Изучение биомаркеров метаболизма омега-3 и омега-6 полиненасыщенных жирных кислот у детей и беременных женщин

Шилина, Наталия Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение биомаркеров метаболизма омега-3 и омега-6 полиненасыщенных жирных кислот у детей и беременных женщин
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение биомаркеров метаболизма омега-3 и омега-6 полиненасыщенных жирных кислот у детей и беременных женщин"

На правах рукописи

ШИЛИНА НАТАЛИЯ МИХАЙЛОВНА

ИЗУЧЕНИЕ БИОМАРКЕРОВ МЕТАБОЛИЗМА ю-З и со-6 ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ У ДЕТЕЙ И БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 1 ОКТ 2012

Москва-2012

005053024

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательском институте питания» Российской академии медицинских наук

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Конь Игорь Яковлевич

Официальные оппоненты: Северин Евгений Сергеевич

доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН, ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», профессор кафедры биоорганической химии Биологического факультета

Яровая Галина Алексеевна

доктор биологических наук, профессор, ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздравсоцразвития России, заведующая кафедрой биохимии, декан Медико-биологического факультета

Терентьев Александр Александрович

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Минздравсоцразвития России, заведующий кафедрой биохимии Лечебного факультета

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»

Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится «22» октября 2012 г. в 14 часов на заседании Диссетрационного совета Д 001.002.01 при ФГБУ «НИИ питания» РАМН по адресу: г. Москва, Устьинский проезд, 2/14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ питания» РАМН по адресу: г. Москва, Устьинский проезд, 2/14.

Автореферат разослан «_»_20 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Коденцова Вера Митрофановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), принадлежащие к числу незаменимых факторов питания, служат предметом значительного внимания исследователей как в нашей стране (Левачев М.М., 2002, Тутельян В.А., Погожева A.B., 2000), так и за рубежом (Koletzko В., 1997, 2001, Carlson S., 1997, Calder P., 2001, Uauy R., 2002, 2009). За два последних десятилетия накоплен большой объем научных данных, указывающих на важную роль этих соединений в реализации многочисленных физиологических и биохимических процессов в организме в норме и при патологических состояниях. К их числу относятся: формирование иммунного статуса, воспалительные реакции, регуляция системы гемостаза, под держание тонуса сосудов и гладкой мускулатуры, процессы роста, когнитивные функции.

Изучены многие стороны метаболических превращений ПНЖК, лежащих в основе указанных процессов. В то же время, ряд путей метаболизма жирных кислот и, особенно, взаимодействие этих путей, в значительной мере определяющее их функциональные эффекты, остаются малоизученными. Это, в частности, относится к участию ПНЖК в процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты, образовании различных классов эйкозаноидов и построении и функционировании биомембран. Изучение взаимодействия этих путей представляет особый интерес с точки зрения поиска новых биомаркеров метаболизма ПНЖК у детей и беременных женщин.

Роль ПНЖК в процессах ПОЛ в течение многих лет обоснованно связывалась с их функцией как субстратов ПОЛ (Семенов H.H., 1956, Эммануэль Н.М., 1958 , Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972, Тутельян В.А., 2003, 2009, и др.). Вместе с тем, в литературе имеются единичные указания на их возможное антиоксидантное действие (Бурлакова Е.Б., 1975, Dormandy S., 1983, Budovsky, 1996, Храпова Н.В., 1997, Сторожок Н.Б., 2000, Погожева A.B., 2000, King V.R., 2006, Leung, 2006). В связи с этим возникает вопрос о возможной роли длинноцепочечных (ДЦ) ПНЖК в формировании антиоксидантной активности (АОА) крови. С этой точки зрения значительный интерес представляет изучение АОА и химического состава отдельных хроматографических фракций сыворотки крови, в которых возможно присутствуют ДЦ ПНЖК, а также параллельная клинико-биохимическая оценка показателей ПОЛ, АОА и жирнокислотного состава плазмы крови у беременных женщин и недоношенных детей.

роста (Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П., 1975, Скулачев В.П., 1999, Henry P.D., 2000, Pierce G.N., 2004, 2010). В связи с этим целесообразно проведение исследования возрастной динамики АОА крови у человека и экспериментальных животных, а также изучение возможной связи между АОА крови и показателями клеточной пролиферации в тканях животных.

В многочисленных работах установлены пути образования из ю-6 и ю-3 ПНЖК различных серий одного из видов эйкозаноидов — лейкотриенов (ЛТ) (Lee T.N. et al., 1985, Okamoto M. et al., 2000). Эти исследования ограничены, однако, изучением, преимущественно, ЛТ 4-й серии, тогда как ЛТ 5-й серии остаются изученными недостаточно. При этом изучение образования ЛТ у детей проведено лишь в немногочисленных исследованиях, посвященных оценке продукции ЛТ 4-й серии при некоторых патологических состояниях. В то же время, спектр ЛТ у здоровых детей остается практически неизученным. В связи с этим представляется важным провести детальный анализ всего спектра ЛТ как 4-й, так и 5-й серии у условно здоровых детей, а также у детей с бронхиальной астмой и ожирением. При этом особого внимания заслуживает вьивление возможной корреляции между уровнем ПОЛ/АОА и продукцией ЛТ как двух альтернативных путей метаболизма ПНЖК у человека.

Как было уже упомянуто, ПНЖК принимают участие в регуляции процессов воспаления в качестве субстратов ПОЛ и предшественников ЛТ, что сопровождается значительным расходом этих соединений. В то же время, ПНЖК входят в состав фосфолипидов клеточных мембран (КМ) и в значительной мере определяют их структурные и функциональные свойства (Uauy R., 2002, Северин Е.С., 2005). В связи с этим представляется целесообразным изучение возможных изменений спектра жирных кислот (ЖК) КМ у детей при различных видах воспалительных заболеваний, относящихся к числу распространенной патологии детского возраста, характеризующейся тяжелым хроническим течением. При этом представляло интерес сравнить ЖК КМ крови (эритроцитов, лейкоцитов) у детей при двух видах воспаления (аллергическом и альтеративно-экссудативном).

Изучение указанных биохимических показателей (МДА, АОА, ЛТ и ЖК состав крови) представляется важным не только с позиций решения фундаментальных задач биохимии, но и с позиций проблемы расширения спектра биомаркеров как скрининговых показателей различных метаболических процессов в норме и при патологии. В связи с этим представляло интерес изучить возможность использования указанных трех групп показателей в качестве биомаркеров метаболизма ю-3 и ю-6 ПНЖК в организме детей и беременных женщин.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР НИИ питания РАМН в рамках тем №051 «Обоснование оптимального белкового и липидного компонентов рационов питания для детей различных возрастных групп» и № 074 «Разработка системы диагностики, профилактики и лечения ожирения у детей раннего, дошкольного и школьного возраста».

Цель и задачи исследования:

Цель: Изучение роли длинноцепочечных ПНЖК в формировании антиоксидантной системы и соотношения основных путей метаболизма ПНЖК: процессов ПОЛ, участия в построении клеточных мембран и образования лейкотриенов в крови детей и беременных женщин.

Задачи:

1. Изучить роль ш-3 и со-6 ПНЖК в формировании антиоксидантной системы (АОС) крови у взрослых мужчин и женщин и у детей.

2. Исследовать особенности участия ш-3 и ш-6 ПНЖК в формировании антиоксидантного потенциала у беременных женщин (при физиологически протекающей беременности и преэклампсии (ПЭ)) и у недоношенных детей.

3. Исследовать возрастную динамику АОА крови у детей и экспериментальных животных и оценить возможную роль АОА крови в процессах клеточной пролиферации.

4. Провести параллельное изучение интенсивности ПОЛ, уровня АОА и образования лейкотриенов крови в норме и при патологии (бронхиальной астме, ожирении).

5. Изучить состав жирных кислот клеточных мембран в норме и при воспалительных заболеваниях органов желудочно-кишечного тракта и бронхиальной астме.

Научная новизна исследования

Впервые доказана важная роль высокомолекулярного липопротеинового комплекса, содержащего длинноцепочечные ш-3 и ш-6 ПНЖК, в формировании антиоксидантного (АО) потенциала крови. Установлено, что АОА сыворотки крови максимальна в раннем возрасте у детей и экспериментальных животных и коррелирует со скоростью клеточной пролиферации. Показано, что обогащение рациона беременных женщин с ПЭ ш-3 ПНЖК увеличивает уровень АОА их крови и подавляет ПОЛ, повышенное при ПЭ. Впервые доказано, что соотношение различных видов ЛТ у детей в норме и при патологии меняется при изменении в организме уровня ш-3 ПНЖК. Установлено существование реципрокных отношений между ЛТ различных серий (4-й и 5-й) и различных видов (В, С, Д, Е). Недостаточный уровень в организме детей ш-6 ПНЖК вследствие их сниженного поступления (недоношенные дети) или повышенного расхода на образование

провоспалительных эйкозаноидов (бронхиальная астма) сопровождается снижением уровня ПОЛ, а обогащение их рациона ПНЖК приводит к нормализации уровня ПОЛ. На основании параллельного изучения ПОЛ, АОА и образования ЛТ сформулировано положение о реципрокности метаболических превращений ПНЖК. Впервые установлено, что различные виды воспаления - альтеративно-экссудативное и аллергическое, а также состояние недоношенности у детей вызывают сходные изменения в составе различных типов КМ (эритроцитов и лейкоцитов) и в плазме крови, заключающиеся в накоплении в них эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК), снижении докозагексаеновой кислоты (ДГК) со-3 и общего уровня ш-6 ПНЖК. На основании результатов исследования показана возможность использования указанных трех групп показателей (ПОЛ/АОА, лейкотриены, жирнокислотный состав биомембран) в качестве биомаркеров метаболизма ПНЖК.

Научно-практическое значение работы

Выявленный в работе факт взаимодействия трех исследованных путей метаболизма ПНЖК (участие в формировании АОС и регуляции ПОЛ, образование ЛТ и построение биомембран), позволивший сформулировать положение об их реципрокности, открывает новые направления в изучении особенностей биохимической регуляции этих соединений в организме. Не описанный ранее феномен накопления в крови ЭПК в сочетании со снижением уровня ДГК и со-6 ПНЖК при патологических состояниях у детей вносит новые представления в концепцию патогенеза этих состояний. Обнаружение АО свойств у ДЦ ПНЖК расширяет спектр известных к настоящему времени АО факторов и указывает на перспективность использования этих соединений в клинической практике. Полученные данные раскрывают новые стороны метаболизма ПНЖК и могут способствовать пониманию их физиологической роли у детей, а также служат теоретической основой для разработки новых подходов к диетотерапии болезней детского возраста. Данные о положительных эффектах обогащения рациона беременных женщин со-3 ПНЖК используются в комплексной терапии ПЭ у беременных женщин.

Апробация диссертации

Результаты работы были доложены на Всероссийских и международных конференциях: Y и VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 1998, 2002); Y и YII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998, 2000); Y Конгрессе педиатров России (Москва, 1999), International Congress of Pediatrics (Амстердам, Нидерланды, 1998), Международном симпозиуме "Питание XXI века. Медико-биологические аспекты, пути оптимизации" (Владивосток, 1999), Международном семинаре

"Проблемы беременности высокого риска" (Москва, 1999); I Всероссийском Конгрессе с международным участием "Питание детей: XXI век" (Москва, 2000); II российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2002); YII Всероссийском Конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва, 2003); Second International Symposium on Trace Elements and Minerals in Medicine and Biology (Мюнхен, Германия, 2004); 38th, 42th, 44th Annual Meetings of the European Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (ESPGHAN) (Порто, Португалия, 2005; Будапешт, Венгрия, 2009; Сорренто, Италия, 2011); Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), I Всероссийском съезде диетологов и нутрициологов «Диетология: проблемы и горизонты» (Москва, 2006); конгрессе «Внутриутробный ребенок и общество. Роль перинатальной психологии в акушерстве, неонатологии, психотерапии, психологии и социологии» (Москва, 2007); 10th European Nutrition Conference (Париж, Франция, 2007); World Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (Сан-Паоло, Бразилия, 2008); IX, X, XI, XII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2007, 2008, 2009, 2010).

Публикации и внедрение в практику

По теме диссертации опубликовано 64 работы, из них 19 публикаций - в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, другие издания - 10 публикаций, материалы научных конференций - 35 публикаций, 1 методические рекомендации, 4 главы в коллективных монографиях. Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры питания детей и подростков ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (361 ссылка). Объем работы составляет 289 страниц, содержит 61 рисунок и 34 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Отбор и обследование больных проведены врачами на базе отделения педиатрической гастроэнтерологии, гепатологии и диетологии ФГБУ «НИИ питания» РАМН, ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России, отделения пульмонологии ФГБУ «Московский НИИ педиатрии

и детской хирургии» Минздравсоцразвития России, детского клинического санатория «Малаховка», отделения недоношенных родильного дома ДГКБ №8; ДГКБ №13 им. Н.Ф. Филатова, родильного дома №6 ЦАО г. Москва, женской консультации при поликлинике №54 ЮАО г. Москва и родильных домов г.г. Рязань, Люберцы.

Всего в исследовании приняло участие 672 человека, в числе которых 441 ребенок в возрасте от 0 до 18 лет, 201 беременная женщина, 30 взрослых добровольцев; экспериментальные исследования выполнены на 30 крысах линии Вистар. Всего проанализировано 5860 биологических образцов с использованием следующих методов.

1. Хроматографические методы.

Гелъ-филътраиию сыворотки крови человека на колонке с «Sephadex G-200» (1,6x69 см, объем 138 мл, скорость элюирования 30 мл/час) фирмы "Amersham Biotech Pharmacia", Швеция, и эксклюзионную хроматографию на колонках "Superóse б" (1x30 см, скорость элюирования - 2 мл/мин) той же фирмы и «TSK-GEL G4000 SW» (2,1x60 см, скорость элюирования - 4 мл/мин) фирмы "Tosoh Bioscience", Япония, проводили, используя образцы объединенного пула сыворотки крови от здоровых взрослых добровольцев 20-40 лет, и пуповинной крови детей из родильных домов г.г. Москвы, Рязани, Люберец, хранившихся при -18 С до момента исследования. Элюцию фракций проводили 10 мМ трис-HCl буфером, рН 7,5, с 0,15 М NaCl). Колонки предварительно были откалиброваны по стандартным водорастворимым глобулярным белкам.

2. Методы определения A OA в крови и ее хроматографических фракциях.

Определение АО А сыворотки (плазмы) крови в системе Fe2*'зависимого ПОЛ,

инициированного в липосомах липопротеинов яичного желтка. Суммарную АОА сыворотки крови (в относительных единицах) определяли по методу Клебанова и др., 1988, основанному на оценке способности сыворотки крови к подавлению Ре2+-зависимого ПОЛ в желточных липопротеинах (ЖЛП) in vitro, в собственной модификации. ПОЛ инициировали в суспензии ЖЛП, добавляя эту суспензию к смеси, содержащей 10 мМ трис-HCl (рН 7,5) и 20 мМ FeíSOí. Для подавления индуцированного ПОЛ в пробы добавляли аликвоты сыворотки крови. Смесь инкубировали 1 ч при 37°С, после чего в пробы добавляли 0,25М ЭДТА, 50% трихлоруксусную кислоту и центрифугировали 15 мин при 1600 g. К надосадку добавляли 0,9% тиобарбитуровую кислоту (ТЕК) и инкубировали пробы в течение 15 мин при 100°С, после чего в надосадочной жидкости определяли содержание ТБК-активных продуктов (МДА) спектрофотометрически (при 532 нм). Уровень суммарной АОА крови (в относительных единицах) рассчитывали как отношение А532 в пробах, не содержащих сыворотку крови, к А532 в пробах с сывороткой крови.

Для исследования АОА фракций, полученных при разделении сыворотки крови на

«SEPHADEX G-200», отбирали по 1 мл фракций; при разделении сыворотки крови на «SUPEROSE 6» и «TSK-GEL G4000 SW» - по 300 мкл фракций и исследовали АОА как описано выше.

Определение АОА методом TAS (Total Antioxidant Status). Общую AO емкость сыворотки (плазмы) крови определяли в модельной системе TAS с использованием набора RANDOX TAS (Randox Laboratories, Великобритания). Метод основан на торможении внесенными антиоксидантами образования окрашенного стабильного радикала ABTS + (2,2'-азино-ди-(3-этилбензтиазолина сульфонат)) в смеси АВТЭ-метмиоглобин-НгОг (Miller N.J. et al., 1993).

Определение АОА с помощью оценки окисления метилолеата манометрическим методом. Свободно-радикальное окисление (СРО) инициировали с помощью термического разложения азобисизобутиронитрила (АИБН), (6x10"4 моль/л). АОА рассчитывали как отношение разности периодов индукции в опыте и в контроле (Дт=топ - тк) к периоду

ИНДУКЦИИ КОНТРОЛЯ Тк.

3. Определение МДА в сыворотке (плазме) крови людей и экспериментальных животных проводили по методу Кагана В.Е. и соавт., 1986, Wade C.R. et al., 1988, в собственной модификации. Для определения МДА к 10-100 мкл сыворотки (плазмы) крови в физиологическом растворе прибавляли 50% ТХУ, центрифугировали 15 мин при 855 g, отбирали 2 мл супернатанта, добавляли к нему 35 мМ FcCb и 0,6% ТБК в 50% уксусной кислоте. Пробы инкубировали 20 мин при 100°С, затем охлаждали, добавляли 4 мл п-бутанола, перемешивали и центрифугировали 20 мин при 855 g. В органической фракции измеряли флуоресценцию на флуориметре "Perkin Elmer", Xi=515 нм, >.2=553 нм. Интенсивность флуоресценции сравнивали с таковой стандарта - 1,1,3,3 тетраэтоксипропана ("Sigma", США). Содержание МДА в сыворотке крови выражали в нмоль/мл.

4. Определение белка в сыворотке крови и во фракциях проводили по методу Spector Т., 1978, сКумасси G-250.

5. Определение содержания в сыворотке крови и хроматографических фракциях трансфеурина. иерулоплазмина. ачъфа-фетопротеина, аполипопротеинов ano Alu ano В. Содержание трансферрина (ТФ) и церулоплазмина (ЦП) определяли методом простой радиальной иммунодиффузии по Manchini, используя антисыворотку свиньи к ТФ и ЦП человека ("Sevac", Чехия), альфа-фетопротеина - с помощью иммуноферментного анализа, используя набор Accu-Bind ELISA Microwells (Monobind Inc., USA), аполипопротеинов - с помощью иммунотурбидиметрии, используя тест-наборы фирмы «Human» (Германия).

6. Активность параоксоназы (PON-1) определяли по методу Boltowsky, 2005,

основанному на измерении увеличения оптического поглощения окрашенного продукта реакции ферментативного расщепления субстрата (фенил ацетата). Активность параоксоназы рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинкции Е270 = 1310 М'см"1 и выражали в ммоль фенола в мин на мг белка (или мл фракции).

7. Определение общих липидов в хроматографических фракциях проводили с помощью нативного электрофореза в градиентном ПААГ в концентрации 3-12% (ICN Pharmaceuticals, Inc, США), используя специфическое окрашивание на липиды красителем OIL RED с последующей денситометрией образцов.

8. Определение содержания общего холестерина и триглицеридов в хроматографических фракциях проводили с помощью автоанализатора "Airone 200", Crony Instruments, Италия, ферментным методом, используя комбинированные диагностические наборы «Biocon Diagnostik GmbH», Германия; фосфолипидов - методом двумерной тонкослойной хроматографии; липопротеинов - с помощью электрофореза в агарозе с последующей специфической окраской на липопротеины и денситометрией электрофореграмм.

9. Определение жирнокислотного состава сыворотки крови, мембран клеток крови и хроматографических фракций проводили в экстрактах липидов, выделенных по методу Folch J. et а]., используя разделение метиловых эфиров ЖК с помощью газожидкостной хроматографии на хроматографе "Dani 1000" с пламенно-ионизационным детектором. Капиллярная кварцевая колонка длиной 60 м и диаметром 0,25 мм с фазой НР-23. Газ-носитель - азот (42 метра в минуту); температура испарителя, колонки и детектора (230: 100220: 240°С). Результаты выражали в % от суммы ЖК сыворотки крови, ее фракций и клеточных мембран.

10. Определение витаминов А. Е и В-каротина в сыворотке крови и хроматографических фракциях проводили с помощью обращённо-фазной ВЭЖХ после экстракции их гексаном (совместно с к.х.н. Бекетовой Н.А.)

11. Определение лейкотриенов в крови детей, проводили с помощью обращённо-фазной ВЭЖХ после экстракции их по Clancy and Hugli, 1983, используя стандарты лейкотриенов В4, С4, Д4, Е4, В5, Д5 фирмы "Sigma Aldrich", США.

12. Изучение возрастной динамики процессов пролиферации и апоптоза у крыс методом проточной цитометрии. Опыты проводили на 30 белых беспородных крысах Вистар обоего пола разного возраста - 0,5; 6; 11 и 24 недели. После декапитации крыс под легким эфирным наркозом, собирали кровь для получения сыворотки, извлекали печень и тимус, получали суспензии клеток в 4% формалине на фосфатном буфере и хранили их в холодильнике до момента измерений на цитометре. Для определения апоптоза и фаз

клеточного цикла суспензии клеток окрашивали пропидиума йодидом в гипотоническом буфере. Измерения проводили на проточном цитометре "FACSCalibur" ("Becton Dicinson") при длине волны 610±5 нм по программе "CellQuest". При этом в каждом образце выставляли гейты, обозначающие отдельные популяции клеток (гепатоциты, лимфоциты, макрофаги и т.д.). В каждом гейте анализировали 10 тыс. событий.

13. Статистическую обработку данных проводили с помощью статистического программного пакета SPSS версий 11-18 с использованием параметрических и непараметрических методов анализа (критерий Фишера-Стьюдента, ранговые критерии Манна-Уитни и Вилкоксона). Различия считали достоверными при р<0,05.

1. Оценка возможной роли ю-3 ПНЖК и отдельных антиоксидантов крови в формировании ее суммарной антиоксидантной активности.

Изучение химической природы соединений, ответственных за формирование суммарной АОА сыворотки крови у взрослых и детей, было проведено в серии экспериментов по хроматографическому разделению сыворотки крови на фракции с различной молекулярной массой, в которых была измерена суммарная АОА. Хроматографическое разделение сыворотки крови на фракции проводили на колонках с носителями «8ер11ас1ех С-200», «вирегове-б» и «Т8К-СЕЬ С4000 8\У», которые характеризовались нарастающей разделяющей способностью*.

На рисунке 1А приведены результаты изучения АОА фракций с различной молекуляр-

Рис. 1А. АОА фракций сыворотки крови взрослых людей, полученных на колонке «верЬааех С-200».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

АОА, Кд/шт; Белок, ыг/ия

1 - АОА, Кд/мп;

2 — Белок, нг/нл

2 О □ О

Коллагенээа Гемоглобин ЮЭкДа 6 5 кДа

№№ фракций

* - совместно с д.б.н. А.Н. Котеровым и к.б.н. С.Н. Зориным

ной массой, полученных при разделении сыворотки крови взрослых людей на колонке «Sephadex G-200», на рисунке 1Б - на колонке «Superose-б». Как видно на рисунке 1А, наибольший вклад в суммарную АОА сыворотки крови взрослых людей вносили пики №№ I, II и III (30, 17 и 31%) с молекулярной массой 1063 кДа, 674 кДа и 248 кДа, соответственно.

Профиль АОА сыворотки крови, разделенной с помощью «Superóse 6» (рис.1 Б), характеризовался четко выраженным максимумом во фракции №13, молекулярная масса которой составила 585 кДа, что близко к молекулярной массе фракции II с высокой АОА, выявленной в предыдущем опыте с использованием колонки с «Sephadex G-200» (рис. 1А). Наблюдался также еще один пик АОА в области 67 кДа, образуемый 15 и 16 фракциями. Распределение АОА во фракциях, полученных при хроматографическом разделении сыворотки крови на колонке «TSK-GEL G4000 SW» принципиально не отличалось от данных, полученных на колонке с «Superóse 6».

Рис. 1Б. АОА фракций сыворотки крови взрослых людей, полученных на колонке с «Superóse 6»

АОА

Содержание белка по

Содержание белка во фракциях, усл.ед.опт.пл.

19 20 21 22 23 24

Номера фракций

Таким образом, в трех независимых опытах с использованием различных типов колонок и хроматографических носителей доказано, что максимальная АОА крови была выявлена в высокомолекулярных фракциях. Вместе с тем, АОА в 15-й и 16-й фракции сыворотки крови взрослых людей определяется присутствием ТФ и ЦП, выявленных с помощью иммунохимического определения. При этом фракция с максимальной АОА (№13) этих белков не содержала.

Изучение химического состава фракций с максимальной и минимальной АОА, выделенных с помощью разделения сыворотки крови на колонке «Sephadex 0-200», показало (таблица 1), что фракция с максимальной АОА содержит несколько меньшее количество белка, но существенно большее количество общих липидов, чем фракция с минимальной АОА. Содержание холестерина, триглицеридов, фосфолипидов и аполипопротеина В также было выше во фракции с максимальной АОА, в особенности при расчете на количество белка во фракции.

Эти результаты были подтверждены с помощью электрофоретического определения в указанных фракциях общих липидов (рис. 2).

Таблица 1.

Химический состав фракций с максимальной и минимальной АОА, полученных на колонке с «8ер11ас1ех С-200»

Компоненты фракций, мг/мл Фракция с максимальной АОА Удельное содержание компонента, мг/мг белка во фракции с максимальной АОА Фракция без АОА Удельное содержание компонента, мг/мг белка во фракции с минимальной АОА

Общий белок 2,5 3,2

Общие липиды, усл. ед. 48,9 19,6 27,8 8,7

Общий холестерин 0,52 0,21 0,26 0,08

Триглицериды 0,23 0,09 0,09 0,03

Фосфолипиды 0,168 0,07 0,135 0,04

ano А] 0,075 0,03 0,22 0,07

ano В 0,23 0,09 0,04 0,01

__Rf

I Г " 2

Рис. 2. Результаты электрофоретического определения содержания общих липидов во фракциях с минимальной (А) и максимальной (Б) АОА.

Фракции получены с помощью хроматографического разделения сыворотки крови взрослых людей на колонке "Sephadex G-200".

А и Б денситограммы (1) и

электорофореграммы (2) фракций с низкой и высокой АОА, соответственно. Гели окрашены специфическим для липидов красителем "OIL RED".

Как видно на рисунке, выявлено более высокое содержание липидов во фракции с высокой АОА (рис. 2Б), чем во фракции с низкой АОА (рис. 2А).

Содержание низкомолекулярных антиоксидантов витаминов А и Е в сыворотке крови составило - 79,9 мкг/дд и 1,81 мг/дл, против нормы 30-70 мкг/дл и 0,8-1,5 мг/дл, соответственно. Однако, во фракции с максимальной АОА витамин А обнаружен не был, а витамин Е присутствовал в незначительном количестве (0,054 мг/дл).

Представленные в предыдущем разделе данные были получены с помощью оценки общей АОА в системе ЖЛП/Fe2*. Поскольку АОА является интегральным показателем, величина которого зависит от взаимодействия многих компонентов, закономерно возникает вопрос о правомерности данного вывода при использовании иных методов детекции АОА, основанных на оценке других составляющих АОС. С этой целью было проведено определение АОА в двух других модельных системах индуцированного СРО.

Определение АОА с помощью оценки ингибирования окисления метилолеата .

Максимум АОА, вьивившийся в системе окисления метилолеата, обнаружен в области высокомолекулярных фракций №9 и 10 (0,47 и 1,26 отн.ед., соответственно), второй пик АОА обнаруживается во фракциях №15-18 (0,54-1,10 отн.ед), характеризующихся значительно меньшей молекулярной массой, которые включают ТФ и ЦП. Полученные данные согласуются с результатами, полученными в системе ЖЛП, в которой наиболее высокая АОА сыворотки крови выявлена в высокомолекулярных фракциях.

Определение АОА с помощью торможения ПОЛ в системе определения общего антиоксидантного статуса (total antioxidant status, TAS).

Максимальные значения АОА, определенной этим методом, наблюдались (в порядке убывания) во фракциях № 13-17, №20, №25 и №11. В системе ЖЛП максимальные значения АОА наблюдались во фракциях №12, №15 и №27. В обеих модельных системах пики АОА наблюдались в близких областях молекулярных масс, а именно в области фракций № 14-16, в которой обнаружено присутствие ТФ и ЦП, и в области фракций 12-13, совпадающей с областью высокомолекулярных компонентов (около 600 кДа).

Таким образом, при использовании трех независимых методов оценки АОА сыворотки крови были получены сходные результаты, свидетельствующие о том, что высокая АОА связана с высокомолекулярными фракциями сыворотки крови.

Определение жирнокислотного состава фракций сыворотки крови". Фракция с максимальной АОА характеризовалась более высоким (в 2-4 раза по сравнению с контролем)

* - совместно с д.х.н. Сторожок Н.М

** - совместно с к.х.н. Медведевым Ф.А

содержанием ДЦ ПНЖК ш-З и ш-6 семейств (таблица 2), причем содержание ДГК (22:6 со-3) составляло во фракции с максимальной АОА 2,8±0,97% против 0,5±0,3% во фракции с низкой АОА (р<0,05).

Таблица 2.

Суммарное содержание ДЦ ПНЖК ш-З и ш-6 семейств в лнпидах, выделенных из фракций сыворотки крови с максимальной и минимальной АОА, % от суммы жирных

кислот.

Семейства ПНЖК Фракция сыворотки крови с Фракция сыворотки крови

минимальной АОА с максимальной АОА

ш-З ДПК+ДГК 1,3 5,3

ш-6 АК+ДГЛК 2,1 4,3

ш-З+ш-6 ДЦ ПНЖК 3,4 9,6

Приведенные данные указывают на возможную роль ю-3 ПНЖК как одного из важных компонентов АОС крови. Известно, что ПНЖК и, в частности, ш-З ПНЖК переносятся в крови в составе ФЛ, входящих в липопротеидные комплексы. В то же время в предыдущем разделе было показано, что АОА крови связана в основном с высокомолекулярной фракцией, богатой липидами. Основными высокомолекулярными комплексами крови являются различные классы ЛП. В связи с этим, на следующем этапе работы была проведена оценка присутствия в указанной фракции ЛП, содержащих в своем составе ФЛ, способные переносить в крови ПНЖК. Эти исследования были проведены с помощью двух подходов: 1) электрофоретического разделения белков сыворотки крови в агарозе с последующей специфической окраской на ЛП; 2) исследования активности фермента, ассоциированного с ЛПВП, - параоксоназы-1 (paraoxona.sc-1, РОЫ-1, ЕС 3.1.1.2) как маркера присутствия во фракции сыворотки крови ЛПВП, позволяющего дифференцировать ЛПВП от ЛПНП.

Результаты электрофоретического изучения* ЛП показали, что АОА во фракциях с ее максимальными значениями (рис.3, А), определяется присутствием в них, в отличие от фракций с минимальной АОА (рис. 3, Б), ЛП (а) - фракцией Р-ЛП, представляющих собой ЛПНП, на поверхности которых находится ковалентно связанная с апобелком ЛПНП молекула апо(а) - белка, с помощью которого осуществляется направленный перенос эссенциальных ПНЖК к клеткам (Титов В.Н., 2008).

Во втором независимо проведенном опыте были получены сходные результаты: фракция с максимальной АОА также содержала ЛП, которые совпадали с

' - совместно с к.м.н. Амелюшкиной В.А.

электрофоретической подвижностью а-ЛП - ЛПВП, в ассоциации с апобелком (апоА-1) которых переносятся фосфолипиды, диглицериды, небольшое количество эфиров холестерина, содержащие в своем составе ПНЖК.

Рис. 3. Деиситограммы электрофореграмм липопротеинов фракций сыворотки крови с максимальной (А) и минимальной (Б) АОА. А)

Chylomicrons

Beta Alpha

ЛП (а)

II а Щ 1

м ш

щ МШ шшш

Chylomicrons -хиломикроны Beta - бета-ЛП Alpha - альфа - ЛП

Б)

Chylomicrons Beta Alpha

¡gJÉj

Изучение распределения во фракциях крови активности антиоксидантного фермента PON-1, являющегося маркером присутствия в исследуемых фракциях ЛПВП, проведено с использованием аналитического («Superóse 6») и препаративного варианта колонки с высокой разрешающей способностью («TSKGel G4000SW»), При использовании колонки «TSKGelG4000SW» выраженная активность PON-1 наблюдалась во фракциях №№15 и 16 с максимальным значением 49,52 цмоль/мин/мг белка в 16 фракции; а максимум АОА (3,75 отн.ед.) был выявлен во фракции №12. При использовании же для разделения крови колонки «Superóse 6» и максимальная АОА, и активность PON-1 были обнаружены в одной фракции (№13).

Учитывая, что активность PON-1 - маркера ЛПВП - выявлена в 15 и 16 фракциях, можно

полагать, что АОА этих фракций определяется присутствием в них ЛПВП, а АОА 12 фракции - другими классами ЛП, что согласуется с результатами предыдущей серии опытов с электрофоретической детекцией различных классов ЛП во фракциях крови. При использовании же колонки с «Superóse 6» ЛПНП и ЛПВП выходили в одном пике с высокой АОА. Тем самым эти результаты подтверждают, что АОА в высокомолекулярных фракциях крови связана не только с ЛПВП, но и с другими классами ЛП, способными переносить в крови ПНЖК, в том числе ПНЖК ш-3 семейства, в составе ФЛ.

Таким образом, проведенные исследования показали, что ш-З ПНЖК могут проявлять свое антиоксидантное действие в качестве компонентов ЛП, в которых они транспортируются в составе ФЛ. В пользу этого вывода говорят также литературные данные о том, что ПНЖК проявляют свои антиоксидантные эффекты, связанные с восстановлением радикала витамина Е, именно в составе ФЛ, и эти эффекты тем более выражены, чем больше степень ненасыщенности ПНЖК, входящих в состав ФЛ (Сторожок Н.М., Храпова H.H., 1997; Луконькин И.Н., 2000).

2. Изучение уровня АОА, МДА и спектра жирных кислот в крови у беременных женщин с преэклампсией и с нормально протекающей беременностью.

Другим подходом к оценке возможной роли ю-3 ПНЖК в формировании АОА крови явилось параллельное изучение ПОЛ, АОА и спектра ЖК у беременных женщин с ПЭ в сравнении с нормально протекающей беременностью.

Исследование было проведено совместно с профессором Л.Е. Мурашко, к.м.н. О.Л. Ивановой и др. на базе ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития РФ. Обследовали 141 беременную женщину в возрасте от 17 до 44 лет с ПЭ и 60 женщин с нормально протекающей беременностью. Диагностическими критериями развития ПЭ служило возникновение у беременных гипертензии, протеинурии, отеков. Все обследованные женщины в зависимости от срока выявления ПЭ были разделены на три группы: 17-28 неделя беременности (I группа), 29-34 нед (II группа) и 35—40 нед (III группа) соответственно. Изучение спектра ЖК плазмы крови было проведено методом ГЖХ. Проведенные исследования показали (таблица 3), что содержание ЭПК (20:5) и ДГК (22:6) со-З ПНЖК во второй половине беременности у женщин с ПЭ было достоверно снижено по сравнению со здоровыми женщинами. В то же время уровень ш-6 ПНЖК при ПЭ возрастал по сравнению с нормально протекающей беременностью. Соотношение ю-6/ш-З ПНЖК при нормально протекающей беременности составляло 10:1, тогда как при ПЭ в период с 20 по 28 и с 35 по 40 неделю беременности оно было повышено до 30:1.

Таблица 3.

Уровень ПНЖК (0-3 и ю-6 семейства в плазме крови беременных женщин с ПЭ в сравнении с их уровнем в плазме крови женщин с нормально протекающей беременностью (% от суммы жирных кислот, М±8Б).

Семейство ПНЖК Жирные кислоты Течение беременности Группы беременных женщин

17-28 нед. 29-34 нед. 35-40 нед.

ш-3 20:5 (ЭПК) ПЭ 0,5±0,08* 0,5±0,1* 0,3±0,03*

норма 0,6±0,12 0,8±0,3 0,7±0,2

22:6 (ДГК) ПЭ 1,0±0,23* 0,6±0,3* 1,2±0,2*

норма 2, 2±0,8 1,8±0,9 2,0±0,4

ш- 6 18:2 (Линолевая к-та) ПЭ 36,0±8,4* 28,3±6,3 39,3±9,8*

норма 24,0±5,3 25,3±7,5 23,0±6,2

20:3 (Дигомо-гамма-линоленовая к-та) ПЭ 0,6±0,3* 0,3±0,15 0,4±0,03

норма 0,3 ±0,15 0,4±0,27 0,3±0,02

20:4 (Арахидоновая к-та) ПЭ 5,7±2,5* 3,9±1,8 5,3±2,3

норма 4,3±2,1 3,7±1,6 4,0±1,9

* - отличия достоверны по сравнению с нормально протекающей беременностью, р<0,05

Параллельное исследование динамики изменений уровня МДА и АОА крови женщин при неосложненной беременности и беременности с ПЭ показало, что при нормальной беременности содержание в крови МДА в период с 17 по 30 неделю беременности остается неизменным (рис. 4, кривая 2), в то время как у беременных с ПЭ отмечается нарастание этого показателя с максимумом в период с 30 по 34 неделю (рис. 4, кривая 1).

Вместе с тем, у женщин с ПЭ, в отличие от здоровых беременных, АОА (рис. 5, кривая 1) и уровень одного из компонентов АОС крови ТФ в сыворотке крови в динамике беременности не нарастали. Выявлена достоверная обратная корреляция между концентрацией МДА и ^ АОА как у здоровых беременных (г = -0,534, р<0,01, п=24), так и у беременных с ПЭ (г=-0,425, р<0,01, п=35) и прямая корреляция между АОА и уровнем ТФ в сыворотке крови беременных обеих групп (г=+0,45, р<0,001, п=62).

С целью коррекции соотношения ш-6/ш-З ПНЖК рацион беременных женщин с ПЭ был обогащен ш-3 ПНЖК, источником которых служила биологически активная добавка к пище «Эйконол» (НПП «Тринита», Россия), свидетельство о государственной регистрации № 77.99.232.3.У.11459.12.08 от 30.12.2008, в капсулах по 1 г, содержащих 0,3 г концентрата ПНЖК. Содержание ш-3 ДЦ ПНЖК (ЭПК и ДГК) в добавке составляло 25% от суммы всех

ЖК, витамина Е - 1 мг на капсулу (5,9% от суточной потребности в этом витамине для беременных женщин, МР 2.3.1.2432-08).

Рис. 4. Уровень МДА в сыворотке крови женщин в динамике нормально

протекающей беременности и беременности, осложненной преэклампсией.

МДА, нмоль/мл

Срок беременности, недели 1 —женщины с преэклампсией, 2 — нормальная беременность; * - отличия достоверны, р<0,01

Рис. 5. Антиоксидантная активность сыворотки крови здоровых беременных (2) и женщин с преэклампсией (1).

АОА, отн.ед.

ъ-

• ч °

^ ^ ' ' ' ~20 ' 1 ' ' ЗО ' ' ' ' +0

Срок беременности, недели 1 — женщины с преэклампсией, 2 — здоровые беременные; * - отличия достоверны, р<0,01

Включение в комплексную терапию ПЭ со-3 ПНЖК (по 1 капсуле 1 раз в сутки в течение 30 дней) достоверно увеличивало относительное содержание ЭПК и ДГК в крови у беременных женщин с ПЭ, особенно в 29-ю и 34-ю недели. При этом содержание ЭПК -

увеличилось в среднем в 1,4 раза, а ДГК - удвоилось. Отношение со-6/ю-З ПНЖК при этом составило 11:1 -14:1 и приблизилось к его значениям при физиологической беременности.

Прием ш-З ПНЖК полностью устранял рост концентрации МДА в крови, вызванный ПЭ, и приводил к резкому (в 1,5-2 раза) снижению этого показателя даже по сравнению с неосложненной беременностью (табл. 4). Этот эффект был особенно выраженным в период с 29-й по 34-ю неделю беременности, когда снижение содержания МДА, вызванное приемом ю-З ПНЖК, достигало 50% по сравнению с его уровнем при нормально протекающей беременности. АОА сыворотки крови, сниженная при ПЭ, повышалась при приеме со-3 ПНЖК на всех изученных сроках беременности.

Таблица 4.

Концентрация малонового диальдегида в сыворотке крови беременных женщин,

нмоль/мл (М±ш)

Срок гестации, нед Нормальная беременность Беременность, осложненная преэклампсией % Прием ш-З пнжк при беременности, осложненной преэклампсией %

17-28 5,87±0,72 п=10 6,3610,52 п=18 108±19% 3,24±0,48 п=18 51+8** р<0,001

29-34 5,63±0,89 п=10 8,02±0,98 п=14 142±17%* р<0.1 3,73+0,47 п=12 66±8* 47±6** р<0,001

35-40 5,12±0,87 п=7 4,49±0,42 п=14 88±8% 3,49±0,21 п=15 68±4* 78±5** р<0,02

* — изменения достоверны по сравнению с нормальной беременностью;

** — изменения достоверны по сравнению с беременностью, осложненной ПЭ.

Прием со-3 ПНЖК значительно повышал также содержание в крови ТФ, сниженного у беременных женщин при ПЭ, что может служить дополнительным фактором стимулирующего влияния со-3 ПНЖК на АОА,

Полученные данные, в сочетании с другими проведенными нами исследованиями, подтверждают гипотезу об АО эффектах со-3 ПНЖК, обусловленных, очевидно, не прямым обрывом ими цепей СРО, а включением в состав ЛП комплексов, обладающих максимальной АОА в крови, а также стимуляцией синтеза ТФ - как одного из важных АО факторов крови.

Важно подчеркнуть, что дополнительный прием ш-З ПНЖК позволил снизить тяжесть течения ПЭ, что проявлялось более ранним (на 2-3 дня), чем при применении общепринятой терапии, исчезновением клинических проявлений ПЭ, более благоприятным исходом беременности и родов для матери и плода (своевременные роды в 2 раза чаще, а

преждевременные - в 5 раз реже, чем у пациенток с ПЭ, не получавших ю-3 ПНЖК) и в доле детей, родившихся доношенными (90% в группе женщин, принимавших, и 47% у пациенток, не принимавших со-3 ПНЖК). Эти результаты послужили основанием для использования со-3 ПНЖК в комплексной терапии ПЭ у беременных женщин в ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития РФ.

3. Изучение уровня суммарной АОА, МДА и спектра жирных кислот в крови у недоношенных детей. Еще одним подходом к оценке возможной роли со-3 ПНЖК в формировании АОА крови явилось параллельное изучение ПОЛ, АОА и спектра ЖК у недоношенных детей, для которых характерно снижение уровня ПНЖК в организме вследствие прерывания их внутриутробного развития во второй половине беременности, когда идет максимальное накопление плодом ПНЖК.

Исследования были проведены у 43 недоношенных детей с гестационным возрастом 33-37 недель с массой тела при рождении 1740-2690 г. В зависимости от вида вскармливания дети были разделены на 2 группы: дети 1-й группы вскармливались смесью для недоношенных детей, обогащенной АК и ДГК («PreNAN» т.м. «Nestle», свидетельство о государственной регистрации № RU.77.99.19.005.E.015625.05.11), дети 2 группы -аналогичной смесью, не обогащенной указанными ЖК («PreNAN» т.м. «Nestle», свидетельство о государственной регистрации № 77.99.19.5.У.10017.12.07). Содержание МДА, АОА и состав ЖК изучали в плазме пуповинной крови, а затем через 14 дней в плазме венозной крови детей. Референсную группу составили 50 здоровых доношенных детей из родильных домов г.г. Москвы, Рязани и Люберец, у которых МДА, АОА и состав ЖК изучали только в пуповинной крови.

Установлено, что уровень МДА и АОА в пуповинной крови у недоношенных детей был значительно и достоверно (р<0,05) ниже, чем их уровень в пуповинной крови здоровых доношенных детей (58% и 46% от контроля для АОА и МДА, соответственно). Данные о низкой АОА крови недоношенных детей согласуются с литературными данными о высокой частоте у этой категории больных детей свободно-радикальной патологии (ретинопатии, бронхолегочной дисплазии, некротизирующего энтероколита и др.), а низкий уровень показателя интенсивности процессов ПОЛ - МДА - возможно относится к числу факторов, ответственных за нарушение роста и дифференцировки, которые вносят вклад в развитие ряда патологических состояний, сопровождающих недоношенность.

Изучение спектра ЖК плазмы крови у недоношенных детей выявило рост уровня среднецепочечных ЖК и снижение содержания всех представителей со-6 ПНЖК - линолевой

(18:2), ДГЛК (20:3) и, особенно, АК (20:4) по сравнению с доношенными новорожденными (рис. 6). В то же время на фоне снижения уровня АК и других ш-6 ПНЖК выявлено накопление в плазме ЭПК (20:5) и суммы ш-3 ПНЖК. Вместе с тем, уровень двух других ДЦ ПНЖК шЗ семейства (ДПК 22:5 и ДГК 22:6) проявлял тенденцию к снижению. Таким образом, можно предполагать, что у недоношенных детей имеет место задержка метаболизма ЭПК в ее более длинноцепочечные производные, которая не была описана ранее в литературе.

Полученные данные позволяют предполагать, что причиной снижения уровня ПОЛ, проявляющегося в уменьшении содержания в крови МДА, может служить снижение в плазме крови недоношенных детей субстрата ПОЛ - м-6 ПНЖК, а снижение АОА плазмы крови недоношенных детей обусловлено низким содержанием ДЦ ПНЖК (АК, ДПК и ДГК) в составе ФЛ липопротеинов.

В пользу данного предположения говорят результаты исследования ЖК состава крови недоношенных детей через 2 недели после начала их вскармливания смесью, обогащенной ДЦ ПНЖК (АК и ДГК), либо стандартной смесью для недоношенных детей (группа сравнения). Было установлено, что в крови детей, получавших обогащенную смесь (рис. 6), достоверно увеличивался, по сравнению с исходным, суммарный уровень ш-6 ПНЖК, и, в частности, линолевой кислоты (18:2). При этом снижался уровень ЭПК (20:5), что, возможно, указывает на прекращение компенсаторного накопления ЭПК в крови вследствие увеличения в ней уровня ш-6 ПНЖК.

АОА сыворотки крови при этом несколько снижалась (с 1,23±0,53 до 0,944±0,35 отн.ед.), что согласуется с отсутствием увеличения уровня ДЦ ПНЖК (АК, ДПК 22:5 и ДГК 22:6) в крови детей, а уровень МДА незначительно возрастал (с 0,41±0,2 до 0,53±0,36 нмоль/мл), что согласуется с увеличением суммарного уровня ю-6 ПНЖК как субстрата ПОЛ в крови у этих детей.

В группе сравнения, получавшей сходную по составу смесь, но не обогащенную ДЦ ПНЖК, уровень МДА к концу исследования, напротив, резко снизился (с 0,41±0,36 до 0,26±0,30 нмоль/мл), также как и уровень АОА (с 1,22±0,6 до 0,99±0,65 отн.ед.). При этом исследование спектра ЖК крови данной группы детей выявило нарастание его дисбаланса -дальнейшее снижение уровня АК, рост ЭПК и суммы со-3 ПНЖК в плазме крови недоношенных детей по сравнению с их уровнем у доношенных детей. Полученные результаты подтверждают предположение об участии ДЦ ПНЖК в формировании АО системы сыворотки крови, достоверно сниженной у недоношенных детей, и возраставшей (в виде тенденции) при вскармливании их смесью, обогащенной ДЦ ПНЖК.

Рис. 6. Уровень жирных кислот в плазме крови недоношенных детей до и после их вскармливания специализированной смесью в сравнении с их уровнем у доношенных детей, % от суммы жирных кислот

□ Доношенные

и Недоношенные, до

□ Недоношенные, после

Жирные кислоты

* - отличия достоверны по сравнению с доношенными детьми, р<0,05; #- отличия достоверны по сравнению с уровнем жирных кислот в пуповинной крови недоношенных детей, р<0,05

4. Изучение возрастных особенностей АОА у детей.

Целью данного раздела работы было: 1) изучение возрастных особенностей АОС путем сравнительного изучения суммарной АОА сыворотки крови взрослых и детей разного возраста; 2) сравнительная оценка вклада отдельных компонентов АОС в суммарную АОА различных фракций сыворотки крови взрослых и детей.

4. ¡.Возрастная динамика суммарной АОА сыворотки крови.

Сравнительное изучение суммарной АОА в системе с ЖЛП у 131 ребенка раннего (I год жизни), 19 детей дошкольного (5 лет) и 30 детей школьного возраста (10-14 лет) в сравнении с взрослыми мужчинами и женщинами и беременными женщинами показало (рис.7), что суммарная АОА сыворотки крови детей первого года жизни (2,85±0,18 отн.ед., М±ш) превышает АОА детей в возрасте 5 лет (1,51±0,07 отн.ед., р<0,05) и 10-14 лет (1,96±0,43 отн. ед.), а также АОА взрослых мужчин и женщин и беременных женщин (Р<0,05).

Рис. 7.

Динамика суммарной АОА сыворотки крови в зависимости от возраста, отн.ед.

3,5 1 3

з 2,5 Ч

5 2 -

О А

с" 1,5 -§ !" 0,5 0

3 АОА, отн.ед. |

Возраст

*- отличия достоверны по сравнению с 1 годом жизни, р<0,05;

** - отличия достоверны по сравнению с возрастом 10-14 лет, р<0,05.

АОА сыворотки крови детей обследованных возрастных групп, изученная в системе подавления Ре2+-зависимого ПОЛ в ЖЛП, была выше, чем у взрослых людей, несмотря на то, что по данным литературы, содержание большинства АО компонентов в крови в детском возрасте ниже, чем у взрослых (Berger Н.М., 1995). Примечательно, что максимальная АОА в крови новорожденных детей совпадает с максимальной скоростью роста, наблюдающейся в этот период у детей. Повышение АОА крови наблюдается также и у подростков (рис. 7), т.е. в период второго ростового скачка.

Учитывая полученные нами результаты изучения вклада отдельных АО в формирование АОА сыворотки крови (раздел 1), представлялось целесообразным сравнить спектр ЖК крови у детей разного возраста. Показано, что в плазме крови здоровых доношенных новорожденных детей выше уровень длинноцепочечных ПНЖК: ДГЛК (20:3), АК (20:4) и ДГК (22:6), а в мембранах эритроцитов - АК (20:4) и ДПК (22:5) по сравнению с их уровнем в плазме крови и мембранах эритроцитов подростков и беременных женщин. В то же время уровень АК и ДПК в крови у подростков, для которых характерен ростовой скачок, был выше по сравнению с беременными женщинами. Эти данные согласуются с нашим предположением о важной роли ДЦ ПНЖК в формировании АОА сыворотки крови. В то же время, выдвинутое нами предположение о существенном значении АО фермента PON-1 для возрастной динамики АОА крови, не нашло, в отличие от ДЦ ПНЖК, своего подтверждения, поскольку средний уровень PON-1 в крови подростков (11,0±3,4 ммоль/л) был в 6 раз выше, чем в пуповинной крови (1,9±0,4 ммоль/л; р=0,036).

4.2. Изучение АОА хроматографических фракций сыворотки крови детей.

Изучение распределения АОА в хроматографических фракциях сыворотки крови взрослых и детей, полученных с использованием колонки «Superóse 6», показало (рис.8), что АОА сыворотки крови детей характеризовалась одним пиком с максимальной АОА, соответствующим фракции №13, и отсутствием дополнительного пика, соответствовавшего 16 фракции у взрослых.

Рис. 8. АОА фракций, полученных при хроматографическом разделении сыворотки крови детей на колонке с "Superóse 6".

Ы tfbci-e-i i-' <Р

. ..... L4 ; Ц1

AJ \

. / \

ш Г ----г—--V J ^ —\ 2

* ! " о г • а а »P. v. - /% ü . ■ 1 «» .-Я!?, .■>.»,.. ■ " »

1 - профиль элюции белков при 280 нм;

2 - профиль АОА, определенной в системе с ЖЛП

Определение содержания ТФ и ЦП во фракциях сыворотки крови детей выявило присутствие этих белков в 15 и 16 фракциях (ТФ) и в 14, 15 и 16 (ЦП), но не в 13 фракции. При этом содержание указанных белков в сыворотке крови детей было ниже, чем в

сыворотке крови взрослых (табл. 5), особенно в случае ТФ.

Таблица 5.

Содержание трансферрина и церулоплазмина в сыворотке крови условно здоровых детей и взрослых.

Белки Взрослые в возрасте 20-40 лет, M±SD Дети первого года жизни, M±SD

Трансферрин, мг/дл 231,6±54,0 132,7±34,3*

Церулоплазмин, мг/дл 45,4±5,4 39,0±10,8

*-отличие достоверно по сравнению с уровнем ТФ в крови у взрослых, р<0,001.

Учитывая важную роль, которую играет у новорожденных детей а-фетопротеин (АФП), выполняющий роль переносчика ПНЖК в крови (вместо альбумина у взрослых людей), исследовали содержание АФП в хроматографических фракциях пуповинной крови с помощью иммуноферментного анализа. Проведенные исследования показали, однако, что этот белок содержится во фракциях среднемолекулярных белков (около 67 кДа) совместно с ТФ, ЦП и альбумином (фракции № 14-16) и не содержится в высокомолекулярных фракциях, обладающих максимальной АОА.

Таким образом, АОА крови детей определяется высокомолекулярным ЛП компонентом сыворотки крови, содержащим ПНЖК шб и юЗ семейства. В то же время, такие важные антиоксиданты сыворотки крови как ТФ и ЦП, присутствуют в крови в существенно меньшей концентрации, чем у взрослых, что согласуется с литературными данными (Berger, 1995), и не участвуют в формировании АОА у детей.

5. Изучение АОА и клеточной пролиферации у экспериментальных животных в зависимости от возраста.

Рост обусловлен увеличением количества и размера клеток и ростом органов и тканей, в основе которых лежит изменение соотношения скоростей клеточной пролиферации и дифференцировки. Одним из механизмов их регуляции может, по-видимому, служить изменение баланса между прооксидантами и АОС организма. Показано, в частности, что для вступления клетки в митотический цикл и его быстрого завершения необходима высокая АОА липидов клетки (Алесенко, Бурлакова и др., 1975).

В связи с этим нами была изучена возможная зависимость показателей клеточного роста животных: объема клеточной массы и скорости пролиферации - от АОА сыворотки крови. Опыты были проведены на 30 белых крысах Вистар обоего пола в возрасте 0,5; 6; 11 и

24 недели. Исследовали* процессы клеточной пролиферации и апоптоза (рис. 9) в клетках тимуса, для которого характерна высокая скорость этих процессов, и в печени крыс, в сопоставлении с суммарной АОА их сыворотки крови и уровнем МДА в крови в различные возрастные периоды.

Проведенные исследования показали (табл. 6, рис. 10), что максимальные значения АОА крови наблюдались у новорожденных животных на 3-4 день жизни. Более поздние возрастные периоды характеризовались существенно меньшей (в 6-9 раз) АОА. Эти данные совпадают с данными о возрастной динамике АОА, полученными нами у детей (раздел 4.1). Высокий уровень АОА совпадает, следовательно, с максимальной скоростью роста как у детей, так и у экспериментальных животных. В отличие от АОА, уровень одного из показателей процессов ПОЛ - МДА характеризовался большим разбросом значений и не имел такой четко выраженной возрастной динамики (табл. 6).

Изучение клеточных популяций печени и тимуса крыс с помощью проточной цитометрии показало (рис. 10, табл. 6), что число клеток на 1 грамм ткани в печени (рис. 10Д) и тимусе, так же, как и АОА, было максимальным у новорожденных животных, снижалось с возрастом и коррелировало с АОА (г =0,387, р<0,05, п=30 и г = 0,568, р<0,01, п=30 для печени и тимуса, соответственно). Динамика доли лимфоцитов и гепатоцитов в печени (табл. 6, Рис. 10 Б, В) была сходной с динамикой общего числа клеток в печени и также коррелировала с АОА (г = 0,815, р<0,001, п=30 и г = 0,485, р<0,01, п=30 для лимфоцитов и гепатоцитов печени, соответственно).

Скорость клеточной пролиферации (относительная доля делящихся клеток) в обоих изученных органах была максимальной у новорожденных животных, снижалась с возрастом, причем уменьшение числа делящихся клеток было намного более выраженным в тимусе, чем в печени, и коррелировала с АОА (г = 0,789, р<0,001, п=30), что соответствует более высокой скорости деления лимфоцитов (табл. 6, рис. ЮГ). В отличие от показателей клеточной пролиферации, количество клеток в апоптозе в тимусе с возрастом существенно не изменялось. В то же время в печени доля клеток в апоптозе имела сходную с АОА динамику (г =0,531, р<0,01, п=30), что подтверждает известный факт тканевой специфичности процессов апоптоза. Динамика изменений других изученных показателей (относительное число тимоцитов по отношению к клеткам стромы тимуса и среднее геометрическое (G mean) флюоресценции делящихся клеток в тимусе) также была сходной с возрастной динамикой АОА.

Таким образом, наиболее высокая достоверная корреляция выявлена между АОА

- совместно с канд. мед. наук Мартыновой Е.А.

Рисунок 9. Пример распределения клеток в образце печени крыс при исследовании на проточном цитометре. Каждый гейт окрашен в собственный цвет и соответствует отдельной популяции клеток

Н гепатоциты ] лимфоциты I моноциты / макрофаги О фибробласты. эпителий и т.д. I] гепатоциты делящиеся

Таблица 6. Уровень АОА, МДА в сыворотке крови и характеристика клеточных популяций печени и тимуса крыс в зависимости от возраста.

Возраст, недели АОА, усл.ед. МДА, нмоль/мл Печень Тимус

Клеток хЮ7/ г ткани % гепато-цитов) % лимфоцитов % делящихся клеток % клеток в апо-птозе Клеток х108/г ткани % делящихся клеток Отеап делящихся клеток % клеток в апо-птозе ^шеап апо-птоза

0,5 22,0±10,5 0,4±0,5 (4,9±2,4) 3,5±0,8 26,3±2,3 14,4±4,7 6,2±2,4 5,7±1,5 50,4±9,1 159±147,4 1,2 ±1,1 7,4±3,1

6 4,2±1,0а 0,2±0,4 (4,13±0,56) 1,0±0,0а 8,2±1,9а 11,2±2,4 5,9±1,3 3,8±0,62а 13,6±2,2а 83,8±20,4 0,9 ±0,2 7,6±1,6

11 2,4±0,5а'ь 0,3±0,2 (2,53±0,82)а'ь 1,1±0,2а 8,9±1,7а 11,9±1,7 4,6±2,0 3,2±1,2а 16,1±5,7а 72,1±10,8 1,0±0,4 6,4±1,2

26 3,6±0,9а,с 0,4±0,2 (1,75±0,47)а,ь,с 3,1±0,7Ь,С 6,9±3,0а 7,4±2,6а'ь'с 4,4±2,8 3,3±1,64а 9,5±4,0а'Ь|С 84,4±22,1 1,8±0,7Ь'С 6,4±1,1

а -различия достоверны по сравнению с возрастом 0,5 недели, р<0,05;ь - различия достоверны по сравнению с возрастом 6 недель, р<0,05; с - различия достоверны по сравнению с возрастом 11 недель, р<0,05. ОтФал - среднее геометрическое флюоресценции

10п 10' 10* 10* РвгСР-Сув-Я-А

Возраст, недели

Рисунок 10. Возрастная динамика АОА сыворотки крови (А), относительного числа лимфоцитов (Б) и гепатоцитов (В), делящихся клеток (Г), удельного числа клеток (Д) и клеток в апоптозе в печени крыс (Е) (по данным проточной цитометрии).

сыворотки крови и количеством быстро делящихся клеточных популяций - лимфоцитов печени и делящихся клеток тимуса, которые были максимальны в раннем возрастном периоде, характеризующемся и максимальной скоростью роста. Можно предположить, поэтому, что высокая АОА может играть регуляторную роль в стимулировании процессов пролиферации и смещении равновесия в сторону их преобладания над процессами апоптоза. Это предположение согласуется с давно выдвинутой концепцией, указывающей на роль ПОЛ в регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки (Бурлакова Е.Б., 1975, Скулачев В.П., 1999).

В предыдущих разделах была показана роль ПНЖК в формировании АОА крови. В то же время, эти соединения являются основным субстратом ПОЛ. Таким образом, со-3 ПНЖК, с одной стороны, выступают в качестве субстратов ПОЛ, с другой стороны, участвуют в формировании АО потенциала. Более того, сложные метаболические взаимоотношения, в которых участвуют ш-3 ПНЖК, дополняются еще одной группой метаболических реакций: ПНЖК являются предшественниками различных классов эйкоза- и докозаноидов, причем их образование включает в качестве промежуточных метаболитов продукты ПОЛ.

Многообразие путей как превращения ПНЖК, так и путей образования и превращения различных видов ЛТ, позволяет предполагать возможность их реципрокных взаимоотношений, вытекающих из факта единого источника этих метаболических путей -пула со-3 и со-6 ПНЖК, образующихся в результате их поступления с пищей и освобождения из тканевых депо. Несмотря на всю очевидность данных представлений, эта гипотеза не была рассмотрена ранее в литературе. В связи с этим в работе была проведена оценка данной гипотезы, включающая исследование спектра ЛТ с параллельной оценкой одного из показателей ПОЛ - МДА и АОА крови у условно здоровых детей, детей с бронхиальной астмой (БА) и ожирением.

6. Изучение спектра лейкотриенов, образуемых лейкоцитами, АОА и ПОЛ в крови у детей в норме и при патологии.

6.1. Изучение спектра ЛТ, А О А и ПОЛ в крови у условно здоровых детей.

Обследование условно здоровых детей в возрасте от 5 до 16 лет, поступивших на плановые хирургические вмешательства по поводу заболеваний, не сопровождавшихся воспалительной реакцией и не менявших общее состояние и самочувствие больных, позволило впервые установить, что у условно здоровых детей дошкольного и школьного возраста лейкоциты способны к продукции ЛТ и 4-й, и 5-й серии, причем основным видом ЛТ является производное ЭПК - ЛТД5, количество которого превышает уровень всех других изученных нами видов ЛТ (рис. 11). Этот факт согласуется с обнаруженным нами высоким содержанием со-3 ПНЖК и, в особенности ЭПК, в мембранах лейкоцитов условно здоровых

детей (см. раздел 7). В то же время в лейкоцитах условно здоровых детей практически отсутствовало образование JITE4, который образуется из ЛТД4, производного сульфидопептидного ЛТС4. Поскольку образование ЛТС4 у здоровых детей невелико, уровень его «дочерних» сульфидопептидных ЛТ - ЛТД4 и ЛТЕ4 также низкий, а баланс ЛТВ4 - ЛТС4 сдвинут в сторону образования ЛТВ4.

Рис. 11. Образование лейкотриенов лейкоцитами периферической крови условно здоровых детей, нг/107 лейкоцитов, М±ш.

—

В4 С4 D4 Е4 В5 D5

лейкотриены

Содержание МДА в крови у условно здоровых детей было 1,13±0,28 нмоль/мл (п=19), а суммарная АОА - 1,68±0,57 отн.ед. (п=32).

6.2. Изучение спектра ЛТ, АОА и ПОЛ в крови у детей в условиях детского клинического санатория.

В ходе двойного слепого рандомизированного, плацебо контролируемого исследования у 47 детей 7-14 лет, получавших в течение 2 месяцев стандартный рацион санатория с неоптимальным содержанием со-З ПНЖК или тот же рацион, обогащенный ш-3 ПНЖК в составе рыбьего жира, проводилось изучение* спектра и уровня ЛТ, МДА и АОА.

У всех наблюдавшихся детей до начала исследования было выявлено сниженное образование МДА по сравнению с условно здоровыми детьми данного возраста (0,40 против 1,13 нмоль/мл, соответственно), что позволило предположить существование у них дефицита ПНЖК и, в особенности, ш-3 семейства. В связи с этим дети были разделены на 2 группы, одна из которых (основная, п=26) получала ежедневно по 3 капсулы с рыбьим жиром («Биафишенол рыбий жир для детей» производитель ООО «Дель Риос», свидетельство о государственной регистрации №77.99.23.3.У.2822.3.05 от 13.04.2005), содержащим 0,23 г со-З ПНЖК, в т.ч. 0,16 г ЭПК+ДГК, и 1,17 мг витамина Е, что составляло 10-12% от

- совместно с к.м.н. Коростелевой М.М. и к.м.н. Елезовой Л.И.

физиологической потребности детей 7-14 лет (MP 2.3.1.2432-08). Дети второй группы (сравнения, п=21) получали плацебо - капсулы с подсолнечным маслом (со-6 ПНЖК - 0,32 г; ЭПК+ДГК - 0 г).

Установлено (рис. 12), что продукция противовоспалительного JITDj в основной группе детей, принимавших ш-3 ПНЖК в составе рыбьего жира, возросла на 88% (с 1,21±0,47 до 2,28±0,56 нг/107лейкоцитов), а в группе сравнения - снизилась на 42% (с 2,24±0,66 до 1,30±0,31 нг/107лейкоцитов). Изменения в продукции провоспалительного JITD4 носили противоположный характер: в основной группе она снижалась на 84% (с 3,06±2,38 до 0,52±0,29 нг/107лейкоцитов), а в группе сравнения - возрастала на 120% (с 1,11±0,61 до 2,45±1,86 нг/107лейкоцитов).

Рис. 12. Динамика образования ЛТ лейкоцитами у детей в основной группе и группе сравнения, в % от исходного уровня.

Продукция ЛТВ5 снижалась в 4 раза в основной группе (с 0,93±0,37 до 0,24±0,12 нг/107лей) и возрастала в группе сравнения (с 1,88±0,84 до 2,54±1,7 нг/107лей). Образование ЛТВ4 и ЛТС4 снижалось в обеих группах. Полученные данные подтверждают предположение о реципрокных отношениях между различными видами и сериями ЛТ, происходящими из единого пула их предшественников - ПНЖК. При этом прием рыбьего жира изменял спектр ЛТ у детей основной группы, приближая их к спектру и уровню, наблюдаемому у здоровых детей.

Уровень МДА в сыворотке крови у детей основной группы к концу исследования практически не менялся (0,43+0,13 и 0,42+0,09 нмоль/мл в начале и конце исследования, соответственно) на фоне тенденции к увеличению АОА (с 2,12+0,09 до 2,23+0,12 отн.ед.). Напротив, в группе сравнения содержание МДА в сыворотке крови увеличилось на 18% от исходного уровня (с 0,34+0,05 до 0,40+0,08 нмоль/мл), а АОА уменьшилась на 4% (с

2,13±0,09 до 2,04±0,08 отн. ед).

Сопоставление данных о продукции ЛТ и скорости ПОЛ не выявило реципрокных отношений между уровнем ПОЛ и образованием ЛТ у обследованных детей. В то же время полученные данные говорят о том, что такие отношения существуют между ЛТ различных серий (4-й и 5-й) и ЛТ различных видов (В, С, Д и др.). Так, при увеличении образования ЛТД5 снижается образование ЛТД4. При снижении уровня сульфидопептидного ЛТД5 наблюдается рост несульфидопептидного ЛТВ5.

Таким образом, при умеренной стимуляции синтеза ЛТ в организме обследованных детей под влиянием рыбьего жира реципрокные отношения между ПОЛ и образованием ЛТ выявлены не были. Представляло интерес исследовать эти отношения в условиях резкого усиления синтеза ЛТ, что имеет место при воспалительных заболеваниях таких, как БА и ожирение.

6.3. Изучение спектра ЛТ, уровня МДА и АО А в крови у детей с бронхиальной астмой.

Обследовали 71 ребенка 7-12 лет с БА различной степени тяжести, находившихся на лечении в МНИИ педиатрии и детской хирургии,* и их 8 условно здоровых сверстников. Дети с тяжелой формой БА получали в качестве стандартной базисной терапии ингаляционные кортикостероиды (ИКС), со среднетяжелой формой - кромогликаты. Дети с легкой формой БА не получали никакой лекарственной терапии. Показано (рис. 13), что БА вела к значительному нарастанию продукции всех видов ЛТ при преимущественном увеличении уровня провоспапительных метаболитов АК ш-6 семейства -сульфидопептидных ЛТ и, особенно, ЛТС4 и ЛТЕ4 (р=0,018).

Рис. 13. Уровень ЛТ у больных БА (п=71) в сравнении с условно здоровыми детьми (п=8).

# - отличия достоверны по сравнению с группой условно здоровых детей, р=0,018.

Параллельное изучение АОА крови (таблица 7) выявило снижение суммарной АОА у детей с легкой БА, не получавших медикаментозного лечения. Напротив, АОА при средне-

- совместно с д.м.н. Погомий H.H. и к.м.н. Комаровой О.Н.

тяжелой форме заболевания увеличена. Последнее может быть связано с положительными сдвигами в ЖК составе клеточных мембран у больных БА под влиянием мембраностабилизирующего действия кромогликатов, препятствующего усилению ПОЛ.

Таблица 7.

Уровень МДА и АОА в сыворотке крови детей больных БА и здоровых детей.

Здоровые (п=19) Легкая БА (п=14) Средне-тяжелая БА (п=17) Тяжелая БА (п=36)

АОА, усл.ед. 1,68±0,57 1,05±0,23* 2,94± 1,9* 1,9±0,5

МДА, нмоль/мл 1,13±0,28 0,55±0,54** 0,47±0,63** 0,47±0,6**

* - отличия достоверны по сравнению со здоровыми детьми (с легкой р=0,0006, со средне-тяжелой р=0,02)

** - отличия достоверны по сравнению с группой здоровых детей (с легкой БА р=0,005, со средне-тяжелой БА р=0,002, с тяжелой БА р=0,0001)

В то же время, у детей с БА выявлено (таблица 7) достоверное снижение уровня МДА в крови при всех формах БА, что может быть отражением реципрокных отношений между метаболизмом ПНЖК по липоксигеназному и перекисному пути.

Можно полагать, что полученные данные о снижении уровня МДА следует рассматривать не как доказательство отсутствия вклада неконтролируемого СРО в развитие БА, а как свидетельство исчерпания запасов ПНЖК (АК, ДГЛК, ДГК) как субстратов ПОЛ, связанного с их расходом на синтез ЛТ, образующихся на развернутом этапе течения БА.

Для подтверждения предлагаемой гипотезы представляло интерес оценить возможное влияние дополнительного включения в рацион питания детей с БА ю-З ПНЖК в виде льняного масла, богатого а-линоленовой кислотой. Льняное масло (ЗАО «РеалКапс», Россия, свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.2308.3.06 от 16.03.2006) было назначено 8 детям как дополнение к базисной терапии (кромогликатами или ИКС) и 8 детям без базисной терапии. 10 мл масла, содержащего 3,9 г а-линоленовой кислоты и 1,08 мг витамина Е, что составляло 9-10% от физиологических потребностей детей 7-12 лет (МР 2.3.1.2432-08) вводили в рацион 6 недель. Группу сравнения составили 5 детей с тяжелой БА, в межприступном периоде, длительно получающих ИКС и не получавших льняное масло.

Показано (рис. 14), что под влиянием ИКС содержание в крови ЛТВ4 уменьшалось, а ЛТВ5 - увеличивалось, однако, в ряду сульфидопептидных ЛТ увеличивалось содержание ЛТС4, обладающего сильными бронхоконстрикторными свойствами, и снижалось содержание противовоспалительного ЛТД5.

Прием льняного масла (рис. 15) приводил к увеличению образования ЛТ 5 серии -ЛТВ5 и, особенно, ЛТД5. При этом соотношение ЛТВ4: ЛТВ5 уменьшалось. В то же время наблюдалось снижение образования ЛТВ4 и ЛТС4, сопряженное с увеличением уровня менее активных продуктов - ЛТД4 и ЛТЕ4.

Рис. 14. Влияние ИКС на уровень ЛТ у детей с БА.

леикотриены

Рис. 15. Влияние льняного масла на уровень ЛТ у детей с БА.

35-ffl

ЛТВ4 ЛТС4 ЛТО4 Л ТЕ 4 ЛТВ5 ЛТ05

лейкотриены

Вместе с тем, прием льняного масла вызывал тенденцию к нормализации уровня ПОЛ и увеличению АОА, в отличие от детей с БА, получавших только базисную терапию, у которых ПОЛ продолжало снижаться, а АОА увеличивалась в меньшей степени, чем при дополнительном приеме льняного масла (табл. 8).

Таблица 8. Влияние льняного масла и базисной терапии на показатели ПОЛ и

АОА сыворотки крови детей с БА, M±SD

Показатели Терапия В начале исследования В конце исследования

МДА, нмоль/мл Льняное масло 0,72 ± 0,84 1,14 ± 1,09

Базисная терапия 0,29 ±0,19 0,15 ±0,3

АОА, усл. ед. Льняное масло 2,06 ± 0,47 2,59 ± 1,37

Базисная терапия 2,16 ±0,57 2,36 ± 2,63

Таким образом, проведенные комплексные исследования позволили получить данные,

свидетельствующие о сложном характере изменений в метаболизме ПНЖК при БА у детей и, в частности, нарастании продукции всех ЛТ, особенно С4 и Е4, сопряженного с уменьшением образования МДА, одним из основных предшественников которого является АК, расходуемая при БА на образование ЛТС4 и Е4.

Дополнительное введение в рацион больных БА льняного масла как источника ш-3 ПНЖК увеличивало уровень МДА до его уровня в контрольной группе детей, снижало уровень ЛТ С4 и В4 и увеличивало ЛТ Д5 и В5. Это подтверждает наше предположение о реципрокных отношениях между процессами ПОЛ и образованием провоспалительных ЛТ 4-й серии.

б. 4. Изучение спектра ЛТ, ПОЛ и A OA крови у детей с ожирением.

Обследовано 52 ребенка в возрасте 12-17 лет с ожирением I-III степени* и 9 условно здоровых детей.

Выявлено достоверное увеличение (по сравнению с условно здоровыми детьми) уровня провоспалительных ЛТ 4-й серии, в особенности, ЛТЭ4, а также ЛТЕ4, небольшое, но достоверное снижение уровня ЛТВ4 и отсутствие отличий в уровне ЛТСд и В5 у условно здоровых детей и детей с ожирением. Ни у одного больного ожирением не выявлен ЛТОг -преобладающий вид ЛТ у здоровых детей.

У детей с ожирением выявлено также снижение на 38% по сравнению с условно здоровыми детьми образования МДА в сыворотке крови. Суммарная АОА сыворотки крови при этом также имела тенденцию к снижению (до 1,85±0,08 отн.ед. против 2,11 ±0,23 отн.ед. у условно здоровых детей).

Полученные данные, указывающие на снижение у детей с ожирением ПОЛ в сочетании с увеличением образования провоспалительных лейкотриенов 4-й серии, согласуются с результатами, полученными у детей с БА, и, тем самым, подтверждают гипотезу о реципрокности двух путей метаболизма ПНЖК: ПОЛ и образование ЛТ.

Учитывая, что ПНЖК являются также компонентами биологических мембран, можно предположить, что изменения в продукции ЛТ и МДА отражаются и на уровне ПНЖК в клеточных мембранах. В связи с этим было проведено изучение спектра ЖК мембран клеток крови в условиях резкого увеличения продукции ЛТ, характерного для различных видов воспаления.

7. Изучение спектра жирных кислот мембран клеток крови при воспалительных заболеваниях у детей.

Изучен состав жирных кислот мембран клеток крови (эритроцитов и лейкоцитов) детей с двумя типами воспалительных реакций: воспалительными заболеваниями желудочно-

- совместно с д.м.н. Строковой Т.В. и к.м.н. Сурковым А.Г.

кишечного тракта (ВЗЖКТ) (эзофагитами, гастродуоденитами, язвенной болезнью желудка,), возникающими под воздействием инфекционных, механических или химических факторов и относящихся к преимущественно нормергической альтеративно-экссудативной форме воспаления, сопровождающейся болевой и температурной реакцией; и аллергическим воспалением, лежащим в основе БА, инициируемым реакцией антиген-антитело, носящим гиперергический характер и сопровождающимся обструкцией бронхов, серозной экссудацией, отеком тканей бронхиального дерева при отсутствии болевого синдрома и лихорадки.

Обследовано* 57 детей 7-14 лет, из них 13 детей с ВЗЖКТ и 25 детей с ВЗЖКТ с сопутствующим ожирением 1-Ш степени; 9 детей с БА в межприступном периоде заболевания и 10 условно здоровых детей, поступивших на плановые хирургические вмешательства по поводу заболеваний, не сопровождавшихся воспалительной реакцией и не менявших общее состояние и самочувствие больных.

Установлено, что в мембранах эритроцитов (МЭ) детей с ВЗЖКТ резко и достоверно снижается уровень со-6 ПНЖК - линолевой (18:2), АК (20:4) и ее предшественницы - ДГЛК (20:3) (рис. 16 А). При этом наблюдались полярные изменения уровня ш-3 ПНЖК - резкое увеличение содержания в МЭ ЭПК (20:5) и а-линоленовой (18:3) кислоты, что вело к повышению суммарного содержания в МЭ ш-3 ПНЖК. Однако одновременно имело место снижение содержания в МЭ ДГК (22:6 со-3). Это вело к резкому повышению отношения ЭПК/ДГК (с 1,5 у здоровых до 12,6 у больных детей). В результате отмеченных изменений в уровне со-6 и ш-3 ПНЖК соотношение ПНЖК ш-6 и ш-3 в МЭ у детей с ВЗЖКТ резко (в 3,7 раза) снизилось по сравнению с условно здоровыми детьми, и составило у них 0,7 против 2,6 у условно здоровых детей. Одновременно в МЭ существенно снижался коэффициент эффективности метаболизации" (КЭМ) (0,21 - у больных против 1,2 - у здоровых) и незначительно уменьшался индекс ненасыщенности*" (1,15 - при воспалении, 1,3 - у здоровых детей). Изменение этих индексов указывает на изменение физико-химических характеристик мембран и позволяет предполагать снижение их текучести вследствие снижения ненасыщенности ЖК, входящих в состав мембран, и уменьшения содержания ДЦ ПНЖК - АК и ДГК.

Таким образом, ВЗЖКТ сопровождаются значительным изменением жирнокислотного состава МЭ, которое, возможно, связано с увеличением образования в мембранах из АК

* - совместно с д.м.н. Дубровской М.И., к.м.н. Комаровой О.Н., к.м.н. Пустограевым H.H.

" - КЭМ=20:4/20:2+20:3+20:5+22:5+22:6 [Левачев М.М. и др., 1967];

*** - индекс ненасыщенности - отношение суммы ненасыщенных жирных кислот к сумме насыщенных жирных кислот

провоспалительных эйкозаноидов и нарушением превращения ЭПК в ДГК.

Сходные, но менее выраженные изменения в спектре ЖК МЭ наблюдались при ВЗЖКТ с сопутствующим ожирением (рис. 16 А). Рис. 16 А.

Уровень ДЦ ПНЖК в МЭ у детей с ВЗЖКТ и ВЗЖКТ с сопутствующим ожирением, % от суммы ЖК МЭ, М±80

30 п

х 12 в

о- -

а сп

* 8

3 ь

2 I

>> 5 и а Н

20 -

□ Здоровые

В ВЗЖКТ+ожирение

□ ВЗЖКТ

15 -

0 | Игл | [Щ | йцнь

ДГЛК АК ЭПК ДГК

АК ЭПК ДГК соЗ

Виды жирных кислот

Исследование содержания ЖК в мембранах другого класса клеток - лейкоцитов у детей с иным типом воспалительной реакции - аллергическим воспалением, имеющим место при БА, показало (рис. 16 Б), что хроническое аллергическое воспаление также сопровождалось значительным и достоверным увеличением уровня ЭПК в мембранах лейкоцитов (МЛ), сопровождавшемся тенденцией к накоплению а-линоленовой кислоты и суммы ш-З ПНЖК и Рис. 16 Б.

Уровень ДЦ ПНЖК в МЛ у детей с БА в сравнении с их уровнем у здоровых детей, % от суммы ЖК МЛ, М±вО

* § 3 н

ы 3

30 25 Н 20 15 -10 -5 -

г!

I I РШ1__II НИ-!-_!_I_

ДГЛК АК

□ Здоровые И БА

ЭПК ДГК соЗ соб Виды жирных кислот

*- отличия достоверны по сравнению с условно здоровыми детьми, р<0,05

тенденцией к снижению ДГК (22:6 со-3) и ПНЖК шб семейства.

При этом соотношение ю-6/ш-З ПНЖК снижалось в 2 раза (до 0,39 у больных БА против 0,79 у здоровых детей), а отношение ЭПК/ДГК, напротив, резко возрастало (26,8 против 6,0). Это приводило к росту индекса ненасыщенности (1,23 - при БА, 0,72 - у здоровых детей). При этом КЭМ, так же как и в МЭ при ВЗЖКТ, значительно снижался (до 0,06 против 0,13 у здоровых детей). Таким образом, полученные результаты показывают, что и воспалительные заболевания ЖКТ, и хроническое аллергическое воспаление при БА, приводят к значительным и сходным изменениям состава ЖК клеточных мембран у детей -накоплению ЭПК и снижению уровня ДГК. Этот феномен был выявлен и в МЭ, и в МЛ, которые были избраны в качестве моделей клеток, существенно различающихся по своим функциональным и метаболическим особенностям. Однако, несмотря на существенные функциональные различия этих клеток, изменения, происходящие в их мембранах при воспалении, имели много общих признаков, к числу которых следует отнести накопление в мембранах ЭПК ш-3 семейства и снижение уровня ее длинноцепочечного производного ДГК (22:6 ш-3) с увеличением соотношения ЭПК/ДГК в 4-8 раз. Увеличение этого соотношения указывает, очевидно, на торможение метаболизации ЭПК в ее длинноцепочечные производные, что подтверждается накоплением в мембранах предшественника ЭПК -эссенциальной а-линоленовой кислоты (18:3) юЗ семейства. Рост в МЭ и МЛ уровня ЭПК и а-линоленовой кислоты и резкое снижение, особенно в МЭ, уровня ш-6 ПНЖК приводили к увеличению в них суммы юЗ ПНЖК и снижению отношения ш-6/ш-З. Выявленный у детей с ВЗЖКТ и БА феномен нарастания уровня ЭПК и снижения уровня ДГК в МЭ и МЛ не был описан ранее в литературе и требует дальнейшего изучения. Можно предполагать, что его причинами у детей могут быть: недостаточное поступление ш-6 ПНЖК в составе пищевых рационов; усиленный расход АК на образование провоспалительных эйкозаноидов (простагландинов, тромбоксанов и лейкотриенов); недостаточность субстрата для фосфолипаз, элонгаз и десатураз, либо нарушение превращения ЭПК в ДГК вследствие возникновения ферментативного блока. В частности, в пользу справедливости гипотезы о тесной связи ЖК состава мембран и синтеза из ЖК эйкозаноидов говорят наши данные о снижении уровня ш-6 ПНЖК в МЛ и повышении образования провоспалительных эйкозаноидов при БА (раздел 6). Вместе с тем, накопление ЭПК в КМ при воспалении, по-видимому, является причиной снижения образования из нее противоспалительных эйкозаноидов, в частности лейкотриена Д5, выявленного нами у детей с ожирением (см. раздел 6), а снижение уровня ДГК - причиной снижения образования докозаноидов (резолвинов и протектинов), играющих важную роль при разрешающей фазе воспаления. Выявленные изменения состава ЖК КМ при воспалении могут оказывать существенное

влияние на свойства и функции этих мембран (Покровский А.А., 1972; Левачев М.М. и др., 1976). Все эти факторы могут, очевидно, являться важными патогенетическими звеньями указанных заболеваний, требующими соответствующей алиментарной коррекции. С этой точки зрения, полученные результаты могут рассматриваться как указание на необходимость дальнейшего изучения вопроса об оптимальном соотношении в диетических рационах ш-3 и ш-6 ПНЖК как патогенетически обоснованном дополнительном подходе к терапии воспалительных заболеваний у детей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования выявили важную роль высокомолекулярного липопротеинового комплекса, содержащего длинноцепочечные ш-3 и ю-6 ПНЖК, в формировании антиоксидантного потенциала крови. АОА крови максимальна у новорожденных, прогрессивно снижается с возрастом и коррелирует со скоростью клеточной пролиферации. Изучение трех направлений метаболизма ЖК: участие в формировании АО потенциала, образование ЛТ и построение биомембран позволили сделать вывод о существовании реципрокных отношений между указанными путями их метаболизма. Впервые выявлен феномен накопления в крови и мембранах клеток крови эйкозапентаеновой кислоты в сочетании со снижением уровня докозагексаеновой кислоты и со-6 ПНЖК в условиях недостаточной обеспеченности детей ПНЖК (недоношенность и 2 различных типа воспаления.) Проведенные исследования позволяют заключить, что антиоксидантная активность, уровень МДА как показатель интенсивности ПОЛ, образование лейкотриенов в крови и жирнокислотный состав мембран могут служить биомаркерами метаболизма ПНЖК в организме детей и беременных женщин.

ВЫВОДЫ

1. Доказана важная роль высокомолекулярных (около 600 кДа) компонентов (липопротеинов и входящих в их состав фосфолипидов) в формировании антиоксидантного потенциала крови у взрослых и детей при исследовании распределения антиоксидантной активности во фракциях их крови. Установлено, что фракции крови с высокой антиоксидантной активностью содержат в 3 раза больше длинноцепочечных ПНЖК, в том числе, в 5,6 раза - докозагексаеновой кислоты (р<0,05) семейства ш-3, по сравнению с фракциями, обладающими низкой антиоксидантной активностью.

2. Показано, что увеличение соотношения ш-6/ш-З ПНЖК в крови у беременных женщин с преэклампсией до 29:1 (против 10:1 в норме) сопровождается снижением антиоксидантной активности и интенсификацией ПОЛ, наиболее выраженным (р<0,05) в середине второго триместра беременности. Обогащение рациона беременных женщин с

преэклампсией со-З ПНЖК приводит к нормализации спектра жирных кислот (снижению ш-6/ш-З ПНЖК до 11:1), увеличению уровня антиоксидантной активности крови (р<0,05) и снижению интенсивности ПОЛ (р<0,05).

3. Установлено, что снижение содержания в плазме крови недоношенных детей длинноцепочечных ПНЖК ш-6 и ш-3 (р<0,05) и их соотношения (до 4:1), накопление в их крови эйкозапентаеновой и снижение докозагексаеновой кислоты сопровождается достоверным (на 50%, р<0,05) снижением антиоксидантной активности и уровня МДА. Вскармливание недоношенных детей смесью, обогащенной длинноцепочечными ПНЖК (арахидоновой и докозагексаеновой), приводит к частичной нормализации спектра жирных кислот крови, что проявляется увеличением уровня со-6 ПНЖК и уменьшением накопления эйкозапентаеновой кислоты на фоне тенденции к нормализации процессов ПОЛ.

4. Показано, что антиоксидантная активность сыворотки крови максимальна у новорожденных детей (в 2 раза выше (р<0,05) по сравнению с другими возрастными группами). Исследования на экспериментальных животных подтвердили выявленную закономерность. При этом уровень антиоксидантной активности крови у крыс коррелировал со скоростью клеточной пролиферации лимфоцитов печени (г = 0,815, р<0,001, п=30) и делящихся клеток в тимусе (г = 0,789, р<0,001, п=30), что подтверждает представление об участии ПОЛ в процессах клеточной пролиферации и роста.

5. Впервые установлено, что в лейкоцитах условно здоровых детей преобладают лейкотриены 5-й серии - метаболиты ПНЖК ш-3. Увеличение синтеза провоспалительных сульфидопептидных лейкотриенов 4 серии (производных ш-6 ПНЖК) ЛТС4 и ЛТЕ4 - при бронхиальной астме (р=0,018), и ЛТД4 - при ожирении (р=0,001) у детей сопровождается снижением уровня МДА (р<0,05), изменением соотношения между лейкотриенами 4-й и 5-й серий, а также между отдельными видами сульфидопептидных (С, Д, Е) и несульфидопептидных (В) лейкотриенов.

6. Обогащение рационов со сниженным уровнем ш-3 ПНЖК этими нутриентами из различных пищевых источников (0,9 г рыбьего жира/день, содержащего 0,23 г длинноцепочечных ш-3 ПНЖК, либо 10 мл льняного масла/день, содержащего 3,9 г а-линоленовой кислоты) в течение 5-6 недель приводит к нормализации спектра лейкотриенов крови детей: снижению образования провоспалительных лейкотриенов 4-й серии и увеличению уровня противовоспалительных лейкотриенов 5-й серии.

изменения жирнокислотного спектра: накопление эйкозапентаеновой кислоты и снижение содержания докозагексаеновой кислоты с увеличением (в 4 - 8 раз) их соотношения, сопряженных со снижением (в 2 - 6 раз) коэффициента эффективности метаболизации жирных кислот.

8. Накопление эйкозапентаеновой и снижение докозагексаеновой кислоты, обнаруженное в клеточных мембранах при воспалении, а также в плазме крови недоношенных детей, позволяет характеризовать выявленный феномен как типовую «биохимическую аномалию», отражающую снижение адаптационного потенциала у детей. Предложено рассматривать реакции превращения эйкозапентаеновой кислоты в докозагексаеновую кислоту как «метаболический перекресток», отражающий баланс между поступлением, синтезом и метаболизмом длинноцепочечных ПНЖК.

9. Проведенные исследования позволяют заключить, что антиоксидантная активность, уровень МДА как показатель интенсивности ПОЛ, синтез лейкотриенов в крови и жирнокислотный состав клеточных мембран могут быть отнесены к биомаркерам метаболизма ПНЖК в организме детей и беременных женщин.

Внедрение результатов в практику

1. Методические рекомендации «Оптимизация жирнокислотного состава рационов питания дошкольных образовательных учреждений г. Москвы (МР 2.4.5.015-09, М., 2009 г.) Утв. Главным государственным санитарным врачом по г. Москве, август, 2009, Тутельян В.А., Батурин А.К., Конь И.Я., Коростелева М.М., Шилина Н.М. и др.

2. Преэклампсия: руководство Л1од ред. акад. РАМН Сухих Г.Т., проф. Мурашко Л.Е. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010,- 576 с.

3. Детское питание. Руководство для врачей /Под ред. Тутельяна В.А., Коня И.Я. М.: Медицинское информационное агентство, 2009. -952 с.

Список работ, опубликованных по теме диссертации: Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, определенных ВАК РФ:

1. Коденцова В.М., Пустограев H.H., Вржесинская O.A., Бекетова H.A., Переверзева О.Г., Харитончик Л.А., Шилина Н.М., Ленская Р.В., Снигирева Т.В., Шатнюк Т.В., Пилютик В.Ф., Смирнов В.В., Спиричев В.Б., Трофименко Л.С., Конь И.Я. Использование в диетотерапии детей, больных инсулинзависимым сахарным диабетом, витаминизированного напитка // Вопросы питания.-1998,- № 5-6. С.19-25.

2. Шилина Н.М., Коновалова Л.С., Котеров А.Н., Мурашко Л.Е., Иванова О.Л., Конь И.Я. Динамика уровня малонового диальдегида, трансферрина и антиоксидантной активности сыворотки крови у женщин с нормальной беременностью и беременностью, осложненной токсикозом: влияние эйконола // Вопросы медицинской химии.- 1999.- Т.45, № 5, С. 398406.

3. Шилина Н.М., Котеров А.Н., Зорин С.Н., Конь И.Я. Антиоксидантный спектр сыворотки

крови и его особенности у детей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2004,- Т.2, №2,- С.7-10.

4. Конь И.Я., Шилина Н.М. Биохимические методы оценки пищевого статуса детей// Вопросы питания,- 2002,- Т.71, №6. Стр.47-50.

5. Грибакин С.Г., Шилина Н.М. Роль липидов в питании детей: некоторые актуальные аспекты// Вопросы детской диетологии.- 2005.-Т. 3, №2, С. 40-46.

6. Комарова О.Н., Шилина Н.М., Погомий H.H., Окунева Т.С., Мизерницкий Ю.Л., Конь И.Я. Изучение роли лейкотриенов 4 и 5 серии в патогенезе бронхиальной астмы у детей//Педиатрия.- 2006.- №5, С.35-42.

7. Конь И.Я., Алешина И.В., Бекетова H.A., Гмошинская М.В., Абрамова Т.В., Шилина Н.М. и др. Исследование эффективности применения фруктовых соков, обогащенных железом и комплексом витаминов, в питании беременных женщин// Вопросы детской диетологии,- 2007.-Т. 5, №2, С. 18-21.

8. Конь И.Я., Вольфсон С.Б., Кирдяшкина В.В., Шилина Н.М. Клиническая эффективность полиненасыщенных жирных кислот семейства омега-3 у детей с хроническим гастродуоденитом и язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки// Вопросы детской диетологии, 2007,- Т.5, №2, С.5-10.

9. Ларионова З.Г., Елезова Л.И., Шилина Н.М., Конь И.Я. Оценка эффективности ш-3 ПНЖК в комплексной терапии детей в период реабилитации в детском санатории// Вопросы детской диетологии.- 2007.-Т.5, №2, С. 29-33.

10. Шилина Н.М., Иванушкина Т.А., Конь И.Я. Влияние длительного хранения смесей для детского питания на содержание в них витаминов А, Е и величину перекисного числа и антиоксидантной активности. Сравнение с грудным молоком// Вопросы питания. -2007.-№6.-С.48-53.

11. Конь И.Я., Коростелева М.М., Шилина Н.М. Характеристика липидного компонента рациона питания детей дошкольного возраста//Вопросы детской диетологии,- 2008.- Т. 6, №3,- С. 5-8.

12. Блинова Е.Г, Бекетова H.A., Шилина Н.М. Оценка заболеваемости и пищевого статуса студентов Омска//Вопросы детской диетологии,- 2008.-Т.6, №4.- С. 64-67.

13. Шилина Н.М., Конь И.Я., Гусева М.Р., Хаценко И.Е., Яшкова А.Е., Коростелева М.М., Буданцева C.B. Рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование влияния рыбьего жира как источника юЗ полиненасыщенных жирных кислот на когнитивные и зрительные функции, антропометрические показатели и острую респираторную заболеваемость у дошкольников 5-6 лет// Вопросы детской диетологии,-2008,- Т. 6, №4,-С. 10-17.

14. Шилина Н.М. Механизмы антиоксидантной защиты у детей//Вопросы питания,- 2009.-Т. 78, № 3.-С.11-17.

15. Конь И.Я., Шилина Н.М., Гусева М.Р., Хаценко И.Е., Яшкова А.Е., Коростелева М.М., Буданцева C.B. Исследование влияния рыбьего жира как источника шЗ-полиненасыщенных жирных кислот на заболеваемость острыми респираторными инфекциями, антропометрические показатели и зрительную функцию у дошкольников 56 лет//Педиатрия.- 2010.-Т.89, №1,- С. 76-80.

16. Шилина Н.М., Комарова О.Н., Медведев Ф.А., Дубровская М.И., Конь И.Я. Накопление эйкозапентаеновой кислоты в мембранах эритроцитов и лейкоцитов при альтеративно-экссудативном и аллергическом воспалении// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,- 2010,- Т.149, №5,- С.516-519.

17. Шилина Н.М. Роль докозагексаеновой кислоты в питании беременных и кормящих женщин//Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии.-2010-Т.9, №4.-С.88-91.

18. Шилина Н.М. Современные представления о роли полиненасыщенных жирных кислот в питании женщин и детей: новые аспекты//Вопросы питания.-2010.-Т. 79, №5.-С. 15-23.

19. Shilina N. M., Dubrovskaya M. I., Komarova О. N., Medvedev F. A., Kon I. Ya. Changes in the Fatty Acid Composition of Blood Cell Membranes in Children with Inflammatory Diseases

// Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 2011,- Vol.5, No.l.-p.81-87.

Статьи, опубликованные в других изданиях:

20. Конь И.Я., Шилина Н.М. Роль пищевых веществ в функционировании системы антиоксидантной защиты организма//Вопросы детской диетологии.-2003.- Т.1, №4.-С. 5357.

21. Шилина Н.М., Конь И.Я. Современные представления о физиологических и метаболических функциях полиненасыщенных жирных кислот// Вопросы детской диетологии,- 2004,- Т. 2, №6.-С.25-30.

22. Гмошинская М.В., Алешина И.В., Шилина Н.М., Коновалова JI.C., Конь И.Я. и др. Использование специализированного продукта «МОмил Мама» в питании беременных женщин// Вопросы детской диетологии,- 2004.-Т. 2, № 6.-С. 20-24.

23. Прилепина И.А., Шилина Н.М., Копытько М.В., Доскин В.А., Конь И.Я. Алиментарная коррекция состояния здоровья детей со сниженной резистентностью в дошкольных учреждениях// Вопросы детской диетологии.- 2004.- Т.2, №4,- С. 7-11.

24. Гмошинский И.В., Шилина Н.М., Дмитриев A.B. Гмошинская М.В., Алешина И.В., Фатеева Е.М., Мазо В.К., Конь И.Я. «Обеспеченность селеном и антиоксидантная активность молозива, грудного молока и сыворотки крови рожениц и их новорожденных детей в г.г. Москве и Рязани// Вопросы детской диетологии.- 2004.- Т.2, №5,- С. 16-21.

25. Конь И.Я. Шилина Н.М., Вольфсон С.Б., Георгиева О.В. Использование полиненасыщенных жирных кислот в питании здоровых детей// Лечащий врач.-2006.-№4.-С.42-47.

26. Конь И.Я. Шилина Н.М., Вольфсон С.Б. Омега-3 жирные кислоты в профилактике и лечении болезней детей и взрослых// Лечащий врач.-2006.-№6.-С.55-59.

Материалы научных конференций:

27. Kon I.Y., Shilina N. M., Konovalova L.S., Koterov A.N., Ivanova O.L., Murashko L.E. The effects of omega-3 polyunsaturated fatty acids on the blood malonic dialdehyde and antioxidant activity in preeclamptic pregnancy in women// In: Mater. Intern. Congress of Pediatrics, Amsterdam, 9-14 August, 1998,- P. 411.

28. Конь И.Я., Шилина H.M., Коновалова Л.С., Котеров А.Н., Иванова О.Л., Мурашко Л.Е. Антиоксидантные эффекты эйконола при гестозах беременности // Тезисы докл. Y Междунар. конф. "Биоантиоксидант", Москва, 18-20 ноября 1998 г. С. 224-225.

29. Творогова Т.М., Коровина H.A., Гаврюшева Л.Н., Радченко Е.Р., Кузнецова В.А., Конь И.Я., Шилина Н.М. Применение природного биоантиоксиданта - биологически активной пищевой добавки - "Mera Про" при комплексной терапии артритов у детей" //В кн.: Тез. докл. 2-й Межд. мед. конф. корп. "Витамакс", Москва, 29-30 апреля 1999.-С. 52-61.

30. Иванова О.Л., Мурашко Л.Ю., Шилина Н.М., Коновалова Л.С., Конь И.Я. Влияние эйконола на динамику уровня малонового диальдегида и антиоксидантную активность сыворотки крови у беременных женщин с гестозами// Тез. докд. Y Росс, национ. конгресса "Человек и лекарство", Москва, 21-25 апреля 1998.-С. 368-369.

31. Мурашко Л.Е., Иванова О.Л., Шилина Н.М., Сокур Т.Н., Конь И. Я. Прогнозирование гестоза по определению полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в крови// Тез. докл. междун. семинара "Проблемы беременности высокого риска", Москва, 15-19 ноября 1999 . -С. 33.

32. Мурашко Л.Е., Иванова О.Л., Сокур Т.Н., Шилина Н.М., Конь И.Я. Антиоксидантная терапия у беременных женщин с гестозом// Тез. докл. междун. семинара "Проблемы беременности высокого риска", Москва, 15-19 ноября 1999.-С. 83.

33. Творогова Т.М., Шилина Н.М., Гаврюшова Л.Н., Радченко Е.Р., Кузнецова И.А., Тимофеева Т.Д., Курашвили В.А. Эффективность применения биологически активной добавки к пище нутрицевтика "Mera Про" при артритах// В кн.: Тез. докл. Междунар.

симпоз."Питание XXI века. Медико-биологические аспекты, пути оптимизации", Владивосток, 7-9 октября 1999.-С. 152.

34. Котеров А.Н., Шилина Н.М. Возможность использования метода, основанного на подавлении Fe2+- индуцированного окисления липопротеинов яичного желтка для определения антиоксидантной активности сыворотки (плазмы) крови у детей: вклад отдельных компонентов// Тез. докл. I Всеросс. Конгресса с междунар. участием "Питание детей:ХХ1 век", Москва,14-17 марта 2000,- С. 116.

35. Шилина Н.М., Котеров А.Н., Конь И.Я. Пищевые антиоксиданты в питании здоровых и больных детей// Тез. докл. I Всеросс. Конгресса с междунар. участием "Питание детей: XXI век" Москва, 14-17 марта 2000.-С. 137.

36. Шилина Н.М., Прилепина И.А., Творогова Т.М., Конь И.Я. Коррекция антиоксидантного статуса у детей разного возраста с помощью некоторых биологически активных добавок к пище// Тез. докл. YII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва,10-14 апреля 2000.- С. 572.

37. Шилина Н.М., Котеров А.Н., Шеваренкова Е.В., Конь И.Я. Антиоксидантная система новорожденных: проблемы формирования и коррекции// В кн.: тез. док. III Российского форума «Мать и дитя», Москва, 22-26 октября, 2001.-С. 593.

38. Шилина Н.М., Котеров А.Н., Крупская Е.В., Джумачук О.В., Конь И.Я. Возрастные особенности антиоксидантной активности сыворотки крови детей// Тез. докл. VI Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 16-19 апреля, 2002,- С. 628630.

39. Шилина Н.М., Комарова О.В., Крупская Е.В., Джумачук О.В., Бекетова H.A., Мизерницкий Ю.Л., Конь И.Я. Показатели ПОЛ и антиоксидантного статуса у детей больных бронхиальной астмой// Вопросы современной педиатрии, том 1 (приложение), №1. Тезисы научно-практической конференции «Фармакотерапия аллергических болезней у детей», 2002.- С.51.

40. Шилина Н.М., Крупская Е.В., Джумачук О.В., Конь И.Я. Особенности применения антиоксидантов в питании детей разного возраста// Тезисы II российской гастроэнтерологической недели Москва, ноябрь 2002.- С.38.

41. Шилина Н.М., Гмошинская М.В., Конь И.Я., Бойко A.A. Сравнительное изучение антиоксидантной активности материнской и пуповинной крови и молозива//Тезисы YII Всеросс. Конгресса «Здоровое питание населения России», Москва, ноябрь 2003.- С. 577578.

42. Shilina N. M., Gmoshinski I.V., Gmoshinskaya M.V., Fateeva E.M., Kon I.Ya. Blood serum antioxidant indices in parturient women and their infants in Moscow// Proceed, of the Second Intern. Symp. on Trace Elements and Minerals in Medicine and Biology, May 13-15, 2004, Munich, Germany.- P.41.

43. Shilina N. M., Gmoshinski I.V., Gmoshinskaya M.V., Kon I.Ya. Selenium status and total blood antioxidant activity in Russian parturient women and their newboms//In: Proceed, of 38th Annual Meeting of the ESPGHAN, Porto, June, 2005,- P.64.

44. Шилина H.M., Котеров A.H., Зорин C.H., Конь И.Я. и др. Химический состав высокомолекулярной фракции сыворотки крови, обладающей максимальной антиоксидантной активностью. Сообщение 1//Тезисы Международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки», Тюмень, сентябрь, 2005,- С.7-9.

45. Шилина Н.М., Котеров А.Н., Зорин С.Н., Конь И.Я. и др. Химический состав высокомолекулярной фракции сыворотки крови, обладающей максимальной антиоксидантной активностью. Сообщение 2// Тезисы Международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки», Тюмень, сентябрь, 2005.-С.9-11.

46. Комарова О.Н., Шилина Н.М., Погомий H.H., Конь И.Я. и др. Лейкотриены серий 4 и 5 в лейкоцитах периферической крови здоровых детей и больных бронхиальной астмой// Тезисы Всероссийского съезда диетологов и нутрициологов «Диетология: проблемы и горизонты», Вопросы детской диетологии, 2006.-Т.4, №4.- 2006.-С. 22-23.

47. Коростелева М.М., Шилина Н.М., Бессонов В.В., Конь И.Я. Гигиеническая оценка фактического потребления различных классов жирных кислот детьми дошкольного возраста в условиях детских дошкольных учреждений//Тезисы I Всероссийского съезда диетологов и нутрициологов «Диетология: проблемы и горизонты», Вопросы детской диетологии.- 2006.-Т.4, №4.-С.25.

48. Шилина Н.М., Вольфсон С.Б. Изучение влияния полиненасыщенных жирных кислот семейства омега-3, полученных из морепродуктов, на уровень цитокинов у детей с заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки// Тезисы I Всероссийского съезда диетологов и нутрициологов «Диетология: проблемы и горизонты», Вопросы детской диетологии.- 2006.-Т.4, №4.- С.51.

49. Конь И.Я., Шилина Н.М., Гмошинская М.В. Питание беременных женщин и развитие плода: современные данные//Тезисы Всемирного конгресса «Внутриутробный ребенок и общество. Роль перинатальной психологии в акушерстве, неонатологии, психотерапии, психологии и социологии», 2007.-С.40-44.

50. Коп I. Ya., Volfson S.B., Shilina N. М. The study of n-3 PUFA clinical efficiency in chronic gastroduodenitis and duodenal ulcer treatment of school children // In: Proceed, of 10th European Nutrition Conference, Paris, France, 10-13 July, 2007.-P.189 .

51. Shilina N.M., Kon I.Ya., Komarova O.N., Pogomy N.N. Production of n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) metabolites - leukotriens (LT) 4 and 5 series in children with asthma: possible effects of anti-inflammatory therapy// In: Proceed, of 10th European Nutrition Conference, Paris, France, 10-13 July, 2007.-P.189.

52. Бекетова H.A., Шилина H.M., Блинова Е.Г., Конь И.Я. Оценка влияния обеспеченности студентов жирорастворимыми витаминами-антиоксидантами на антиоксидантную активность крови // В мат. IX Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», Москва, декабрь, 2007.- С.9.

53. Комарова О.Н., Шилина Н.М., Целиков Д.Н., Конь И.Я. и др. Эффективность применения льняного масла в комплексной терапии бронхиальной астмы у детей// В мат. IX Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье»// Москва, декабрь, 2007.- С.46.

54. Shilina N.. Kon I., Guseva M.R., Hatcenko I. Е., Korosteleva М. Double blind placebo-controlled randomized study of co-3 polyunsaturated fatty acids effects on cognitive and visual function of children aged 5-6 years// In: Proceed, of World Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, San-Paolo, Brasil, August, 2008.-P.0968.

55. Shilina N., Kurbatova E., Beketova N.A., Baibarina E.N., Kon I. Lipid peroxidation and antioxidant status of extremely low birth weight neonates enterally fed by breast milk or formulas/In: Proceed, of the 42nd Ann. Met. of European Society for Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Budapest, 3-6 June, 2009.-P.64 .

56. Коростелева M.M., Елезова Л.И., Шилина H.M., Конь И.Я. Исследование влияния рыбьего жира как источника со-3 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) на некоторые биохимические показатели крови у детей 8-17 лет// Тезисы X Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», Москва, 1-3 декабря, 2008,- С. 57.

57. Шилина Н.М., Конь И.Я., Кулакова С.Н., Медведев Ф.А., Дубровская М.И., Паршина П.В., Иванушкина Т.А. Состав жирных кислот мембран эритроцитов у детей с заболеваниями желудочно-кишечного тракта без превышения массы тела и с ожирением// Тезисы X Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», Москва, 1-3 декабря, 2008.-С. 127.

58. Шилина Н.М., Иванушкина Т. Медведев Ф.А., Сурков А.Г., Строкова Т.В. Изучение спектра жирных кислот мембран эритроцитов детей, больных ожирением//Тезисы XI Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», Москва, 30 ноября - 2 декабря 2009 г.- С. 184.

59. Шилина Н.М., Лашенкова Е.А., Сурков А.Г., Строкова Т.В., Конь И.Я. Изучение спектра

лейкотриенов у детей, больных ожирением//Тезисы XI Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», Москва, 30 ноября - 2 декабря 2009 г.-С. 184.

60. Шилина Н.М., Коростелева М.М., Лашенкова Е.А., Конь И.Я. Влияние дополнительного включения со-З ПНЖК в рацион детей 7-14 лет на уровень различных классов лейкотриенов и ПОЛ в крови: рандомизированное плацебо-контролируемое исследование//Тезисы XI Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», Москва, 30 ноября - 2 декабря 2009 г.-С. 184.

61. Shilina N., Коп I., Medvedev F. Changes In The Fatty Acid Composition Of Blood Cell Membranes In Children With Inflammatory Diseases/In Proceed, of 44th Annual Meeting of European Society for Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Sorrento, Italy, 2011).-P. 186.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АК - арахидоновая кислота

АО - антиоксидантный

АОА - антиоксидантная активность

АОС - антиоксидантная система

БА - бронхиальная астма

ВЗЖКТ - воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта

ДГК - докозагексаеновая кислота

ДГЛК - дигомо-гамма-линоленовая кислота

ДПК - докозапентаеновая кислота

ДЦ ПНЖК - ддинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты

ЖК - жирные кислоты

ЖЛП - желточные липопротеины

КМ - клеточные мембраны

ЛП - липопротеины

ЛТ - лейкотриены

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

ЛПВП - липопротеины высокой плотности

МДА - малоновый диальдегид

МЛ - мембраны лейкоцитов

МЭ - мембраны эритроцитов

СРО - свободно-радикальное окисление

ТФ - трансферрин

ЦП - церулоплазмин

ЭПК - эйкозапентаеновая кислота

Заказ № 26-А/07/2012 Подписано в печать 11.07.2012 Тираж 150 экз. Усл. п.л. 2,4

(Ть"

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:zak@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Шилина, Наталия Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ОСНОВНЫЕ ДАННЫЕ О МЕТАБОЛИЗМЕ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ РОЛИ ЖИРНЫХ КИСЛОТ.

1.1.1. Строение и номенклатура жирных кислот.

1.1.2. Основные пути метаболизма ПНЖК со-3 и со-6 семейств.

1.1.2.1. ПНЖК как энергетический субстрат.

1.1.2.2. ПНЖК как субстрат перекисного окисления липидов и фактор антиоксидантной защиты организма.

1.1.2.3. Фосфолипазный путь метаболизма ПНЖК.

1.1.2.4. Пластическая функция ПНЖК.

1.1.2.5. Роль ПНЖК в регуляции транскрипции генов.

1.1.3. Роль ДЦ ПНЖК у детей первого года жизни.

1.1.4. Недостаточность ЖК в питании и их пищевые источники.

1.2. АНТИОКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА ОРГАНИЗМА: РОЛЬ АЛИМЕНТАРНЫХ ФАКТОРОВ.

1.2.1. Основные представления о свободно-радикальном окислении и перекисном окислении липидов.

1.2.2. Понятие об антиоксидантах и их классификация.

1.2.3. Роль алиментарных факторов в формировании антиоксидантной системы организма.

1.2.4. Взаимодействие между антиоксидантами.

1.2.5. Окислительный стресс.

1.2.6. Механизмы антиоксидантной защиты у детей.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОЙ РОЛИ со-3 ПНЖК И ОТДЕЛЬНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ КРОВИ В ФОРМИРОВАНИИ ЕЕ СУММАРНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ.

3.2. ИЗУЧЕНИЕ УРОВНЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ, МДА И СПЕКТРА ЖИРНЫХ КИСЛОТ В КРОВИ У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН С ПРЕЭКЛАМПСИЕЙ И С НОРМАЛЬНО ПРОТЕКАЮЩЕЙ БЕРЕМЕННОСТЬЮ.

3.3. ИЗУЧЕНИЕ УРОВНЯ СУММАРНОЙ АОА, МДА И СПЕКТРА ЖИРНЫХ КИСЛОТ В КРОВИ У НЕДОНОШЕННЫХ ДЕТЕЙ.

3.4. ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ АОА У ДЕТЕЙ.

3.4.1. Возрастная динамика суммарной АОА сыворотки крови.

3.4.2. Изучение АОА хроматографических фракций сыворотки крови детей.

3.5. ИЗУЧЕНИЕ АОА И КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВОЗРАСТА.

3.6. ИЗУЧЕНИЕ СПЕКТРА ЛЕЙКОТРИЕНОВ, ОБРАЗУЕМЫХ ЛЕЙКОЦИТАМИ, АОА И ПОЛ В КРОВИ У ДЕТЕЙ В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ.

3.6.1. Изучение спектра ЛТ, АОА и ПОЛ у условно здоровых детей.

3.6.2. Изучение спектра ЛТ, АОА и ПОЛ в крови у детей в условиях детского клинического санатория.

3.6.3. Изучение спектра ЛТ, уровня МДА и АОА сыворотки крови у детей с бронхиальной астмой.

3.6.4. Изучение спектра ЛТ, ПОЛ и АОА крови у детей с ожирением.

3.7. ИЗУЧЕНИЕ СПЕКТРА ЖИРНЫХ КИСЛОТ МЕМБРАН КЛЕТОК КРОВИ ПРИ

ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ У ДЕТЕЙ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение биомаркеров метаболизма омега-3 и омега-6 полиненасыщенных жирных кислот у детей и беременных женщин"

Актуальность проблемы. Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), принадлежащие к числу незаменимых факторов питания, служат предметом значительного внимания исследователей как в нашей стране [39, 59, 28], так и за рубежом [108, 111, 207, 208, 331, 332]. За два последних десятилетия накоплен большой объем научных данных, указывающих на важную роль этих соединений в реализации многочисленных физиологических и биохимических процессов в организме в норме и при патологических состояниях. К их числу относятся: формирование иммунного статуса, воспалительные реакции, регуляция системы гемостаза, поддержание тонуса сосудов и гладкой мускулатуры, процессы роста, когнитивные функции.

Роль ПНЖК в процессах ПОЛ в течение многих лет обоснованно связывалась с их функцией как субстратов ПОЛ [7, 59, 23, 48, 63]. Вместе с тем, в литературе имеются единичные указания на их возможное антиоксидантное действие [1, 30, 39, 51, 52, 61, 103, 142, 202, 226, 150]. В связи с этим возникает вопрос о возможной роли длинноцепочечных (ДЦ) ПНЖК в формировании антиоксидантной активности (АОА) крови. С этой точки зрения значительный интерес представляет изучение АОА и химического состава отдельных хроматографических фракций сыворотки крови, в которых возможно присутствуют ДЦ ПНЖК, а также параллельная клиникобиохимическая оценка показателей ПОЛ, АОА и жирнокислотного состава плазмы крови у беременных женщин и недоношенных детей.

Следует подчеркнуть, что роль системы ПОЛ/АОА не может рассматриваться только с позиций патогенетического механизма развития заболеваний. В ряде исследований показана тесная связь между балансом этих систем и процессами клеточной пролиферации и роста [1, 118, 308, 359, 360]. В связи с этим целесообразно проведение исследования возрастной динамики АОА крови у человека и экспериментальных животных, а также изучение возможной связи между АОА крови и показателями клеточной пролиферации в тканях животных.

В многочисленных работах установлены пути образования из ш-6 и со-З ПНЖК различных серий одного из видов эйкозаноидов - лейкотриенов (ЛТ) [116, 221]. Эти исследования ограничены, однако, изучением, преимущественно, ЛТ 4-й серии, тогда как ЛТ 5-й серии остаются изученными недостаточно. При этом изучение образования ЛТ у детей проведено лишь в немногочисленных исследованиях, посвященных оценке продукции ЛТ 4-й серии при некоторых патологических состояниях. В то же время, спектр ЛТ у здоровых детей остается практически неизученным. В связи с этим представляется важным провести детальный анализ всего спектра ЛТ как 4-й, так и 5-й серии у условно здоровых детей, а также у детей с бронхиальной астмой и ожирением. При этом особого внимания заслуживает выявление возможной корреляции между уровнем ПОЛ/АОА и продукцией ЛТ как двух альтернативных путей метаболизма ПНЖК у человека.

Как было уже упомянуто, ПНЖК принимают участие в регуляции процессов воспаления в качестве субстратов ПОЛ и предшественников ЛТ, что сопровождается значительным расходом этих соединений. В то же время, ПНЖК входят в состав фосфолипидов клеточных мембран (КМ) и в значительной мере определяют их структурные и функциональные свойства [332, 47]. В связи с этим представляется целесообразным изучение возможных изменений спектра жирных кислот (ЖК) КМ у детей при различных видах воспалительных заболеваний, относящихся к числу распространенной патологии детского возраста, характеризующейся тяжелым хроническим течением. При этом представляло интерес сравнить ЖК КМ крови (эритроцитов, лейкоцитов) у детей при двух видах воспаления (аллергическом и альтеративно-экссудативном).

Цель и задачи исследования:

Задачи:

1. Изучить роль со-3 и со-6 ПНЖК в формировании антиоксидантной системы (АОС) крови у взрослых мужчин и женщин и у детей,

2. Исследовать особенности участия со-3 и со-6 ПНЖК в формировании антиоксидантного потенциала у беременных женщин (при физиологически протекающей беременности и преэклампсии (ПЭ)) и у недоношенных детей.

3. Исследовать возрастную динамику АО А крови у детей и экспериментальных животных и оценить возможную роль АОА крови в процессах клеточной пролиферации.

Научная новизна работы. Впервые доказана важная роль высокомолекулярного липопротеинового комплекса, содержащего длинноцепочечные со-3 и ео-6 ПНЖК, в формировании антиоксидантного (АО) потенциала крови. Установлено, что АОА сыворотки крови максимальна в раннем возрасте у детей и экспериментальных животных и коррелирует со скоростью клеточной пролиферации. Показано, что обогащение рациона беременных женщин с ПЭ со-3 ПНЖК увеличивает уровень АОА их крови и подавляет ПОЛ, повышенное при ПЭ. Впервые доказано, что соотношение различных видов ЛТ у детей в норме и при патологии меняется при изменении в организме уровня со-3 ПНЖК. Установлено существование реципрокных отношений между ЛТ различных серий (4-й и 5-й) и различных видов (В, С, Д, Е). Недостаточный уровень в организме детей со-6 ПНЖК вследствие их сниженного поступления (недоношенные дети) или повышенного расхода на образование провоспалительных эйкозаноидов (бронхиальная астма) сопровождается снижением уровня ПОЛ, а обогащение их рациона ПНЖК приводит к нормализации уровня ПОЛ. На основании параллельного изучения ПОЛ, АОА и образования ЛТ сформулировано положение о реципрокности метаболических превращений ПНЖК. Впервые установлено, что различные виды воспаления - альтеративно-экссудативное и аллергическое, а также состояние недоношенности у детей вызывают сходные изменения в составе различных типов КМ (эритроцитов и лейкоцитов) и в плазме крови, заключающиеся в накоплении в них эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК), снижении докозагексаеновой кислоты (ДГК) со-3 и общего уровня со-6 ПНЖК. На основании результатов исследования п оказана возможность использования указанных трех групп показателей (ПОЛ/АОА, лейкотриены, жирнокислотный состав биомембран) в качестве биомаркеров метаболизма ПНЖК.

Научно-практическое значение работы. Выявленный в работе факт взаимодействия трех исследованных путей метаболизма ПНЖК (участие в формировании АОС и регуляции ПОЛ, образование ЛТ и построение биомембран), позволивший сформулировать положение об их реципрокности, открывает новые направления в изучении особенностей биохимической регуляции этих соединений в организме. Не описанный ранее феномен накопления в крови ЭПК в сочетании со снижением уровня ДГК и со-6 ПНЖК при патологических состояниях у детей вносит новые представления в концепцию патогенеза этих состояний. Обнаружение АО свойств у ДЦ ПНЖК расширяет спектр известных к настоящему времени АО факторов и указывает на перспективность использования этих соединений в клинической практике. Полученные данные раскрывают новые стороны метаболизма ПНЖК и могут способствовать пониманию их физиологической роли у детей, а также служат теоретической основой для разработки новых подходов к диетотерапии болезней детского возраста. Данные о положительных эффектах обогащения рациона беременных женщин оо-З ПНЖК используются в комплексной терапии ПЭ у беременных женщин.

Материалы диссертации легли в основу глав руководства для врачей «Детское питание» /Под ред. Тутельяна В.А., Коня И.Я.: МИА,- 2009.- 952 е., и руководства для врачей и акушеров «Преэклампсия: руководство» /Под ред. акад. РАМН Сухих Г.Т., проф. Мурашко Л.Е. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010.-576 с. Разработаны Методические рекомендации «Оптимизация жирнокислотного состава рационов питания дошкольных образовательных учреждений г. Москвы (MP 2.4.5.015-09, М., 2009 г.).

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Всероссийских и международных конференциях: Y и VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 1998, 2002); Y и YII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998, 2000); Y Конгрессе педиатров России (Москва, 1999), International Congress of Pediatrics (Амстердам, Нидерланды, 1998), Международном симпозиуме "Питание XXI века. Медико-биологические аспекты, пути оптимизации" (Владивосток, 1999), Международном семинаре "Проблемы беременности высокого риска" (Москва, 1999); I Всероссийском Конгрессе с международным участием "Питание детей: XXI век" (Москва, 2000); II российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2002); YII Всероссийском Конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва, 2003); Second International Symposium on Trace Elements and Minerals in Medicine and Biology (Мюнхен, Германия, 2004); 38th, 42th, 44lh Annual Meetings of the European Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (ESPGHAN) (Порто, Португалия, 2005; Будапешт, Венгрия, 2009; Сорренто, Италия, 2011); Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), I Всероссийском съезде диетологов и нутрициологов «Диетология: проблемы и горизонты» (Москва, 2006); конгрессе «Внутриутробный ребенок и общество. Роль перинатальной психологии в акушерстве, неонатологии, психотерапии, психологии и социологии» (Москва, 2007); 10th European Nutrition Conference (Париж, Франция, 2007); World Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (Сан-Паоло, Бразилия, 2008); IX, X, XI, XII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2007, 2008, 2009, 2010).

По материалам диссертации опубликовано 64 работы, из них 19 публикаций - в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, другие издания - 10 публикаций, материалы научных конференций - 35 публикаций, 1 методические рекомендации, главы в 2-х руководствах.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (361 ссылка). Объем работы составляет 289 страниц, содержит 61 рисунок и 34 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шилина, Наталия Михайловна

248 ВЫВОДЫ

1. Доказана важная роль высокомолекулярных (около 600 кДа) компонентов (липопротеинов и входящих в их состав фосфолипидов) в формировании антиоксидантного потенциала крови у взрослых и детей при исследовании распределения антиоксидантной активности во фракциях их крови. Установлено, что фракции крови с высокой антиоксидантной активностью содержат в 3 раза больше длинноцепочечных ПНЖК, в том числе, в 5,6 раза - докозагексаеновой кислоты (р<0,05) семейства со-3, по сравнению с фракциями, обладающими низкой антиоксидантной активностью.

2. Показано, что увеличение соотношения со-6/ю-З ПНЖК в крови у беременных женщин с преэклампсией до 29:1 (против 10:1 в норме) сопровождается снижением антиоксидантной активности и интенсификацией ПОЛ, наиболее выраженным (р<0,05) в середине второго триместра беременности. Обогащение рациона беременных женщин с преэклампсией со-3 ПНЖК приводит к нормализации спектра жирных кислот (снижению со-6/со-З ПНЖК до 11:1), увеличению уровня антиоксидантной активности крови (р<0,05) и снижению интенсивности ПОЛ (р<0,05).

3. Установлено, что снижение содержания в плазме крови недоношенных детей длинноцепочечных ПНЖК со-6 и со-3 (р<0,05) и их соотношения (до 4:1), накопление в их крови эйкозапентаеновой и снижение докозагексаеновой кислоты сопровождается достоверным (на 50%, р<0,05) снижением антиоксидантной активности и уровня МДА. Вскармливание недоношенных детей смесью, обогащенной длинноцепочечными ПНЖК (арахидоновой и докозагексаеновой), приводит к частичной нормализации спектра жирных кислот крови, что проявляется увеличением уровня со-6 ПНЖК и уменьшением накопления эйкозапентаеновой кислоты на фоне тенденции к нормализации процессов ПОЛ.

5. Впервые установлено, что в лейкоцитах условно здоровых детей преобладают лейкотриены 5-й серии - метаболиты ПНЖК со-3. Увеличение синтеза провоспалительных сульфидопептидных лейкотриенов 4 серии (производных со-6 ПНЖК) ЛТС4 и ЛТЕ4 - при бронхиальной астме (р=0,018), и ЛТД4 - при ожирении (р=0,001) у детей сопровождается снижением уровня МДА (р<0,05), изменением соотношения между лейкотриенами 4-й и 5-й серий, а также между отдельными видами сульфидопептидных (С, Д, Е) и несульфидопептидных (В) лейкотриенов.

6. Обогащение рационов со сниженным уровнем со-3 ПНЖК этими нутриентами из различных пищевых источников (0,9 г рыбьего жира/день, содержащего 0,23 г длинноцепочечных со-3 ПНЖК, либо 10 мл льняного масла/день, содержащего 3,9 г а-линоленовой кислоты) в течение 5-6 недель приводит к нормализации спектра лейкотриенов крови детей: снижению образования провоспалительных лейкотриенов 4-й серии и увеличению уровня противовоспалительных лейкотриенов 5-й серии.

7. Впервые показано, что у детей при различных видах воспаления - альтеративно-экссудативном (воспалительные заболевания верхних отделов желудочно-кишечного тракта) и аллергическом (бронхиальная астма) - в мембранах как дифференцированных клеток (эритроцитов), так и клеток, способных к делению (лейкоцитов), обнаруживаются сходные изменения жирнокислотного спектра: накопление эйкозапентаеновой кислоты и снижение содержания докозагексаеновой кислоты с увеличением (в 4 - 8 раз) их соотношения, сопряженных со снижением (в 2 - 6 раз) коэффициента эффективности метаболизации жирных кислот.

251

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) относятся к эссенциальным факторам питания и привлекают внимание исследователей как в нашей стране [39, 59, 27], так и за рубежом [108, 111, 207, 208, 331, 332]. За два последних десятилетия накоплен большой объем научных данных, указывающих на важную роль этих соединений в реализации таких важных физиологических и биохимических процессов в организме, как формирование иммунного статуса, воспалительные реакции, регуляция системы гемостаза, поддержание тонуса сосудов и гладкой мускулатуры, процессы роста, когнитивные функции, как в норме, так и при патологических состояниях.

Неконтролируемое усиление процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) играет важную роль в развитии и течении таких тяжелых заболеваний как ретинопатия недоношенных, бронхолегочная дисплазия, артриты, сахарный диабет, гипертоническая болезнь у детей, а также преэклампсии у беременных женщин. Роль ПНЖК в процессах ПОЛ в течение многих лет обоснованно связывалась с их функцией как субстратов ПОЛ [7, 59, 23, 48, 63]. Вместе с тем, в литературе имеются единичные указания на их возможное антиоксидантное действие [1, 30, 39, 51, 52, 61, 103, 142, 202, 226, 150]. В связи с этим нами было проведено изучение возможной роли длинноцепочечных (ДЦ)

ПНЖК в формировании антиоксидантной активности (АОА) крови, которая является частью общей АОС организма. Эта система, сформировавшаяся в ходе эволюции, представляет из себя сложную, многоуровневую систему защиты организма от окислительного стресса, которая осуществляется с участием различных факторов, как классических антиоксидантов, так и веществ, которые способны проявлять и прооксидантное действие.

В частности, в мембранах существует несколько путей, определяющих антиоксидантный статус организма, которые изменяют скорость окисления липидов и которые можно рассматривать как регуляторные. К ним относятся строго определенная структурная организация липидов, влияющая на скорость реакции инициирования, продолжения и обрыва цепи, ферменты, регулирующие обмен фосфолипидов мембран, выход из них окисленных форм липидов, влияющие на скорость окисления путем изменения состава жирных кислот фосфолипидов, отношения липиды/белок, фосфолипиды/холестерин и т.д., ферменты антиоксидантного действия и низкомолекулярные вещества, в том числе, витамины [61]. Любые лекарства или пищевые добавки, изменяющие условия работы перечисленных систем, будут менять скорость ПОЛ, даже не являясь антиоксидантами. При этом между вышеперечисленными факторами возможны различные взаимодействия и, в частности, между пищевыми антиоксидантами и другими звеньями антиоксидантной системы. Это необходимо учитывать при оценке действия пищевых антиоксидантов и их назначении с лечебными и профилактическими целями, в особенности детям. Применение пищевых антиоксидантов в качестве единственного средства антиоксидантной терапии и профилактики не учитывает роли других уровней антиоксидантной защиты и синергических взаимоотношений, возникающих между пищевыми антиоксидантами и компонентами антиоксидантной защиты с других уровней и может вести к развитию негативных побочных реакций со стороны организма [71, 279, 280, 309, 272, 295, 23]. Эти побочные эффекты особенно нежелательны для организма детей младшего возраста в связи с незрелостью выделительной и детоксицирующей систем и потенциальной опасностью нарушения нормального развития, включающего процессы тканевой пролиферации и дифференцировки. Для детей более старшего возраста опасность побочных эффектов от слепого использования высоких доз антиоксидантов не теряет актуальности, особенно в период так называемых «критических окон» в развитии (5-6 лет и препубертатный возраст). Вместе с тем, представляется весьма привлекательной теоретическая возможность использования при проведении антиоксидантной терапии веществ, обладающих максимально эффективной способностью вызывать положительные сдвиги в системе ПОЛ/АОС и клиническом течении заболеваний, связанных с неконтролируемым усилением процессов ПОЛ. Для выяснения природы этих веществ необходимо проведение исследований, направленных на выяснение роли отдельных компонентов антиоксидантной системы в формировании АОС организма.

Учитывая важную роль баланса ПОЛ и АОС, очевидна необходимость разработки адекватных методов контроля за скоростью ПОЛ и состоянием антиоксидантной защиты организма у детей. При этом практически наиболее доступной для исследования тканью является кровь, состав которой в значительной мере отражает и может рассматриваться как интегральный показатель состояния других органов и систем [188]. В то же время циркулирующие в крови компоненты могут, в свою очередь, оказывать существенное влияние на метаболические процессы в различных органах и тканях, в частности, окисленные липопротеины низкой плотности могут инициировать в тканях изменения, проявляющиеся в виде метаболического синдрома [182, 188, 341]. С этой точки зрения исследование антиоксидантной системы крови представляет значительный теоретический и практический интерес.

При этом особый интерес представляет использование для характеристики АОС крови такого интегрального показателя, как суммарная АОА, поскольку изучение содержания отдельных антиоксидантов в биологических субстратах организма без учета их синергических отношений с компонентами других уровней антиоксидантной защиты не может считаться исчерпывающей характеристикой антиоксидантного статуса. Кроме того, определение отдельных компонентов эндогенной системы защиты липидов клеточных мембран и липопротеинов от перекисной деградации не представляется возможным из-за трудоемкости анализов и синергизма действия различных ингибиторов в системе защиты.

В связи с этим, на протяжении 25-30 последних лет предпринимаются попытки создания методик для определения суммарной активности ингибиторов свободно-радикальных реакций, присутствующих в биологических жидкостях (сыворотке крови, моче, слюне, слезе и др.), гомогенатах тканей и суспензиях мембран и липопротеинов, так как, с одной стороны, это упрощает характеристику антиоксидантого статуса методически, с другой стороны позволяет учесть и синергические отношения антиоксидантов, и вклад компонентов других уровней антиоксидантной защиты.

При выборе наиболее адекватного для наших целей метода определения АОА мы исходили из представления о том, что в принципе любая методика определения АОА биологических жидкостей основывается на использовании модельной системы, которая включает в себя по крайней мере два компонента: механизм генерации определенного сорта свободных радикалов и систему их детектирования. Введение в такую модельную систему перехватчика свободных радикалов, либо веществ, влияющих на концентрацию или состояние ионов-катализаторов, вызовет уменьшение концентрации свободных радикалов, что отразится на параметрах детектирующей системы. При этом для определения общей АОА биологических жидкостей применяют несколько модельных систем, различающихся по способу генерации свободных радикалов, методу их детектирования, характеру фазы системы (гомогенная или гетерогенная) и сложности интерпретации.

Одной из первых доступных и воспроизводимых модельных систем окисления, примененной для определения АОА сыворотки крови, был предложенный Стоксом и соавт. в 1974 г., гомогенат мозга [315]. С помощью этой модельной системы было показано, что сыворотка крови и другие биологические жидкости ингибируют ПОЛ модельной системы, определяемое по концентрации вторичных продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активные продукты). Было показано также, что основной вклад в общую АОА крови вносят сывороточные белки - церулоплазмин и трансферрин. а-Токоферол (а-Тк) в физиологических концентрациях отвечает лишь за незначительную часть общей АОА сыворотки крови. Альбумин, добавленный к гомогенату в физиологических концентрациях, эффективно ингибирует накопление ТБК-активных продуктов, что, по мнению авторов, обусловлено его способностью связывать различные лиганды, в том числе Бе2+. Таким образом, гомогенат мозга в качестве модельной системы оказался пригодным для определения вклада железоокисляющих и железосвязывающих компонентов в общую АОА биологических жидкостей (церулоплазмина, трансферрина, альбумина) [315]. Другие компоненты общей АОА сыворотки крови (аскорбат, урат, а-токоферол, каротиноиды) на свойства этой модельной системы не влияли.

Другой модельной системой, которую использовали Клебанов и соавт. [19] для определения АОА во фракциях, полученных при разделении сыворотки крови на колонке с ТОУОРЕЯЬ Н\¥-60 (Япония), явилась система желточных липопротеинов (ЖЛП) [19], инициирование ПОЛ в которой осуществляется с помощью ионов двухвалентного железа. Суспензия липопротеинов желтка яиц как модельная система отличается от других липидсодержащих систем доступностью получения, высокой стабильностью и относительно хорошей окисляемостью [19, 18]. Профиль белковой элюции включал два пика: первый пик был связан с выходом из колонки липопротеинов, а также крупно- и среднемолекулярных плазменных белков, второй - с элюцией низкомолекулярных веществ. Исследователи пришли к выводу, что АО А сыворотки крови была связана, в основном, с активностью ЦП, сконцентрированного во фракции среднемолекулярных белков. В то же время, низкомолекулярные фракции не меняли параметры регистрирующей системы (интенсивность хемилюминисценции модельной системы ЖЛП).

В наших исследованиях для оценки общей АОА мы избрали систему ЖЛП с инициацией ПОЛ ионами Fe . Следует подчеркнуть, что в соответствии с традиционными представлениями принято считать, что в суммарную АОА сыворотки крови вносят вклад различные вещества высоко- и низкомолекулярной природы: ферменты (супероксид дисмутазы, каталаза, глутатион-пероксидазы), белки - хелаторы ионов металлов, витамины Е, С, А, каротиноиды, мочевая кислота, билирубин и др.) Многочисленные исследования, проведенные отечественными и зарубежными авторами [12, 60, 23, 27, 42], позволили прийти к заключению о том, что основной вклад в формирование неферментативной антиоксидантной системы крови вносят низкомолекулярные соединения (витамины А, Е, С, билирубин, коэнзим Q, флавоноиды, мочевая кислота и др.). Однако, в дополнение к антиоксидантам с хорошо изученными свойствами работами Стокса с соавт. (1974), Клебанова Г.И. и соавт., 1999 [19, 315] было показано значение высокомолекулярных белковых компонентов крови (трансферрина и церулоплазмина) в формировании ее суммарной АОА. Кроме того, представляют значительный интерес данные литературы об АОА липопротеинов, одним из компонентов которых являются ПНЖК семейства со-З [56, 58, 182, 254, 256]. Вопреки сложившимся представлениям об этих соединениях как о субстратах ПОЛ, в ряде работ имеются указания на возможность их полярного, антиоксидантного действия [19, 52, 103, 202, 150]. По одним данным такой активностью обладает докозагексаеновая кислота (ДГК) - ДЦ ПНЖК с 6 двойными связями [103, 202] , по другим - все длинноцепочечные полиненасыщенные ЖК [30, 52], которые вступают в синергические отношения с витамином E и проявляют антиоксидантные свойства, являясь комонентами фосфолипидов. Однако вклад ПНЖК в формирование суммарной АОА сыворотки крови неизвестен.

Таким образом, к моменту начала наших исследований вопрос о природе АОА крови оставался спорным и требовал дальнейшего изучения. С этой целью была проведена серия экспериментов по хроматографическому разделению сыворотки крови на фракции с различной молекулярной массой, в которых была измерена суммарная АОА методом подавления Fe2+- индуцированного ПОЛ в системе липопротеинов яичного желтка и в других модельных системах подавления ПОЛ (TAS /total antioxidant status/; окисление метилолеата, а также содержание витаминов-антиоксидантов, уровень белков с антиоксидантными свойствами и жирнокислотный состав фракций, уровень в них различных липопротеинов и активность антиокисдантного фермента PON-1, связанного с липопротеинами.

Взяв за основу исследование Stocks et al. [315], в первой части нашего исследования мы провели хроматографическое разделение сыворотки крови на геле "SEPHADEX G-200" со свойствами, сходными со свойствами гелей, использованных Stocks и соавт. (1974) [315], но в системе с ЖЛП. Большая разрешающая способность носителя позволила нам в дополнение к пику с АОА, определяемой ТФ и ЦП, выявить еще один, дополнительный пик с высокой молекулярной массой, АОА которого была максимальной.

Характеристика этого пика показала, что по молекулярной массе он соответствует липопротеинам, а его химический состав представлен меньшим количеством белка и большим количеством как общих липидов, так и отдельных липидных компонентов (холестерина, фосфолипидов, триглицеридов) и аполипопротеина В1 по сравнению с контрольной фракцией, не обладающей АОА; содержит небольшое количество жирорастворимого витамина Е.

Следует указать, однако, что использованный нами в качестве носителя гель "SEPHADEX G-200", равно, как и "SEPHADEX G-150", использованный Stocks et al. [315] не позволяют проводить эффективное разделение белков с молекулярной массой больше 200 кДа. Поэтому во второй части исследования для проведения хроматографического разделения мы выбрали носитель «Superose-б» с рекомендуемым диапазоном молекулярных масс разделяемых белков от 5 до 5000 кДа.

Используя этот носитель, мы вновь подтвердили существование высокомолекулярной фракции (М. масса ~ 600 кДа), обладающей максимальной АОА. Однако, в отличие от данных Клебанова и Стокса, которые считали, что основной вклад в АОА высокомолекулярной фракции вносят ТФ и ЦП, мы не обнаружили присутствия этих белков в данной фракции, что было показано с помощью методов иммунохимии. Эти белки, а также альфа-фетопротеин и альбумин образовывали второй по величине пик АОА, обусловленной способностью связывать ионы металлов переходной валентности (Fe, Cu), феррооксидазной активностью церулоплазмина и способностью таких входящих в его состав белков, как альбумин и альфа-фетопротеин связывать и переносить ПНЖК [56, 53].

Поскольку АОА является интегральным показателем, величина которого зависит от взаимодействия многих компонентов, закономерно возникает вопрос о правомерности данного вывода при использовании иных методов детекции АОА, основанных на оценке других составляющих АОС. С этой целью было проведено определение АОА в двух других модельных системах индуцированного СРО: определение АОА с помощью оценки ингибирования окисления метилолеата и с помощью торможения ПОЛ в системе определения общего антиоксидантного статуса (total antioxidant status, TAS). В первой из этих систем свободно-радикальное окисление (СРО) инициировали с помощью термического разложения азобисизобутиронитрила (АИБН) (6x10"4 моль/л), а АОА рассчитывали как отношение разности периодов индукции в опыте и в контроле (Ах^Топ тк) к периоду индукции контроля тк [30] Во второй - внесенные антиоксиданты в составе сыворотки крови или ее фракций тормозят образование окрашенного стабильного радикала ABTS+ (2,2'-азино-ди-(3-этилбензтиазолина сульфонат)) в смеси ABTS-метмиоглобин-НгОг [ 243]. В обеих модельных системах были выявлены пики АОА в области высокомолекулярных компонентов (около 600 кДа). Таким образом, при использовании трех независимых методов оценки АОА сыворотки крови были получены сходные результаты, свидетельствующие о том, что высокомолекулярные фракциии сыворотки крови обладают высокой АОА.

Анализ жирнокислотного состава выявленной фракции с максимальной АОА показал наличие гораздо большего, чем в контрольной фракции, количества в ней ПНЖК, достоверно более высокое содержание ДГК ю-3 семейства и суммы ДЦ ПНЖК как со-3 , так и со-6 семейства. Учитывая имеющиеся в литературе данные о способности длинноцепочечных (ДЦ, более 20 углеродных атомов) ПНЖК, входящих в состав фосфолипидов, восстанавливать активную форму а-Тк при взаимодействии с токоферрильными радикалами и проявлять тем самым АОА, состоящую в способности вступать в синергические отношения с основным жирорастворимым антиоксидантом биомембран - витамином Е [Сторожок, Храпова, 1997, Луконькин, 2000], можно предположить, что АОА выявленной нами фракции во многом определяется ПНЖК в особенности ДЦ ПНЖК со-3 семейства, входящими в состав фосфолипидов, триглицеридов и липопротеидов, и способностью этих ПНЖК к синергическим взаимодействиям с жирорастворимыми компонентами антиоксидантной системы крови.

Для подтверждения этого предположения был проведен электрофорез указанной фракции в агарозе, который выявил присутствие в ней липопротеинов, соответствующих по подвижности а-липопротеинам и липопротеину (а), т.е ЛПВП и ЛПНП [58]. Во фракции сыворотки крови, не обладающей АОА, эти виды липопротеинов не выявлялись.

Другим подходом к определению природы ЛП во фракции с высокой АОА явилось определение во фракциях сыворотки крови активности фермента параоксоназы-1 (Р01\М), ассоциированного с ЛПВП, которую исследовали во фракциях крови, полученных с помощьюдвух разных хроматографических носителей: «8ирегозе-6» и носителя с более высокой разрешающей способностью «Т8КОеЮ40008\У». Эти данные показали, что АОА в высокомолекулярных областях действительно связана с ЛП, но АОА обладают не только ЛПВП, а и другие классы ЛП, выявляемые с помощью хроматографического носителя с более высокой разрешающей способностью («Т8КОеЮ40008\\6>) и способные переносить в крови ПНЖК, в особенности, ПНЖК со-3 семейства, в составе фосфолипидов.

Таким образом, проведенные исследования показали, что ю-3 и со-6 ДЦ ПНЖК могут проявлять свое антиоксидантное действие в качестве компонентов липопротеинов, в которых они транспортируются в составе фосфолипидов и триглицеридов в комплексе с аполипопротеинами. В пользу этого вывода говорят и литературные данные о том, что ПНЖК проявляют свои антиоксидантные эффекты, связанные с восстановлением радикала витамина Е, именно в составе фосфолипидов [30, 51, 52].

Примечательно, что по данным Сторожок Н.М. и Луконькина И.А. [30], ПНЖК с большей длиной углеводородной цепи и большим количеством двойных связей обладают более высокой АОА. В связи с этим можно полагать, что одной из причин более высокой АОА данной фракции может быть присутствие в ней большего количества ДЦ ПНЖК. Авторы связывают АОА ПНЖК с их участием в построении фосфолипидов и синергизмом в действии конъюгированной системы из чередующихся двойных и одинарных связей в цепочке жирной кислоты и полярной головки фосфолипида: чем больше количество двойных связей в молекуле жирной кислоты, а, следовательно, и ее длина, тем выше АОА фосфолипида [30, 51, 52]. Учитывая этот принцип, наибольшей АОА должны обладать ПНЖК со-3 семейства как более ненасыщенные и длинноцепочечные. Следовательно, максимальной АОА будут обладать фосфолипиды, в состав которых входит ДГК с 22 углеродными атомами и 6 двойными связями [30, 103], а в сыворотке крови - частицы, которые переносят эти фосфолипиды. Таким образом, можно заключить, что более высокая АОА фракции с ее максимальным значением может быть обусловлена более высоким уровнем входящих в ее состав длинноцепочечных ПНЖК со-3 семейства.

Полученные данные указывают, следовательно, на гораздо более сложные взаимоотношения отдельных антиоксидантов и их вклад в формирование суммарной АОА крови, чем это принято считать в настоящее время.

Другим подходом к оценке возможной роли со-3 ПНЖК в реализации АОА крови явилось параллельное изучение, ПОЛ, АОА и спектра жирных кислот у беременных женщин с преэклампсией (ПЭ). При оценке антиоксидантного статуса исследовали также содержание в крови одного из белков с антиоксидантными свойствами -трансферрина.

Было установлено, что при ПЭ наблюдалось увеличение уровня со-6 ПНЖК и снижение уровня со-3 ПНЖК в крови беременных женщин, а также изменение соотношения со-б/со-З ПНЖК: при нормально протекающей беременности оно составляло 10:1, тогда как при ПЭ оно повышалось до 30:1. При этом в динамике беременности наблюдалось увеличение уровня ПОЛ в крови по сравнению с нормально протекающей беременностью, и отсутствие увеличения во втором триместре беременности АОА и ТФ в сыворотке крови, имеющее место при нормально протекающей беременности. Наши данные согласуются с результатами работы американских исследователей, проведенной независимо от нас в 90-е годы прошлого века [133].

Включение в комплексную терапию со-3 ПНЖК в составе рыбьего жира приводило к достоверному увеличению относительного содержания ЭПК и ДГК в крови у беременных женщин с ПЭ, особенно выраженному в 29-ю и 34-ю недели. При этом в среднем содержание ЭПК - увеличилось в 1,4 раза, а ДГК - удвоилось. Отношение со-6/ю

3 ПНЖК при этом составило 11:1 -14:1 и приблизилось к значениям при физиологической беременности.

Прием со-3 ПНЖК полностью устранял также рост концентрации МДА в крови, вызванный ПЭ, и приводил к резкому (в 1,5-2 раза) снижению этого показателя даже по сравнению с неосложненной беременностью. АОА и уровень ТФ при этом возрастали на всех изученных сроках беременности.

Таким образом, полученные данные подтверждают представления о существенной роли нарушений антиоксидантного статуса в патогенезе ПЭ, связанного с накоплением в крови продуктов ПОЛ, отражающим его усиление [25, 239]. Это ведет к оксидативному стрессу и снижению содержания антиоксидантов в организме беременной, что вызывает дефицит эссенциальных ПНЖК в организме беременных и способствует развитию ПЭ. В то же время нельзя исключить и обратную зависимость: недостаточное поступление эссенциальных ПНЖК со-3 семейства в организм женщины в предконцептуальный период, ведущее к повышению соотношения со-6/со-З ПНЖК, может провоцировать снижение АОА крови и окислительный стресс. Дополнительный прием препарата со-3 ПНЖК позволяет повысить содержание со-З ПНЖК в крови беременных женщин, изменить соотношение ш-6/со-З ПНЖК и приблизить его к уровню у женщин с нормально протекающей беременностью, устранить нарушения антиоксидантного статуса и усиление процессов ПОЛ и улучшить клиническое течение ПЭ. Так, после проведенной терапии с включением со-3 ПНЖК наблюдалось более раннее (на 2-3 дня), чем при применении общепринятой терапии, исчезновение клинических проявлений ПЭ, более благоприятное течение ПЭ и исходы беременности и родов для матери и плода (своевременные роды в 2 раза чаще, а преждевременные - в 5 раз реже, чем у пациенток группы сравнения; более высокий процент (93%) самостоятельной родовой деятельности у женщин, принимавших со-3 ПНЖК, и 75% - в группе сравнения, соответственно) и детей, родившихся доношенными (90% в группе женщин, принимавших со-3 ПНЖК, и 47% в группе сравнения). Эти результаты послужили основанием для использования со-3 ПНЖК в комплексной терапии ПЭ у беременных женщин в ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития РФ.

Полученные данные, в сочетании с проведенными нами исследованиями in vitro, подтверждают гипотезу об антиоксидантных эффектах со-3 ПНЖК, обусловленных их включением в состав ЛП комплексов, обладающих максимальной АОА в крови, а также стимуляцией синтеза ТФ - как одного из важных АО факторов крови [315]. Возможно, этот эффект реализуется путем влияния со-3 ПНЖК, входящих в состав рыбьего жира, на активность ядерного фактора каппа би [219, 220], который, в соотвествии с современными представлениями, отвечает за экспрессию многих молекул, принимающих участие в развитии воспаления. Можно также предполагать, что этот процесс опосредован образованием противовоспалительных эйкозаноидов, в частности, лейкотриенов (ЛТ) 5 серии из ЭПК [220, 221].

Еще одним подходом к оценке возможной роли ш-3 ПНЖК в формировании АОА крови явилось параллельное изучение ПОЛ, АОА и спектра ЖК у недоношенных детей, для которых характерно снижение уровня ПНЖК в организме вследствие прерывания их внутриутробного развития во второй половине беременности, когда идет максимальное накопление плодом ПНЖК [111, 113, 208, 331] .

Проведенные исследования показали, что уровень МДА и АОА в крови недоношенных детей был существенно и достоверно ниже, чем их уровень в пуповинной крови у здоровых доношенных детей (58% и 46% от контроля для АОА и МДА, соответственно). Снижение уровня суммарной АОА говорит о нарушении антиоксидантной защиты недоношенных детей, что согласуется с литературными данными о высокой частоте у этой категории больных детей свободно-радикальной патологии, такой как ретинопатия недоношенных, бронхолегочная дисплазия, некротизирующий энтероколит и др. [272, 273], а кроме этого может служить причиной задержки роста, характерной для недоношенных детей [208, 272]. В то же время, обращает на себя внимание снижение в крови у недоношенных детей уровня МДА как показателя процессов ПОЛ. Согласно данным литературы [6, 26, 308] интенсивность ПОЛ поддерживается в здоровом организме на определенном уровне, поскольку ПОЛ участвует в таких важных физиологических процессах, как апоптоз, неспецифический иммунитет и др., обеспечивая нормальный уровень тканевой дифференцировки и иммунной защиты. Поэтому снижение уровня МДА как показателя ПОЛ в крови у недоношенных детей является неблагоприятным признаком, так как в результате снижения ПОЛ могут нарушаться процессы нормальной дифференцировки тканей и защитные механизмы у недоношенных детей. Таким образом, можно предполагать, что низкий уровень АОА сыворотки крови и показателя интенсивности процессов ПОЛ -МДА - у недоношенных детей относятся к числу факторов, ответственных за нарушение роста и дифференцировки, которые вносят вклад в развитие ряда патологических состояний, сопровождающих недоношенность. Исходя из выдвинутой гипотезы, с нашей точки зрения, необходимо пересмотреть представления об оптимальных дозах пищевых антиоксидантов. В самом деле, если свободно-радикальная патология недоношенных младенцев (ретинопатия недоношенных, некротический энтероколит) является лишь следствием незрелости младенцев, в особенности недоношенных, то поступление с пищей достаточного количества всех экзогенных антиоксидантов, включая витамины А, Е, С, бета-каротин, микроэлементы (Zn, Си, Mn, Se), глутатион, серусодержащие аминокислоты и др. играет исключительно важную роль в поддержании их гомеостаза. Однако, если усиление ПОЛ, сопряженное с генерацией свободных радикалов, служит также одним из механизмов регуляции процессов клеточного роста и дифференцировки [69, 118, 262, 359, 360], можно полагать, что избыточное поступление антиоксидантов с пищей в организм ребенка раннего возраста, в особенности в определенные критические периоды, может нарушить тонкую регуляцию дифференцировки тканей, лежащую в основе процессов развития.

Параллельная с изучением ПОЛ оценка уровня жирных кислот в крови у недоношенных детей показала, что у них наблюдается достоверное снижение уровня всех представителей со-6 ПНЖК - линолевой (18:2), дигомо-гамма-линоленовой (20:3) и, особенно, арахидоновой кислоты (20:4). В то же время на фоне снижения уровня со-6 ПНЖК выявлено накопление в плазме крови эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК, 20:5) и суммы со-3 ПНЖК. Вместе с тем, уровень двух других ДЦ ПНЖК со-3 семейства (ДПК 22:5 и ДГК 22:6) проявлял тенденцию к снижению. Можно предполагать, что выявленное нами снижение уровня арахидоновой кислоты (20:4) со-6 семейства в плазме крови недоношенных детей частично компенсируется за счет накопления в ней ЭПК (20:5) со-3 семейства, метаболизация которой в ее более длинноцепочечные производные - 22:5 и 22:6 - понижена. Этот феномен - блок превращения ЭПК в ДГК - не был описан ранее в литературе. Вместе с тем, было высказано предположение, что недостаток эссенциальных ПНЖК со-6 семейства может компенсироваться увеличением содержания в организме производных олеиновой кислоты семейства со-9, способной синтезироваться в организме [54, 55, 58]. Полученные нами данные не согласуются с данной гипотезой и показывают, что у детей в условиях дефицита ПНЖК со-6 семейства производные эссенциальных ПНЖК со-3 семейства накапливаются в крови быстрее и/или более предпочтительно, чем жирные кислоты семейства со-9.

Снижение в плазме крови недоношенных детей субстрата ПОЛ - со-6 ПНЖК - может быть причиной наблюдавшегося снижения уровня ПОЛ, проявляющегося в уменьшении уровня в крови МДА, а снижение АОА плазмы крови недоношенных детей, видимо, обусловлено низким содержанием ДЦ ПНЖК (арахидоновой, ДПК и ДГК) в составе фосфолипидов, переносимых липопротеинами.

Таким образом, результаты, полученные при обследовании недоношенных детей, представляющих собой как бы природную модель недостаточной обеспеченности организма ДЦ ПНЖК, связанной с прерыванием внутриутробного развития ребенка в период, предшествующий максимальному трансплацентарному переносу ДЦ ПНЖК от матери к плоду, подтверждают предположение об участии этих соединений в формировании АО системы сыворотки крови, достоверно сниженной у этих детей.

Через 2 недели после начала их вскармливания либо модифицированной смесью для недоношенных детей, обогащенной ДЦ ПНЖК - арахидоновой и ДГК, либо стандартной смесью для недоношенных детей (группа сравнения) показал, что в крови детей, получавших обогащенную смесь, достоверно увеличивался по сравнению с исходным уровнем, суммарный уровень со-6 ПНЖК, и, в частности, линолевой кислоты (18:2). При этом снижался уровень ЭПК (20:5), что могло свидетельствовать о прекращении компенсаторного накопления ЭПК в крови вследствие увеличения в ней уровня со-6 ПНЖК. ПОЛ на этом фоне повышалось, стремясь к уровню у доношенных детей. Таким образом, наблюдаемые изменения в спектре жирных кислот носили в целом благоприятный характер, хотя и не нормализовали спектр жирных кислот полностью. В частности, не удалось нормализовать в крови детей уровень арахидоновой кислоты (20:4).

В группе сравнения, у детей, получавших такую же смесь, но не обогащенную ДЦ ПНЖК, уровень МДА к концу исследования резко снизился (M±SD: 0,41± 0,36 и 0,26±0,30 нмоль/мл в начале и конце исследования, соответственно). При этом, исследование спектра жирных кислот плазмы крови данной группы детей выявило нарастание его дисбаланса. В частности, продолжилось снижение уровня арахидоновой кислоты и рост ЭПК и суммы со-3 ПНЖК в плазме крови детей.

Полученные результаты подтверждают предположение о том, что ДЦ ПНЖК играют существенную роль в формировании АО статуса у детей. В частности, снижение обеспеченности этими жирными кислотами, которое наблюдается у недоношенных детей, ведет к ухудшению антиоксидантного статуса, что выражается в снижении АОА сыворотки крови. При этом дополнительное потребление ДЦ ПНЖК в составе специализированной смеси вызывало тенденцию к нормализации состава жирных кислот плазмы крови и ПОЛ. Однако нормализации АОА крови под влиянием обогащения смеси не наблюдалось в связи с неполной нормализацией состава ДЦ ПНЖК плазмы крови.

Следующий раздел работы был направлен на оценку возможного участия ДЦ ПНЖК в реализации альтернативной, то есть связанной не с их ролью в развитии заболеваний, а с участием в контроле клеточной пролиферации и дифференцировки, функции системы ПОЛ/АОА. Эта гипотеза, выдвинутая в 70-е годы прошлого столетия Е.Б.Бурлаковой и соавт. [1], была впоследствии поддержана работами других исследователей [118, 308, 359, 360].

С этой целью нами было проведено исследование вклада отдельных антиоксидантов в суммарную АОА крови у детей в сравнении с этими показателями у взрослых людей, изучение возрастной динамики АОА крови у человека и экспериментальных животных, а также изучение возможной связи между АОА крови и показателями клеточной пролиферации в тканях животных.

В результате проведенных исследований было установлено, что суммарная АОА т? 2+ сыворотки крови детей первого года жизни, изученная в системе подавления ге -зависимого ПОЛ в ЖЛП, достоверно (Р<0,05) превышает АОА детей в возрасте 5 лет и взрослых людей, и выше, чем у детей 10-14 лет. АОА сыворотки крови детей всех обследованных возрастных групп, была выше, чем у взрослых людей, несмотря на то, что по данным литературы, содержание большинства АО компонентов в крови в детском возрасте ниже, чем у взрослых [223, 228, 229]. Примечательно, что максимальная АОА наблюдается в крови у новорожденных детей. Этот феномен отражает, очевидно, эволюционно закрепленную способность новорожденных противостоять агрессивному воздействию Ог, которому он подвергается в первые же минуты после прекращения внутриутробного существования и появления на свет. Максимальная АОА в крови у новорожденных детей совпадает с максимальной скоростью роста, наблюдающейся в этот период у детей [276]. Повышение АОА крови наблюдается также и у подростков, т.е. в период второго ростового скачка.

Учитывая полученные нами результаты изучения вклада отдельных АО в формирование АОА сыворотки крови (глава З.1.), представлялось целесообразным сравнить спектр ЖК крови у детей разного возраста. Было показано, что в плазме крови здоровых доношенных новорожденных детей достоверно выше уровень длинноцепочечных ПНЖК: ДГЛК (20:3), АК (20:4) и ДГК (22:6), а в мембранах эритроцитов - АК (20:4) и ДПК (22:5) по сравнению с их уровнем в плазме крови и мембранах эритроцитов подростков и беременных женщин. В то же время уровень АК и ДПК в крови у подростков, для которых характерен ростовой скачок, был выше по сравнению с беременными женщинами. Эти данные согласуются с выдвинутым положением о важной роли ДЦ ПНЖК в формировании АОА сыворотки крови и указывают также на их возможную роль в процессах роста.

В связи с этим была проведена сравнительная оценка вклада отдельных компонентов АОС в суммарную АОА различных фракций сыворотки крови взрослых и детей. Хроматографическое разделение сыворотки крови детей показало, что их суммарная АОА характеризовалась одним пиком с максимальной АОА, соответствующим фракции №13, и отсутствием дополнительного пика, соответствовавшего 16 фракции у взрослых (глава 3.1.2.) и определяется, следовательно, высокомолекулярным ЛП компонентом сыворотки крови, содержащим входящие в состав ЛП ПНЖК со-6 и соЗ семейства. Эти результаты согласуются с результатами изучения возрастной динамики уровня ПНЖК в крови детей, приведенными в предыдущем разделе, и подтверждают сделанный вывод о важной роли ДЦ ПНЖК в формировании АОА сыворотки крови и их возможном участии в регуляции процессов роста. Такие важные высокомолекулярные антиоксиданты сыворотки крови как ТФ и ЦП не участвовали в формировании суммарной АОА у детей, поскольку присутствовали в крови в существенно меньшей концентрации, чем у взрослых. Представления о том, что именно ДЦ ПНЖК играют важную роль в формировании АОС у детей, согласуются с известными из литературы данными о том, что ю-6 и ю-З ПНЖК имеют большое значение для нормального развития детей, ю-6 и ю-3 ПНЖК активно захватываются из кровотока матери организмом плода в последнем триместре беременности, а после рождения ребенка поступают в его организм с грудным молоком и используются как строительный материал для клеточных и субклеточных мембран, в особенности для растущего с высокой скоростью головного мозга и формирования зрительного анализатора [93, 123, 158, 208]. Эти данные заслуживают особого внимания в связи со значительным интересом исследователей к проблемам роста и его регуляции.

В частности, в последние годы активно обсуждается проблема программирования заболеваний взрослого человека неблагоприятными факторами, действующими на ранних этапах онтогенеза, в период так называемых «критических окон» развития. Одним из таких факторов является скорость роста во внутриутробном и раннем постнатальном периоде [152, 276, 289]. Показано, что как задержка роста, так и скачкообразное увеличение скорости роста ведут к неблагоприятным метаболическим сдвигам, проявляющимся развитием избыточной массы тела и ожирения, инсулинорезистентности, диабета, гипертонии, атеросклероза и других «болезней цивилизации» [152, 276, 289]. В то же время, механизмы регуляции процессов нормального роста не ясны. Поэтому изучение факторов, влияющих на рост и развитие организма в различные возрастные периоды, представляется весьма актуальным.

Рост складывается из трех процессов: роста всего тела, роста органов и тканей и увеличения количества и размера клеток. Последние два компонента роста регулируются путем изменения баланса клеточной пролиферации и дифференцировки. В раннем возрастном периоде этот баланс сдвинут в сторону процессов пролиферации, и первые месяцы жизни характеризуются максимальной скоростью роста как у человека, так и у экспериментальных животных, в частности, крыс [276]. В то же время недостаточно данных о факторах, определяющих высокую скорость роста в раннем возрасте.

Одним из механизмов регуляции клеточного цикла и процессов клеточной пролиферации и дифференцировки может служить изменение баланса между антиоксидантным статусом организма и прооксидантами. Так, показано, что первичные продукты ПОЛ - окисленные липопротеины низкой плотности (оЛПНП) обладают свойством ингибировать клеточную пролиферацию, в частности, путем снижения экспрессии митогенов [117, 118] и общего числа клеток, как входящих в клеточный цикл, так и завершивших его, а также уровня в ядре белков клеточного цикла [359]. Основным механизмом антипролиферативного действия оЛПНП авторы считают снижение транслокации белков клеточного цикла из цитоплазмы в ядро, в частности, такое снижение наблюдалось для циклина D1, ответственного за переход клетки из фазы Go в фазу Gi. Следствием этого было снижение образования активных комплексов циклинов с циклин-зависимыми киназами. В частности, обнаружено снижение активности Cdc2 и Cdk2 киназ в клетках, обработанных оЛПНП [359]. Таким образом, увеличение перекисного окисления липидов, приводящее к повышению уровня оЛПНП в крови или среде, ведет к торможению клеточной пролиферации, по-видимому, за счет торможения фазы Gi.

Что касается тканевой дифференцировки, то одним из важных механизмов ее регуляции является апоптоз, в свою очередь регулируемый при активном участии свободных радикалов [308]. При развитии плода свободные радикалы вовлечены в контроль апоптоза и детальной индивидуализации развивающихся частей зародыша. На ранних этапах эмбриогенеза присутствие перекиси водорода обязательно для формирования бластоциста и апоптоза внутренней массы [272].

Таким образом, соотношение процессов ПОЛ и АОА в организме может оказывать влияние на соотношение в нем процессов пролиферации и дифференцировки и, таким образом, служить фактором регуляции скорости роста. В связи с этим следущим этапом работы явилось сопоставление возрастной динамики АОА и интенсивности клеточной пролиферации и апоптоза в различные возрастные периоды у экспериментальных животных (крыс). Исследование было проведено с помощью метода проточной цитометрии на клеточных популяциях печени и тимуса крыс.

При этом было выявлено существенное и достоверное снижение уровня АОА у крови у крыс с возрастом. Максимальные значения этого показателя наблюдались в группе новорожденных животных в возрасте 3-4 дней жизни. Более поздние возрастные периоды характеризовались в 6-9 раз меньшей АОА сыворотки крови (22,1 отн.ед. и 2,4 - 4,2 отн.ед. в возрасте 0,5 и 6-26 недель, соответственно). Данные, полученные у экспериментальных животных, совпадают с данными, полученными нами у детей разного возраста (глава З.4.). Максимум этого показателя наблюдался в пуповинной крови у новорожденных детей и на первом году жизни, постепенно снижаясь в более поздние возрастные периоды. Высокий уровень АОА совпадает, следовательно, с максимальной скоростью роста, наблюдающейся в этот возрастной период как у детей, так и у экспериментальных животных [276].

Изучение клеточных популяций печени и тимуса крыс с помощью проточной цитометрии показало, что скорость клеточной пролиферации (относительная доля делящихся клеток) в обоих изученных органах была максимальной у новорожденных животных, снижалась с возрастом, причем уменьшение числа делящихся клеток было намного более выраженным в тимусе, чем в печени, и коррелировала с АОА. Наиболее высокая достоверная корреляция выявлена между АОА сыворотки крови и наиболее быстро делящимися клеточными популяциями - лимфоцитами печени (г = 0,815, р<0,001, п=30) и делящимися клетками тимуса (г = 0,789, р<0,001, п=30), что подтверждает выдвинутое нами предположение о связи высокой АОА с пролиферативной активностью: показатели клеточной пролиферации были особенно высоки в раннем возрастном периоде, характеризующемся максимальной скоростью роста. Можно предположить, что высокая АОА может играть регуляторную роль в стимулировании процессов пролиферации и смещении равновесия в сторону их преобладания над процессами апоптоза и дифференцировки. Мы не располагаем конкретными данными относительно влияния СРО на соотношение процессов пролиферации и дифференцировки, однако, можно преположить, что механизм данного явления связан с липопротеидными комплексами, участвующими, по нашим данным, в формировании АОС крови (глава 3.1), а именно ЛПВП и ЛПНП. Как уже было отмечено, оЛПНП могут тормозить процессы клеточной пролиферации [117, 118, 359] и вызывать апоптоз эндотелиальных клеток в культуре, увеличивая концентрацию внутриклеточного кальция, тогда как для нативных форм другого вида липопротеинов - ЛПВП, напротив, показана способность защищать эти клетки от апоптоза [318] и стимулировать процессы клеточной пролиферации в ряде клеточных популяций. Для этих процессов требуется внеклеточный кальций и изменение внутриклеточного pH [261, 323]. В пролиферирующих эндотелиальных клетках ЛПВП стимулируют также РКС-зависимое фосфорилирование белка теплового шока 27 кДа [132]. ЛПВП могут противостоять способности оЛПНП стимулировать апоптоз путем непосредственного влияния на сигнальные пути эндотелиальной клетки, что подтверждается исследованиями^ которых предварительная совместная инкубация ЛПВП с оЛПНП не снижала проапоптотического действия оЛПНП [323].

АОА у подклассов ЛПВП, особенно 2-го и 3-го связывают с наличием собственных антиоксидантных ферментов ЛПВП - параоксоназы-1 [148] и др. [175, 330], антиоксидатной активности, присущей апоА-1 [254], и липидному компоненту ЛПВП, а именно переносимым этим липопротеином фосфолипидам, компонентами которых являются ПНЖК, причем АОА фосфолипидов увеличивается с ростом степени ненасыщенности и длины углеродной цепи ПНЖК, входящих в состав фосфолипидов [30, 52,62].

Важно подчеркнуть, что антиапоптотической активностью может обладать именно липидный компонент ЛПВП, поскольку их защитный эффект, как показано, не зависел ни от антиоксидантного фермента параоксоназы, ни от действия апоА-1, ни от влияния на захват клетками оЛПНП [258, 323]. Данные о том, что липидная фракция ЛПВП может увеличивать в эндотелиальных клетках внутриклеточную концентрацию кальция, который регулирует такие ключевые процессы как пролиферация, апоптоз, синтез простагландинов иЖ) [189, 261].

Наряду с уже упомянутыми обычными фосфолипидами, АОА в липидной фракции ЛПВП могут обладать плазмалогены, в состав которых также входят длинноцепочечные ПНЖК и количество которых в клеточных мембранах может достигать 30% от суммы всех фосфолипидов [35].

Известны данные о стимулирующем действии на рост злокачественных опухолей молочной железы со-6 ПНЖК: ЛК, АК и образующихся из нее эйкозаноидов (ПГЕ2, ЛТВ4, 12-НЕТЕ) [293]. Увеличение потребления со-3 ПНЖК приводило к снижению в организме уровня со-6 ПНЖК и их активных метаболитов и тормозило пролиферацию данного вида опухолей [101, 102]. В то же время, при раке простаты данные о роли со-6 и со-3 ПНЖК в прогрессировании заболевания противоречивы. По одним данным рост пролиферации опухоли связан с повышенным потреблением общего жира и со-6 ПНЖК [101, 102, 293], по другим - прямо пропорционален потреблению а-линоленовой кислоты со-3 семейства ПНЖК [293]. Как было упомянуто выше, ДЦ ПНЖК как со-6 (АК), так и со-3 семейства (ДГК) в составе фосфолипидов и ЛП крови обладают АОА (раздел З.1.), которая максимальна в период активного роста у человека и экспериментальных животных и коррелирует с высокой пролиферативной активностью клеток печени и тимуса у крыс. Литературные данные о стимулирующем действии со-6 ПНЖК на пролиферативную активность злокачественных опухолей молочной железы и простаты косвенно подтверждают вывод, сделанный нами в разделах 3.1.-3.5. о роли ДЦ ПНЖК в формировании АОА и регуляции процессов пролиферации в организме человека и животных.

Другим липидным компонентом, регулирующим клеточный цикл, могут быть сфинголипиды. ]\^ег а1. [258] сообщили, что выделенные из ЛПВП лизосульфатид и сфингозилфосфорилхолин активируют фосфоинозитол-специфическую фосфолипазу С в фибробластах и способствуют клеточной пролиферации. Однако не ясно, влияют ли сфинголипиды на АОА ЛПВП.

Другой точкой зрения на проблему связи АОА с процессами пролиферации является точка зрения Е.Б. Бурлаковой и соавт. [1], наблюдавших увеличение АОА клеточных липидов в период прохождения клеткой фазы [1]. Авторы трактовали полученные результаты в свете представлений о важной роли липидов для построения клеточных мембран и определения их физико-химических свойств. Поскольку АОА является отражением именно физико-химических свойств липидных компонентов, ее изменение могло быть связано с теми процессами, которые происходят на мембранных структурах, в частности с образованием комплекса нуклеопротеидов с липопротеидами мембран, необходимого для репликации ДНК [1]. Важно подчеркнуть, что по данным литературы АОА обладают в первую очередь представители именно со-3 класса, как наиболее длинноцепочечные и ненасыщенные представители жирных кислот [30, 52, 103, 202]. Именно их встраивание в клеточные мембраны может изменять физико-химические свойства последних, способствуя максимально эффективной передаче сигналов, стимулирующих пролиферативные процессы в клетках.

И, наконец, можно предположить, что для делящихся в период активного роста организма клеток необходимо большое количество ДЦ ПНЖК, а именно АК и ДГК, входящих в состав фосфолипидов клеточных мембран. Эти ДЦ ПНЖК в то же время обладают АОА в составе фосфолипидов. Таким образом, ДЦ ПНЖК в период активного роста могут выполнять множественные функции: быть «строительным материалом» для мембран новых клеток, обладать защитными свойствами в отношении СРО и стимулировать рост путем ускорения прохождения клеткой фазы 01.

В предыдущих разделах была показана роль ПНЖК в формировании АОА крови. В то же время, эти соединения являются основным субстратом ПОЛ. Таким образом, со-3 ПНЖК, с одной стороны, выступают в качестве субстратов ПОЛ, с другой стороны, участвуют в формировании АО потенциала. Более того, сложные метаболические взаимоотношения, в которых участвуют со-3 ПНЖК, дополняются еще одной группой метаболических реакций: ПНЖК являются предшественниками различных классов эй коза- и докозаноидов, причем их образование включает в качестве промежуточных метаболитов продукты ПОЛ [342].

Многообразие путей как превращения ПНЖК, так и путей образования и превращения различных видов эйкозаноидов (лейкотриенов, ЛТ), позволяет предполагать возможность их реципрокных взаимоотношений, вытекающих из факта единого источника этих метаболических путей - пула со-3 и со-6 ПНЖК, образующихся в результате их поступления с пищей и освобождения из тканевых депо. Несмотря на всю очевидность данных представлений, эта гипотеза не была рассмотрена ранее в литературе. В связи с этим в работе была проведена оценка данной гипотезы, включающая исследование спектра ЛТ с параллельной оценкой одного из показателей ПОЛ - МДА и АОА крови у условно здоровых детей, детей с бронхиальной астмой (БА) и ожирением.

Пути образования различных серий ЛТ из со-6 и со-3 ПНЖК изучены в ряде работ [116, 221, 251]. Эти исследования ограничены, однако, изучением, преимущественно, ЛТ 4-й серии, тогда как ЛТ 5-й серии остаются изученными недостаточно. При этом изучение образования ЛТ у детей проведено лишь в немногочисленных исследованиях, посвященных оценке продукции ЛТ 4-й серии при некоторых патологических состояниях. В то же время, спектр ЛТ у здоровых детей остается практически неизученным. В связи с этим мы провели детальный анализ всего спектра ЛТ как 4-й, так и 5-й серии у условно здоровых детей, а также у детей с бронхиальной астмой и ожирением. При этом особое внимание было обращено на выявление возможной корреляции между уровнем ПОЛ/АОА и продукцией ЛТ как двух альтернативных путей метаболизма ПНЖК у человека.

Было установлено, что основным классом ЛТ, образуемых лейкоцитами здоровых детей, является производное ЭПК - ЛТД5, количество которого превышает уровень всех других изученных нами видов ЛТ. Этот факт согласуется с обнаруженным высоким содержанием со-3 ПНЖК и, в особенности ЭПК, в мембранах лейкоцитов здоровых детей (раздел З.7.). Обращает на себя внимание также отсутствие образования лейкоцитами здоровых детей лте4.

Изучение указанных показателей у детей, получавших диету с неоптимальным уровнем ПНЖК в условиях санатория, выявило снижение у них в крови уровня МДА и АОА. Обогащение диеты детей со-3 ПНЖК в составе рыбьего жира вело к изменениям спектра ЛТ, направленным в сторону приближения их к спектру и уровню, наблюдаемому у здоровых детей: рост ЛТД5, снижение ЛТД4, С4, В4. Уровень ЛТД5 у детей группы сравнения, получавших капсулы с подсолнечным маслом, напротив, снижался, в то время как уровень лтд4 у них возрастал.

Следует подчеркнуть, что по данным ряда авторов [68, 177, 334], повышенное поступление ПНЖК с пищей в организм детей может привести к усилению ПОЛ. Полученные нами данные не выявили, однако, существенного изменения интенсивности ПОЛ на фоне приема дополнительных количеств со-3 ПНЖК, но, напротив, показали, что дополнительный прием со-3 ПНЖК в составе рыбьего жира, богатого ДЦ ПНЖК, сдерживает тенденцию к росту ПОЛ, наблюдающуюся у детей группы сравнения, не получавших рыбий жир, и ведет к некоторому увеличению суммарной АОА сыворотки крови. Можно полагать, что потребление ПНЖК со-6 семейства в составе капсул с подсолнечным маслом детьми группы сравнения позволяет повысить уровень субстрата ты

ПОЛ в организме с увеличением образования его конечного продукта МДА, тогда как потребление ПНЖК со-3 семейства в составе рыбьего жира обогащает организм детей длинноцепочечными ПНЖК, которые влияют на увеличение суммарной АОА их сыворотки крови.

Сопоставление данных о продукции ЛТ и ПОЛ показало, что реципрокные отношения между уровнем ПОЛ и образованием ЛТ у детей, обследованных в санатории, наблюдаются на уровне тенденции. В то же время полученные данные говорят о том, что такие отношения существуют между ЛТ различных серий (4 и 5) и ЛТ различных видов (В, С, Д и др.). Так, при увеличении уровня образования ЛТД5 снижается уровень образования ЛТД4 При росте уровня ЛТД4 наблюдается снижение уровней ЛТС4 и ЛТВ4. При снижении уровня сульфидопептидного ЛТД5 наблюдается рост несульфидопептидного ЛТВ5

Таким образом, при умеренной стимуляции синтеза ЛТ в организме обследованных в санатории детей под влиянием рыбьего жира реципрокные отношения между ПОЛ и образованием ЛТ выявлены не были. В то же время реципрокные отношения были выявлены в условиях резкого усиления синтеза ЛТ при воспалительном заболевании (БА) и ожирении.

Установлено, что при Б А имело место нарастание продукции всех видов ЛТ при преимущественном увеличении уровня сульфидопептидных ЛТ и, особенно, ЛТС4 и ЛТЕ4 (р=0,018) - провоспалительных метаболитов арахидоновой кислоты ПНЖК со-6 семейства.

Изменения в спектре ЛТ у детей с БА различной степени тяжести согласуются с выводами, сделанными при изучении изменений спектра ЛТ под влиянием дополнительного приема со-3 ПНЖК в составе рыбьего жира условно здоровыми детьми школьного возраста о реципрокности продукции различных семейств и классов ЛТ. Эти сложные отношения могут оказывать влияние на клиническое течение и эффективность терапии различных заболеваний и, в частности, БА. Поэтому их необходимо учитывать при назначении фармпрепаратов, влияющих на образование ЛТ, но не оказывающих влияние на обеспеченность организма ДЦ ПНЖК.

У детей с БА выявлено достоверное снижение уровня МДА в сыворотке крови при всех формах БА, которое может быть отражением реципрокных отношений между метаболизмом ПНЖК по липоксигеназному и перекисному пути. Учитывая роль ПОЛ в таких ключевых процессах жизнедеятельности как иммунный ответ, клеточная пролиферация, дифференцировка, апоптоз и др. [272, 295], обнаруженные данные о снижении уровня МДА, указывающие на снижение интенсивности ПОЛ, свидетельствуют, очевидно, о неблагоприятном изменении в соотношении путей метаболизма ПНЖК. Полученные данные указывают на необходимость пересмотра подхода к антиоксидантной терапии при БА. Можно полагать, что патогенетически более оправданным подходом может служить не назначение антиоксидантов, а коррекция ЖК состава рациона.

Параллельное изучение АОА крови у детей с БА выявило снижение суммарной АОА у детей с легкой БА, не получавших медикаментозного лечения, что, по-видимому, отражает низкий уровень в организме ДЦ ПНЖК, в первую очередь, АК и ЭПК, израсходованных на усиленное образование ЛТ 4 и 5 серии при данном заболевании.

Напротив, при средне-тяжелой форме заболевания АОА сыворотки крови была увеличена, что может быть связано с положительными сдвигами в ЖК составе клеточных мембран у больных БА под влиянием мембраностабилизирующего действия кромогликатов.

Таким образом, полученные нами данные о снижении уровня МДА и повышении АОА крови, по-видимому, могут рассматриваться не как доказательство отсутствия вклада неконтролируемого свободно-радикального окисления в развитие БА, а как свидетельство исчерпания запасов субстрата ПОЛ - ПНЖК, особенно легкоокисляемых

АК и со-3 ПНЖК, связанного с их расходом на синтез ЛТ и других эйкозаноидов, образующихся на развернутом этапе течения БА.

В связи с этим, заслуживают особого, внимания данные, полученные при использовании льняного масла в дополнение к базисной терапии БА. При этом были выявлены более благоприятные тенденции, чем при использовании только базисной терапии, а именно наблюдалось подавление образования провоспалительных медиаторов аллергии - ЛТ 4-ой серии и увеличение содержания противовоспалительных медиаторов ЛТ 5-ой серии.

Прием льняного масла вызывал тенденцию к нормализации уровня ПОЛ (содержание МДА увеличивалось и приближалось к нормальным значениям) и увеличению АОА. В группе детей с БА, получавших только базисную терапию, не удалось добиться нормализации ПОЛ, которое продолжало снижаться.

Таким образом, проведенные исследования позволили впервые получить комплекс данных об образовании важного класса метаболитов со-6 и ю-3 ПНЖК - ЛТ 4-ой и 5-ой серии, соотношении интенсивности ПОЛ и АОА в крови детей с БА легкой, средне-тяжелой и тяжелой степени. Проведенный анализ указывает на достаточно сложный характер изменений в метаболизме ПНЖК при БА у детей. В частности, выявлено нарастание продукции всех ЛТ при преимущественном увеличении уровня сульфидопептидных ЛТ и особенно С4 и Е4 - провоспалительных ЛТ 4-ой серии. Именно с этим можно связать уменьшение образования МДА, одним из основных предшественников которого является АК, расходуемая при БА на образование лтс4 и Е4.

При использовании льняного масла в качестве дополнительного источника со-3 ПНЖК в рационе больных БА наблюдалось увеличение уровня МДА до его уровня в контрольной группе детей и изменение в соотношении ЛТ крови - снижение уровня провоспалительных ЛТ и рост противовоспалительных ЛТ. Таким образом при обогащении рациона ю-3 ПНЖК у больных с хроническим аллергическим воспалением имеют место реципрокные отношения между процессами ПОЛ (увеличение уровня МДА) и уровнем провоспалительных ЛТ 4 серии, в особенности ЛТ С4 и В4- Сниженный уровень МДА при БА у детей может являться биомаркером увеличения продукции провоспалительных ЛТ при аллергическом воспалении.

Изучение тех же показателей, что были изучены у детей с БА, у детей с ожирением, выявило повышенное образование в лейкоцитах провоспалительного ЛТ04, являющегося констриктором гладкой мускулатуры сосудов, кишечника и др. органов [180, 221, 222], и возможно, участвующего в развитии дискинезии желчного пузыря, выявленной у значительного числа обследованных больных. При этом у детей с ожирением отсутствует ЛТБз, что связано, возможно, с недостаточным поступлением ПНЖК, в особенности со-3 класса, в составе их рациона.

Изучение показателей ПОЛ и антиоксидантного статуса выявило снижение на 38% образования МДА в сыворотке крови у детей с ожирением по сравнению со здоровыми детьми. Суммарная АОА сыворотки крови при этом также имела тенденцию к снижению.

Данные, полученные нами у детей с ожирением, указывают, следовательно, на снижение процессов ПОЛ при увеличении уровня образования провоспалительных лейкотриенов 4 серии и, наряду с приведенными данными обследования детей с БА, подтверждают гипотезу о реципрокности основных путей метаболизма ПНЖК.

Увеличение уровня ЛТБ4 в крови детей с ожирением в сочетании со снижением уровня МДА может служить биомаркером метаболизма ПНЖК по липоксигеназному пути и свидетельствовать о наличии воспалительного процесса в организме детей с ожирением.

Приведенные данные об участии ДЦ ПНЖК в формировании АОС и процессах ПОЛ и образовании эйкозаноидов позволили предположить, что изменения в продукции данных соединений отразятся на уровне ПНЖК в клеточных мембранах. В связи с этим нами было проведено изучение спектра жирных кислот мембран клеток крови при различных видах воспаления - патологического процесса, для которого характерно резкое увеличение продукции различных провоспалительных медиаторов [15].

Было установлено, что в мембранах эритроцитов (МЭ) детей с воспалительными заболеваниями ЖКТ (ВЗЖКТ) наблюдается достоверное повышение по сравнению со здоровыми детьми содержания среднецепочечных жирных кислот - лауриновой (12:0), миристиновой (14:0), мононенасыщенной миристоолеиновой (14:1) и тенденция к повышению уровня пентадекановой (15:0), пальмитиновой (16:0) и пальмитолеиновой (16:1), гептадеценовой (17:1) и олеиновой (18:1) жирных кислот.

Одновременно наблюдалось резкое и достоверное снижение уровня ПНЖК семейства со-6 - эссенциальной линолевой кислоты (18:2) и ее метаболитов: арахидоновой кислоты (20:4) - основной ПНЖК клеточных мембран, и предшественницы АК в метаболическом ряду со-6 ПНЖК - дигомо-гамма-линоленовой кислоты (20:3). Это вело к резкому и достоверному снижению суммы со-6 ПНЖК в МЭ детей, страдающих ВЗЖКТ. При этом наблюдались полярные изменения уровня со-3 ПНЖК - резкое увеличение содержания в МЭ эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) (20:5) семейства со-3 и эссенциальной со-3 ПНЖК - а-линоленовой (18:3) кислоты, что вело к повышению суммарного содержания со-3 ПНЖК в МЭ. Однако одновременно имело место снижение содержания в МЭ докозагексаеновой кислоты (ДГК) (22:6 со-3).

Это вело к резкому повышению отношения ЭПК/ДГК (с 1,5 у здоровых до 12,6 у больных детей). В результате отмеченных изменений в уровне со-6 и со-3 ПНЖК у детей с ВЗЖКТ резко (в 3,7 раза) снизилось по сравнению со здоровыми детьми соотношение в МЭ ПНЖК со-6 и со-3, которое составило у них 0,7 против 2,6 у здоровых детей. Одновременно при воспалении в МЭ резко снижался коэффициент эффективности метаболизации (КЭМ) (0,21 - у больных против 1,2 - у здоровых) и менее значительно -индекс ненасыщенности (1,15 - при воспалении, 1,3 - у здоровых детей) [27]. Изменение этих индексов указывает на изменение физико-химических характеристик мембран и позволяет предполагать снижение их жидкостности, пластичности и текучести вследствие снижения степени ненасыщенности жирных кислот, входящих в состав мембран, и уровня длинноцепочечных производных эссенциальных ПНЖК таких, как АК и ДГК [54, 332].

Таким образом, ВЗЖКТ сопровождаются значительным изменением жирнокислотного состава МЭ, которое, возможно, связано с увеличением образования в организме провоспалительных эйкозаноидов и торможением превращения ЭПК в ДГК, аналогичным обнаруженному нами у недоношенных детей. Это в свою очередь может вести к изменению функции клеточных и субклеточных мембран, играющих важную роль в патогенезе болезней ЖКТ [43, 54, 332, 301].

В пользу патогенетической значимости выявленных нарушений состава жирных кислот МЭ говорят результаты изучения состава жирных кислот МЭ у детей с ВЗЖКТ в сочетании с ожирением - заболеванием, которое характеризуется резкими нарушениями метаболизма.

В МЭ крови детей с ожирением сохраняются те же тенденции, что и при ВЗЖКТ у детей с нормальной массой тела, а именно увеличение доли насыщенных жирных кислот и изменение соотношения со-6 и со-3 ПНЖК с резким и достоверным снижением содержания ПНЖК со-6 семейства и параллельным увеличением ПНЖК со-3 семейства в первую очередь, ЭПК и а-линоленовой кислоты. В то же время, также как и в случае ВЗЖКТ, наблюдалось достоверное снижение в МЭ уровня ДГК со-3 семейства. Однако при ожирении, в сочетании с ВЗЖКТ, все выявленные изменения носили менее выраженный характер, чем при ВЗЖКТ у детей с нормальной массой тела. Следовательно, степень нарушений метаболизма жирных кислот при ВЗЖКТ у детей является столь значительной, что на них не могут заметно повлиять даже такие существенные метаболические сдвиги, какие имеют место при ожирении.

При изучении ЖК состава мембран другого типа клеток (лейкоцитов) при другом виде воспаления - хроническом аллергическом воспалении, имеющем место при БА, выявлено значительное и достоверное увеличение уровня ЭПК в мембранах лейкоцитов (МЛ), сопровождавшееся тенденцией к накоплению а-линоленовой кислоты и суммы ПНЖК со-3 семейства и тенденцией к снижению ДГК (22:6 со-3) и ПНЖК со-6 семейства. При этом отношение со-6/со-З ПНЖК в МЛ при БА было снижено в 2 раза (0,39 у больных БА против 0,79 у здоровых детей), а отношение ЭПК/ДГК, напротив, резко возрастало (26,8 при БА против 6,0 у здоровых детей), что приводило к росту индекса ненасыщенности (1,23 - при БА, 0,72 - у здоровых детей), но КЭМ при этом снижался (0,06 - у больных против 0,13 - у здоровых).

Таким образом, полученные результаты показывают, что и воспалительные заболевания ЖКТ, и хроническое аллергическое воспаление при БА, приводят к значительным и сходным изменениям состава жирных кислот клеточных мембран -накоплению ЭПК и снижению уровня ДГК. Этот феномен был выявлен и в МЭ, и в МЛ, которые были избраны в качестве моделей клеток, существенно различающихся по своим функциональным и метаболическим особенностям. Эритроциты представляют собой высокодифференцированные клетки, лишенные ядра и неспособные к делению, с ограниченной метаболической активностью, тогда как лейкоциты являются примером клеток, способных как к клеточному делению, так и к дифференцировке в различные типы клеток иммунного ответа под влиянием стимулов и сигналов воспаления. Однако, несмотря на существенные функциональные различия этих клеток, изменения, происходящие в их мембранах при воспалении, имели много общих признаков, к числу которых, в первую очередь, следует отнести накопление в мембранах ЭПК со-3 семейства и снижение уровня ее длинноцепочечного производного ДГК (22:6 со-3) с увеличением отношения ЭПК/ДГК в 4-8 раз. Увеличение этого отношения говорит о торможении процесса метаболизации ЭПК в ее длинноцепочечные производные, что подтверждается накоплением в мембранах предшественника ЭПК - эссенциальной а-линоленовой кислоты (18:3) со-3 семейства. Рост в МЭ и МЛ уровня ЭПК и а-линоленовой кислоты приводил к увеличению в них суммы со-3 ПНЖК и снижению отношения со-6/со-З. Последнее усугублялось драматическим снижением, особенно в МЭ, уровня оо-б ПНЖК. В МЭ особенно заметным было снижение уровня основной со-6 ПНЖК МЭ - арахидоновой кислоты (20:4), сопряженное с достоверным снижением содержания в МЭ ее предшественников - эссенциальной линолевой (18:2) и дигомо-гамма-линоленовой (20:3) кислот. Таким образом, проведенные исследования позволили впервые выявить резкие изменения состава жирных кислот клеточных мембран, характеризующиеся торможением превращения ЭПК в ДГК, возникающим при воспалении, аналогичные выявленным нами изменениям ЖК состава плазмы крови у недоношенных детей. В качестве рабочих гипотез причин выявленных изменений могут быть рассмотрены следующие.

Недостаток в составе клеточных мембран арахидоновой кислоты (АК, 20:4), может возникать вследствие недостаточного поступления ее в организм с рационом; сниженной метаболизации эссенциальной ПНЖК (линолевой) или повышенного расхода на образование провоспалительных эйкозаноидов (в частности, ЛТ). Дефицит АК в составе клеточных мембран восполняется за счет производных со-3 семейства, а именно ЭПК (20:5), что сопровождается торможением ее метаболизации в длинноцепочечные производные, и, в частности, в ДГК (22:6), которая выполняет важные функции в организме, в особенности, у детей. К ним относятся: пластическая, заключающаяся в участии в построении мембран клеток головного мозга и зрительного анализатора, а также в построении так называемых аннулярных фосфолипидов [27, 32], и защитная, связанная с образованием из ДГК резолвинов и протектинов, - соединений, принимающих активное участие в репаративных процессах в поврежденной клетке [83, 168, 248, 301]. Кроме того, можно полагать, что накопление ЭПК в клеточных мембранах в процессе воспаления является причиной снижения образования из нее противоспалительных эйкозаноидов, в частности лейкотриена Д5, выявленное нами у детей с ожирением (раздел З.6.4.). Таким образом, изменение состава жирных кислот клеточных мембран при воспалении может вести к снижению способности клеток образовывать вещества, обладающие защитными и репаративными свойствами, что, очевидно, может способствовать хронизации и рецидивирующему характеру течения воспалительного процесса [9, 83].

Изменение состава жирных кислот клеточных мембран при воспалении может оказывать существенное влияние и на свойства и функции самой мембраны. Так, в работе [41], авторами изучено влияние жирнокислотного состава рациона экспериментальных животных на спектр жирных кислот митохондриальных мембран и их функциональные свойства, в частности, показатели, характеризующие состояние дыхательной цепи митохондрий: скорость переноса электронов в основной цепи (на внутренней мембране митохондрий), скорость окисления по нефосфорилирующему пути (во внешних мембранах митохондрий), а также количество переносчиков и их стехиометрия. Было выявлено снижение скорости окисления во внутренних мембранах митохондрий у животных, получавших те виды жира, потребление которых приводило к снижению уровня арахидоновой кислоты в митохондриальных мембранах. В то же время наблюдалась активация внешнего пути переноса электронов и увеличение количества цитохромов Ьз с и а и изменение пропорции цитохрома Ьз по отношению к цитохрому а, что подтверждает факт активации внешнего пути транспорта электронов у животных, и является, по-видимому, своеобразной адаптационной реакцией на изменения состава жирных кислот, поступающих с рационом. Таким образом, изменения жирнокислотного состава рациона могут влиять не только на клеточные мембраны, но и на мембраны субклеточных структур В связи с этим можно предполагать, что существенные изменения состава жирных кислот клеточных мембран, выявленные нами при различных видах воспаления, существенно меняют их функциональные свойства, что может являться важным патогенетическим звеном указанных заболеваний, требующим специфического терапевтического подхода и, в частности, использование диетотерапии. С этой точки зрения, полученные результаты могут рассматриваться как указание на необходимость дальнейшего изучения вопроса об оптимальном соотношении в диетических рационах ео-3 и со-6 ПНЖК как патогенетически обоснованном дополнительном подходе к терапии воспалительных заболеваний у детей.

Проведенные исследования позволили нам впервые выявить ряд новых особенностей трех направлений метаболизма ПНЖК: участие в формировании АО потенциала, образование ЛТ и построение биомембран. С помощью разных методических подходов была доказана роль высокомолекулярного липопротеинового комплекса, содержащего длинноцепочечные со-3 и со-6 ПНЖК, в формировании антиоксидантного потенциала крови. Антиоксидантные свойства со-3 ПНЖК были доказаны также при изучении их влияния на показатели ПОЛ и АОА крови у беременных женщин с преэклампсией (ПЭ) и недоношенных детей. При изучении возрастных особенностей АОА крови было показано, что в ее реализации принимают участие высокомолекулярные липопротеидные комплексы, но не ТФ и ЦП. При этом максимальная АОА крови наблюдалась у новорожденных детей. Эти данные были подтверждены в опытах на экспериментальных животных. Проведенные исследования позволили подтвердить гипотезу об участии системы ПОЛ/АОА в клеточной пролиферации, на что указывает высокая положительная корреляция скорости клеточной пролиферации и АОА крови. Изучение трех направлений метаболизма ПНЖК: участие в формировании АО потенциала, образование ЛТ и построение биомембран позволили сделать вывод о существовании реципрокных отношений между указанными путями их метаболизма. Впервые выявлен феномен накопления в крови и мембранах клеток крови эйкозапентаеновой кислоты в сочетании со снижением уровня докозагексаеновой кислоты и со-6 ПНЖК в условиях недостаточной обеспеченности детей ПНЖК, выявленной при обследовании недоношенных детей и детей с различными типами воспалительных заболеваний - аллергическом воспалении при БА и альтеративно-экссудативном при ВЗЖКТ).

Полученные в работе данные используются в комплексной терапии ПЭ у беременных женщин и могут служить основой для разработки диетотерапии болезней детского возраста, основанной на коррекции жирнокислотного состава рационов. Проведенные исследования позволяют заключить, что антиоксидантная активность, уровень МДА как показатель интенсивности ПОЛ, образование лейкотриенов в крови и жирнокислотный состав мембран могут служить биомаркерами метаболизма ПНЖК в организме детей и беременных женщин.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Шилина, Наталия Михайловна, Москва

1. Биохимия/под ред. Е. С. Северина. М.: ГэотарМед, 2004. С. 417-426.

2. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты//Усп. химии. 1985. -Т.54, Вып.9. - С. 1540-1558 .

3. Вельтищев Ю.Е., Святкина О.Б. Новые медиаторы аллергии и воспаления липидной природы//Вопр. мед. химии.-1984.-Т.6.-С. 2-8.

4. Вельтищев Ю.Е., Святкина О.Б. Новые медиаторы аллергии и воспаления липидной природы//Вопр. мед. химии.-1984.-Т.6.-С. 2-8.

5. Владимиров Ю.А. "Свободные радикалы и антиоксиданты" /Вестн. Росс. Акад. мед. наук,-1998, вып. 7,- С. 43-51.

6. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах.-М., 1972. 252 с.

7. Вознесенская Т. С, Кутафина Е. К. и др. Влияние со-3 полиненасыщенных жирных кислот на показатели липидного обмена у детей с нефротическим синдромом//Вопросы детской диетологии. 2003. Т. 1. № 2. С. 90-93.

8. Ворожко И.В. Иммунологические маркеры прогноза эффективности диетотерапии у больных с пищевой аллергией// Автореф. дисс.канд. мед. наук.-М,- 2012,- 25 с.

9. Вржесинская O.A., Бекетова H.A., Васильев A.B. и др. Влияние длительной модификации жирового компонента рациона и дополнительного введения в него коэнизма Qio на обеспеченность крыс витаминами-антиоксидантами»//Вопр. питания .-2010.-N 6.-С. 30-37.

10. Гущин И. С. Немедленная гиперчувствительность (аллергические реакции 1 типа)//Патологическая физиология.-1993.-№1.-С. 51-60.

11. Дадали В.А., Тутельян В.А., Дадали Ю.В., Кравченко JI.B. Каротиноиды. Биологическая активность//Вопр. питания.-2011.-Т. 80, №4.-Стр.4-18.

12. Евстигнеева Р.П., Мягкова Г.И. Лейкотриены природные биологически активные метаболиты полиненасыщенных кислот//Успехи химии. - 1986. -Т. LV, Вып. 5. - С. 843-878.

13. Каган В.Е., Орлов О.Н., Прилипко Л.А. Биофизика (1986) Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. М., 18, 1-136.

14. Каганов С.Ю., Святкина О.Б., Заболотских Т.В. и др. Хронические бронхолегочные заболевания у детей и патогенетическая роль липидных медиаторов// Вопр. охраны мат. и детства.-1990.-Т. З.-С. 3-8.

15. Кейтс М.С. Техника липидологии. М.: Мир, 1975. С. 175.

16. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О. и др. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов.-1988.- Лаб. дело.-№ 5.-Стр.59-62.

17. Клебанов Г.И., Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Любицкий О.Б., Владимиров Ю.А. Антиоксидантная активность сыворотки крови // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. М.: Медицина, 1999. - № 2. - С. 15-22.

18. Комарова О.Н. Клинико-патогенетическое обоснование применения полиненасыщенных жирных кислот со-3 класса в комплексной терапии бронхиальной астмы у детей // Автореф. дисс.канд. мед. наук.-М.-2007,- 24 с.

19. Конь И.Я. Биохимические механизмы действия витамина А. Автореф. дисс. докт. мед. наук, М., 1987, 45 с.

20. Конь И.Я. Прооксиданты и антиоксиданты (АО) в питании/ В м-лах V Международной конференции "Биоантиоксйдант", М., 18-20 ноября 1998. С. 20-21.

21. Кравченко Л. В., Морозов С. В. Антиоксидантный статус крыс, получавших разное количество ликопина//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2003. -Т. 135, N4.-0. 414-418.

22. Кривопишин И.П. "Озон в промышленном птицеводстве".- М.: Россельхозиздат, 1979,- 96 с.

23. Кулаков В.И., Мурашко Л.Е., Бурлев В.Н. Клинико-биохимические аспекты патогенеза гестозов //Акуш. и гинекол.-1995.-№6.-С.З-5.

24. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромалекул: польза, вред, защита// Соровский образовательный журнал, 1999, № 1, с. 2-7.

25. Ланкин В.З., Капелько В.И., Рууге Э.К., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Коэнзим физиологическая функция и перспективы использования в комплексной терапии заболеваний сердечно-сосудистой системы. Пособие для врачей. М.: Медпрактика-М, 2008; 22.

26. Левачев М.М. Значение жира в питании здорового и больного человека: справочник по диетологии /под ред. Тутельяна В.А., Самсонова М.А. М.:Медицина, 2002. С.25-32.

27. Ленинджер А. Основы биохимии в 3-х томах. Т.1. М.: Мир, 1985., Стр. 325-351.

28. Луконькин И.Н. Эффекты синергизма в совместном антиоксидантном действии а-токоферола с производными пантоевой кислоты и Ь-карнитином. //Автореф. дисс.канд. хим. наук.-М.-2000.- 23 с.

29. Мазуев К.А. Влияние полиненасыщенных жирных кислот со-3 класса на позднюю фазу аллергической реакции у больных бронхиальной астмой/ЛГерапевтический архив.-1997.-№3.-С.31-33.

30. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: в 2-х томах. Т. 2. Пер. с англ. Под ред. Л.М. Гинодмана, В.И. Кандрома. М.: Мир, 1993.-415 с.

31. Мартынова Е.А. , Васильев A.B., Гаппаров М.М. Влияние метаболического стресса на экспрессию киназы mTOR в клетках печени мышей//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2009.- Т. 148, 11.-Стр. 533-537.

32. Миронова Г.Е. Состояние антиоксидантной защиты при развитии хронического обструктивного бронхита и применение антиоксидантов в комплексной терапии больных в условиях Крайнего Севера. Автореф. канд. дисс., Москва, 2000.

33. Назаров Е., Мягкова Г. И., Гроза Н.В. Полиненасыщенные жирные кислоты как универсальные эндогенные биорегуляторы//Вестник МИТХТ.-2009.-Т.4, 5,- Стр.3-18.

34. Недосугова Л.В. Окислительный стресс при сахарном диабете типа 2 и возможности его медикаментозной коррекции/Автореф. дисс. докт. мед. наук, М., 2006, 48 с.

35. Недосугова Л.В. Балаболкин М.И., Антонова К.В., Ланкин В.З., Коновалова Г.Г., Лисина М.О. /М-лы 3-го Всероссийского Диабетологического Конгресса.-Москва.-2004.-№4.-С. 16-17.

36. Новгородцева Т.П., Караман Ю.К., Жукова Н.В. Влияние высокожирового рациона на состав жирных кислот липидов плазмы и эритроцитов крови крыс//Вопр. питания.-2011 .-Т.80, №4.-Стр. 19-24.

37. Погожева A.B. Сердечно-сосудистые заболевания, диета и ПНЖК соЗ/ М.,2000, 320 с.

38. Покровский А.А, Левачев М.М., Гаппаров М.М.Г.(1973) Вопросы питания, №4, 3-11.

39. Покровский A.A. Роль биохимии в развитии науки о питании-.М.: Наука, 1974,-127 с.

40. Приворотский В.Ф., Луппова Н.Е. (2005) Кислотозависимые заболевания у детей (клиническая картина, диагностика, лечение) СПб.: СПбМАПО, 89

41. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных пищевых добавок к пище. М. Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004, с.24.

42. СанПиН 2.3.2. 1293-03 «Гигиенические требования по применению пищевых добавок». Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы. М.: Федеральный центргоссанэпиднадзора Минздрава России, 2003.- 416 с.

43. Святкина О.Б. Патогенетическое значение структурно-функциональных изменений мембран иммунокомпетентных клеток// Автореф. дисс.докт. мед. наук.-М,- 1987.24 с.

44. Северин Е.С., Муйжнек Е.Л., Северин С.Е. Концепция вторичных мессенджеров: от фундаментальных основ- к клинической практике.// М.-Изд. «Димитрейд График Групп»- 2005 -226 с.

45. Семенов H.H. Основные проблемы химической кинетики: доклад на VIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии / H.H. Семенов. М. : Изд-во АН СССР, 1956. -26 с.

46. Сергеева М. Г., Варфоломеева А. Т. Каскад арахидоновой кислоты /М. : Народное образование, 2006. 256 с.

47. Терентьев А.А., Молдогазиева Н.Т. Структурно-функциональное картирование а-фетопротеина (обзор)//Биохимия.- 2006,- Т. 71, № 2.- С. 157-172.

48. Титов В.Н., Лисицын Д.М. Жирные кислоты. Физическая химия, биология и медицина.-М.-Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2006.-672 с.

49. Титов В.Н. Атеросклероз как патология полиеновых жирных кислот. Биологические основы теории атерогенеза.-М.: Алтус, 2002.-495 с.

50. Титов В.Н. Нарушение транспорта в клетки насыщенных жирных кислот в патогенезе эссенциальной гипертонии//Вопр. мед. химии. Биомедицинская химия-1998.-Т. 44, вып.4.-Стр. 317-329.

51. Титов В.Н. Первичный и вторичный атеросклероз, атероматоз и атеротромбоз.-М.Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2008.-344 с.

52. Титов В.Н. Филогенез и становление транспорта жирных кислот//Клин. лаб. диагност.- 1999,-№2.-с.1-6.

53. Тутельян В.А. О нормах физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации //Вопр. питания, 2009, №1,4-15.

54. Тутельян В.А., Лашнева Н.В. Биологически активные вещества растительного происхождения. Флавононы: пищевые источники, биодоступность, влияние на ферменты метаболизма ксенобиотиков// Вопр. питания.-2011.-Т.80, №5.-Стр.4-23.

55. Храпова Н.Г. Всегда ли пищевые добавки должны быть антиоксидантами/В кн.: М-лы 1 Симпозиума «Биологически активные добавки и продукты для оздоровления людей в условиях мегаполиса».-Москва, 13-14 ноября.-2001.-С. 29-31.

56. Эммануэль Н.М. Цепные реакции.-М.-1958.-180 с.

57. Якушина Л.М., Таранова А.Г. Быстрый способ определения жирорастворимых витаминов в сыворотке крови//Ж.Физ.Химии, 1994, 68(10), с. 1826-1828.

58. Abrahan С.Е., Miranda G.E., Agnolazza D.L., Politi L.E.,. Rotstein N.P. Synthesis of sphingosine is essential for oxidative stress-induced apoptosis of photoreceptors// Investigative ophthalmology and visual science.- 2010.-V.5, №1.- P.1171-1180.

59. Agostoni C., Trojan S., Bellu R. et al. Developmental quotient at 24 months and fatty acid composition of diet in early infancy: a follow up study//Arch. Dis. Child.-1997.- V.76.-P. 421-424.

60. Agostoni C., Trojan S., Bellu R. et al. Neurodevelopmental quotient of healthy term infants at 4 months and feeding practice: The role of long-chain polyunsaturated fatty acids//Pediatr. Res.-1995.-V. 38.-P. 262-266.

61. Allard JP, Kurian R, Aghdassi E, Muggli R, Royall D.Lipid peroxidation during n-3 fatty acid and vitamin E supplementation in humans// Lipids. 1997 May;32(5):535-541.

62. Allen R.G., Ballin A.K. Oxidative influence on defelopment and differentiation: An overview of a free radical theory of development//! Free Radicals Biol. & Med., 1989, 6: 631-661.

63. Allen R.G., Sohal R.S. /In: Aging in Insects: Stratagies and Mechanisms (Collatz KG, Sohal RS, eds. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany), 1986, p. 168-181.

64. Allen R.G., Venkatraj V.S. Oxidants and antioxidants in development and differentiation // J.Nutr.-1992, 122:631-635.

65. Amici C., Sistonen L., Santoro M.G., Morimoto R.I. Antiproliferative Prostaglandins Activate Heat Shock Transcription Factor //Proc Natl Acad Sci U.S.A., 1992, 89, 62276231.

66. Arakawa H., Lutvall J., Kawikova I., et al. Leukotriene D4- and prostaglandin F2 alpha-induced airflow obstruction and airway plasma exudation in guinea-pig: Role of thromboxane and its receptor// Br J Pharmacol. 1993.- V. 110,- P. 127-32.

67. Arm J. & Lee T. Evidence for a specific role of leukotriene E4 in asthma and airways hyperresponsiveness. In Advances in prostaglandin, Thromboxane and leukotriene research//Raven Press. New York. 1994. - V. 22. - P. 227-240.

68. Arm J., Spur B. and Lee T. The effects of inhaled leukotriene E4 on the airway responsiveness to histamine in subjects with asthma and normal subjects//.!. Allergy Clin. Immunol. 1988. - V. 82. - P. 654-660.

69. Arthur G., Choy P.C. Acylation of 1-alkenyl-glycerophosphocholine and 1-acyl-glycerophosphocholine in guinea pig heart//Biochem. J. 1986.-Vol. 236, №2.-P. 481-487.

70. Balsinde J. et al. Inhibition of calcium-independent phospholipase A2 prevents arachidonic acid incorporation and phospholipid remodeling in P388DI macrophages// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92, № 18,- P. 8527-8531.

71. Balsinde J., Fernandez B., Solis-Herruso J.A. Increased incorporation of arachidonic acid into phospholipids in zymosan-stimulated mouse peritoneal macrophages// Eur. J. Biochem.- 1994,-Vol. 221, № 3.-P. 1013-1018.

72. Barnes P. Pathophysiology of asthma. // Br J Clin Pharmacol. 1996. - V. 42,- P. 3-10.

73. Barnes P., Page C. and Henson P. Platelet Activating Factor and Human Disease.-Blackwell, Oxford, 1989.

74. Bazan NG. Neuroprotectin DI (NPD1): a DHA-derived mediator that protects brain and retina against cell injury-induced oxidative stress// Brain Pathol. 2005 Apr; 15(2): 159-66.

75. Bel E., van der Veen H., Kramps J., Dijkman J. and Sterk P. Maximal airway narrowing to inhaled leukotriene D4 in normal subjects: Comparison and interaction with methacholine// Am. Rev. Respir. Dis. 1987. - V. 136. - P. 979-84.

76. Bellia V., Bonanno A., Cibella F., Cuttitta G., Mirabella A., Profíta M„ Vignola A. and Bonsignore G. Urinary leukotriene E4 in the assessment of nocturnal asthma// J. Allergy Clin. Immunol. 1996. - V. 97. - P. 735-41.

77. Bendich A. 3-Carotene and the immune response, Proc Nutr Soc 1991.50: 263-274,

78. Bendich A. Symposium conclusions: biological actions of carotenoids, J Nutr 119: 135136, 1989.

79. Bendich A., Olson J.A. Biologic actions of carotenoids// FASEB J.- 1989.-3: 1927-1932.

80. Bennett MK, Toth JI, Osborne TF.Selective association of sterol regulatory element-binding protein isoforms with target promoters in vivo//J Biol Chem.- 2004.- V. 279, N. 36.-P. 373 60-3 7367.

81. Benveniste J., Henson P., Cochrate C. Leukocyte-dependent histamine release from rabbit platelets: the role of IgE, basophils and platelet-activating factor// J. Exp. Med. 1972,- V. 156,- P. 1956-1977.

82. Birch E.E., Garfield S., Hoffman D.R. et al. A randomised controlled trial of early dietary supply of long-chain polyunsaturated fatty acids and mental development in term infants//Dev. Ved. Child. Neurol.- 2000.-V. 42.-P. 174-181.

83. Birch E.E., Hoffman D.R., Uauy R. et al. Visual acuity and the essentiality of docosahexaenoic acid and arachidonic acid in the diet of term infants//Pediatr. Res.-1998.-V. 44.-P. 201-209.

84. Black P., Fuller R., Taylor G., Barnes P. and Dollery C. Effect of inhaled leukotriene B4 alone and in combination with prostaglandin D2 on bronchial responsiveness to histamine in normal subjects// Thorax. 1989. - V. 44,- P. 491-495.

85. Botolin D, Wang Y, Christian B, Jump DB. Docosahexaneoic acid (22:6,n-3) regulates rat hepatocyte SREBP-1 nuclear abundance by Erk- and 26S proteasome-dependent pathways/AI Lipid Res.-2006.-V.47, N. 1 .-P. 181 -192.

86. Brain S. and Williams T. Leukotrienes and inflammation // Pharmacol. Ther. 1990. - V. 46,- P. 57-66.

87. Brash A.R. Arachidonic acid as a bioactive molecule// J. Clin. Invest.- 2001.-Vol. 107, № Il.-P. 1339-1345.

88. Bratton D., Clay K. and Henson P. Cellular sources of platelet activating factor and related lipids, in The Handbook of Immunopharmacology: Lipid Mediators (Cunningham FM ed), Academic Press, London. 1994. P. 193-221.

89. British Nutrition Foundation. Unsaturated Fatty Acids. Nutritional and physiological significance. London: Chapman & Hall.- 1992.

90. Broughton K.S., Johnson C.S., Pace B.K., Liebman M., Kleppinger K.M. Reduced asthma symptoms with n-3 fatty acid ingestion are related to 5-series leukotriene production//Am. J. Clin. Nutr.-1997.-V.65.-P.1011-1017.

91. Brown M D, Hart C, Gazi E, Gardner P, Lockyer N, Clarke N. Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on metastatic spread from prostate cancer Br J Cancer. 2010 January 19; 102(2): 403-413.

92. Brown MD, Hart CA, Gazi E, Bagley S, Clarke NW. Promotion of prostatic metastatic migration towards human bone marrow stoma by Omega 6 and its inhibition by Omega 3 PUFAs// Br J Cancer.- 2006,- V.94.-P. 842-853.

93. Budowski P. The omega-3 fatty acids peroxidation paradox//Redox.Rep.- 1996.- V.2.-P.75-77.

94. Burgess J. R. Attention deficit hyperactivity disorder: observational and interventional studies. Paper presented at: NIH workshop on m-3 essential fatty acids and psychiatric disorders; September 2-3, 1998; Bethesda, Md.

95. Burton G.W. Antioxidant action of carotenoids, J Nutr 1989119: 109-111,.

96. Burton G.W., Traber M.G. Vitamin E: antioxidant activity, biokinetics, and bioavailability, Annu Rev Nutr 1990.-10: 357-382.

97. Calder P.C. Fatty acid metabolism and eicosanoid synthesis//Clinical Nutrition.-2001.-V.20, №4.-P. 1-5.

98. Campbell A. Bronchial epithelial cells in asthma//Allergy. 1997. - V. 52. - P. 483-489.

99. Carlson S.E. Long chain polyunsaturated fatty acids in infants and children/In: Dietary fats in infancy and childhood.-Annales Nestle.-1997.-V.55, N2.-P.52-62. 25aUauy R., Castillo C. // J. Nutr.-2003.-V. 133,- P. 2962S-2972S.

100. Carlson S.E., Ford A.J., Werkman S.H. et al. Visual acuity and fatty acid status of terminfants fed human milk and formulas with and without docosahexaenoate and arachidonate1from egg yolk lecithin//Pediatr. Res.-1996.-V. 39.-P. 882-888.

101. Carlson S.E., Werkman S.H., Peeples J.M. et. al. Arachidonic acid status correlates with first year growth in preterm infants// Proc. Natl. Acad. Sei. US A.-1993.-V.90,- P. 10731077.

102. Carnielli V.P., Wattimena D.J.L,, Luijendijk I.H.T. et al. The very low birth weight infant is capable of synthesizing arachidonic and docosahexaenoic acids from linoleic and linolenic acids// Pediatr. Res.-1996.-V.40.-P. 169-174.

103. Chan S., McCowen K.C., Bistrian B. //Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 1998; 1:163-9.

104. Chapkin RS, Hubbard NE, Erickson KL. 5-series peptido-leukotriene synthesis in mouse peritoneal macrophages: modulation by dietary n-3 fatty acids// Biochem Biophys Res Commun. 1990. - V. 171. - № 2. - P.764-9.

105. Chen C.H., Jiang W., Via D.P., Luo S., Li T.R., Lee Y.T., Henry P.D. Oxidized low-density lipoproteins inhibit endothelial cell proliferation by suppressing basic fibroblast growth factor expression //Circulation.-2000.-V. 101.-P. 171-177.

106. Chen W, Jump DB, Esselman WJ, Busik JV. Inhibition of cytokine signaling in human retinal endothelial cells through modification of caveolae/lipid rafts by docosahexaenoic acid//Invest Ophthalmol Vis Sci.-2007.-V. 48, N.1.-P.18-26.

107. Chilton F. H., Murphy R. C. Remodeling of arachidonate-containing phosphoglycerides within the human neutrophil //J. Biol. Chem. 1986. - Vol. 261, № 17,- P. 7771-7777.

108. Chung K. Platelet-activating factor in inflammation and pulmonary disorders//Clin Sci. -1992. -V. 83. P. 127-138.

109. Clancy R., Hugli F. The extraction of leukotriens (LTC4, LTD4, LTE4) from tissue fluids: the metabolism of these mediators during IgE-dependemt hypersensitivity reactions in lung//Anal. Biochem.-1983.-V. 133.-P. 30-39.

110. Clandinin M.T., Chapell J.E., Van Aerde J.E.E. Requirements of newborn infants for long chain polyunsaturated fatty acids//Acta Paediatr Scand.-1989.V. 351 Suppl.-P. 63-71.

111. Coffey RG, Hadden JW, Middleton E Jr. Increased adenosine triphosphatase in leukocytes of asthmatic children //J Clin Invest. 1974 Jul;54(l):138-46.

112. Cohen P., Noveral J., Bhala A., Nunn S., Herrick D. and Grunstein M. Leukotriene D4 facilitates airway smooth muscle cell proliferation via modulation of the IGF axis//Am. J. Physiol. 1995,- V. 269. - P.151-157.

113. Coleman R.A., Lewin T.M., Van Horn C.G., Gonzalez-Baro M.R. Do long-chain acyl-CoA synthetases regulate fatty acid entry into synthetic versus degradative pathways?//J Nutr.-2002.-V.132, N8.-P.2123-2126.

114. Colville-Nash P.R., Qureshi S.S., Willis D., Willoughby D.A. Inhibition of Inducible Nitric Oxide Synthase by Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Agonists: Correlation with Induction of Heme Oxygenase 1//J Immunol, 1998, 161, 978-984.

115. Coniglio J. G. How does fish oil lower plasma triglycerides?//Nutr. Rev. 1992; 50: 7: 195197.

116. Cunnane, S. C. Problems with essential fatty acids: time for a new paradigm?// Prog. Lipid Res. 2003. - Vol. 42, № 6. - P. 544-568.

117. Cynamon H.A., Isenderg J.N., Nguyen C.H. Erythrocyte malondialdehyde release in vitro: a Functional measure of vitamin E status//Clin Chim Acta.- 1985.- V.151: 169-176.

118. Daleke D. L. Regulation of transbilayer plasma membrane phospholipids asymmetry // J. Lipid Res. 2003. - Vol. 44, № 2. - P. 233-242.

119. Darbon J-M, Tournier J-F, Tauber J-P, et al. Possible role of protein phosphorylation in the mitogenic effect of high density lipoproteins on cultured vascular endothelial cells// J Biol Chem. 1986; 261: 8002-8008.

120. Davidge S.T., Hubel C.A., Brayden R.D., Capeless E.D., McLaughlin M.K. Sera antioxidant activity in uncomplicated and pre-eclamptic pregnancies//Obstet. and Gyvecol.- 1992.-V.79, N.6.-P. 897-901.

121. De Caterina R., Caption R., Giannessi D. n-3 fatty acids reduce proteinuria in patients with chronic glomerular disease//Kidney. Int. 1993; 44(4): 843-850.

122. De la Puerta R, Martinez-Dominguez E, Ruiz-Gutierrez V. Effect of minor components of virgin olive oil on topical antiinflammatory assays. Z. Naturforsch. 2000, 55: 814-819.

123. DeBose-Boyd RA, Brown MS, Li WP, Nohturfft A, Goldstein JL, Espenshade PJ. Transport-dependent proteolysis of SREBP: relocation of site-1 protease from Golgi to ER obviates the need for SREBP transport to Golgi. Cell.-1999.- V.99, №7.-P. 703-712.

124. Decsi T., Szabo E., Kozari A., Erhardt E., Marosvolgyi T., Solvesz G. Polyunsaturated fatty acids in plasma lipids of diabetic children during and after diabetic ketoacidosis//Acta Paediatr. 2005; 94 (7): 850-855.

125. Diamant Z., Hiltermann J., van Rensen, et al. The effect of inhaled leukotriene D4 and methacholine on sputum cell differentiationin asthma//Am. J.Respir. Crit. Care Mefd.-1997.-V. 155.-P. 1247-1253.

126. Diplock A.T. Antioxidant nutrients and disease prevention: an overview, Am J Clin Nutr 53:189S-193S, 1991.

127. DiRusso C.C.et al. Comparative biochemical studies of the murine fatty acid transport proteins (FATP) expressed in yeast//J Biol Chem.-2005 .-V.280, N17.-P.16829-16837.

128. Dormandy T.L. An approach to free radicals, Lancet 1983.ii: 1010-1014,

129. Draper H.H., Bettger W.J. Role of nutrients in the cause and prevention of oxygen radical pathology//Adv. Exp. Med. Biol.-1994.- P. 366.

130. Drazen J. Comparative contractile responses to sulfidopeptide leukotrienes in normal and asthmatic human subjects//Ann. N.Y. Acad. Sci.-1988.-V. 524.-P. 289-297.

131. Drazen J., O'Brien J., Sparrow D., Weiss S., Martins M., Israel E. and Fanta C.Recovery of leukotrien E4 from urine of patients with airway obstruction//Am. Re. Respir Dis.-1987.-V.136.-P. 985-998.

132. Dumelin E.E., Tappel A.L. Hydrocarbon gases produced during in vitro peroxidation of polyunsaturated fatty acids and decomposition of preformed hydroperoxides, Lipids 1977,-V. 12: 894-900.

133. Duplus E, Glorian M, Forest C. Fatty acid regulation of gene transcription. J Biol Chem. 2000 Oct 6;275(40):30749-52.

134. Durrington P.N., Mackness B., Mackness M.I. Paraoxonase and atherosclerosis//Arterioscler Thromb Vase Biol.- 2001.-V.21.-P.473-480.

135. Dyerberg J., Bang H.O., Stoffersen E., Moncada S., Vane J.R. Eicosapentaenoic acid and prevention of thrombosis and atherosclerosis //Lancet. 1978. - Vol. 2, № 8081.-P. 117119.

136. Eidelman A.I. The effect of long chain polyunsaturated fatty acids on infant development/In: Infant nutrition 2000+.-2001.-P.21-29.

137. Eriksson J.G. Childhood growth and adult body composition and later health /In: Proceed, of Int. Conference on Developmental Origins of Health and Disease "The Power of Programming", Munich, Germany, 6th-8th May, 2010.- P.28.

138. EU Commission Directive 96/4/EC of February 1996 amending Directive 91/321/EEC on infant formulae and follow-on formulae.

139. Evans D., Barnes P.,Coulby L.,Spaethe S., van Alstyne., Pechous P., Mitchell M. O'Connor B. The effect of a leukotrien B4 antagonist LY293111 on allergen-induced responses in asthma//Thorax.-1996.-V.51.-P.l 178-1184.

140. Fairburn K., Grootveld M., Ward R.J. et al. Alpha-tocopherol, lipids and lipoproteins in knee-joint synovial fluid and serum from patients with inflammatory joint disease. Clin. Sci. 1992; 83: 657-664.

141. FAO/WHO Lipids in early development/ In: Fats and oils in human nutrition.-1994.

142. Farooqui A. A., Horrocks L. A. Glycerophospholipids in brain: their metabolism, incorporation into membranes, functions, and involvements in neurological disorders//Chem. Phys. Lipids. 2000. -Vol. 106, № 1.- P. 1-29.

143. Farquharson J., Cockburn F., Patrick W.A. Infant cerebral cortex phospholipid fatty-acid composition and diet//The Lancet.- 1992.-V. 340.-P. 810-813.

144. Ferguson L.R. Nutrigenomics Approches to Functional Foods//J Am Diet Assoc.-2009.-V.109.-P.452-458.

145. Folch J., Lees G.N., Sloanley-Stanley. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. // J. Biol, chem., 1957.-vol. 226, №1.- P. 497-509.

146. Fonteh A. N., Chilton F.H. Rapid remodeling of arachidonate from phosphatidylcholine to phosphatidyl-ethanolamine pools during mast cell activation//J. Immunol. 1992. -Vol. 148, №6.-P. 1784-1791.

147. Ford-Hutchinson A. Flap: A novel drug target for inhibiting the synthesis of leukotrienes// Trends Pharmacol. Sci. 1991. - V. 21. - P. 68-70.

148. Fossati P., Principe L. Serum triglycerides determined colorimetrically with an enzyme that produces hydrogen peroxide//Clin. Chem.- 1982 vol. 28, 0ct;28(10):2077-80.

149. Frei B. Ascorbic acid protects lipids in human plasma and low-density lipoprotein against oxidative demage//Am J Clin Nutr.- 1991.-54.-P. 1113S-1118S.

150. Gaidukov L, Viji RI, Yacobson S, Rosenblat M, Aviram M, Tawfik DS. ApoE induces serum paraoxonase PON1 activity and stability similar to ApoA-I. Biochemistry. 2010 Jan 26;49(3):532-8.

151. German OL, Insua MF, Gentili C, Rotstein NP, Politi LE. Docosahexaenoic acid prevents apoptosis of retina photoreceptors by activating the ERK/MAPK pathway. J Neurochem. 2006 .-V. 98(5): 1507-1520.

152. Giovannucci EL, Rimm EB, Colditz GA, Stampfer MJ, Ascherio A. A prospective study of dietary fat and risk of prostate cancer. J Nat Cancer Inst. 1993.-V. 85.-P. 1571-1579.

153. Goetzl E.J., Lewis R.A. Cellular generation, transport, and effects of eicosanoids. Biological role and Pharmacological intervention//Ann. of NY Academy of Sciences. New York.- 1994.-V. 744: 340.

154. Goldman D.W., Pickett W.C., Goetzl E.J. Human neutrophil chemotactic and degranulating activities of leukotriene B5 (LTB5) derived from eicosapentaenoic acid// Biochem Biophys Res Commun. 1983. - V. 117. - № 1. - P. 282-288.

155. Goldstein JL, DeBose-Boyd RA, Brown MS. Protein sensors for membrane sterols.Cell. 2006 Jan 13;124(l):35-46.

156. Gorenne I., Norel X. and Brink C. Cysteinyl leukotriene receptors in the human lung: What's new? // Trends Pharmacol. Sci. 1996. - V. 17. - P. 342-345.

157. Goswami S., Ohashi M., Stathas P. and Marom Z. Platelet-activating factor stimulates secretion of respiratory glycoconjugate from human airways in culture. // J Allergy Clin Immunol. 1989. - V. 84,- P. 726-734.

158. Goyal J., Wang K., Liu M., Subbaiah P.V. Novel function of lecithin-cholesterol acyltransferase// J Biol Chem.-1997.-V.272.-P. 16231-16239.

159. Grundt H, Nilsen DW, Mansoor MA, Nordey A. Increased lipid peroxidation during long-term intervention with high doses of n-3 fatty acids (PUFAs) following an acute myocardial infarction. Eur J ClinNutr. 2003 Jun;57(6):793-800.

160. Halliwell B. Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause, or consequence? //Lancet.-1994.-V.344.-P.721-774.

161. Hammarstrom S. Leukotriene C5: a slow Reacting Substance Derived from Eicosapentaenoic Acid//J Biol Chem.-1980.-V.255, N.15.-P.7093-7094.

162. Hammond B.R., Jr., Frick J.E. Nutritional protection of the developing retina//The Hong Kong Practitioner.-2007.-V.29.-P. 1-12.

163. Henderson W. Role of leukotrienes in asthma//Ann. Allergy.-1994.-V.72.-P.272-278.

164. Hertzel A.V., Bernlohr D.A. The mammalian fatty acid-binding protein multigene family: molecular and genetic insights into function//Trends Endocrinol Metab.- 2000 .-V.ll, N15.-P.175-180.

165. Hoffman D.R., Birch E.E., Birch D.G. et al. Impact of early dietary intake and blood lipid composition of long-chain polyunsaturated fatty acids on later visual development//!. Pediatr. Gastroenterol. Nutr.-2000.-V.31.-P. 540-553.

166. Hoffstein S., Malo P., Bugelski P. and Wheeldon E. Leukotriene D4 (LTD4) induces mucus secretion from goblet cells in the guinea pig respiratory epithelium//Exp. Lung Res.-1990.-V.16.-P.711-725.

167. Holvoet P., Lee D.-H., Steffes M., Gross M., Jacobs D.R., Jr. Association Between Circulating Oxidized Low-Density Lipoprotein and Incidence of the Metabolic Syndrome//JAMA.-2008.-V. 299,- P. 2287 2293.

168. Honda HM, Wakamatsu BK, Goldhaber JI, et al. High-density lipoprotein increases intracellular calcium levels by releasing calcium from internal stores in human endothelial cells. Atherosclerosis. 1999; 149: 299-306.

169. Horton JD, Goldstein JL, Brown MS. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver// J Clin Invest. 2002 May; 109(9): 11251131.

170. ISSFAL. Recommendation for the essential fatty acid requirement for infant formulas//J. Am. Col. Nutr.-1995.-V.14.-P. 213-214.

171. Itoh K., Wakabayashi M., Katoh Y., Ishii T., Igarashi K., Engel J.D., Yamamoto M. Keapl represses nuclear activation of antioxidant responsive elements by Nrf2 through binding to the amino-terminal Neh2 domain //Genes Dev.-2003,- V.13.- p.76-86.

172. Johnson M, Ostlund S, Fransson G, Kadesjo B, Gillberg C.Omega-3/omega-6 fatty acids for attention deficit hyperactivity disorder: a randomized placebo-controlled trial in children and adolescents//J Atten Disord.- 2009.-12, N.5.-V.394-401.

173. Jump D.B., Botolin D., Wang Y., Xu J., Demeure O., Christian B. Docosahexaenoic acid (DHA) and hepatic gene transcription//Chem Phys Lipids.-2008.-V. 153, №1.-P.3-13.

174. Junqueira L.C., Carneiro J., Long J.A. Basic Histology, 5th ed. Appleton and Lange.- 1986.

175. Kamp F, Hamilton JA. How fatty acids of different chain length enter and leave cells by free diffusion// Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids.-2006.-V. 75, N3.-P.149-159. Epub 2006 Jul 7.

176. Kim Y.J., Yokozawa T., Chung H.Y. Suppression of oxidative stress in aging NZB/NZW mice: effect of fish oil feeding on hepatic antioxidant status and guanidino compounds// Free Radic Res.- 2005.- V.39, N10.-P.1101-1110.

177. Kitajka K, Sinclair AJ, Weisinger RS, Weisinger HS, Mathai M, Jayasooriya AP, Halver JE, Puskäs LG. Effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids on brain gene expression//Proc Natl Acad Sei U S A.- 2004.-V.101, №30.-P. 10931-10936.

178. Klemmer W.H., Schalbach J. Lipoprotein stain on Celluloseacetate plates// Z. Clin. Chem. Clin. Biochem.- 1969. -Vol. 7,- P. 540.

179. Knopp R.H., Paramsothy P. Oxidized LDL and abdominal obesity: a key to understanding the metabolic syndrome//American Journal of Clinical Nutrition. 2006, Vol. 83, No. 1, 1-2.

180. Koletzko B. Trans-fatty acids/In: Dietary fats in infancy and childhood.-Annales Nestle.-1997.-V.55,N2.-P.63-72.

181. Koletzko B., Agostoni C., Carlson S. et al. Long chain polyunsaturated fatty acid (LC-PUFA) and perinatal development//Acta Paediatr. Scand.-2001.-V.90.-P.460-465.

182. Krause R.M., Burke D.J. Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans// Journal of Lipid Research, vol. 23, 1982. P. 97-104.

183. Krell R., Aharony D., Buckner C. and Kusner E. Peptide leukotriene receptors and antagonists//Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukotriene Res. 1990. - V.20. - P. 119126.

184. Kromhout D. Diet and cardiovascular diseases//! Nutr. Health. Aging. 2001; 5(3): 144149.

185. Kwon S.C., Kim Y.B. Antioxidative and aldose reductase-inhibitory effects of a fermentation filtrate of Rubus coreanus//Lab Anim Res.-2011,-V.27, N4,- P.365-368. Epub 2011 Dec 19.

186. Laitinen L., Laitinen A., Haahtela T., Vilkaa V., Spur B. and Lee T. Leukotriene E4 and granulocyte infiltration into asthmatic airways // Lancet. 1993. - V. 341,- P. 989-990.

187. Langseth L. Oxidants, antioxidants, and disease prevention. ILSI Europe, 1995. - 24 p.

188. Lee JY, Sohn KH, Rhee SH & Hwang D. Saturated fatty acids, but not unsaturated fatty acids, induce the expression of cyclooxygenase-2 mediated through Toll-like receptor 4//J. Biol. Chem. 2001,- V.276. - P. 16683-16689.

189. Lee JY, Plakidas A, Lee WH, Heikkinen A, Chanmugam P, Bray G & Hwang DH. Differential modulation of Toll-like receptors by fatty acids: preferential inhibition by n-3 polyunsaturated fatty acids// J. Lipid Res. 2003. - V. 44. - P. 479-486.

190. Lee Y.S., Chou Y.H. Antioxidant profiles in full term and preterm neonates //Chang Gung Med J, 2005,28:846-51

191. Leung I.Y., Sandstrom M.M., Zucker C.L. Neuringer M., Snodderly D.M. Nutritional manipulation of primate retinas. IV. Effects of n-3 fatty acids, lutein, and zeaxanthin on Scones and rods in the foveal region// Exp Eye Res. 2005,- V.81, N5.-P.513-529.

192. Leung I.Y., Snodderly D.M., Neuringer M., et al. Nutritional effects of n-3 fatty acids, lutein and zeaxanthin on the lipofuscin accumulation in the foveal retinal pigment epithelium of rhesus monkeys (abstract).-IOVS.- 2006.-V.47.-P.2822.

193. Lindeman JH, Houdkamp E, Lentjes EG, Poorthuis BJ, Berger HM. Limited protection against iron-induced lipid peroxidation by cord blood plasma. Free Radic Res Commun, 1992; 16(5):285-294.

194. Lindeman JH, van Zoeren-Grobben D, Schrijver J, Speek AJ, Poorthuis BJ, Berger HM The total free radical trapping ability of cord blood plasma in preterm and term babies. Pediatr Res, 1989 Jul;26(l):20-24.

195. Makrides M., Neumann M.A., Byrad R.W. et al. Fatty acid composition of brain, retina and erythrocytes in breast- and formula-fed infants//Am. J. Clin. Nutr.- 1994.-V.60.-P. 189-194.

196. Makrides M., Neumann M.A., Simmer K. et al. Are long-chain polyunsaturated fatty acids essential nutrients in infancy?//Lancet.-l995.-V. 345.-P. 1463-1468.

197. Manchini C., Carbonara A.O., Heremans J.F. Immunochemistry .-1965,- 2, №1, 235-241.

198. Marom Z., Shelhamer J., Bach M., Morton D. and Kaliner M. Slow-reacting substances, leukotrienes C4 and D4 increase the release of mucus from human airways in vitro//Am. Rev. Respir. Des.-1982.-V.126.-P. 31-33.

199. Mater M.K., Thelen A.P., Pan D.A., Jump D.B. Sterol response element-binding protein lc (SREBPlc) is involved in the polyunsaturated fatty acid suppression of hepatic S14 gene transcription// J Biol Chem.- 1999.-V. 274, N.46.-P. 32725-32732.

200. McCarthy K., Bhogal M., Nardi M., et al. Pathogenic factors in bronchopulmonary Dysplasia// Pediatr Res.-1984.-18: 483-487.

201. McElveen J, Mackness MI, Colley CM, Peard T, Warner S, Walker CH. Distribution of paraoxon hydrolytic activity in the serum of patients after myocardial infarction//Clin Chem.-1986.-V.32(4).-P.671-673.

202. Mehendale S., Kilari A., Dangat K., Taralekar V. et al. Fatty acids , antioxidants and oxidative stress in preeclampcia//Int. J.Gyneacol.Obstet.-2008.-V.100 (3).-P.234-238.

203. Metters K. Leukotriene receptors//! Lipid. Mediat. Cell Signal.-1995.-V.12.-P.413-427.

204. Mickleborough T.D, Lindley M.R., Ionesku A.A., Fly A.D. Protective effect of fish oil supplementation reduces severity of exercise-induced bronchoconstriction in asthma//Chest.-2006.-V. 129.-P.39-49.

205. Miki I., Watanabe T., Nakamura M., Seyama Y., Ui M., sato F., Shimizu T. Solubilisation and caracterization of leukotriene B4 receptor-GTP binding protein complex from porcine spleen//Biochem. Biophys. Res. Commun.-1990.-V.166.-P.342-348.

206. Miller SB. Prostaglandins in health and disease: an overview//Semin Arthritis Rheum. 2006 Aug; 36(1 ):37-49. Epub 2006 Jul 3.

207. Miller N.J., Rice-Evans C., Davies M.J., Gopinathan V., Milner A. A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates// Clinical Science .-1993.- V. 84.-P. 407-412.

208. Moreno JJ. Differential effects of arachidonic and eicosapentaenoic acid-derived eicosanoids on polymorphonuclear transmigration across endothelial cell cultures// J Pharmacol Exp Ther. -2009,- V. 331(3): 1111-7.

209. Mozaffarian D., Bryson C. L., Lemaitre R. N. Burke G. L. et al. Fish intake and risk of incident heart failure//J. Am. Coll. Cardiol. 2005; 45: 2015-2021.

210. Mukherjee PK, Marcheselli VL, Serhan CN, Bazan NG. Neuroprotectin Dl: a docosahexaenoic acid-derived docosatriene protects human retinal pigment epithelial cells from oxidative stress. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Jun 1; 101 (22): 8491 -6.

211. Muller D.P.R. Free radical problems of the newborn// Proc Nutr Soc.- 1987.-46: 69-75.

212. Murphy RC, Gijon MA. Biosynthesis and metabolism of leukotrienes//Biochem J. 2007 Aug l;405(3):379-95.

213. Mutch D.M., Wahli W., Williamson G. Nutrigenomics and nutrigenetics: the emerging faces of nutritioiV/The FASEB Journal.-2005.-V.19.-P.1602-1616. 225a. Ferguson L.R. Nutrigenomics Approches to Functional Foods//J Am Diet Assoc.-2009.-V.109.-P.452-458.

214. Nettleton J.A. Omega-3 fatty acids and health. N.Y.: Chapman&Hall, 1994, 355 p.

215. Nguyen SD, Sok DE. Preferable stimulation of PON1 arylesterase activity by phosphatidylcholines with unsaturated acyl chains or oxidized acyl chains at sn-2 position. Biochim Biophys Acta. 2006 Apr;1758(4):499-508.

216. Niki E. Action of ascorbic acid as a scavenger of active and stable oxygen radicals, Am J ClinNutr.- 1991.-54.-P. 1119S-1124S.

217. Nofer JR, Fobker M, Hobbel G, et al. Activation of phosphatidylinositol-specific phospholipase C by HDL-associated lysosphingolipid: involvement in mitogenesis but not in cholesterol efflux. Biochemistry. 2000; 39: 15199-15207.

218. Norum K. R. Dietary fat and blood lipids//Nutr. Rev. 1992; 50: 4: 2: 30-37.

219. O'Hickey S., Hawksworth R., Fong C., Arm J., Spur B., Lee T.//Leukotrienes C4, D4 and E4 enhance histamine responsiveness in asthmatic airways//Am Rev respire Dis.-1991.-V. 144.-P.-1053-1077.

220. O'Connell B.J. and Genest J., Jr. High-density lipoproteins and endothelial function// Circulation.- 2001 .-V. 104.-P. 1978-1983.

221. Okamoto M., Mitsunobu F., Ashida K., Mifune T., Hosaki Y., Tsugeno H., Harada S., Tanizaki Y. Effects of dietary supplementation with n-3 fatty acids compared with n-6 fatty acids on bronchial asthma//Intern. Med.-2000.-V.122.-P.137-142.

222. Packer L. Protective role of vitamin E in biological systems.-Am J Clin Nutr 10-1991,- 53: 1050S-1055S.

223. Park CH, Nguyen SD, Kim MR, Jeong TS, Sok DE. Differential effect of lysophospholipids on activities of human plasma paraoxonasel, either soluble or lipid-bound. Lipids. 2006 Apr; 41(4):371-80.

224. Pawar A., Jump D.B. Unsaturated fatty acid regulation of peroxisome proliferator-activated receptor-alpha activity in rat primary hepatocytes//J Biol Chem. 2003 V.278, N.38.-P.35931-35939.

225. Payan D.G., Wong M.Y., Chernov-Rogan T., Valone F.H., Pickett W.C., Blake V.A., Gold W.M., Goetzl E.J. Alterations in human leukocyte function induced by ingestion of eicosapentaenoic acid//J. Clin. Immunol.-1986.-V.6.-P.402-410.

226. Peet M, Horrobin DF. A dose-ranging study of the effects of ethyl-eicosapentaenoate in patients with ongoing depression despite apparently adequate treatment with standard drugs// Arch Gen Psychiatry.- 2002,- 0ct;59(10):913-919.

227. Perez-Sala D., Cernuda- Morollon E., Pineda-Molina E., Canada F.J. Contribution of covalent protein modification to the antiinflammatory effects of cyclopel63ntenone prostaglandins//Ann NY Acad Sci, 2002, 973, 533-536.

228. Peters S., Schulman E., Mark C. et al. Separation of major prostaglandins, leukotrienes and mono-HETEs by performance liquid chromatography//J. Immunol. Methods.-1983.-V.64.-P.343-353.

229. Perrone S., Salvi G., Billieni C.V., Buonocore G. Oxidative Stress and Nutrition in the preterm newborn //JPGN J Pediatr Gastroenter Nutr.- 2007.- V.45, №3.-P.S178-S182.

230. Phylactos A.C., Costeloe K., Leaf A.A. et al. Polyunsaturated fatty acids and antioxidants in early development. Possible prevention of oxygen-induced disorders//Eur. J. Clin. Nutr.-1994,- V.48, suppl. 3.-P. 1-7.

231. Poulos A. Very long chain fatty acids in higher animals a review// Lipids. - 1995.-Vol. 30, №I.-P. 1-14.

232. Puig M. Body composition and growth /In:Nutrition in Pediatrics. Basic Science and Clinical Applications. Ed. by Walker W.A. and Watkins J.B.-Hamilton: B.C. Decker Inc. Publisher.- 1997.-Chapter IV.-P.44-62.

233. Punga T, Bengoechea-Alonso MT, Ericsson J. Phosphorylation and ubiquitination of the transcription factor sterol regulatory element-binding protein-1 in response to DNA binding//J Biol Chem.- 2006,- V.281, N.35.-P. 25278-25286.

234. Rahman I., MacNee W. Regulation of redox glutathione levels and gene transcription in lung inflammation: therapeutic approaches//Free Radic Biol Med. 2000 May 1 ;28(9): 14051420.

235. Rao K.V. A study of sulfhydryl groups in morphogenesis of the chick embryo.// Wilhelm Roux' Archiv. Ent. Mech. der Organ, 1969, 163: 161-165.

236. Refat M., Moore T.J., Kazui M., et al. Utility of breath ethane as a noninvasive biomarker of vitamin E status of children// Pediatr Res.-1991,- 30: 396-403.

237. Richardson AJ, Montgomery P. The Oxford-Durham study, a randomized, controlled trial of dietary supplementation with fatty acids in children with developmental coordination disorder. Pediatrics. 2005 May;l 15(5):1360-6.

238. Richardson AJ. Omega-3 fatty acids in ADHD and related neurodevelopmental disorders//Int Rev Psychiatry. 2006 .-V. 18, N.2-P. 155-172.

239. Riely C.A., Cohen G., Lieberman M. Ethane evolution: a new index of lipid peroxidation, Science.- 1974.-183.-P. 208-210.

240. Roberts L. J., and Morrow J.D. Measurement of F2-isoprostanes an index of oxidative stress in vivo// Free Radic. Biol. Med-. 2000.-28.-P. 505-513.

241. Robinson TW, Sevanian A, Forman HJ. Inhibition of arachidonic acid release by nordihydroguaiaretic acid and its antioxidant action in rat alveolar macrophages and Chinese hamster lung fibroblasts. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1990 Aug;105(l):113-22.

242. Rojas DB, Gemelli T, de Andrade RB, Campos AG, Dutra-Filho CS, Wannmacher CM.Administration of Histidine to Female Rats Induces Changes in Oxidative Status in Cortex and Hippocampus of the Offspring//Neurochem Res.- 2012 Jan 12. Epub ahead of print.

243. Rola-Pleszczynski M. & Stankova J. Leukotriene B4 enhances interleukin-6 (IL-6) production and IL-6 messenger RNA accumulation in human monocytes in vitro: transcriptional and posttranscriptional mechanisms//Blood.-1992.-V.80.-P.1004-1011.

244. Rola-Pleszczynski M. Leukotrienes/Elsiver.-1982.- Amsterdam. North Holland.-P. 32-47.

245. Rose D.P. Dietary fatty acids and prevention of hormone-responsive cancer// Proc Soc Exp Biol Med.-1997.- V. 216, N2.-P.224-233.

246. Salas-Vidal E, Lomelí H, Castro-Obregón S, Cuervo R, Escalante-Alcalde D, Covarrubias L. Reactive oxygen species participate in the control of mouse embryonic cell death// Exp Cell Res. 1998 Jan 10;238(1): 136-47.

247. Santoro M.G., Garaci E., Amici C. Inhibition of Sendai virus replication by delta 12-prostaglandin J2: induction of heat shock protein synthesis and alteration of protein glycosylatioiV/Proc Natl Acad Sci U.S.A., 1989, 86, 6227-6231.

248. Sauerwald T.U., Hachey D.L., Jensen C.L. et al. Intermediates in endogenous synthesis of C22:6co3 and C20:4co3 by term and preterm infants//Pediatr. Res.-1997,- V. 41.-P. 183187.

249. Saugstad O.D. Oxidative stress in newborn a 30 -year perspective. Biol. Neonate.2005; 3(88):228-36.

250. Schuchardt JP, Huss M, Stauss-Grabo M, Hahn A. Significance of long-chain polyunsaturated fatty acids (PUFAs) for the development and behaviour of children//Eur J Pediatr.-2010.-169, N.2.-P. 149-164.

251. Schwab JM, Chiang N, Arita M, Serhan CN. Resolvin El and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 2007 Jun 14;447(7146):869-74.

252. Serhan CN. Resolution phase of inflammation: novel endogenous anti-inflammatory and proresolving lipid mediators and pathways//Annu Rev Immunol. 2007;25:101-37.

253. Shao B. and Heinecke J.W. HDL, lipid peroxidation, and atherosclerosis// Journal of lipid research.-2009.-V. 50,- P. 599-601.

254. Shindo K., Matsumoto Y., Hirai Y., Sumitomo M., Amano T., Miyakawa K., Matsumura M., Mizuno T. Measurement of leukotriene B4 in arterial blood of asthmatic patients during wheezing attacks// J Intern Med. 1990. - V. 228, №2.-P. 91-96.

255. Sies H. Total antioxidant capacity: appraisal of a concept//J. Nutr.-2007.-V.137, №6.-P.1493-1495.

256. Simopoulos, A. P. The traditional diet of Greece and cancer / A. P. Simopoulos // Eur. J.Cancer Prev. 2004. - Vol. 13, № 3. - P. 219-230.

257. Singh R. B., Dubnov G., Niaz M. A. et al. Effect of an Indo-Mediterranean diet on progression of coronary artery disease in high risk patients (Indo-Mediterranean Diet Heart Study): a randomised single-blind trial//Lancet. 2002; 360: 1455-1461.

258. Skulachev VP Phenoptosis: programmed death of an organism. Biochemistry (Mosc). 1999 Dec;64(12): 1418-1426.

259. Spector T. Refinement of the coomassi blue method of protein quantitation. A simple and linear spectrophotometric assay for < 0,5 to 50 pm protein// Anal. Biochem., 1978. V. 86, N 1. P. 142-146.

260. Sprecher H., Luthria D.L., Mohammed B.S., Baykousheva S.P. Réévaluation of the pathways of the biosynthesis of polyunsaturated fatty acids//J Lipid Res.-1995.-V.36.-P. 2471-2477.

261. Stenson W., Parker C, Sulliwan T. Augmentation of IgE-mediated release of histamine by 5-hydroxy eicosatetraenoic acid and 12-hydroxy eicosatetraenoic acid// Biochem. And Biophis. Res. Commun. 1980. - V. 96. - N 3. - P. 1045-1052.

262. Stocks I., Gutteridge I.M.C., Sharp R.I., Dormandy T.L. The inhibition of lipid autoxidation by human serum and its relation to serum proteins and a-tocopherol// Clin. Sci. Mol. Med.-1974.-47, № 3, 223-233.

263. Stoll A. L., Locke C. A., Marangell L. B., Severus W. E. Omega-3 fatty acids and bipolar disorder: a review//Prostaglandins. Leukot. Essent. Fatty. Acids. 1999; 60: 329-337.

264. Straus D.S.; Glass C.K. Cyclopentenone prostaglandins: new insights on biological activities and cellular targets //Med Res Rev, 2001, 21, 185-210.

265. Suc I, Escarguil-Blanc I, Troly M, et al. HDL and apoA prevent cell death of endothelial cells induced by oxidized LDL// Arterioscler Thromb Vase Biol. 1997; 17: 2158-2166.

266. Sulivan J.L. Iron, plasma antioxidants and the oxygen radical disease of prematurity. Am. J. Dis. Child., 142: 1341-1344, 1988.

267. Surette M.E., Fonteh A.N., Bernatchez C., Chilton F.H. Perturbations in the control of cellular arachidonic acid levels block cell growth and induce apoptosis in HL-60 cells//Carcinogenesis.- 1999. Vol. 20, № 5. - P. 757- 763.

268. Tamagaki T, Sawada S, Imamura H, et al. Effects of high-density lipoproteins on intracellular pH and proliferation of human vascular endothelial cells// Atherosclerosis. 1996; 123: 73-82.

269. Taylor G., Taylor I., Black P., Maltby N., Turner N., Fuller R., Dollery C. Urinary leukotriene E4 after antigen challenge and in acute asthma and allergic rhinitis//Lancet.-1989.-V. 1 .-P.584-588.

270. Tiffany L. Graves and John E. Scott. A High Throughput Serum Paraoxonase Assay for Discovery of Small Molecule Modulators of PON1 Activity. Curr Chem Genomics. 2008; 2: 51-61.

271. Triggiani M., Oriente A., Marone G. Differential roles for triglycerides and phospholipids pools of arachidonic acid in human lung macrophages //J. Immunol. 1994. -Vol. 152, № 3,-P. 1394-1403.

272. Triggiani M., Oriente A., Seeds M.C., Bass D.A., Marone G., Chilton F.H. Migration of human inflammatory cells into the lung results in the remodeling of arachidonic acid into a triglyceride pool//J. Exp. Med. 1995. - Vol. 182, № 5. - P. 1181- 1190.

273. Triggiani M., Schleimer R., Warner J. and Chilton F. Differential synthesis of l-acyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine and platelet-activating factor by human inflammatory cells// J Immunol. 1991. - V. 147. - P. 660-666.

274. Trimboli A.J. et al. Influence of coenzyme A-independent transacylase and cyclooxigenase inhibitors on the proliferation of breast cancer cells// Cancer Res. 1999. - Vol. 59, № 24. -P. 6171-6177.

275. Uauy R., Birch E., Birch D., et al. Visual and brain function measurements in studies of n-3 fatty acid requirements of infant//J. Pediatr.-1992.-V. 120.-P. SI68-180.

276. Uauy R., Castillo C. Lipid requirements of infants: implications for nutrient composition of fortified complementary foods// J Nutr. 2003,- V.133, №9.-P. 2962S-2972S.

277. Valk EE, Hornstra G. Relationship between vitamin E requirement and polyunsaturated fatty acid intake in man: a review//Int J Vitam Nutr Res. 2000 Mar; 70(2):31-42.

278. Vargova V. et al. Will administration of co-3 unsaturated fatty acids reduce the use of nonsteroidal antirheumatic agents in children with chronic juvenile arthritis?//Cas. Lek. Cesk. 1998; 21: 651-653.

279. Visioli F, Bellomo G, Galli C. Free radical-scavenging properties of olive oil polyphenols. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 247: 60-64.

280. Voss A., Reinhart M., Sankarappea S. et al. The metabolism of 7,10, 13, 16, 19-docosapentaenoic acid to 4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic acid in rat liver is independent of 4-desaturase//J.Biol.Chem.-1991.-V. 266.-P. 19995-20000.

281. Wade C.R., Van Rij A.M. (1988) Life Sci. 43, № 13, 1085-1093.

282. Waheed M.A., Mulherkar L. Studies on induction by substances containing sulfhydryl groups in post-nodal pieces of chick blastoderms // J. Embryol. Exp. Morphol., 1967, 17: 161-169.

283. Ward R.J. Peters T.J. Free radicals/ In.: "Clinical Biochemistry Metabolic and Clinical Aspects", ed. Marshall W.S., Bangert St.K. Churchill Livingstone New York, Edinburgh, London, Madrid, Melbourne, San Francisco, Tokyo, 1995, p. 765-777.

284. Weinbrenner T, Schröder H, Escurriol V, et al. Circulating oxidized LDL is associated with increased waist circumference independent of body mass index in men and women//Am. J. Clin. Nutr.- 2006.-V.83.-P.30-35.

285. Weitzel F. and Wendel A. Selenoenzymes regulate the activity of leukocyte 5-lipoxygenase via the peroxide tone// J. Biol. Chem.-1993.-V.268.-P. 6288 6292.

286. Wenzel S., Trudeau J., Kaminsky D., Cohn J., Martin R. and Westcott J. Effect of 5-lipoxygenase inhibition on bronchoconstriction and airway inflammation in nocturnal asthma//Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1995. - V. 152. - P. 897-905.

287. Willatts P., Forsyth J.S., Dimodugno M.K. et al. Effect of long-chain polyunsaturated fatty acids infant formula on problem solving at 10 months of age//Lancet.-1998.-V. 352.-P.688-691.

288. Wilson D. B., Prescott S. M., Majerus P. W. Discovery of an arachidonoyl coenzyme A synthetase in human platelets//! Biol. Chem. 1982. - Vol. 257, № 7. -P. 3510-3515.

289. Winkler J.D. et al. Effects of CoA-independent transacylase inhibitors on the production of lipid inflammatory mediators// III J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995. - Vol. 274, № 3. - P. 1338-1347.

290. Wispe J.R., Bell E.F., Roberts R.J. Assessment of lipid peroxidation in newborn infants and rabbits by measurements of expired ethane and pentane: influence of parenteral lipid infusion.-Pediatr Res 1985.19: 374-379.

291. Woltil HA. Early nutrition of low birthwheigt infants. LC PUFA metabolism, growth and development/ Van Denderen, B.V., Groningen. -1997.-159 p.

292. Xia P., Vadas M.A., Rye K.-A., Barter P.J., and Gamble J.R. High density lipoproteins (HDL) interrupt the sphingosine kinase signaling pathway//The journal of biological chemistry.-1999.-V. 274, № 46.-P. 33143-33147.

293. Xu J, Teran-Garcia M, Park JH, Nakamura MT, Clarke SD. Polyunsaturated fatty acids suppress hepatic sterol regulatory element-binding protein-1 expression by accelerating transcript decay// J Biol Chem.- 2001.- V. 276.-N.13.-P. 9800-9807.

294. Yin H., Havrilla C.M., Gao L., Morrow J.D., Porter N.A. Mechanisms for the Formation of Isoprostane Endoperoxides from Arachidonic Acid// J biol chem. 2003. - V. 278. -N19. - P. 16720-16725.

295. Yin H., Havrilla C.M., Gao L., Morrow J.D., Porter N.A. Mechanisms for the Formation of Isoprostane Endoperoxides from Arachidonic Acid// J biol chem. 2003. - V. 278. -N19. - P. 16720-16725.

296. Zettler M.E., Merchant M.A., Pierce G.N. Augmented cell cycle protein expression and kinase activity in atherosclerotic rabbit vessels. Exp Clin Cardiol. 2010 Winter; 15(4):e 13944.

297. Zimmer J.P., Hammond B.R., Jr. Possible influences of lutein and zeaxanthin on the developing retina//Clinical Ophthalmology.-2007.-V.l, №1.-P. 1-11.

Информация о работе

Шилина, Наталия Михайловна
доктора биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Изучение биомаркеров метаболизма омега-3 и омега-6 полиненасыщенных жирных кислот у детей и беременных женщин - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы