Изучение генетического разнообразия изолятов вируса гепатита С и факторов риска инфицирования у пациентов с острыми и хроническими гапатитами в Новосибирске

Плясунова, Ирина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение генетического разнообразия изолятов вируса гепатита С и факторов риска инфицирования у пациентов с острыми и хроническими гапатитами в Новосибирске
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетического разнообразия изолятов вируса гепатита С и факторов риска инфицирования у пациентов с острыми и хроническими гапатитами в Новосибирске"

На правах рукописи

Плясунова Ирина Викторовна

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА С И ФАКТОРОВ РИСКА ИНФИЦИРОВАНИЯ У ПАЦИЕНТОВ С ОСТРЫМИ И ХРОНИЧЕСКИМИ ГЕПАТИТАМИ В НОВОСИБИРСКЕ

03.00.06 — вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 4 ЛЕК 2Си9

Кольцово - 2009

003490063

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора Минздравсоцразвипгия России.

Научный руководитель:

Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Нетёсов Сергей Викторович.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Щелкунов Сергей Николаевич кандидат биологических наук Коваленко Сергей Петрович

Ведущая организму: Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск)

Защита состоится « 29 » декабря 2009 г. в 9.00 часов на заседании диссертационного совета при ФГУН Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцове Новосибирской области, 630559, тел. 8(383)336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан ч2£л ноября 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Карпенко Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гепатит С - заболевание печени, этиологическим агентом которого является вирус гепатита С (ВГС). Гепатит С отличается медленным течением; в 75-85% случаев инфекция ВГС переходит в хроническую форму, которая может прогрессировать в цирроз или первичный рак печени (Chen et al., 2006). В настоящее время гепатит С представляет серьезную проблему для здравоохранения многих стран мира, в том числе и России. По оценкам Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) - в мире около 170 млн. лиц, инфицированных ВГС (WHO, 1999). В Российской Федерации с начала регистрации инфекции ВГС (1994 г.) и до 2001 года наблюдался ежегодный рост заболеваемости острым гепатитом С, что с одной стороны было связано с улучшением диагностики этой инфекции, а с другой обусловлено ростом внутривенного употребления наркотических препаратов в конце 90-х годов. По данным официальной статистики заболеваемость острым гепатитом С в 2001 году достигла 16,7 случаев на 100 тыс., тогда как в 1994 году регистрировали только 3,2 заболевших на 100 тыс. населения (ЗНиСО, 2002). Следует отметить, что официально регистрируемые случаи острых гепатитов не в полной мере отражают реальную картину заболеваемости, что в основном связано с бессимптомным течением острого гепатита С в большинстве случаев и со сложностью дифференциальной диагностики острой инфекции от случаев обострения хронического гепатита.

Отметим, что показатели впервые выявленных случаев хронического гепатита С в несколько раз превышают показатели заболеваемости острым гепатитом С. Так, отчётливый рост заболеваемости хроническим гепатитом С в конце 90-х годов (12,9 на 100 тыс. населения в 1999 г., 29,6 - в 2001 г.) явился отражением высокого уровня заболеваемости острой формой этой инфекции в середине 90-х. В общей численности вновь выявленных хронических гепатитов в последние годы именно на долю хронического гепатита С приходится более двух третей случаев. Так, по официальным данным за 2001 год доля хронического гепатита С составила 62,2%, хронического гепатита В - 33,8%, гепатитов неуточ-нёшюй этиологии - 4% (ЗНиСО, 2002). Однако официальные данные по выявлению хронических гепатитов являются неполными, поскольку ежегодно наряду с впервые выявленными больными с манифестными формами хронического гепатита В и С регистрируют большую когорту бессимптомных «носителей» вирусов.

причине их высокой стоимости и весьма ограниченного применения в Российской Федерации в то время. Из-за недостаточно эффективных методов диагностики более 11% регистрируемых случаев гепатитов оказывались гепатитами нерасшифрованной этиологии (Каира и др., 2001). Проведённые к 2001 году работы по эпидемиологии ВГС с привлечением используемых за рубежом молекулярно-эпидемиологических подходов, таких как подтверждающие серологические тесты, ПЦР анализ, генотипирование были единичными в России и затрагивали только отдельные регионы и популяционные группы (Кузин и др., 1999; Львов и др., 1997; Kalinina et al., 2001). В одном из наиболее крупных эпидемиологических исследований, проведённом в то время Львовым Д.К. и соавторами, была оценена только встречаемость серологических маркёров ВГС среди клинически здорового населения (доноры крови) в Европейской части России, некоторых областях Урала, Восточной Сибири, Дальнего Востока, Монголии и изучено генотипическое разнообразие в группе доноров и небольшой группе больных с разными клиническими формами гепатита С (п=180) из Москвы и Санкт-Петербурга (Львов и др., 1997). Структура и соотношение факторов риска инфицирования гепатитом С в России также были изучены недостаточно, в более чем 30% случаях факторы риска оставались неиденггифицированными (Закиров и др., 2003). Выводы о значимости тех или иных факторов риска строились лишь на сравнении процентов ВГС-инфицированных среди некоторых популяционных груш или основывались только на данных эпидемиологического анамнеза без использования специальных программ для обработки эпидемиологических данных (Epilnfo, SPSS), которыми пользуются зарубежные учёные.

В значительной степени из-за того, что в России не проводилось молекулярно-эпидемиологических исследований вирусных гепатитов с использованием современных международно-признанных подходов, в 1999 году в лаборатории молекулярной биологии РНК-содержащих вирусов ГНЦ ВБ «Вектор» нами был начат цикл молекулярно-эпидемиологических исследований, направленных на изучение распространенности, факторов риска, генотигшческого разнообразия ВГС на территории юга Западной Сибири. В Западно-Сибирском экономическом регионе, богатом ресурсами, проживает около 15 млн. человек, что составляет более 10% населения России, поэтому проведение эпидемиологических исследований на данной территории является весьма актуальным для России в целом. Исследования были проведены нами с привлечением современных методов и подходов в диагностике (подтверждающие серологические тесты, ПЦР анализ), генотипирова-нии (филогенетический анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей), обработке собранных эпидемиологических и молекулярно-биологических данных (использование программ Epilnfo, SPSS). На первом этапе были получены данные по встречаемости маркёров ВГС, факторам риска, распространённости генотипов среди пациентов инфекционных клиник и наркологического диспансера, медицинских работников, доноров, клинически здоровых людей; лиц с временным ухудшением здоровья, обратившихся к врачам-терапевтам (Шустов и др., 2000; 2002; 2004). При этом начатыми исследованиями остались неохваченными и другие представляющие интерес популяционные группы, например - пациенты с острыми и хроническими гепатитами. Более детальное изучение факторов риска заражения гепатитом С среди пациентов с острым и хроническим гепатитом, получете данных относительно гетерогенности генома ВГС и особенностей геноти-пического разнообразия изолятов в этих двух группах пациентов, получение информации о «вкладе» именно гепатита С в заболеваемость острыми и особенно хроническими гепатитами на изучаемой территории и явилось предметом изучения для настоящей работы.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение распространённости, генетического разнообразия вируса гепатита С и факторов риска инфицирования у пациентов с острыми и хроническими гепатитами на территории Западной Сибири (г. Новосибирск).

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Создание коллекции сывороток крови от 2-х групп пациентов: 1) пациенты с клиническими признаками острого гепатита; 2) пациенты с обострением хрошиеского гепатита. Для этого было необходимо подготовить пакет документов для рассмотрения и утверждения в этическом комитете ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор". Методом индивидуального анонимного интервью нужно было провести анкетирование обследованных лиц, собрать необходимые эпидемиологические данные и образцы сывороток крови.

2. Исследование встречаемости серологических маркёров и РНК вирусного гепатита С в образцах создашюй коллекции сывороток.

3. Изучение генетического разнообразия изолятов ВГС у пациентов с клиническими признаками острого гепатита и пациентов с обострением хронического гепатита.

4. Проведение статистико-эпидемиологичесхого анализа данных анкетирования и полученных результатов по распространённости ВГС и его генотипам для выявления и описания факторов риска инфицирования гепатитом С у пациентов с острым и хроническим гепатитом.

5. Проведение филогенетического анализа аминокислотных последовательностей Ш5В гена изолятов ВГС, полученных от пациентов с признаками острого гепатита и пациентов с хроническим гепатитом, и исследование генетических особенностей N8513 области генома изолятов ВГС, полученных от двух групп пациентов.

Научная новизна и практическая значимость работы.

1. Впервые получены данные по встречаемости маркёров ВГС у пациентов с обострением хронического гепатита в г. Новосибирске, оценена роль ВГС в этиологии острых и хронических гепатитов.

2. Нами одними из первых в России показана важность проведения ПЦР для обнаружения геномных маркёров ВГС и ВГВ в сыворотках крови хронически инфицированных пациентов, не имеющих серологических маркёров вирусных гепатитов В и С.

3. Проведено сравнение генотипического разнообразия изолятов ВГС у пациентов с острыми и хроническими гепатитами. Выявлены изоляты ВГС с уникальными заменами, которые не встречались до этого нигде в мире по результатам поиска в Международных базах данных.

4. Выявлены эпидемиологически значимые закономерности между соотношением генотипов ВГС и возрастом обследованных в группе пациентов с клиническими признаками острого гепатита и среди лиц с обострением хронического гепатита; в обследованных группах пациентов наблюдалось увеличение доли генотипа 1Ь и снижение доли генотипа За с увеличением возраста.

5. Обнаружены статистически значимые связи между определёнными факторами риска и генотипами ВГС в группе пациентов с хроническим гепатитом: генотип 1Ь достоверно чаще встречался у лиц, которым проводилось переливание крови, генотип 2 - среди получавших общую анестезию лиц.

Положения, выносимые на защиту.

1. Соотношение генотипов ВГС в разных возрастных группах у пациентов с клиническими признаками острого гепатита и лиц с обострением хронического гепатита различалось; с увеличением возраста обследованных пациентов наблюдалось увеличение доли генотипа 1Ь и снижение доли генотипа За.

2. Наиболее значимый фактор инфицирования ВГС в обследованных группах пациентов связан с внутривенным употреблением наркотических препаратов (отношение шансов: (Ж >6,98); в группе пациентов с клиническими признаками острого гепатита показано значение и интраназальное использование наркотических веществ ((Ж=8,29), Среди других выявленных факторов риска в отношении инфекции ВГС наибольшее значение имели: в группе пациентов с клиническими признаками острого гепатита - пребывание в местах лишения свободы (ОК=5,82) и нанесение та-

туировок (OR=4,37); в группе пациентов с обострением хронического гепатита -внутрисемейные контакты с больным острым гепатитом (OR=5,56).

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, 3 из них - в журналах, рекомендованных для опубликования основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Результаты работы были представлены в форме докладов на Международном междисциплинарном конгрессе «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека» (Судак, Украина, 10-21 июня 2004 г.), на Международной школе «10th International Workshop on Virus Evolution and Molecular Epidemiology» (Helsinki, Finland, 30 August - 3 September, 2004); в форме постерных докладов на научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002), на Международном вирусологическом конгрессе «XIV International Congress of Virology» (Istanbul, 10-15 August, 2008).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 218 страницах, содержит 17 таблиц и 28 рисунков. Состоит из «Введения», глав «Обзор литературы», «Материалы и методы» и «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы», а также «Приложения». Список литературы включает в себя 423 ссылки.

Вклад автора. Результаты работы, за исключением анкетирования пациентов, серологических тестов и ПЦР на ДНК ВГВ получены лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обслсдованные группы. В период с 2001 по 2003 гг. было проведено молекулярно-эпвдемио логическое исследование на предмет изучения ситуации с гепатитом С среди пациентов инфекционных больниц г. Новосибирска и Новосибирской области. Исследования было одобрены этическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор». К исследованию приглашались достигшие 18 летнего возраста лица на добровольной основе после подписания ими информированного согласия. От каждого пациента, согласившегося принять участие в обследовании, был получен образец сыворотки и заполнена анкета-опросник. В рамках данной работы было обследовано 2 группы пациентов: Группа 1 (п-689) - пациенты с клиническими признаками острого гепатита; обследовано 629 пациентов 1-ой Городской Инфекционной Клинической Больницы (ГИКБ, г. Новосибирск) и 60 пациентов Новосибирского государственного областного центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями (Центр СПИД, пос. Кольцово, Новосибирская обл.) в период с октября по декабрь 2001 г. и в аналогичный период с октября по декабрь 2002 г. Все пациенты поступили в вышеуказанные лечебные заведения с клиническими признаками острого гепатита и включали только первично госпитализированных по поводу гепатита пациентов. Группа 2 (п=164) - пациенты с обострением хронического гепатита; обследовано 164 пациента Новосибирской Областной Клинической Больницы (ОКБ, г. Новосибирск) в период с 1 июля 2002 г. по 31 декабря 2003 г.

Анкетирование. Нами совместно со специалистами отделения вирусных гепатитов CDC были разработаны два варианта анкет (опросных листов): первый - для исследования факторов риска в отношении инфекции ВГС у пациентов с острым гепатитом; второй -для пациентов с хроническим гепатитом. Анкеты включали широкий спектр вопросов, основные разделы были следующие: 1) Индивидуальный анамнез, состояние здоровья на момент обследования. 2) Нозокомиальные факторы риска. 3) Факторы профессионального риска. 4) Факторы риска, связанные с особенностями поведения и привычками. 5) Факторы риска со стороны ближайшего окружения. 6) Социально-экономические данные. 7) Результаты лабораторных исследований. Анкетирование добровольцев проводили врачи со-

ответствующего медицинского учреждения или сотрудники нашего отдела с медицинским образованием.

ИФА тесты. Сыворотки, собранные от пациентов с клиническими признаками острого гепатита, анализировали на наличие маркёров гепатитов А, В, С и Е, пробы от пациентов с обострением хронического гепатита тестировали на маркёры гепатитов В и С. ИФА тесты проводили в аттестованной лаборатории МСЧ-163 (пос. Кольцове) с использованием коммерческих тест-систем производства ЗАО "Вектор-Бест" (http:/www. vector-best.ru) на наличие следующих серологических маркёров: общих IgG к ВГС, IgG к Core и NS белкам ВГС; HBsAg, суммарных антител к HBcAg, IgM к HBcAg, HBeAg, IgG к HBeAg; IgM к ВГА; IgM к ВГЕ, IgG к ВГЕ.

Выделение суммарных РНК. Выделение суммарных РНК проводили методом SDS/EDTA/фенол из 50 мкл сыворотки. Данная методика была оформлена в,соответствии с требованиями Службы качества, согласована с отделом биобезопасности'и утверждена Генеральным директором ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Обратная транскрипция (ОТ). Комплементарные ДНК синтезировали на матрице суммарной РНК с использованием статистического праймера dNj. Синтез проводили в 20 мкл раствора состава: 50 мМ Tris-HCl рН8.3, 40 мМ KCl, 1 мМ МпС12, 1 мМ DTT, 200 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 15 нг/мкл гексамера dh'6¡ 70 е.а. обратной транскриптазы Mo-MuLV (Amersham, USA) при 37°С в течете 1 часа.

Полимеразная цепная реакция. Амплификацию осуществляли в 30 мкл смеси, содержащей 60 мМ Трис-НС1, 1,5 мМ MgC12, 25 мМ KCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,08 o.e./ml праймеров, 1 ед. ДНК-полимеразы Taq (ЗАО "Сибэнзим", г. Новосибирск). Температурные условия амплификации для разных пар праймеров подбирали экспериментально (типичные условия: 95° С -1 мин, T,,,,, -1 мин, 72° С -1 мин, 40 циклов -для первого раунда ПЦР и 30 циклов - для второго). Использовали по 2 пары праймеров (по схеме "гнездовой" ПЦР) для 5'-UTR и NS5B районов генома ВГС.

Определение нуклеотидиых последовательностей. Нуклеотидкые последовательности продуктов амплификации 5'-UTR и NS5B определяли методом прямого секвенирова-ния в ПЦР. Секвенирование продуктов амплификации проводили по обеим цепям с использованием автоматического секвенатора Beckman CEQ20Ö0 XL. Использовали наборы реактивов CEQ DTCS Kit (Beckman, Cal# 608000) согласно инструкции производителя.

Анализ последовательностей. Для генотипирования изолятов ВГС проводили филогенетический анализ последовательностей фрагментов 5'-UTR и NS5B, для сравнения ис-, пользовали последовательности прототипных изолятов ВГС. Множественные элайнменты строили с использованием программы ClustalW VI.83. Статистический анализ элайнмен-тов проводили с помощью программ MEGA V4 и TREE-PUZZLE V5.2. Филогенетический анализ проводили с использованием программ MEGA V4 и PHYLIP V3.6c. Для оценки достоверности группирования применяли бутстреп-тест.

Обработка эпидемиологических данных. Данные анкетирования пациентов, а также результаты молекулярно-диагностических тестов анализировались с помощью программ Epilnfo 2005 и SPSS 14. Статистическую значимость связей между факторами риска и статусом по маркёрам инфекции ВГС оценивали с помощью критерия Хи-квадрат с поправкой Йетса или двустороннего точного критерия Фишера (если ожидаемые частоты в любой из клеток таблицы сопряжённости были меньше 5). Критическое значение достигнутого уровня значимости для ситуации двустороннего оценивания было 5%. Для сравнения факторов риска по величине эффекта вычисляли отношения шансов (odds ratio, OR) с 95% доверительными интервалами. Для выявления независимо влияющих факторов риска и ранжирования их по величине эффекта применяли логистический регрессионный анализ; в исходную модель включали предикторы, показавшие в унивариантном анализе связь с р<0,25.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.1 Половозрастная характеристика обследованных групп

В Таблице 1. представлен половозрастной состав обследованных групп пациентов. Диаграмма на Рис.1 иллюстрирует распределение обследованных групп по возрастам. В группе пациентов с клиническими признаками острого гепатита (пациенты ГИКБ и центра СПИД, п=689) преобладали лица молодого возраста (до 30 лет 70,7%). В группе пациентов с хроническим гепатитом (пациенты ОКБ, п=164) распределение по возрасту носило бимодальный характер, пики приходились на возрастные группы 20-25 и 50-55 лет; однако, преобладающее большинство обследованных составляли лица старше 30 лет (68,9%).

Таблица 1. Половозрастной состав обследованных групп

Группы обследованных пациентов из разных больниц с указанием периода сбора образцов п Обследованные Мт-Мах возраст; средний возраст 1

Пациенты ГИКБ (группа 1); октябрь-декабрь 2001, октябрь-декабрь 2002 1 ! 629 302 (48,0%) женщины 18-74 лет; 28,5 лет

327 (52,0%) мужчин 18-68 лет; 26,4 года

Пациенты Центра СПИД (группа 1); октябрь-декабрь 2001, октябрь-декабрь 2002 60 25 (41.7%) женщин 18-49 лет; 24,2 года

35 (58,3%) мужчин 18-41 год; 23,8 лет

Пациенты ОКБ (группа 2); ! июля 2002 г. - 31 декабря 2003 164 68 (41,5%) женщин 18-71 год; 43 года

96 (58,5%) мужчин 18-75 лет; 37,5 лет

Группа 1 Группа 2

Рис. 1. Распределение по возрасту в группе пациентов с клиническими признаками острого гепатита (группа 1) и в группе пациентов с хроническим гепатитом (группа 2).

1.2 Исследование встречаемости маркёров вирусного гепатита С в группе пациентов с острым гепатитом

Собранные образцы сывороток от пациентов, поступивших в инфекционные больницы (ГИКБ и Центр СПИД) с признаками «острого гепатита», были тестированы для выяв-

ления антител к антигенам ВГС; серопозитивные пробы исследованы в ОТ-ПЦР на РНК ВГС. Среди п=б29 обследованных пациентов ГИКБ антитела ZgG к антигенам ВГС были выявлены у 134 (21,3%) пациентов, РНК ВГС обнаружена в 106 (79,1%) серопозитивных сыворотках. Из п=60 обследованных пациентов Центра СПИД анти-ВГС IgG были найдены в 25 (41,7%) образцах, РНК ВГС обнаружена в 21 (84,0%) пробе. В целом, в группе обследованных пациентов (п=689) с симптомами острого гепатита частота обнаружения серологических маркёров ВГС составила 23,1%, РНК ВГС была выявлена в 79,9% серопозитивных образцов.

1.3 Исследование встречаемости маркёров вирусного гепатита В и С в группе пациентов с хроническим гепатитом

Все собранные сыворотки от пациентов с хроническим гепатитом анализировали на наличие серологических маркёров вирусных гепатитов В и С. В реакцию ПЦР брали серопозитивные образцы и пробы, которые не содержали ИФА маркёров ВГВ или ВГС инфекций (безмаркёрные). Результаты проведённых серологических тестов (см. Рис.2) показали, что 62,8% (103 чел.) имели только IgG к антигенам ВГС и 6,7% (11 чел.) содержали и IgG к антигенам ВГС и ИФА маркёры ВГВ. Таким образом, серологические маркёры ВГС были обнаружены у 69,5% обследованных пациентов. У 11,6% (19 чел.) обследованных лиц не было найдено серологических маркёров ни ВГС, ни ВГВ инфекций (группа безмаркёрных). Результаты ПЦР теста на РНК ВГС и ДНК ВГВ, проведённого для этой группы обследованных, показали, что в 8 образцах определяется и ДНК ВГВ, и РНК ВГС (42,1%), в 1 пробе (5,3%) только РНК ВГС (в ПЦР на ВГВ образец не проверялся), в 6 образцах (31,6%) обнаруживается ДНК ВГВ, 4 пробы были отрицательны в ПЦР на ВГС и на ВГВ (21,1%). Таким образом, результаты серологических тестов и ПЦР показали, что среди 164 обследованных пациентов 104 (63,4%) имеют маркёры вирусного гепатита С, 37 (22,6%) гепатита В, у 19 пациентов (11,6%) маркёры двух вирусных гепатитов (ВГС и ВГВ); у 4 обследованных пациентов (2,4%) на момент исследования не было обнаружено маркёров ни ВГВ ни ВГС инфекций в используемых нами тестах, хотя в анамнезе 3 пациента имеют хронический вирусный гепатит В, а у 1 - смешанная инфекция двух вирусных гепатитов (ВГС и ВГВ).

Следует особо отметить важность проведения ПЦР теста для группы лиц, в сыворотке которых не удаётся выявить серологических маркёров вирусных гепатитов В и С. В нашем исследовании проведение ПЦР для этой группы лиц позволило определить этиологию гепатита в 78,9% случаев (15 из 19), из них 53,3% (8 из 15) приходится на смешанную инфекцию.

1.4 Генотипнческое разнообразие изолятов ВГС в группе пациентов с острым гепатитом

В группе пациентов с клиническими признаками острого гепатита генотипнческое разнообразие изолятов ВГС по 5-UTR и NS5B областям генома оказалось следующим: преобладал субтип 1Ь -57,5% (73 образца), следующий по частоте встречаемости субтип За - 33,9% (43 образца), с меньшими частотами встречались субтипы 2а-1,6% (2 образца), 2с -1,6% (2 образца), 2а/2с -3,9% (5 образцов), 1,6% (2 образца) не удалось однозначно генотипировать из-за вероятной микстинфекции изолятами ВГС разных генотипов (результаты изучения электрофореграммы показали наличие дополнительных пиков, не допускающих однозначное прочтение последовательности). Образцы с генотипом 2а/2с удалось генотипировать только по области 5'-UTR, в связи с чем однозначное отнесешге к субтипам 2а или 2с было невозможным. Это связано с тем, что изоляты субтапов 2а и 2с по нуклеотидным последовательностям 5'-UTR области друг от друга не отличаются.

Генотилическое разнообразие изолятов ВГС оказалось неодинаковым в разных возрастных группах. На Рис. 3 представлены доли (%) изолятов ВГС разных генотипов, выявленных нами в различных возрастных группах из обобщённой популяции пациентов обеих больниц (127 человек). Диаграмма иллюстрирует увеличение доли генотипа 1 и снижение доли генотипа 3 с увеличением возраста (генотип 1: 42,5% в подгруппе 21-30

лет, 87,5% среди лиц старше 40 лет; генотип 3: 38,3% в подгруппе 21-30 лет, 0% среди лиц 41-50 лет). Доля генотипа 2 не имеет какой-либо определённой тенденции, варьируя в пределах от 0% (в группе лиц до 20 лет) до 14,9% (в возрастной группе 21-30 лет),

Н ИФА маркёры ВГС И ИФА маркёры ВГВ

0 ИФА маркёры ВГС+ВГВ □ ИФА безмаркёрные

Результаты ИФА

Результаты ПЦР

0 РНК ВГС+ДНК ВГВ ■ ДНК ВГВ □ ПЦР безмаркёрные В РНК ВГС

Рис. 2. Серологические и геномные маркёры вирусных гепатитов В и С у пациентов с признаками хронического гепатита.

18-20 21-30 31-40 41-50

Возраст

Рис. 3. Распределение генотипов ВГС в разных возрастных группах среди пациентов с клиническими признаками острого гепатита.

Б Генотип 1Ь ■ Генотип 2 (2а, 2с, 2а/2с) □ Генотип За □ Нетшшруемые

1.5 Генотипнческое разнообразие нзолягов ВГС в группе пациентов с хроническим гепатитом

В сыворотках крови, полученных от пациентов ОКБ (п=164), РНК ВГС была обнаружена в 110 образцах. Генотипирование выявленных изолятов по 5'-UTR и NS5B областям генома ВГС показало преобладание субтипа 1Ь - 62,7% (69 образцов). С меньшими частотами встречались субтипы 2а - 6,4% (7 образцов), 2с - 1,8% (2 образца), 2к - 0,9% (1 образец), 2а/2с - 2,7% (3 образца), За - 22,7% (25 образцов). Образцы с генотипом 2а/2с удалось генотипировать только по области 5'-UTR, в связи с чем однозначное отнесение.к субтипам 2а или 2с было невозможным. Два образца (1,8%) были генотипированы по 5'-UTR как изоляты генотипа 2а/2с, а по району NS5B относились к генотипу Ib. Изоляты подобного типа в литературе рассматриваются, как рекомбинантные изоляты. Один образец (0,9%) - вероятно, смешанная инфекция изолятами ВГС разных генотипов (результаты изучения электрофореграммы показали наличие двойных пиков в генотипзначимых областях).

На Рис. 4 представлены доли (%) изолятов ВГС разных генотипов, выявленных нами в различных возрастных группах (110 человек) лиц с хроническим гепатитом. Диаграмма иллюстрирует увеличение доли генотипа 1Ь и снижение доли генотипа За с увеличением возраста (генотип 1Ь: 16,5% в подгруппе 18-20 лет, 100% среди лиц старше 70 лет; генотип За: 83,3% в подгруппе 18-20 лет, 0% среди лиц старше 60 лет). Доля генотипа 2 не имеет какой-либо определённой тенденции, варьируя в пределах от 0% (в группе лиц до 20 лет и в группе старше 70 лет) до 20% (в возрастной группе 31-40 лет).

Ш Генотип 1 b ■ Генотип 2 (2а, 2с, 2к, 2а/2с)

Ш Генотип За 0 Нетипируемые

□ Рекомбинантные изоляты

Рис. 4. Распределение генотипов ВГС в разных возрастных группах у пациентов с хроническим гепатитом.

18-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 Возраст

71-80

Таблица 2. Анализ данных по факторам риска и факторам корреляции в отношении инфекции ВГС среди пациентов с острым гепатитом

Фактор N1 %(+)2 оя3 N %(+) ОЯ N ОЯ N ОЯ N %(+) ОЯ

ГИКБ цСПИД Все обследованные Возраст до 30 лет вкл. Возраст более 30 лет

Пол

женщины 302 13,6 25 28 327 14,7 215 17,7 112 8,9

мужчины 327 28,5 2,53 35 51,4 362 30,7 2,56 272 34,6 2,46 90 18,9

Образование4

Неполное 78 24,4 12 50,0 90 27,8 81 29,6 9 11,1

Среднее 242 24,0 21 52,4 263 26,2 210 28,1 53 ' 18,9

Среднее специальное 209 23,4 25 32,0 234 24,4 146 30,8 88 13,6

Высшее 99 8,1 0,28 2 0 101 7,9 0,25 50 8,0 0,21 51 7,9

Семейное положение

Женат/замужем 230 14,4 0,49 19 21,1 249 14,9 0,45 112 19,6 0,59 137 11

Не женат/не замужем 349 26,6 2,12 41 51,2 390 29,2 2,33 356 29,8 1,71 34 23,5

Разведён 49 16,3 0 49 16.3 19 21,1 30 13,3

Доход семьи выше прожиточного минимума

Да 189 14,8 0,55 7 57,2 196 16,3 0,56 133 20,3 0,60 63 7,9

Нет 440 24 1 53 39,6 493 25,8 354 29,7 139 15,8

Совместное проживание с лицами в течение последних 6 месяцев до заболевания

У которых было переливание крови 4 75,0 11,12 0 0 4 75,0 10,02* 2 100 2 50

Которые употребляли когда-либо в/в наркотики 14 57,1 5,19 1 0 15 53,3 3,94 13 53,8 2 50

Наличие работы

Да 301 18,9 33 30,3 334 20,1 196 27,6 138 9,4

Нет 328 23,5 27 55,6 355 25,9 291 26.8 64 21,9 2,70

Контакты с больными, у которых подозревали или диагностировали гепатит В, гепатит С или носительство HBsAg в течение последних 6 месяцев до заболевания

Да 79 32,9 2,44 17 58,8 6,86 96 37,5 2,98 82 39 2,55 14 28,6

Нет Если Да, то у иих было: 400 16,8 29 17,3 429 16,8 284 20,1 145 10,4

Миксггепатиты В и С Вид контакта: Связанный с совместным использованием игл для внутривенного введения 6 83,3 12,38 8 75,0 7,65 6 66,7 5 100 12 75,0 6,33 13 84,6 12,76 11 81,8 9,39 12 83,3 10,9 1 0 1 100

Лечение в больнице в последние 6 месяцев до заболевания

Да Нет 75 30,7 1,77 554 20,0 6 33,3 54 42,6 81 30,9 608 22,0 61 34,4 426 26,1 20 20,0 182 12,6

Наличие татуировок, сделанных в течение всей жизни

Да Нет 85 45,9 4,01 544 17,5 13 76,9 7,11 47 31,9 98 50 4,37 591 18,6 72 56,9 4,71 414 22 26 30,8 176 10,8

Пребывание в тюрьме или камере предварительного заключения (как минимум одну ночь) в последние 6 месяцев до заболевания

Да Нет 20 55,0 4,83 609 20,2 6 83,3 54 37 26 61,5 5,82 663 21,6 25 60 4,42 462 25,3 1 100 201 12,9

Какое-либо отношение к психиатрическому и наркологическому заведению в последние 6 месяцев до заболевания

Да Нет 12 66,7 7,79 617 20,4 1 100 59 40,7 13 69,2 7,89 676 22,2 11 63,6 4,91 476 26,3 2 100 8,00 200 12,5

Количество половых партнёров противоположного пола в последние 6 месяцев до заболевания

0-2 >2 522 18,2 107 36,4 2,58 47 31,9 13 76,9 7,09 569 19,3 120 40,8 2,88 385 22,6 102 44,1 2,7 184 12,5 18 22,2

Половые контакты в течение последних 6 месяцев до заболевания с партнёрами, которые употребляли когда-либо внутривенно наркотические вещества

Да Нет 19 57,9 6,64 507 17,2 10 70,0 6,15 40 27,5 29 62,1 7,50 547 17,9 24 58,3 4,96 368 22,0 5 80 38,12 179 9,5

Употребление когда-либо наркотических средств внутривенно

Да Нет 74 74,3 18,1 551 13,8 23 82,6 23,75 36 16,7 97 76,3 19,8 587 14,0 87 74,7 15,37 397 16,1 10 90,0 86,0 190 9,5

Употребляли ли Вы наркотические средства внутривенно в последние 6 месяцев до заболевания

Да Нет 50 80 19 57,9 19 89,5 4 50,0 69 82,6 3,65 23 56,5 63 81 21 57,1 . 6 100 2 50

Использовали ли Вы когда-нибудь чужой шприц

Да Нет 23 91,3 6,22 43 62,8 17 88,2 4 75,0 40 90 5,10 47 63,8 35 88,6 4,71 45 62,2 5 100 2 100

Вдыхание когда-либо наркотических веществ через нос

Да Нет 35 60 6,56 591 18,6 13 84,6 12,96 47 29,8 48 66,7 8,29 638 19,4 45 68,9 7,7 439 22,3 3 33,3 199 13Д

Употребление алкоголя

Да Нет 390 24,9 1,81 239 15,5 18 50 42 38,1 408 26 1,51 281 18,9 296 31,1 1,70 191 20,9 112 12,5 90 14,5

1 Число обследованных, которые дали ответ на соответствующий вопрос, приведённый в столбце "Фактор риска" (были лица, которые отказывались отвечать на ряд вопросов или давали неопределённый ответ типа «не знаю/не уверен», такие ответы в расчётах не учитывались).

2 Процент проб, позитивных в ИФЛ на анти-ВГС ^О.

3 Отношение шансов (ОК. из таблиц сопряжённости, см. текст). Количественные значения ОЯ приведены только если ОЯ достоверны на 5% уровне значимости.

4 Для вычисления значение ОЯ в подпунктах вопроса об образовании в группу действия фактора включали лиц с данным уровнем образования, а в группу сравнения - всех лиц с другими уровнями образования.

* Статистически значимо при использовании двустороннего критерия Фишера на достигнутом уровне значимости Р<0,05

1.6 Анализ факторов риска инфицирования ВГС у пациентов с острым гепатитом

Результаты исследования статистических связей между факторами риска и статусом по маркёрам ВГС приведены в Таблице 2. В данной таблице приведены встречаемости маркёров (анти-ВГС ^О) в подгруппах, сформированных по наличшо/отсутствшо в эпида-намнезе факторов риска, отношения шансов (СЖ) и достигнутые уровни значимости критерия Хи-квадрат с поправкой Йстса. Были исследованы различные варианты группирования данных. В Таблице 2 представлены результаты расчетов для выборок из ГИКБ и Центра СПИД по отдельности, а также для объединённой группы (все обследованные нами пациенты, п=689), подгруппы молодых людей (возраст на момент обследования до 30 лет включительно, п=487) и подгруппы лиц старше 30 лет (п=202). В Таблице 2 приведены факторы риска, показавшие статистическую значимость хотя бы в одной из выделенных 1рупп. В расчётах не учитывались ответы на вопросы неопределённого характера: «не знаю/не уверен», «отказываюсь отвечать» и т.п.

Иммунологические маркёры ВГС чаще выявляли у лиц молодого возраста (27,1%), чем у лиц старше 30 лет (13,4%), различия оказались статистически значимыми ((Ж=2,41) (дашшю в Таблице 2 не приведены). Риск инфицирования ВГС для мужчин оказался достоверно выше, чем для женщин. (СЖ муж./жен.=2,56). В группе пациентов Центра СПИД встречаемость ИФА маркёров ВГС (41,7%) была почти в 2 раза выше, чем в группе пациентов ГИКБ (21,3%). Эти данные хорошо коррелируют с количеством респондентов, употреблявших наркотики (11,8% - в ГИКБ, 39% - в Центре СПИД), и, вероятно, употребление наркотиков является основным фактором риска в этих исследованных группах (см. ниже).

Исследование социально экономических факторов выявило, что одним из значимых факторов корреляции в отношении ВГС оказалось отсутствие семьи (<Ж=2,33). Среди лиц, которые на вопрос о своём семейном положении ответили «не женат/не замужем» процент ВГС положительных составил 51,2%, тогда как у имеющих семью респондентов маркёры ВГС были обнаружены в 21,1% случаях. Маркёры ВГС достоверно реже встречались у обследованных, имевших высшее образование (СЖ.=0,25), и лиц, доход которых был выше прожиточного минимума (СЖ=0,56). Для лиц старше 30 лет статистически значимым фактором корреляции оказался статус безработного (СЖ=2,70).

Известно, что риск передачи ВГС половым путём является низким, однако, в нашем исследовании мы обнаружили статистически достоверную связь между количеством половых партнёров и серопозитивностью по маркёрам ВГС. Выяснилось, что факторами риска является наличие у респондента более 2 половых партнёров в последние б месяцев до заболевания (ОГ<=2,88) и половые контакты в течение 6 месяцев до заболевания с партнёрами, которые употребляли когда-либо внутривенно наркотические вещества (СЖ=7,50). Не исключено, что лица, имевшие половые контакты с наркопотребителями, сами употребляли наркотические препараты «за компанию» вместе со своим половым партнёром, но об этом в анкете умолчали.

Употребляющие алкоголь лица имели повышенный риск серопозитивности в отношении инфекции ВГС (СЖ=1,51). Среди исследованных факторов риска наибольшее значение отношения шансов было получено для внутривенного употребления наркотиков (ОК>15) во всех выделенных подгруппах, особенно в группе пациентов старше 30 лет (СЖ=86,0). В более старшей возрастной группе факт употребления наркотиков признало только 5% опрошенных (возраст от 31 до 44 лет), но среди употреблявших процент серо-позитивных на маркёры ВГС был очень высоким и составил 90%. В возрастной группе до 30 лет внутривенные наркотики употребляли 18%, из них у 74,7% были обнаружены ^О к антигенам ВГС. Как выяснилось, из всех лиц, употребляющих наркотики внутривенно, 41% хотя бы раз использовали для инъекций чужой шприц.

Интересно, что фактором риска оказалось не только инъекционное, но и интраназалыше употребление наркотиков (СЖ=8,29). Среди опрошенных лиц, которые

отрицали инъекционное потребление наркотиков, но употребляли наркотики интраназально, было 66,7% инфицированных (ОК=13,54).

Значимым в отношении инфекции ВГС оказалась также связь с пребыванием в наркологическом или психиатрическом заведениях (СЖ=7,89). Пребывание в местах лишения свободы на срок как минимум одну ночь в последние 6 месяцев до заболевания оказалось статистически значимым фактором (011=5,82) так же, как и наличие у обследованного татуировок (СЖ=4,37). В нашем исследовании более 60% респондентов сообщили, что делали татуировки в домашних условиях и не обращались в специализированные салоны, что, несомненно, приводит к возрастанию риска заражения не только ВГС, но и другими парентерально передающимися инфекциями.

Нами не было выявлено статистически значимой связи между фактами совместного использования с другими людьми предметов личной гигиены (зубные щётки, бритвенные принадлежности, маникюрные наборы, полотенца и др.) и инфицированием ВГС. Тем не менее, мы выявили достоверные риски, происходящие от совместного проживания с лицами, которые перенесли переливание крови (ОЯ= 10,02) и употребляют наркотики внутривенно (011=3,94).

В нашем исследовании мы не выявили повышенного риска серопозитивности по маркёрам ВГС у лиц, получавших переливания крови, имеющих отношения к гемодиализу, к отделению по трансплантации почек, перенесших хирургические операции. Однако при попытке оценить факторы риска, относящиеся к медицинским процедурам среди лиц, отрицавших употребление внутривенных и интраназальных наркотиков (575 чел.), выяснилось, что статистически значимыми факторами риска являются: лечение в больнице в последние 6 месяцев до заболевания (01<=2,20), использование стеклянных шприцов для инъекций (011=10,38), проведете внутривенных вливаний (ОЯ=3,79), госпитализации в отделение хирургии, гинекологии, интенсивной терапии (011=5,50) и посещение врачей в поликлинике (хирург, гинеколог, проведение гастроскопии, колоноскопии) (011=1,71).

Логистические регрессионные модели строили для качественно однородных выборок -групп пациентов из ГИКБ и Центра СПИД. Результаты выявления в выборках наиболее прогностически ценных и независимо влияющих факторов риска представлены в Таблице 3. Для пациентов ГИКБ знание ответов на вопросы об употреблении наркотиков, наличии татуировок, потреблении алкоголя и числа посещений стоматолога оказалось достаточным, чтобы предсказывать наличие/отсутствие у обследуемого маркёров ВГС с уверенностью 84,9%. В логистическую регрессионную модель для пациентов Центра СПИД вошёл единственный фактор - вопрос о внутривенном употреблении наркотиков, - знание ответа на который было достаточно для предсказания статуса по маркёрам ВГС с уверенностью 83,3%, т.е. только употребление внутривенных наркотических препаратов объясняет >80% случаев заражения ВГС в этой группе.

1.7 Анализ факторов риска ВГС у пациентов с хроническим гепатитом

Результаты исследования статистических связей между факторами риска и статусом по маркёрам ВГС приведены в Таблице 4. Были исследованы различные варианты группирования данных. В Таблице 4 представлены результаты расчетов для всех обследованных нами пациентов (п=164); подгруппы молодых людей (возраст на момент обследования до 30 лет включительно, п=50); подгруппы лиц старше 30 лет (п=113); подгруппы лиц, употребляющих наркотики (как в инъекционной, так и в не инъекционной форме, п=29) и лиц, отрицавших употребление наркотиков (п=125). В Таблице 4 приведены факторы риска, показавшие статистическую значимость хотя бы в одной из выделенных групп. В расчётах не учитывались ответы на вопросы неопределённого характера: «не знаю/не уверен», «отказываюсь отвечать» и т.п. Наиболее значимым фактором риска заражения ВГС в обследованной группе пациентов оказалось внутривенное употребление наркотических препа-

ратов (011=6,98). Большинство из опрошенных пациентов употребляли опий-сырец (ханку) 73,7% и героин 42,1%, меньший процент приходился на употребление эфедрина (5,3%). Среди лиц, употребляющих наркотики внутривенно, 94,7% имели маркёры ВГС.

Таблица 3. Независимые и наиболее прогностически важные факторы риска в группе пациентов с острым гепатитом

Скорректированный OR ДИ 95%3 Р

OR1

Пациенты ГИКБ

Употребление наркотических средств внут-

ривенно 15,894 8,861 28,510 0

Наличие татуировок, выполненных в тече-

ние всей жизни 2,080 1,151 3,757 0,015

Употребление алкоголя 1,644 1,010 2,676 0,045

Число посещений стоматолога2 1,170 1,013 1,352 0,033

Const.4 0,095 0

Пациенты Центра СПИД

Употребление наркотических средств внут-

ривенно 24,534 6,123 98,303 0

Const. 0,211 0,005

1 Отношение шансов, вычисленное для каждого из факторов риска, включенных в модель, при условии постоянства других факторов (adjusted OR).

2 Значение OR для данной переменной соответствует увеличению риска инфицирования на одно посещение стоматолога.

95% доверительный шггсрвал для скорректированного отношения шансов. 4 Параметр отсечения (intercept), приведено значение Const =ехр(а), а - свободный член уравнения регрессии.

Ниже представлены характеристики качества подгонки моделей: Хи-квадрат для модели (LR), число степеней свободы (di), достигнутый уровень значимости для модели в целом (р), процент правильных отнесений к позитивной группе (чувствительность, SN), npoustfr правильных отнесений к негативной группе (специфичность, SP), общий процент правильных предсказаний (TP).

Для выборки пациентов ГИКБ: LR= 136,24, df=4, р< 0.001; SN=44,0%; SP=96,0; ТР=84,9%.

Для выборки пацииггов Центра СПИД: LR= 27,45, df=l, р< 0.001; SN=76,0%; SP=88,6%; TP=X3,3%.

Оказалось, что среди лиц, употребляющих более 80 г. алкоголя в неделю, достоверно больше инфицированных ВГС, чем среди тех, кто пьёт меньше (OR=6,18). Особенно высокое значение OR было получено для подгруппы лиц, старше 30 лет (OR=20,0). Для удобства расчётов суммарное количество употребляемого алкоголя (водка, внно, пиво) было переведено в граммы этилового спирта. В группе обследуемых лиц .в употреблении алкоголя признались 24,4 % опрошенных. Среднее количество алкоголя, употребляемого лицами с ВГС, составило 239 г. в неделю, что в 4,6 раза больше того, что выпивают обследуемые без инфекции ВГС (в среднем 54 г. в неделю), хотя, около 54,5% опрошенных пациентов указали на то, что в связи с заболеванием печени полностью или частично отказались от алкоголя. Естественно, что употребление алкоголя не следует рассматривать в качестве причины, вызывающей гепатит С. Для инфицированных ВГС лиц, употребляющих более 80 г. алкоголя в неделю, был проведён анализ анкетных данных с целью выявления возможных источников заражения ВГС. В эпиданамнезе всех пациентов были факторы, которые можно рассматривать в качестве вероятных причин заражения ВГС: употребление наркотиков внутривенно, переливание крови, контакт с больным острым гепатитом или имеющим гемофилию, общая анестезия, донорство.

Таблица 4. Анализ данных по факторам риска и факторам корреляции в отношении инфекции ВГС в группе пациентов с хроническим гепатитом

Фактор N1 %(+)2 ОЯ3 N % (+) ОК. N % (+) ОК. N % (+) ОЯ N %(+) ОЯ

Все обследованные Употребляющие наркотики4 Не употребляющие наркотики Возраст до 30 лет вкл. Возраст более 30 лет

Употребление наркотических препаратов внутривенно (хотя бы один раз)

Да Нет 19 94,7 6,98 136 72,1 19 94,7 10 70,0 0 0 125 72.0 15 93,3 7,0 30 66,7 7 100 102 72,5

Количество алкоголя, употребляемого в неделю5

До 80 г. вкл. Более 80 г. 19 57,9 19 89,5 6,18 9 77,8 8 100 9 44,4 11 81,8 10 70,0 9 88,9 9 44,4 10 90,0 11,25

Наличие у кого-нибудь из членов семьи острого гепатита

Да Нет 16 93,8 5,56 148 73,0 2 100 27 85,2 14 92,9" 5,74 111 69,4 2 100 48 75,0 14 92,9 99 71,7

Повышение уровня АЛТ

До 40 МЕ/л Выше 40 МЕ/л 81 60,5 83 89,2 5,37 14 71,4 15 100 60 56,7 65 86,2 4,76 28 60,7 22 95,5 13,59 53 60,4 60 86,7 4,27

Наличие язвенной болезни желудка

Да Нет 36 61,1 0,42 128 78,9 8 87,5 21 85,7 26 50,0 0,29 99 77,8 9 66,7 41 78,0 27 59,3 0,39 86 79,1

1 Число обследованных, которые дали ответ на соответствующий вопрос, приведённый в столбце "Фактор риска".

2 Процент проб позитивных в ИФА на анти-ВГС и положительных в ПЦР на РНК ВГС для серонегативных образцов

3 Отношение шансов (ОЯ из таблиц сопряжённости). Количественные значения ОК. приведены, только если ОК достоверны на 5% уровне значимости.

4 В группу включены лица, употребляющие наркотические препараты как в инъекционной, так и в не инъекционной форме.

5 Суммарное количество употребляемого алкоголя (водка, вино, пиво) выражено в граммах этилового спирта. Из расчета исключены не употребляющие алкоголь лица.

Таблица 5. Независимые и наиболее прогностически важные факторы риска и факторы корреляции в группе пациентов с хроническим гепатитом

Скорректированный OR1 OR ДИ 95%2 Р

Пациенты ОКБ

Употребление наркотических препа-

ратов внутривенно 11,57 1,41 94,99 0,02

Повышение уровня AJIT (более 40

МЕ/л) 6,37 2,67 15,15 0

Наличие татуировок (пирсинга), вы-

полненных в течение всей жизни 2,31 1,00 5,33 0,05

Const3 0,05 0

1 Отношение шансов, вычисленное для каждого из факторов риска, включённых в модель, при условии постоянства других факторов (adjusted OR).

2 95% доверительный интервал для скорректированного отношения шансов.

3 Параметр отсечения (intercept); приведено значение Const =ехр(а), а - свободный член уравнения регрессии.

Ниже представлены характеристики качества подгонки модели: LR= 29,5, df=3, р< 0.0001; SN=41,0%; SP=84,5; ТР=73,5%, где

LR - Хи-квадрат для модели, df - число степеней свободы, р - достигнутый уровень значимости для модели в целом, SN - процент правильных отнесений к позитивной группе (чувствительность), SP - процент правильных отнесений к негативной группе (специфичность), TP - общий процент правильных предсказаний.

Таблица 6. Анализ данных по факторам риска в отношении инфекции ВГС в зависимости от генотипа в группе пациентов с хроническим гепатитом

Фактор N1 %2 OR3 N % OR N % OR

Генотип lb Генотип 2 Генотип За

Переливание крови или её компонентов (плазмы, клеточных элементов)

Да 32 84.4 4,59 32 9,4 32 3,1 0,07

Нет 74 54,1 74 12,2 74 31,1

Общая анестезия

Да 60 61,7 60 18,3 10,78 60 18.3

Нет 49 65,3 49 2,0 49 28,6

Госпитализации по поводу заболеваний печени

Да 34 76,5 2,49 34 8,8 34 8,8 0,24

Нет 76 56,6 76 13,2 76 28,9

1 Число обследованных, которые дали ответ на соответствующий вопрос, приведенный в столбце "Фактор риска".

2 Процент проб с указашшм генотипом

3 Отношение шансов (OR из таблиц сопряжённости). Количественные значения OR приведены, только если OR достоверны на 5% уровне значимости.

В последние 10-15 лет вопрос связи алкоголизма и хронического гепатита С активно обсуждается в литературе. В последних обзорных публикациях имеются данные о том, что распространённость гепатита С среди алкоголиков в 7-10 раз выше, чем в общей популяции, причины этого факта до конца не выяснены. Гепатит С в сочетании с алкоголизмом приводит к более быстрому прогрессированию заболевания печени, наблюдается эффект синергизма при воздействии на печень алкоголя и ВГС. Алкоголь потенцирует негативное влияние вируса гепатита С на печень.

Риск инфицирования ВГС был выше у тех лиц, которые указывали о заболеваемости острым гепатитом кого-нибудь из членов семьи (СЖ=5,56), причём достоверные значения ОЛ были получены и для подгруппы лиц, не употребляющих наркотики (011=5,74). Высо-кокоррелирующим в отношении инфекции ВГС оказалось повышение уровня АЛТ (более 40 МЕ/л), особенно в группе лиц до 30 лет (ОК=13,59). Среди обследованных пациентов с ВГС уровень АЛТ был повышен у 56,9% (70 из 123) и в среднем значения превышали норму в 2,3 раза (Норма: 8-40 МЕ/л), тогда как в группе лиц без ВГС только у 19,5% значения АЛТ были выше 40 МЕ/л.

В обследованной нами группе пациентов риск ВГС был оценен в отношении сопутствующих заболеваний. Статистически достоверные данные были получены только в отношении язвенной болезни желудка. Процент инфицированных ВГС среди пациентов с яз-вешюй болезнью желудка был достоверно ниже, чем в группе обследованных, которые отрицают наличие язвы желудка в качестве сопутствующего заболевания. Однако дальнейшие расчёты показали, что данный факт, вероятно, можно объяснить разницей в количестве употребляемого алкоголя лицами с язвенной болезнью желудка и без неё. Пациенты с язвой желудка по нашим данным употребляют алкоголя в 3 раза меньше, чем лица без язвенной болезни.

Для выявления наиболее значимых и прогностически ценных факторов инфекции ВГС был проведён логистический регрессионный анализ. Результаты логистического регрессионного анализа приведены в Таблице 5. Полученная модель включила в себя 3 независимых фактора: употребление наркотических средств внутривенно, повышение уровня АЛТ более чем 40 МЕ/л и наличие татуировок и (или) пирсинга, выполненных в течение всей жизни. Наличие только этих трёх факторов оказалось достаточным для предсказания наличия у обследованного ВГС инфекции с уверенностью 73,5%.

Наличие в нашем исследовании достаточного количества эпидемиологических и моле-кулярно биологических данных позволило нам провести анализ для выявления зависимостей между генотипом ВГС и определённым фактором риска (Таблица 6). Выяснилось, что генотип 1Ь достоверно чаще встречается у лиц, которым проводилось переливание крови (011=4,59). Пациенты, имеющие генотип 1Ъ, госпитализировались по поводу заболевания печени достоверно чаще, чем лица с генотипом За (011=2,49). Видимо, это связано с тем, что генотип 1Ь имеет более тяжёлые последствия для печени, чем другие генотипы. Генотип 2 достоверно чаще встречается у лиц, которым проводилась общая анестезия (011=10,78); удовлетворительному объяснению этому факту нам пока найти не удалось. ■

1.8 Исследование генетических особенностей 1Ч55В области генома ВГС в обследованных группах пациентов

В данном разделе представлены результаты исследования аминокислотных последовательностей белка N858, определённых нами у изолятов ВГС, полученных от пациентов с острым и хроническим гепатитом. В ходе исследования для генотипирования изолятов ВГС нами были определены нуклеотидные последовательности для 5'-ШИ и №5В областей генома ВГС и проведён филогенетический анализ. Определённым преимуществом генотипирования по результатам филогенетического анализа последовательностей по сравнению с исследованием области 5'-иТЯ является большая специфичность в отношении определения субтипов. Продукты амплификации 5'-иЖ области генома ВГС в ос-

новном получают в диагностическом варианте ПЦР, поскольку высокий консерватизм 5'-UTR района обуславливает высокую чувствительность ПЦР-теста.

Наиболее привлекательными районами для изучения генетических особенностей генома ВГС являются более гетерогенные районы, например NS5B область. Белок NS5B кодирует вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу, и изучения особенностей аминокислотного состава полученных NS5B фрагментов в обследованных группах пациентов представляло научный интерес.

Нами были проанализированы 39 выведенных аминокислотных последовательностей области Gln241-Asp318 белка NS5B, полученных для изолятов ВГС от пациентов с клиническими признаками острого гепатита и 49 последовательностей аналогичного района для изолятов ВГС от пациентов с хроническим гепатитом. В первичной структуре белка NS5B ВГС выделяют несколько консервативных аминокислотных мотивов (А, В, С, D, Е), которые являются определяющими для активности и функции РНК-зависимой РНК по-Л1шеразы. Изучаемый нами район (Gln241-Asp318) включал участок между мотивом А и В, полностью мотив В (277-303 а.к.) и захватывал часть мотива С (309-318 а.к.). Для удобства описания и количественной оценки аминокислотных замен, полученные аминокислотные последовательности области Gln241-Asp318 белка NS5B сравнивались с соответствующими прототипными последовательностями. А именно: изоляты субтипа lb сравнивались с прототипом HCV-J, последовательности субтипа 2а с изолятом HC-J6, изоляты 2с субтипа с ВЕВЕ1 и последовательности, относящиеся к За субтипу с прототипом Nzll. Анализ аминокислотного состава 39 выведенных аминокислотных последовательностей области Gln241-Asp318 белка NS5B изолятов ВГС, полученных от пациентов с острым гепатитом, показал, что 3 последовательности (7,7%) из 39 не имели аминокислотных замен по сравнению с прототипными изолятами (TTG96, TTG172 - субтип lb, UYAS69 -субтип 2с). Преобладающее большинство изолятов (76,9%) имели от 1 до 3 замен и 15,4% последовательностей отличались от прототипных наличием 4-5 замен. Анализ аминокислотных замен для 49 выведенных аминокислотных последовательностей области GIn241-Asp318 белка NS5B изолятов ВГС, полученных от пациентов с хроническим гепатитом, показал, что только 1 из 49 последовательностей (2%) не отличалась по аминокислотному составу от соответствующего прототипного изолята (ТАМ49, субтип 2с), остальные 48 (98%) имели от 1 до 6 замен. Большинство проанализированных последовательностей (79,5%) в среднем имели 1-3 замены. Последовательностей с максимальным количеством замен (5-6) оказалось только 7 (14,3%), причём большая их часть (6 из 7) приходится на изоляты субгипа lb.

В группе пациентов с острым гепатитом доля изолятов генотипа lb, имеющих 0-1 замену (41,7%) была больше, чем в группе пациентов с хроническим гепатитом (12,9%). Различия оказались статистически значимыми (%2=5,9; р=0,015) и, соответственно, доля изолятов генотипа lb с 2-мя и более заменами статистически достоверно больше у пациентов с хроническим (87,1%), чем с острым гепатитом (58,3%) (у,2=5,9; р=0,015). Для последовательностей генотипа За наблюдается обратная ситуация: в группе пациентов с хроническим гепатитом последовательностей с 0-1 заменами больше (36,4%), чем для пациентов с острым гепатитом (27,3%), наблюдаемые различия статистически недостоверны. Все изоляты генотипа 2а имели по 2 и более замен, а последовательности генотипа 2с 0-1 замену в обеих обследованных группах пациентов. При объединении последовательностей всех генотипов вместе, оказалось, что в группе пациентов с острым гепатитом последовательностей с 0-1 заменой (38,5%) статистически достоверно больше (^2=5,4; р=0,036), чем в группе обследованных с хроническим гепатитом (18,4%).

Результаты поиска в Международной базе данных Genbank при помощи программы Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?Jform=l) показали, что среди аминокислотных последовательностей, полученных от пациентов с острым гепатитом, уникальных замен найдено не было, но обнаружено 3 последовательности с довольно редкими заме-

нами, а именно: KIV137 (замена GIn241Pro), BTG68 (Lys298Gln), KDI67 (Met289Val). Следует особо отметить последовательность BTG68 (су&гип За), которая имела замену лизин на глутамин в 298 положении. В структуре РНК-зависимой РНК-полимеразы ВГС данная мутация расположена в консервативной для изолятов ВГС области мотива В, который принимает участие во взаимодействии с матрицей/праймером. В базе данных GenBank было найдено только 3 изолята, имеющих аналогичную замену (ААХ94616, ААХ94615, ААХ94604). Данные изоляты были получены от пациентов с симптомами острого гепатита из г. Барнаула сотрудниками нашей лаборатории (Чуб Е.В., Плясунова И.В., Нетёсов C.B.). Дальнейшая судьба изолятов с такой заменой непонятна, так как проспективные исследования для имеющих такую мутацию вариантов ВГС пока не проводились. Поскольку такая замена встречается среди изолятов ВГС довольно редко, и выявляется только у пациентов с острым гепатитом, можно предположить, что вирусные частицы с такой заменой могут иметь нарушения в процессе репликации и в последующем будут элиминированы.

Среди изолятов, выделенных от пациентов с хроническим гепатитом, по результатам поиска в GenBank было обнаружено 5 последовательностей с уникальными аминокислотными заменами, которые не встречались нигде в мире: KNG350 (Cys311Ala), ТАМ4 (Arg304Gln) - субгип lb; LAG1 (Phe267Val) - 2a; LAG19 (Aig244Met) -2k; LAG16 (Ser288Gly) - За. Обнаруженные уникальные изоляты оказались принадлежащими к разным генотипам. Анализ местоположения найденных уникальных замен в структуре РНК-зависимой РНК-полимеразы ВГС показал, что большинство мутаций располагаются на участках, расположенных между консервативными мотивами полимеразы или в вариабельных участках внутри мотива и поэтому не должны затрагивать функциональную активность фермента. Только одна замена серина на глицин у изолята LAG16 в 288 положении расположена в консервативном районе мотива В. Анализ данных литературы показал, что мутация, затрагивающая 288 аминокислотный остаток, не должна повлиять на каталитическую активность NS5B ВГС.

Выводы

1. По результатам молекулярно-эпидемиологического исследования, проведённого среди пациентов инфекционных больниц г. Новосибирска, частота выявления серологических маркеров ВГС составила: 23% - в группе пациентов с клиническими признаками острого гепатита (21% - среди пациентов 1-ой Городской Инфекционной Клинической Больницы и 42% у пациентов Областного Центра СПИД), 70% - в группе пациентов с обострением хронического гепатита из Новосибирской Областной Клинической Больницы. Таким образом, в Новосибирске вирусный гепатит С является основной причиной хронического гепатита, тогда как в этиологии острых гепатитов вирусный гепатит С составляет в среднем менее 24%.

2. Результаты серологических тестов показали, что в группе пациентов с хроническим гепатитом 12% не имели серологических маркёров ни ВГС, ни ВГВ инфекций. Проведение ПЦР для обнаружения ДНК ВГВ и РНК ВГС позволило выяснить этиологию вирусного гепатита в более чем 78% безмаркёрных случаях. По результатам серологических тестов и ПЦР в группе пациентов с обострением хронического гепатита 63% обследованных имели маркёры вирусного гепатита С, 12% - маркёры двух вирусных гепатитов (ВГС и ВГВ), у 23% - маркёры гепатита В; в 2% случаев не было выявлено маркёров ВГВ или ВГС.

lb) - 1,8%, нетипируемые образцы - 0,9%. Соотношение генотипов ВГС в разных возрастных группах у пациентов с острым гепатитом и у лиц с хроническим гепатитом оказалось различным; наблюдалось увеличение доли генотипа lb и еншкение генотипа За с увеличением возраста обследованных пациентов.

4. Основные факторы риска инфицирования ВГС у пациентов с острым гепатитом -употребление наркотических веществ (отношение шансов: OR=19,8 и OR=8,3 для внутривенного и интраназального использования наркотических веществ соответственно), пребывание в местах лишения свободы (OR=5,9) и наличие татуировок (OR=4,4). Среди обследованных, отрицавших употребление наркотиков, значимыми факторами оказались: лечение в больнице (OR=2,2), использование стеклянных шприцов для инъекций (OR=10,4), проведение внутривенных вливаний (OR=3,8), госпитализации в отделения хирургии, гинекологии, интенсивной терапии (OR=5,5) и посещение врачей в поликлинике (хирург, гинеколог, проведение гастроскопии, колоно-скопии) (OR=l,7).

5. Наиболее значимые факторы риска по инфекции ВГС в группе пациентов с хроническим гепатитом - употребление инъекционных наркотических веществ (OR=7,0) и внутрисемейные контакты с больным острым гепатитом (OR=5,6). Генотип lb достоверно чаще встречается у лиц, которым проводилось переливание крови (OR=4,6), генотип 2 - среди получавших общую анестезию лиц (OR=10,8).

6. Анализ 88 выведенных аминокислотных последовательностей области Gln241-Asp318 белка NS5B изолятов ВГС, выделенных от обследованных пациентов, выявил 5 изоля-тов разных генотипов с уникальными заменами в группе пациентов с хроническим гепатитом: KNG350 (субтип lb, замена Cys311А1а), ТАМ4 (субтип lb, Arg304Gln), LAG1 (субттш2a, Phe267Val), LAG 19 (субтип2k, Arg244Met), LAG 16 (субтип За, Ser288Gly).

Результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

Статьи:

1. Гаврилова (Плясунова) И.В., Шустов A.B., Нетёсов C.B. Быстрые методы генотипиро-вания изолятов вируса гепатита С с использованием анализа конформационного полиморфизма одиночных цепей ДНК и гетеродуплексного анализа. // Мир вирусных гепатитов. - 2001,-№11,-С. 8-18.

2. Гаврилова (Плясунова) И.В., Шустов A.B., Кочнева Г.В. Сиволобова Г.Ф., Гражданце-ва A.A., Акинфеева Л.А., Орловский В.Г., Алёшина М.В., Сахарова Е.Г., Толоконская Н.П., Нетесов C.B. Факторы риска заражения больных гепатитом С в инфекционных больницах Новосибирска. // Эпидемиология и инфекционные болезни.-2005.- № 6,- С. 28-33.

3. Кочнева Г.В., Гражданцева A.A., Сиволобова Г.Ф., Шустов A.B., Гаврилова И.В., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Акинфеева Л.А., Гранитов В.М., Сахарова Е.Г., Губанова Л.И., Орловский В.Г. Этиология острых гепатитов и генотипи-ческое разнообразие вирусов гепатитов А, В, С и Е в трех регионах Сибири. // Инфекционные болезни. - 2005. - Т.З, № 1.-С. 26 - 31.

4. Гаврилова (Плясунова) И.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Баян-дан Р.Б., Нетесов C.B. Распространённость, генотипическое разнообразие и факторы риска гепатита С среди больных с хроническими вирусными гепатитами в Новосибирской области. // Инфекционные болезни,- 2007.-Т.5, №3,- С. 9-15.

Тезисы конференций:

1. Гаврилова (Плясунова) И.В., Шустов A.B., Нетёсов C.B. Быстрые и эффективные методы генотипирования изолятов вируса гепатита С. // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: Тезисы 2-й научной конференции с международным участием, Новосибирск, 2002, С. 33

2. Гаврилова (Плясунова) И.В., Шустов A.B., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Граждан-цева A.A., Акинфеева JI.A., Орловский В.Г., Алешина М.В., Сахарова Е.Г., Толокон-ская Н.П., Нетесов C.B. Частота встречаемости маркеров, распределение генотипов и факторы риска вирусного гепатита С среди пациентов инфекционных больниц г. Новосибирска.// Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека (Междунар. междисциплинарный конгр. Науч. дискусс. клуб), Судак, Крым, Украина, 10-21 июня, 2004, С. 87 - 88

3. Шустов A.B., Кочнева Г.В., Гражданцева A.A., Сиволобова Г.Ф., Ракова И.Г., Алешина М.В., Гаврилова (Плясунова) И.В., Чуб Е.В., Акинфеева Л.А., Орловский В.Г., Сахарова Е.Г., Гранитов В.М., Губанова Л.И. Предварительные итоги сторожевого надзора за острыми вирусными гепатитами в трех городах Западной Сибири: Новосибирске, Барнауле и Иркутске. // Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний: Междунар. конф., Сосновка, Новосибирская обл., 8-10 сект., 2004, С. 301-302.

4. Кочнева Г.В., Гражданцева A.A., Сиволобова Г.Ф., Шустов A.B., Плясунова И.В., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Акинфеева Л.А., Гранитов В.М., Сахарова Е.Г., Губанова Л.И., Орловский В.Г. Молекулярное разнообразие геномов вирусов гепатитов А, В, С, Е и его диагностическое, клиническое и эпидемиологическое значение. // Фундаментальные науки в медицине: Всерос. конф. (Новосибирск, 4-8 сент. 2005г.), Новосибирск, 2005, С. 62.

5. Кочнева Г.В., Гражданцева A.A., Сиволобова Г.Ф., Плясунова И.В., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Акинфеева Л.А., Гранитов В.М., Сахарова Е.Г., Губанова Л.И., Орловский В.Г., Нетесов C.B.. Этиология гепатитов и генотипическое разнообразие вирусов гепатитов А, В, С и Е в трех регионах Сибири. // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: Тезисы 3-й Российской научной конференции с международным участием, Новосибирск, 27-29 сентября 2006, С. 44-45.

6. Plyasunova I.V., Kochneva G.V., Sivolobova G.F., Grazhdantseva A.A., Bayandin R.B., Netesov S.V. The prevalence, distribution of genotypes and risk factors of hepatitis С virus in patients with chronic hepatitis in Novosibirsk region. // XIV International Congress of Virology, 10-15 August 2008, Istanbul, Abstract Book, P. 280

Благодарности

Автор приносит благодарность своим коллегам по лаборатории и сотрудникам ГНЦ ВБ "Вектор", в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена диссертационная работа, а именно: д.б.н., проф. C.B. Нетесову, д.б.н., проф. В.Б. Локтеву, к.б.н. A.B. Шустову, K.6.H. Г.В. Кочневой, к.б.н. A.A. Гражданцевой, к.б.н. Г.Ф. Сиволобовой, Р.Б. Баянди-ну, С.А. Походне. Автор благодарен Л.А. Акинфеевой за помощь в выполнении работ по тестированию образцов сывороток в ИФА, а также врачам 1-ой Городской инфекционной клинической больницы г. Новосибирска (Сахаровой Е.Г., Черноусовой Н.Я., Красильни-ковой И.В., Козлову Д.И., Бурмистровой Т.Г., Томиленко Т.Г., Фихман Е.А., Мельниковой О.В., Ульяновой Я.С.), Новосибирского государственного областного центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями (Орловскому В.Г., Алёшиной М.В.), Областной клинической больницы г. Новосибирска (Масленниковой Т.А., Лебедеву А.Г.) за проведение анкетирования пациентов.

Плясучова Ирина Викторовна

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА СИ ФАКТОРОВ РИСКА ИНФИЦИРОВАНИЯ У ПАЦИЕНТОВ С ОСТРЫМИ И ХРОНИЧЕСКИМИ ГЕПАТИТАМИ В НОВОСИБИРСКЕ

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Подписано в печать 24.11.2009. Заказ № 121. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии Института катализа СО РАН 630090 Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Плясунова, Ирина Викторовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Общие сведения о гепатите С и его возбудителе.

1.2 Структура вирусных частиц.

1.3 Строение генома ВГС.

1.3.1 Нетранслируемые области.

1.3.2 Структурные белки.

1.3.3 Неструктурные белки.

1.3.3.4. Структура и функция белка NS5B.

1.4. Вариабельность генома ВГС.

1.4.1 Уровни вариабельности.

1.4.2 Уровень инфицированного индивида - квазивиды.

1.4.3 Уровень эпидемической цепочки - изолдты.

1.4.4 Уровень популяций — генотипы и субтипы.

1.5 Географическая распространённость генотипов ВГС.

1.5.1 Генотипы ВГС в мире.

1.5.2 Распределение генотипов ВГС в Российской Федерации.

1.6 Клиническое значение генотипов ВГС.

1.7 Методы генотипирования нзолятов ВГС.

1.7.1 Коммерческие наборы для генотипирования.

1.7.2 Некоммерческие методы генотипирования.

1.7.3 Методы серотилирования.

1.8 Естественное течение вирусного гепапита С.

1.8.1 Острый вирусный гепатит С.

1.8.2 Хронический вирусный гепатит С.

1.8.3 Цирроз и гепатоцеллюлярная карцинома.

1.8.4 Внепечёночные проявления.

1.8.5 Механизмы хронизации гепатита С.

1.9 Эпидемиология вирусного гепатита С.

1.9.1 Распространенность.

1.9.2 Пути передачи.

1.9.3 Факторы риска.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение генетического разнообразия изолятов вируса гепатита С и факторов риска инфицирования у пациентов с острыми и хроническими гапатитами в Новосибирске"

Актуальность проблемы

Гепатит С — заболевание печени, этиологическим агентом которого является вирус гепатита С (ВГС). Гепатит С отличается медленным течением; в 75-85% случаев инфекция ВГС переходит в хроническую форму, которая может прогрессировать в цирроз или первичный рак печени (Chen et al., 2006). В настоящее время гепатит С представляет серьезную проблему для здравоохранения многих стран мира, в том числе и России. По оценкам Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) - в мире около 170 млн. лиц, инфицированных ВГС (WHO, 1999). В Российской Федерации с начала регистрации инфекции ВГС (1994 г.) и до 2001 года наблюдался ежегодный рост заболеваемости острым гепатитом С, что с одной стороны было связано с улучшением диагностики этой инфекции, а с другой обусловлено ростом внутривенного употребления наркотических препаратов в конце 90-х годов. По данным официальной статистики заболеваемость острым гепатитом С в 2001 году достигла 16,7 случаев на 100 тыс., тогда как в 1994 году регистрировали только 3,2 заболевших на 100 тыс. населения (ЗНиСО, 2002). Следует отметить, что официально регистрируемые случаи острых гепатитов не в полной мере отражают реальную картину заболеваемости, что в основном связано с бессимптомным течением острого гепатита С в большинстве случаев и со сложностью дифференциальной диагностики острой инфекции от случаев обострения хронического гепатита.

Отметим, что показатели впервые выявленных случаев хронического гепатита С в несколько раз превышают показатели заболеваемости острым гепатитом С. Так, отчётливый рост заболеваемости хроническим гепатитом С в конце 90-х годов (12,9 на 100 тыс. населения в 1999 г., 29,6 - в 2001 г.) явился отражением высокого уровня заболеваемости острой формой этой инфекции в начале и середине 90-х. В общей численности вновь выявленных хронических гепатитов именно на долю хронического гепатита С приходится более двух третей случаев. Так, по официальным данным за 2001 год доля хронического гепатита С составила 62,2%, хронического гепатита В - 33,8%, гепатитов неуточнённой этиологии — 4% (ЗНиСО, 2002). Однако официальные данные по выявлению хронических гепатитов являются неполными, поскольку наряду с ежегодно впервые выявленными больными с манифестными формами хронического гепатита В и С регистрируют большую когорту бессимптомных «носителей» вирусов.

Изучению вопросов эпидемиологии парентеральных вирусных гепатитов и в частности вирусного гепатита С в России долгое время уделялось мало внимания. Не было единого подхода в проведении эпидемиологических исследований, большинство результатов было получено на основе данных официальной статистики, что может не являться отражением реальной картины заболеваемости. В США, например, данные официальной статистики по заболеваемости гепатитами считаются в 3-5 раз ниже реальных (адрес: http://\vww.cdc.uov/hepatitis/Statistics.htrri). В период наибольшего роста заболеваемости ВГС (до 2001 года) некоторые авторы предпринимали попытки проанализировать имеющиеся официальные данные по заболеваемости с целью выявления групп риска, путей передачи парентеральных гепатитов и их соотношения на разных территориях Российской Федерации (Каира и др., 2001, Каира и др., 2002; Закиров, 2003; Мефодьев и др., 2002; Reshetnikov et al., 2001). Наибольшая встречаемость антител к ВГС была выявлена среди пациентов наркологических и кожно-венерологических диспансеров, детей из домов ребёнка (Тюменская обл.) (Мефодьев и др., 2002), работников служб крови (Московская, Тюменская обл.) (Каира и др., 2002, Мефодьев и др., 2002), студентов медицинских университетов (г. Новосибирск) (Reshetnikov et al., 2001). Самые высокие показатели заболеваемости ВГС регистрировались среди возрастной группы 15-29 лет (Каира и др., 2001; Закиров, 2003; Мефодьев и др., 2002). Однако сделанные выводы основывались только на изучении встречаемости серологических маркёров без привлечения подтверждающих серологических тестов и ПЦР анализа по причине их высокой стоимости и весьма ограниченного применения в Российской Федерации в то время. Из-за недостаточно эффективных методов диагностики более 11% регистрируемых случаев гепатитов оказывались гепатитами нерасшифрованной этиологии (Каира и др., 2001). Проведённые к 2001 году работы по эпидемиологии ВГС с привлечением используехмых за рубежом молекулярно-эпидемиологических подходов, таких как подтверждающие серологические тесты, ПЦР анализ, генотипирование были единичными в России и затрагивали только отдельные регионы и популяционные группы (Кузин и др., 1999; Львов и др., 1997; Kalinina et al., 2001). В одном из наиболее крупных эпидемиологических исследований, проведённом в то время Львовым Д.К. и соавторами, была оценена только встречаемость серологических маркёров ВГС среди клинически здорового населения (доноры крови) в Европейской части России, некоторых областях Урала, Восточной Сибири, Дальнего Востока, Монголии и изучено генотипическое разнообразие в группе доноров и небольшой группе больных с разными клиническими формами гепатита С (п=180) из Москвы и Санкт-Петербурга (Львов и др., 1997). Структура и соотношение факторов риска инфицирования гепатитом С в России также были изучены недостаточно, в более чем 30% случаях факторы риска оставались нейдентифицированными (Закиров и др., 2003). Выводы о значимости тех или иных факторов риска строились лишь на сравнении процентов ВГС-инфицированных среди некоторых популяционных групп или основывались только на данных эпидемиологического анамнеза без использования специальных программ для обработки эпидемиологических данных (Epilnfo, SPSS), которыми пользуются зарубежные учёные.

В значительной степени из-за того, что в России не проводилось молекулярно-эпидемиологических исследований вирусных гепатитов с использованием современных международно-признанных подходов, в 1999 году в лаборатории молекулярной биологии РНК-содержащих вирусов ГНЦ ВБ «Вектор» нами был начат цикл молекулярно-эпидемиологических исследований, направленных на изучение распространенности, факторов риска, генотипического разнообразия ВГС на территории юга Западной Сибири. В Западно-Сибирском экономическом регионе, богатом ресурсами, проживает около 15 млн. человек, что составляет более 10% населения России, поэтому проведение эпидемиологических исследований на данной территории является весьма актуальным для России в целом. Исследования были проведены нами с привлечением современных методов и подходов в диагностике (подтверждающие серологические тесты, ПЦР анализ), генотипировании (филогенетический анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей), обработке собранных эпидемиологических и молекулярно-биологических данных (использование программ Epilnfo, SPSS). На первом этапе были получены данные по встречаемости маркёров ВГС, факторам риска, распространённости генотипов среди пациентов инфекционных клиник и наркологического диспансера, медицинских работников, доноров, клинически здоровых людей; лиц с временным ухудшением здоровья, обратившихся к врачам-терапевтам (Шустов и др., 2000; 2002; 2004). При этом начатыми исследованиями остались неохваченными и другие представляющие интерес популяционные группы, например - пациенты с острыми и хроническими гепатитами. Более детальное изучение факторов риска заражения гепатитом С среди пациентов с острым и хроническим гепатитом, получение данных относительно гетерогенности генома ВГС и особенностей генотипического разнообразия изолятов в этих двух группах пациентов, получение информации о «вкладе» именно гепатита С в заболеваемость острыми и особенно хроническими гепатитами на изучаемой территории и явилось предметом изучения для настоящей работы.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлось изучение распространённости, генетического разнообразия вируса гепатита С и факторов риска инфицирования у пациентов с острыми и хроническими гепатитами на территории Западной Сибири (г. Новосибирск).

Для достижения указанной целей были поставлены следующие задачи:

1. Создание коллекции сывороток крови от 2-х групп пациентов: 1) пациенты с клиническими признаками острого гепатита; 2) пациенты с обострением хронического гепатита. Для этого было необходимо подготовить пакет документов для рассмотрения и утверждения в этическом комитете ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор". Методом индивидуального анонимного интервью нужно было провести анкетирование обследованных лиц, собрать необходимые эпидемиологические данные и образцы сывороток крови.

2. Исследование встречаемости серологических маркёров и РНК вирусного гепатита С в образцах созданной коллекции сывороток.

4. Проведение статистико-эпидемиологического анализа данных анкетирования и полученных результатов по распространённости ВГС и его генотипам для выявления и описания факторов риска инфицирования гепатитом С у пациентов с острым и хроническим гепатитом.

5. Проведение филогенетического анализа аминокислотных последовательностей NS5B гена изолятов ВГС, полученных от пациентов с признаками острого гепатита и пациентов с хроническим гепатитом, и исследование генетических особенностей NS5B области генома изолятов ВГС, полученных от двух групп пациентов.

Научная новизна и практическая ценность

4. Выявлены эпидемиологически значимые закономерности между соотношением генотипов ВГС и возрастом обследованных в группе пациентов с клиническими признаками острого гепатита и среди лиц с обострением хронического гепатита; в обследованных группах пациентов наблюдалось увеличение доли генотипа lb и снижение доли генотипа За с увеличением возраста.

5. Обнаружены статистически значимые связи между определёнными факторами риска и генотипами ВГС в группе пациентов с хроническим гепатитом: генотип lb достоверно чаще встречался у лиц, которым проводилось переливание крови, генотип 2 - среди получавших общую анестезию лиц.

Положения, выносимые на защиту:

1. Соотношение генотипов ВГС в разных возрастных группах у пациентов с клиническими признаками острого гепатита и лиц с обострением хронического гепатита различалось; с увеличением возраста обследованных пациентов наблюдалось увеличение доли генотипа lb и снижение доли генотипа За.

2. Наиболее значимый фактор инфицирования ВГС в обследованных группах пациентов связан с внутривенным употреблением наркотических препаратов (отношение шансов: OR >6,98); в группе пациентов с клиническими признаками острого гепатита показано значение и интраназальное использование наркотических веществ (OR-8,29). Среди других выявленных факторов риска в отношении инфекции ВГС наибольшее значение имели: в группе пациентов с клиническими признаками острого гепатита - пребывание в местах лишения свободы (OR-5,82) и нанесение татуировок (OR=4,37); в группе пациентов с обострением хронического гепатита - внутрисемейные контакты с больным острым гепатитом (OR=5,56).

Апробация работы и публикации

Статьи:

1. Гаврилова (Плясунова) И.В., Шустов А.В., Нетёсов С.В. (2001). Быстрые методы генотипирования изолятов вируса гепатита С с использованием анализа копформационного полиморфизма одиночных цепей ДНК и гетер о дуплексного анализа. Мир вирусных гепатитов 11, 8-18.

2. Гаврилова (Плясунова) И.В., Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Граяеданцева А.А., Акинфеева JI.A., Орловский В.Г., Алёшина М.В., Сахарова Е.Г., Толоконская Н.П., Нетесов С.В. (2005). Факторы риска заражения больных гепатитом С в инфекционных больницах Новосибирска. Эпидемиология и инфекционные болезни 6, 28-33.

3. Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Шустов А.В., Гаврилова (Плясунова) И.В., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Акинфеева JI.A., Гранитов В.М., Сахарова Е.Г., Губанова Л.И., Орловский В.Г. (2005). Этиология острых гепатитов и генотипическое разнообразие вирусов гепатитов А, В, С и Е в трех регионах Сибири. Инфекционные болезни 3, 26 - 31.

4. Гаврилова (Плясунова) И.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Баяндин Р.Б., Нетесов С.В. (2007). Распространенность, генотипическое разнообразие и факторы риска гепатита С среди больных с хроническими вирусными гепатитами в Новосибирской области. Инфекционные болезни 5, 9-15.

Вклад автора:

Результаты по теме диссертации за исключением работ, связанных с анкетированием пациентов, проведением серологических тестов и ПЦР на ДНК ВГВ были получены лично автором.

Благодарности:

Автор приносит благодарность своим коллегам по лаборатории и сотрудникам ГНЦ ВБ "Вектор", в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена диссертационная работа, а именно: д.б.н., проф. С.В. Нетесову, д.б.н., проф. В.Б. Локтеву, к.б.н. А.В. Шустову, к.б.н. Г.В. Кочневой, к.б.н. А.А. Гражданцевой, к.б.н. Г.Ф. Сиволобовой, Р.Б. Баяндину, С.А. Походне. Автор благодарен JI.A. Акинфеевой за помощь в выполнении работ по тестированию образцов сывороток в ИФА, а также врачам 1-ой Городской инфекционной клинической больницы г. Новосибирска (Сахаровой Е.Г., Черноусовой Н.Я., Красильниковой И.В., Козлову Д.И., Бурмистровой Т.Г., Томиленко Т.Г., Фихман Е.А., Мельниковой О.В., Ульяновой Я.С.), Новосибирского государственного областного центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями (Орловскому В.Г., Алёшиной М.В.), Областной клинической больницы г. Новосибирска (Масленниковой Т. А., Лебедеву А.Г.) за проведение анкетирования пациентов.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Плясунова, Ирина Викторовна

выводы

3. Генотипическое разнообразие изолятов ВГС по 5'-UTR и NS5B областям генома оказалось следующим: в группе пациентов с клиническими признаками острого гепатита - субтип lb - 57,5%, 2а - 1,6%, 2с - 1,6%, 2а/2с - 3,9%, За - 33,9%, нетипируемые - 1,6%; среди пациентов с обострением хронического гепатита — субтип lb - 62,7%, 2а - 6,4%, 2с - 1,8%, 2к - 0,9%, 2а/2с - 2,7%, За - 22,7%, рекомбинантные изоляты (2а/2с-1Ь) - 1,8%, нетипируемые образцы - 0,9%. Соотношение генотипов ВГС в разных возрастных группах у пациентов с острым гепатитом и у лиц с хроническим гепатитом оказалось различным; наблюдалось увеличение доли генотипа lb и снижение генотипа За с увеличением возраста обследованных пациентов.

4. Основные факторы риска инфицирования ВГС у пациентов с острым гепатитом -употребление наркотических веществ (отношение шансов: OR=19,8 и OR=8,3 для внутривенного и интраназального использования наркотических веществ соответственно), пребывание в местах лишения свободы (OR=5,9) и наличие татуировок (OR=4,4). Среди обследованных, отрицавших употребление наркотиков, значимыми факторами оказались: лечение в больнице (OR=2,2), использование стеклянных шприцов для инъекций (0R=1Q,4), проведение внутривенных вливаний

OR=3,8), госпитализации в отделения хирургии, гинекологии, интенсивной терапии

OR=5,5) и посещение врачей в поликлинике (хирург, гинеколог, проведение гастроскопии, колоноскопии) (OR=l,7).

6. Анализ 88 выведенных аминокислотных последовательностей области Gln241-Asp318 белка NS5B изолятов ВГС, выделенных от обследованных пациентов, выявил 5 изолятов разных генотипов с уникальными заменами в группе пациентов с хроническим гепатитом: KNG350 (субтип lb, замена Cys311Ala), ТАМ4 (субтип lb, Arg304Gln), LAG1 (субтип 2а, Phe267Val), LAG 19 (субтип 2k, Arg244Met), LAG 16 (субтип За, Ser288Gly).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью настоящего исследования являлись: изучение распространённости, генетического разнообразия вируса гепатита С и факторов риска инфицирования у пациентов с острыми и хроническими гепатитами на территории Западной Сибири (г. Новосибирск).

Изучение встречаемости серологических маркёров ВГС показало, что среди пациентов с острым гепатитом AT к ВГС были выявлены у 23,1% обследованных, тогда как в группе пациентов с хроническим гепатитом встречаемость серологических маркёров ВГС составила 69,5%. Эти данные наглядно показывают, что вирусному гепатиту С принадлежит ведущая роль в этиологии хронических гепатитов в Сибири, тогда как доля ВГС в развитии острых гепатитов составляет менее 24%. Поскольку течение гепатита С часто бессимптомно, большинство пациентов обращаются за медицинской помощью через несколько лет после заражения при появлении видимых нарушений в работе печени уже после перехода инфекции ВГС в хроническую форму. По литературным данным средний возраст пациентов с хроническим гепатитом С при первом обследовании составляет 43-49 лет (Roudot-Thoraval et al., 1997; Gordon et al., 1998; Niederau, 1998). Изучение возрастной структуры исследованных групп пациентов в нашем исследовании показало, что среди лиц с хроническим гепатитом преобладали пациенты старше 30 лет (68,9%), тогда как в группе пациентов с острым гепатитом большинство обследованных были лицами молодого возраста (лица до 30 лет составили 70,7%).

По нашим данным 11,6% пациентов с хроническим гепатитом не имели серологических маркёров ни ВГС, ни ВГВ инфекций (безмаркёрные). Проведение ПЦР анализа для обнаружения РНК ВГС и ДНК ВГВ у «безмаркёрных» пациентов позволило определить этиологию гепатита в 78,9% случаев, причём более половины выявленных случаев (53,3%) пришлось на смешанную инфекцию (ВГС+ВГВ). Полученные результаты подчёркивают важность проведения ПЦР-тестов для обследования пациентов с хроническими гепатитами.

Изучение генетического разнообразия изолятов ВГС, выявленных у пациентов с острым и хроническим гепатитом, показало, что преобладающим субтипом в обеих обследованных группах является субтип lb, следующий по частоте встречаемости — субтип За, с меньшими частотами встречаются изоляты генотипа 2 (2а, 2с, 2к, 2а/2с). Выявленное нами соотношение генотипов в целом соответствует полученным ранее данным по генотипическому разнообразию ВГС на территории Западной Сибири (Шустов и др., 2000, 2002, 2004, Чуб и др., 2007). Однако доля субтипа За в группе пациентов с острым гепатитом была больше (33,9%), чем в группе пациентов с обострением хронического гепатита (22,7%) и разница приближалась к статистически достоверной (х2=3,57, р=0,0589). Кроме того, в группе пациентов с хроническим гепатитом были найдены более редкие варианты ВГС: изолят субтипа 2к и 2 рекомбинатных изолята (2а-2с/1Ь).

Интересно, что соотношение выявленных генотипов ВГС оказалось неодинаковым в разных возрастных группах как у пациентов с острым, так и у пациентов с хроническим гепатитом. Наблюдалось увеличение доли генотипа lb и снижение доли генотипа За с увеличением возраста в обеих обследованных группах пациентов. Вероятно, соотношение генотипов зависит от превалирующих путей и механизмов передачи вируса в популяции. До начала тестирования донорской крови на маркеры ВГС (в России 1994 год) переливание инфицированной крови было основным механизмом заражения. По литературным данным генотип lb достоверно чаще встречался среди лиц, которым проводилось переливание крови (Dubois et al., 1997; Elghouzzi et al., 2000; Kurbanov et al., 2003; Dal Molin et al., 2002). Аналогичные результаты получились и у нас: среди лиц с генотипом lb в группе пациентов с острым гепатитом переливание крови до 1994 года получали 63,0%, основная масса которых - это лица старшего возраста (средний возраст 49,5 лет). В последние годы основным путём заражения ВГС становится использование внутривенных наркотиков. Среди лиц, употребляющих наркотические препараты внутривенно, достоверно чаще встречается генотип За. Данный генотип является доминирующим в странах Азии, откуда он, вернее всего, и распространился по миру, главным образом, в среду наркоманов (Morice et al., 2006). Поскольку потребителями наркотиков являются преимущественно молодые люди, доля генотипа За возрастает в младших возрастных группах и соотношение генотипов ВГС в популяции меняется со временем в сторону увеличения доли генотипа За. Можно ожидать, что со временем и нынешняя картина распределения генотипов ВГС изменится, что приведёт к необходимости внесения коррективов в методы диагностики и стратегию лечения ВГС.

Проведённый нами анализ факторов риска инфицирования ВГС показал, что наиболее значимым фактором риска заражения ВГС в обеих обследованных группах пациентов является внутривенное употребление наркотических препаратов (OR>6,98). Кроме того, в группе пациентов с острым гепатитом выявлена значимость и интраназального использования наркотиков (OR=8,29). За рубежом это отметили ранее - вероятным механизмом заражения таким способом является проникновение вируса через повреждённую слизистую оболочку носа при совместном использовании специальных приспособлений для вдыхания наркотика (Conry-Cantilena et al., 1996).

Предполагают, что риск передачи ВГС половым путём является низким: в одной из обзорных публикаций (Cavalheiro, 2007) приведены сведения, что по данным большинства исследователей на долю сексуального пути передачи приходится от 0 до 3% в общей структуре изученных путей передачи ВГС. В нашем исследовании мы обнаружили статистически достоверную связь между количеством половых партнёров и серопозитивностью по маркёрам ВГС. В группе пациентов с симптомами острого гепатита те лица, которые имели более 2 половых партнёров в последние 6 месяцев до заболевания и половые контакты в течение 6 месяцев до заболевания с партнёрами, которые употребляли когда-либо внутривенно наркотические вещества, имели повышенный риск серопозитивности по маркёрам ВГС.

Данные по бытовым путям передачи гепатита С, обсуждаемые в литературе, довольно противоречивы: в одной из обзорных публикаций имеются данные, что процент инфицирования при передачи ВГС бытовым путём варьирует от 0 до 11% (Memon at al., 2002). Нами не было выявлено статистически значимой связи между фактом совместного использования с другими людьми предметов личной гигиены (зубные щётки, бритвенные принадлежности, маникюрные наборы, полотенца и др.) и инфицированием ВГС. Тем не менее, в группе пациентов с симптомами острого гепатита мы выявили повышенные риски заражения, происходящие от совместного проживания с лицами, которые перенесли переливание крови (OR= 10,02) и употребляют наркотики внутривенно (OR=3,94). В группе пациентов с хроническим гепатитом риск инфицирования ВГС был выше у лиц, которые указывали о заболеваемости острым гепатитом кого-нибудь из членов семьи (OR=5,56). Однако не исключено, что в выявленных случаях бытовой передачи могло иметь место и совместное употребление наркотиков, о чём респонденты могли и умолчать.

По нашим данным употребляющие алкоголь лица имели повышенный риск серопозитивности в отношении инфекции ВГС. В последние 10-15 лет вопрос связи алкоголизма и хронического гепатита С активно обсуждается в литературе. В последних обзорных публикациях (Bhattacharya et al., 2003; Jamal et al., 2005) имеются данные о том, что распространённость гепатита С среди алкоголиков в 7-10 раз выше, чем в общей популяции. Также стоит отметить, что гепатит С, в сочетании с алкоголизмом приводит к более быстрому прогрессированию заболевания печени, что связано с синергизмом совместного воздействия на печень этих факторов.

Факторы риска, связанные с медицинскими процедурами, по-видимому, уже не играют такой большой роли в распространении ВГС, как это было до введения тестирования на антитела к ВГС в России в 1994 году (Батрак, 1994). В нашем исследовании мы не выявили повышенного риска серопозитивности по маркёрам ВГС у лиц, получавших переливания крови, имевших отношение к гемодиализу, к отделению по трансплантации почек, перенёсших хирургические операции. Однако при попытке оценить факторы риска, имеющие отношения к медицинским процедурам, среди лиц, отрицавших употребление внутривенных и интраназальных наркотиков в группе пациентов с острым гепатитом, выяснилось, что наиболее статистически значимыми факторами риска являются: использование стеклянных шприцов для инъекций (OR=l 0,38), госпитализации в отделение хирургии, гинекологии, интенсивной терапии (OR=5,50), лечение в больнице в последние 6 месяцев до заболевания (OR=2,20). Унивариантный анализ не позволил выяснить статистически значимые связи между посещениями стоматолога и инфекцией ВГС, но при проведении логистического регрессионного анализа выяснилось, что риск инфицирования ВГС с каждым посещением стоматолога увеличивается в 1,17 раза.

Среди факторов риска, связанных с немедицинскими травматическими манипуляциями, значимым оказалось нанесение татуировок. В группе пациентов с острым гепатитом у респондентов, имеющих татуировки, AT к ВГС обнаруживались в 50% случаев, в то время как у лиц без татуировок - только в 18,6%. Haley R.W. в своей статье (Haley et al., 2001) указывает на значение татуировок в качестве весомого фактора риска для передачи ВГС. Риск заразиться ВГС возрастал с увеличением размера татуировок, частоты посещений тату-салонов и зависел от техники нанесения. Вероятными причинами инфицирования ВГС при нанесении татуировок могут быть: повторное использование игл или красителей, нарушение правил стерилизации инструментов и правил асептики (например, проверка качества получаемого изображения на тыльной стороне своей руки или руки клиента). В нашем исследовании более 60% респондентов сообщили, что делали татуировки в домашних условиях и не обращались в специализированные салоны, что, несомненно, приводит к возрастанию риска заражения не только ВГС, но и другими парентерально передающимися инфекциями.

Наличие в нашем исследовании достаточного количества эпидемиологических и молекулярно-биологических данных позволило нам провести анализ по выявлению зависимостей между генотипом ВГС и определённым фактором риска. В группе пациентов с острым гепатитом статистически значимых закономерностей выявлено не было, в то время как во второй обследованной группе пациентов (пациенты с хроническим гепатитом) были получены интересные данные. Выяснилось, что генотип lb достоверно чаще встречается у лиц, которым проводилось переливание крови (OR=4,59). Пациенты, имеющие генотип lb, госпитализировались по поводу заболевания печени достоверно чаще, чем лица с генотипом За (OR=2,49). Видимо, это связано с тем, что ВГС генотипа lb вызывает более тяжёлые последствия для печени, чем другие генотипы. (Zein, 2000). Генотип 2 достоверно чаще встречался у лиц, которым проводилась общая анестезия (OR= 10,78).

Для генотипирования изолятов ВГС, полученных от пациентов с острым и хроническим вирусным гепатитом, наряду с секвенированием нами были использованы методы SSCP и НМА. Из 38 образцов, использованных для генотипирования методом SSCP, однозначно и правильно было генотипировано 97,4%. Метод НМА показал 100% сходимость в определении генотипа ВГС для 82 взятых в анализ образцов. Таким образом, оба метода НМА и SSCP с уверенностью можно рекомендовать для генотипирования изолятов ВГС в клинической практике, потому что для назначения схем лечения ВГС достаточно знать генотип вируса (1,2 или 3) и нет необходимости в определении субтипа. Генотипирование с помощью SSCP и НМА отличается простотой выполнения, низкой стоимостью, относительной быстротой, возможностью организовать выполнение практически в любой лаборатории, где гель-электрофорез нуклеиновых кислот является рутинной практикой. Освоенные нами протоколы НМА и SSCP позволяют генотипировать изоляты ВГС, относящиеся к трём основным для Российской Федерации генотипам вируса: lb, 2а/2с и За.

Нами были проанализированы 39 аминокислотных последовательностей области Gln241-Asp318 белка NS5B для изолятов, полученных от пациентов с клиническими признаками острого гепатита, и 49 последовательностей аналогичного района для изолятов, выделенных от пациентов с хроническим гепатитом. Результаты филогенетического анализа показали, что все изучаемые изоляты группируются в хорошо различимые ветви субтипов lb, 2а, 2с, 2к (обнаружен только в группе пациентов с хроническим гепатитом) и За. Аминокислотные последовательности субтипа lb в группе пациентов с острым гепатитом образовывали на филогенетическом дереве отдельные подгруппы, согласно имеющимся заменам, что нельзя было сказать про вторую обследованную группу пациентов. Филогенетический анализ, проведённый для группы пациентов с хроническим гепатитом, показал, что среди последовательностей субтипа lb чётко выделить отдельные подгруппы было затруднительно, видимо, в силу большей гетерогенности по аминокислотному составу. Действительно, дальнейшие расчёты показали, что доля изолятов генотипа lb с 2-мя. и более заменами статистически достоверно больше у пациентов с хроническим (87,1%), чем с острым гепатитом (58,3%) (Х2=5,9; р=0,015).

Результаты поиска в Международной базе данных Genbank показали, что среди аминокислотных последовательностей, полученных от пациентов с острым гепатитом, не было обнаружено изолятов с уникальными заменами. Однако встречались последовательности, имеющие довольно редкие замены: KIV137 (замена Gln241Pro), BTG68 (Lys298Gln), KDI67 (Met289Val). Следует особо отметить последовательность BTG68 (субтип За), которая имела замену лизин на глутамин в 298 положении. В структуре РНК-зависимой РНК-полимеразы ВГС данная мутация расположена в консервативной для изолятов ВГС области мотива В, который принимает участие во взаимодействии с матрицей/праймером (Koonin, 1991). В базе данных GenBank было найдено только 3 изолята, имеющих аналогичную замену (ААХ94616, ААХ94615, ААХ94604). Данные изоляты были получены от пациентов с симптомами острого гепатита из г. Барнаула сотрудниками нашей лаборатории (Чуб Е.В., Плясунова И.В., Нетёсов С.В.). Дальнейшая судьба изолятов с такой заменой непонятна, так как проспективные исследования для имеющих такую мутацию вариантов ВГС нами пока не проводились. Поскольку такая замена встречалась среди изолятов ВГС довольно редко и выявлялась только у пациентов с острым гепатитом, можно предположить, что вирусные частицы с такой заменой могут иметь нарушения в процессе репликации и в последующем могут быть элиминированы.

В процессе поиска в базе GenBank гомологичных последовательностей было выяснено, что выделенные от пациентов с острым и хроническим гепатитом изоляты ВГС, имеющие часто встречающиеся замены, на филогенетических деревьях группируются с последовательностями, выделенными в России, Узбекистане, Японии, Эстонии, Литвы, Испании.

Среди изолятов, выделенных от пациентов с хроническим гепатитом, было обнаружено 5 последовательностей с уникальными заменами: KNG350 (Cys311Ala), ТАМ4 (Arg304Gln) - субтип lb; LAG1 (Phe267Val) - 2a; LAG 19 (Arg244Met) -2k; LAG 16 (Ser288Gly) - За. Результаты поиска в GenBank показали, что изоляты с такими заменами не встречаются нигде в мире. Наличие уникальных замен у вариантов ВГС, выделенных от пациентов с хроническим гепатитом, может говорить о долговременности циркулирования данных изолятов в Западной Сибири и о существовании независимых от других регионов путей эволюции генома данного вируса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Плясунова, Ирина Викторовна, Кольцово

1. Батрак, Н.И. Вирусные гепатиты В, С и Д как нозокомиальные инфекции в госпитлях // Воен.-мед. Жури.-1994.- 5.-С. 37-39.

2. Бююль, А., Цёфель, П. SPSS: Искусство обработки информации. Анализ статистических данных и восстановление скрытых закономерностей / Пер. с нем,-СПб.: ООО "ДиаСофтЮП", 2002. 608 с.

3. Закиров, И.Г. Хронические гепатиты в условиях крупного промышленно-сельскохозяйственного региона (на примере республики Татарстан) // Эпидемиология и инфекционные болезни.-2003.-2.-С. 19-21.

4. ЗНиСО. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за январь-декабрь 2001 года // Здоровье населения и среда обитания (ЗНиСО). Ежемесячный бюллетень Госсанэпиднадзора МЗ РФ.-2002.-№1.-106.- С. 50.

5. Ильина, Е.Н., Гущин, А.Г., Говорун, О.О., Знойко, О.О., Климова, Е.А., Ющук, Н.Д. Новый подход в генотипировании вируса гепатита С // Эпидемиология и инфекционные болезни.-1999.- 2.- С. 23-26.

6. Каира, А.Н., Ющенко Г.В. Вирусные гепатиты в Московской области: эпидемиология и профилактика// Эпидемиология и инфекционные болезни.-2001.- 5.-С. 7-10.

7. Каира, А.Н., Ющенко, Г.В. Вирусные гепатиты В и С среди медицинских работников Московской области и их профилактика // Эпидемиология и инфекционные болезни.-2002.-2.-С. 230-34.

8. И. Мефодьев, В.В., Марченко, А.Н., Огурцов, А.А. Эпидемиология вирусных гепатитов на юге Тюменской области // Эпидемиология и инфекционные болезни.-2002.- 4.-С. 13-16.

9. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных.-М.: Медиа Сфера, 2002.-312 с.

10. Флетчер, Р., Флетчер, С. Вагнер, Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины / Пер с англ. -М.: Медиа Сфера, 1998. -352с.

11. Чуб Е. В., Кочнева Г. В., Нетесов С. В. Рекомбинанты вируса гепатита С типа 2k/lb у населения Алтайского края // Инфекционные болезни.-2007.- 5.-С. 5-11.

12. Adams, A., Chamberlain, R. W., Taylor, L. A., Davidson, F., Lin, С. К., Simmonds, P., Elliot, R. M.Complete coding sequence of hepatitis С virus genotype 6a // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1997.- 234.-P. 393-396.

13. Ago, H., Adachi, Т., Yoshida, A., Yamamoto, M., Habuka, N., Yatsunami, K., Miyano, M. Crystal structure of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis С virus // Structure. Fold. Des.-1999.- 7.-P. 1417-1426.

14. Ali, N., Wang, С., Siddiqui, A. Translation of hepatitis С virus genome // Princess. Takamatsu. Symp.-1995.- 25.-P. 99-110.

15. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis С virus infection // World. J. Gastroenterol.-2007.-13.-P. 2436-2441.

16. Alter, M.J. Prevention of spread of hepatitis С // Hepatology.-2002.- 36.-P. 93-98.

17. Alter, M.J., Kruszon-Moran, D., Nainan, O.V., McQuillan, G.M., Gao, F., Moyer, L.A., Kaslow, R.A., Margolis, H.S. The prevalence of hepatitis С vims infection in the United States, 1988 through 1994 //N. Engl. J. Med.-1999,- 341.-P. 556-562.

18. Anderson, J.C., Simonetti, J., Fisher, D.G., Williams, J., Yamamura, Y., Rodriguez, N., Sullivan, D.G., Gretch, D.R., McMahon, В., Williams, K.J. Comparison of different HCV viral load and genotyping assays // J. Clin. Virol.-2003.- 28.-P. 27-37.

19. Armstrong, G.L., Wasley, A., Simard, E.P., McQuillan, G.M., Kuhnert, W.L., Alter, M.J. The prevalence of hepatitis С virus infection in the United States, 1999 through 2002 // Ann. Intern. Med.-2006.- 144.-P. 705-714.

20. Backmund, M., Reimer, J., Meye,r K., Gerlach, J.T., Zachoval, R. Hepatitis С vims infectionand injection drug users: prevention, risk factors, and treatment // Clin. Infect.-2005.- 40.-P. 330-335.

21. Barria, M.I., Vera-Otarola, J., Leon, U., Vollrath, V., Marsac, D., Riquelme, A., Lopez-Lastra, M., Soza, A. Influence of extrahepatic viral infection on the natural history of hepatitis С// Ann. Hepatol.-2008.- 7.-P. 136-143.

22. Bartenschlager, R., Ahlborn-Laake, L., Yasargil, K., Mous, J., Jacobsen, H. Substrate determinants for cleavage in cis and in trans by the hepatitis С virus NS3 proteinase // J. Virol.-1995.- 69.-P. 198-205.

23. Bartosch, В., Cosset, F.L. Cell entry of hepatitis С virus // Virology.-2006.- 348.-P. 1-12.

24. Behrens, S. E., Tomei, L., De Francesco, R. Identification and properties of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis С vims // EMBO J.-1996.- 15.-P.12-22.

25. Bellentani, S., Tiribelli, C. The spectrum of liver disease in the general population: lesson from the Dionysos study // J. Hepatol.-2001.-35.-P. 531-537.

26. Bhattacharya, R., Shuhart, M.C. Hepatitis С and alcohol: interactions, outcomes, and implications // J. Clin. Gastroenterol.-2003.- 36.-P. 242-252.

27. Blackard, J.T., Hiasa, Y., Smeaton, L., Jamieson, D.J., Rodriguez, I., Mayer, K.H., Chung, R.T. Compartmentalization of hepatitis С virus (HCV) during HCV/HIV coinfection // J. Infect. Dis.-2007.- 195.-P. 1765-1773.

28. Blanchette, V.S., Vorstman, E., Shore, A., Wang, E., Petric, M., Jett, B.W., Alter, H.J. Hepatitis С infection in children with hemophilia A and В // Blood.-1999.- 78.-P. 285-289.

29. Bosman, C., Valli, M., Bertolini, L., Serafino, A., Boldrini, R., Marcellini, M., Carloni, G. Detection of virus-like particles in liver biopsies from HCV-infected patients // Res. Virol.-1998.- 149.-P. 311-314.

30. Bressanelli, S., Tomei, L., Roussel, A., Incitti, I., Vitale, R.L., Mathieu, M.,De Francesco, R., Rey, F.A. Crystal structure of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis С virus // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.-1999,- 96.-P. 13034-13039.

31. Bukh, J., Miller, R. H., Purcell, R. H. Genetic heterogeneity of hepatitis С virus: quasispecies and genotypes // Semin. Liver. Dis.-1995.- 15.-P. 41-63.

32. Buratti, E., Tisminetzky, S., Zotti, M., Baralle, F. E. Functional analysis of the interaction between HCV 5'UTR and putative subunits of eukaryotic translation initiation factor eIF3 // Nucleic. Acids. Res.-1998,- 26.-P. 3179-3187.

33. Cacoub, P., Ohayon, V., Sekkat, S., Dumont, В., Sbai, A., Lunel, F., et al. Epidemiologic and virologic study of hepatitis С virus infection in Morocco // Gastroenterol. Clin. Biol.-2000.-24.-P. 169-173.

34. Cantaloube, J.F., Gallian, P., Attoui, H., Biagini, P., De Micco, P., de Lamballerie, X. Genotype distribution and molecular epidemiology of hepatitis С virus in blood donors from southeast France // J. Clin. Microbiol.-2005.-43.-P. 3624-3629.

35. Carbonne, A., Thiers, V. Nosocomial transmission of hepatitis С from patient to patient in general anesthesia in the northern inter-region in 2001-2002 //Ann. Fr. Anesth. Reanim.-2004.-23.-P. 550-553.

36. Carrie, R. J., Schlauder, G. G., Peterson, D. A., Mushahwar, I. K. Examination of the buoyant density of hepatitis С virus by the polymerase chain reaction // J. Virol. Methods.-1992.-39.-P. 279-289.

37. Caruntu, F.A., Benea, L. Acute hepatitis С virus infection: Diagnosis, pathogenesis, treatment // J. Gastrointestin. Liver Dis.-2006.-15.-P. 249-56.

38. Cavalheiro, Nde.P. Sexual transmission of hepatitis С // Rev. Inst. Med. Trop. S Paulo.-2007.-49.-P. 271-277.

39. CDC (Centers for Disease Control and Prevention). Guidelines for Laboratory Testing and

40. Result Reporting of Antibody to Hepatitis С Virus // MMWR Recomm. Rep.-2003.- 52(RR-03).-P. 1-16.

41. CDC (Centers for Disease Control and Prevention). Guidelines for Viral Hepatitis

42. Surveillance and Case Management.-2005.- Atlanta, GA.-P. 1-54.

43. CDC (Centers for Disease Control and Prevention). Recommendations for prevention and control of hepatitis С virus (HCV) infection and HCV-related chronic disease // MMWR Recomm. Rep.-1998.- 47(RR-19).-P. 1-39.

44. CDC (Centers for Disease Control and Prevention). Surveillance for Acute Viral Hepatitis

45. United States //MMWR Surveillance Summaries.-2008.- 57 (SS-2).-P. 1-28.

46. Chamberlain, R. W., Adams, N. J., Saeed, A. A., Simmonds, P., Elliott, R. M. Complete nucleotide sequence of a type 4 hepatitis С virus variant, the predominant genotype in the Middle East // J. Gen. Virol.-1997а,- 78.-P. 1341-1347.

47. Chamberlain, R. W., Adams, N. J., Taylor, L. A., Simmonds, P., Elliot, R. M. The complete coding sequence of hepatitis С virus genotype 5a, the predominant genotype in South Africa //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1997b.- 236.-P. 44-49.

48. Chambers, T. J., Hahn, Galler, R., Rice, С. M. Flavivirus genome organization, expression, and replication //Annu. Rev. Microbiol.-1990.- 44.-P. 649-688.

49. Chang, J. C., Seidel, C., Ofenloch, В., Jue, D. L., Fields, H. A., Khudyakov, Y. E. Antigenic heterogeneity of the hepatitis С virus NS4 protein as modeled with synthetic peptides // Virology.-1999,- 257.- P. 177-190.

50. Chayama, K., Tsubota, A., Koida, I., Arase, Y., Saitoh, S., Ikeda, K., Kumada, H. Nucleotide sequence hepatitis С virus (type 3b) isolated from a Japanese patient with chronic hepatitic С // J. Gen. Virol.-1994.- 75.-P. 3623-3628.

51. Chen, S.L., Morgan, T.R. The natural history of hepatitis С virus (HCV) infection. Int. J. Med. Sci.-2006.- 3.-P. 47-52.

52. Chen, Z., Week, K.E. Hepatitis С virus genotyping: interrogation of the 5' untranslated region cannot accurately distinguish genotypes la and lb // J. Clin. Microbiol.-2002.-40.-P. 3127-3134.

53. Chiba, Т., Matsuzaki, Y., Abei, M., Shoda, J., Aikawa, Т., Tanaka, N., Osuga, T. Multivariate analysis of risk factors for hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis С virus-related liver cirrhosis // J. Gastroenterol.-1996.- 31.-P. 552-558.

54. Choo, Q. L., Kuo, G., Weiner, A. J., Overby, L. R., Bradley, D. W., Houghton, M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome // Science.-1989,-244.-P. 359-362.

55. Clarysse, C., Lin, L., Crabbe, Т., van Pelt, J. F., Cammack, N., Yap, S. H. HVR1 quasispecies analysis from a long-term culture of hepatitis С virus in Hep G2 derived cells grown in a haemodialysis cartridge // J. Viral. Hepat.-2001.-8.- P. 132-138.

56. Cocquerel, L., Meunier, J. C., Op de Beeck, A., Bonte, D., Wychowski, C., Dubuisson, J. Coexpression of hepatitis С virus envelope proteins El and E2 in cis improves the stability of membrane insertion of E2 // J. Gen. Virol.-2001.- 82.-P. 1629-1635.

57. Cocquerel, L., Voisset, C., Dubuisson, J. Hepatitis С virus entry: potential receptors and their biological functions // J. Gen. Virol.-2006.- 87.-P. 1075-1084.

58. Cody, S.H., Nainan, O.V., Garfein, R.S., Meyers, H., Bell, B.P., Shapiro, C.N., Meeks, E.L.,

59. Pitt, H., Mouzin, E., Alter, M.J., Margolis, H.S., Vugia, D.J. Hepatitis С virus transmission from an anesthesiologist to a patient // Arch. Intern. Med.-2002.- 162.-P. 345-350.

60. Colina, R., Casane, D., Vasquez, S., Garcia-Aguirre, L., Chunga ,A., Romero, H., Khan, В., Cristina, J. Evidence of intratypic recombination in natural populations of hepatitis С virus // J. Gen. Virol.-2004.- 85.-P. 31-37

61. Conry-Cantilena, C., VanRaden, M., Gibble, J., Melpolder, J., Shakil, A.O., Viladomiu, L.,

62. Cheung, L., DiBisceglie, A., Hoofnagle, J., Shih, J.W. Routes of infection, viremia, and liver disease in blood donors found to have hepatitis С virus infection // N. Engl. J. Med.-1996.-334.-P. 1691-1696.

63. Craxi, A., Licata, A. Acute hepatitis C: in search of the optimal approach to cure // Hepatology.-2006.- 43.-P. 221-224.

64. Dal Molin, G., Ansaldi, F., Biagi, C., D'Agaro, P., Comar, M., Croce, L., Tiribelli, C., Campello, C. Changing molecular epidemiology of hepatitis С virus infection in Northeast Italy // J. Med. Virol.-2002.- 68.-P. 352-6.

65. Delwart, E.L., Herring, В., Learn, G., Rodrigo, A.G., Mullins, J.I. (1995a). NIII-NIAID AIDS Reference and Reagent Program, Rockville, MD, USA, 1995a

66. Delwart, E.L., Herring, В., Rodrigo, A.G., Mullins, J.I. Genetic subtyping of human immunodeficiency virus using a heteroduplex mobility assay // PCR Methods Appl.-1995b.-4.-P. 202-216.

67. Delwart, E.L., Sheppard, H.W., Walker, B.D., Goudsmit, J., Mullins, J.I. Human immunodeficiency virus type 1 evolution in vivo tracked by DNA heteroduplex mobility assays//J. Virol.-1994.-68.-P. 6672-6683.

68. Delwart, E.L., Shpaer, E.G., Louwagie, J., McCutchan, F.E., Grez, M., Rtibsamen-Waigmann, H., Mullins, J.I. Genetic relationships determined by a DNA heteroduplex mobility assay: analysis of HIV-1 env genes // Science.-1993.- 262.-P. 1257-1261.

69. Djebbi, A., Triki, H., Bahri, O., Cheikh, I., Sadraoui, A., Ben Ammar, A., Dellagi, K. Genotypes of hepatitis С virus circulating in Tunisia // Epidemiol Infect.-2003.- 130.-P. 501-505.

70. Domingo, E., Baranowski, E., Ruiz-Jarabo, С. M., Martin-Hernandez, A. M., Saiz, J. C., Escarmis, C. Quasispecies structure and persistence of RNA viruses // Emerg. Infect. Dis.-1998.-4.-P. 521-527.

71. Dominguez, A., Bruguera, M., Vidal, J., Plans, P., Salleras, L. Community-based seroepidemiological survey of HCV infection in Catalonia, Spain // J. Med. Virol.-2001.-65.-P. 688-693.

72. Donahue, J.G., Munoz, A., Ness, P.M., Brown, D.E. Jr, Yawn, D.H., McAllister, H.A. Jr, Reitz, B.A., Nelson, K.E. The declining risk of posttransfusion hepatitis С virus infection // N. Engl. J. Med.-1992.- 327.-P.369-373.

73. Dore, G.J., Law, M., MacDonald, M., Kaldor, J.M. (2003). Epidemiology of hepatitis С virus infection in Australia.// J. Clin. Virol.-2003.-26.-P. 171-184.

74. Dubuisson, J., Penin, F., Moradpour, D. Interaction of hepatitis С virus proteins with host cell membranes and lipids // Trends Cell. Biol.-2002.- 12.-P. 517-523

75. Diabetes and Digestive and Kidney Diseases. Washington, DC: US Government Printing Office, 1994; NIH publication no. 94-1447, P.-615-645.

76. ECDPC (European Centre for Disease Prevention and Control). The First European Communicable Disease Epidemiological Report. Editors: Amato-Gauci A. and Ammon A., Stockholm, 7 June 2007.

77. E1-Serag, H.B, Hampel, H., Yeh, C., Rabeneck, L. Extrahepatic manifestations of hepatitis С among United States male veterans // Hepatology.-2002.- 36.-P. 1439-1445.

78. Eroglu, C., Yildiz, E., Ozturk, M., Pinarbasi, E. A highly sensitive and specific enzyme-linked immunosorbent assay of antibodies to hepatitis С virus // Acta. Virol. J.-2000.- 44.-P. 29-33.

79. Esteban, J.I., Gomez, J., Martell, M., Cabot, В., Quer, J., Camps, J., Gonzalez, A., Otero, Т., Moya, A., Esteban, R., et al. Transmission of hepatitis С virus by a cardiac surgeon // N. Engl. J. Med.-1996.- 334.-P. 555-560.

80. Esteban, J.I., Sauleda, S., Quer, J. The changing epidemiology of hepatitis С virus infection in Europe // J. Hepatol.-2008.- 48.-P. 148-162.

81. Farci, P., Alter, H.J., Shimoda, A., Govindarajan, S., Cheung, L.C., Melpolder, J.C., Sacher, R.A., Shih, J.W., Purcell, R.H. Hepatitis С virus-associated fulminant hepatic failure // N. Engl. J. Med.-1996.- 335.-P. 631-634.

82. Farci, P., Alter, H.J., Wong, D., Miller, R.H., Shih, J.W., Jett, В., Purcell, R.H. A long-term study of hepatitis С virus replication in non-A, non-B hepatitis // N. Engl. J. Med.-1991.-325(2) .-P. 98-104.

83. Felsenstein, J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap // Evolutional985.- 39.-P. 787-791.

84. Felsenstein, J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version З.баЗ. Distributed by the author. Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle.-2002

85. Ferroni, P., Mascolo, G., Zaninetti, M., Colzani, D., Pregliasco, F., Pirisi, M., Barbone, F., Gasparini, V. Identification of four epitopes in hepatitis С virus core protein // J. Clin. Microbiol.-1993.-31 .-P. 1586-1591

86. Feucht, H.H., Schroter, M., Zollner, B. The influence of age on the prevalence of hepatitis С virus subtypes la and lb //J. Infect. Dis.-1997.- 175.-P. 685-688.

87. Flamm, S.L. Chronic hepatitis С virus infection // JAMA.-2003.- 289.-P. 2413-2417.

88. Forns, X., Purcell, R. H., Bukh, J. Quasispecies in viral persistence and pathogenesis of hepatitis С virus // Trends Microbiol.-1999.- 7.-P. 402-410.

89. Fukushi, S., Katayama, K., Kurihara, C., Ishiyama, N., Hoshino, F. В., Ando, Т., Oya, A. Complete 5' noncoding region is necessary for the efficient internal initiation of hepatitis С virus RNA // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1994.- 199.-P. 425-432.

90. Gardner, J.P., Durso, R.J., Arrigale, R.R., Donovan, G.P., Maddon, P.J., Dragic, Т., Olson, W.C. L-SIGN (CD 209L) is a liver-specific capture receptor for hepatitis С virus // Proc. Natl. Acad. Sci.-2003.- 100.-P. 4498-4503.

91. Garten, R.J., Zhang, J., Lai, S., Liu, W., Chen, J., Yu, X.F. Coinfection with HIV and hepatitis С virus among injection drug users in southern China // Clin. Infect. Dis.-2005.-41.-P. 18-24.

92. Gavalheiro,N.P. Hepatitis C: genotyping// Braz. J. Infect. Dis.-2007.- 1 l.-P. 25-27.

93. Glavac, D., Dean, M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations // Hum. Mutat.-1993.-2.-P. 404-414.

94. Global burden of disease (GBD) for hepatitis С // J. Clin. Pharmacol.-2004.- 44.-P. 20-29.

95. Gomez, J., Martell, M., Quer, J., Cabot, В., Esteban, J.I. Hepatitis С viral quasispecies // J. Viral. Hepat.-1999.-6.-P. 3-16.

96. Goobar-Larsson, L., Wiklund, L., Schwartz, S. Intracellular hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase activity // Arch. Virol.-2001.- 146.-P. 1553-1570.

97. Gordon, S.C., Bayati, N., Silverman, A.L. Clinical outcome of hepatitis С as a function of mode of transmission // Hepatology.-1998.- 28.-P. 562-567.

98. Goutagny, N., Fatmi, A., De Ledinghen, V., Penin, F., Couzigou, P., Ichauspe, G. Evidence of viral replication in circulating dendritic cells during hepatitis С virus infection // J. Infect. Dis.-2003.- 187.-P. 1951-1958.

99. Gross, J.B. Hepatitis C: A sexually transmitted disease? // Am. J. Gastroenterol.-2001.-96.-P. 3051-3053.

100. Gumber, S.C., Chopra, S. Hepatitis C: a multifaceted disease. Review of extrahepatic manifestations//Ann. Intern. Med.-1995.- 123.-P. 615-620.

101. Hagan, H., Thiede, H., Weiss, N.S., Hopkins, S.G., Duchin, J.S., Alexander, E.R. Sharing of drug preparation equipment as a risk factor for hepatitis С // Am. J. Public. Health.-2001.-91.-P. 42-46.

102. Haley, R.W., Fischer, R.P. Commercial tattooing as a potentially important source of hepatitis С infection. Clinical epidemiology of 626 consecutive patients unaware of their hepatitis С serologic status // Medicine (Baltimore).-2001.- 80.-P. 134-151.

103. Hauri, A.M., Armstrong, G.L., Hutin, Y.J. The global burden of disease attributable to contaminated injections given in health care settings // Int. J. STD AIDS.-2004.- 15.-P. 716.

104. Hayashi, K., Yandell, D.W. How sensitive is PCR-SSCP? // Hum. Mutat.-1993.-2.-P. 33846.

105. Heinsen, A., Bendtsen, F., Fomsgaard, A. A phylogenetic analysis elucidating a case of patient-to-patient transmission of hepatitis С virus during surgery // J. Hosp. Infect.-2000.-46.-P. 309-313.

106. Heller, Т., Rehermann, В. Acute hepatitis С: a multifaceted disease // Semin. Liver. Dis.-2005,- 25.-P. 7-17.

107. Hennessy, L.K., Teare, J., Ко, С. PCR condition and DNA denaturants effects on reproducibility of SSCP patterns for BRCA1 mutations // Life Science News.-1999.- 3.-P. 1-3.

108. Hijikata, M., Kato, N., Ootsuyama, Y., Nakagawa, M., Ohkoshi, S., Shimotohno, K. Hypervariable regions in the putative glycoprotein of hepatitis С virus // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1991a.- 175.-P. 220-228.

109. Hijikata, M., Kato, N., Ootsuyama, Y., Nakagawa, M., Shimotohno, K. Gene mapping of the putative structural region of the hepatitis С virus genome by in vitro processing analysis //Proc.Natl. Acad. Sci. U S A.-1991b.- 88.-P. 5547-5551.

110. Hillis, D.M. & Bull., J.J. An empirical test of bootstrapping as a method for assessing confidence in phylogenetic analysis // Systematic. Biology.-1993.- 42.-P. 182-192.

111. Hladik, W., Kataaha, P., Mermin, J., Purdy, M., Otekat, G., Lackritz, E., Alter M.J., Downing, R. Prevalence and screening costs of hepatitis С virus among Ugandan blood donors//Trop. Med. Int. Health.-2006.- 11.-P. 951-954.

112. Hnatyszyn, H.J. Chronic hepatitis С and genotyping: the clinical significance of determining HCV genotypes // Antivir. Ther.-2005.- 10.-P. 1-11.

113. Honda, M., Brown, E. A., Lemon, S. M. Stability of a stem-loop involving the initiator AUG controls the efficiency of internal initiation of translation on hepatitis С virus RNA // RNA.-1996.- 2.-P. 955-968.

114. Hoofnagle, J.H. Course and outcome of hepatitis С // Hepatology.-2002.- 36.-P. 21-29.

115. Horiike, N., Michitaka, K., Masumoto, Т., Okura, I., Akbar, S.F., Onji, M. Relationship between the effect of interferon therapy and the change of hepatitis С virus non-structural 5B gene // J. Gastroenterol, and Hepatol.-1999.- 14.-P. 345-351.

116. Horowitz, В., Lazo, A., Grossberg, H., Page, G., Lippin, A., Swan, G. Virus inactivation by solvent/detergent treatment and the manufacture of SD-plasma // Vox. Sang.-1998.- 74.-P. 203-206.

117. Howell, C., Jeffers, L., Hoofnagle, J.H. Hepatitis С in African Americans: summary of a workshop//Gastroenterology.-2000.- 119.-P. 1385-1396.

118. Hu, K.Q., Tong, M.J. The long-term outcomes of patients with compensated hepatitis С virus-related cirrhosis and history of parenteral exposure in the United States // Hepatology.-1999.-29.-P. 1311-1316.

119. Hwang, S. В., Park, K. J., Kim, Y. S., Sung, Y. C., Lai, M. M. Hepatitis С virus NS5B protein is a membrane-associated phosphoprotein with a predominantly perinuclear localization //Virology.-1997.- 227.-P. 439-446.

120. Ishido, S., Fujita, Т., Hotta, H. Complex formation of NS5B with NS3 and NS4A proteins of hepatitis С virus // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1998.- 244.-P. 35-40.

121. Jamal, M.M., Saadi, Z., Morgan, T.R. Alcohol and hepatitis С // Dig. Dis.-2005.- 23.-P. 285-296.

122. Jang, S.J., Wang, L., Radkowski, M., Rakela, J., Laskus, T. Differences between hepatitis virus 5' untranslated region quasispecies in serum and liver // J. Gen. Virol.-1999.-80.-P. 711-716.

123. Kaito, M., Watanabe, S., Tsukiyama-Kohara, K., Yamaguchi, K., Kobayashi, Y., Konishi, M., Yokoi, M., Suzuki, S., Kohara, M. Hepatitis С virus particle detected by immunoelectron microscopic study // J. Gen. Virol.-1994.- 75.-P. 1755-1760.

124. Kalinina, O., Norder, H., Mukomolov, S., Magnius, L.O. A natural intergenotypic recombinant of hepatitis С virus identified in St. Petersburg // J. Virol.-2002.-76.-P. 40344043.

125. Kamili, S., Krawczynski, K., McCaustland, K.A., Li, X., Alter, M.T. The infectivity of hepatitis С virus after drying and storing at room temperature // Infect. Control. Hosp. Epidemiol.-2007.- 28.-P. 519-524.

126. Kato, N. Genome of human hepatitis С virus (HCV): gene organization, sequence diversity, and variation // Microb. Сотр. Genomics.-2000.- 5.-P. 129-151.

127. Kato, N. Molecular virology of hepatitis С virus // Acta. Med. 0kayama.-2001.- 55.-P. 133159.

128. Kato, N., Hijikata, M., Ootsuyama, Y., Nakagawa, M., Ohkoshi, S., Shimotohno, К. A structural protein encoded by the 5' region of the hepatitis С virus genome efficiently detects viral infection// Jpn. J. Cancer Res.-1990.- 81.-P. 1092-1094.

129. Kato, Т., Furusaka, A., Miyamoto, M., Date, Т., Yasui, K., Hiramoto, J., Nagayama, K., Tanaka, Т., Wakita, T. Sequence analysis of hepatitis С virus isolated from a fulminant hepatitis patient// J. Med. Virol.-2001.- 64.-P. 334-339.

130. Kenny-Walsh, E. Clinical outcomes after hepatitis С infection from contaminated anti-D immune globulin. Irish Hepatology Research Group // N. Engl. J. Med.-1999.- 340.-P. 1228-1233.

131. Khan, R. U., Tong, C. Y., Bloom, S., Gilmore, I. Т., Toh, С. H., Bolton-Maggs, P. H., Beeching, N. J., Hart, C. A. Evaluation of two simplified methods for genotyping hepatitis С virus // J. Med. Virol.-1997.- 52.-C. 35-41.

132. Kita, H., Hiroishi, К., Moriyama, Т., Okamoto, H., Kancko, Т., Ohnishi, S., Yazaki, Y., Imawari, M. A minimal and optimal cytotoxic T cell epitope within hepatitis С virus nucleoprotein // J. Gen. Virol.-1995.- 76.-C. 3189-3193.

133. Kleter, G.E., van Doom, L.J., Stuyver L, Maertens G, Brouwer JT, Schalm SW, Heijtink RA, Quint WG. Rapid genotyping of hepatitis С virus RNA-isolates obtained from patients residing in western Europe // J. Med. ViroL-1995.- 47.-P. 35-42.

134. Koch, J. O. & Bartenschlager, R. Modulation of hepatitis С virus NS5A hyperphosphorylation by nonstructural proteins NS3, NS4A, and NS4B // J. Virol.-1999.-73.-P. 7138-7146.

135. Kolykhalov, A. A., Feinstone, S. M., Rice, С. M. Identification of a highly conserved sequence element at the 3' terminus of hepatitis С virus genome RNA // J. Virol.-1996.-70.-P. 3363-3371.

136. Koonin, E. V. The phylogeny of RNA-dependent RNA polymerases of positive-strand RNA viruses//J. Gen. Virol.-1991-72.-P. 2197-2206.

137. Корка, A. Anesthetist to patient transmission of hepatitis С virus associated with non exposure-prone procedures // J. Med. Virol.-2005.-77.-P. 500

138. Korenaga, M., Hino, K., Katoh, Y., Yamaguchi, Y., Okuda, M., Yoshioka, K., Okita, К. A possible role of hypervariable region 1 quasispecies in escape of hepatitis С virus particles from neutralization // J. Viral. Hepat -2001.- 8.-P. 331-340.

139. Krause, G., Trepka, M.J., Whisenhunt, R.S., Katz, D., Nainan, O., Wiersma, S.T., Hopkins, R.S. Nosocomial transmission of hepatitis С virus associated with the use of multidose saline vials//Infect. Control. Hosp. Epidemiol. -2003.-24.-P. 122-127.

140. Kretz, K., Callen, W., Hedden, V. Cycle sequencing // PCR Methods Appl.-1994.- 3.-P. 107-112.

141. Kumar, D., Malik, A., Asim, M., Chakravarti, A., Das, R.H., Kar, P. (2008). Influence of quasispecies on virological responses and disease severity in patients with chronic hepatitis С // World J. Gastroenterol.-2008.- 14.-P. 701-708.

142. Kumar, S., Tamura, K., Jakobsen, I.B., Nei, M. MEGA2: molecular evolutionary genetics analysis software//Bioinformatics.-2001- 17.-P. 1244-1245.

143. Kunkel, M., Lorinczi, M., Rijnbrand, R., Lemon, S. M., Watowich, S. J. Self-assembly of nucleocapsid-like particles from recombinant hepatitis С virus core protein // J. Virol.-2001.-75.-P. 2119-2129.

144. Kurbanov, F., Tanaka, Y., Sugauchi, F., Kato, H., Ruzibakiev, R., Zalyalieva, M., Yunusova, Z., Mizokami, M. Hepatitis С virus molecular epidemiology in Uzbekistan // J. Med. Virol-2003.-69.-P. 367-375.

145. Lampe, E., Yoshida, C.F., De Oliveira, R.V., Lauer, G.M., Lewis-Ximenez, L.L. Molecular analysis and patterns of ALT and hepatitis С virus seroconversion in haemodialysis patients with acute hepatitis // Nephrology (Carlton).-2008.-13.-P. 186-192.

146. Lareu, R.R., Swanson, N.R., Fox, S.A. Rapid and sensitive genotyping of hepatitis С virus by single-strand conformation polymorphism // J. Virol.Methods.-1997.-64.-P. 11-8.

147. Laskus, Т., Radkowski, M., Wang, L., Jang, S., Vargas, H., Rakela, J. Hepatitis С virus quasispecies in patients infected with HIV-1: correlation with extrahepatic replication // Virology.-1998a.- 248.-P. 164-171.

148. Laskus, Т., Radkowski, M., Wang, L., Vargas, H., Rakela, J. (1998c). The presence of active hepatitis С virus replication in lymphoid tissue in patients coinfected with human immunodeficiency virus type 1 // J. Infect. Dis.-1998c.- 178.-P. 1189-1192.

149. Le Pogam, S., Dubois, F., Christen, R., Raby, C., Cavicchini, A., Goudeau, A. Comparison of DNA enzyme immunoassay and line probe assays (Inno-LiPA HCV I and II) for hepatitis С virus genotyping//J. Clin. Microbiol.-1998.-36.-P. 1461-1463.

150. Le, S. Y., Liu, W. M., Maizel J. V. Phylogenetic evidence for the improved RNA higher-order structure in internal ribosome entry sequences of HCV and pestiviruses // Virus Genes.-1998.- 17.-P. 279-295.

151. Lehmann, M., Meyer, M.F., Monazahian, M., Tillmann, H.L., Manns, M.P., Wedemeyer, H. (2004). High rate of spontaneous clearance of acute hepatitis С virus genotype 3 infection // J. Med. Virol-2004.-73.-P. 387-391.

152. Lemberg, M.K., Martoglio, B. Requirements for signal peptide peptidase-catalysed intramembrane proteolysis // Mol Cell.-2002.-10.-P. 735-744.

153. Lipman, M.M. & Cotler, S.J. Antiviral therapy for hepatitis С // Current Treatment Options in Gastroenterology.-2003.-6.-P. 445-453.

154. Liu, L.J., Zhang, R., Li, J.Q., DU, S.C., Jin, D., Wei, L. The distribution of hepatitis С virus genotype la in Yanbian area // Zhonghua Yi Xue Za Zhi.-2007.-87.-P. 1407-1410.

155. Lu, L., Nakano, Т., He, Y., Fu, Y., Hagedorn, C.H., Robertson, B.H. Hepatitis С virus genotype distribution in China: Predominance of closely related subtype lb isolates and existence of new genotype 6 variants // J. Med. Virol.-2005.-75.-P. 538-549.

156. Lwin, A.A., Shinji, Т., Khin, M., Win, N., Obika, M., Okada, S.,Koide, N. Hepatitis С virus genotype distribution in Myanmar: Predominance of genotype 6 and existence of new genotype 6 subtype // Hepatol Res.-2007.- 37.-P. 337-345.

157. Lyons, A. J., Lytle, J. R., Gomez, J., Robertson, H. D. Hepatitis С virus internal ribosome entry site RNA contains a tertiary structural element in a functional domain of stem-loop II //Nucleic Acids Res.-2001.-29.-P. 2535-2541.

158. Ma, W., Feng, В., Tao, Q. Murine antibody against E2 can capture hepatitis С virus in vitro // Chin Med. J.-2002.-114.-P. 860-863.

159. Maertens, G. & Styuver, Genotypes and genetic variation of hepatitis С virus // In: The molecular medicine of viral hepatitis. Edited by T. J. Harrison & A. J. Zuckerman.: John Wiley and Sons Ltd.-1997.-P. 183-233.

160. Mahaney, K., Tedeschi, V., Maertens, G., Di Bisceglie, A.M., Vergalla, J., Hoofnagle, J.H., et al. Genotypic analysis of hepatitis С virus in American patients // Hepatology.-1994.-20.-P. 1405-1411.

161. Margraf, R.L., Erali, M., Liew, M., Wittwer, C.T. Genotyping hepatitis С virus by heteroduplex mobility analysis using temperature gradient capillary electrophoresis // J. Clin. Microbiol.-2004.-42.-P. 4545-4551.

162. Massari, M., Petrosillo, N., Ippolito, G., Solforosi, L., Bonazzi, L., Clementi, M., Manzin, A. Transmission of hepatitis С virus in a gynecological surgery setting // J. Clin. Microbiol.-2001.-39.-P. 2860-2863.

163. Mawdsley, J., Teo, C.G., Kyi, M., Anderson, M. Anesthetist to patient transmission of hepatitis С virus associated with non exposure-prone procedures // J. Med. Virol.-2005.-75.-P. 399-401.

164. McHutchison, J.G. & Fried, M.W. Current therapy for hepatitis C: pegylated interferon and ribavirin// Clinical Liver Diseas.-2003.-7.-P. 149-161.

165. McOmish, F., Yap, P.L., Dow, B.C., Follett, E.A., Seed, C., Keller, A.J., et al. Geographical distribution of hepatitis С virus genotypes in blood donors: an international collaborative survey// J. Clin. Microbiol.-1994.-32.-P. 884-892.

166. Medhat, A., Shehata, M„ Magder, L.S., Mikhail, N. Abdel-Baki, L., Nafeh, M., Abdel-Hamid, M., Strickland, G.T., Fix, A.D. Hepatitis с in a community in Upper Egypt: risk factors for infection // Am J Trop Med Hyg.-2002.-66.-P. 633-638.

167. Meisel, H., Reip, A., Faltus, В., Lu, M., Porst, H., Wiese, M., Roggendorf, M., Kruger, D.H. Transmission of hepatitis С virus to children and husbands by women infected with contaminated anti-D immunoglobulin//Lancet.-1995.-345.-P. 1209.

168. Mele, A., Stroffolini, Т., Tosti, M.E. Corona, R., Santonastasi, F., Gallo, G., Ragni, P., Balocchini, E., Bernacchia, R., Moiraghi, A. Heterosexual transmission of hepatitis С in Italy // J. Med. Virol.-1999.-57.-P. 111-113.

169. Mellor, J., Walsh, E.A., Prescott, L.E., Jarvis, L.M., Davidson, F., Yap, P.L., Simmonds, P. Survey of type 6 group variants of hepatitis V virus in Southeast Asia by using a core-based genotyping assay //J. Clin. Microbiol.-1996.-34.-P. 417-423.

170. Memon, M.I., Memon, M.A. Hepatitis C: an epidemiological review // J. Viral. Hepat.-2002.-9.-P. 84-100.

171. Michalak, J. P., Wychowski, C., Choukhi. A., Meunier, J. C., Ung, S., Rice, С. M., Dubuisson, J. Characterization of truncated forms of hepatitis С virus glycoproteins // J. Gen. Virol.-1997.- 78.-P. 2299-2306.

172. Miyamura, T. & Matsuura, Y. Structural proteins of hepatitis С virus // Trends Microbiol.-1993.-1.-P. 229-231.

173. Mizushima, H., Hijikata, M., Asabe, S., Hirota, M., Kimura, K., Shimotohno, K. Two hepatitis С virus glycoprotein E2 products with different С termini. // J. Virol.-1994.-68.-P. 6215-6222.

174. Mondelli, M.U., Cerino, A., Cividini, A. Acute hepatitis C: diagnosis and management // J Hepatol.-2005.-42.-Suppl(l).-P. 108-114.

175. Moreau, I., Hegarty, S., Levis, J., Sheehy, P., Crosbie, O., Kenny-Walsh, E., Fanning, L. J. Serendipitous identification of natural Intergenotypic recombinants of hepatitis С in Ireland //Virol J.-2006.-11.-P. 95-98

176. Moriishi, K., Matsuura, Y. Mechanisms of hepatitis С virus infection // Antivir Chem Chemothe.-2003.-14.-P. 285-97.

177. Murakami, K., Abe, M., Kageyama, Т., Kamoshita, N., Nomoto, A. Downregulation of translation driven by hepatitis С virus internal ribosomal entry site by the 3'-untranslated region of RNA // Arch Virol.-2001.-146.-P. 729-741.

178. Myung, P., Mallette, C., Taylor, L., Allen, S., Feller, E. Sexual transmission of hepatitis C: practical recommendations // Med Health R I.-2003.-86.-P. 168-171.

179. Nakao, H., Okamoto, H., Tokita, H., Inoue, Т., Iizuka, H., Pozzato, G., Mishiro, S. Full-length genomic sequence of a hepatitis С virus genotype 2c isolate (BEBE1) and the 2c-specific PCR primers // Arch Virol.-1996.-141.-P. 701-704.

180. Nakao, Т., Enomoto, N., Takada, N., Takada, A., Date, T. Typing of hepatitis С virus genomes by restriction fragment length polymorphism // J. Gen. Virol.-1991.-72.-P. 21052112.

181. Nakazawa, Т., Kato, N., Ohkoshi, S., Shibuya, A., Shimotohno, K. Characterization of the 5' noncoding and structural region of the hepatitis responding differently to interferon treatment // J Hepatol.-1994.-20.-P. 623-629.

182. Nataraj, A.J., Olivos-Glander, I., Kusukawa, N., Highsmith, W.E. Jr. Single-strand conformation polymorphism and heteroduplex analysis for gel-based mutation detection // Electrophoresis.-199.-20.-P. 1177-1185.

183. Neddermann, P., Tomei, L., Steinkuhler, C., Gallinari, P., Tramontano, A., De Francesco, R. The nonstructural proteins of the hepatitis С virus: structure and functions // Biol Chem.-1997.-378.-P. 469-476.

184. Neumayr, G., Propst, A., Schwaighofer, H., Judmaier, G., Vogel, W. Lack of evidence for the heterosexual transmission of hepatitis С // QJM.-1999.-92.-P. 505-508.

185. Noppornpanth, S, Lien, Т. X., Poovorawan, Y, Smits, S. L., Osterhaus, A.D., Haagmans, B.L. Identification of a naturally occurring recombinant genotype 2/6 hepatitis С virus // J. Virol.-2006.-80.-P. 7569-7577.

186. Nousbaum, J.B., Pol, S., Nalpas, В., Landais, P., Berthelot, P., Brechot, C. Group Collaborative Study. Hepatitis С virus type lb (II) infection in France and Italy // Ann Intern Med.-1995.-122.-P. 161-688.

187. Nowicki, M.J., Laskus, Т., Nikolopoulou, G., Radkowski, M., Wilkinson, J., Du, W.B., Rakela, J., Ко vacs, A. Presence of hepatitis С virus (HCV) RNA in the genital tracts of HCV/HIV-1 -coinfected women//J. Infect. Dis.-2005.-192.-P. 1557-1565.

188. Ogata, N., Alter, H. J., Miller, R. H., Purcell, R. H. Nucleotide sequence and mutation rate of the H strain of hepatitis С virus // Proc Natl Acad Sci U S A.-1991.-88.-P. 3392-3396.

189. Okura, I., Horiike, N., Michitaka, K., Onji, M. Effect of mutation in the hepatitis С virus nonstructural 5B region on HCV replication // J. Gastroenterol.-2004.-39,-P. 449-454.

190. Oni, A.D., Harrison, T.J. Genotypes of hepatitis С virus in Nigeria // J. Med. Virol.-1996.-49.-P. 178-86.

191. Petit, J.M., Bour, J.B., Alio, L.S., Castaneda, A., Vaillant, G., Brun, J.M. HCV and diabetes mellitus: influence of nosocomial transmission with the use of a finger stick device // Am J. Gastroenterol.-1999.-94.-P. 1709-1710.

192. Pham, T.N., MacParland, S.A., Mulrooney, P.M., Cooksley, H., Naoumov, N.V., Michalak, T.I. Hepatitis С virus persistence after spontaneous or treatment-induced resolution of hepatitis С //J. Virol.-2004.-78.-P. 5867-5874.

193. Pileri, P., Uematsu, Y., Campagnoli, S., Galli, G., Falugi, F., Petracca, R., Weiner, A.J., Houghton, M., Rosa, D., Grandi, G., Abrignani, S. Binding of hepatitis С virus to CD81 // Science.-1998.-282.-P. 938-941.

194. Poch, O., Sauvaget, I., Delarue, M., Tordo, N. Identification of four conserved motifs among the RNA-dependent polymerase encoding elements // EMBO J.-1989.-8.-P. 38673874.

195. Pohjanpelto, P., Lappalainen, M., Widell, A., Asikainen, K., Paunio, M. Hepatitis С genotypes in Finland determined by RFLP // Clin Diagn Virol.-1996.-7.-P. 7-16.

196. Pohlmann, S., Zhang, J., Baribaud, F., Chen, Z., Leslie, G.J., Lin, G., Granelli-Piperno, A., Doms, R.W., Rice, C.M., McKeating, J.A. Hepatitis С virus glycoproteins interact with DC-SIGN and DC-SIGNR // J. Virol.-2003.-77.-P. 4070-4080.

197. Pol, S., Thiers, V., Nousbaum, J.B., Legendre, C., Berthelot, P., Kreis, H., et al. The changing relative prevalence of hepatitis С virus genotypes: evidence in hemodialyzed patients and kidney recipients // Gastroenterology.-1995.~108.-P. 581-583.

198. Polyak, P. Innate intracellular defense against HCV and its modulation by HCV gene products // EASL Postgraduate Course. Vienna, Austria April 26-27.-2006.-P. 30-33.

199. Polyak, S.J., Khabar, K.S., Rezeiq, M., Gretch, D.R. Elevated levels of interleukin-8 in serum are associated with hepatitis С virus infection and resistance to interferon therapy // J. Virol.-2001a.-75.-P. 6209-6211.

200. Premkumar, A., Wilson, L., Ewart, G.D., Gage, P.W. (2004). Cation-selective ion channels formed by p7 of hepatitis С virus are blocked by hexamethylene amiloride // FEBS Lett.-2004.-557.-P. 99-103

201. Qin, W., Yamashiya, Т., Shirita, Y., Lin, Y., Wei, W., Murakami, S. Mutational analysis of the structure and functions of Hepatitis С Virus RNA-dependent RNA polymerase // Hepatology .-2001.-33.-P. 728-737.

202. Querenghi, F., Yu, Q., Billaud, G., Maertens, G., Trepo, C., Zoulim, F. Evolution of hepatitis С virus genome in chronically infected patients receiving ribavirin monotherapy // J. Viral. Hepat.-2001.-8.-P. 120-131.

203. Radkowski, M., Kubicka, J., Kisiel, E., Cianciara, J., Nowicki, M., Rakela, J., Laskus, T. Detection of active hepatitis С virus and hepatitis G virus/GB virus С replication in bone marrow in human subjects // Blood.-2000.-95.-P. 3986-3989.

204. Ramia, S. & Eid-Fares, J. Distribution of hepatitis С virus genotypes in the Middle East // Int J. Infect. Dis.-2006.-10.-P. 272-277.

205. Reshetnikov, O.V., Khryanin, A.A., Teinina, T.R., Krivenchuk, N.A., Zimina, I.Y. Hepatitis В and С seroprevalence in Novosibirsk, western Siberia // Sex Transm Infect.-2001.-77.-P. 463.

206. Reynolds, J. E., Kaminski, A., Carroll, A. R., Clarke, В. E., Rowlands, D. J., Jackson, R. J. Internal initiation of translation of hepatitis С virus RNA: the ribosome entry site is at the authentic initiation codon // RNA.-1996.-2.-P. 867-878.

207. Reynolds, J. E., Kaminski, A., Kettinen, H. J., Grace, K., Clarke, В. E., Carroll, A. R., Rowlands, D. J., Jackson, R. J. Unique features of internal initiation of hepatitis С virus RNA translation // EMBO J.-1995.-14.-P. 6010-6020.

208. Rice, С. M. Overview of flavivirus molecular biology and future vaccine development via recombinant DNA // Southeast Asian J Trop Med Public Health.-1990.-21.-P. 670-677.

209. Roberts, E.A., Yeung, L. Maternal-infant transmission of hepatitis С virus infection // Hepatology.-2002.-36.-P. 106-113.

210. Rolfs, A., Schuller, I., Finckh, U., Weber-Rolfs. PCR: Clinical Diagnostics and Research.-Berlin: Springer, 1992.- 300 p.

211. Ross, R.S., Viazov, S., Gross, Т., Hofmann, F, Seipp, H.M., Roggendorf, M. Transmission of hepatitis С virus from a patient to an anesthesiology assistant to five patients //N. Engl. J. Med.-2002a.-343.-P. 1851-1854.

212. Ross, R.S., Viazov, S., Renzing-Kohler, K., Roggendorf, M. Changes in the epidemiology of hepatitis С infection in Germany: shift in the predominance of hepatitis С subtypes // J. Med. Virol.-2000b.- 60.-P. 122-5.

213. Ross, R.S., Viazov, S., Roggendorf, M. Phylogenetic analysis indicates transmission of hepatitis С virus from an infected orthopedic surgeon to a patient // J. Med. Virol.-2002a.-66.-P. 461-467.

214. Sakamoto, N., Enomoto, N., Kurosaki, M., Marumo, F., Sato, C. Sequential change of the hypervariable region of the hepatitis С virus genome in acute infection // J. Med. Virol.-1994.-42.-P. 103-108.

215. Sallberg, M., Ruden, U., Wahren, В., Magnius, L. O. Immune response to a single peptide containing an immunodominant region of hepatitis С virus core protein: the isotypes and the recognition site// Immunol. Lett.-1992.-33.-P. 27-33.

216. Sandres-Saune, K., Deny, P., Pasquier, C., Thibaut, V., Duverlie, G., Izopet, J. Determining hepatitis С genotype by analyzing the sequence of the NS5b region // J. Virol.Methods.-2003.-109.-P. 187-193.

217. Saracco, G., Olivero, A., Ciancio, A., Carenzi, S., Rizzetto, M. Therapy of chronic hepatitis C: a critical review // Current Drug Targets in Infectious Disorders.-2003.-3.-P. 25-32.

218. Sarobe P. Can VHC subvert dendritic cell function? EASL Postgraduate Course. Vienna, Austria, April 26-27, 2006.-P. 25-29.

219. Savey, A., Simon, F., Izopet, J., Lepoutre, A., Fabry, J., Desenclos, J.C. A large nosocomial outbreak of hepatitis С virus infections at a hemodialysis center. Infect Control // Hosp Epidemiol.-2005.-26.-P. 752-760.

220. Schmidt, H. A., Strimmer, K., Vingron, M., von Haeseler, A. TREE-PUZZLE: maximum likelihood phylogenetic analysis using quartets and parallel computing // Bioinformatics.-2002.-18.-P. 502-504.

221. Schroter, M., Feucht, H.H., Schafer, P., Zollner, В., Laufs, R. Serological determination of hepatitis С virus subtypes la, lb, 2a, 2b, 3a, and 4a by a recombinant immunoblot assay // J. Clin. Microbiol.-l999.-37.-P. 2576-2580.

222. Schroter, M., Zollner, В., Schafer, P., Reimer, A., Muller, M., Laufs, R., Feucht, H.H. Epidemiological dynamics of hepatitis С vims among 747 German individuals: new subtypes on the advance // J. Clin. Microbiol.-2002.-40.-P. 1866-1868.

223. Schutzbank, Т.Е., Sefers, S.E., Kahmann, N., Li, H., Tang, Y.W. Comparative evaluation of three commercially available methodologies for hepatitis С virus genotyping // J. Clin. Microbiol.-2006.-44.-P. 3797-3798.

224. Seeff, L.B. & Hoofnagle, J.H. Appendix: The National Institutes of Health Consensus

225. Development Conference Management of Hepatitis С 2002 // Clinical Liver Disease.-2003.-7.-P. 261-287.

226. Serfaty, L., Aumaitre, H., Chazouilleres, O., Bonnand, A.M., Rosmorduc, O., Pouponm R.E., Poupon, R. Determinants of outcome of compensated hepatitis С virus-related cirrhosis // Hepatology.-1998.-27.-P. 1435-1440.

227. Shimizu, Y. K., Feinstone, S. M., Kohara, M., Purcell, R. H., Yoshikura, H. Hepatitis С virus: detection of intracellular virus particles by electron microscopy // Hepatology.-1996.-23.-P. 205-209.

228. Shimotohno, K., Tanji, Y., Hirowatari, Y., Komoda, Y., Kato, N., Hijikata, M. Processing of the hepatitis С virus precursor protein // J Hepatol.-1995.-22.-P. 87-92.

229. Singleton, P., Sainsbury, D. Dictionary of microbiology and molecular biology. 3rd Edition. John Wiley & Sons.- Portland, USA, 2002.-908 p.

230. Sivapalasingam, S., Malak, S.F., Sullivan, J.F., Lorch, J., Sepkowitz, K.A. High prevalence of hepatitis С infection among patients receiving hemodialysis at an urban dialysis center // Infect Control Hosp Epidemiol.-2002.-23.-P. 319-324.

231. Smuts, H.E., Kannemeyer, J. Genotyping of hepatitis С virus in South Africa // J. Clin. Microbiol.-1995.-33.-P. 1679-81.

232. Sood, A., Midha, V., Sood, N., Awasthi, G. Prevalence of anti-HCV antibodies among family contacts of hepatitis С virus-infected patients // Indian J. Gastroenterol.-2002.-21.-P. 185-187.

233. Stark, К., Hanel, M., Berg, Т., Schreier, E. Nosocomial transmission of hepatitis С virus from an anesthesiologist to three patients-epidemiologic and molecular evidence // Arch. Virol.~2006.-151.-P. 1025-1030.

234. Stockburger, D.W. Introductory statistics: concepts, models and applications. WWW Version 1.0. Revised 2/19/98. Southwest Missouri State University. (Electronic publication: http:// vvww.psychstat.smsu.edu/introbook/sbkOO.htm)

235. Stuyver, L., Rossau, R., Wyseur, A., Duhamel, M., Vanderborght, В., Van Heuverswyn, H., Maertens, G. Typing of hepatitis С virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay // J. Gen. Virol.-1993.-74.-P. 1093-1102.

236. Su, Y„ Yoon, S.S. Epi info present and future // AMIA Annu Symp Proc.-2003.-P. 1023.

237. Sun, C.A., Chen, H.C., Lu, S.N., Chen, C.J., Lu, C.F., You, S.L., Lin, S.H. Persistent hyperendemicity of hepatitis С virus infection in Taiwan: the important role of iatrogenic risk factors // J. Med. Virol.-65.-P. 30-34.

238. Suzuki, K., Shinzawa, H., Kuboki, M., Ishibashi, M., Yoshii, E., Saito, Т., Takahashi, T. Secondary structure of the hepatitis С virus 5' untranslated region and efficacy of interferon therapy for chronic hepatitis С // Liver.-1998.-18.-P. 331-336.

239. Tackett, A. J., Wei, L., Cameron, С. E., Raney, K. D. Unwinding of nucleic acids by HCV NS3 helicase is sensitive to the structure of the duplex // Nucleic Acids Res.-2001.-29.-P. 565-572.

240. Takaniizawa, A., Mori, C., Manabe, S., Murakami, S., Fujita, J., Onishi, E., Andoh, Т., Yoshida, I., Okayama, H. The structure and organization of the Hepatitis С virus genome isolated from human carriers // J. Virol.-1991.-65.-P. 1105-1113.

241. Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., Kumar, S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 // Molecular Biology and Evolution.-2007.-24.-P. 1596-1599.

242. Tanaka, Т., Kato, N., Cho, M. J., Shimotohno, K. A novel sequence found at the 3' terminus of hepatitis С virus genome // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1995.-215.-P. 744-749.

243. Тапака, Т., Kato, N., Cho, M. J., Sugiyama, К., Shimotohno, К. Structure of the 3' terminus of the hepatitis С virus genome // J. Virol.-1996.-70.-P. 3307-3312.

244. Terrault, N.A. Sexual activity as a risk factor for hepatitis С // Hepatology.-2002.-36.-P. 99105.

245. Thaikruea, L., Thongsawat, S., Maneekam, N., Netski, D., Thomas, D. L., Nelson, К. E. Risk factors for hepatitis С virus infection among blood donors in northern Thailand // Transfusion.-2004.-44.-P. 1433-1440.

246. Thiel, H.J., Collett, M.S., Gould, E.A., Heinz, F.X., Houghton, M., Meyers, G., et al. Flaviviridae. In: Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U,Ball LA, eds // Virus Taxonomy, VIHth Report of the ICTV.-2005.-P. 979-996.

247. Thimme, R., Oldach, D., Chang, K.M., Steiger, C., Ray, S.C., Chisari, F.V. Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis С virus infection // J Exp Med.-194.-P. 1395-1406.

248. Thomas, D.L., Vlahov, D., Solomon, L., Cohn, S., Taylor, E., Garfein, R., Nelson, K.E. Correlates of hepatitis С virus infections among injection drug users // Medicine.-1995a.-74.-P. 212-220.

249. Thomas, F., Nicot, F., Sandres-Saune, K., Dubois, M., Abravanel, F., Alric, L., Peron, J. M., Pasquier, C., Izopet, J. Genetic diversity of HCV genotype 2 strains in South Western France // J. Med. Virol.-2006.-79.-P. 26-34.

250. Tong, M.J., el-Farra, N.S., Reikes, A.R., Co, R.L. Clinical outcomes after transfusion-associated hepatitis С //N. Engl. J. Med.-1995.-332.-P. 1463-1466.

251. Toyoda, H., Fukuda, Y., Hayakawa, Т., Kumada, Т., Nakano, S., Takamatsu, J., Saito, PI.

252. Tsukiyama-Kohara, K., Iizuka, N., Kohara, M., Nomoto, A. Internal ribosome entry site within hepatitis С virus RNA // J. Virol.-1992.-66.-P. 1476-1483.

253. Vatteroni, M., Maggi, F., Morrica, A., Fornai, C., Giorgi, M., Pistello, M., Bendinelli, M. Comparative evaluation of five rapid methods for identifying subtype lb and 2c hepatitis С virus isolates //J. Virol.Methods.-1997,- 66.-P. 187-194.

254. Verma, V., Chakravarti, A., Kar, P. Genotypic characterization of hepatitis С virus and its significance in patients with chronic liver disease from Northern India // Diagn Microbiol Infect Dis.-2008.-61.-P. 408-414.

255. Viazov, S., Kuzin, S., Paladi, N., Tchemovetsky, M., Isaeva, E., Mazhul L„ et al. Hepatitis С virus genotypes in different regions of the former Soviet Union (Russia, Belarus, Moldova, and Uzbekistan) // J. Med. Virol.-1997.-53.-P. 36-40.

256. Viazov, S., Zibert, A., Ramakrishnan, K., Widell, A., Cavicchini, A., Schreier, E., Roggendorf, M. Typing of hepatitis С virus isolates by DNA enzyme immunoassay // J. Virol.Methods.-1994.-48.-P. 81-91.

257. Villano, S.A., Vlahov, D., Nelson, K.E., Cohn, S., Thomas, D.L. Persistence of viremia and the importance of long-term follow-up after acute hepatitis С infection // Hepatology.-1999.-29.-,P. 908-914.

258. Vos, S.5 Berrisford, D. J., Avis, J. M. Effect of magnesium ions on the tertiary structure of the hepatitis С virus IRES and its affinity for the cyclic peptide antibiotic viomycin // Biochemistry.-2002.-41.-P. 5383-5396.

259. Wang, C., Le, S. Y., Ali, N., Siddiqui, A. An RNA pseudoknot is an essential structural element of the internal ribosome entry site located within the hepatitis С virus 5' noncoding region//RNA.-1995.-l.-P. 526-537.

260. Wang, J.T., Sheu, J.C., Lin, J.T., Wang, Т.Н., Chen, D.S. Detection of replicative form of hepatitis С virus RNA in peripheral blood mononuclear cells // J. Infect. Dis.-1992.-166.-P. 1167-1169.

261. Week, K. Molecular methods of hepatitis С genotyping // Expert Rev Mol Diagn.-2005.-5.-P. 507-520.

262. White, P.A., Zhai, X., Carter, I., Zhao, Y., Rawlinson, W.D. Simplified hepatitis С virus genotyping by heteroduplex mobility analysis // J. Clin. Microbiol.-2000.-38.-P. 477-482

263. WHO (World Health Organization). Global surveillance and control of hepatitis C. Report of WHO consultation organized in collaboration with the viral hepatitis prevention board, Antwerp, Belgium // J. Viral.Hepat.-1999.-6.-P. 35-47.

264. Wiese, M., Berr, F., Lafrenz, M., Porstm, H., Oesen, U. Low frequency of cirrhosis in a hepatitis С (genotype lb) single-source outbreak in germany: a 20-year multicenter study // Hepatology.-2000.-32.-P. 91-96.

265. Williams, I.T., Perz, J.F., Bell, B.P. Viral hepatitis transmission in ambulatory health care settings // Clin Infect Dis.-2004.-38.-P. 1592-1598.

266. Xu, L.Z., Larzul, D., Delaporte, E., Brechot, C., Kremsdorf, D. Hepatitis С virus genotype 4 is highly prevalent in Central Africa (Gabon) // J. Gen. Virol.-1994.-75.-P. 2393-2398.

267. Yagnik, А. Т., Lahm, A., Meola, A., Roccasecca, R. M., Ercole, В. В., Nicosia, A., Tramontano, A. A model for the hepatitis С virus envelope glycoprotein E2 // Proteins.-2000.-40.-P. 355-366.

268. Yamada, N. Tanihara, K., Mizokami, M., Ohba, K., Takada, A., Tsutsumi, M., et al. Full-length sequence of the genome of hepatitis С virus type 3a: comparative study with different genotypes // J. Gen. Virol.-1994.-75.-P. 3279-3284.

269. Yan, F.M., Chen, A.S., Hao, F., Zhao, X.P., Gu, C.H., Zhao, L.B., Yang. D.L., Hao. L.J. Hepatitis С virus may infect extrahepatic tissues in patients with hepatitis С // World J. Gastroenterol.-2000.-6.-P. 805-811.

270. Yen, Т., Keeffe, E.B., Ahmed, A. The epidemiology of hepatitis С virus infection // J Clin Gastroenterol.-2003.-36.-P. 47-53.

271. Yen-Lieberman, В., Roberto, A., Schindler, S., Starkey, C. Clinical validation of the INVADER HCV genotyping assay // J Mol Diagn.-2004.- 6.-425.

272. Zein, N.N. Clinical significance of hepatitis С virus genotypes // Clin Microbiol Rev.-2000.-13.-P. 223-235.

273. Zeng, L., Falgout, В., Markoff, L. Identification of specific nucleotide sequences within the conserved З'-SL in the dengue type 2 virus genome required for replication // J. Virol.-1998.-72.-P. 7510-7522.

274. Zeuzem, S. The kinetics of hepatitis С virus infection // Clin Liver Dis.-2001.-5.-P. 917930.

275. Zoulim, F., Chevallicr, M., Maynard, M., Trepo, C. Clinical consequences of hepatitis С virus infection // Reviews in Medical Virology.-2003.-13.-P. 57-68.

Информация о работе

Плясунова, Ирина Викторовна
кандидата медицинских наук
Кольцово, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Изучение генетического разнообразия изолятов вируса гепатита С и факторов риска инфицирования у пациентов с острыми и хроническими гапатитами в Новосибирске - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы