Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение физико-химических изменений белков хрусталика на ранних стадиях развития радиационной и наследственной катаракт

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение физико-химических изменений белков хрусталика на ранних стадиях развития радиационной и наследственной катаракт"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН НАУЧНЫЙ ЦЕНТР] РЕГИОНАЛЬНЫХ ПРОБЛЕМ ПИТАНИЯ НАН РК

) 1 , 'А ^ !,Равах рукописи

АЙТМАГАМВЕТОВ МАРАТ 7ЕШРГАЛИШМ

ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО- ХИМИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЯ БЕЛКОВ ХРУЯ ЛЛИКА ЙД РАННИХ СТАДИЯХ РАЗВИТИЯ РАДИАЦИОННОЙ И НАСЛЕДСТВЕННОЙ МАРАЮ

03. 00.04. - биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Алматы 1994

(^спч". Выполнена на кафедре . биофизики Российского Государственного Медицинского Университета Министерство здравоохранения РФ.

^аучние руководители:

академик РАМН, 11, ^феесор Ю. А. Владимиров, канд. биол. наук А. И. Дееь.

фщиалыше оппоненты;

Заслуженный работник народного образования, доктор .медицинских наук,профессор С. М. ¡Хлешкова. • доктор медицинских наук Ю. С. Краморенко

Ведущее научное учреждение - Алматинский Государственный институт усовершенствования врачей Ю Республики Казахстан

Завета диссертации состоится "... "............" 1994 г.

на заседании специал,...11рованного Совета Д 001 35.01. В Научной Центре региональных проблем питания НАН Республики Казахстан по адресу: 480008, Алматы, ,ул. Кдочкоьа 66.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного Центра региональных проблем питанияПАН Республики Казахстан.

Автореферат разослан "... ".........." 1094 г.

Ученый секретарь Специализированного со«»^ доктор медицинских на> профессор

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Одной . из актуальнейших проблем офтальмологии является профилактика,ранняя диагностика н консервативное лечение катаракт.. Актуальность этой проблемы подчеркивается тем, что ежегодно только в двух странах США и СНГ, делается около 300-400 тыс. операций экстракций хрусталика,вызванных развитием катаракты.

Кик иявеотно, ранняя диагностика и терапия во многом предопределяет успех лечения большинства заболеваний консервативным путем. Однако в настоящее время в офтальмологической практике развитие катаракты регистрируется только начиная на стадии гту-ально фиксируемых помутнений, когда процесс приобретает у те необратимый характер.

Поиск объективных диагностических критериев катаракты и н.оучение ранних стадий её патогенеза у человека осложнены. ,с одной стороны отсутствием клинического материала т..е. хрусталиков с самыми ранними проявлениями катаракты, с другой сторон» отсутствием адекватных моделей у животных.

В свяеи с этим в данной работе изучалась модель катаракты, вызнанной общим облучением мшей (П(,С57В1*СВА) в сублетальной дозе (4-Г> Гр).Актуальность изучения подобной модели катарактогенеза обусловлена с одной стороны тем обстоятельством, что развитие катаракты является одним из наиболее частых отдаленных последствий действия ионизирующего излучения, причем частота развития катаракты линейно зависит от дозы облучения №Доренко В. С. , 1Р91). С другой стороны общее облучение организма, вызывающее его ускоренное старение приводит к

- г -

развитию катаракты, схожей со старческой, доля которой у ■человека составляет 05% всех случаев катаракт.

. ЦЕЛЬ и ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основной целью данной работы был поиск ранних физико-химических изменений на стадиях развития катаракты,предшествующих помутненшэ хрусталика. Задачей работы являлось научение последовательности физико-химических изменений в хрусталике на ранних стадиях радиационной и наследственной катаракт.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЕ Исследована последовательность фиэико-химических изменений в хрусталиках, связанных с его антиокислительным потенциал ам (уровень восстановленного глутатиона ) и коиформационними изменениями белков. Показано, что изменения в структуре белков наступают после снижения уровня восстановленного глутатиона в хрусталике.

Показано, что как в случае наследственной катаракты (линия 1С«/НаЪ), так и катаракты, индуцированной общим облучением, а тшсисе после действия лазерного облучении происходит значительное увеличение констант тушения белковой флуоресценции анионами нитрата, что объясняется снижением плотности отрицательных еарядов ьа поверхности белков.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Разработаны тести, регистрирующие начало катарактогенеаа у животных. Это позволяет сократить время для исследования .эффективности действия как факторов, выэивакдах развитие катаракты, так и антикатарактальных препаратов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены На республиканском семинаре по радиобиологии, организованном .лабораторией изучения действия жестких космических излучений на -организм (ИМЕЛ, г.Дубна) в 1037 г., на международном совещании

по программа "Интеркосмоо" в г. Варшава, на Всесоюзное сът.де генетиков в г. Алма-Ате, на 14 международном съезда патофизиологов в г. Москве в 1991 г. и на международном симпозиуме "й?мб|-ани хрусталика и старение" в г. Гент? (Бельгия, 1991).

ПУК/ШВДИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ, Основные положения диссертации опубликованы в 12 печатных работах.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИСШТАПЙЛ Диссертация изложена 'на 14] страница);, содержит 2 таблиц!,!, 27 рисунков и состоит к а введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов. список литературы включает 42 ссылки на работы отечественных авторов, и 106 етч"К на работи зарубежных актеров.

11. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Изучение ранних физико-химических изменений белков хрусталиков мышей с радиационной катарактой.

Радиационную катаракту моделировали однократным

гамма-облучением на источнике Со60 в дозе <1,00 - 5,00 Гр Ь Институте «"дико-биологических проблем (г. Дубна). Стегонь развития катаракты контролировали с помощью . офтальмоскопа. Согласно принятой классификации выделяли следующее стадии развития катаракты: 1) начачьная - наличие отдельных точечных помутнений; 2) незрелая - количество точечных помутнений увеличено; 3) зрелая - слияние отдельных точечных помутнений в островки; 4) перезрелая - помутнение всей околоядер.чой зоны.

На первом этапе работы в качестве биохимических• -маркеров развития катаракты использовали содержание белкогьи тиолов (Т2Н) н уровень восстановленного глутатисна (63Н). Из представленных данных видно (табл.1), что концентрация ТЗН , измеренная нами

Таблица 1. Физико-химические изменения в хрусталиках мыш>~й шд различных стадиях радиационной катаракты (доза общего облучения - 5 Гр ).

Стадии развития 0 1+ 3+ 4*-

катаракты

Бремя после 0 2-3 5-8 13-14 16-18

облучения, мес

Параметры хруста- Я Се.Х

ликов (Ю

Содержание общих 100 1,00 95 92 87 ¡Л 10

•гиолов, (ТЗН), мкмоль/г

тк. хруст.

Содержание воссга- в,5 1,00 3,6 1,6 1,7 1.6 15

новленного глута-

тиона (ВЗИ) ,мкмо'ль/г

тк. хрусталика

К (отношение пиков 0,03 1,00 3.7 3,7 3,1' 2,7 10

нетриптофановой флуо-

ресценции к трипто-

фановой )

|!лнстанта тушения 8,0 1,00 1,4 6,1 3,0 - 20

1Кт),Ы Сежов кортекса (прод. табл. см. след. стр. >

Доля тринтофаяилов, 0,21 1,00 1,81 1,06 0,97 - 10 достушшх для тушителя if) в белках кортекса '

Условная доля трип- 0,14 1,00 1,28 1,71 2,00 - 5 тофанллов, доступных для воды ( сС )

R-отмошение средних величин параметра у облученных животных к значению соответствующего параметра у неоОлученннх животных того же возраста; Cs-показатель точности оценок.

по методу Седлайка, снижалась градуально с 100+12 мМ в хрусталиках необлучешшх животных, которые служили контролем до 87+0 мМ на 3-еЛ стадии развития катаракты. Как в'идкм, стикенн» Т5Й произошло примерно на 13Х, в то гремя как катаракта клинически была представлена обширными эспами помутнения. Измерение содержания GSH в целом хрусталике, наоборот, показало резкое снижение его концентрации уте на первой стадии, т. е. до появления клинических признаков начавшегося кЗтаршггогенеза. Так,если у необлученных животных уровень GSH составлял 8,5+1,12 мМ, то угв на первой стадии катаракты этот параметр снижался в втрое и составлял 2,7+0,7 иМ.

Как известно, одним из проявлений старческой катаракты является появление характерней Флуоресценции хрусталика с максимумом испускания в области 420 ям. Увеличение интенсивности нетрштоф-шовой флуоресценции было зарегистрировано с помощью

- € -

катода сннхрошшго сканирования. Суть метода заключается i; peí .¡етрацин флуоресценции при сишгронном движении монохроматораь возбуждения и испускания с Фиксированной разницей длин волн. За ^¡ксировашшй шаг нами била принята величина 20 нм. В качестве .параметра было взято соотношение интенсивности пика нетриги основой флуоресценции к триптофановой - К. Было показано,что К практически не зависит от положения , целого хрусталика в ккшете, а именно вариация отношений пиков второго к перьои/ составляла не более при произвольном изменении 8%. Сравнение двух способов регистрации флуоресценции в спектрах синхронного сканирования ji спектров испускания флуоресценции при розничных положениях хрусталика в кювете показало высокую корреляцию ыээду отношениями пиков (R-0,9). Поэтому, ь дакшейаем, чтобы уменьшить инструментальную ошибку -и воздействие -света на хрусталик,а также иметь более нпгмдние, компактные спектри флуоресценции использовались спсктри синхронного сканирования флуоресценции.

Анализ липидиых экстрактов, полученных из хрусталиков мяиь-й на первой стадии развития катарактя, индуцированной однократным У-о5лучеиием в доаа 4,00 Гр и из хрусталиков необученных >.и-вотшос i» илкааал „у^ллвснвш • различий ьзжду спектрам^ м&пдокыши фсоресцшиш ( Fue. I). Таким- образом, шкодя из

подрмшшх данных ыо.ню сделать предварительный вывод о той, ч«»ц

\

веэдрстьа, олрзделямцие ^луоресцируилие с об пасти 4-0 нм не входят в состав акстрактов лнп.эдов аелых зфусташгов.

■ Проведении* исследования интенсивности ^луороЯо/юв в корче-кои и--н.цре хрусталиков нормам них н облученных хипитиых показали, что ь то время как cwki pu нетриитоф-шоый фнуаресцедшш коршюов суцгстионно на стличашсъ друг от друга.

Я!?»1» ям

Рис 1. Спектр!-! флуоресценции целых хрусталиков (А) ( сннх> ровное сканирование) и их липндных экстрактов (С) ( Лвозб. «301.1 им), приготовленных из одпнжо1:ьи навесок ткани.

—.— хрусталики

---- хрусталики

дуцнрованно.1, ,

кош рольных мшеей П(СВЛ«С57В1/б)

пике Л на первой стадии развития катаракт м, нн-

-облучением ( доза облуч-счшя - Гр ).

} А /

* /

« 1

1 /

1 í

) ч1 1 ' \ »

Рис.2. Спектры иепускашп {луоро^оров ядра (А) и корчекса

(Б) хрусталиков мигаей П(СБА С07Б1/0) в нор.уз (•--) и гл 1-й

стадии развития катаракты,индуцированной ^-облучзшнм (4,0 Гр)

(----). Возбуждение йлубресцочции при 2У5 (1) и 3(55 им (2).

спектры ветриптыЗановой флуереириции в ядре • еЛ№Т|,7.*»"!И

существенное повышение отношения К (Рис.2).

Особый интерес представляет изучение динамики изменения параметра К на четырех стадиях развития катаракты, индуцированной общим облучением. Как видно из представленных данных (см. таблицу 1) уже на стадии начальной . катаракты, характеризуемой отдельными точечными помутнениями, происходит 4-х кратное увеличение интенсивности флуоресценции спектров синхронного сканирования между нулевой и первой стадиями ( с 0,03 до 0,11 ).

20 • 40 60 ЦО

Срок после облучения,сутки -

Рис. 3. Кинетика изменения концентрации СЕН (о—а) и ^«уоресценцш! пигментов (о—о) (К-гшраметр) лэсл« о'ц;;го £-облучения (5,0 Гр) на хрусталиках миней П (Ш «иьУМ/б}.

Изучение динамики изменения концентрации П."П шкоьеиъ, н ь'< борот,, трехкратное уменьшение его концентрации уже на »й-м^шт стадии Котарс-.лты. Возникает вопрос: к,-.а;ой **> и.» зуих дь> ю «Димитров изменяется раны«: концентрации ci.ll им от1к1кк.ш$'нйт.-и-

сигнпстей пиков флуоресценции в спектрах синхронного сканирования (II). Сравнение юшетик двух параметров доказало, что в та время, примерно на 40-й день после облучения, когда концентрация 63Н еще практически не отличается от таковой у нормальных мышей ( 7,5 мМ и 8,0 мМ соответственно), отношение ин-тенсившстей двух пиков повышается фактически в два раза с 0,02 до 0,035 (Рко.3). Иа всего вышеизложенного мокно заключить, что-появление характерной флуоресценции более ранний признак развития катаракты, чем падение концентрации (3511. ■

Изучение дозовой зависимости иаменеия этих пзрамечров в ; хрусталиках мышей тага® показало, что флуоресцентные маркеры изменяются при меньших дозах облучения, чем уровень бЗН.

2. Изучение конформационннх изменений белков хрусталиков• на ранних стадиях развития радиационной катаракт

. Известно,что квантовый выход флуоресце/эдш триптофана при замене Нг0 на Р?0 увеличивается примерно в два раза (Владимиров Ю. М.Зимина Г. М..19В5). В первом приближении изменение белковой флуоресценция при вамене Иг0 на определяется достулчост! »з<> тртпс^днилов для води. А именно, согласно наиболее простой модели все флуорофори моято разбить не две группы: реагирующие на Р г0 тают» кок и свободный гриптофаи, т.е. полностью доступные дня воды (доля этих ф.чторс}оров-сС) и полное«.» недоступные для Рг0, т. е. не реагируют» на замену Нг0 иа 1^0. Тогда возрастание флуоресценции (У) при замене Н20 ка РдО могет быть списано следующим уравнением:

у»Г (11гр)/Г (Н40) - г6*1.1 'И,откуда ^-у-1/1,1 ' , где

х-объемная доля D^OjF и F HgO-интенсивности флуоресценции в тяжелой воде и простой воде; ¿-условная доля тряптофашцов, изменяющих флуоресценцию под действием [НО.

Исходя из этой модели была найдена доля доступных для DgO триптофан и.юв на различных стадиях раавитий. катаракты, индуцированной обдам облучением, организма. Из приведенных данных вид!Ю(см. табл. Я, что доступность при развитии зрелой катаракты увеличивается почти в два раза,что, по всей видимости, свидетельствует о градуальном разворачивании молекул белка. Это, в свою очередь может способствовать дальнейшему окислению сульфгидрйлът« групп в белках.

Д.<ш выяснения локализации ■ триптофанилов И вогмо>лого изменения их микроокружения применялся метод избирательного тушения фчуоресценции анионами нитрата, обладающего высоко;'-' Э'1'Ь" ктш'ноотью туикния. .Ло модифицированному уравнению üífípwa-'Toifi-ppa (уравнение Лерера) определялись два параметра: конлачта туис-чия (Кт) и доступность'Ччлуорофора для тушителя ф.

к:'вест)г.>, (Кг) определяется, в основном, локальным зарядом М1»кроокруя?ния (Муорофора, a f - местоположением á.iyopoíopa в бел^е. Ш приведенных данных видно ( Рис. 4 ), что доступность для нитрата существенно не.изменяется по мере развития катаракты, составляя в среднем около 20Z; ' .

Напротив, константа тушения нитратом резко возрастает по mf-ре развития катарагп,1,индуцированной обчдач облучением (Рис.4)» Особенно значительное поитенле Кт отмечается на второй стадии рлзвитня катаракты-( в 5 рч?). -Существенное повышение конотанты тушения отрэл'.рт.по всей видимости« ..снижение- плотности отрицательных зарядов на поверхности бедка. Вовмгчню, именно это Играет опр^д°ляюий71 роль в формировании, высокомолекулярных

агрегатов белков,выявляемых из катарактальных хрусталиков. Результаты иэмёрения зависимости ¡!г и от дозы облучения такяе' показали отсутствие существенных изменений доступности. Кт,наоборот,не изменяясь при субкатарактогенных дозах (до 4,00 I)

ц-I

О и.

\9.D0

. О Ь.

•7.00

5.00

-4°

л; 1

■л V

, ' -41' , -в/ д"

3

— -ю-

•I-

ПТГТТТТ'Т

0.00 2.00 4-.00 6.30 и.эо 10.ю

т/кыо,,

Ряс. 4. Типичные кривые тупгеиия белковых фдуорофоров КМЭдЗ гомогенатах хрусталиков мышей Г1(СРЛ С57С1/С) на различных ста-ди.чх развития катаракты (I-III) ,иидуцироданной {-облучением 4,0 1'р. о-нэобяучешшэ тавотные. Гриппе представлены в двойных обратных координатах, ГО и Г - фл^1«сц?ииия в отсутствие и присутствие тухчхеля соответственно. Концентрат« бежа 0,1 !т/мл. Флуоресценции возбуждали лри 252 нм,регистрировали при 334 им.

/

Гр;. су^'ственпт увелитзлзсь (в среднем в три раза ) при д-ж

облучения 4,00 Гр и 5,00 Гр.

Изучение зависимости константы тушения флуоресценции белков кортикальной зоны хрусталика от рЯ показало, что рК заряженных групп белка равно 7,8 (Рис.5), что соответствует значению рК для $осфосерина. С точки врения известных данных о фосфорилированин белков хрусталика ( 5гес!у Х, Брео1ог А. ,1984), полученные данные позволяют предполагать, что снижение плотности отртшельньк зарядов на поверхности белков кортекеа при

Рис.5. Изменение констангн тушения флуоресценции белков кортекеа' мышей Г1(СВА* С57В1/6) от рН среды. Кт-консэанта тушения,

^аавитии катаракты может быть обусловлено снижением степени их фосфорилирования. В пользу этого' предположения также говорит исключительно высокая чувствительность к действию ионизирующих излучений ц-АИФ-зависимого фосфоршшрования (Соболева А. С. ,1982).

3. Изучение физико-химических параметров мышей линии ЮЯ/НаЬ. >

Для медико-биологических исследований большой интерес представляют модели патологических . состояний,имеющие характеристики, аналогичные заболеваниям человека. Установлено, что инбредные линии лабораторных мышей отличаются друг от друта частотой появления катаракт, что обусловлено наследственными факторами (Абдрашитова Э. X", 1988). Мз имеющихся у нас в стране линий мышей значительный интерес представляют линия ЮК/НаЬ. 11ри изучении ее морфофизиологических особенностей было отмечено наличие у всех животных данной линии катаракты, которая визуально определяется, как правило, не сразу после открытия глазной щели, й в возрасте 1-2 месяцев. Поэтому линия ШР/НаЬ является удобной моделью для исследования ранних иаиг-нсний в хрусталике'до его помутнения:

Исследование содержания восстановленного глутатиона и сРч;их тиолов в хрусталике молодых мышей в возрасте 8 недель показало, что линия КЖ/НаЬ характеризуется несколько меньшим содержанием ГСП в' хрусталике, чем линия.СВА и Р1(СВА»С57Б1/0) (в 2 и 3-4 раза соответственно). Однако они близки по этому параметру к СРА^, у которых катаракта встречается ке чаще, ч-»м У линии СВА ' Та?л. 2).

; ' - 14 'Таблица 2. Содержание GSH, TSH и параметры тувенич флуоресценции гомпгенатов кортикальной воны хрустали мыше!» различных линий.

Линия Возраст,нед. GSH.MM TSH.MM КтЛГ1 ' /

CCA/J . e , 2,2 68,0 • 1,4 0,54

l'BA/J 12 2,5 59,0 ' i.6 ■ 0,52

F1(CBA*C5?EJ/G) 8 8.8 98,0 6,0 0,25

СВА 8 6,3 100,8 0,8 0,25

'iOR/lLib 4 1,9 ' 40,3' 10,4 0,30

JCfJ/llab G 2,1 68,0' 19,4 0,22

¡IR/Ilab 8 .1,3. ' 64,7 32.3 0,23

Кг - г.онста.Ч'а тушения, М*Ч J- доступность флуорофоров для ТУНЧПЕЛЛ. '

Исследование тушенил растворимых белков кортекса нш-ршом показало, '«о греми констанга тушения линии ÎCR/Hob'существенно

рте, чем константа тушения других линий и резко возрастает с'

; ■

4 по . 8-ую недели, когда развивается помутнение xf ул&кика. Imw сСгаэом, также гак и при развитии помутнетю, r.»T.-i9jjv.pMœoro 'оСчт облучением организма! в данном случае '"■»••гдстся резко" увеличение констант тушения белковой <] -Т-сценции aiuioHc!"-.! нитрата, чго свидетельствует о снижения нллт'-сти огргар»!о.ил«и зарядов на кортикальных белках.

4. Шюяешв параметров тушения ' флуоресценции белкой хрусталика « стекловидного тела после действия лазерного

Г.З ''уамнч.

!1''чрс!п-f ;'яис;:<га ; оро1ко">;пульсного неодимового ■ ЧЮ-лп -

вера в офтальмологии показало, что лазерная хирургия связана с риском послеоперационных осложнений (повышение внутриглазного давления, йитреиты,■ макулярниа отеки, увеиаы, отслойки сетчатки), В связи с этим предстаьляло интерес исследовать возможное изменение физико-химических свойств белков хрусталика и стекловидного те^а после действия УАЗ-лазера.

Таблица 3. , Параметры тушения. безкоьой флуог».*ирршш анионами нитрата в гомогенатах хрусталиков и стекловиппгго кроликов в контроле и после облучения УАв-.ок^рт/.

Тканевая Паранеа, Группа гйиг!н«"1г.

1очусировки' структура контроль облуче- ,:э 0тч01с1-

тлучения ние ла- •:>ю к ко"

зером

гупле ,

•русталик / 0,2310,0' 0, п '

'русталж Кт.М ' 8,4+1,0 18,.¡4,0 г,! 1

1-я группа)

стекловидно'- 5 0,5810,0'.. 0, 43»0, С" ■ 0,7! .

гело " кт,н 1С, но,? "0,012,? {, "2

хрусталик I. о,гз±о,п< о,гр+о,о! 1, '"Г

■''теклоь'лдное Ит,>Г! 8,612, С ?, '

гело

2-я группа) •текловидно<"- 1 0,64+0,0!. 452.0, г1

гело ■ Кг,!,Г' 14,9+0,9 '! . !

. - 16 -

.лоследования проводили на двух группах кроликов: в 1-й группе фокальную плоскость пятна наведения совмещали с плоскостью оптического срева ядра хрусталика. Во 2-й группе фокусировку лазера осуществляли на средних отделах стекловидного тела. В обеих группах использовали одинаковые энергетические режимы: энергия импульса - 7,1-8.3 мДж, количество импульсов -60-100, суммарная энергия - 700 мДж. Через две недели животных вабивали и из энуклеированных глаз сразу же выделяли'хрусталик и ртекловидкое тело. Результаты измерения параметров тушения ¿елксвой флуоресценции анионами нитрата в гомогенатах хрусталиков и стекловидного тела представлены, в табл. 3.

Как видно из приведенных данных наиболее значительно изменяются константы тушения как хрусталика, так и стекловидного тела. Увеличение констант по отношению к контролю может быть обусловлено снижением плотности . отрицательных зарядов на

I

поверзности белков. Более сильно изменямгся белки'тех тканевых структур, на которых происходит фокусировка, однако и в удаленных от фокальной' плоскости вонах такяэ наблюдаются изменения белков. Снилжние плотности зарядов на белке в свою очередь может привести к уменьшению гидратации (синерезису) белкового матрикса, что может быть причиной коллапса стекловидного тела, ведущего к его отслойке от ааднэй гиалоидной мембрана и тракции сетчатки.

5. Морфологический анализ изолированных хрусталиков на начальном этапе развития ; катаракты,индуцированной обидам . облучением.

Существующая 'в настоящий момент классификация С'Ьу1аок,

1985) основывается на клинической оценке развития заболевание и разработана в результате визуальных наблюдений. В настоящий момент уже сделаны попытки (Бабижаев м.а. ,Деев а. И., Деревян;:-) В.И., 1.383) разработать количественный критерий развития процесса помутнения хрусталика на основе .использования анализаторов изображения. В нашем случае ми проводили исследование изолированных хрусталиков мышей, облученных ^-облучением в доаа-4,00 Гр. Измерение проводили' на оптическом телевизионное анализаторе изображений "Классимат" ( фирма "Лей гц",ОТ). Принцип измерения сводится к следующему. Этот прибор раабивае/ всю площадь исследуемого обгекта на 10 зон с одинаково.; оптической плотностью изменяющихся от темного до светлого 1Ы<ла

0. о и

1 0 1 2.1 -1.1 в. 1 и. 1 1 у. 1

Гие. б. Усредненное распределение шющадкй жвидешли- (31) перадней(А)' и задней(Б) полонии хрусталика штй ШСР.*«СЬ7Ш6) в нирцо (1) и через-2 месяца после обвито однократного у-ибл^ четьи ?). Ш осц'ординит отлолени услокнш значения оптических см---тностей соответствующих зквиденонт, по оси абсцисс оч носить ¡ни« Л >4« ¡Ь'плЧаДС-Й ССЮМл'ТПТНУМЩ ЭКВИДеИСИТ ££-1Ш.Ы|;(Д|, ВОВ» ОМ.ИПсН

1 I I I 1 I 1 1 I I

i 2.1 4.1 6.1 а. 1 10

сит. !

1) измеряет плсщрдь каждой вопи в условных единицах. Результаты исследования представлены на Рис. б. Видно, что, при измерении передай половины хрусталика, как и в случае измерения задней половины хрусталика у нормальных необлученлых 1 животных распределение площадей по плотностям примерно одинаково и (чшен&тся около 10 X. В случля хрусталиков облученных жвоиясс измерение распределения оптических плотностей показачо значительную разницу ( в 2 и более раз ) по сравнению с пермальинми хрусталика»'". Изменения отмечались »сак в передней половине хрустите, так и в задней. Необходимо отметить, что хруста кики облучешш животных взятие для ' исследования были грогратшкз!.

Таким образом, модно заключить, что исследование оптических ноодн'.-годиостеО хрусталика иояролает обнаружить раннио изменения

при отс^тстниц вигуапыю наблюдаемых признаков помутнения.

; *

ВЫВОДЫ: 1

1. Чувствительным м.да;ером- начала катарактогенеза,пндуциро-«шюго облучением животных, является увеличение в ядерной зоне хрусталика я-л риатофииовой фзуерзеценции с'максимумом испускания около 430 «1; штшсизность этой флуоресценции в изолированны:« «Р7ст?личах удобно оценивать по соотношению пиков триптофана'и "'''Трг.:;;о1 хпових флуорофоров в спектрах синхронного сканирования.

2. Увеличение интенсивности нетриптофаповой флуоресценции у ийъчешшх кнвотш« прдшествует снижению концентрации. ^-сстацивлешм'о Iлутатиопа в хрусталике.

3. 1Ь мере .1'гснологического старения мышей лшшии СНА

(более 15 месяцев) происходит значительное' снижение ■кшяьяп&.яа ■восстановленного глутатиона в хрусталике ( s 5 раз ) к увеличение интенсивности лет* тгаофг-игзвей флуоресценции флуоресцирующих пигментов ( в 2 раза )

4. По мере -, развития катаракты, индуцированной обида облучением, доступность триптофо.-л.аов белков хрусталика для воды, оцененная по увеличению их флуоресценции при замена IîjO на ■ D2P градуально возрастала, начиная со етадич точе'аня помутнений (в 1,1 раза) до'стадии ¡годного помуч.чения хрусталика (в " ¡'.аза).

5. Показано, что как в случае наследственной катаракты (линия IOR/НаЬ), так и катаракты, нэдуцирсва^.ой общий облучением, а такав после дейетьая. на уруст&етж кролика • лазерного облучения происходит значительное увеличение констант ; тушения флуоресценции белков кортикальной вони шшонши ви-ггзд*, что объясняется снижением плотности отрицательных зарядов на поверхности белков.

6. С помойыо морфологического анализа ваза л;-ihj раагачпз а распределении «квиденсит оптической плотности на хрудаиюкел иь.аьтных и облученных (4,0 Гр ) иышей на стадии oiey г::-№ы видимых проявлений помутнения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУВЛМЮЙАЮИХ ПО Ш® деСЕГТАЩШ.

1. Нндушшя хрусталиком ne ре кис него окисления ллйадоь/ 'IV» s. &г:с. биоя. и мед, -1987. -Т. 53. -Я 1.стр. 33-40. Оо.а-.тсри: Г^СпУзеь' М. А. , Доев А. И. , Владимиров й А.

' 2. Изучение -доступности трюдафишлоь аш "Протеидов е сывороточных лилопротеидах человека для D ,,0 и ¡шт'м'га, //ОД4»|ГКа - 1V88. - Т. 33. -!1 Z. стр. 380-381. Соавтор*: Я'-с В P. ii

! - ЕО -

3. Неопухолевые формы отдаленной лучевой патологии обусловленной ускоренными заряженными частицзми и стандартным кзлучеш:<" и. //Тезисы на XXI Совещание и Симпозиум Постоянно Яействуюгей рабочей группы соцстран по космической биологии и величине по программе "Интеркосмос". Варшава.-1988. стр.,228. Соав-пры: Федоренко ЕС. .Кабаченко Л. IL .Воронцова С. В. и др.

4. Изучение флуоресценции хрусталиков мышей на различных стадиях радиационной катаракты методом синхронного счишировачия. //Вам. экс. биол. и мед.-1989. -Т. 55.-М В. стр. 347- 349. Соавторы: Леев А. И. , Кабаченко A. IL .Владимиров Ю. А.

5.Фотоповреадение глаза при воздействии излучения V'Va-лазера с модулированной добротностью-, физико-химические с Iруктурные изменения хрусталика и стекловидного тела. //Вестник сЦтальмодогии. -1990.-Т. 106. -N 1. стр. 31-35. Соавторы: Степанов Л. Б., БаОижаев М. А., Иванов А. Е , Деев А. И. 1

6. Исследование процессов, ■ предшествующих помутнению хрусталика у линии мышей с наследственной катарактой.// Тезисы д исладоп • 2-го Всесоюзного съезда медицинских г «Нетиков.-г. Алма-Ата,4-6 декабря 1990 г.-Москва.-1990 г.-С. 214. Соавторы: Костенко Е. Р., Леев А. Я !

7. Reduction protein negative charge of murine lens cortex . fit the early stages of racll at Ion-Induced and hereditary • cataract. //Constituent congress International Society for (rathcphyslolcgy, Moscow.-1991. - p. 227-228. Coauthors: Deyev A. I. ,

TJ) tarohuk I. A.

8. Уменьшение отрицательного заряда белков кортекса *руст.и>аков мышей линии IOR/llab.//Бюлл. экс. биол. и мед.-1991.-Т. об.-с. 551-553. Соавторы: Деев А. И.,Костенко Е. F.,Владимиров Ю. А.

9. Увеличение доступности бзлковнх флуорофоров хрусталиков

миши дли воды при развитии радиационной катаракты. //Балл. око. биол. и мед. -19S1. -Т. 56. -с. S&7-Ö69. Соавторы: Доев А. И. ,Владимирор ¡0. А.

10. Изменение флуоресценции - хрусталиков мышей после облучения ионизирующей радиацией. //В кн. " Флуоресцентные методы исследования и клинической диагностики".1992. вып. 4. стр.12-13. Tes. IV Всесоюзного совещания: "Люминесцентний анализ в медицине и биологии и • его аппаратурное

обеспечение".-Соавторы: Деев А. И. , Владимиров ¡O.A.

И. Оценка наряда кортикальных белков хрусталиков шша() методом избирательного тушения флуоресценции на ранних стадиях развития радиационной и наследственной катаракт. //$ кн."Флуоресцентные методы исследования и клинической диагностики". 1992. вып. 4. стр. 13. Tea. IY ' Всесошного совещания: "Люминесцентный анализ в медицине и биологии н его аппаратурное обеспечение". Соавторы: Ситарчук И л, ,Деев А. И. .Владимиров Ю. А. ■ 1

12.Sequence оГ physical and chemical changes in murine lerK with cataract developnwnt initiated Ьу total gamma-irradiation. (Eurage Symposium on "Eye lens Kfentoranes and Ageinu".Ghent,Belgium.-1991. Oct. 6th to Oct. 8th. P. 247-253. ) Co-authors: A. I. Deyev, Y. A. Vladimirov, A. N. Kabatchenko, }. A. Sita ' chuk.

I - ES -

M А 3 tí Y H I ' Айтма*амбетов Марат Тем) рвали улы.

РадИациояк^ жяне ту^нм к,уалайГнн кат&ракталарда ерте к»э-i'ieeTlH коз бураюта белоктарырыныц фиглмаяы",, химикалии «н-(•ерн:тер-Я зерттеу.

Катара1^татанн;( дам/ барысында кез б^рявгн белоктирчндч Со-лагын фиэикаяыч.хкмикалщ дзЯекп esrepícrepíi аны^тау уш>и К Гр ■'дозамей радинцияланган тык,т;андар мен т^г.ым цуанайтш качарактчеы (IOR/КаЬ) бар тыш^андар пайдаланылдн-

' Квз'буршармнда epie кездесетж earepiCTepre онин ортаончда г-(.йдроеыида) .»грыцталван (флусресделенген) еншдердП) иайдн бо-. лун, тлутатионкын, 2,5 есеге дейт агат жагадн. Кейшрек к>ыр: " тыотык (ьет жавындарь') Селоктардац тер)с заряды жжалл баетайды Аа^ыры коз буршагында ■ квлд1рл!Г) б^зьдаак (лайламан) вонплар найда боладн.

•v'' IJmuc Htmutecl катаракта дамуыныц ерте кэз)нде б)р!нен соц Oipl отет)Н к^былыетарди} гайда болатынын керсетт): Кез б^ршары -f ядроочнДа бес ■ ■ радйкалдыц процестердщ активтелу1, дарнитая?*» оюмдерд)^ адналуы,1 'оттеПНК! активт1 туртц пайда болуы - кез • С^ршагышЦ тоты»у процессе .^арсыцаОлетшц тем*ндеун ц-А>№-«» .■ тяуелгЛ (¡»сферланудш) тогыгулыч бузылун - кыртмс белоюарнныц Tep'lc езрядыныН' аэакы'- нейтральды белоктарды^ мембранамен бай-• Ланысуы «вне мембрана Куалдынтарыныц пайда болуы - мембранасы за-\1«дакГ8Н клетк^лардын цыртыста жиналуы.

- 23 -S U M M A R Y Altmagamhetov Marat Temirgalievich

" The Stud ire of the early physico-nhemica}. chant's Jn the ci-ystallifis of hereditated end Irradiated cataracts"..

The cataract induced by total irradiation (13 Gy) and • Uli

hereditated cataract of mice UOR/Hab) were, used for'tlw'

identification of some physical and chemical paramettifs' fliar./

undergo changes with cataract development anc( ; '.hsij'*,

consideration of the order In which these changes occur.'!; 7h*V

' i earliest change in the lenses of irradiated mice and iiiic.6*y\Ui\'

hereditated cataract was the acpearance of fJuortsoenc? -,

products in the lens nucleus followed by a 2,5-fold decrease

of glutathione content. Later on the cort ical proteiijs ' last'

their negative charge and final]'/ visible clouded jaafiot(S.v-

appeared in the lens, " .

According to the results of these study the foHciWjng; sequence of events at early stages of these cataract.-, say 1 x>-': postulated - activation of free radical processes-in the lotu ' - accumulation of fluorescent products in the lens nucleus -generation of active oxygen speed es - decrease of hm antioxidant potential - oxidative damage to o-AMP dej-«si»i«n:t phosphorylation - decrease of negative charge of proteins in cortex - association of neutral proteins with iiwittoranes and appeai'aj"ice of menbrane ruptures - aoouniulatlon of cells '¡fit' rneiiibrane defects In cortex.