб

4 Разработка способов генетического типирования штаммов SVCV и IHNV на основании методов ПЦР и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ)

5 Филогенетический анализ штаммов SVCV и 1HNV на основе данных о нуклеотидной последовательности участков генов нуклеопротеина

Положения, выносимые на защиту

1 Системы ОТ-пгПЦР-диагностики на вирусы весенней виремии карпа (SVCV) и инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV) позволяющие выявлять вирусную РНК с высокой чувствительностью и специфичностью в препаратах культуральных вирусов и в клиническом материале от больных рыб

2 Способ генотипирования рабдовирусов рыб с помощью ПДРФ-анализа. Все исследуемые изоляты SVCV образуют пять генетических групп Исследованные изоляты IHNV принадлежат к трем основным геногруппам (U, М и L)

3 Филогенетическое исследование участков гена нуклеопротеина для восемнадцати изолятов SVCV и тринадцати изолятов IHNV Изоляты SVCV образуют генетические группы в зависимости от географии их выделения Камчатский изолят IHNV генетически близок североамериканским изолятам геногруппы U, а изоляты, выделенные в подмосковном регионе, образуют обособленную подгруппу в составе геногруппы U

Научная новизна и практическая ценность работы

В результате проделанной работы, на основе методов полимеразной цепной реакции и гибридизации нуклеиновых кислот впервые созданы тест-системы для идентификации РНК вирусов весенней виремии карпа и инфекционного нехроза гемопоэтической ткани в инфицированных культурах клеток и в органах и тканях от рыб Разработаны методы генетического типирования изолятов указанных патогенов с помощью ПЦР и ПДРФ-анализа. Впервые проведен филогенетический анализ последовательностей гена нуклеопротеина для 12 российских и б европейских изолятов SVCV и показано их различие на генетическом уровне Также выполнен филогенетический анализ последовательностей гена нуклеопротеина для изолятов IHNV Проведено сравнение изолятов, выделенных из естественных водоемов Камчатки и из форелевых рыбоводных хозяйств Московской и Тверской областей с изолятами, расиростраными на Тихоокеанском побережье Северной Америки

Результаты настоящих исследований могут представлять интерес для практического рыбоводства, так как позволяют специфично, с высокой чувствительностью и в короткие сроки выявлять патогены, вызывающие наиболее опасные заболевания разводимых видов рыб (карповых и лососевых) Знание эпизоотической обстановки как в естественных водоемах, так и на рыбоводных заводах и в хозяйствах позволяет оценивать риск распространения опасных вирусных агентов среди разводимой рыбы, и, как следствие, избегать экономических потерь Информация, полученная с помощью разработанных методов генотипирования SVCV и IHNV, поможет проследить перемещение генетических вариантов вирусов как в России, так и за рубежом при перевозке икры и живой рыбы для воспроизводства, что позволит своевременно и эффективно осуществлять соответствующие профилактические мероприятия

Апробация работы и публикации

По материалам диссертации опубликовано три статьи в реферируемых научных журналах и одна в книге «Научные основы производства ветеринарных биоло1ических препаратов» Полученные результаты были представлены на трех международных конференциях Second United States and Russia Bilateral Conference "Aquatic&Marme Animal Health" (Shepherdstown, West Virginia, USA, 2003), 2-ой международной конференции (Москва, МГУ, 2004), международной научно-практической конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006)

Структура il объем диссертации

Диссертационная работа состоит из шести разделов введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список использованной литературы

(117 наименований). Работа изложена на 121 страницах машинописного текста и содержит 12 таблиц, 38 рисунков,

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Разработка методов выявления вируса весенней виремии карпа (SVCV) на основе полнмеразной цепной реакции

Для амплификации фрагментов генома SVCV на основании полной нуклеотидной последовательности референсой линии Fijan (код доступа GenBank U18101) были подобраны праймеры к консервативным участкам гена нуклеопротеина(таблица!, рис. 1).

-5'

Рис. 1 Схема расположения праймеров и размеры получаемых ПЦР-продуктов на К-гене 8УСУ.

Таблица 1 Последовательности праймеров, использованных в работе

№ п/п Праймер Ориентация Последовательность Положение на геноме

1 IHNV2Rev прямой 5 '-AC AG ААСА AGC AG ААСТАТТТ 111-131

2 IHNV1 обратный 5 '-TTG ATGAGAATG АТССС AT AG 748 - 770

3 IHNV2 обратный 5'-GAAGAGGAGGCCGGTCAC 553 - 570

4 GSout прямой 5'-AGAGATCCCTACACCAGAGAC 3507 -3527

5 GSin прямой 5'-TCACCCTGCCAGACTCATTGG 3567 - 3587

6 GASin обратный 5'-ATAGATGGAGCCTTTGTGCAT 4028 - 4049

7 N17 прямой 5'-CAGCTTGTTGCTGCATTATG 968 - 987

8 N1 прямой 5'-AATGCAAGCTTGCTGATGGCT 1049- ¡069

9 N2 обратный 5 '-AACTGCAGCATACGCTTTGAGGCTT 1434-1453

10 N3 прямой 5 '-AGTCTAGATTGTAGCCTGTGTGGAC A 639 - 662

11 N4 обратный 5 '-ATAGATCTCGTCAGGCTGTCTTGC 1010- 1033

12 N5 обратный 5'-CCCAAGCTTGCATTTGAGATCGAC 1039- 1062

13 Nros 11 rev прямой 5 '-CAGCCCTGATATTGAGCAG 1084- 1102

14 Nros2 обратный 5' -CTTCTATTATC ACTTAAAATTGTC 1348 - 1371

Примечание'. 1 - 3 - праймеры, комплементарные последовательности N-гена IHNV; 4 - 6 - праймеры, комплементарные последовательности G-гена ÍHNV, 7 -14 - праймеры, комплементарные последовательности N-гена SVCV. Нумерация нуклеотидов дана от 5'-конда генома IHNV штамма WRAC (код доступа GenBank L40883) и генома SVCV штамма Fijan (коды доступа GenBank U18101, AJ318079).

Nrosllrev

(288 ПН)

N2 (486 пн) N2 (405 пн)

N5 (423 пн) N4 (393 гн)

При разработке метода идентификации вируса ВВК в культуре клеток на основе ОТ-ПЦР применялись два альтернативных набора праймеров С целью повышения чувствительности была разработана методика полугнездовой ПЦР (пг-ПЦР), которая заключалась в использовании в первом раунде реакции в качестве внешней пары праймеров N17 и N2 (или N3 и N5), а во втором - внутреннего праймера N1 (или N4) Было показано, что оба варианта ОТ-пгПЦР при их использовании для детекции культурального вируса дают продукты ожидаемого размера для всех изученных изолятов SVCV уже в первом раунде реакции

Для определения специфичности метода ОТ-пгПЦР в реакции были использованы препараты РНК российских и европейских штаммов и изолятов SVCV, а также препараты РНК других рабдовирусов рыб, относящихся к родам Vesiculovirus (PFRV, Rh anguilla), и Novirhabdovirus (IHNV, VHSV) Было показано, что при проведении реакции с праймерами N17 и N2 специфичный продукт (486 пи) синтезировался для всех испытанных изолятов SVCV, тогда как в случае PFRV, IHNV, VHS V и Rh anguilla продукт реакции отсутствовал Интересно, что проведение реакции с праймерами N1 и N2 приводило к образованию продукта 405 пн не только в случае SVCV, но также для изолятов PFRV (рабдовирус мальков щуки, вызывающийсходное заболевание) Проведение ОТ-пгПЦР в системе с использованием праймеров N3, N4 и N5 давало образование продуктов 423 пн (первый раунд) и 393 пн (второй раунд) только для всех изученных изолятов SVCV

Чувствительность выявления вируса определяли с помощью серии последовательных десятикратных разведений вирусной РНК, выделенной из образцов культурального вируса В первом раунде ОТ-ПЦР для двух пар праймеров (N1-N2 и N3-N5) чувствительность составила ~106ТЦД5о/мл После проведения второго раунда ПЦР с праймерами N3 и N4 чувствительность возросла до 10 09 ТЦД50/МЛ Определение чувствительности метода в патологическом материале от карпов, экспериментально зараженных штаммом 3JI4 проводили с праймерами N17, N1 и N2 Чувствительность ОТ-пгПЦР значительно варьировала в зависимости от вида тестируемого клинического материала После проведения второго раунда она составила мозг -<10* ТЦ/Ьо/г, экссудат - ~102 ТЦ/Ымл, плавники - <103 ТЦДл/г, кожа -103 ТЦД50/Г, почка -104 ТЦД50/Г Таким образом, наиболее ценными для ПЦР-диагностики вируса SVC являются образцы мозга, экссудата и плавников больных рыб, тогда как в пробах почки имело место выраженное ингибирование реакции

Следующим этапом работы было определение эффективности выявления вируса SVC методом ОТ-пгПЦР в полевых материалах от рыб, отбор которых производился в четырех рыбхозах Тверской и Московской областей С помощью реакции нейтрализации в лаборатории ихтиопатологии ФГУП «ВНИИПРХ» вирусные агенты были выделены из двух проб от годовика и от трехлетков карпа из двух хозяйств Параллельно нами было проведено

тестирование клинических проб в ОТ-пгПЦР с праймерами N3, N4 и N5, которое показало присутствие специфичных для 8УСУ продуктов во всех четырех хозяйствах.Следовательно, метод ПЦР значительно превосходит традиционный метод выделения вируса в культуре клеток по эффективности выявления вируса весенней виремии карпа на стадиях скрытого и хронического течения болезни.

Определение эффективности метода ОТ-пгПЦР в ходе развития инфекции на пробах от экспериментально зараженных карпов проводилось на пробах, отобранных из различных тканей рыб на разные сутки после инфицирования. Образцы отбирались на [З-ые-14-ые (из внутренних органов и экссудата), 30-ые (из внутренних органов и экссудата), 45-ые (из внутренних органов и жабр), 60-ые (из внутренних органов и кожи) и 90-ые (из внутренних органов и кожи) сутки после инфицирования (р. ¡.) и были исследованы в лаборатории ихтиопатологии ФГУП «ВНИИПРХ» в реакции нейтрализации на культуре клеток.

Нами был проведен анализ полученного материала с помощью метода ОТ-пгПЦР с праймерами N17, N1 и N2, а также в альтернативном варианте с праймерами N3, N4 и N5 (рис.2).

1234М56789 10 М1234М56789 10

Рис.2 Первый раунд ОТ-пгПЦР с праймерами N17^2 (а) и Ю-Ы5 (б) на пробах от карпов

в ходе развития инфекции.

Дорожки 1,2- 13-14 суток. (1 - внутренние органы (пч+пн+сел ), 2 - экссудат);

3, 4 - 30 суток р.ЦЗ - внутренние органы (пч+пн+сел), 4 - экссудат);

5,6-45 суток р.¡.(5 - внутренние органы (пч+пн+сел), 6 - жабры);

7, 8 - 60 суток рл.( 7 - внутренние органы (пч+пн+сел ), 8 - кожа);

9, 10-90 суток рл.( 9 - внутренние органы (пч+пн+сел), 10- кожа);

М - ДНК-маркер.

Анализ полученных данных показал, что при исследовании традиционными вирусологическими методами на 13-ые-14-ые сутки рл. и на 30-ые сутки р. Г БУСУ выделялся как из образцов внутренних органов, так и из экссудата всех зараженных рыб. На 45-ые сутки рл. вирус удалось выделить лишь из проб, взятых от двух рыб из пяти, причем его титр значительно снизился. Ни на 60-ые, ни на 90-ые сутки рл. вирус выделить не удалось.

При применении метода ОТ-пгПЦР к исследованным образцам было показано, что на 13ые-14-ые сутки рл. вирусная РНК надежно детектируется уже в первом раунде при

использовании праймеров N3 и N5, тогда как при амплификации с праймерами N17, N1 и N2 в некоторых пробах, положительных на культуре клеток, продукт не выявлялся даже после проведения второго раунда На 30-ые сутки р i РНК вируса выявлялась во всех пробах в системе с праймерами N3, N4 и N5, а при использовании праймеров N17, N1 и N2 вирус выявлялся в пяти пробах их десяти На 45-ые сутки р i праймеры N17, N1 и N2 детектировали вирус только в тех пробах, где он был обнаружен традиционными вирусологическими методами, а с помощью праймеров N3, N4 и N5 удалось обнаружить вирусную РНК в пробах, отрицательных на культуре клеток На 60-ые и 90-ые сутки р i удалось выявить вирус только с помощью праймеров N3, N4 и N5, хотя с помощью традиционных вирусологических методов вирус выделить не удалось В системе ОТ-пгПЦР с праймерами N17, N1 и N2 не было выявлено ни одной положительной пробы

Очевидно, что выделение вируса традиционными вирусологическими методами от переболевших или устойчивых к заболеванию рыб, которые могут продолжительное время оставаться вирусоносигелями, не представляется возможным Однако эффективность выявления вируса SVC на стадиях скрытого и хронического течения болезни методом ОТ-пгПЦР с праймерами N3, N4 и N5 значительно превосходит этот метод Таким образом, предложенная методика предоставляет возможность выявления скрытого вирусоносительства в популяциях внешне здоровых рыб, что особенно важно для регионов, неблагополучных по данному заболеванию

Оценка эффективности выявления вируса SVC методом ОТ-пгПЦР с использованием в реакции обратной транскрипции праймеров прямой и обратной ориентации Во всех предыдущих исследованиях для выявления SVCV в препаратах кулыуральных вирусов и клинических проб от рыб в реакции обратной транскрипции нами были использованы праймеры прямой ориентации, комплементарные геномной РНК вируса В то же время известно, что N-ген рабдовирусов в инфицированных клетках транскрибируется первым и с наивысшей эффективностью В связи с этим нами были проведены исследования по определению эффективности ОТ-пгПЦР при использовании в реакции обратной транскрипции праймеров обратной ориентации (N2 и N5, таблица 1, рис 1), комплементарных мРНК N-гена SVCV На культуральном вирусе ВВК было показано, что эффективность амплификации при использовании в ревертазной реакции праймеров обратной ориентации выше, чем праймеров прямой ориентации

На следующем этапе была определена эффективность детекции вирусной РНК с праймеров обратной ориентации в клинических пробах от экспериментально зараженных карпов с острой формой ВВК В работе была использована система ОТ-пгПЦР с праймерами N3, N4 и N5 Реакцию обратной транскрипции вели параллельно с праймеров прямой (N3), и

обратной (N5) ориентации После проведения первого раунда амплификации на кДНК, полученной с праймера N5, выявилось 60% положительных проб (12 из 20), тогда как на кДНК, полученной с праймера N3 - 45% (9 из 20) Второй раунд ОТ-пгПЦР с праймерами №-N4 был проведен для проб, в которых в первом раунде ПЦР продукт не выявлялся Во всех пробах, где ревертазная реакция была проведена с праймера N5, был получен нужный фрагмент 393 пн, тогда как в пробах, где обратную транскрипцию вели с праймера N3, этого фрагмента не обнаружили Таким образом, чувствительность метода ОТ-пгПЦР для выявления РНК 5УСУ в клинических образцах от зараженных рыб гораздо выше при использовании в реакции обратной транскрипции праймера обратной ориентации, комплементарного мРНК М-гена 8 УСУ

Ранее было показано, что при использовании в обратной транскрипции прямого праймера N3 возможно проведение дифференциальной диагностики 8УСУ и РП1У Однако при применении в ревертазной реакции обратного праймера N5 после проведения первого раунда ПЦР с праймерами N3 и N5 был получен продукт амплификации как для БУСУ, так и для РРИУ В связи с этим для дифференциальной диагностики БУСУ и РЕЯУ целесообразно использовать в ревертазной реакции только прямой праймер N3

Генетическое типирование изолятов вУСУ с помощью анализа полиморфизма длин рестрикцнониых фрагментов (ПДРФ)

На основании полученных данных о нуклеотидной последовательности N[-N2 фрагмента восьми европейских и десяти отечественных изолятов БУСУ был проведен поиск сайтов гидролиза для эндонуклеаз рестрикции, позволяющий проводить генетическое типирование с помощью рестрикционного анализа Для исследования было выбрано пять эндонуклеаз рестрикции (С1а\, 1Ьа\, ЯюМА1, РхЛ и Тги91), в сайтах узнавания которых на фрагменте 405 пн разных изолятов вУСУ имелись нуклеотидные замены (таблица 2)

Таблица 2 Рестрикционный анализ фрагмента N1-N2 гена нуклеопротеина БУСУ

Изолят Эндонуклеаза рестрикции

(место выделения) Clal Rsal ÄsoMAI Pill Trißl Fok\

Группа 1

Рцап (Хорватия) 405 303 102 294 71 40 313 92 405 210 195

500 (Чехия) 405 303 102 294 71 40 313 92 405 210 195

541 (Чехия) 405 303 102 294 71 40 313 92 405 210 195

17314/5 (Венгрия) 405 303 102 294 71 40 313 92 405 210 195

17417/3 (Венгрия) 405 303 102 294 71 40 313 92 405 210 195

450 (Германия) 405 303 102 294 71 40 313 92 405 210 195

3587 (Австрия ?) 405 303 102 294 71 40 313 92 405 210 195

Группа 2

М2 (Молдова) 405 303 102 294 71 40 405 405 210 195

2/90 (Молдова) 405 303 102 294 71 40 405 405 210 195

Группа 3

Уд (Россия) 277 128 405 294 71 40 313 92 405 210 195

Р4 (Россия) 277 128 405 294 71 40 313 92 405 210 195

Группа 4

LK/03 (Россия) 277 128 303 102 365 40 313 92 309 96 210 195

KU/0204 (Россия) 277 128 303 102 365 40 313 92 309 96 210 195

KL/0604 (Россия) 277 128 303 102 365 40 313 92 309 96 210 195

Группа 5

ЗЛ4 (Россия) 277 128 405 230 71 64 40 405 309 96 210 195

Кр 1 (Россия) 277 128 405 230 71 64 40 405 309 96 210 195

ККК (Россия) 277 128 405 230 71 64 40 405 309 96 210 195

14(Россия) 277 128 405 230 71 64 40 405 309 96 210 195

N1 (Украина) 277 128 405 230 71 64 40 405 309 96 210 195

N3 (Украина) 277 128 405 230 71 64 40 405 309 96 210 195

N5 (Украина) 277 128 405 230 71 64 40 405 309 96 210 195

Изоляты с уникальными профилями рестрикции

1/99 (Украина) 277 128 303 102 294 71 40 313 92 309 96 210 195

RVC-1 (Зап Европа ?) 405 405 230 71 64 40 405 309 96 210 195

435 (Германия) 405 303 102 294 71 40 313 92 309 96 210 195

Примечание цифрами указаны размеры фрагментов, полученных после гидролиза ампликона Ы1-Ы2 (405 пн) эндонуклеазами рестрикции

Анализ полученных результатов позволил разделить двадцать четыре исследованных штамма SVCV на пять рестрикционных генетических групп, куда не вошли три штамма с уникальными профилями рестрикции (один отечественный и два европейских) Группа 1 образована семью европейскими изолятами, тогда как группы 2 - 5 - изолятами из бывшего СССР Отечественные изоляты, составляющие группы 2 (два изолята), 3 (два изолята) и 4 (три изолята) имеют сайты рестрикции, характерные как для группы 1, так и для группы 5, что позволяет рассматривать их как переходные между этими большими группами Подобная корреляция распределения генетических вариантов вирусов по группам с географией их выделения была установлена в аналогичных работах для вирусов VHS и IHN Таким образом, разработанный метод ПДРФ-анализа позволил разделить все исследованные изоляты SVCV на две разобщенные генетические группы европейскую и из бывшего СССР, причем европейские штаммы оказались генетически более гомогенными Географическое распределение рестрикционных генотипов SVCV, циркулирующих на территории Европы и европейской части России, представлено на рисунке 3

Разработанный метод рестрикционного анализа был успешно применен для типирования изолятов БУСУ непосредственно в клинических материалах, без выделения вируса от рыб.

• Геногруппа 1 ;+Геногруппа 2; ^ Геногруппа 3; ■ Геногруппа 4; А Геногруппа 5.

Рис. 3 Географическое распределение генетических вариантов 8УСУ на территории Европы и европейской части России.

Разработанный метод рестрикционного анализа был успешно применен для типирования

изолятов 8 УС V непосредственно в клинических материалах, без выделения вируса от рыб

Филогенетический анализ изолятов вУСУ на основании нуклеотидной последовательности фрагмента 14-гена (405 пн)

Для проверки достоверности результатов, полученных с помощью ПЦР-ПДРФ, на основании нуклеотидной последовательности участка К-гена величиной 405 пн был проведен филогенетический анализ восемнадцати изолятов 8УСУ, принадлежащих к пяти рестрикционным геногругшам. В созданной дендрограмме (рис. 4) выделяются три кластера. Первый кластер образуют изоляты из бывшего СССР, принадлежащие к рестрикционным геногруппам 5 и 3. Внутри кластера выделяются несколько групп российских и украинских штаммов, причем российские изоляты, входящие в рестрикционную геногруппу 3, с высокой надежностью образуют обособленную подгруппу. Второй кластер также образован изолятами из бывшего СССР, принадлежащими к другим рестрикционным группам: 2 и 4. С высоким индексом статистической надежности группируются российские изоляты, выделенные в подмосковном регионе (геногруппа 4), а молдавский изолят М2 (геногруппа 2) демонстрирует наиболее значительные отличия от всех изученных штаммов БУСУ. Третий кластер состоит только из европейских изолятов (геногруппа 1). Происхождение изолята КУС-! точно не установлено, и по результатам ПДРФ его не удалось отнести ни к одной из выделенных

геногрупп Филогенетический анализ показал, что указанный изолят и изоляты из Европы, очевидно, имеют монофилетическое происхождение

И »д

| '—9 Р4 (России, Ростовская обл)_

"1 ■ О ЗЛ4 (Россия, Краснодарский кр) I—-I «О 1 4 (Россия, Свердловская обл ) I—N3 (Украина)

IО ККК (Россия, Курская обл ) __|0 Кр1 (Россия, Краснодарский кр )

аЬ,0 N5 (Украина) "^N1 (Украина)

Уд (Россия, Тверская обл )

Геногруппа3

Геногруппа5

TÍ

Геногруппа 4

С

~— 0 М2 (Молдова) ] Геногруппа 2 i О KL/0604 (Россия, Московская обл )1 üy о KU/0204 (Россия, Тверская обл ) J О RVC (Зап Европа)

|9 500 (Чиня)

541 (Чехия) Fijan (Хорватия) Геногруппа 1 17314/5 (Венгрия) 450 (Германия)

JW swill—»541 "991 .♦Fija:

I—04

О 005 замен/сайт

Рис 4 Дендрограмма, построенная методом объединения ближайших соседей, отражающая уровень иуклеотидных различий фрагмента N-гена величиной 405 пн генома различных штаммов SVCV Цифры на дендрограмме показывают индексы статистической надежности узлов дерева

Исследование полученной дендрограммы выявило наличие большого генетического разнообразия среди изолятов из бывшего СССР, в отличие от европейских штаммов, которые оказались генетически гомогенными в исследованной группе штаммов В целом полученные результаты генотипирования SVCV согласуются с данными филогенетического анализа вируса, полученными Stone et al (2003) Таким образом, проведенный филогенетический анализ подтвердил достоверность результатов, полученных с помощью ПЦР-ПДРФ Исследованные изоляты имеют тенденцию образовывать генетические группы в зависимости от географии их выделения, причем данные, полученные с помощью двух разных методов, практически полностью совпадают Так как методика секвеиирования с последующим филогенетическим анализом требует больших временных и финансовых затрат, ПДРФ-анализ представляет возможность быстро и сравнительно недорого охарактеризовать большое количество изолятов, что позволяет использовать метод в диагностических лабораториях для проведения широкомасштабных эпидемиологических исследований

Разработка методов выявления вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани (Ш1ЧУ) на основе гибридизациопного анализа

Для конструирования ДНК-зондов, специфичных в отношении ШЫУ, в настоящей работе было выполнено клонирование участка Ы-гена 1НЫУ из плазмиды рОЕМ-'ГЕазу-М-ШЫУ, любезно предоставленной сотрудницей университета г Турку К Киппасго, содержащей полноразмерную копию гена, в ЯР ДНК фага М13шр8 (рис 5) Таким образом, в составе фага М13шр8 нами был получен ДНК-зонд для геномной РНК рабдовируса (на минус-цепь 1Н>1У)

Рис 5 Схема конструирования ДНК-зовда для выявления 1НЫУ

Для проведения гибридизационного анализа полученный однонитевой ДНК-зонд в составе фага М13 был биотинилирован После проведения дот-гибридизации были получены следующие результаты зонд гибридизовался с одинаковой эффективностью со всеми изолятами 1НЫУ и с изолятом УШУ, и не гибридизовался с неинфицированной культурой клеток Это отражает тог факт, что оба вируса относятся к одному роду рабдовирусов ЫотгИаЫЬппм Таким образом, полученный зонд оказался пригодным для выявления рабдовирусов рода М<тгИаМ<тпя в культуре клеток

Метод гибридизации нуклеиновых кислот является достаточно простым и удобным способом выявления вирусных заболеваний, однако к недостаткам полученного нами зонда следует огнести невысокую специфичность для дифференцировки между 1НИУ и УНЭУ, что ограничивает возможности применения метода для массового скрининга проб в ихтиовирусологии Поэтому основные усилия были направлены нами на разработку метода ОТ-пгПЦР для диагностики ШЫУ, а также метода ПДРФ-анализа для генетического типирования вируса.

Разработка метода выявления вируса инфекциоиного некроза гемопоэтической ткани (IHNV) с помощью ОТ-ПЦР

На основании опубликованных данных нами были выбраны праймеры к консервативным участкам последовательностей N- и G-генов вируса IHN (таблица I, рис. 6).

GSio "> ■*- GASin (482 пн)

1Н1ЧУ2гет -»• •*- |Н!МУ2 (460 пн!

Рис.6 Схема расположения праймеров и размеры получаемых ПЦР-продуктов на геноме I> 1N V.

Для детекции вируса в культуре клеток использовали внешние праймеры 1НЫУ2геу и 1ШГУ1. Эта пара праймеров обеспечивала синтез фрагмента Ы-гена 1НЫУ величиной 660 пн для всех изученных изолятов Для проведения пгПЦР в качестве внутреннего праймера использовали олигонуклеотид 1ПМУ2. Длина продукта амплификации после проведения второго раунда составляла 460 пн и соответствовала ожидаемой. Специфичность выбранных праймеров была продемонстрирована при использовании в ОТ-ПЦР реакции вируса весенней виремии карпа и неинфицированных культур клеток Аналогичные результаты были получены при использовании праймеров на (¡-ген Для первого раунда ПЦР были использованы праймеры вЗот и САЯш, а для пгПЦР - йвт и ОАвт (таблица 1). После проведения реакции продукт ожидаемой длины (542 пн в первом раунде и 482 пи во втором) синтезировался только для 1НЫУ, и не детектировался для вируса весенней виремии карпа и вируса геморрагической септицемии, использованных в качестве отрицательного контроля

Для определения чувствительности первого и второго раундов ПЦР была проведена серия десятикратных разбавлений исходного культурального вируса. Было показано, что чувствительность первого раунда составляет ~105 ТЦД50/МЛ, а проведение второго раунда пгПЦР позволило достичь гораздо большей чувствительности: менее 10'1 ТЦД5о/мл как для Ы, так и для в-гена Это особенно важно для тестирования вируса в клинических пробах от рыб, поскольку в них эффект ингибирования реакции тканевыми материалами бывает выражен значительно сильнее, чем компонентами клеток при работе с культуральными вирусами.

Метод полугнездовой ПЦР на К- и О-гене был использован для обнаружения исследуемого вируса в клинических материалах от предположительно инфицированной

IHNV2rev

V

половозрелой нерки Пробы были отобраны на рыбоводном заводе «Озерки» (Камчатская область) Для исследования были взяты внутренние органы рыб (почка, селезенка) в виде тканевого гомогенага и супернатанта, полученного после центрифугирования его суспензии, а также овариальная жидкость Было показано, что лучше всего вирус выявляется в супернатанте внутренних органов как на N-, так и на G-гене, тогда как в гомогенате имеет место выраженный эффект ингибирования ПЦР Этот феномен был ранее показан при тестировании клинических проб для двух других рабдовирусов рыб VHS V и S VCV

Определение эффективности метода ОТ-пг ПЦР в ходе развития инфекции на пробах от экспериментально зараженных рыб Пробы для анализа отбирали из тканей двух рыб (плавники, слизь, жаберная крышка, жабры, мозг, печень, селезенка, почка) в ходе развития заболевания - через 8 и 36 суток после инфицирования ОТ-пг ПЦР проводили HaN-геие IHNV с праймерами IHNV2rev, IHNV1 и IHNV2 На начальной стадии заболевания (8 суток) диагностически наиболее ценными оказались образцы жабр, селезенки, почки и печени больных рыб На 36-е сутки после заражения количество ПЦР-продукта (а значит и вируса) в пробах значительно снизилось вирусная РНК слабо детектировалась в пробах слизи, жабр, жаберной крышки, почки, печени и мозга (таблица 3)

Таблица 3 Результаты ОТ-пг ПЦР с праймерами IHNV2rev-IHNV2 на N-ген IHNV в

пробах экспериментально зараженной форели в ходе развития инфекции

Сутки после заражения Материал ^ТЦДм/мл ГТЦ-буфера ОТ-пгПЦР ^ТЩЫмл ГТЦ-буфера ОТ-пгПЦР

Рыба 1 Рыба 2

8 Слизь Плавник Жаб крышка Жабры Мозг Печень Селезенка Почка 4,43 3,43 4,93 5,93 3,43 6,18 6,43 6,18 + ++ + ++ ++ 4,18 5,93 3,93 6,18 4,43 6,43 7,18 7,18 +/- ++ ++ -н-

36 Слизь н/в +/- н/в -

Плавник н/в - н/в -

Жаб крышка н/в +/- н/в +

Жабры н/в - 1,93 +

Мозг н/в +/- 2,93 -

Печень н/в - 3,93 +

Селезенка н/в н/д н/в +/-

Почка н/в +/- н/в +/-

Примечание н/в - не выделен, н/д - не делали, «-» - амплификат не детектировался, «+/-» амплификат почти не детектировался, «+» - амплификат слабо детектировался, «++>» амплификат хорошо детектировался

Полученные результаты согласуются с литературными данными при исследовании иммуногистохимическими методами органов зараженных рыб на 8-е сутки после

инфицирования вирус был обнаружен Brudeseth et al. (2002) практически во всех органах, включая печень и мозг, однако количество вируса снижалось уже на 21-28 день после инфицирования.

Оценка эффективности выявления вируса IHN методом ОТ-пгПЦР с использованием в реакции обратной транскрипции праймеров прямой и обратной ориентации. Для определения эффективности выявления РНК IHNV в культуре клеток при использовании в ревертазной реакции праймеров прямой (IHNV2rev) и обратной (IHNV1) ориентации была проведена ОТ-ПЦР с исходными культуральными вирусами. После проведения первого раунда ПЦР с праймерами IHNV2rev и IHNV1 (таблица 1, рис. 6) фрагмент ожидаемого размера (660 пн) образовывался для всех исследованных штаммов IHNV, однако количество наработанного амплификата было больше в случае использования в реакции обратной транскрипции обратного праймера IHNV1.

Сравнительное определение чувствительности ОТ-ПЦР с использованием праймеров различной ориентации проводили с помощью метода последовательных десятикратных разбавлений кДНК, полученной в параллельных ОТ-реакциях с праймеров IHNV2rev и IHNV1 (рис, 7). Чувствительность ОТ-ПЦР при использовании традиционного праймера прямой ориентации, комплементарного N-гену IHNV ((-)-цепь РНК), составила ~106'"7 ТЦДзо/мл после проведения первого раунда, тогда как при использовании обратного праймера, комплементарного мРНК ((+)-цепь), она увеличилась до значения ~Ю3'07 ТЦДзо/мл. Таким образом, при использовании в реакции обратной транскрипции праймера обратной ориентации чувствительность метода сильно возросла уже после проведения первого раунда ОТ-ПЦР.

а)

659 пн —

б)

659 пн —»

Рис. 7 Сравнительное определение чувствительности выявления исходного культурального вируса IHN (штамм RBH) в первом раунде ОТ-пгПЦР с праймеров прямой (IHNV2rev, а) и обратной (IHNV1, б) ориентации.

Дорожки 1-8 - серия десятикратных разбавлений РНК IHNV:1 - 108,07ТЦД50/мл; 2 - 107,07ТЦД50/мл; 3 -106,07ТЦД50/мл; 4 - 105,07ТЦД50/мл;

12 345 6 7 8 М

12 34 5 6 7 8 М

5 - 104,07ТЦЦ50/мл, 6 - 103,07ТЦД50/мл, 7 - 102,07ТЦД50/мл, 8 - 101,07ТЦЦ50/мл, М— ДНК-маркеры

Генетическое типирование изолятов ШМУ с помощью анализа полиморфизма длин

рестрикционных фрагментов (ПДРФ)

Был разработан метод типирования изолятов ШЫУ с помощью ПДРФ-анализа на основании нуклеотидной последовательности участка Ы-гепа Группа исследователей из США провела филогенетический анализ более 300 изолятов вируса из разных регионов страны, что позволило разделить их на три основных геногруппы и, М и Ь, что соответствует их географическому распространению Из представленных в СепВапк последовательностей Ы-гена 1НЫУ мы выбрали десять изолятов, относящихся к трем указанным геногруппам, и провели выравнивание фрагмента 460 пн С помощью программы УейогШ! 6 0 были получены карты рестрикции выровненных фрагментов 1^-гена, анализ которых показал, что определить принадлежность изолятов к одной из трех геногрупп можно с использованием эндонуклеаз рестрикции Я$с41 и tfgaI Использование двух других ферментов - и НраП - сделало возможным разделение изолятов на подгруппы

Таблица 4 Экспериментально полученные карты рестрикции фрагмента 460 пн Ы-гена 13-ти изолятов 1НЫУ

Изолят (место выделения) Эндонуклеаза рестрикции

Bsell | BscA\ \ HpaW | HRa\

Геногруппа U

ЯВН (США) 267 98 95 460 297 152 11 460

10ис-26-4 (Россия) 267 98 95 460 297 152 11 460

58орг-4 (Россия) 267 98 95 460 297 152 11 460

Геногруппа М

HAG (США) 362 98 299 161 297 152 11 384 76

FR23/87 (Франция) 267 98 95 299 161 297 152 11 384 76

1-4008 (Италия) 267 98 95 299 161 297 152 11 384 76

БК-9995200(Германия) 267 98 95 299 161 297 152 И 384 76

DK-DF-4199(Германия) н/о* 299 161 297 152 11 384 76

DK-9695338 (Австрия) 267 98 95 299 161 297 152 11 384 76

Геногруппа Ь

ТЯ (США) | 362 98 [ 299 161 | 297 152 11 | 460

Геногруппа не определена

РШ/ОО (Россия) 202 160 98 460 210 152 75 12 11 384 76

?Я2/00 (Россия) 202 160 98 460 210 152 75 12 11 384 76

ри/0204 (Россия) 202 160 98 460 210 152 75 12 11 384 76

Примечание цифрами указаны размеры фрагментов, полученных после гидролиза ампликона 1НЫУ2ге\'-ШЫУ2 (460 пн) эндонуклеазами рестрикции, н/о - не определено

Карты гидролиза изолятов 1НЫУ, полученные с помощью компьютерного анализа, были экспериментально подтверждены рестрикцией тринадцати штаммов вируса с использованием четырех выбранных ферментов Полученные результаты позволили определить принадлежность десяти исследованных изолятов ШЫУ к трем основным геногруппам (таблица

4) Положение европейских изолятов в геногруппе М согласуется с литературными данными, как и положение камчатских изолятов в геногруппе U (личное сообщение Рудаковой С Л ) Три российских изолята, выделенные в Московской (FR1/00 и FR2/00) и Тверской (FU/0204) областях, сформировали отдельную подгруппу Распределение исследованных изолятов на группы коррелирует с географией их выделения и не зависит от вида-хозяина, что согласуется с данными по филогенетическому анализу вирусов VHS, SVC и IHN

Филогенетический анализ некоторых изолятов IIINV на основании иуклеотидной

последовательности фрагмента N-гена

-© LB-91K (Канада)

RB-76 (Канада)

58орг-4 (Россия, Камчатская обл ) T~QFU/0204 (Россия, Тверская обл.) х__1© FRI/00 (Россия, Московская обл) О FR2/00 (Россия, Московская обл )

__p@SRCV (США, Калифорния)

^в Со1-80(США, Калифорния)

И-геногруппа

lL-геногруппа

__sziei

'«ID ОП ,ä

) HO-7 (США, Айда») I ] 93-110 (США, Айдахо) 'О LR-80 (США, Айдахо) WRAC-1 (США, Afcuxo) 100 'eCST-82 (США, Айдахо)

М-геногруппа

О 005 замен/сайт

Рис 8 Дендрограмма, построенная методом объединения ближайших соседей, отражающая уровень нуклеотидных различий фрагмента N-гена величиной 460 пн генома различных штаммов IHNV Курсивом выделены российские изоляты Цифры на дендрограмме показывают индексы статистической надежности узлов дерева

Для подтверждения данных ПЦР-ПДРФ мы провели филогенетический анализ последовательностей фрагментов И-гена ШЫУ (460 пн), полученных го ОспСапк и в ходе данной работы Исследование дендрограммы (рис 8) выявило высокую степень гомологии между изолятами, образующими и-геногруппу, и камчатским изолятом 58орг-4 Данный факт согласуется с тем, что области нагула в океане для нерки, от которой был выделен вирус на Камчатке, и для популяций лососевых рыб из реки Колумбия и всех северных рек Северной Америки, являющихся хозяевами для изолятов и-геногруппы, частично перекрываются Кроме того, было показано, что изоляты РК1/00, FR2/00 и Ш/0204 с высокой надежностью по результатам перестановочного анализа образуют обособленную подгруппу в составе геногруппы и Генетическое родство указанных изолятов с вариантом вируса, циркулирующим на Камчатке, косвенно подтверждается данными о том, что в 1990-е годы для исследовательских целей завозили кижуча с Камчатки и, вероятно, занесли патоген в

форелевые хозяйства материковой части страны (личное сообщение Щелкунова И С) Можно предположить, что в европейской части России в дальнейшем произошла независимая эволюция 1НЫУ, а изоляты, выделенные в данном регионе, имеют монофилетическое происхождение и наиболее близки к изолятам североамериканской геногруппы и, куда входят изоляты с Камчатки

ВЫВОДЫ

1 Разработаны методы ОТ-ПЦР и ОТ-пгПЦР диагностики вирусов весенней виремии карпа (БУСУ) и инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (ШКУ), обладающие высокой чувствительностью и специфичностью Методы позволяют детектировать РНК вирусов в культуре клеток и в клиническом материале от зараженных рыб

2 С помощью клонирования участка К-гена 1НЫУ в однонитевой вектор М13тр8 сконструирован ДНК-зонд на вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани Показана пригодность зонда для детекции 1НЫУ и УШУ в культуре клеток

3 Разработан метод генотипирования штаммов вируса весенней виремии карпа и инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых с помощью ПЦР-ПДРФ-анализа Впервые проведено изучение генотипического разнообразия двадцати четырех изолятов БУСУ и тринадцати изолятов 1НЫУ

В рамках исследования

• показано, что все исследуемые изоляты БУСУ подразделяются на пять генетических групп Европейские штаммы входят в состав геногруппы 1, а изоляты из бывшего СССР образуют одну большую геногруппу 5 и три небольшие группы - 2,3 и 4

• определена принадлежность 10-ти исследованных изолятов Н-ГЫУ к трем основным геногруппам (и, М и Ь), выявлена принадлежность камчатских изолятов к геногруппе I), подтверждена принадлежность европейских изолятов к геногруппе М

4 На основании нуклеотидной последовательности фрагмента гена нуклеопротеина впервые проведено филогенетическое исследование восемнадцати изолятов БУСУ, принадлежащих к пяти геногруппам Показано, что исследованные изоляты имеют тенденцию образовывать генетические группы в зависимости от географии их выделения Филогенетический анализ подтвердил достоверность результатов, полученных с помощью ПЦР-ПДРФ-анализа, что дает основания рекомендовать эту более простую методику к использованию в диагностических лабораториях для проведения широкомасштабных эпидемиологических исследований

5 В результате проведенного филогенетического анализа изолятов 1НЫУ на основании нуклеотидной последовательности фрагмента гена нуклеопротеина впервые обнаружено,

что па территории России наряду с камчатскими изолятами, генетически близкими североамериканским изолятам геногруппы U, в подмосковном регионе циркулируют штаммы, образующие отдельную подгруппу в составе геногруппы U, что указывает на их монофилетическое происхождение

Список публикаций.

1 Shchelkunov I S , Oreshkova S F, Popova A G , Nikolenko G N, Shchelkunova TI, Ilyichev A A Development of PCR-based techniques for routine detection and grouping of spring viraemia of carp virus // In Health and Diseases of Aquatic Organisms Bilateral Perspectives Ed Michigan State University, 2005 -P 260-284

2 Shchelkunov I S , Popova A G, Shchelkunova T I, Oreshkova S F , Pichugina T D , Zavyalova E A, and Bonsova M N First finding of spring viraemia of carp virus in Moscow Province, Russia // J Fish Dis -2005 -V 25, N5 -P 203-211

3 Щелкунов И С , Орешкова С Ф, Попова А Г, Щелкунова Т И, Блинова Н Н , ИльичевА А Выявление вируса весенней виремии карпа в материалах от рыб путем выделения на культуре клеток и методом ПЦР В кн «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» Матер междун научно-практич конф -Щелково, 26-27 мая 2005г-С 243-247

4 Попова А Г, Орешкова С Ф, Щелкунов И С , Рудакова С JI, Щелкунова Т И , Тикунова Н В , Блинова Н Н, Ильичев А А Разработка методов идентификации и типирования вируса инфекционного некроза гемопозтической ткани лососевых на основе ОТ-ПЦР // Вопросы вирусологии-2008 -№3 - С 37-41

Доклады и тезисы конференций:

1 Oreshkova S F, Shchelkunov I S, Voronova О S, Popova A G, Nikolenko G N, Shchelkunova TI, Ilyichev A A Development of Methods for Diagnosis and Specific Prevention of Spring Viraemia of Carp In Abstr of the the Second United States and Russia Bilateral Conference "Aquatic&Marine Animal Health", Shepherdstown, West Virginia, USA, September 21-28, 2003 -P 19

2 Попова А Г, Орешкова С Ф Разработка методов диагностики и типирования вируса весенней виремии карпа Доклад на конференции молодых ученых ГНЦ ВБ «Вектор» 2003

3 Щелкунов И С , Орешкова С Ф, Попова А Г, Щелкунова Т И, Блинов А Г, Ильичев А А Молекулярно-генетический анализ и типирование полевых изолятов Rhabdovirus сагрю европейского ареала Науч труды Межд биотехнол центра МГУ, тез докл второй межд науч конф «Биотехнология - охране окружающей среды» и третьей школы-конф молодых ученых и

студентов «Сохранение биоразнообразия и рационального использования биологических ресурсов», Москва, МГУ, 25-27 мая 2004 г - С 194

4 Попова А Г, Щелкунов И С, Рудакова С Л, Орешкова С Ф , Блинова Н Н , Ильичев А А Разработка методов идентификации и типирования вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых на основе ОТ-ПЦР Материалы международной научно-практической конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, 27-29 сентября 2006 г - С 298-299

Попова А Г

Попова Анастасия Геннадьевна

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ РАБДОВИРУСОВ НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ИХ ДИАГНОСТИКИ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ И ГИБРИДИЗАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ

КИСЛОТ

Автореф дисс на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать 16 04 2008 Заказ № 29 Формат 60x90/16 Уел печ л 1 Тираж 100 экз Типография Института катализа им Г К Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Попова, Анастасия Геннадьевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ ^

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Вирусные заболевания культивируемых видов рыб

2.1.1. Семейство Rhabdoviridae

2.1.1.1. Структура рабдовирусов

2.1.1.2. Особенности генома рабдовирусов рыб

2.1.2. Некоторые заболевания культивируемых видов рыб, вызываемые рабдовирусами

2.1.2.1 Инфекционный некроз гемопоэтической ткани (ИНГТ)

2.1.2.2. Вирусная геморрагическая септицимия (ВГС)

- 2.1.2.3. Весенняя виремия карпа (ВВК)

2.1.3 Методы профилактики и лечения вирусных заболеваний рыб

2.2. Методы диагностики вирусных заболеваний рыб

2.2.1. Традиционные методы диагностики вирусных заболеваний в аквакультуре

2.2.2. Гибридизация нуклеиновых кислот

2.2.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и молекулярно-генетический анализ * 25 2.2.3.1. Новейшие модификации метода ПЦР в диагностике вирусных инфекций рыб '

2.2.3.1.1. Мультиплексная ПЦР

2.2.3.1.2 ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR)

2.3. Генетическое типирование и филогенетический анализ рабдовирусов рыб

2.3.1. Вирус геморрагической септицимии

2.3.2. Вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани

2.3.3. Вирус весенней виремии карпа

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение генетического разнообразия рабдовирусов низших позвоночных и разработка методов их диагностики с помощью полимеразной цепной реакции и гибридизации нуклеиновых кислот"

История аквакультуры насчитывает тысячи лет, беря свое начало в государствах Древнего Востока. Однако за последние 20-25 лет в ее развитии произошли революционные изменения, вызванные истощением биологических ресурсов океана и континентальных пресных вод, издавна служивших человеку источником высокоценных пищевых продуктов. Будучи сегодня самым перспективным и быстрорастущим сектором сферы производства продуктов питания, аквакультура все больше замещает промышленный промысел гидробионтов в дикой природе. Серьезным препятствием на пути успешного развития аквакультуры являются болезни объектов культивирования, при этом основной ущерб наносят вирусные инфекции рыб. Несмотря на то, что современная ихтиовирусология - сравнительно молодая наука, уже обнаружено около 350 вирусов гидробионтов. Список открываемых вирусов, как правило, пополняется после введения в аквакультуру новых объектов разведения (Щелкунов И. С., 2006).

Рабдовирусы составляют группу особо значимых вирусных патогенов культивируемых видов рыб. Наиболее интенсивно изучались вирусы, инфицирующие лососевые породы, такие как вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV) и вирусной геморрагической септицемки (VHSV), так как именно эти патогены имеют наибольшее экономическое значение для мирового производства рыбы. В России, наряду с инфекционным некрозом гемопоэтцческой ткани лососевых, весьма масштабной проблемой является весенняя виремия карпа (ВВК), вызываемая вирусом SVCV.

В последнее время большое внимание уделяется разработке методов молекулярно-генетической диагностики вирусных инфекций рыб, основанных на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти методы обладают рядом очевидных достоинств, среди которых быстрота получения результата, высокая чувствительность и специфичность, возможность осуществления генетического типирования изолятов.

Для создания эффективной системы ПЦР-диагностики очень важны данные по изменчивости геномов патогенных штаммов вируса, выделенных от хозяев из разных географических областей. Эти данные необходимы для создания тест-систем, способных различать генетические варианты вируса и, тем самым, прослеживать пути распространения инфекции.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования было создание эффективных диагностических тест-систем на вирусы SVC и JHN на основе методов ПЦР и молекулярной гибридизации, изучение генетического разнообразия данных патогенов, а также разработка методов их генотипирования с помощью молекулярно-биологических методов.

В ходе работы решались следующие задачи:

1. Разработка метода ОТ-пгПЦР для выявления вирусов весенней виремии карпа и инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых.

2. Конструирование зондов и создание системы детекции IHNV с помощью гибридизационного анализа.

3. Определение чувствительности и специфичности разработанных методов идентификации SVCV и IHNV в зараженной культуре клеток и в клиническом материале от инфицированных рыб.

4. Разработка способов генетического типирования штаммов SVCV и IHNV на основании методов ПЦР и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

5. Филогенетический анализ штаммов SVCV и IHNV на основе данных о нуклеотидной последовательности участков генов нуклеопротеина.

Положения, выносимые на защиту

1. Системы ОТ-пгПЦР-диагностики на вирусы весенней виремии карпа (SVCV) и инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV) позволяющие выявлять вирусную РНК с высокой .чувствительностью и специфичностью в препаратах культуральных вирусов и в клиническом материале от больных рыб.

2. Способ генотипирования рабдовирусов рыб с помощью ПДРФ-анализа. Все исследуемые изоляты SVCV образуют пять генетических групп. Исследованные изоляты IHNV принадлежат к трем основным геногруппам (U, М и L).

3. Филогенетическое исследование участков гена нуклеопротеина для восемнадцати изолятов SVCV и тринадцати изолятов IHNV. Изоляты SVCV образуют генетические группы в зависимости от географии их выделения. Камчатский изолят IHNV генетически близок североамериканским изолятам геногруппы U, а изоляты, выделенные в подмосковном регионе, образуют обособленную подгруппу в составе геногруппы U.

Научная новизна и практическая ценность работы

В результате проделанной работы на основе методов полимеразной цепной реакции и гибридизации нуклеиновых кислот впервые созданы тест-системы для идентификации РНК вирусов весенней виремии карпа и инфекционного некроза гемопоэтической ткани в инфицированных культурах клеток, в органах и тканях рыб. Разработаны методы генетического типирования изолятов указанных патогенов с помощью ПЦР и ПДРФ-анализа. Впервые проведен филогенетический анализ последовательностей гена нуклеопротеина для 12 российских и 6 европейских изолятов SVCV и показано их различие на генетическом уровне. Также выполнен филогенетический анализ последовательностей гена нуклеопротеина для изолятов IHNV. Проведено сравнение изолятов, выделенных из естественных водоемов Камчатки и из форелевых рыбоводных хозяйств Московской и Тверской областей с изолятами, распространенными на Тихоокеанском побережье Северной Америки.

Результаты настоящих исследований могут представлять интерес для практического рыбоводства, так как позволяют специфично, с высокой чувствительностью и в короткие сроки выявлять патогены, вызывающие наиболее опасные заболевания разводимых видов рыб (карповых" и лососевых). Знание эпизоотической обстановки как в естественных водоемах, так и на рыбоводных заводах и хозяйствах позволяет оценивать риск распространения опасных вирусных агентов среди разводимой рыбы, и, как следствие, избегать существенных экономических потерь. Информация, полученная с помощью разработанных методов генотипирования SVCV и IHNV, поможет проследить перемещение генетических вариантов вирусов, как в России, так и за рубежом при перевозке икры и живой рыбы для воспроизводства, что позволит своевременно и эффективно осуществлять соответствующие профилактические мероприятия.

Апробация работы и публикации

По материалам диссертации -опубликовано три статьи в реферируемых научных журналах и одна в книге «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Полученные результаты были пpeдcfaвлeны на трех международных конференциях: Second United States and Russia Bilateral Conference "Aquatic&Marine Animal Health" (Shepherdstown, West Virginia, USA, 2003), 2-ой международной конференции (Москва, МГУ, 2004), международной научно-практической конференции

Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006).

Вклад автора

Выделение препаратов РНК вирусов, конструирование ДНК-зонда для IHNV на основе ДНК фага М13, мечение ДНК-зонда N-гидрок^исукцинимидным эфиром биотина, гибридизационный анализ, выравнивание последовательностей фрагментов N-генов SVCV и IHNV, поиск сайтов рестрикции, ПЦР-ПДРФ анализ всех изученных изолятов SVCV и IHNV выполнен автором самостоятельно. Секвенирование ПЦР-фрагментов проводилось А.Г. Блиновым (ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск), И.В. Бабкиным и А.В. Качко (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, г. Новосибирск). Филогенетический анализ генетического разнообразия изолятов вирусов проведен автором совместно с И.В. Бабкиным.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Попова, Анастасия Геннадьевна

6. ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы ОТ-ПЦР и ОТ-пгПЦР диагностики вирусов весенней виремии "карпа (SVCV) и инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (IHNV), обладающие высокой чувствительностью и специфичностью. Методы позволяют детектировать РНК вирусов в культуре клеток и в клиническом материале от зараженных рыб.

2. С помощью клонирования участка N-гена IHNV в однонитевой вектор М13тр8 сконструирован ДНК-зонд на вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани. Показана пригодность зонда для детекции IHNV и VHSV в культуре клеток.

3. Разработан метод генотипирования штаммов вируса весенней виремии карпа и инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых с помощью ПДРФ-анализа. Впервые проведено изучение, генотипического разнообразия двадцати четырех .изолятов SVCV и тринадцати изолятов IHNV.

В рамках исследования:

• показано, что все исследуемые изоляты SVCV подразделяются на пять генетических групп. Европейские штаммы входят в состав одной большой геногруппы 1, а изоляты из бывшего СССР образуют одну большую геногруппу 5 и три небольшие группы — 2, 3 и 4.

• определена принадлежность 10 исследованных изолятов IHNV к трем основным геногруппам (U, М и L), выявлена принадлежность камчатских изолятов к геногруппе U, подтверждена принадлежность европейских к геногруппе М.

4. На основанйи нуклеотидной последовательности фрагмента гена нуклеопротеина впервые проведено филогенетическое исследование восемнадцати изолятов SVCV, принадлежащих к пяти геногруппам. Показано, что исследованные изоляты имеют тенденцию образовывать генетические группы в зависимости от географии их выделения. Филогенетический анализ подтвердил достоверность результатов, полученных с помощью ПЦР-ПДРФ, что дает основания рекомендовать эту более простую методику к использованию в диагностических лабораториях для проведения широкомасштабных эпидемиологических исследований.

5. В результате проведенного филогенетического анализа изолятов IHNV на основании нуклеотидной последовательности фрагмента гена нуклеопротеина впервые обнаружено, что на территории'России наряду с камчатскими изолятами, генетически ,близкими североамериканским изолятам геногруппы U, в подмосковном регионе циркулируют штаммы, образующие отдельную подгруппу в составе геногруппы U, что указывает на их монофилетическое происхождение.

2.4. Заключение

Ресурсы рек, озёр, Морей и океанов не безграничны, и уловы ценной в пищевом отношении рыбы ежегодно снижаются. Таким образом, ускоренное развитие рыбоводства, позволяющего реально и в короткие сроки обеспечить население рыбой и её продукцией, становится все более актуальным.

Вирусные болезни разводимых видов гидробионтов, возникающие вследствие бурного развития аквакультуры, наносят большой ущерб этой отрасли. Наибольший урон для мирового производства рыбы наносят вирусы IHN и VHS, поражающие рыбу лососевых пород. В России, в странах бывшего СССР и Восточного блока основной вирусной болезнью рыб является весенняя виремия карпа, традиционного объекта выращивания в европейской аквакультуре.

В настоящее время не существует эффективных методов лечения вирусных заболеваний гидробионтов, поэтому на первое место выходит разработка методов профилактики возникновения эпизоотии, в том числе своевременная и быстрая диагностика вирусных инфекций. Методы диагностики вирусных заболеваний рыб традиционно основаны на выделении вируса в чувствительной культуре клеток с последующей идентификацией в реакции нейтрализации со специфическими антителами (Amos, 1985). Однако эти методы требуют много времени и не позволяют дифференцировать генотипы вируса. Попытки преодолеть эти проблемы привели к созданию иммунологических тестов, таких как ELISA, иммунофлуоресцентный, иммуноферментный и радиоиммунный анализ. Данные методы обеспечивают быстрое получение результата, но, с другой стороны, они недостаточно чувствительны и специфичны, в частности, при идентификации рабдовирусов рыб (Dixon and Longshaw, 2005).

Новым этапом в совершенствовании методик, используемых для диагностики вирусных заболеваний гидробионтов, стало применеие для этих целей методов молекулярной биологии, основанных на гибридизации и полимеразной цепной реакции. Как видно из обзора литературы, в настоящее время такие методы разработаны для диагностики многих экономически значимых патогенов культивируемых рыб, моллюсков и ракообразных (Asche, 1996; Miller et al., 1998, Walker and Subasinghe, 2000). IHNV стал первым рабдовирусом рыб, для которого такой метод был разработан (Arakawa et al., 1990).

Необходимость изучения вариабельности геномов вирусных агентов, поражающих разводимые виды гидробионтов, продиктована тем, что эти патогены были обнаружены далеко за пределами прежних хорошо известных ареалов. Так, IHNV, широко распространенный в Северной Америке и встречавшийся в Японии, в 1987 г. был выявлен в Европе (Bovo et al., 1987), a VHSV, считавшийся исключительно европейским эндемиком, в 1988 г. был изолирован в США от идущих на нерест лососей (Meyers et al., 1999). Вирус весенней виремии карпа, традиционно являющегося объектом европейской аквакультуры, в 2002 г. был обнаружен на территории США (Goodwin, 2002), а в 2004 г. - в одном из северных регионов Китая (Liu et al., 2004). В связи с этим в мировой ихтиовирусологии появилось новое направление - молекулярная эпизоотология. Предметом ее исследования стало генетическое разнообразие и родство изолятов, базирующееся на особенностях изменчивости генома вируса. Из приведенных выше литературных данных видно, что это дало возможность устанавливать географию происхождения вирусных изолятов, отслеживать пути их перемещения и эволюцию вирусов. Рабдовирусам, как группе наиболее значимЬтх патогенов рыб, было уделено особое внимание, что отражено в литературном обзоре.

Успех генетического анализа вирусов VHS и IHN, а также первые попытки филогенетического анализа SVCV, описанные в литературе, подтверждают широкие возможности использования методов молекулярной биологии для генотипирования вирусных изолятов.

В связи с высоким риском распространения опасных вирусных болезней в аквакультуре необходимы новые более удобные, экономичные и чувствительные методы генотипирования вирусов. Это позволит оперативно отслеживать перемещение патогенных вирусных штаммов между континентами и внутри них и своевременно принимать необходимые меры профилактики и борьбы с болезнями.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 3.1. Материалы

Реактивы:

В работе использованы реактивы следующих фирм:

1. "Sigma", США: ЭДТА, 2-р-меркаптоэтанол, агароза А9539, акриламид, метиленбисакриламид, поливинилпирралидон, глицин, MOPS, IPTG, найлоновые фильтры для гибридизации, размер пор 0,45 мкм, N-гидроксисукцинимидный эфир биотина, конъюгат стрептаведина со щелочной фосфотазой.

2. "Serva", ФРГ: бромистый этидий, бромфеноловый синий, SDS, ТЕМЕД, Tween-20;

3. "ICN Biomedicals", США - нитротетразолевый синий, 5-бром-З-индолил-фосфат;

4. "Fluka", Швейцария: дрожжевой экстракт, пептон;

5. "Difco", США: триптон, бакто-агар;

6. "Сибэнзим", г. Новосибирск, Россия: Y-Gal, буферы для эндонуклеаз рестрикции (1(B), 2(G), 4(W), 5(Y)), набор для проведения реакции обратной транскрипции (буфер, вода, 0,5 mM dNTP), набор для проведения ПЦР (буфер, вода, 0,5 тМ dNTP), ферменты (эндонуклеазы рестрикции Bsa29l, As'oMAI, Rsal, Fokl, Tru9l, Psil, Hindlll, Sfr21Al, Sail, BstNl, Bse II, Bsc4l, Hp all, Hgal, ДНК-лигаза фага T4, ДНК-полимераза Thermus aquaticus, обратная транскриптаза M-MuLV), маркеры молекулярного веса ДНК.

Все остальные реактивы были произведены в ВО "Реахим" и имели квалификацию "осч", "чда" и 'Ччм.

Олигонуклеотиды:

Олигонуклеотиды, использованные в данной работе, были синтезированы фосфонатным методом (Froechler et al., 1986) в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора Горбуновым Ю.А.

Последовательности праймеров указаны в таблице 2. Таблица 2. Последовательности праймеров, использованных в работе п/п Праймер Ориентация Последовательность Положение на геноме

1 IHNV2Rev прямой 5'-ACAGAACAAGCAGAACTATTT 111 - 131

2г IHNV1 обратный 5'-TTGATGAGAATGATCCCATAG 748 - 770

3 IHNV2 обратный 5'-GAAGAGGAGGCCGGTCAC 553 - 570

4 GSout прямой 5 '-AG AG АТСССТАС АСС AGAGAC 3507 - 3527

5 GSin прямой 5'-TCACCCTGCCAGACTCATTGG 3567 - 3587

6 GASin обратный 5 '-ATAGATGGAGCCTTTGTGCAT 4028 - 4049

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Попова, Анастасия Геннадьевна, Кольцово

1. Адаричев В. А., Дымшиц Г. М., Калачиков С. М. Получение ДНК, несущей алифатические аминогруппы, и использование её флуоресцентного производного в качестве зонда при молекулярной гибридизации. // Биоорган. Химия. 1987. - Т. 13. - №8. -С. 1066-1069.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. С. 101-102.

3. Найк Д. Вирусологоия. М.: Мир, 1989. С. 419-443.

4. Орешкова С. Ф., Тикунова Н. В., Щелкунов И. С., Щелкунова Т. И., Ильичёв А. А. Обнаружение вируса весенней виремии карпа гибридизацией с нерадиоактивными ДНК-зондами. //Молек. генет., микробиол. вирусол. 1996. - №2. - С. 22-25.

5. Рудакова С. Л. Некроз гемопоэтической ткани у производителей нерки и предполагаемые источники инфекции. // Вопросы рыболовства. — 2003. Т. 4. - №1 (13).1. С. 93-102.

6. Рудакова С.Л. Анализ развития эпизоотии, вызванной вирусом инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV) у мальков нерки Oncorhynchus пегка при искусственном выращивании (Камчатка). // Вопр. рыбол. 2004. - Т. 5. - № 2 (18). - С. 362-374.

7. Херрингтон С., Манги Д. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М.: Мир. -1999. С. 374, 395-402.

8. Щелкунов И. С., Орешкова С. Ф. Новые перспективы в диагностике вирусных болезней рыб: разработка тест-систем для выявления возбудителя весенней виремии карпа на основе методов анализа генома. // Москва. 2006.

9. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. Новосибирск, Издательтво новосибирского университета, 1994. Т. 1. С. 138-150.

10. Ahne W., Bjorklund H.V., Essbauer S., Fijan N., Kurath G., Winton J.R. Spring Viremia of Carp (SVC). // Deseases of aquatic organisms. 2002. - N10. - P. 261-272.

11. Ahne W., Kurath G., Winton J. R. A ribonuclease protection assay can distinguish spring viremia of carp virus from pike fry rhabdovirus. // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 1998. - V. 18. -P.220-224.

12. Amos К. H. Procedures for the detection and identification of certain fish pathogens. // 3-rd Ed. 1985,- Corvallis, Oregon.

13. Asche V. Recent advances in microbiology. // The Australian Society for Microbiology Inc. -1996.-P. 41-55.

14. Ball L. A., Pringle C. R., Flangan В., Perepelitsa V. P., Wertz G. W. Phenotypic Consequences of Rearranging the P, M, and G Genes of Vesicular Stomatitis Virus. // J. Virology. 1999. - June. - P. 4705-4712.

15. Basurco В., Vende P., Monnier A. F., Winton J. R., de Kinkelin P., Benmansour A. Genetic diversity and phylogenetic classification of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV). // Vet Res. 1995. - V. 26. - P. 460-463

16. Benmansour A, de Kinkelin P. Live fish vaccines: history and perspectives. // Dev Biol Stand. 1997. -V. 90. - P. 279-289.

17. Bernard J., Bremont M. Molecular biology of fish viruses: a review. // Vet. Res. 1995. - V. 26.-P. 341-351.'

18. Bernard J., Bremont M., Winton J. Nucleocapsid gene sequence of a North American isolate of viral haemorrhagic septicaemia virus, a fish rhabdovirus. // J. Gen. Virol. 1992. — V. 77 — P.1011-1014.

19. Bernard J., Lecocq-Xhonneux F., Rossius M., Thiry M.E., de Kinkelin P. Cloning and sequencing the messenger RNA of the N gene of viral haemorrhagic septicaemia virus. // J. Gen. Virol.- 1990.-V.71-P. 1669-1674.

20. Bjorklund H.V., Emmenegger E. J., Kurath G. Comparison of the polymerase (L genes) of spring virmia of carp virus and infectious hematopoetic necrosis virus. // Vet Res. 1995. - V.26.-P. 394-398.

21. Bovo G., Gioggetti G., Jorgensen P. E. V., OlsenN. J. Infectious haematopoietic necrosis: first detection in Italy. // Bui. Eur. Ass. Fish Pathol. 1987. - V.7. - P. 124.т

22. Bruchhof В., Marquardt O., Enzmann P.-J. Differential diagnosis of fish pathogenic rhabdoviruses by reverse transcriptase-dependent polymerase chain reaction. // J.Virol. Methods.- 1995.-V.55.-P. 111-119.

23. Brown L.L., Sperker S.A., Clouthier S., Thornton J.C. Development of a vaccine against infectious salmon anemia virus. // 9th International Conference "Diseases of fish and Shellfish".- 1999. Rhodes, Greece. - Abstract book. - P. 258.

24. Christie K.E. Immunization with viral antigens: infectious pancreatic necrosis. // Dev.Biol.Stand. 1997. -V. 90. - P. 191-199.

25. Chou P. P., Drolet B. S., Leong J. C. Polimerase chain amplification of infectious hematopoetic necrosis virus RNA extracted from fixed and embadded fish tissue. // Journal of Aquatic Animal Health. 1995. - V. 7. - P. 9-15.

26. Chico V., Gomez N., Estepa A., Perez L. Rapid detection and quantitation of viral hemorrhagic septicemia virus in experimentally challenged rainbow trout by real-time RT-PCR. // Journal of Virological Methods. 2006. - V. 132. - P. 154-159.

27. Chomczynski P.; Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal. Biochem. 1987. - V.162. - P. 156-159.

28. Cupit P.M., Lorenzen N., Strachan G., Kemp G.J.L., Secombes C.J., Cunningham C. Neutralisation and binding of VHS virus by monovalent antibody fragments. // Virus Research. -2001.-V. 81.-P. 47-56.

29. De Kinkelin'P., Bearzotti M., Castric J., Nougayrede P., Lecocq-Xhonneux F., Thiry M. Eighteen years of vaccination against viral haemorrhagic septicaemia in France. // Vet Res. — 1995.-N. 26(5-6).-P. 379-387.

30. Deering R. E., Arakawa С. K., Oshima К. H., O'Hara P. J., Landolt M. L., Winton J. R. Development of a biotinilated DNA probe and identification of infectious hematopoetic necrosis virus. // Dis. Aquat. Org. 1991. - V. 11. P. - 57-65.

31. Dixon P. F., Longshaw C.B. Assessment of commercial test kits for identification of spring viraemia of carp virus. // Dis. Aquat. Org. 2005. - V.67.- P. 25-29.

32. Dixon P. Immunization with viral antigens: viral diseases of carp and catfish. // Dev Biol Stand. 1997. - V. 90. - P. 221-32.

33. DNA-based molecular diagnostic techniques. Research needs for standardization and validation of the detection of aquatic animal pathogens and diseases // FAO Fisheries Technical Paper. 1999. - V. 395. - P. 1-3.

34. Einer-Jensen, K., Bjorklund, H., Oreshkova, S., Shchelkunov, I., Vesely, Т., Lorenzen, N. Detection and typing offish viruses. // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 2002. - V.22. - P. 158-165.

35. Einer-Jensen K., Ahrens P., Forsberg R., Lorenzen N. Evolution of the fish rhabdovirus viralhaemorrhagic septicaemia virus. // Journal of General Virology. — 2004. — V. 85. P. 1167— 1179.

36. Einer-Jensen K., Winton J., Lorenzen N. Genotyping of the fish rhabdovirus, viral haemorrhagic septicaemia virus, by restriction fragment length polymorphisms. // Veterinary Microbiology. 2005. - V. 106. - P. 167-178.

37. Emmenegger R. J., Meyers T. R., Burton Т. O., Kurath, G. Genetic diversity and epidemiology of infectious hematopoietic necrosis virus in Alaska. // Dis Aquat Org. 2000. — V. 40.-P. 163-176.

38. Enzmann P. J., Kurath G., Fichtner D., Bergmann S. M. Infectious hematopoietic necrosis virus: monophyletic origin of European isolates from North American genogroup M. // Dis. Aquat. Organ. 2005. - V.*66(3). - P. 187-95.

39. Estepa A., De Bias C., Ponz F., Coll J. M. Detection of trout hemorrhagic septicemia rhabdovirus by capture with monocldnal antibodies and amplification with PCR. // Vet. Res. -1995.-V. 26. -P. 530-532.

40. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. // Evolution. 1985. - V. 39. - P. 783-791.

41. Fichtner D., Bergmann S., Enzmann P. J., Weiland F., Granzow H. Characterization of viral haemorrhagic septicemia (VHS) virus isolates. // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 1998. - V. 18. - P. 56-61.

42. Fijan N., Petrinec Z., Sulimanovic D., Zwillenberg L.O. Isolation of the viral causative agent from the acute form of infectious dropsy of carp. // Vet. Arh. 1971.-V. 41.-P. 125-138.

43. Fijan N. Spring Viraemia of carp,and other viral disaeses and agents of warm-water fish. // In: Fish Diseases and Disorders. V. 3; Viral, Bacterial and Fungal infections, Woo P.T.K. & Bruno D.W., eds. CABI Publishing, UK. 1999. - P. 177-244.

44. Froehler B.C., Ny P. G. , Mattencci M. D. Synthesis of DNA via deoxinucleoside H-phosphonate intermediates. // Nucl. Acds Res. 1986. - V. 14. - P. 5399-5407.

45. Garver K.A., Troyer R.M., Kurath G. Two distinct phylogenetic clades of infectious hematopoietic necrosis virus overlap within the Columbia river basin. // Dis. Aquat. Org. 2003. -V. 55.-P.187-203.

46. Goldberg T.L., Coleman D.A., Grant E.C., Inendino K.R., Philipp D.P. Strain variation in an emerging iridovirus of warm-water fishes. // J.Virol. 2003. - V. 77.- P. 8812-8818.

47. Goodwin A.E. Spring Viraemia of Carp Virus in North America. // 5th international symposium for viruses of lower vertebrates. Seattle, Washington. - 2002. - Abstract book. - P. 6.

48. Gudding R., A. Lillehaug, O. Evensen. Recent developments in fish vaccinology. // Vet. Immunology & Immunopathology. 1999. - V. 72. - N. 12. - P. 203-212.

49. Heistinger H., Behm D., Janacek R. Experiences in oral vaccination of carp against spring viremia of carp. // 3th international Symposium on fish vaccinology. Bergen, Norway. - 2003. -Abstract book. - P.73.

50. Hoffmann В., Schutze II., Mettenleiter T.C. Determination of the complete genomic sequence and analisis of the gene products of the virus of Spring Viremia of Carp, a fish rhabdovirus. // Virus Research. 2002. - V. 84. - P. 89-100.

51. Hoffmann В., Schutze H:, Mettenleiter T.C. Determination of the complete genomic sequence and analisis of the gene products of the virus of Spring Viremia of Carp, a fish rhabdovirus. // Virus Research. 2002. - V. 84. - P. 89-100.

52. Hsu Y. L., Engelking H. M., Leong J. C. Occurrence of different types of infectious hematopoietic necrosis virus in fish. // Appl Environ Microbiol. 1986. - V. 52. - P. 1353— 1361.

53. Jensen, M. H. Research on the virus of Egtved disease. // Ann NY Acad Sci. 1965. - V. 126.-P. 422-426.

54. Jorgensen P. E. V., Olsen N. J., Ahne Lorenzen N. SVC and PFR viruses serological examination of 22 isolates identicates close relationship between the two rhabdoviruses. // Viruses of Lower Vertebrates, Spring Verlag. Heidelberg. 1989. - P. 349-366.

55. Koutna M., Vesely Т., Psikal I., Hulova J. Identification of spring viraemia of carp virus (SVCV) by combined RT-PCR and nested PCR. // Dis Aquat Org. 2003. - V. 55(3). - P. 229235.

56. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. // Briefings in Bioinformatics. 2004. - V. 5. — P. 150-163.

57. Kurath G., Higman К. H., Bjorklund H. V. The NV genes of fish rhabdoviruses: development of RNase protection assays for rapid assessment of genetic variation. // Vet Res. -1995. V. 26. - P. 477-485

58. Kurath G., Garver K.A, Troyer R.M., Emmenegger E.J., Einer-Jensen K., Anderson E.D. Phylogeography of infectious hematopoietic necrosis virus in North America. // J. Gen. Virol. -2003.-V. 84.-P. 803-814.

59. Leong J.C, Bootland L., Anderson E. et al. Viral vaccine for aquaculture. // J. Marine Biotechnology. -1995. V. 3. - P. 16-23.

60. Leong J. C., Hsu Y. L., H. Engelking M., Mulcahy D. Strains of infectious hematopoietic necrosis (IHN) virus may be identified by structural protein differences. // Dev. Biol. Stand. -1981.-V. 49.-P. 43-55.

61. Liu H, Gao L, Shi X, Gu T, Jiang Y & Chen H (2004). Isolation of spring viraemia of carp virus (SVCV) from cultured koi (Cyprinus carpio koi) and common carp (Cyprinus carpio carpio) in P.R. China. // Bull. EAFP. 2004. - V.24. - P. 194-202.

62. Liljeqvist S., Stahl S. Production of recombinant subunit vaccines: protein immunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines. // J. Bacteriology. — 1999. V. 73. - P. 1-33.

63. Lorenzen N, Lorenzen E, Einer-Jensen K. Immunity to viral hemorrhagic septicemia (VHS) following DNA vaccination of rainbow trout at an early life-stage. // Fish Shellfish Immunol. -2001.-V.l 1(7). P. 585-591.

64. Maxam A. M., Gilbert W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages. // Methods Enzymol. 1980. - V. 65. - P. 499.

65. Meyers T. R., Short S., Lipson K. Isolation of the North American strain of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) associated with epizootic mortality in two new host species of Alaskan marine fish. // Dis. Aquat. Org. 1999. - V. 38. - P. 81-86.

66. Messing J., Vieira J. A new pair of M13 vectors for selecting either DNA strand of double-digest restriction fragments. // Gene. 1982. - V. 19. - P. 269-276.

67. Nadin-Davis S. A. Polimerase chain reaction protocols for rabies virus discrimination. // J. Virol. Methods. 1998. - V. 75. - P. 1-8.

68. Nichol S. Т., Rowe J. E., Winton, J. R. Molecular epizootiology and evolution of the glycoprotein and non-virion protein genes of infectious hematopoietic necrosis virus, a fish rhabdovirus. // Virus Res. -Л995. V. 38. - P. 159-173.

69. Nunam, L.M., Tang-Nelson, K., Lightner, D.V. Real-time RT-PCR determination of viral copy number in Penaeus vannamei experimentally infected with Taura syndrome virus. // Aquaculture. 20*04. - V. 229. - P. 1-10.

70. Oshima К. H., Higmafi К. Н., Arakawa С. К. Genetic comparison of viral haemorrhagic septicemia virus isolated from North America and Europe. // Dis. Aquat. Org. 1993. - V. 17. -P. 73-80.

71. Oshima К. H., Arakawa С. K., Higman К. H., Landolt M. L., Nichol S. Т., Winton J. R. The genetic diversity and epizootiology of infectious hematopoietic necrosis virus. // Virus Res. -1995.-V. 35.-P. 123-141.

72. Overturf K., LaPatra S.E., Powell M. Real-time PCR for the detection and quantitative analysis of IHNV in salmonids. // J. Fish Dis. 2001. - V. 24. - P. 325-333.

73. Poinan A., Gomes A., Oliveira R., Silva J. Migration of vesicular stomatitis virus glycoprotein to the nucleus of infected cells. // Biochemistry. 1996. - V. 93. - P. 8268-8273.

74. Roy P., Gupta K.C., Kiuchi A. Characterisation of .spring viremia of carp virus mRNA species and the 3'sequence of the viral RNA. // Virus Res. 1984. - V.l. - P. 189-202.

75. Rudakova S.L., Kurath G., Bochkova E.V. Occurrence and genetic typing of infectious hematopoietic necrosis virus in Kamchatka, Russia // Dis Aquat Org. 2007 - V.75. - P. 1-11.

76. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. // Mol. Biol. Evol. 1987. - V. 4. - P. 40-425.

77. Schutze H., Enzmann P. J., Kuchling R., Mundt E., Niemann H., Mettenleitter Т. C. Complete genomic sequence of the fish rhabdovirus infectious hematopoetic necrosis virus. // J. Gen. Virol. 1995. - V. 76. - P. 2519-2527.

78. Scherba G., Jin L., Schitzlein W. H., Vodkin M. H. Differential polimerase chain reaction for detection of wild-type and a vaccine strain of Aujeszky's disease (pseudorabies) virus. // J. Virol. Methods. 1992. - V. 32. - P. 131-143.

79. Shchelkunov I. S. Report on results of FAO consultancy mission in Iraq aimed at identification and control of an acute epizootic in fish cultured in the national inland aquaculture, TEMP/INT/859/MSC. // Rome, FAO. 2002. - P,12.

80. Snow M., Cunningham C.O., Melvin W.T., Kurath G. Analysis of the glycoprotein gene identifies distinct lineages of viral haemorrhagic septicaemia virus within European marine environment. // Virus Res. 1999. - V. 63. - P. 35-44.

81. Spada E., Ciccaglione A. R., Dettori S., Chionfte P., Kondili L. A., Amoroso P., Guadagnino V., Greco M., Rapicetta M. Genotyping HCV isolates from Italy by type-specific PCR assay in the core region. // Res. Virol. 1998. - V. 149. - P. 209-218.

82. Thompson J. D., Gibson T. J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D. G. The ClustalX Windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 24. - P. 4876-4882.

83. Troyer R. M., LaPatra S., Kurath G. Genetic analyses reveal unusually high diversity of infectious hemat6poietic necrosis virus in rainbow trout aquaculture. // J Gen Virol. 2000. — V. 81.-P. 2823-2832.

84. Troyer R. M., Kurath G. Molecular epidemiology of infectious hematopoetic necrosisi virus reveals complex virus traffic and evolution within southern Idaho aquaculture. // Dis. Aquat. Org. 2003. - V.55. - P. 178-185.

85. Williams K., Blake S., Sweeney A., Singer J. Т., Nicholson B. L. Multiplex Reverse Transcriptase PCR assay for simultaneous detection of three fish viruses. // Journal of Clinical Microbiology. 1999. - V. 37. - P. 4139-4141.

86. Winton JR. Immunization with viral antigens: infectious haematopoietic necrosis. // Dev Biol Stand. 1997. - V. 90. - P. 211-220.

87. Walker P., Subasinghe R. (Eds.) DNA-based Molecular Diagnostic Techniques. Research Needs for Standardization and Validation of the Detection of Aquatic Animal Pathogens and Diseases. // FAO Fisheries Technical Paper 395. FAO, Rome. 2000. - P.93.

88. Wolf И., Haus M., Leser U. Sandwich nucleic acid hybridization as a universally usable method for routine diagnosis. // Zbl. Bakteriol., M;krobiol. und Hyg. 1985. - V. 4. - P. 519-520.