Изучение чувствительности опухолевых клеток человека к действию цитотоксических лимфоцитов, индуцированных дендритными клетками

Родина, Алла Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение чувствительности опухолевых клеток человека к действию цитотоксических лимфоцитов, индуцированных дендритными клетками
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение чувствительности опухолевых клеток человека к действию цитотоксических лимфоцитов, индуцированных дендритными клетками"

На правах рукописи

Родина Алла Валерьевна

ИЗУЧЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА К ДЕЙСТВИЮ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЛИМФОЦИТОВ, ИНДУЦИРОВАННЫХ ДЕНДРИТНЫМИ КЛЕТКАМИ.

03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2005г.

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте медицинской экологи Департамента здравоохранения г. Москвы.

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Москалева Елизавета Юрьевна.

доктор биологических наук Абакумова Ольга Юрьевна,

доктор биологических наук Глоба Александр Георгиевич.

Ведущая организация: Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится:" "_2005 года Б_часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.010.01 при ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, 10.

Афтореферат разослан "_"_2005 г.

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Недостаточная эффективность химиотерапии злокачественных опухолей, обусловленнная низкой селективностью противоопухолевых препаратов по отношению к раковым клеткам и развивающейся в короткие сроки устойчивостью клеток опухоли к лекарственному воздействию, является основным препятствием для успешного лечения онкологических заболеваний. Использование в современной химиотерапии комбинации лекарственных средств, принадлежащих к разным классам и действующих на разные клеточные мишени, выдвигает на первый план проблему преодоления множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолевых клеток. МЛУ может определяться включением различных биохимических механизмов, характеризующих разные этапы осуществления токсического действия химиопрепарата на клетку - от ограничения накопления лекарства внутри клетки до ингибирования программы гибели опухолевой клетки [Bosmann H.B., 1971, Ставровская А.А., 2000]. К ним относятся повышение экспрессии генов трансмембранных транспортных белков, выводящих противоопухолевые препараты из клетки (например, Р-гликопротеина, Pgp); активация ферментов системы глутатиона, инактивирующих цитотоксические препараты; изменения генов и белков, контролирующих процессы апоптоза опухолевой клетки (р53, семейство Bcl-2, IAP и др.).

Вещества различной химической структуры: блокаторы кальциевых каналов (верапамил), ингибиторы кальмодулина, стероиды, антибиотики, иммуносупрессоры, транквилизаторы способны в той или иной степени обращать МЛУ [Fienkel G.D. and Caffiey P.B., 2001, Ojima I. et al, 1998]. Однако клинические испытания таких модуляторов МЛУ не привели к желаемым результатам из-за их высокой токсичности [Germann U.A. and Harding M.W., 1995, Mickley LA et al, 1989]. В настоящее время на основе исследований биохимии рецептор-опосредованного эндоцитоза разрабатываются новые способы противоопухолевой терапии, которые позволяют избирательно убивать клетки опухоли и должны обращать МЛУ, обусловленную функционированием Pgp. Одной из перспективных разработок в этой области является система направленного транспорта, в которой в качестве вектора используется онкофетальный белок альфа-фетопротеин (АФП), рецептор которого является опухолеспецифическим белком и представлен только на раковых клетках [Moro R et al, 1993, Severin S.E. et al, 1994].

В предупреждении и элиминации развившихся опухолей большие надежды связывают с развитием методов иммунотерапии [Coulie P.G. et al, 1997, Lindauer M. et al, 1998, Romero P., et al, 2002]. Показано, что при LAK-терапии клетки, устойчивые к противоопухолевым препаратам в результате гиперэкспрессии MDR1, могут быть чувствительны к активированным NK-клеткам [Geromin D. et al, 2004, Scheper R.J., et al, 1991, Shtil A.A. et al, 1999]. Однако

способность опухолеспцифических Т-лимфоцитов элиминировать опухолевые клетки с фенотипом МЛУ не изучена.

Одним из перспективных направлений в индукции специфического клеточного противоопухолевого иммунитета является разработка методологии, основанной на использовании дендритных клеток (ДК) - эффективных антигенпредставляющих клеток (АПК), обладающих уникальной способностью представлять антигены наивным Т-клеткам и вызывать их дифференцировку в антигенспецифические цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) [Qark G J. et al, 2000, Stockwin L.H. et al, 2000, Romani N., et al, 1989]. В связи с этим, целью данного исследования явилось изучение чувствительности исходных и резистентных опухолевых клеток человека к действию опухолеспецифических ЦТЛ, индуцированных с помощью ДК в экспериментах in vitro.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

- характеристика модельных линий опухолевых клеток человека по содержанию белковых продуктов генов MDR1, Bcl-2, и Вах;

- анализ чувствительности исследуемых линий опухолевых клеток человека к доксорубицину (ДР) и возможности её изменения с помощью модулятора активности MDR1 верапамила и системы направленного транспорта ДР в виде его коньюгата с АФП;

- оптимизация метода приготовления зрелых ДК из фракции моноцитов периферической крови человека;

- изучение эффективности индукции опухолеспецифических ЦТЛ с помощью иммуногенных ДК, приготовленных с использованием HLA-рестриктированных пептидов опухолеспецифических антигенов, лизатов и РНК опухолевых клеток;

- изучение активности опухолеспецифических ЦТЛ, индуцированных иммуногенными ДК, в отношении чувствительных и резистентных линий опухолевых клеток человека в экспериментах in vitro

Научная новизна работы.

Впервые показано, что количество белка Вс1-2 в клетках высокорезистентных линий SKVLB и MCF-7AdrR , экспрессирующих ген MDR1, ниже, чем в исходных чувствительных клетках SKOV3 и MCF-7.

Впервые показано, что мутация, обнаруженная в гене Вах в клетках линии SKOV3 и SKVLB, приводит к инактивации проапоптотической активности белка Вах.

опухолевых клеток, экспрессирующих ген МЛУ MDR1 и ген MDR1 в сочетании с инактивированным в результате мутации геном Вах.

Практическая значимость исследования.

Оптимизирован метод приготовления зрелых иммуногенных ДК благодаря использованию препарата "Лейкинферон" в качестве источника цитокинов для индукции созревания ДК.

Выявлен нетоксичный диапазон концентраций лизатов опухолевых клеток для приготовления иммуногенных ДК.

Обнаруженная чувствительность высокорезистентных опухолевых клеток к действию ЦТЛ, индуцированных с помощью ДК, нагруженных опухолеспецифическими антигенами, позволяет рекомендовать использование данного метода иммунотерапии при высокорезистентных опухолях.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на XXV Съезде Международного общества по изучению онкофетальной биологии и медицины (1997 г., Монтрё), на Международном симпозиуме "Биология клетки в культуре" (2001 г., Санкт-Петербург), на XIV Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра." (2002 г, Санкт-Петербург), на I Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака» (2002 г., Москва), на VII Международном симпозиуме по дендритным клеткам (2002 г., Бамберг), на Ш Международном симпозиуме по генетическим противоопухолевым препаратам (2002 г., Амстердам), на VII и VIII Всероссийском форуме с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (2003 г., 2004 г., Санкт-Петербург).

Апробация работы состоялась на научном семинаре МНИИМЭ 25 октября 2004 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, выводы, список цитированной литературы, включающий 203 источника. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 14 таблицами.

Содержание работы.

Материалы и методы исследования.

Культивирование клеток. Клетки эритролейкоза человека линии К562, Т-В-клеточной гибридомы линии Т2, аденокарциномы яичника человека линии SKOV3 (исходная линия), SKVLB (резистентная) культивировали в пластиковых флаконах ("Costar") в среде RPMI1640 с добавлением 10% сыворотки плодов крупного рогатого скота, 50 мкг/мл гентамицина при

температуре 37°С в СО2 инкубаторе при содержании СО2 5% и влажности 95%. Клетки аденокарциномы молочной железы исходной - MCF-7" и резистентной - MCF-7Air линии, клетки меланомы человека линии SK-MEL-1 - в среде DMEM при тех же условиях. Линия SKVLB получена в результате селекции по устойчивости к винбластину, линия MCF-7AdrR получена в результате селекции с использованием ДР. Резистентность клеток поддерживали путем ежемесячной селекции с ДР (0.5 мкг/мл).

Исследование экспрессии MDR1 и РеАФП с помощью иммуноцитохимического метода

проводили с моноклональными антителами (МоАТ) к белку MDR1 в разведении 1:20 (Santa Cruz Biotechnology, клон G-1) и МоАТ к РеАФП в концентрации 500 нМ (клон 2В8) с использованием системы усиления DAKO LSAB®2 System (Peroxidase, DAB) в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Исследование экспрессии MDR1 с помощью метода проточной цитофлуориметрии. К 100

мкл суспензии клеток SKOV3, SKVLB, MCF-7, MCF-T*' (5х106 кл/мл) в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) добавляли 20 мкл МоАТ к MDR1, меченных фикоэритрином (Beckman-Coulter, клон UIC2), перемешивали и инкубировали в течение 20 мин. при комнатной температуре. Затем клетки промывали ФСБ, содержащим 0,2% BSA и 0.02% NaN3, фиксировали 2% параформальдегидом и анализировали интенсивность красной флуоресценции (FL2) на проточном цитофлуориметре EPICS XL.

Иммуноблотинг для анализа экспрессии белков Вах, Вс1-2 и MDR1. Белки лизатов клеток исследуемых линий (100 мкг) разделяли с помощью электрофореза в 12,5% SDS-ПААГе и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (2 мА/см2 1 час). Мембрану инкубировали в блокирующем буфгре (3% обезжиренного сухого молока в 10 мМ Трис-HCl рН 7.5) 2 часа при комнатной температуре и затем, 12 часов при 4°С в этом же буфере с поликлональными антителами к Вах, Вс1-2 и MDR1 (PharMingen). После промывания мембрану инкубировали с меченными пероксидазой антителами козы к антителам кролика при комнатной температуре 2 ч. Результат визуализировали с помощью хемилюминесцентной системы детекции при использовании рентгеновской пленки Kodak BioMax.

Определение цитотоксической активности различных препаратов in vitro проводили, определяя выживаемость клеток после их инкубации с исследуемыми препаратами в течение 72 ч с помощью МТТ-теста [Mosmann Т., 1983].

Трансфекцию клеточных линий человека проводили плазмидами (pLPC-puro - контрольная, pLPC-gfp - содержащая ген зеленого флуоресцирующего белка, pLPC- bax - ген bax), содержащими ген устойчивости к антибиотику пуромицину под контролем MoMLV LTR, с использованием набора Maxifectin-21™ в соответствии с прилагаемой инструкцией. Оптимальные условия трансфекции для каждой клеточной линии подбирали с использованием

плазмиды pLPC-gfp. Количество флуоресцирующих клеток определяли на проточном цитофлуориметре Coulter Epics. Через 24 - 48 часов после трансфекции живые клетки высевали в планшеты и анализировали чувствительность клеток к ДР по их выживаемости через 72 ч инкубации с ДР с помощью МТТ-теста или их подвергали селекции, культивируя в течение двух недель с пуромицином в концентрации 1 мкг/мл.

Приготовление дендритных клеток. Для получения ДК моноциты выделяли из периферической крови добровольцев и культивировали до дня "1", а затем заменяли среду на полную культуральную среду, содержащую рГМ-КСФ (800 ед/мл) и рИЛ-4 (1000 ед/мл). Цитокины добавляли повторно в день "3". В день "5" клетки собирали и переносили в 6-луночные планшеты при плотности 5хЮ5 клеток/лунку в 3-х мл свежей ПКС с цитокинами, В день 6 добавляли среду, кондиционированную моноцитами (СКМ), или "Лейкинферон" (ЛФ) в сочетании с фактором некроза опухоли альфа в концентрации 50 нг/мл для индукции

созревания ДК и на день 8 ДК собирали.

Анализ фенотипа ДК проводили с использованием моноклональных антител к антигену CD 14 и ФИТЦ-меченных F(ab)2 фрагментов козьих МоАТ к IgG мыши ("Сорбент", Россия), а также ФИТЦ-меченных моноклональных антител к антигенам CD83, CD80, CD86, HLA-DR ("PharMingen", США). Для проведения иммунофлуоресцентного окрашивания ДК, их отмывали ФСБ и инкубировали с моноклональными антителами в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей. Анализ фенотипа ДК проводили при помощи проточного цитофлуориметра EPICS-C ("Coulter Electronics", USA).

Индукция ЦТЛ с помощью ДК, нагруженных синтетическими пептидами, клеточными лизатами или суммарной опухолевой РНК, в культуре in vitro. Лизат опухолевых клеток линий SK-MEL-1, SKOV3 и MCF-7 готовили с помощью трехкратной процедуры замораживания-оттаивания суспензии опухолевых клеток в ФСБ. После определения концентрации белка лизат тарировали и хранили при -70 °С. Суммарную клеточную РНК выделяли из клеточных линий SKOV3 и MCF-7 по методу Chomczynski P. and Sacchi N.,1987. ДК-стимуляторы готовили следующим образом. ДК отмывали ФСБ, суспендировали в бессывороточной среде AIM-V и инкубировали с соответствующими пептидами в концентрации 50 мкг/мл в течение 4 ч, или с лизатами клеток в концентрации 100 мкг/мл или с РНК в концентрации 50 мкг/мл в течение 18 часов. Затем клетки отмывали, суспендировали в той же среде и добавляли к лимфоцитам в соотношении 1:20. На следующий день после инициации и два раза в неделю в последующем к культурам добавляли 30 ед/мл человеческого рИЛ-2 (Sigma). Раз в неделю культуры рестимулировали препаратами размороженных ДК, обработанных антигенами как описано выше. После 2-4 рестимуляций лимфоциты использовали для анализа цитотоксической активности.

Определение цитотоксической активности лимфоцитов человека. Опухолевые клетки, предварительно помеченные 3Н-тимидином (инкубация в течение ночи с 3Н-тимидином в концентрации 1 мкКи/мл, удельная радиоактивность 80 Ки/ммоль) высевали в 96-луночный планшет по 5x103 клеток в лунку и добавляли суспензию лимфоцитов в количестве 5 - 100x103 клеток на лунку, чтобы соотношение клетки-мишени : клетки-эффекторы составляло от 1:1 до 1:20. Через 24 ч инкубации лимфоциты отмывали, опухолевые клетки собирали на фильтры и измеряли их радиоактивность на сцинтилляционном счетчике RackBeta ("LKB"). ЦТА лимфоцитов расчитывали по формуле: ЦТА = [РАщишень " РАмишень+эффекгор]: РАМишеньХЮ0%, где РА(мншень+эффекгор) И РА(мишеа,) — радиоактивность проб, где инкубировались опухолевые клетки-мишени с клетками-эффекторами и только клетки-мишени, соответственно. Клетки линий SKOV3, SKVLB плохо включали 3Н-тимидин, поэтому ЦТА в отношении этих клеток определяли по выживаемости клеток после отмывания лифоцитов с помощью красителя кристаллического фиолетового [Zvaifler, NJ., 2000].

ELISPOT. На платы MultiScreen-MAHA S45 (Millipore, USA) сорбировали МоАТ к НФу (для сорбции и проявления использовали пару МоАТ к Ифу для ELISPOT, BD Biosciences Pharmingen, USA) и инкубировали 18 ч при 4°С. Затем платы отмывали ФСБ и инкубировали с блокирующей средой IMDM с 10% инактивированной сывороткой человека IV(AB) 1ч при комнатной температуре. После удаления блокирующей среды, вносили суспензию лимфоцитов, индуцирванных ДК, нагруженными лизатом или суммарной РНК клеток MCF-7 в количестве 50-100хЮ3 клеток на лунку в среде IMDM с 2% сыворотки и добавляли к ним по 5-10 хЮ3 ДК, нагруженных соответствующими антигенами в той же среде. После 24 ч инкубации, клетки удаляли, платы отмывали дистилированной водой, затем ФСБ, содержащем 0,05% Tween-20. После отмывки вносили в платы биотинилированные AT к Ифу в ФСБ с 0,05% Tween-20 и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Затем отмывали как описано ранее и инкубировали 1 ч с комплексом авидин-щелочная фосфатаза (ABComplex/AP, DAKO, BD Denmark). После отмывания 0,05М Tris/HCl для развития окраски добавляли субстрат BCIP/NBT (Sigma). Реакцию останавливали промыванием дистиллированной водой, платы сканировали и подсчитывали окрашенные пятна.

Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов проводили по методу Стьюдента с использованием компьютерной программы "Origin".

Результаты и обсуждение.

1. Характеристика исследуемых линий опухолевых клеток-мишеней.

Характеристика чувствительных и резистентных линий клеток-мишеней по уровню экспрессии MDR1.

Для исследования особенностей действия опухолеспецифических ЦТЛ на резистентные клетки, в качестве клеток-мишеней были выбраны чувствительные и резистентные линии клеток аденокарциномы молочной железы МСР-7 и МСР-7МгК и яичника человека 8КОУ3 и 8КУЬБ, соответственно. Для характеристики уровня экспрессии МБК1 в исследуемых линиях клеток использовали методы проточной цитофлуориметрии, иммуноцитохимического окрашивания с использованием системы стрептавидин-биотин и иммуноблотинга.

Рис.1. Гистограммы экспрессии МЛЯ1 клетками аденокарциномы молочной железы человека линий MCF-7, MCF7AdrR (А) и аденокарциномы яичника человека линий SKOV3, ЭКУЪБ (Б). Левый пик гистограммы - флуоресценция чувствительных клеток, правый - флуоресценция резистентных клеток. Аутофлуоресценция чувствительных и резистентных клеток совпадает с флуоресценцией чувствительных клеток и на рис. не показана. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции, усл. ед., по оси ординат -количество клеток, отн.ед.

Таблица 1.

Уровень экспрессии МОЯ1 в чувствительных и резистентных клетках аденокарциномы молочной железы линий MCF-7 и MCF-7AdгR и яичника человека линий ЭКОУЗ и ЭКУЬБ (проточная цитофлуориметрия). Данные одного из трех типичных экспериментов.

Линия клеток Окрашенные клетки,% МИ*, усл. ед.

Окрашивание изотипическими антителами Окрашивание антителами к МЖ1 Окрашивание изотипическими антителами Окрашивание антителами к МГЖ1

вКОУЗ 0.7 5.0 23 2.9

8КУЬВ 0.5 98.7 3.2 109.7

МСР-7 1.0 1.1 0.5 0.4

мср_7ЛЧгй 0.4 94.9 0.3 23.1

МИ* - средняя интенсивность флуоресценции,

При иммуноцитохимическом окрашивании клеток антителами к МЭШ, в случае чувствительных линий 8КОУ3 и МСБ-7 окрашивания не наблюдалось, а клетки резистентных линий и 8КУЬБ и МСР-7АЛгЕ интенсивно окрашивались, причем наиболее интенсивное окрашивание отмечено в области клеточной мембраны При анализе экспрессии МБК1 с помощью иммуноблотинга также обнаружили большое количество этого белка в резистентных линиях клеток и отсутствие в чувствительных линиях Цитофлуориметрический анализ с одной стороны подтвердил полученные с помощью иммуноблотинга и иммуноцитохимического окрашивания результаты, а с другой позволил количественно охарактеризовать содержание белка МБК1 на клеточной мембране чувствительных и резистентных клеток

Данные, полученные с помощью проточной цитофлуориметрии, представленные на Рис 1 и в Табл 1, показывают, что резистентные линии клеток экспрессируют высокий уровень МБК1 , в отличие от исходных чувствительных линий, в которых экспрессия МБК1 очень незначительна и обнаруживаетсая лишь у 0 1% клеток линии МСБ-7 и 4 3% клеток линии 8КОУ3 Сравнивая средние значения интенсивности флуоресценции клеток линии 8КУЬБ (МБ1 составляет 106 7 усл ед) и МСБ-7АЛгЕ (22 8 усл ед) можно заключить, что клетки аденокарциномы яичника линии 8КУЬБ содержат более высокий уровень белка МЭШ, чем МСБ-7АЛгЕ (табл.1)

Гиперэкспрессия МБК1 предопределяет устойчивость клеточных линий к цитотоксическим препаратам, поэтому далее была изучена устойчивость исследованных линий к ДР.

Исследование чувствительности клеток аденокарциномы молочной железы человека линий MCF-7 и MCF-7AdrR и аденокарциномы яичнника линий SKOV3 и SKVLB к доксорубицину.

Для сравнения чувствительности клеток к ДР по кривым выживаемости (рис 2) определяли концентрации вещества, вызывавшие гибель 50% клеток через 72 ч инкубации с препаратом (1С50) Значение 1&о для ДР в отношении клеток линии 8КОУ3 составило 0 3 мкг/мл , для 8КУЬБ - 7 5 мкг/мл Для клеток линии МСБ-7 значение 1Со для ДР было равно О 08 мкг/мл, для МСБ-7АЛгЕ - 7 2 мкг/мл Следует подчеркнуть, что по 1Со, устойчивость клеток 8КУЬБ и МСБ-7АЛгЕ к ДР значительно выше, чем 8КОУ3 и МСБ-7, соответственно Для исследования возможности изменения устойчивости исследуемых линий клеток 8КУЬБ и МСБ-7АЛгЕ с высоким уровнем экспрессии МВЯ1, исследовали влияние ингибитора белка МЭШ верапамила и системы направленного транспорта ДР в виде конъюгата с АФП на чувствительность клеток к ДР.

0| ......... ■ i nuiy ........ ................. ....... ........ .......

0.01 0.1 1 10 100 o-1 1 'O 100

Концентрация доксорубицима, utrlun Кмщифмит дксорубмдти. -кг/мл

Рис.2. Чувствительность клеток аденокарциномы молочной железы (MCF-7 и MCF-7 ) и аденокарциномы яичника (SKOV3 и SKVLB) в зависимости от концентрации ДР.

Исследование возможности преодоления МЛУ с помощью верапамила и направленного транспорта с использованием конъюгата АФП-ДР.

При обращении резистентности с помощью верапамила (20 мкМ) величина IC50 для ДР составила 1 мкг/мл в случае клеток линии SKVLB (Табл.2). Чувствительность линии MCF-7AdrR к ДР в присутствии верапамила также возросла: значение ICso составило 1.6 мкг/мл.

Таблица 2.

Эффективность обращения МЛУ клеток резистентных линий с помощью верапамила и конъюгата АФП-ДР.

Ливия клеток IC50, мкг/мл

ДР ДР + верапамил АФП-ДР

SKVLB 7.5±0.4 1.0±0.1 0.8±0.1

MCF-7AírR 7.2±0.4 1.6±0.2 2.0±0.2

Таким образом, верапамил существенно повышал чувствительность резистентных клеток к ДР, но не обращал МЛУ до уровня, наблюдаемого для чувствительных исходных линий (Рис.2, Табл.2). Результаты, полученные при исследовании цитотоксической активности конъюгата АФП с ДР в отношении резистентных к ДР клеточных линий 8КУЬБ и МСР-7м™, по сравнению со свободным ДР, представлены также в Табл.2. Чувствительность к ДР исходно устойчивых к антибиотику клеток 8КУЬБ в присутствии конъюгата возрастала на порядок. Величина 1С50 для ДР уменьшалась с 7.5 мкг/мл до 0.8 мкг/мл в случае клеток линии 8КУЬБ и с 7.2 мкг/мл до 2.0 мкг/мл в отношении клеток МСР-7МгК соответственно. Таким образом, использование системы направленного транспорта в виде конъюгата АФП-ДР позволяло

обращать МЛУ также (в случае клеток линии МСБ-7АЛгЕ) или более (в случае клеток линии 8КУЬБ) эффективно, чем с помощью верапамила. Однако, конъюгат АФП-ДР также как и верапамил обращал МЛУ не до уровня чувствительных клеток, что предполагает наличие в этих клетках и других механизмов клеточной резистентности.

Характеристика чувствительных и резистентных линий клеток-мишеней по уровню экспрессии белков Вс1-2 и Вах.

Лекарственная устойчивость опухолевых клеток в значительной мере может определяться особенностями процессов апоптоза, в частности уровнем белков семейства Вс1-2. Количество белков Вс1-2 и Вах в различных клетках определяли с помощью иммуноблотинга. Оказалось, что в резистентных и чувствительных клеточных линиях количество белка Вс1-2 различалось (Рис.3). В клетках резистентных линий 8КУЬБ и МСБ-7АЛгЕ количество белка Вс1-2 было существенно ниже, чем в клетках чувствительных линий 8КОУ3 и МСБ-7. Количество Вах в клетках резистентных и чувствительных линий практически не различалось. Важно отметить, что гиперэкспрессии Вс1-2, предопределяющей устойчивость клеточных линий к цитотоксическим препаратам, и гиперэкспрессии Вах, приводящей к сенсибилизации опухолевых клеток, не наблюдалось ни в чувствительных, ни в резистентных линиях опухолевых клеток.

вКОУЗ вКУЬВ МСР-7 МСГ-7А<*гК ^ ^

»ах тштж

Кврь Т^ифштЯк

Рис.3. Иммуноблотинг белков Вс1-2 и Вах клеток аденокарциыомы молочной железы (МСБ-7 и МСБ-7АЛгЕ) и аденокарциномы яичника (8КОУ3 н 8КУЬБ). В качестве контроля использован актин.

Рис.4. Выживаемость клеток адено-карциномы яичника человека линии 8КОУ3 через 24 часа после транс-фекции геном Вах. Выживаемость клеток, трансфицированных контрольной плазмндой, принята за 100%.

Ранее было обнаружено, что клетки линий SKOV3 и SKVLB содержат мутацию в экзоне 3 гена Вах. При секвенсировании продукта ПЦР этого фрагмента гена Вах картирована гетерозиготная мутация [Обухова В.В., 2004]. В клетках линий MCF-7 и MCF-7AirR в гене Вах мутации не обнаружено. Изменение нуклеотидной последовательности гена Вах определяет

синтез мутантного белка Вах. Для исследования влияния обнаруженной мутации на чувствительность клеток 8КОУ3 к апоптозу, индуцированному ДР, были проведены эксперименты по введению нормального гена Вах в эти клетки с помощью липотрансфицирующих агентов набора Мах1Гес1т-21™. Эффективность трансфекции исследуемых клеток оценивали по уровню экспрессии гена ОРР, трансфицированного в тех же условиях, что и ген Вах, с помощью проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии. В выбранных условиях эффективность трансфекции клеток составляла около 7080%, однако уровень экспрессии гена ОРР в отдельных клетках различался очень существенно.

При трансфекции опухолевых клеток конструкцией, содержащей ген Вах, и контрольной плазмидой обнаружена интенсивная гибель (90%) трансфицированных геном Вах клеток через 24 ч после трансфекции (Рис.4). Выжившие после трансфекции клетки подвергали селекции на среде с пуромицином (1 мкг/мл). Уровень белка Вах исследовали через 24 ч после трансфекции в живых и погибших клетках линии 8КОУ3 и в селектированных после трансфекции клетках. Полученные результаты представлены на Рис.5. Оказалось, что через 24 часа после трансфекции клеток линии 8КОУ3 наблюдается гиперэкспрессия этого белка в погибших (открепившихся от подложки) к этому времени клетках и повышенный по сравнению с исходным уровень эксперессии Вах в живых клетках. Полученные результаты прямо свидетельствуют о том, что гибель клеток этой линии зависит от уровня экспрессии трансфицированного нативного гена Вах. В тоже время после селекции трансфицированных клеток уровень экспрессии Вах в клетках линии 8КОУ3 не отличался от контроля (Рис.5), что свидетельствует о гибели всех трансфицированных клеток. По-видимому те клетки линии 8КОУ3, которые были живы через 24 ч после трансфекции, но содержали повышенный уровень экспрессии Вах, погибали в более поздний период. При исследовании чувствительности к ДР клеток, полученных в результате селекции в среде с пуромицином, оказалось, что чувствительность трансфицированных Вах клеток линии 8КОУ3, в которых отсутствовала повышенная экспрессия этого белка, не отличалась от контрольных клеток. Таким образом, гиперэкспрессия нативного гена Вах приводила к гибели опухолевых клеток в случае линии 8КОУ3.

12 5 6

Рис. 5. Имуноблотинг белка Вах трансфицированных геном Вах клеток линии SKOV3. Контроль глицеральдегиддегидрогеназа (GADPH).

1 - клетки, выжившие через 24 часа после трансфекции геном Вах; 2 - клетки, трансфицированные контрольной плазмидой, через 24 ч после трансфекции; 3 - клетки, погибшие через 24 ч после трансфекции геном Вах; 4 - клетки, трансфицированные контрольной плазмидой, после селекции; 5 - клетки, трансфицированные геном Вах, после селекции; 6 -контрольные нетрансфицированные клетки.

Полученные данные позволяют заключить, что обнаруженная мутация приводит к инактивации проапоптотической активности гена Вах.

Присутствие инактивирующей мутации в гене Вах в клетках линий SKOV3 и SKVLB может вносить дополнительный вклад в их устойчивость к цитотоксическим препаратам.

Таким образом, исследование выбранных нами двух пар чувствительных и резистентных опухолевых клеток показало, что эти линии клеток различаются не только по уровню экспрессии MDRJ, но и по наличию инактивирующей мутации в гене Вах в клетках аденокарциномы яичника человека.

Полученные результаты позволили выбрать клетки линий SKOV3, SKVLB и линий MCF-7, MCF-7AdrR в качестве клеток-мишеней для сравнения эффективности элиминации чувствительных и резистентных опухолевых клеток с помощью ЦТЛ, индуцированных ДК, нагруженными опухолеспецифическими антигенами.

2. Получение и характеристика зрелых дендритных клеток человека. Оптимизация условий получения зрелых ДК с помощью препарата "Лейкинферон".

В настоящее время однозначно установлено, что для оптимальной индукции клеточного иммунного ответа и in vivo и in vitro необходимо использовать зрелые ДК. В качестве индукторов созревания используют среду, кондиционированную моноцитами (СКМ), содержащую ФНОа, ИЛ-Ip и другие цитокины, или рекомбинантные ФНОа, ИЛ-13, Ифу [Steinbach F. et al, 1998, Liu K et al, 2002], что существенно повышает стоимость приготовления ДК. В то же время в клинической практике в качестве имммунокорректора успешно применяется препарат "Лейкинферон", содержащий природный комплекс цитокинов Ифа, Ифу, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНОа в их естественном соотношении, синтезированных лейкоцитами из крови клинически здоровых доноров. Состав этого препарата аналогичен составу СКМ, что позволило предположить возможность его использования в качестве стандартного препарата для индукции созревания ДК. Для выбора условий использования ЛФ в экспериментах по индукции созревания ДК исследовали степень дифференцировки ДК после инкубации с этим препаратом по изменению уровня экспрессии костимулирующих молекул CD80 и CD86. Концентрацию ЛФ выбирали по его активности, которая стандартизуется по содержанию активности в 1 мл среды.

Показано, что все исследованные концентрации ЛФ (50-200 ЕД/мл) уже через 24 ч индуцировали созревание ДК, регистрируемое по повышению уровня экспрессии как CD80, так и CD86. При фазово-контрастной микроскопии такие клетки имели звездчатую форму и вуалевидные образования Увеличение времени инкубации с этим препаратом до 72 ч приводило к усилению экспрессии CD80 и не влияло или даже снижало уровень экспрессии

CD86. Наиболее высокий уровень экспрессии CD80 отмечен при комбинированном действии ФНОаиЛФ.

Полученные данные позволяют заключить, что использование ЛФ в качестве фактора, индуцирующего дифференцировку ДК, наиболее эффективно в комбинации с ФНОа. Поэтому для приготовления зрелых ДК из моноцитов периферической крови in vitro вместо СКМ использовали сочетание ЛФ (100 ЕД/мл) и ФНОа (50 нг/мл), которые добавляли к незрелым ДК на 6-е сутки инкубации.

Рис.6. Морфология

незрелых ДК, полученных на 6-е сутки инкубации с рГМ-КСФ и рИЛ-4, и зрелых ДК, полученных через 2 суток инкубации незрелых ДК с лейкинфероном (100 Ед/мл) в сочетании с ФНОа (50 нг/мл), при фазово-контрастной микроскопии. х400

С083\ СОвО^, С086++\ НЬА ОЯ^, СО 14".

Характеристика зрелых ДК

Морфологическая характеристика при фазово-контрастной микроскопии и уровень экспрессии поверхностных молекул ДК, приготовленных с использованием ЛФ (100 ЕД/мл) и ФНОа (50 нг/мл), представлены на рис.6. Анализируя полученные данные, можно заключить, что применение комбинации ЛФ и позволяет получить зрелые ДК, характеризующиеся

типичными морфологией (крупные округлые клетки с наличием специфических выростов на поверхности клетки) и фенотипом

При исследовании жидкофазного эндоцитоза ЕГГС-меченного декстрана зрелыми и незрелыми ДК с помощью проточной цитофлуориметрии показано, что скорость эндоцитоза в зрелых ДК на порядок ниже, чем в незрелых.

При исследовании антигенпредставляющей способности ДК, полученных с использованием СКМ и ЛФ в сочетании с в смешанной культуре лимфоцитов

обнаружена практически одинаковая способность таких ДК стимулировать пролиферацию

алтогенных лимфоцитов Максимум пролиферации лимфоцитов наблюдался уже при соотношении ДК лимфоциты равном 1 200 Увеличение количества ДК от 1 до 20 тыс /лунку и соотношения ДК/лимфоциты от 1 200 до 1 10 (при концентрации лимфоцитов 200 тыс /лунку в 200 мкл среды) не влияло на уровень стимуляции пролиферации лимфоцитов Представленные данные позволяют заключить, что ДК, полученные обоими методами и характеризующиеся высоким уровнем экспрессиии костимулирующих молекул, эффективно стимулируют аллогенные лимфоциты в смешанной культуре лимфоцитов

Таким образом, ДК, приготовленные из моноцитов периферической крови человека с помощью рГМ-КСФ и рИЛ-4 с применением препарата "Лейкинферон" вместо СКМ для индукции их созревания, по морфологии, по типу и уровню экспрессии поверхностных молекул и по их функциональной активности соответствуют зрелым ДК и могут быть использованы для приготовления ДК-вакцин Кроме того, полученные результаты позволяют полагать, что одним из механизмов иммуномодулирующего действия Лейкинферона" в том числе и его противоопухолевой активности, является его способность стимулировать созревание ДК

3. Индукция специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с помощью аутологических ДК.

Индукция специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с использованием опухолеспецифических пептидов.

Для индукции специфических ЦТЛ с помощью ДК, нагруженных опухолеспецифическими пептидами, были выбраны два пептида матриксный пептид вируса гриппа - Influenza Matrix-IM5866, с аминокистотной последовательностью GILGFVFTL и пептид меланомаспецифического антигена MAGE-3 - MAGE- 3 27 1279 с аминокислотной последовательностью FLWGPRALV, о которых известно, что они специфически связываются с HLA-A2 Для проведения соответствующих экспериментов были подобраны HLA-A2+ добровольцы для приготовления ДК и лимфоцитов и НLА-А2+-клеточные линии для проведения соответствующих экспериментов по тестированию эффективности индукции антигенспецифических ЦТЛ с помощью ДК in vitro Пептид вируса гриппа выбран в качестве положительного контроля, так как продемонстрировать индукцию специфических ЦТЛ к опухолеспецифическим антигенам у неиммунизированных доноров часто удается только после клонирования индуцированных ЦТЛ Для тестирования активности ЦТЛ в качестве клеток-мишеней были выбраны следующие HLA-A2+ линии клеток линия меланомы человека SK-MEL-1, линия Т2 и пара чувствительных и резистентных HLA-A2+ клеток аденокарциномы моточной железы человека линий MCF-7 и MCF-7AdrR Клетки линии SK-MEL-1 экспрессируют ген MAGE-3, а клетки линий MCF-7 и MCF-7AdrR - нет Показано, что MAGE- 3 27 1279 и

матриксный пептид вируса гриппа эффективно накапливаются в клетках при 37 °С. Пептид МЛОЕ-3 накапливался в клетках чувствительной и резистентной линии аденокарциномы молочной железы в равном количестве.

Для приготовления иммуногенных зрелых ДК, использовали ДК, характеризующиеся фенотипом нагруженные опухолеспецифическими

пептидами. Для этого их инкубировали с исследуемыми пептидами и после отмывания использовали для индукции специфических ЦТЛ. Для исследования ЦТЛ индуцированных с помощью ДК лимфоцитов, готовили пептидспецифические клетки-мишени путем предварительной инкубации с соответствующим пептидом в течение 4 ч. Из данных, представленных на рис.7, следует, что использование ДК, нагруженных высоко иммуногенным матриксным пептидом вируса гриппа, позволяет получить активные пептидспецифические ЦТЛ, эффективно лизирующие специфические клетки-мишени даже при очень низком соотношении эффектор:мишень (Рис.7А). В то же время использование ДК, нагруженных низко иммуногенным опухолеспецифическим пептидом МЛОЕ-3, также позволяет получить МЛОЕ-3-специфические ЦТЛ, лизирующие специфические клетки-мишени, хотя их специфическая активность существенно ниже, чем в случае пептида вируса гриппа и регистрируется лишь при значительно более высоком соотношении эффектор:мишень (Рис.7Б).

В следующей серии экспериментов была исследована пептидспецифическая активность ЦТЛ, индуцированных ДК, нагруженными пептидом МЛОЕ-3, в отношении ИЬЛ-Л2+-опухолевых клеток МСБ-7 и МСР-7ЛМ, не экспрессирующих ген МЛОЕ-3. Как следует из рис.8, МЛОЕ-3-специфические ЦТЛ, полученные с помощью ДК, нагруженных пептидом МЛОЕ-3, обладают специфической в отношении этого пептида ЦТА при использовании в качестве мишени как чувствительных, так и резистентных ИЬЛ-Л2+ МЛОЕ-3-специфических, т.е. нагруженных этим пептидом, опухолевых клеток МСБ-7 и МСР-7ЛМ (Рис.8).

Рис7. ЦТАлимфоцитов, индуцированных дендритными {слетками, обработанными матриксным пептидом вируса гриппа (А) и опухолеспецифическим пептидом MAGE-3 (Б) после двух рестимуляций в отношении клеток линии Т2, необработанных (1) и обработанных (2) иммуни-зируюшим пептидом.

Рис.8. ЦТА лимфоцитов,

индуцированных дендритными

клетками, нагруженными пептидом МАвЕ-3, в отношении

чувствительных МСЕ-7 (2) и резистентных МСЕ-7ЛМ" (4) клеток аденокарциномы молочной железы, обработанных пептидом МАвЕ-3. 1,3 -ЦТА нестимулированныхных

лимфоцитов. Соотношение

мишень:эффектор равно 1:10. Данные одного из трех типичных экспериментов.

В специальной серии экспериментов с определением ЦТА специфических ЦТЛ в присутствии 30-кратного избытка немеченных клеток К562 для ингибирования ЦТА МК-клеток показано, что ДК, наряду с индукцией пептидспецифических ЦТЛ, активируют МК-клетки, активность которых частично маскирует специфическую ЦТА индуцированных ДК Т-лимфоцитов

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что использование МНС 1-рестриктированных опухолеспецифических пептидов в комплексе со зрелыми ДК, приготовленными из моноцитов периферической крови человека по оптимизированному методу, позволяет индуцировать пептидспецифические ЦТЛ, эффективные как в отношении чувствительных, так и резистентных опухолевых клеток с высоким уровнем МЭШ Кроме того, в этих условиях одновременно происходит повышение неспецифической ЦТА лимфоцитов в результате активации МК-клеток, что также может способствовать развитию более высокого противоопухолевого ответа

Индукция специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с использованием ДК, нагруженных лизатом опухолевых клеток.

В предварительных экспериментах для исключения токсического действия содержимого опухолевых лизатов на ДК была изучена индукция апоптоза в ДК в зависимости от концентрации белка лизата Исследование апоптоза проводили после инкубации зрелых и незрелых ДК с различными концентрациями лизата клеток SK-MEL-1 в течение 24 ч с помощью флуоресцентной микроскопии после окрашивания красителем Hoechst 33342 Количество клеток в состоянии апоптоза определяли по таким морфологическим признакам как уменьшение объема клетки, вакуолизация цитоплазмы, конденсация хроматина и фрагментация ядра (Рис 9) Показано, что количество как зрелых, так и незрелых ДК в состоянии апоптоза значимо увеличивается при повышении концентрации белка опухолевого лизата свыше 100 мкг/мл, но зрелые ДК более устойчивы к индукции апоптоза Таким образом,

методику приготовления ДК-вакцин с использованием лизатов опухолевых клеток нужно стандартизовать с учетом оптимальной концентрации, которая, по нашим данным не должна превышать 100 мкг/млпо белку

^^^НМВННВ " С! -!' ' 1 - ¥

Рис.9. Апоптоз в дендритных клетках

человека после

инкубации с лизатом опухолевых клеток (165 мкг/мл) в течение 24 ч (флуоресцентная и

фазово-контрастная микроскопия, окра-

шивание НоеесЬй 33342).

Для сравнения эффективности индукции антигенспецифических ЦТЛ с помощью опухолеспецифических пептидов и лизатов опухолевых клеток, лимфоциты инкубировали с ДК, нагруженными пептидом МЛОЕ-3 и ДК, нагруженными лизатом опухолевых клеток меланомы человека линии 8К-МЕЬ-1 (100 мкг/мл) Сравнивая уровень активности ЦТЛ, индуцированных ДК, нагруженными пептидом МЛОЕ-3, и ЦТЛ, индуцированных ДК, нагруженными лизатом опухолевых клеток меланомы человека линии 8К-МЕЬ-1 в отношении клеток 8К-МЕЬ-1, экспрессирующих ген МЛОЕ-3 (Рис 10), следует отметить, что более высокая активность ЦТЛ обнаруживается при использовании лизата клеток в качестве источника опухолеспецифических антигенов

Рис.10. ЦТА

индуцированных

дендритными

лимфоцитов, интактными клетками (1),

нагруженными пептидом МЛОЕ-3 (2) или лизатом опухолевых клеток 8К-МЕЬ-1 (3), после двух рестимуляций в отношении клеток меланомы человека линии 8К-МЕЬ-1.

Для индукции опухолеспецифических ЦТЛ, специфических в отношении чувствительных и резистентных опухолевых клеток, ДК нагружали лизатом чувствительных клеток МСБ-7 и 8КОУ3 в концентрации 100 мкг/мл, затем отмывали и инкубировали с аутологическими лимфоцитами В качестве контроля использовали лимфоциты, полученные в

результате инкубации с интактными ДК Уровень ЦТА лимфоцитов, индуцированных с помощью иммуногенных ДК, был исследован в отношении чувствительных и резистентных вариантов клеток аденокарциномы молочной железы и яичника человека

МСР-7 мср.7А<1гк вКОУЗ БКУЬВ

12 12 12 12

Рис.11. ЦТА лимфоцитов, индуцированных интактными дендритными клетками (1) и нагруженными лизатом чувствительных опухолевых клеток (2), после двух рестимуляций в отношении чувствительных клеток линии MCF-7, резистентных клеток линии МСВ7""" , чувствительных клеток линии SKOV3 и резистентных клеток линии SKVLB. Соотношение мишень.эффектор равно 1:10.

Из данных, представленных на Рис 11, следует, что лимфоциты, индуцированные ДК, нагруженными лизатами чувствительных клеток МСБ-7 и 8К0У3, обладали высокой ЦТА в отношении как чувствительных, так и резистентных типов исследуемых линий клеток. Причем, в случае резистентной линии 8КУЬБ активность опухолеспецифических ЦТЛ была даже выше, чем в отношении исходной чувствительной линий 8К0У3 В случае контрольных лимфоцитов, их ЦТА отсутствовала в отношении клеток линии МСБ-7 и была значительно ниже индуцированной специфическими ЦТЛ в отношении клеток линии 8КОУ3

При исследовании фенотипа лимфоцитов, индуцированных интактными ДК и ДК, нагруженными лизатом клеток линии МСБ-7, показано, что в этом случае происходит значительное увеличение (по сравнению с нестимулированными лимфоцитами) количества СБ16+ и СБ56+ клеток, что свидетельствует о возрастании в этих условиях количества КК-клеток или Т-киллеров При специфической стимуляции в меньшей степени возрастает количество СБ16+ и СБ56+ клеток, но существенно увеличивается количество СБ8+ Т-клеток В присутствии ЗОх избытка клеток К562 - специфической мишени КК-клеток ЦТА лимфоцитов, индуцированных интактными ДК снижается, тогда как ЦТА лимфоцитов, индуцированных ДК, нагруженными лизатом клеток МСБ-7, практически остается прежней Таким образом, при индукции лимфоцитов интактными ДК происходит увеличение количества КК-клеток, а ДК, нагруженные лизатом опухолевых клеток, помимо КК-клеток индуцируют специфические Т-лимфоциты

На основе полученных данных можно заключить, что с помощью ДК, обработанных лизатом чувствительных опухолевых клеток, можно индуцировать специфические в отношении опухолевых антигенов ЦТЛ, с высокой эффективностью лизирующие как чувствительные, так и высоко устойчивые к противоопухолевым препаратам клетки

Индукция специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с использованием ДК, нагруженных суммарной опухолевой РНК.

Для индукции опухолеспецифических ЦТЛ, зрелые ДК инкубировали с суммарной РНК чувствительных клеток МСБ-7 и 8КОУ3 в концентрации 50 мкг/мл в течение 18 часов, затем отмывали и инкубировали с аутологическими лимфоцитами В качестве контроля использовали лимфоциты, полученные после инкубации с интактными ДК Уровень ЦТА лимфоцитов, индуцированных с помощью иммуногенных ДК, был исследован в отношении клеток чувствительных и резистентных вариантов аденокарциномы молочной железы и яичника человека

Из данных, представленных на Рис 12, следует, что лимфоциты, индуцированные ДК, нагруженными суммарной РНК чувствительных клеток, обладали высокой ЦТА в отношении и чувствительных, и резистентных типов исследуемых линий клеток. Причем, в случае резистентных линий 8КУЬБ и МСР-7ЛМ активность опухолеспецифических ЦТЛ была выше, чем в отношении чувствительных линий 8КОУ3 и МСБ-7, соответственно ЦТА контрольных лимфоцитов была значительно ниже ЦТА опухолеспецифицеских ЦТЛ в отношении чувствительных клеток линии 8КОУ3 и отсутствовала в отношении клеток линии МСБ-7 В случае обеих резистентных линий отмечена более высокая, чем в случае чувствительных линий, неспецифическая ЦТА

Рис.12. ЦТА лимфоцитов, индуцированных интактными дендритными клетками (1) и нагруженными РНК чувствительных опухолевых клеток (2), после двух рестимуляций в отношении чувствительных клеток линии МСБ-7, резистентных клеток линии МСР7ЛЛгК , чувствительных клеток линии 8КОУ3 и резистентных клеток линии 8КУЬБ. Соотношение мишень:эффектор равно 1:10.

Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что специфические в отношении опухолевых антигенов ЦТЛ, индуцированные с помощью ДК, обработанных суммарной опухолевой РНК, с одинаково высокой эффективностью лизируют как чувствительные, так и высоко устойчивые к противоопухолевым препаратам клетки.

Анализ количества антигенспецифических лимфоцитов, индуцируемых с помощью ДК, нагруженных лизатом опухолевых клеток или их РНК.

Наряду с исследованием ЦТА, для количественного определения антигенспецифических клеток определяют количество лимфоцитов, секретирующих в этих условиях Ифу, ФНОа и др. с помощью ЕЬВРОТ-теста. Этот метод мы использовали для сравнения количества антигенспецифических лимфоцитов, индуцируемых с помощью ДК, нагруженных лизатом опухолевых клеток или их РНК. На рис.13 представлены результаты ЕЬВРОТ-теста, в котором определяли количество Ифу-секретируюших лимфоцитов, индуцированных ДК, нагруженными лизатом или суммарной РНК клеток МСБ-7. Для оценки антигенспецифической секреции Ифу, лимфоциты, индуцированные иммуногенными ДК, инкубировали с ДК, нагруженными лизатом клеток линии МСБ-7 в соотношении 10:1. Для определения уровня спонтанной секреции Ифу использовали лимфоциты без добавления ДК. Как следует из представленных данных, количество окрашенных пятен, соответствующее количеству клеток, секретирующих Ифу, в случае лимфоцитов, индуцированных иммуногенными ДК значительно выше, чем в случае контрольных, индуцированных интактными ДК (Рис.13).

Сравнивая уровень Ифу-секретирующих лимфоцитов, индуцированных ДК, нагруженными опухолевым лизатом и индуцированных ДК, нагруженными суммарной опухолевой РНК, следует отметить, что более высокий уровень антигенспецифических лимфоцитов обнаруживается в случае использования лизата опухолевых клеток (рис.13). Это связано, по-видимому, с тем, что при нагрузке ДК лизатом происходит представление большего числа опухолеспецифических антигенов по сравнению с нагрузкой суммарной РНК, которая за время инкубации могла быть частично разрушена под действием нуклеаз. Возможно также, что ДК могут эндоцитировать белки лизата более эффективно, чем РНК. Кроме того, лизат опухолевых клеток может содержать дополнительные факторы, активирующие ДК, например, такие, как белки теплового шока.

В то же время следует подчеркнуть, что уровень ЦТА лимфоцитов, индуцированных ДК, нагруженными лизатом и РНК опухолевых клеток, был одинаков (Рис.11,12). Возможно, что существенные различия в количестве Ифу-секретирующих лимфоцитов определяется СЭ4+-лимфоцитами, в то время как количество или активность опухолеспецифических ЦТЛ оказываются одинаковыми при обоих способах нагрузки ДК для их индукции.

1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

■

Л"

п,|| 1 7

Рис.13. Количество Ифу-секретирующих лимфоцитов, индуцированных

интактными ДК, ДК, нагруженными суммарной РНК клеток линии МСЕ-7, и ДК, нагруженными лизатом клеток линии МСЕ-7, при стимуляции ДК, нагруженными лизатом клеток линии МСЕ-7. Соотношение лимфоцитыДК равно 10:1. По оси ординат - количество пятен на 106 лимфоцитов. Левый столбец - спонтанная секреция Ифу лимфоцитами перед добавлением ДК, правый столбец - секреция Ифу после стимуляции лимфоцитов ДК, нагруженными опухолевым лизатом.

Контроль РНК

Лизат

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что использование опухолеспецифических пептидов, лизатов опухолевых клеток и суммарной опухолевой РНК для нагрузки ДК, приготовленных из моноцитов периферической крови человека по оптимизированному методу, позволяет индуцировать опухолеспецифические ЦТЛ При этом крайне важно еще раз подчеркнуть, что ЦТЛ, индуцированные с помощью нагруженных опухолеспецифическими антигенами ДК, высоко активны как в отношении чувствительных к противоопухолевым препаратам клеток, так и в отношении высоко резистентных опухолевых клеток, экспрессирующих ген множественной лекарственной устойчивости МБК1 и имеющих другие механизмы устойчивости

Выводы.

1 В резистентных к противоопухолевым препаратам клетках аденокарциномы молочной железы линии МСР-7АЛгЕ и яичника человека линии 8КУЬБ, экспрессирующих высокий уровень МВЯ1, снижена экспрессии гена Вс1-2, а экспрессия гена Вах одинакова в чувствительных и резистентных линиях клеток

2 В клетках линии 8КОУ3 и полученной из нее высокорезистентной к ДР линии 8КУЬБ обнаружено присутствие инактивирующей мутации в гене Вах

3 Использование конъюгата АФП-ДР позволяет обращать МЛУ опухолевых клеток также или более эффективно, чем использование верапамила

4. Показано, что для индукции созревания ДК, приготовленных из моноцитов периферической крови человека, в качестве источника цитокинов может быть использован препарат "Лейкинферон".

5. Показано, что с помощью ДК, нагруженных опухолеспецифическим пептидом, можно индуцировать опухолеспецифические ЦТЛ, активные в отношении как чувствительных, так и резистентных клеток.

6. Обнаружено, что высокие концентрации лизата опухолевых клеток могут вызывать апоптоз ДК, что необходимо учитывать при приготовлении иммуногенных ДК на основе опухолевых лизатов.

7. Показано, что ЦТЛ, индуцированные с помощью ДК, нагруженных лизатом или РНК чувствительных опухолевых клеток высоко активны как в отношении чувствительных к ДР клеток, так и в отношении высоко резистентных опухолевых клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Северин С.Е, Родина AB., Клименко ПА, Шмырев ИЛ, Москалева Е. Ю., Северин Е.С.

Противоопухолевая акшшюсль южькяшов АФП с докссрубицином в отношении ккпж карциномы яичникш

человека invito. // Акушеравои гинекология. 1997.6^45-47

2. Moskaleva EYu, Posypanova OA, Shmyrev U, Rodina AV., Muizimek EL, Severin ES, Katukov V.Yu.,

Luzhkov Yu. M, Severin S.E. Alpha-fetcproton-mediated targeting - A new strategy to overcame miihidmg resistance of

tunar cdls in vitro. // Cell Biology IrJarratimaL 1997.21 (12). 793-799.

3. Severin S.E, Katukov V.Ya, Moskaleva EYu, Belousova YaV, Rodina AV., Lulsenco S.V, Gumanov S.G,

Shmyrev I.I., Severin E.S. Effickixy ofdaMulscmtargai^

growth fktearri growth hormone. //Tte XXV апгаижау meeting ofthe ISOBM Swiseriand 1997.45.

4. Москалева ЕЮ, Родина AB, Шмырев ИЛ, Туманов СГ, Посыпанова ГАДуценко CS, Катуков В.Ю., Северин Е.С. Срашаше щлотокоиескш акшвкосш шнькгаш дасор^бицина с атьфа-фекшрогалюм и эпвдгумальным фактором роста в спношении чувешпепьных и резиишшш к дзш)1$0щину клеточных линий.// Шпрсшбжштиэский.медииишс^ 1998.2,20-25.

5. Сладкова JLB, Родина AB, Москалева Е.Ю, Прусакова О.В, Белящий ИЛ Закераева ТЗ, Суровой АЮ, Северин С.Е, Северин ЕС. Траисфекция гша Ьах в опухолевые клящ несупцв мутацию в этом гак, нызываегих1ибель.//Цтотоги^Магер|даы международногосимпозиума"Бижшклеткивкультуре"2001.43 (9), 890

6. Белушкина ПН, Зыкова ЕС, Закераева ТЗ, Зыксва ОЛ, Родина AB, Силуянова СЛ, Лесничук CA, Северин СЕ Обнаружение мутаций в проапоптшическом гене Ьах различных кегочных линий с помошуо

полимеразной цепной реакции. Материалы медународного симпозиума "Биология клетки в культуре" //Цитология, 2001..43 (9), B41.

У. Сладкова Л. В., Родина А. В., Москалева E. Ю., Северин С. E., Северин E. Вклад индуцируемой экспрессии генов bcl-2 и tax в устойчивость клеток карциномы яичников человека линии SKVLB. XIV Всероссийский симпозиум "Структура и функции клеточного ядра." /У Цитология.2002 44,(9),904. B. Москалева E^., Родина А.В., Луценко СВ., Северин СE. Роль цитокинов в биотерапии рака с использованием дендритных клеток. // Цитокины и воспаление. 2002. с.80

9. Москалева E^., Родина А.В., Луценко СВ., Северин CE., Северин EX Теоретические основы и подготовительный этап использования дендритных клеток для биотерапии рака. //1 Всероссийская научно-практическая конференция «Биотерапия рака», 2002. с. бб-б8

10. Moskaleva E.Yu., Rodina A.V., Lutzenko S.V., Severin E.S., Severin S.E. Apoptosis and antigen-presenting capacity of dendritic cells after their incubation with tumor cell lysate. // Abstr. of the У" International symposium on dendritic cells, 2002. Р.бУ.

11. Родина А.В., Москалева E^., Гукасова Н.В, Луценко СВ., Беляев Д.Л., Бабаянц А.А., Кузнецова СЮ., Северин СE., Северин EX. Лейкинферон индуцирует созревание дендритных клеток человека in vitro.// Медицинская иммунология, 200З. 5, (З-4), с. 214-215.

12. Гукасова Н.В, Москалева E^., Родина А.В., Луценко СВ., Беляев Д.Л., Бабаянц А А., Кузнецова С.Ю., Северин CE., Северин EX Сравнение фенотипа и функциональной активности дендритных клеток человека, полученных при обычном и "ускоренном" методе культивирования. // Медицинская иммунология. 200З. .5,З-4, с. 19B-199.

13. Гукасова Н.В., Москалёва E^., Родина А.В., Северин EX, Северин СE. Характеристика дендритных клеток человека, полученных с использованием стандартного и "ускоренного" методов культивирования. Молекулярная медицина, 2004.2,38-44.

14. Москалева E^., Родина А.В., Гукасова Н.В., Луценко СВ., Макаров В.А., Попова О.Н., Северин CE., Северин E.C Изучение способности дендритных клеток, нагруженных пептидом опухолеспецифического антигена MAGE-3 индуцировать пептид-специфические цитотоксические лимфоциты. Аллергия, астма и клиническая иммунология, 200З.У (9), 28-34.

15. Родина А.В., Москалева E^., Беляев Д.Л, Луценко СВ., Кузнецова С.Ю., Бабаянц А.А., Попова О.Н., Северин CE., Северин E.C Получение функционально активных дендритных клеток человека, с использованием препарата Лейкинферон в качестве индуктора созревания. // Аллергия, астма и клиническая иммунология, 200З.У (9), 19-2У.

16. Ницветов МБ, Москалева E^., Сладкова Л.В., Родина А.В., Посыпанова ГА, Попова О.Н., Коромыслова И.А., Караулов А.В., Северин СE., Северин EX Характеристика чувствительных и резистеишьк к дсшздбициыу опухолевых квючньк линий по уровню экспрессии рецяпора атьфа-фем цхлеина и способности к гшапсет юсгхмшанному эшюшишу. // Молекулярная медицина, 2003.2, 57-60.

17. Родина А.В., Москалева Е.Ю., Высоцкая О.В., Попова О.Н., Северин С.Е., Северин Е.С. Чувсшггельносп. опухолевых клеток с фенотипом MDR1+ к дейявию цщогокшчэских лимфоцитов, индуцированных с тмошыодеадршыьк кияок //Медицинская иммунология, 2004. 6(3-5), 249.

18. Родина А. В., Сладкова Л. В., Обухова В. В., Везирханова Т. 3., Москалева Е. Ю., Прусакова О. В., Белецкий И. П., Белушкина Н. Н., Стрельников В. В., Иванов М. А., Северин С. Е., Северин Е. С. Инактивация и сенсибилизация опухолевых клеток с помощью трансфекции г еним Век. И Молекулярная биология. 2004.38, (б), 1-8.

19. Severin S.E, Sladkova L.B., Rodina A.V., Moskaleva E.Yu., Zakeraeva T.Z., Belushkina N.N., Zykova E.S., Prusacova O.V., Belecky I.P., Surovoy A.Yu. Transfection of gene bax induces death of human ovary carcinoma cells (SKOV3). // Abstractbook of the 3ft International symposium on genetic anticancer agents. Amsterdam. 2002. P. 147.

20. Родина A.B., Москалева Е.Ю., Высоцкая O.B., Попова О.Н., Северин С.Е., Северин Е.С. Высокая активность цитотоксических лимфоцитов, индуцированных с помощью дендритных клеток, нагруженных опухолевым лизатом или РНК, в отношении опухолевых клеток с фенотипом множественной лекарственной устойчивости. // Иммунология, 2004.25(6), 345-350.

Принято к исполнению 09/02/2005 Исполнено 14/02/2005

Заказ № 593 Тираж: 80 экз..

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095) 318-40-68 \vww.autoreferat ги

/ í- ••• > ( HUI ■

2 2КРИ5 VJ'2 1653

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Родина, Алла Валерьевна

Список сокращений. Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток.

1.1.1. Множественная лекарственная устойчивость, определяемая функцией белка Pgp.

1.1.2. Экспрессия Pgp в нормальных тканях и клетках

1.1.3. Экспериментальные подходы к обращению Pgp-МЛУ.

1.1.4. Роль ключевых генов, контролирующих апоптоз, в лекарственной устойчивости опухолевых клеток.

1.2. Дендритные клетки и их роль в индукции клеточного противоопухолевого ответа.

1.2.1. Дендритные клетки человека и их свойства.

1.2.2. Методы получения дендритных клеток in vitro.

1.2.3. Методы количественного определения антигенспецифических Т-лимфоцитов.

1.2.4. Опухолеспецифические антигены человека, распознаваемые Т-лимфоцитами. 1.3 Заключение.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Характеристика исследуемых линий опухолевых клеток-мишеней.

3.1.1. Характеристика чувствительных и резистентных линий клеток-мишеней по уровню экспрессии MDR1.

3.1.2. Исследование чувствительности клеток аденокарциномы молочной железы человека линий MCF-7 и MCF-7AdrR и аденокарциномы яичнника линий SKOV3 и SKVLB к доксорубицину.

3.1.3. Исследование возможности преодоления МЛУ с помощью верапамила и направленного транспорта ДР с использованием конъюгата АФП-ДР.

3.1.4. Характеристика чувствительных и резистентных линий клеток-мишеней по уровню экспрессии белков Вс1-2 и Вах.

3.2 Получение и характеристика зрелых дендритных клеток человека.

3.2.1. Оптимизация условий получения зрелых ДК с помощью препарата "Лейкинферон".

3.2.2. Характеристика зрелых ДК.

3.3. Индукция специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с помощью аутологических ДК и анализ их цитотоксической активности в отношении чувствительных и резистентных опухолевых клеток.

3.3.1. Индукция специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с использованием опухолеспецифических пептидов и анализ их цитотоксической активности в отношении чувствительных и резистентных опухолевых клеток.

3.3.2 Индукция специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с использованием лизатов опухолевых клеток и анализ их цитотоксической активности в отношении чувствительных и резистентных опухолевых клеток.

3.3.3. Индукция специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с использованием суммарной опухолевой РНК и анализ их цитотоксической активности в отношении чувствительных и резистентных опухолевых клеток.

3.3.4. Анализ количества антигенспецифических лимфоцитов, индуцируемых с помощью ДК, нагруженных лизатом опухолевых клеток или их РНК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение чувствительности опухолевых клеток человека к действию цитотоксических лимфоцитов, индуцированных дендритными клетками"

Актуальность проблемы. Недостаточная эффективность химиотерапии злокачественных опухолей, обусловленная низкой селективностью противоопухолевых препаратов по отношению к раковым клеткам и развивающейся в короткие сроки устойчивостью клеток опухоли к лекарственному воздействию, является основным препятствием для успешного лечения онкологических заболеваний. Использование в современной химиотерапии комбинации лекарственных средств, принадлежащих к разным классам и действующих на разные клеточные мишени, выдвигает на первый план проблему преодоления множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолевых клеток. МЛУ может определяться включением различных биохимических механизмов, характеризующих разные этапы осуществления токсического действия химиопрепарата на клетку - от ограничения накопления лекарства внутри клетки до ингибирования программы гибели опухолевой клетки [10,34]. К ним относятся повышение экспрессии генов трансмембранных транспортных белков, выводящих противоопухолевые препараты из клетки (например, Р-гликопротеина, Pgp); активация ферментов системы глутатиона, инактивирующих цитотоксические препараты; изменения генов и белков, контролирующих процессы апоптоза опухолевой клетки (р53, семейство BcI-2, IAP и др.).

Вещества различной химической структуры: блокаторы кальциевых каналов (верапамил), ингибиторы кальмодулина, стероиды, антибиотики, иммуносупрессоры, транквилизаторы способны в той или иной степени обращать МЛУ [3,64,128]. Однако клинические испытания таких модуляторов МЛУ не привели к желаемым результатам из-за их высокой токсичности [66,110]. В настоящее время на основе исследований биохимии рецептор-опосредованного эндоцитоза разрабатываются новые способы противоопухолевой терапии, которые позволяют избирательно убивать клетки опухоли и должны обращать МЛУ, обусловленную функционированием Pgp. Одной из перспективных разработок в этой области может быть система направленного транспорта, в которой в качестве вектора используется онкофетальный белок альфа-фетопротеин (АФП), рецептор которого является опухолеспецифическим белком и представлен только на раковых клетках [114,167].

В предупреждении и элиминации развившихся опухолей большие надежды связывают с развитием методов иммунотерапии [54,98,149]. Показано, что при LAK-терапии клетки, устойчивые к противоопухолевым препаратам в результате гиперэкспрессии MDR1, могут быть чувствительны к активированным NK-клеткам [67,162,170]. Однако способность опухолеспцифических Т-лимфоцитов элиминировать опухолевые клетки с фенотипом МЛУ не изучена.

Одним из перспективных направлений в индукции специфического клеточного противоопухолевого иммунитета является разработка методологии, основанной на использовании дендритных клеток (ДК) - эффективных антигенпредставляющих клеток (АПК), обладающих уникальной способностью представлять антигены наивным Т-клеткам и вызывать их дифференцировку в антигенспецифические цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) [52,147,176]. Панель опухолеспецифических антигенов (ОСА), распознаваемых ЦТЛ, уже идентифицирована [54,31,193] и их список продолжает пополняться и известны требования, предъявляемые к ДК для эффективной индукции опухолеспецифических ЦТЛ [79,100,138,182].

В связи с этим, целью данного исследования явилось изучение чувствительности исходных и резистентных опухолевых клеток человека к действию опухолеспецифических ЦТЛ, индуцированных с помощью ДК в экспериментах in vitro. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

- оптимизация метода приготовления зрелых ДК из фракции моноцитов периферической крови человека;

Научная новизна работы. Впервые показано, что количество белка Вс1-2 в клетках высокорезистентных линий SKVLB и MCF-7AdrR, экспрессирующих ген MDR1, ниже, чем в исходных чувствительных клетках SKOV3 и MCF-7.

Впервые показано, что мутация, обнаруженная в гене Вах в клетках линии SKOV3, приводит к инактивации проапоптотической активности белка Вах и вносит вклад в устойчивость этих клеток к действию ДР.

Впервые показано что ЦТЛ, индуцированные с помощью ДК, нагруженных опухолевоспецифическим пептидом, лизатом или РНК чувствительных клеток высоко активны как в отношении чувствительных к ДР клеток, так и в отношении высоко резистентных опухолевых клеток, экспрессирующих ген МЛУ MDR1 и ген MDR1 в сочетании с инактивированным в результате мутации геном Вах.

Практическая значимость исследования.

Выявлен нетоксичный диапазон концентраций лизатов опухолевых клеток для приготовления иммуногенных ДК.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на XXV Съезде международного общества по изучению онкофетальной биологии и медицины (1997 г., Монтрё), на Международном симпозиуме "Биология клетки в культуре"(2001 г., Санкт-Петербург), на XIV Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра." (2002 г., Санкт-Петербург), на I Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака» (2002 г., Москва), на VII Международном симпозиуме по дендритным клеткам (2002 г., Бамберг), на III Международном симпозиуме по генетическим противоопухолевым препаратам (2002 г., Амстердам), на Седьмом и Восьмом Всероссийском форуме с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (2003 г., 2004 г., Санкт-Петербург).

Апробация работы состоялась на научном семинаре МНИИМЭ 25 октября 2004 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Родина, Алла Валерьевна

Выводы.

1. В резистентных к противоопухолевым препаратам клетках аденокарциномы молочной железы линии MCF-7AdrR и яичника человека линии SKVLB, экспрессирующих высокий уровень MDR1, снижена экспрессии гена Bcl-2, а экспрессия гена Вах одинакова в чувствительных и резистентных линиях клеток.

2. В клетках линии SKOV3 и полученной из нее высокорезистентной к ДР линии SKVLB обнаружено присутствие инактивирующей мутации в гене Вах.

3. Использование конъюгата АФП-ДР позволяет обращать МЛУ опухолевых клеток также или более эффективно, чем использование верапамила.

3.4. Заключение.

В результате проведенных исследований были охарактеризованы линии клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 и MCF-7AdrR и яичника человека SKOV3 и SKVLB по уровню экспрессии генов MDR1, Bcl-2 и Вах, определяющих устойчивость опухолевых клеток к действию противоопухолевых препаратов, и по их чувствительности к ДР. Показано, что линии клеток MCF-7AdrR и SKVLB экспрессируют высокий уровень MDR1 в отличие от исходных чувствительных линий, в которых экспрессия MDRI незначительна. По литературным данным гиперэкспрессия MDR1 определяет устойчивость клеточных линий к большинству цитотоксических препаратов. Полученные нами данные об устойчивости исследованных линий клеток к ДР показали, что по IC50, устойчивость клеток SKVLB и MCF-7AdrR значительно выше, чем соответствующих чувствительных линий. По данным цитофлуориметрического анализа и иммуноблотинга клетки линии SKVLB содержат более высокий уровень белка MDR1, чем MCF-7AdrR, а по IC50, их устойчивость к ДР практически одинакова. Это позволило предположить, что лекарственная устойчивость исследуемых линий клеток определяется и другими механизмами. Результаты, полученные при обращении резистентности модификатором МЛУ верапамилом, подтвердили это предположение: верапамил хотя и повышал чувствительность резистентных клеток к ДР, но не обращал МЛУ до уровня, наблюдаемого для чувствительных линий.

Выявление большего количества РеАФП и высокой скорости рецептор-опосредованного эндоцитоза при связывании этого рецептора с АФП в клетках резистентных линий позволило использовать для обращения МЛУ систему направленного транспорта, в которой вектором является онкофетальный белок АФП. Исследование ЦТА конъюгатов АФП с ДР в отношении резистентных линий клеток показало, что эти высокоселективные противоопухолевые препараты, проникающие в клетку посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, являются эффективными модуляторами устойчивости клеток, определяющейся функционированием белка

MDR1. Чувствительность к ДР исходно устойчивых к антибиотику клеток SKVLB в присутствии конъюгатов АФП-ДР возрастала на порядок. Величина IC50 для ДР уменьшалась с 7.5 мкг/мл до 0.8 мкг/мл в случае клеток линии SKVLB и с 7.2 мкг/мл до 2.0 мкг/мл в отношении клеток MCF-7AdrR соответственно. Таким образом, конъюгат АФП-ДР обращает резистентность устойчивых клеток также или более эффективно, чем верапамил, но не до уровня чувствительных клеток.

Для определения роли ключевых генов, контролирующих апоптоз, в лекарственной устойчивости исследуемых линий клеток, сравнивали количество белков Вс1-2 и Вах в резистентных и чувствительных клеточных линиях. В клетках обеих резистентных линий SKVLB и MCF-7AdrR уровень белка Вс1-2 оказался ниже, чем в клетках чувствительных линий, а количество белка Вах было практически одинаково. Важно отметить, что гиперэкспрессии Вс1-2, предопределяющей устойчивость клеточных линий к цитотоксическим препаратам, и гиперэкспрессии Вах, которая может приводить к сенсибилизации опухолевых клеток, не наблюдалось ни в чувствительных, ни в резистентных линиях опухолевых клеток. В то же время с помощью метода конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК было показано, что клетки линий SKOV3 и SKVLB содержат мутацию в экзоне 3 гена Вах, а с помощью секвенирования соответствующего фрагмента ДНК (ПЦР-продукта) эта мутация была идентифицирована как G7/G9 в отличие от дикого типа G8/G8 [8]. В клетках линий MCF-7 и MCF-7AdrR мутации в гене Вах не обнаружено. Наше исследование продемонстрировало чувствительность клеток линии SKOV3 к трансфекции нативным геном Вах. Это позволило заключить, что обнаруженная мутация приводит к инактивации проапоптотической активности белка Вах. В настоящее время хорошо известно, что многие опухоли содержат мутации в гене Вах, а инактивация Вах приводит к формированию устойчивых к индукции апоптоза клеток [85,95]. Возможно, что присутствие мутантного неактивного белка Вах является одной из причин более высокой устойчивости клеток линии SKOV3 к ДР: значение IC50 для ДР в отношении клеток линии SKOV3 составило 0.3 мкг/мл, а для клеток линии MCF-7 - 0.08 мкг/мл. Кроме того, в отношении клеток линии SKOV3 известно, что они содержат мутацию в гене р53, что также может делать их более устойчивыми к индукции апоптоза [178].

Присутствие инактивирующей мутации в гене Вах в клетках линии SKVLB не приводит к повышению устойчивости к ДР, по сравнению с клетками линии MCF-7AdrR: значение IC50 для ДР было равно для SKVLB - 7.5 мкг/мл, а для MCF-7AdrR - 7.2 мкг/мл. Возможно, это связано с тем, что линии SKVLB и MCF-7AdrR исходно были получены в результате селекции по устойчивости к цитотоксическим препаратам с разными механизмами действия на клетку. Клетки линии SKVLB селектировали по устойчивости к винбластину, действующему на веретено деления, а линия MCF-7AdrR получена в результате селекции по устойчивости к интеркалирующему агенту ДР. Кроме того в клетках линии SKVLB и в клетках MCF-7AdrR безусловно возможно наличие и других, не исследовавшихся нами механизмов клеточной резистентности.

Для исследования чувствительности модельных линий опухолевых клеток человека к ЦТЛ, индуцированным ДК, нагруженными ОСА, были изучены разные способы введения опухолеспецифических антигенов в ДК и определена эффективность каждого из указанных методов.

В предварительных экспериментах были оптимизированы условия получения зрелых ДК человека с помощью препарата "Лейкинферон", что позволило заменить использование среды, кондиционированной моноцитами (СКМ), которую обычно используют для индукции созревания ДК. Использование лейкинферона (в сочетании с ФНОа) в качестве индуктора созревания позволило существенно упростить методику получения зрелых ДК благодаря исключению этапа приготовления СКМ. Исследование различных характеристик ДК, полученных с помощью лейкинферона и ФНО-а, в том числе их функциональной активности, показало, что фенотип таких ДК и их активность отвечают всем требованиям, предъявляемым к ДК, используемым для индукции ЦТЛ: это высокий уровень экспрессии CD83, CD80, CD86, HLA-DR, отсутствие экспрессии CD14 и высокая антигенпредставляющая способность.

Важным этапом в процессе приготовлении иммуногенных ДК, является их нагрузка ОСА одним из доступных способов (в виде белка или пептидов, или РНК опухолевых клеток, или кДНК ОСА, или лизатом опухолевых клеток). Для нагрузки ДК мы использовали пептид меланомаспецифического белка MAGE-3 - MAGE-3271-279 - с аминокислотной последовательностью FLWGPRALV, о котором известно, что он специфически связывается с HLA-A2, лизаты чувствительных опухолевых клеток и суммарную опухолевую РНК.

Показано, что MAGE-3-специфические ЦТЛ, индуцированные с помощью ДК, нагруженных HLA-A2 рестриктированным пептидом MAGE-3, обладают специфической в отношении этого пептида ЦТА при использовании в качестве мишени MAGE-3-специфических, т.е. нагруженных этим пептидом, HLA-A2+ опухолевых клеток и MCF-7Adr и MCF-7. Показано также, что ДК помимо индукции специфических ЦТЛ активируют и NK клетки, активность которых может маскировать специфическую ЦТА индуцированных ЦТЛ. Наличие MAGE-3-специфической ЦТА в отношении клеток линии MCF-7 и MCF-7Adr было продемонстрировано в специальной серии экспериментов при блокировании активности NK-клеток с помощью избытка клеток линии К562 - NK-специфической мишени.

Из полученных результатов следует важный вывод о том, что специфические в отношении опухолевого антигена ЦТЛ, индуцированные с помощью ДК, нагруженных пептидом MAGE-3, с высокой эффективностью лизируют как чувствительные, так и высоко устойчивые к противоопухолевым препаратам клетки.

Следует подчеркнуть, что во всех экспериментах были использованы не сингенные, а только совпадающие по HLA-A2 с клетками-мишенями ЦТЛ. В таких экспериментах всегда регистрируется достаточно высокий уровень ЦТА, обусловленный активностью ЦТЛ в отношении аллоантигенов. Во многих работах исследователи вычитают значения ЦТА контрольных серий и представляют данные по разности ЦТА опытных и контрольных проб. Нам такой подход кажется не совсем адекватным, поэтому во всех экспериментах представлены данные соответствующих контролей (например, опухолевые клетки-мишени ненагруженные и нагруженные соответствующими пептидами, а также данные по активности ЦТЛ, индуцированных контрольными, т. е. ненагруженными ОСА, ДК). Крайне важно иметь аналогичные данные для полностью сингенной системы, однако это возможно лишь при доступности культуры опухолевых клеток больного и достаточно большого количества его мононуклеарных лейкоцитов для получения ДК и ЦТЛ. При проведении клинических испытаний на больных в таких исследованиях обнаружено, что ЦТА собственных лимфоцитов в отношении собственных опухолевых клеток удается зарегистрировать у больных лишь после иммунизации с помощью ДК, нагруженных ОСА [8].

При исследовании ЦТА лимфоцитов, индуцированных ДК, обработанными лизатом чувствительных опухолевых клеток также было показано, что в этом случае индуцируются специфические в отношении опухолевых антигенов ЦТЛ, эффективно лизирующие и чувствительные и устойчивые линии клеток.

При сравнении ЦТА пептидспецифических ЦТЛ и ЦТЛ, индуцированных ДК, нагруженными лизатом опухолевых клеток, обнаружено, что более высокая активность ЦТЛ наблюдается в последнем случае. Это связано, по-видимому, с тем, что при использовании лизата опухолевых клеток происходит представление не одного, а сразу нескольких ОСА и их различных эпитопов, что способствует образованию поликлональных ЦТЛ для каждого из ОСА и более эффективному лизису клеток. Кроме того, лизат опухолевых клеток может содержать дополнительные факторы, активирующие ДК, например, такие, как белки теплового шока. Поэтому использование лизата опухолевых клеток может оказаться более перспективным в тех случаях, когда доступен соответствующий материал. Однако, при выборе оптимальной концентрации лизата для нагрузки ДК, на примере клеток SK-MEL-1, было обнаружено, что высокие концентрации лизата опухолевых клеток могут вызывать апоптоз ДК. Таким образом, методику приготовления ДК-вакцин с использованием лизатов опухолевых клеток нужно стандартизовать с учетом оптимальной концентрации, в то время как использование ОСП в комплексе с ДК позволяет получать хорошо охарактеризованные и стандартизованные готовые препараты известного состава, что, безусловно, делает такие препараты высоко перспективными для противоопухолевой иммунотерапии.

Лимфоциты, индуцированные ДК, нагруженными суммарной РНК чувствительных клеток, также обладали высокой ЦТА в отношении и чувствительных, и резистентных типов исследуемых линий клеток. Причем, в случае резистентных линий SKVLB и MCF-7AdrR активность антиген специфических ЦТЛ была выше, чем в отношении чувствительных линий SKOV3 и MCF-7, соответственно. При сравнении уровня ЦТА лимфоцитов, индуцированных ДК, нагруженными лизатом или РНК опухолевых клеток, оказалось, что он был одинаков. Однако, по данным ELISPOT-теста, сравнение уровня Ифу-секретирующих лимфоцитов, индуцированных ДК, нагруженными опухолевым лизатом и индуцированных ДК, нагруженными суммарной опухолевой РНК, показало, что более высокий уровень антигенспецифических лимфоцитов обнаруживается в случае использования лизата опухолевых клеток. Это связано, по-видимому, с тем, что при нагрузке ДК лизатом происходит представление большего числа ОСА по сравнению с нагрузкой суммарной РНК, которая за время инкубации могла быть частично разрушена под действием нуклеаз. Возможно также, что ДК могут эндоцитировать белки лизата более эффективно, чем РНК.

Таким образом, каждый из рассмотренных нами методов индукции опухолеспецифических ЦТЛ с помощью ДК, имел свои преимущества и недостатки. Важно отметить, что ЦТЛ, индуцированные с помощью ДК, нагруженных опухолевым материалом разными способами, активны как в отношении чувствительных к химиотерапии клеток, так и в отношении высоко резистентных опухолевых клеток, экспрессирующих ген множественной лекарственной устойчивости MDR1. Аутологические опухолеспецифические ЦТЛ онкологических больных, полученные с помощью ДК, нагруженных ОСА, можно клонировать и получать линии высокоактивных опухолеспецифических ЦТЛ, которые могут быть использованы для адоптивной иммунотерапии, особенно в случае опухолей, высоко резистентных к химиотерапии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Родина, Алла Валерьевна, Москва

1. Батчикова Н.Б., Кулагина М.А., Луценко С.В. и др. Экспрессия синтетического гена интерлейкина-4 человека в клетках Е. Coli. Получение биологически активного белка. // Биоорганическая химия. 1992. 18 (6), 766-776.

2. Бокерия Л.А., Бескровнова Н.Н., Цыпленкова В.Г., Голухова Е.З., Бескровнов Ф.В. Возможная роль апоптоза в возникновении аритмий у больных с пароксизмальными тахикардиями. // Кардиология. 1995. 35 (10), 52-56.

3. Комбинированное и комплексное лечение больных со злокачественными опухолями, (под ред. Чиссова В.И.). // Медицина. Москва. 1989.

4. Кузнецов В.П., Беляев Д.Л., Вельшер Л.З. и др. Иммунокорригирующая терапия сопровождения при солидных опухолях: тактика, эффективность, перспективы. // Тез. Докл. 1 Всеросс. Научно-практической конф. "Биотерапия рака" М. 18-20 июня 2002. 43-45.

5. Кузнецов В.П., Караулов А.В. Лейкинферон механизмы терапевтического действия и тактика иммунокоррекции. // Интернационал, журн. иммунореабилитации. 1998. 10, 66-74.

6. Кутняк О.А., Коростелев С.А., Глухов А.И. и др. Анализ экспрессии меланомаспецифического антигена MAGE-3 в клетках меланомы человека. // Тез. Докл. Объединенного Иммунол. Форума. Екатеринбург. 2004. Russian J Immunol. 9(1), 338.

7. Обухова В.В. Исследование экспрессии апоптоз-специфических генов семейства Bcl-2 и системы Fas/FasL при новообразованиях желудка и толстой кишки человека. // Автореферат канд. дис. 2004.

8. Петровская Л.Е., Крюкова Е.А., Каюшин А.Л. и др. Получение и свойства делиционных мутантов гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека. // Биоорганическая химия. 2002. 28(5), 440-446.

9. Ставровская А.А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. // Биохимия. .2000. 65, 112-126.

10. И.Фельдман Н.В., Посыпанова Г.А., Гельперина С.Э. и др. Адресная доставка биологически активных соединений в опухолевые клетки с помощью белковых и пептидных векторов. Вестник НИИ Мол. Мед. 2002. 2, 38-53.

11. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью. // Биохимия. 2000. 65, 34-47.

12. Ярилин А.А. Основы иммунологии. //М "Медицина". 1999. с.608.

13. Adams, J.M., and Cory, S. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. // Science, 1998. 281,1322-1326.

14. Agnes M.C., Tan A., Monnaas A.M., Drijfhout J.W., Jordesn R. et al. Mannose receptor-mediated uptake of antigens strongly enhances HLA class II-restricted antigen presentation by cultured dendritic cells. // Eur.J.Immunol. 1997. 27, 2426-2435.

15. Akira, Sh, Takeda, K. Toll-like receptor signalling. // Immunology. 2004. 4,499-511.

16. Alijagic S., Moller P., Artuc M. et al. Dendritic cells generated from peripheral blood transfected with human tyrosinase induce specific T cell activation. // Eur. J. Immunol 1995. 25; 3100-7.

17. Alley M.C., Scudiero D.A., Monks A. et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrasolium assay. // Cancer Res. 1988. 48, 589601.

18. Alters S.E., Gadea J.R., Sorich M. Dendritic Cells Pulswd with CEA Peptide Induce CEA-Specific CTL with Restricted TCR Repertoire. //Journal of Immunotherapy 1998. 21 (1); 1726.

19. Antonsson В., Martinou J.C. The Bcl-2 protein family. // Exp. Cell Res., 2000. 256, p.50-57.

20. Arafat W.O., Gomez-Navarro J., Xiang J. et.al. An adenovirus encoding proapoptotic Bax induces apoptosis and enhances the radiation effect in human ovarian cancer. // Molecular therapy. 2000. 6, 545-554.

21. Baird, RD, Kaye, SB. Drug resistance reversal are we getting closer? // European Journal of Cancer. 2003.39, 2450-2461.

22. Banchereau, J, Palucka, AK, Dhodapkar, M, et al. Immune and clinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34(+) progenitor-derived dendritic cell vaccine.// Cancer Res. 2001.61,6451-6458.

23. Beck, W.T., Cirtain, M.C., Look, A.T., and Ashmun, R.A. Reversal of Vinca alkaloid resistance but not multiple drug resistance in human leukemic cells by verapamil. // Cancer Res. 1986.46, 778-784.

24. Bhardwaj N., Bender A., Gonzalez N. et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. J. // Clin. Invest. 1994. 94; 797-807.

25. Bhushan, A., Abramson, R., Chiu, J.F., and Tritton T.R. Expression of c-fos in human and murine multidrug-resistant cells. // Mol. Pharmacol., 1992. 42, 69-74.

26. Biedler, J.JL, and Reihm, H. Cellular resistance to actinomycin D in Chinese hamster cells in vitro: cross-resistance, radioautographic, and cytogenetic studies. // Cancer Res. 1970. 30, 1174-1179

27. Birnbaum, MJ, Clem, RJ, Miller, LK. An apoptosis-inhibiting gene from a nuclear polyhedrosis virus encoding a polypeptide with Cys/His sequence motifs. // J. Virol. 1994. 67,2168-2174.

28. Boczkowski D., Nair S., Snyder D., Gilboa E. Dendritic cells pulsed with RNA are potent antigen presenting cells in vitro and vi vivo. // J. Exp. Med. 1996. 184; 465-72.

29. Boczkowski D., Nair S.K., Nam J.H., Lyerly H.K., Gilboa E. Induction of tumor immunityand cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. // Cancer Res. 2000. 60; 1028-1034.

30. Boon T, Coulie P.G, Van den Eynde B. Tumor antigens recognized by T cells. // Immunology Today. 1997. 18(6), 267-268.

31. Borst, P. Genetic mechanisms of drug resistance. // Acta Oncol. 1991. 30, 87-101.

32. Bosh, I., and Croop, J. P-glycoprotein multidrug resistance and cancer. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. 1288, F37-F54.

33. Bosmann, HB. Mechanism of cellular drug resistance. //Nature. 1971. 233, 566-569.

34. Brada M. Bcl-2 gene: current relevance to clinical oncology. // Eur. J. Cancer, 1992, Vol.28, p.270-272.

35. Bradley, G, Naik, M, Ling, V. P-glycoprotein expression in multidrug resistant human ovarian carcinoma cell lines. // Cancer Res. 1989. 49,2790-2796.

36. Bradley, G., Juranka, P.P., and Ling, V. Mechanism of multidrug resistance // Biochim. Biophys. Acta. 1988. 948, 87-128.

37. Burt, R.K., and Thorgeirsson, S.S. Coinduction of MDR-1 multidrug-resistance and cytochrome P-450 genes in rat liver by xenobiotics. // J. Natl. Cancer Inst. 1988. 80, 13831386.

38. Butterfield L.H., Ribas A., Econovou J.S. DNA and Dendritic Cell-Based Genetic Immunization Against Cancer. // Gene Therapy of Cancer. 1999.

39. Caux C., Dezutter-Dambuyant C., Schmitt D., Banchereau J. GM-CSF and TNF-a cooperate in the generation of dendritic Langerhans cell. // Nature 1992. 360, 258-261.

40. Caux, C., Vanbervliet, В., Massacrier, C. et al. CD34+ haematopoietic progenitors from human cord blood defferentiate along two independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF + TNFoc. // Journal of Experimental Medicine. 1996.184, 695-706.

41. Caux, C., Vanbervliet, В., Massacrier, C. et al. Interleukin-3 co-operates with tumor necrosis factor alpha for the development of human dendritic/Langerhans cells from cord blood CD34+ haematopoietic progenitor cells. // Blood. 1996. 87,2376-2385.

42. Chang, EH, Pirollo, KF, Bouker, KB. Tp53 gene therapy: a key to modulating resistance to anticancer therapies? // Mol. Medicine Today. 2000. 6, 358-364

43. Chaudhary, P.M., and Roninsin, I.B. Expression and activity of P-glycoprotein, a multidrug efflux pump, in human hematopoietic stem cells. // Cell. 1991. 66, 85-94.

44. Chaudhary, P.M., and Roninsin, I.B. Activation of MDR1 (P-glycoprotein) gene expression in human cells by protein kinase С agonists // Oncol. Res. 1992. 4,281-290.

45. Chaudhary, P.M., and Ronmson, I.B. Induction of multidrug resistance in human cells by transient exposure to different chemotherapeutic drugs // J. Natl. Cancer Inst. 1993. 85, 632639.

46. Chaux P., Moutet M., Faivre J., Martin F. Inflammatory cells infiltrating human colorectal carcinoma express HLA-II but not B7-1 and B7-2 costimulatory molecules of the T-cell activation. // Lab Invest 1996. 74; 975-83.

47. Chin, K-V., Ueda, K., Pastan, I., and Gottesman, M.M. Modulation of activity of the promoter of the human MDR1 gene by Ras and p53. // Science 1992. 255, 459-462.

48. Chiou, S.K. Rao, L., and White, E. Bcl-2 blocks p53-dependent apoptosis. // Mol. Cell. Biol. 1994.14,2556-2563.

49. Chomczynski, P. and Sacchi, N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal. Biochem. 1987. 162, 156-159.

50. Clark G.J., Angel N., Kato M., Lopez A., MacDonald K., Vuckovic S., Harr D.N.J. The role of dendritic cells in the innate immune system. // Microbes and infection. 2000. 2, 257-272.

51. Coppola D., Fu L., Nicosia S.V., Kounelis S., Jonas M. Prognostic significance of p53, bcl-2, vimentin, and SI00 protein-positive Langerhans cells in endometrial carcinoma. // Hum. Pathol 1998.29; 455-62.

52. Coulie P.G., Van den Eynde BJ., Van der Bruggen P, et al. Antigens recognized by T-lymphocytes on human tumors. // Biochemical Society Transactions. 1997.25; 544-548,

53. Crook, NE, Clem, RJ, Miller, LK. An apoptosis-inhibiting baculovirus gene with a zinc finger-like motif. // J. Virol. 1993. 67, 2168-2174.

54. Cui Y, Chang LJ. (1997). Computer-assisted quantitative cytokine enzyme-linked immunospot analysis of human immune effector cell function. Biotechniques 22: 1146-1149.

55. Czerkinsky C.C, Andersson G, Ekre H.P, et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. Enumeration of gamma-interferon secreting cell.: // J Immunol Methods 1988. 110; 29-36.

56. Czerkinsky C.C, Nielsson L.A, Nygren H, Ouchterlony O, Tarkowski A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. // J Immunol Methods 1983. 65: 109-121.

57. Deveraux, QL, Reed, JC. IAP family proteins: suppressors of apoptosis. // Genes Dev. 1992. 13,239-252.

58. Dive. С. Avoidance of apoptosis as a mechanism of drug resistance. // J. Intern. Med., 242, suppl. 1997. 740, 139-145.

59. Eichbaum Q., Clerc P., Bruns G., McKeon F., Ezekowitz R.A.B. Assignment of the human macrophage monnsoe receptor gene (MRC1) to Юр 13 by in situ hybridization and PCR-based sometic cell hybrid mapping. // Genomics 1994. 22, 656-658.

60. Engering A.J., Cella M., Fluitsma D., Brockhaus M., Hoefsmit E.C.M., Lanzavecchia A., Pieters J. The mannose receptor functions as a high capacity and broad specificity antigen receptor in human dendritic cells. // Eur.J.Immunol. 1997. 27, 2417-2425.

61. Eskes R., Antonsson В., Osen-Sand A. et al. Bax-induced cytochrome с release from mitochondria is independent of the permeability transition pore but highly dependent on Mg2+ ions. // J. Cell Biol. 1998. 143,217-224.

62. Frenkel, GD, Caffrey, PB. A prevention strategy for circumventing drug resistance in cancer chemotherapy. // Current Pharmaceutical Design. 2001. 7, 1595-1614.

63. Gabrilovitch D.I., Chen H.L. Girgis K.R. et al. Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells. // Nat. Med. 1996.2; 1096-103.

64. Germann, UA, Harding, MW. Chemosensitizers to overcome and prevent multidrug resistance.//J. Natl Cancer Inst. 1995. 87, 1573-1575.

65. Geromin, D, Bourge, JF, Soulie, A, et al. Glycoprotein 170 induces platelet-activating factor receptor membrane expression and confers tumor cell hipersensitivity to NK-dependent cell lysis. // The Journal of Immunology. 2004. 172, 3604-3611.

66. Giaccia, A.J., and Kastan, M.B. The complexity of p53 modulation: emerging patterns from divergent signals. // Genes Dev. 1998. 12, 2973-2983.

67. Gong J., Chen D., Kashiwsda M., Kufe D. Induction of antitumor activity by immunuzation with fusions of dendritic and carcinoma cells. //Nature 1997. 3, 558-61.

68. Goxe В, Latour N, Chokri M, et al. Simplifieed Method to generate large quantities of dendritic cells suitable for clinical applications. Immunological Investigations. 2000. 29(3); 319-336.

69. Goxe В., Latour N., Bartholeyns J., et al. Monocyte-derived dendritic cells: development of a cellular processor for clinical applications. // Res. Immunol. 1998. 149; 643-646.

70. Gros, P., and Buschman, E. The mouse multidrug resistance gene family: structural and functional analysis. //Int. Rev. Cytol. 1993. 137, 169-197.

71. Hague A., Moorghen M., Hicks D. Et al. Bcl-2 expression in human colorectal adenomas and carcinomas. // Oncogene, 1994. 9,3367-3370.

72. Haimovitz-Friedman A., Chu-Cheng Kan, Ehleiter D. et al. Ionizing Radiation Acts on Cellular Membranes to Generate Ceramide and Initiate Apoptosis. // J.Exp.Med. 1994. 180, 525-535.

73. Hatano Т., Ohkawa K., Matsuda M. Cytotoxic effect of the protein-doxorubicin conjugates on the multidrug-resistant human Myelogenous leukemia cell line, K562, in vitro. // Tumor Biol 1993. 14:288-94.

74. Herr W, Linn B, Leister N, et al. The use of computer-assisted videi image analysis for the quantification of CD8+ T lymphocytes producing tumor necrosis factor a spots in recponse to peptide antigens. // J Immunol Methods 1997. 203; 141-52.

75. Heufler C., Koch F., Stanzl U., et. al. Interleukin-12 is produced by dendritic cells and mediates T helper 1 developments as well as interferon-gamma production by T helper 1 cells. // Eur. J. Immunol. 1996. 26,659 668.

76. Higgins, C.F. The ABC of channel regulation. // Cell. 1995. 82. 693-696.

77. Higgins, C.F., Callaghan, R., Linton, K.J., Rosenberg, M.F., and Ford, R.C. Structure of the multidrug resistance P-glycoprotein. // Sem. Cancer Biol. 1997. 8, 135-142.

78. Hill, B.T., Deucharts, K., Hosking, L.K., Ling, V., and Whelan, R.D.H. Overexpression of P-glycoprotein in mammalian tumor cell lines after fractionated X irradiation in vitro // J. Natl. Cancer Inst. 1990. 82,607-611.

79. Hockenberry D.M., Oltwai Z.N., Yin X.-M., Milliman C.L., Korsmeyer S.J. Bcl-2 Functions in an Antioxidant Pathway to Prevent Apoptosis. // Cell, 1993. 75, 241-251.

80. Huang X., Lin Т., Zhang L. et al. Combined TRAIL and Bax gene therapy prolonged survival in mice with ovarian cancer xenograft. // Gene Therapy. 2002. 9, 1379-1386.

81. Ionov Y., Yamamoto H., Krajewsky s. Mutational inactivation of the proapoptotic gene Bax confers selective advantage during tumor clonale evolution. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. 97, 10872-10877.

82. Ishida Т., Oyama Т., Carbone D.P., Gabrilovich D.I. Defective function of Langerhans cells in tumour-bearing animals is the result of defective maturation from hemopoietic progenitors. //J. Immunol. 1998. 161; 4842-51.

83. Kato M., Neil Т., Clark G., Morris C., Sorg R., Hart D.N.J. cDNA cloning of human DEC205, a putative antigen-uptake receptor of dendritic cells. // Immunogenetics. 1998. 47, 442-450.

84. Klinman, DM. Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. // Immunology. 2004. 4, 249-258.

85. Kren, L, Brazdil, J, Hermanova, M, et al. Prognostic Significance of Anti-Apoptosis Proteins Survivin and bcl-2 in Non-Small Cell Lung Carcinomas. // Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 2003.

86. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. 227,680-685.

87. LeBlanc H., Lawrence D., Varfolomeev E. Et al Tumor-cell resistance to death receptor-induced apoptosis through mutational inactivation of the proapoptotic Bcl-2 homolog Bax. // Nature Med. 2002. 8(3), 274 280.

88. Lewis JJ, Janetzki S, Wang S, et al. Phase I trial of vaccination with tyrosinase peptide plus QS-21 in melanoma (Abstract 1950). // J Clin Oncol 1998, 17.

89. Lindauer M., Stanislawski Th., Hubler A. et al. The molecular basic of cancer immunotherapy by cytotoxic T lymphocytes. // J. Mol. Med. 1998. 76; 32-47.

90. Lindauer M., Stanislawski Th., Hubler A. et al. The molecular basic of cancer immunotherapy by cytotoxic T lymphocytes. // J. Mol. Med. 1998. 76, 32-47.

91. List, A.F. Role of multidrug resistance and its pharmacological modulation in acute myeloid leukemia//Leukemia. 1996. 10, 937-942.

92. Liu Y-J, Kanzler H., Soumelis V. Gilliet M. Dendritic cell lineage, plasticity and cross-regulation. Nature immunol. 2001,2, 585-589.

93. Liu, K, Iyoda, T, Satemus, M, et al. Immune tolerance after delivery of dying cells to dendritic cells in situ. //J Exp Med. 2002. 196,1091-1097.

94. Lotem J., Sachs L. Hematopoietic Cytokines Inhibit Apoptosis Induced by Transforming Growth Factor pi and Cancer Chemotherapy Compounds in Myeloid Leukemia Cells. // Blood. 1992. 80, 1750-1757.

95. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randal R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. 1951.193,265-275.

96. Mannering S.I., McKenzie J.L., Hart D.N.J. Optimisation of the conditions for generating human DC initiated primary antigen specific T lymphocyte lines in vitro. // J.Immunol.Methods. 1998. 219, 69-83.

97. Mazzoni, A., Segal, DM. Controlling the Toll road todendritic cell polarization. // Journal of Leukocyte Biol. 2004.75, 721-730.

98. McDonnell T.J., Troncoso P., Brisbay S.M. et al. Expression of the protooncogene bcl-2 in the prostate and its association with emergence of androgen-independent prostate cancer. // Cancer Res. 1992. 52, 6940-6944.

99. Mednat A, Shehata M, Bucci K, et al. Increased interleukin-4 and interleukin-5 production in response to Schistosoma haematobium abult worm antigens correlates with lack of reinfection after treatment. // J Infect Dis 1998. 178; 512-19.

100. Menetrier-Caux С., Montmain G., Dieu M.C. et al. Inhibition of the differentiation of dendritic cells from CD34 (+) progenitors by tumor cells: Role of interleukin-6 and macrophage colonystimulating factor. // Blood. 1998. 92; 4778-91.

101. Mickley, LA, Bates, SE, Richert ND. Modulation of the expression of a multidrag resistance gene (mdr-l/P-glycoprotein) by differentiating agents. // J. Biol. Chem. 1989. 264, 18031-18040

102. Miltenyi S, Muller W, Weichel W, Radbruch A (). High gradient magnetic cell separation with MACS. // Cytometry. 1990. 11,231-238.

103. Miyahira Y, Murata K, Rodriguez D, et al. Quantification of antigen specific CD8+ T cells using an ELISPOT assay. //J Immunol Methods 1995. 181; 45-54.

104. Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells (Roninson, I.B., ed.), 1990, Plenum Press, N.Y. London.

105. Moro, R, Tamaoki, T, Wegmann, TG, et al. Monoclonal antibodies directed against a widespread oncofetal antigen: The Alpha-Fetoprotein Receptor. //.Tumor Biol. 1993.14, 116130.

106. Morse M.A., Lyerly H.K. Immunotherapy of cancer using dendritic cells. // Cytokines, Cellular & Molecular Therapy. 1998. 4., 35-44.

107. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. // J Immunol. Meth. 1983. 65, 55-63.

108. Muller, MR, Brossart, P. Dendritic cell-based cancer immunotherapy. // Mod. Asp. Immunobiol. 2002. 2, 141-144.

109. Nair S.K. et al. Induction of primary carcinoembryonic antigen (CEA)-specific cytotoxic T lymphocytes in vitro using human dendritic cells transfected with RNA. // Nature Biotechnol. 1998. 16; 364-369.

110. Nair S.K., Heiser A., Boczkowski D. et al. Induction of cytotoxic T cell responses and tumor immunity against unrelated tumors using telomerase reverse transcriptase RNA transfected dendritic cells. // Nature Medicine, 2000. 6(8), September.

111. Nauman U., Weller. M. Retroviral В AX gene transfer fails to sensitise malignant glioma cells to CD95L-induced apoptosis and cancer chemotherapy. // Int. J. Cancer. 1998. 77, 645648.

112. Nicola M.D., Anichini A., Mortarini R. et al. Human dendritic cells: Natural adjuvants in antitumor immunotherapy. // Cytokinas, Cellular & Molecular Therapy 1998. 4, 265-273.

113. Nordstrom I, Ferrua D. Q. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. II. Enumeration of interleukin-l-secreting cells amplified (avidin-biotin anti-peroxidase) assay. // J Immunol Methods 1992. 150; 199-206.

114. Oehler L, Berer A, Keil F, Weinlander G, et al. Genetation of Dendritic Cells from Human Chronic Myelomonocytic Leukemia Cells in Fetal Calf Serum-Free Medium. // Leukemia and Lymphoma. 2000. 38(5-6), 577-586.

115. Ohkawa K, Hatano T, Tsukada Y, et al. Chemotherapeutic efficacy of the protein-doxorubicin conjugates on multidrug resistant rat hepatoma cell line in vitro. // Br. J. Cancer 1993. 67: 274-8.

116. Ohkawa K., Hatano Т., Yamada K., et al. Bovine serum albumin-doxorubicin conjugate overcomes multidrug resistance in a rat hepatoma. // Cancer Res. 1993. 53: 4238-42.

117. Ojima, I, Bounaud, P-Y, Oderda, CF. Recent strategies for the treatment of multi-drug resistance in cancer cells. // Exp. Opin. Ther. Patents. 1998. 8,1587-1598.

118. Palucka K.A, Taquet N, Sanchez-Chapuis F, Claude Gluckman J. Dendritic Cells as the Terminal Stage of Monocyte Differectiation: //The Journal of Immunology, 1998. 160; 45874595.

119. Pass H.A, Schwarz S.L, Wunderlich J.R, Rosenberg S.A. Immunization of patients with melanoma peptides vaccines: immunologic assessment using the ELISPOT assay. // Cancer J Sci Am 1998. 4; 316-23.

120. Pepper C., Bentley P., Hoy T. Regulation of clinical chemoresistance by bcl-2 and bax oncoproteins in B-cell chronic lymphocytic leukaemia. // Brit. J. Haem. 1996. 95, 513-517.

121. Pezzella F., Turley H., Keizer I. Et al. Bcl-2 protein in non-small-cell carcinoma. // N. Engl. J. Med. 1993. 329,690-694.

122. Prigozy T.I., Sieling P.A., Clemens D., Stewart P.L. et al. The mannose receptor delivers lipoglycan antigens to endosomes for presentation to T cells by CD lb molecules. // Immunity 1997. 6, 187-197.

123. Reed J.C. Bcl-2 family proteins strategies for overcoming chemoresistance in cancer. // Advanced in pharmacology, 1997.41, 501-533.

124. Reeves M.E., Royal R.E., Lam J.S. et al. Retroviral transduction of human dendritic cells with tumop-associated gene. // Cancer Res 1996. 56; 5672-7.

125. Reid C.D.L. Dendritic cells and immunotherapy for malignant disease. // British J. Haematol. 2001. 112, 874-887.

126. Reid, C., Fryer, P., Clifford, C. et al. Identification of haematopoietic progenitors of macrophages and dendritic Langerhans cells (DL-CFU) in human bone marrow and peripheral blood. // Blood. 1990. 76, 1139-1149.

127. Reynolds S.R, Oratz R, Shapiro R.L, et al. Stimulation of CD+ T cell responses to MAGE-3 and Melay A/MART-1 by immunization to a polyvalent melanoma vaccine. // Int J Cancer 1997. 72; 972-6.

128. Rice W.G., Hillyer C.D., Harten В., SchaefFer C.A. et al. Induction of endonuclease-mediated apoptosis in tumor cells by C-nitroso-substituted ligands of poly(ADP-ribose) polymerase. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1992. 89, 7703-7707.

129. Ridgway D. The first 1000 dendritic cell vaccines. // Cancer Investigation, 2003. 21, 6, 873-886.

130. Rinderknecht H. Ultra-rapid fluorescent labelling of proteins. // Nature. 1962. 193, 167.

131. Robbins PF, Kawakami Y. Human tumor antigens recognized by cells. // Current Opinion in Immunology 1996.8; 628-636.

132. Romani, N., Gruner, S., Bran, D. et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. //Journal of Experimental Medicine. 1994. 180, 83-93.

133. Romero P, Cerottini J-C, Waanders G.A. Novel methods to monitor antigen-specific cytotoxic T-cell responses in cancer immunotherapy. // Mol Med Today 1998. 4, 305-312.

134. Romero P., Pittet M., Dutoit V. Therapeutic cancer vaccines based on molecularly defined human tumor antigens. // Vaccine. 2002. 20, A2-A7.

135. Sakuragi N., Ohkouchi Т., Hareyama H. Et al. Bcl-2 expression and prognosis of patients with endometrial carcinoma. // Int. J. Cancer, 1998. 79,153-158.

136. Salgaller M.L., Lodge P.A., McLean J.G.,et al. Report of Immune Monitoring of Prostate Cancer Patients Undergoing T-Cell Therapy Using Dendritic Cells Pulsed With HLA-A2

137. Specific Peptides From Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA). // The Prostate 1998. 35; 144-151.

138. Salgaller ML. Monitoring of cancer patients undergoing active or passive immunotherapy. // J. Immunother; 1997. 20; 1-14.

139. Salter R.D., Howell D.N., Cresswell P. Genes regulating HLA cass I antigen expression in T-B lymphoblast hybrids.// Immunogenetics. 1985. 21,235.

140. Sandor, V., Wilson W., Fojo, Т., and Bates, S.E. The role of MDR-1 in refractory lymphoma. // Leuk Lymphoma. 1997. 28 (1-2), 23-31.

141. Santiago-Schwarz, F., Belilos, E., Diamond, B. et al. TNF in combination with GM-CSF enhances the differentiation of neonatal cord blood stem cells into dendritic cells and macrophages. // Journal of Leukocyte Biology. 1992. 52, 274-281.

142. Sawa H., Kobayashi T, Mukai K. et al. Bax overexpression of enhances cytochrome с release from mitochondria and sensitizes KATOIII gastric cells to chemotherapeutic agent-induced apoptosis.// Intern. J. Oncol. 2000.16,745-749.

143. Schakel K, Mayer E.l, Federle Ch, et al A novel dendritic cell population in human blood: one-step immunomagnetic isolation by a specific mAb (M-DC8) and in vitro priming of cytotoxic T lymphocytes. // Eur. J Immunol. 1998.28; 4084-4093.

144. Scheibenbogen C, Schmihel A, Keilholz U, et al. Phase II trial of vaccination with tyrosinase peptides and GM-CSF in melanoma. // J Immunother in press. 1998.

145. Schinkel, A.H. The physiological function of drug-transporting P-glycoproteins. // Sem. Cancer Biol. 1998. 8, 161-170.

146. Schmid D.S, Thieme M.L, Gary H.E Jr, Reeves W.C. Characterization of T cell response to herpes simplex virus type 1 (HSV-1) and herpes simplex virus type 2 (HSV-2) using a TNF-beta ELISPOT cytokine assay. // Arch Virol. 1997. 142; 1659-71.

147. Schmittel A, Keilholz U, Scheibenbogen C. Evaluation of the interferon-g ELISPOT -assay for qualification of peptide-specific Ту lymphocytes from peripheral blood. // J Immunol Methods. 1997.210; 167-74.

148. Severin, SE, Kanevski, VY, Sologub, VK, et al. The purification of human alpha-fetoprotein receptor from fetal and cancerous tissues. // Presented at the XXII Meeting of the ISOBM, Groningen. 1994.

149. Seya, T, Acazawa, T, Uehori, J, et al. Role of Toll-like Receptors and their Adaptors in Adjuvant Immunotherapy for Cancer. // Anticancer Res. 2003. 23. 4369-4376.

150. Shinoura N., Saito K., Yoshida Y. et al. Adenovirus-mediated transfer of Bax with caspase-8 controlled by myelin basic protein promoter exerts an enhanced cytotoxic effect in gliomas.//Cancer Gene Ther. 2000. 7, 739-748.

151. Shtil, AA, Turner, JG, Durfee, J. Cytokine-based tumor cell vaccine is equally effective against parental and isogenic multidrug- resistance myeloma cells: the role of cytotoxic T lymphocytes.//Blood. 1999. 93,1831-1837.

152. Silvestrini R., Veneroni S., Daidone M.G. et al. The Bcl-2 protein: a prognostic indicator strongly related to p53 protein in lymphnode negative breast cancer patients. // J. Natl. Cancer Inst. 1994. 86,499-504.

153. Simon, S.M., and Schindler, M. Cell biological mechanisms of multidrug resistance in tumors. // Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1994. 91. 3497-3504.

154. Smit, J.J.M., Schinkel, A.H., Oude Ellerink, R.P.J., et al. Homozygous disruption of the murine mdr2 P-glycoprotein gene leads to a complete absence of phospholipid from bile and to liver disease. // Cell. 1993. 75,451-462.

155. Stalder Т., Hahn S., Erb P. Fas Antigen Is the Major Target Molecule for T Cell-Mediated Cytotoxicity. // J.Immunol. 1994. 152, 1127-1133.

156. Steinbach F, Krause D, et al (). Development of accessory phenotype and Function during the differentiation of monocyte-derived dendritic cells. // Res. Immunol. 1998. 149; 627-632.

157. Stockwin L.H., McGonagle D., Martin I.G., Blair G.E. Dendritic cells: Immunological sentinels with a central role in health and disease. // Immunology and Cell Biology 2000. 78; 91-102.

158. Takimoto R, Wang W, Dicker DT,. The mutant p53-conformation modifying drug, CP-31398, can induce apoptosis of human cancer cells and can stabilize wild-type p53 protein. // Cancer Biol Ther. 2002. Jan-Feb;l(l):47-55.

159. Tan, M.C., Mommaas, AM, Drijhout, J.W. et al. Mannose receptor-mediated uptake of antigens strongly enhances HLA class 11-restricted antigen presentation by cultured dendritic cells. // Eur. J.Immunol. 1997. 27,2426-2435.

160. Tanguay S, Killion J.J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. // Lymphokine and Cytokine Research 1994. 4; 259-263.

161. Teeter, L.D., Ecksberg, Т., Tsai, Y., and Kuo, K.T. Analysis of the Chinese hamster P-glycoprotein/multidrug resistance gene pgpl reveals that the AP-1 site is essential for full promoter activity. // Cell Growth Differ. 1991.2,429-437.

162. Thurner, B, Roder, C, Dieckmann, D, et al. Generation of large numbers of fully mature and stable dendritic cells from leukapheresis products for clinical application. // J. Immunol. Methods. 1993.223,1-15.

163. Tian Q., Streuli M., Saito H., Schlossman S.F., Andersson P. A Polyadenylate Binding Protein Localized to the Granules of Cytolytic Lymphocytes Induces DNA Fragmentation in Target Cells. // Cell. 1991. 67, 629-639.

164. Titzer S., Christensen O., Manzke O., et al. Vaccination of multiple myeloma patients with idiotype-pulsed dendritic cells: immunological and clinical aspects. // British Journal of Hematology 2000. 8. 805-816.

165. Torres, JM, Geuskens, M, Uriel, J. Activated human T lymphocytes express albumin binding proteins which cross-react with alpha-fetoprotein. // Eur J Cell Biol. 1992. 2, 222228.

166. Toungouz M, Quinet C, Thille E et al Generation of immature autologous clinical grade dendritic cells for vaccination of cancer patients. // Cytotherapy 1999. 6, 447-453.

167. Tron V.A., Krajewski S., Klein-Parker H., Li et al. Immunohistochemical analysis of Bcl-2 protein regulation in cutaneous melanoma. // Am. J. Pathol. 1995.146, 643-650.

168. Tsang K.Y, Zaremba S, Nieroda C.A, et al. Generation of human cytoloxic N cells specific for human carcinoembryonic antigen epitopes from patients immunized with recombinant vaccinia-CEA vaccine. // J. Natl. Cane. Inst. 1995. 87; 982-90.

169. Tsujitani S., Kakeji Y., Maehara Y, Sugimachi K., Kaibara N. Dendritic cells prevent lymph node metastasis in patients with gastric cancer. // In Vivo 1993. 7; 233-7.

170. Tsuruo Т., Hamada H., Sato S., et al. Inhibition of multidrug-resistant human tumor growth in athymic mice by anti-P-glicoprotein monoclonal antibodies. // Jpn. J. Cancer Res. 1989. 80: 627-31.

171. Tsuruta Y., Mandai M., Konishi I., et. al. Combination effect of adenovirus-mediated proapoptotic bax gene transfer with cisplatin or paclitaxel treatment in ovarian cancer cell lines. //European J. Cancer. 2001. 37, 531-541.

172. Ueda, K., Pastan, I., and Gottesman, M.M. Isolation and sequence of the promoter region of the human multidrug-resistance (P-glycoprotein) gene. // J. Biol. Chem. 1987. 268, 1743217436.

173. Van den Eynde B.J., T.Boon. Tumor antigens recognized by T lymphocyties. // Int. J. Clin. Lab. Res. 1997.81,81 -86.

174. Weber J.S, Spears L, Jeffery G, et al. A phase I trial of a MART-1 HLA-A2 restricted peptide vaccine for resected high risk melanoma (Abstract 1676). // J Clin Oncol 1998. 17.

175. Williams G.T., Smith C.A., Spooncer E., Dexter T.M, Taylor D.R. Haemopoietic colony stimulating factors promote cell survival by suppressing apoptosis. // Nature. 1990. 343, 7679.

176. Wittke F., Hoffmann R., Buer J. et al. Interleukin 10 (IL-10): An Immunosuppressive factor and independent predictor in patients with metastatic renal cell carcinoma. // Br. J. Cancer 1997. 79; 1182-4.

177. Xiang J., Gomez-Navarro J., Arafat W. et al. Pro-apoptotic treatment with an adenovirus encoding Bax enchances the effect of chemotherapy in ovarian cancer.// J. Gene Medicine. 2000. 2. 97-106.

178. Xiang J., Piche A., Rancourt C., et al. An inducible recombinant adenoviral vector ancoding Bax selectively induces apoptosis in ovarian cancer cells. // Tumor targeting. 1999. 4. 84-91.

179. Xun Li, J.Gong, E.Feldman et al. Apoptotic cell death during treatment of leukemias. // Leuk.Lymph. 1994. 13:Suppl.l, 65-70.

180. Zeid N.A., Muller H.K. SI00 positive dendritic cells in human lung tumours associated with cell differentiation and enhanced survival. // Pathology 1993. 25; 338-43.

181. Zhang, X, Gordon, JR, Xiang, J. Advances in dendritic cell-based vaccine of cancer. // Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 2002. 6, 601-619.

182. Zheleznova, E.E., Markham, P.M., Neyfakh, A.A., and Brennen, R.G. Structural basis of multidrug recognition by BmrR, a transcription activator of a multidrug transporter. // Cell. 96, 353-362

183. Zvaifler, NJ, Marinova-Mutafchieva, L, Adams, G, et al. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals. // Arthritis Res. 2000. 2, 477-488.

Информация о работе

Родина, Алла Валерьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Изучение чувствительности опухолевых клеток человека к действию цитотоксических лимфоцитов, индуцированных дендритными клетками - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изучение чувствительности опухолевых клеток человека к действию цитотоксических лимфоцитов, индуцированных дендритными клетками - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы