Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение биологической активности синтетических олигопептидных аналогов последовательностей альфа-фетопротеина, гликоделина и инсулина человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение биологической активности синтетических олигопептидных аналогов последовательностей альфа-фетопротеина, гликоделина и инсулина человека"

На правах рукописи

Наджиорум Нгам-Асра

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОПЕПТИДНЫХ АНАЛОГОВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА, ГЛИКОДЕЛИНА И ИНСУЛИНА

ЧЕЛОВЕКА

03. 00. 04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в Российском государственном медицинском университете.

Научный руководитель:

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Терентьев Александр Александрович кандидат медицинских наук, доцент Тагирова Альфия Камильевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Петрунин Дмитрии Дмитриевич доктор биологических наук, профессор Савина Марина Ивановна

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится X.у.2004 в /г. часов на заседании диссертационного совета Б.208.057.01 при НИИ физико-химической медицины МЗ РФ по адресу 119992 Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физико-химической медицины МЗ РФ.

Автореферат разослан"«^? "

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук,

М.А. Мурина

2004-4 27587

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Первые сведения о находках гомологичных и гетерогенных антигенов в опухолевой ткани человека появились еще в тридцатых годах прошлого столетия. После этого потребовалось около 30 лет, чтобы идентифицировать первый эмбриоспецифический антиген альфа-фетопротеин (АФП) в химически индуцированной гепатоме у мышей [Абелев Г.И.,1962] и в сыворотке крови при гепатоцеллюлярном раке у человека [Татаринов Ю.С., 1963]. Дальнейшее изучение этого белка продемонстрировало его иммуномодулирующие свойства и потенциально высокую терапевтическую значимость. Однако создание лекарственных средств на основе очищенного АФП натолкнулось на ряд трудностей, из которых на первом месте стоят инфекционная безопасность сырья и стандартизация как методов выделения АФП, так и самого полученного препарата по его чистоте и биологической активности.

Изучение первичной структуры АФП позволило выявить в нем возможную сигнальную последовательность LDSYQCT (АФП14-20), отсутствующую в альбумине, в белковое семейство которого входит АФП (Терентьев А.А., 1997; Терентьев А.А., Татаринов Ю.С., 1997). Эта последовательность оказалась гомологичной подобным участкам в первичных структурах некоторых факторов роста и инсулина - белков, индуцирующих внутриклеточную тирозинкиназную активность путём действия на специфические цитоплазматические мембраны и поверхностные мембранные рецепторы соответствующих клеток-мишеней.

Определенную гомологию и сходные мотивы последовательности

удалось выявить в ряде онкофетальных и плацентарных белков, в

частности, в гликоделине (Терентьев А.А., Татаринов Ю.С., 1999) - белке,

известном также под названием плацентарный альфа-микроглобулин

1 1'иС,ИЛц..ОЛЛ«1ЬНАЯ I

БИБЛИОТЕКА 1 СПетчКЬрг лл ]

(ПАМГ) и играющем важную роль в процессах репродукции (Петрунин Д.Д., Татаринов Ю.С. 1976).

Нами были учтены достижения в изучении регуляторных пептидов, в ходе которого выяснилось, что во многих случаях воздействие на физиологические процессы оказывают не целые макромолекулы, а их небольшие фрагменты олигопептиды. Это обстоятельство позволило сделать заключение о том, что регуляция и координация функций организма могут осуществляться за счет ключевых фрагментов полипептидов, отщепляющихся от достаточно длинных молекул в соответствии с потребностями организма, а также самими этими фрагментами, представленными на поверхности белковых молекул при белок-рецепторных взаимодействиях. Эти фрагменты обладают определенной направленностью действия, специфичностью и адекватной активностью [Гомазков О. А., 1991]. Синтетические фрагменты биологически активных белков и полипептидов могли бы, по нашему мнению, адекватно моделировать активность самих макромолекул и воспроизводить биологические и терапевтические эффекты этих макромолекул.

Представляло интерес исследовать в клеточных системах биологическую активность аналогов небольших аминокислотных последовательностей белков - синтетических пептидов: ЬБ8У0С(аеш)Т -аналог последовательности АФП14-20, ENYC(acm)N - гомологичной ей последовательности (17-21) а-цепи инсулина - (а-ИНСп^-ин), ИКТЕ^8С(аеш) и 08ММС(аеш)0У, имеющих с ней сходные по аминокислотному составу мотивы участков (59-66) и (115-121) последовательности гликоделина - плацентарного -микроглобулина

(ПАМГ59-66-цин, ПАМГЦ5-ш-тин).

Проверку биологической активности таких синтетических пептидов на первом этапе целесообразно проводить на наиболее доступных клеточных системах: лимфоцитах, эритроцитах и спермальных клетках. Частично иммунобиологические свойства пептида LDSYQC(acm)T были исследованы

(Терентьев А.А., Казимирский А.Н. и др., 1999, 2000, 2001, 2002, 2003 гг.) в различных модельных системах на лимфоцитах человека и были выявлены иммуномодуляторные эффекты синтетической последовательности АФПм-го-В данном исследовании в качестве модельных клеточных систем использовались эритроциты и спермальные клетки человека.

Цель исследования. В связи с вышеизложенным, целью исследования нашей работы явилось изучение в наиболее доступных клеточных системах (изолированных и отмытых эритроцитах и спермальных клетках) биологической активности синтетических пептидов: LDSYQC(acm)T, ENYC(acm)N, HRTENNSC(acm) и QSMMC(acm)QY.

Задачи исследования. Для выполнения этой цели поставлены следующие задачи:

• 1 - изучить влияние синтетических последовательностей АФП14-20,

на поглощение

глюкозы эритроцитами больных сахарным диабетом;

• 2 - сравнить влияние синтетических пептидов и инсулина на поглощение глюкозы in vitro эритроцитами больных сахарным диабетом I и П типа;

• 3 - сравнить интенсивность поглощения глюкозы эритроцитами больных различными типами сахарного диабета под влиянием синтетических пептидов и инсулина;

• 4 - изучить влияние синтетических пептидов АФП^го, ПАМГ59.66-ЦИН,

на функциональные характеристики клеток репродуктивной системы у человека;

• 5 - сравнить влияние синтетических пептидов: АФП14.20 и ингибиторов "Fertilization promote protein" (FPP), а также Ouabain (оуабаин) на подвижность спермальных клеток.

Научная новизна работы. В данной работе впервые проведен анализ биологической активности синтетических пептидов - аналогов

гомологичных пептидных последовательностей АФП14.20, ПАМГ59.66, ПАМГпыи и а-цепи инсулинап.ц в клеточных моделях in vitro. Проведено сравнение влияния синтетических пептидов на поглощение глюкозы in vitro эритроцитами больных сахарным диабетом I и II типа. Выявлены возможности распознавания биологической активности олигопептидных последовательностей в структуре АФП14-20, ПАМГ59.66, ПАМГ115-121 и а-цепи в простых клеточных моделях на отмытых эритроцитах

человека.

Выявленные эффекты действия изученных синтетических пептидов позволяют предположить вовлечение их в регуляторные механизмы клеточного метаболизма на уровне цитоплазматических рецепторов. Впервые продемонстрировано различие во влиянии инсулина и изученных пептидных инсулиномиметиков на поглощение глюкозы эритроцитами больных сахарным диабетом, сочетанным с хроническим панкреатитом, при сравнении с эритроцитами больных сахарным диабетом 1 и П типов. Эти данные дают дополнительное экспериментальное обоснование этиологической классификации нарушений гликемии (ВОЗ, 1999), согласно которой сахарный диабет, связанный с болезнями экзокринной части поджелудочной железы, относится к другим специфическим формам диабета, отличным от диабета I и П типов.

Показано протективное действие последовательности на

сохранение жизнеспособности и поддержание подвижности активной фракции сперматозоидов.

Практическая значимость. Практическим выходом проведенных экспериментов могут служить рекомендации по применению теста поглощения глюкозы эритроцитами in vitro с использованием инсулина и изученных пептидов с целью выявления истинной резистентности к инсулину при сахарном диабете. Пептидный фрагмент может быть

применен для сохранения подвижности и жизнеспособности сперматозоидов в андрологии при искусственном оплодотворении и создании банков спермы.

Внедрение результатов. Результаты исследования внедрены в практическую работу центрального научного исследовательского института гастроэнтерологии и института урологии (больница №47), Москва, Россия, и в программу учебных и элективных курсов кафедры биохимии российского государственного медицинского университета (РГМУ).

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на ежегодных съездах ISOBM (International Society Oncodevelopmental Biology and Medicine) в 2001 и 2003 гг., на конференции «БЕЛКИ - МАРКЕРЫ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ», Астрахань, 2003 г., на кафедре биохимии Российского государственного медицинского университета (РГМУ).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объём работ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, изложения собственных результатов, обсуждения результатов, приложения и литературы.

Работа изложена на 114 страницах компьютерной верстки, содержит 18 таблиц, 5 рисунков, 9 гистограмм. Список использованной литературы включает 130 наименований, из них 55 отечественных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования явились эритроциты периферической крови 19 больных хроническим панкреатитом и сахарным вторичным диабетом, 11 сахарным диабетом I типа, 12 больных сахарным диабетом П типа и 7 практически здоровых доноров. Опыты проводили на образцах эякулята от 25 больных хроническим простатитом вне стадии обострения. Изучение активности сперматозоидов в эякулятах проводилось совместно с сотрудниками лаборатории андрологии, в НИИ урологии МЗ РФ (д.м.н. В.В. Евдокимов).

Определение поглощения глюкозы эритроцитами проводили разработанным в лаборатории профессора Ю.А Князева методом (Ю.А. Князев, Н. П. Микаэлян, 1990) с нашими модификациями.

Суспензию эритроцитов выделяли путем добавления 1 мл цельной крови с гепарином к 9 мл физиологического раствора. Смесь хорошо перемешивали и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 20 минут, клетки отмывали трижды физиологическим раствором хлорида натрия и отбирали эритроциты. Для приготовления содержащей глюкозу взвеси эритроцитарной массы, к 100 цл суспензии эритроцитов (в каждом конкретном случае подсчитывали число эритроцитов с помощью камеры Горяева, количество эритроцитов колебалось около величины 11х106 в 1 рл,) добавляли 10 мл рабочего фосфатного буфера, содержащего глюкозу в концентрации 14 ммоль/л. Таким образом, начальное количество вещества глюкозы составляло около 1,27 микромоль на 10 миллионов клеток, колеблясь около этой величины в каждом конкретном случае.

Разведение пептидов. В отдельные пробирки вносили по 1 мг ПАМГ-тин; 1 мг ПАМГ-цин; 1,5 мг ИНС-ин; 1,3 мг АФП-ин и по 1 мл раствора рабочего буфера с образованием - первичного раствора пептида. Далее с учетом молекулярной массы пептидов готовили разведения в 10"7 и 10"9М, а также инсулин в дозах 0,014; 0,028 и 0,056 мг/мл (соответственно 0,4; 0,8; 1,2 ЕД). Эти растворы пептидов и инсулина использовали в исследованиях.

Концентрацию глюкозы определяли глюкозооксидазным методом, применяя набор реактивов «Новоглюк» фирмы «Вектор-Бест». В каждую пробирку (кроме 4-х первых пробирок, содержащих последовательно 10; 20; 40 инсулина и 10 буферного раствора) вносили по 20 раствора соответствующего пептида и добавляли по 200 цл эритроцитарной суспензии (исходные концентрации пептидов К)-5, 10"7, ю 'м переходили в концентрациях в пробах). Инкубировали пробы в термостате

при 37°С в течение часа. Затем центрифугировали при 1000 об/мин 10 минут.

После центрифугирования отбирали 50 цл надосадочной жидкости, осаждали остаточные эритроциты 500 ЦЛ осадителя. Дальнейшее определение концентрации глюкозы проводили по методической инструкции, прилагаемой к набору реактивов «Новоглюк», фирмы «Вектор-Бест», в последующем рассчитывая количество вещества глюкозы на определенное число эритроцитов в каждой пробе, для удобства количество глюкозы выражали в мкмолях на 107 (10 миллионов) клеток.

Подвижность сперматозоидов определяли по категориям: (а) активноподвижной и (Ь) малоподвижной в световом микроскопе с увеличением х400. В качестве контроля устанавливали исходные подвижности сперматозоидов сразу же после разжижения эякулята, инкубированного в термостате при 37°С в течение 30 минут. У всех исследуемых эякулят брали в количестве и к нему добавляли

соответствующих разведений пептида АФП14.20, либо ингибиторов (FPP, оуабаин) в соотношении с эякулятом 1:10 по объему. Определяли вначале влияние пептида АФПина (в концентрации ю-5 и 10"7 М) и оуабаина (в концентрации 10"^ и 10"7М) на подвижность сперматозоидов. Затем исследовали одновременное влияние ингибиторов и АФПина в качестве активатора на подвижность клеток в течение часа и трёх часов инкубации в термостате при 37°С.

Жизнеспособность сперматозоидов определяли с помощью метода суправитального окрашивания пробы. Метод основан на принципе поглощения красителя мертвыми клетками с поврежденными плазматическими мембранами [Хомасуридзе А. Г., Тбилиси - 1989].

Определение фруктозы в эякулятах проводилось в реакции с резорцином. Фруктоза в сильно кислой среде преобразовывалась в w-оксиметилфурфурол, который давал с резорцином ярко-красное окрашивание.

Определение лимонной кислоты в эякулятах проводили с помощью пиридина в присутствии уксусного ангидрида. Принцип метода состоит в

том, что в присутствии уксусного ангидрида образуются многочисленные лактоны, появление которых ускоряется пиридином при нагревании. Образовавшиеся продукты имеют жёлтое окрашивание, которое пропорционально концентрации лимонной кислоты.

Для оценки достоверности полученных данных применяли пакет прикладных программ "STATISTICA 5.0 - Nonparametric Statistics - Wilcoxon matched pairs test" и "Инженерный калькулятор". Непараметрические методы статистики, примененные для обработки результатов в наших экспериментальных исследованиях, описанны во многих руководствах, и достаточно полно и доступно изложены [Е. В. Гублер, А. А. Генкин 1973].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. - ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПЕПТИДОВ НА ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ ЭРИТРОЦИТАМИ БОЛЬНЫХ

Экспериментальное изучение влияния инсулина и пептидов ИНС17-21-ин, АФП14_2о-ин, ПАМГ59.66-ЦИН, ПАМГп5-121-тин на поглощение глюкозы эритроцитами периферической крови здоровых и больных хроническим панкреатитом, сахарным диабетом I и П типа, было проведено in vitro. Возраст варьировал от 18 до 72 лет. Для больных СД был характерен выраженный повышенный уровень содержания глюкозы в крови. Чувствительность клеток к инсулину, АФПину, инсулиновому и гликоделиновым пептидам оценивали по степени утилизации глюкозы. Предварительно отмытые в физиологическом растворе эритроциты инкубировали с инсулином (в дозах 0,014; 0,028; 0,056 мг/мл) или пептидами (в концентрации 10"5, Ю'7, 10"9М) в течение одного часа при 37"С.

По окончании инкубации определяли концентрацию глюкозы при помощи глюкозооксидазного метода (набор фирмы "Вектор - Бест" -"Новоглюк"), с последующим расчетом оставшегося количества вещества глюкозы в мкмолях на 10 миллионов клеток-эритроцитов, учитывая что, чем

меньше величина оставшейся глюкозы, тем больше ее было захвачено эритроцитами.

Исследование позволило нам выяснить, какие активные инсулиновые или гликоделиновые фрагменты влияют на поглощение глюкозы эритроцитами здоровых и больных и при каких концентрациях.

Результаты наших исследований показали (табл. и гист. № 1), что при добавлении в эритроцитарную суспензию различных концентраций инсулина (начиная с 0,056 мг/мл - 1(Г5М, 0,028 и 0,014 мг/мл) происходит дозозависимое изменение поглощения глюкозы эритроцитами в образцах по сравнению с контролем. При инкубации с инсулином в концентрации 0,056 мг/мл, достоверно уменьшались концентрации глюкозы во всех образцах по сравнению с контролем. Инсулин уже в концентрации 0,028 мг/мл не влиял на поглощение глюкозы клетками у больных хроническим панкреатитом. Чем выше концентрация инсулина в образце, тем сильнее наблюдалось поглощение глюкозы клетками [Baldini P., 1986].

Результаты влияния инсулина на поглощение глюкозы эритроцитами*

Таблица № 1

I группа Здоровых М±т,п,Р И группа Хронический панкреатит М±ш,п,Р Ш группа СДЛтипа M±m,n,P IV группа СД. II типа М±ш, п,Р

Контроль 1,22 ± 0,03 п = 7 1,2 ± 0,23 п= 19 1,19 ± 0,05 п- 11 1,16 ±0,04 п = 12

ИНСУЛИН (0,056 мг/мл) (ИНСУЛ-1) 1,05 ±0,03 п= 10 Р < 0,05 0,93 ± 0.07 п= 11 Р < 0,05 0,92 ±0,03 п= 12 Р < 0,05

ИНСУЛИН (0,028 мг/мл) (ИНСУЛ-2) 1,02*0,04 п-7 Р < 0.05 1,1 ±0,05 п= 19 1,01 ± 0,06 п=11 Р < 0,05 1,02 ± 0,03 п= 12 Р < 0,05

ИНСУЛИН (0,014 мг/мл) (ИНСУЛ-3) 1,04 ±0,02 п-7 Р < 0,05 1,15 ±0,06 п-19 1,07 ± 0,05 П=11 1,08 ±0,03 п-12

* приведенные в таблице числа - количество оставшейся после 1 часа инкубации глюкозы в мкмолях на 1х107 эритроцитов (аналогично во всех таблицах с исследованиями на эритроцитах)

Гистограмма № 1

1.4

здоровые Хр.панкр. СД 1тапа СД.Итопа

□ Контроль в Инсул-1 а Инсул-2 О Инсул-3

* - достоверность р < 0,05 по сравнению с контролем у каждой

группы.

Следует отметить низкую активность инсулина в пересчете на количество вещества. Примененные концентрации 1(Г5М являются достаточно высокими (физиологические концентрации инсулина в организме что может свидетельствовать о невысоком качестве использованного инсулина.

При изучении влияния синтетического инсулинового пептида на. поглощение глюкозы эритроцитами были получены следующие результаты. Добавление пептида ИНС-ин (соответствовал участку 17-21 первичной структуры молекулы инсулина) в концентрации к

эритроцитарной суспензии способствовало достоверному уменьшению концентрации глюкозы в образцах у I, Ш и IV группы по сравнению с контролем. При внесении того же пептида в концентрации были

выявлены недостоверные тенденции к уменьшению концентрации глюкозы во всех образцах у больных по сравнению с контролем (табл. и гист. № 2).

Результаты влияния ИНСп-ц-ин на поглощение глюкозы эритроцитами

таблица № 2

I группа Здоровых М±т.п,Р □ группа Хронический панкреатит М±т,п,Р Шгрутша СД 1тнпа М±га,п,Р IV группа СД II типа М±т,п,Р

Контроль 1,22 ± 0,03 п ■= 7 1,2 ±0,23 п= 19 1,19 ±0,05 п-11 1,16 ±0,04 п= 12

ИНСи.л- ии (10"! М) (ИНСИН-1) 1,08 ± 0,04 п = 7 Р < 0,05 1,15 ± 0,03 п- 19 1,06 ±0,05 п- 11 Р < 0,05 1,05 ± 0,03 п= 12 Р < 0,05

ИНСп-л- нн (10'7М) (ИНСИН-2) 1,09 ± 0,03 п = 7 1,18 ± 0,04 п™ 19 1,08 ±0,06 П- 11 1,09 * 0,02 п= 12

ИНС17.2,- ин (10-*М) (ИНСИН-3) 1,09 ±0,03 П-7 ±0,05 п" 19 1,1 ±0,05 п=11 1,15 ± 0,04 п= 12

Гистограмма № 2

1.25

здоровые Хр.панкр. СД1тапа СДЛтипа

□ Контроль. ■ Инсин -1 □ Инсин -2 □ Инсин -3

При добавлении пептидов ПАМГ59.66-ЦИН или ПАМГш-121-тин в

концентрации 10"5, 10"7, Ю-9 М к эритроцитарной суспензии обнаружено влияние на поглощение глюкозы эритроцитами, причем наиболее выраженное наблюдалось в образцах с концентрацией 10"5 М ПАМГ115.121-тин и у всех больных кроме больных хроническим

панкреатитом (табл. и гист. № 3, 4). Синтетические пептиды в концентрации 10"5, 10"7М в среде с эритроцитами, обладали более высокой биологической

активностью, чем пептиды в концентрации 10"9 М, т.е. выявили дозозависимый эффект.

Результаты влияния ПАМГц^щ- тин на поглощение глюкозы эритроцитами

Таблица № 3

I группа Здоровых M±m,n,P II группа Хронический панкреатит M±m,n,P Шгруппа С Д. I типа М±т,п,Р IV группа СД II типа M±m,n,P

Контроль 1,22*0,03 п-7 1,2 ± 0,23 п = 19 1,19 ±0,05 п —11 1,16 ±0,04 п= 12

ПАМГЦ$_121-ТИН(105М) (ПАМГ-1) 1,06 ±0,03 п-7 Р < 0,05 1,12 ±0,03 п- 19 1,04 ±0,04 п-11 Р < 0,05 1,06 ±0,07 п»12 Р < 0,05

ПАМГция-тин (10"'М) СПАМГ-2) 1,08 ± 0,04 п-7 Р < 0,05 1,17 ± 0,04 п= 19 1,09 ± 0,03 п-11 1,08 ±0,05 п- 12

ПАМГпия-тин (10 9М) (ПАМГ-3) 1,09 ±0,03 п = 7 1,19 ± 0,04 П — 19 1,1 ±0,03 п = 11 1,1 ±0,05 п= 12

Гистограмма № 3

125 т

12.

здоровые Хрпанкр СД 1тапа СДII типа

□ Контроль мПАМГ-1 пПАМГ-2 аПАМГ-З

При использовании данной экспериментальной модели по изучению поглощения глюкозы эритроцитами in vitro продемонстрировано дозозависимое влияние инсулина и инсулинового пептида. Среди гликоделиновых пептидов обнаружен наиболее выраженный эффект на поглощение глюкозы эритроцитами больных сахарным диабетом I типа. Интересно отметить, что ПАМГ-цин особенно активно

влиял на поглощение глюкозы эритроцитами «здоровых» людей, проявляя свою инсулиномиметическую активность даже в концентрации 10"9М.

Результаты влияния ЛАМГ^-м-ЦИН на поглощение глюкозы эритроцитами

Таблица № 4

I группа Здоровых М±т, п,Р Пгруппа Хронический панкреатит М±т, п,Р Шгруппа СД 1типа М±ш,п,Р IV группа СД. II типа М±ш,п,Р

Контроль 1,22 ± 0,03 п = 7 1,2 ±0,23 п = 19 1,19 ±0,05 п= 11 1,16 ±0,04 п=12

ПАМГ»«- щш (10"5М) (ПАМГ-4) 1,06 ±0,03 п= 7 Р < 0,05 1,13 ±0,04 п= 19 1,05 ±0,05 п= 11 Р < 0,05 1,05 ± 0,03 п=12 Р < 0,05

ПАМГ!м<- цин (10"'М) (ПАМГ-5) 1,07 ±0,03 п = 7 Р < 0,05 1,17 ±0,04 п= 19 1,08 ±0,06 п- 11 1,08 ±0,03 п= 12

ПАМГ»««- цнн (10~9М) СПАМГ-6) 1,08 ±0,02 п = 7 Р < 0,05 1,2 ± 0,05 п= 19 1,09 ±0,06 п=11 1,11 ±0,04 п=12

Гистограмма № 4

здоровые Хрпанкр. СД. I тапа СДII типа

□ Контроль иПАМГ-4 еэПАМГ-5 □ ПАМГ- 6

При внесении пептида АФП14.20 в образцы с эритроцитами, обнаруживались незначительные изменения поглощения глюкозы клетками (табл. и гист. № 5).

Результаты влияния АФПц -го-ин на поглощение глюкозы эритроцитами

Таблица №5

I группа Здоровых М±т,п,Р II группа Хронический панкреатит М±ш,п,Р Ш группа СД. 1типа. M±m,n,P IV группа ОД П типа M±m,n,P

Контроль 1,22 ±0,03 п = 7 1,2 ±0,23 п= 19 1,19 ±0,05 п= 11 1,16 ±0,04 п= 12

АФПЦ-20-ИК (10"5М) (АФП-1) 1,09 ± 0,03 п = 7 1,16 ±0,04 п= 19 1,07 ± 0,04 п — 11 Р < 0,05 1,06 ±0,04 п= 12 Р < 0,05

АФП14.20-ИН (10"7М) (АФП-2) 1,09 ± 0,03 п = 7 1,19 ±0,04 п= 19 1,09 ±0,05 п= И 1,09 ±0,03 п= 12

АФП14.20-ИН (10"9М) (АФП-3) 1,09 ±0,03 п = 7 1,2 ±0,04 п= 19 1,11 ±0,06 п= 11 1,12± 0,04 п = 12

Гистограмма № 5

1.25

здоровые Хр.панкр. СД I типа СДII типа

а Контроль я АФ П -1 □ АФП -2 пАФП-3

Наиболее наглядным результатом- этого исследования являлось влияние пептида АФП14-20-ИН в концентрации 10"5М. АФПи_20-ин в концентрации 10"5М, как и синтетические пептиды последовательностей ПАМГ в той же концентрации, достоверно усиливал поглощение глюкозы эритроцитами больных инсулинозависимым и инсулин-независимым сахарным диабетом. В то же время ни один из синтетических пептидов в примененных концентрациях достоверно не влиял на поглощение глюкозы эритроцитами больных хроническим панкреатитом с сочетанным сахарным диабетом.

Таким образом, можно прийти к заключению, что синтетические пептиды в концентрации 10"5, 10"7М при инкубировании с эритроцитами обладали более высокой биологической активностью, чем пептиды в концентрации 10'Чт.е. выявлен дозозависимый эффект.

При использовании данной экспериментальной модели по изучению поглощения глюкозы эритроцитами in vitro продемонстрировано дозазависимое влияние инсулина и инсулинового пептида. Среди гликоделиновых пептидов обнаружен наиболее выраженный эффект ПАМГш.ш-тан на поглощение глюкозы эритроцитами больных СД I типа.

Выявленные эффекты действия инсулиновых и гликоделиновых пептидов позволяют предположить участие соответствующих им последовательностей в данных белках в клеточных рецепторных механизмах распознавания в процессах проникновения глюкозы через клеточные мембраны.

2. - РЕЗУЛЬТАТЫ ВЛИЯНИЯ ПЕПТИДОВ НА ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ

Полученные данные представлены в соответствующих таблицах. Подвижность сперматозоидов- в эякулятах претерпевала различные колебания (табл. № 6). Эти изменения явились целью изучения влияния АФП14-20-ИН, гликоделиновых пептидов и ингибиторов (FPP и оуабаина) на сохранение подвижности спермальных клеток.

В таблице, гистограмме № 7 показано, что при добавлении 20 цл раствора пептида АФП14.20-ИН (в концентр а^М^ к 200 цл эякулята подвижность активной категории сперматозоидов достоверно сохранялась в течение часа и трёх часов по отношению к исходному уровню.

Влияние пептидов ПАМГц$-ш-тин, ПАМГ59.<4-ции и АФПм .20-ин

на подвижность сперматозоидов

Таблица № 6

Исходная Подвижность Подвижность сперма-

подвижность сперматозоидов тозоидов после трёх

(контроль) в после часа часов инкубации в %

% инкубации в %

а* Ьх 31 ь, к, а2 Ь2 к2

Ю'^М 14,7± 37,5 11,0 28,5± 11,5± 9,5± 27,5± 10,5±

п=11 3,0 ±3,9 ± 4,1 1,2 2,2 4,3 1,9

ПАМГцз. 1,96 Р<0,01 Р<0,05 Р<0,05

121-тин 1(Г'М 17,0± 34,6 15,2 26,4± 12,4± 11,25± 19Д5± 10,25±

п=11 1.7 ±2,7 ±1,9 6,0 1,4 2,1 5,4 3,3

Р<0,05 Р<0,02 Р<0,01

Ю'М 16,2± 41,0 16,2 40,6± 12,23 15,8± 34,0± 11,25±

п=13 7,75 ±5,0 ± 5,98 ±3,14 6,09 5,65 2,1

АФП14.20- 7,72 Р<0,02 Р<0,05

ин 1(Г'М 22,16 38,5 18,8 31,66 15,3± 14,66± 26,3± 12,33±

п=13 ±9,43 ± 3± ± 5,62 5,12 6,34 3,38

5,04 6,79 4,76 Р<0,03

ПАМГ59- ю-5м 22,0± 31,0 21,0 18,0± 23,0± 18,0± 21,0± 20,0±

66- цин а-12 4,0 ± ±7,0 2,0 9,0 2,0 3,0 4,0

4,77

Примечание: а* - исходная подвижность активной категории сперматозоидов. Ь* -исходная подвижность малоактивной категории сперматозоидов. - подвижность активной категории сперматозоидов после часа инкубации. 1)1 - подвижность малоактивной категории сперматозоидов после часа инкубации. Иг - подвижность активной категории сперматозоидов после трёх часов инкубации. Ьг - подвижность малоактивной категории сперматозоидов после трёх часов инкубации. _ - подвижность активной категории сперматозоидов после часа инкубации без пептида. - подвижность активной категории сперматозоидов после трёх часов инкубации без пептида.

Гистограмма № 6

г?

а 25 -|

0

1 20 -

о

п О

Й 15 -г а

ю

5 ю-« ..

X

X х

ш о 4

с ак а1 а2

□ ПАМГ-тин 10-5М ШПАМГ-тин 10-7М ПАФП-ин 10-5М

□ АФП- ин 10-7М ■ ПАМГ-цин 10-5М

При внесении пептида АФП14.20-ИН в концентрации 10'7М подвижность сохранилась в активной категории клеток в течение одного часа, затем недостоверно снижалась к трём часам инкубации. Эти результаты представляют особый интерес, так как именно активная фракция сперматозоидов играет наиболее важную и доминирующую роль в процессах оплодотворения. Изменение подвижности сперматозоидов в эякулятах отмечалось также в малоактивной категории сперматозоидов на всех стадиях исследования. Однако они оказались менее значимыми, чем в активной фракции сперматозоидов. Изменения подвижности сперматозидов в малоактивной фракции менее интересны, так как эти клетки практически не принимают участия в акте оплодотворения. Кроме того, при разных патологиях или даже в норме при хранении в течение определенного времени активные категории спермальных клеток теряют свой потенциал подвижности и, либо переходят в малоактивную категорию, либо погибают.

Влияние пептида АФП^а-ин на подвижность сперматозоидов

Таблица№ 7

Исходная подвижность сперматозоидов без пептидов (%) п= 12 Подвижность сперматозоидов после часа инкубации с пептидом (%) п= 12 Подвижность сперматозоидов после трех часов инкубации с пептидом (%) п —12

а* Ьк ai ь, а2

АФПм-20-ин(Ю"5М) 16,2 ± 7,75 41 ±5,0 16,2 ± 7,52 40,6 ± 5,98 15,8 ± 6,09 34 ± 5,65

АФП14.20-ин(10"7М) 22,16 ± 9,43 38,5± 5,04 18,83 ± 6,79 31,66 ± 4,76 14,66 ± 5,12 26,3±6,3 4

Гистограмма № 7

В дальнейших исследованиях проводили тестирование ингибиторов оуабаина и fertilization promote peptide (FPP) на подвижность спермалышх

клеток. Известно, что FPP ингибирует акросому спермиев у самцов крыс, снижая способность к пенетрации яйцеклетки [Fraser, 1997].

При добавлении раствора FPP (в концентрации 10"5,10*7М) в соотношении с эякулятом 1:10 по объему, подвижность активной категории сперматозоидов частично уменьшалась в течение часа, и значительно через три часа по сравнению с исходным уровнем. Оуабаин, ингибитор энергетических процессов в клетке, в концентрации уменьшал

подвижность сперматозоидов после часа инкубации, а к трём часам активные категории клеток полностью теряли свой потенциал подвижности и переходили в малоактивную категорию или погибали (табл., гист. № 8).

Влияние ингибиторов (FPP и Оуабаин) на подвижность

сперматозоидов

Таблица№ 8

Исходная подвижность сперматозоидов без ингибиторов (%). п= 12 Подвижность сперматозоидов после часа инкубации с ингибитором (%) п= 12 Подвижность сперматозоидов после трёх часов • инкубации с ингибитором (%) п = 12

а* bk ai bi 32 ь2

FPP (10_5М) 13 ± 4,35 28,3 ± 6,02 10,33 ± 4,61 26,66± 3,05 4,66 ± 3,05 23 ±3

FPP (10"7М) 9 ±0,00 28,52 ± 1,52 3,33 ± 1,52 21 ± 2,64

Оуабаин (КГ6!^ 2,33±0,57 25,66±10, 69 00 2,33

Оуабаин (10"7М) 4 ±2,00 28 ± 6,24 00, 3

Гистограмма № 8

в 14

ак а1 а2

□ РРР(10-5М)И РРР(10-7М)П Оуабаин (10-6М) о Оуабаин (10-7М)

После внесения раствора FPP или оуабаина в эякулят, через час инкубации добавляли к нему раствор, содержащий АФП-ин (в концентрации 10"5, 10"7М в разных пробах, соответственно) и ещё раз инкубировали три часа.

Влияние АФЩдео-ин в качестве активатора подвижности сперматозоидов

Таблица № 9

Исходная подвижность сперматозоидов. без ингибиторов (%) п = 12 Подвижность сперматозоидов после часа инкубации с ингибитором (%) п= 12 Подвижность сперматозоидов после трёх часов инкубации с ингибитором (%) п= 12

ак Ь* а1 Ь1 а2 ь2

ЕРР(10"5М) + АФП(10"5М) 8,66 ± 1,55 29,66± 1,73 5 ±3,46 23 ± 6,65

БРР (10"'М) + АФП(10"7М) 13 ± 4,35 28,3 ± 6,02 8,33 ± 1,52 28 ± 2,64 5 ± 1,00 24 ± 5,5

Оуабаин (Ю^М) + АФП(10"5М) 2,33 ± 0,57 25,66 ± 10,69 00 2,33

Оуабаин (1{Г7М) + АФП(10'7М) 2,66 ± 1,52 25 ± 10,66 00 1

Результаты показали, что подвижность активной категории клеток в обоих случаях снижалась по сравнению с исходной. Согласно полученным результатам АФП14-20-ИН при последующем добавлении не устранял влияния ингибиторов FPP и оуабаина на активность сперматозоидов (табл., гист. №

9).

Гистограмма № 9

ак а1 а2

О РРР{+ АФП) 10-5М ■ РРР(+АФП) 10-7М □ Оуаб(+ АФП) 10-6М О Оуаб(+ АФП) 10-7М'

В дальнейшем, в ходе исследования мы добавляли в эквивалентном объеме одновременно раствор АФП^о-ин (в концентрации Ю'5, 10"7М) и FPP (в концентрации 10"5,10"7М), соответственно, в эякулят. Из таблицы № 10 видно, что при добавлении Ю'^М АФПн-го-ин и FPP одновременно в эякулят, подвижность активной категории сперматозоидов сохранялась после часа инкубации на уровне 18,6%, затем падала до 12,6 % после трёх часов инкубирования при исходном уровне - 18,6 %, но это снижение не было достоверным.

Анализируя полученный нами материал, можно прийти к заключению, что пептид в концентрации сохраняет подвижность

активной категории сперматозоидов через час и три часа по отношению к

исходному уровню. Пептид АФПи-го-ин в концентрации сохраняет

подвижность активной категории только в течение одного часа.

Одновременное влияние пептидов (АФП13-19) и ГРР или оуабаина на подвижность сперматозоидов

Таблица № 10

Исходная подвижность сперматозоидов без пептидов и ингибиторов(%) п= 12 Подвижность сперматозоидов после часа инкубации с пептидом и ингибитором одновременно (%) п = 12 Подвижность сперматозоидов после трёх часов инкубации с ингибитором одновременно (%) п= 12

ак Ьк а1 Ь1 а2 ь2

ЕРР(10°М) + АФП (10"5М) 18,66 ± 2,51 29 ± 6,55 18,66 ± 3,7 27,66 ± 4,61 12,66 ± 4,16 23,33 ± 4,01

ЕРР(Ю-'М) + АФП (1(Г7М) 19 ± 6,08- 24,66 ± 4,72 13,33 ± 3,05 24,33 ± 4,16

Оуабаин (10"6М) + АФП(Ю'5М) 7,66 ± 1,52 29±7,54 00 4,33

Оуабаин (10"7М) + АФП(10"7М) 7 ±2,00 24,32 ± 7,09 00 1,66

При добавлении ингибитора FPP в концентрации ю-5 и в эякулят,

подвижность активной и малоактивной категории сперматозоидов подвергается ингибированию. При внесении одновременно и

FPP в концентрации 10"5, 10"7М обнаруживается несущественное недостоверное изменение подвижности активной и малоактивной категории сперматозоидов.

Оуабаин как ингибитор, при добавлении в эякулят в разных концентрациях резко подавляет подвижность как активной, так и малоактивной категории сперматозоидов, при этом пептид АФПин не способен устранять или ослаблять его ингибирующую активность (см. таблицу и гистограмму 10).

Гистограмма № 10

Полученные нами результаты показывают, что даже малые дозы пептидов могут in vitro заметно воздействовать на энергетические механизмы в сперматозоидах, а также свидетельствуют о тонкой регуляции биохимических клеточных реакций в репродуктивных процессах.

Практическим выходом проведенных экспериментов могут служить рекомендации об использовании препаратов АФП для поддержания подвижности сперматозоидов в программе фертилизации in vitro.

выводы

1. При инкубации с эритроцитарной суспензией в присутствии глюкозы in vitro синтетические пептиды LDSYQC(acm)T (АФП-ин), QSMMC(acm)QY (ПАМГ-тин), HRTENNSC(acm) (ПАМГ-цин) и ENYC(acm)N (ИНСин) проявляют инсулиномиметические свойства, увеличивая поглощение глюкозы эритроцитами по сравнению с контролем.

2. При сравнительном исследовании инсулиномиметической активности изучаемых пептидов (АФПин, ПАМГ-тин, ПАМГ-цин, ИНСин) и инсулина на эритроцитах больных сахарным диабетом I и II типа, наблюдали примерно одинаковый дозозависимый эффект у всех пептидов, причём наиболее выраженный наблюдается у инсулина по сравнению с контролем.

3. Эритроциты больных хроническим панкреатитом в сочетании с сахарным диабетом проявляют наименьшую чувствительность к действию инсулина и не реагируют в тесте поглощения глюкозы на присутствие изучаемых инсулиномиметических пептидов.

4. Синтетические пептиды-инсулиномиметики могут служить инструментом для выявления функциональной глюкотестируемой неполноценности клеток.

5. Пептид АФПи-го-ин обладает выраженной способностью к сохранению подвижности активной категории сперматозоидов in vitro, и его присутствие в определенной концентрации инактивирует ингибитор FPP при добавлении его одновременно в эякулят.

6. При добавлении оуабаина в концентрации Ю'5, 10"7М до, после или одновременно с пептидом в эякулят, снижается подвижность активной категории сперматозоидов через час инкубации, а к трём часам активная фракция сперматозоидов ингибируется полностью или происходит гибель спермальных клеток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты исследования рекомендуется использовать в практической работе диагностических центров по выявлению истинной резистентности к инсулину при сахарном диабете, в гидрологических отделениях центров репродукции и планирования семьи и при создании банков спермы, а также на семинарских и в лекционном курсе по биохимии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Terentiev A., Tagirova A., Nadiioroum Ngam-Asra, Effect glycodelin (61-67 & 114-120) and insulin alpha chain (16-21) synthetic oligopeptides on glucose uptake by human red blood cells in vitro. // XXIX ISOBM MEETING International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (VIII INTERNATIONAL SYMPOSIUM Biology and Clinical Usefulness of Tumor Markers) Barcelona (Spain) September 29th- October 3"1, 2001, Abstract № P-31,p.l57.

2. A.K. Tagirova, Nadiioroum Ngam-Asra, V.V. Evdokimov, Yu.S. Tatarinov, A.A. Terentiev. A comparative analysis of the role of the synthetic oligopeptide LDSYQC(acm)T (sequence human AFP 14-20) and fertilization promote peptide (FPP) in motility of spermatozoa in the ejaculate in vitro. Tumor Biology, 24, SI, 03. The XXXI meeting ofthe International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. From Tumor Biology to Clinical Oncology, Edinburgh, United Kingdom, August - September, ISOBM 2003, Abstract № P-20 AFP, p. 52.

3. Наджиорум Нгам-Асра, A.K. Татарова, Л.В. Винокурова, А.А. Терентьев. Инсулиноподобное влияние гликоделиновых пептидных последовательностей на поглощение глюкозы клетками. //В кн.: «Белки-маркеры патологических состояний». Материалы 3 научной конференции и школы-семинара для молодых учёных. Астрахань-Москва - 2003, стр. 123-127.

4. А.Н. Казимирский, Ж.М. Салмаси, Л.Ю. Семёнова, Наджиорум Нгам-Асра (Республика Чад), Ж.Д. Беспалова, Е.В. Кудрявцева, Г.В. Порядин, А.А. Терентьев. Индукция рецептора активационного апоптоза CD95 под влиянием альфа-фетопротеина человека и его поверхностного пептида

// Вестник Российского государственного медицинского университета, № 3 (29), Москва - 2003 г., стр. 48-55.

5. Евдокимов В.В., Ерасова В.И., Наджиорум Нгам-Асра. Тагирова А.К., Терентьев А.А. Сравнительное изучение влияния AFP, FPP и Оуабаина на подвижность сперматозоидов. // Андрология и генитальная хирургия, Москва, № 2,2003. ст. 67-69.

6. Тагирова А.К., Наджиорум Нгам-Асра, Терентьев А.А., Татаринов Ю.С. Исследование иммуномиметического действия последовательностей гликоделина и альфа-фетопротеина in vitro. // Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины РГМУ. Научно-практическая конференция: 40 лет МБФ, Москва, 20-21 ноября 2003. ст. 90.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЛФП - альфа-фетопротеин

АФП-ин - синтетическая последовательность альфа-фетопротеина (14-20)

- пептид LDSYQC(acm)T, он жеАФПц-го АКТГ - адренокортикотропный гормон 4-ААП - 4-аминоантипирин АМГФ - альфа-2-микроглобулин фертильности БАГ - бета-2-амниотический глобулин ГОД - глюкозооксидаза ИНЗСД - инсулиннезависимый сахарный диабет ИЗСД - инсулинзависимый сахарный диабет

ИНС-ин - синтетическая последовательность а-цепи инсулина (17-21)-

пептид ENYC(acm)N, он же а-ИНС17.21-ин ИФР - инсулиноподобный фактор роста НТГ - нарушение толерантности глюкозы

ПАМГ - плацентарный альфа-микроглобулин, он же - ПАМГ-2, АМГФ, гликоделин, САМГ-гликоделин, РР-14.

ПАМГ-тин - синтетическая последовательность гликоделина (115-121) -

пептид QSMMC(acm)QY, он же ПАМГц5-121-тин ПАМГ-цин - синтетическая последовательность гликоделина (59-66) -

пептид HRTENNSC(acm), он же ПАМП^-цин

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПОД - пероксидаза

СБГ - секреторный бета-1-глобулин

СД - сахарный диабет

СТАГ - спермальный термостабильный альфа-глобулин

РАЛ-2 - растворимый антиген лейкоцитов-2

FPP - fertilization promote peptide

Наджиорум Нгам-Лсра (Республика Чад) Изучение биологической активности синтетических олигонептидных аналогов последовательностей альфа-фетопротеина, гликоделина и инсулина человека.

Настоящая работа посвящена изучению влияния синтетических олишпептидных последовательностей альфа-фетопротеина LDSYQC(acm)T (АФП14.20), плацентарного альфа-микроглобулина HRTENNSC(acm) (ПАМГбмб-Цин), QSMMC(acm)QY (ПАМГш-ш-тин) и альфа-цепи инсулина ENYC(acm)N (ИНСп.ц-ин) на поглощение глюкозы эритроцитами здоровых, больных хроническим панкреатитом, инсулинозависимым и инсулиннезависимым сахарным диабетом in vitro. Показано, что синтетические пептиды в концентрации при инкубировании с

эритроцитами обладали инсулиномиметической биологической активностью. Эритроциты больных хроническим панкреатитом проявляли наименьшую чувствительность к действию инсулина и не реагировали в тесте поглощения глюкозы на присутствие изучаемых пептидов.

Изучено также влияния пептидов на сохранение подвижности сперматозоидов в эякуляте. Установлено, что пептид АФП в концентрации 10', 10"7М обладает выраженной способностью к сохранению подвижности активной категории сперматозоидов, и его присутствие в определенной концентрации инактивирует ингибитор fertilization promote protein FPP при добавлении его одновременно в эякулят.

Выявленные результаты воздействия инсулиновых, гликоделиновых, и альфа-фетопротеиновых пептидов позволяют предположить вовлечение их в клеточные рецепторные механизмы распознавания, а также в регуляции биохимических клеточных реакций.

Nadjioroum Ngam-Asra (Republic of Chad) The investigation of biological, activity of human synthetic oligopeptide sequences AFP, glycodeline and insulin.

The influence of synthetic oligopeptide sequences AFPJ+.20 LDSYQC(acm)T, glycodeline HRTENNSC(acm), QSMMC(acm)QY and insulin alpha-chain ENYC(acm)N on glucose uptake,by human erythrocytes of normal humans and patients with pancreatic diabetes mellitns and diabetes mellitus I and II in vitro has been studied. It was shown that synthetic peptides at the level 10"5, 10"7M when being incubated with red blood cells have had insulinomimetic biological activity. The sensitivity of erythrocytes of pancreatic diabetes mellitus was less than in other groups; the effect of researched peptides was not remarkable.

We have examined the influence of the AFP14.20 peptide and fertilization promote protein FPP on the motility of the active category of spermatozoa of adult men in vitro. AFP-peptide at 10~5,10~ M prolonged the viability of the active

category of spermatozoa in vitro for 3 hours longer compared with control. Incubation of AFP-peptide in combination with FPP decreased the inhibitory effect of AFP. The determined effects of insulin, AFP and glycodelin peptide action permit to suppose their involving in cellular receptor mechanisms of recognition.

Nadjioroum Ngam-Asra (République du Tchad) L'étude d'activités biologiques des oligopeptides correspondants par analogie à alpha-foetoproteine, glycodeline et & l'insuline humaine.

La présente étude a pour objet d'étudier l'influence des oligopeptides synthétiques correspondants alpha-foetoprotéines AFP14-20 LDSYQC(acm)T, glycodelines HRTENNSC(acm), QSMMC(acm)QY, des chaînes alpha de l'insuline ENYC(acm)N sur l'absorption du glucose par les. érythrocytes des donneurs sains, des sujets atteints de pancréatites chroniques, des diabétiques insulino-dépendant et non insulino-dépendant in vitro. L'expérience montre que les peptides synthétiques à concentration 10"5, 10"7 M incubés avec les érythrocytes possèdent des activités biologiques insulino-mimetiques. Les érythrocytes des malades ayant la pancréatite chronique sont moins sensibles à l'action de l'insuline et ne réagissent pas au test d'absoTption du glucose en présence des peptides mis en évidence.

L'étude a permis également de démontrer que sous l'influence des peptides, on constate la stabilisation de la mobilité des spermatozoïdes normaux. Il a été mis évidence que l'AFP à concentration 1(P, HT7 M a une grande capacité de conserver les mouvements constants des spermatozoïdes à mobilitée normale. Et la présence de l'AFP à concentration bien definie ajoutée simultanément dans l'éjaculat rend inactif l'inhibiteur FPP. Le résultat obtenu en utilisant ces peptides permet de supposer qu'ils peuvent jouer un rôle dans le mécanisme des réceptions intra-cellulaires. De même, les peptides en question peuvent participer à la régulation des réactions biochimiques.

22 37

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 26.01.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,75. Тираж 100 экз. Заказ 112. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. ТелУФакс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Наджиорум Нгам-Асра

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ ОБ ИЗУЧАЕМЫХ ПЕПТИДАХ.

1.1.1. АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИН И ЕГО ПЕПТИД

АФП14.20-ИН.

1.1.2. ИНСУЛИН И ЕГО ПЕПТИД ИНСп-ггин.

1.1.3. ПЛАЦЕНТАРНЫЙ АЛЬФАМИКРОГЛОБУЛИН И ЕГО ПЕПТИДЫ ПАМГ59.66-цин, ПАМГи5.121-тин.

1.1.4. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ТРАНСПОРТЕРЫ

ГЛЮКОЗЫ.

1.1.5. НАРУШЕНИЕ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ.

- САХАРНЫЙ ДИАБЕТ И ЕГО ДИАГНОСТИКА

- КРИТЕРИИ ДИАГНОСТИКИ САХАРНОГО ДИАБЕТА ПО ПЕРОРАЛЬНОЙ ПРОБЕ НА ТОЛЕРАНТНОСТЬ К ГЛЮКОЗЕ

1.2. ОЦЕНКА ФЕРТИЛЬНОСТИ СПЕРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК

НА ОСНОВЕ ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ. 43 1.2.1. ВЛИЯНИЕ БЕЛКОВ, ПЕПТИДОВ НА

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СПЕРМАТОЗОИДОВ.

II. - МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. ОБОРУДОВАНИЕ.

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОГЛОЩЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ

ЭРИТРОЦИТАМИ.

2.2.1.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ГЛЮКОЗЫ

ГЛЮКОЗООКСИДАЗНЫМ МЕТОДОМ.

2.2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЛИЯНИЯ ПЕПТИДОВ

НА СПЕРМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ.

2.2.2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА И ПОДВИЖНОСТИ

СПЕРМАТОЗОИДОВ В ЭЯКУЛЯТЕ.

2.2.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ

СПЕРМАТОЗОИДОВ.■.

2.2.2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ

ФРУКТОЗЫ В ЭЯКУЛЯТЕ.

2.2.2.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ

ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ В ЭЯКУЛЯТЕ.;.

П1. - ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

3.1 ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПЕПТИД(ЭВ НА

ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ ЭРИТРОЦИТАМИ.

3.1.1. ВЛИЯНИЕ ИНСУЛИНА НА ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ ЭРИТРОЦИТАМИ.

3.1.2. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ИНСИНА НА ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ ЭРИТРОЦИТАМИ.

3.1.3. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ПАМГц5.121-тин НА ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ ЭРИТРОЦИТАМИ

3.1.4. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ПАМГ59-66-Цин НА ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ ЭРИТРОЦИТАМИ.

3.1.5. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА АФП14-2о-ин НА

ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ ЭРИТРОЦИТАМИ.

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ВЛИЯНИЯ ПЕПТИДОВ НА

ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ.

3.2.1. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ АФП 14-20-ин НА

ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ.

3.2.2. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ПАМГ115.,21-тин НА

ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ. .'.

3.2.3. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ПАМГ59-66-ЦИН

НА ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ.

3.2.4. ВЛИЯНИЕ FPP И ОУАБАИНА НА

ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ. .:.

3.2.5. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА АФП 14.20-ин

НА ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ НА ФОНЕ ДЕЙСТВИЯ FPP И ОУАБАИНА.

3.2.6. ОДНОВРЕМЕННОЕ ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА АФП14-20-ИН И FPP НА ПОДВИЖНОСТЬ . СПЕРМАТОЗОИДОВ.

3.2.7. ОДНОВРЕМЕННОЕ ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА АФП 14-20-ин И ОУАБАИНА НА

ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ.

IV. - ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ НА ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ ЭРИТРОЦИТАМИ БОЛЬНЫХ.

4.2. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ И ИНГИБИТОРОВ НА ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА.

IV. - ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение биологической активности синтетических олигопептидных аналогов последовательностей альфа-фетопротеина, гликоделина и инсулина человека"

Актуальность проблемы. Первые сведения о находках гомологичных .и гетерогенных антигенов в опухолевой ткани человека появились еще в тридцатых годах прошлого столетия. После этого потребовалось около 30 лет, чтобы идентифицировать первый эмбриоспецифический антиген альфа-фетопротеин (АФП) в химически индуцированной гепатоме у мышей [Абелев Г.И.,1962] и в сыворотке крови при гепатоцеллюлярном раке у человека [Татаринов Ю.С.,1963]. Дальнейшее изучение этого белка продемонстрировало его иммуномодулирующие свойства и потенциально высокую терапевтическую значимость. Однако создание лекарственных средств на основе очищенного АФП натолкнулось на ряд трудностей, из которых на первом месте стоят инфекционная безопасность сырья и стандартизация как методов выделения АФП, так и самого полученного препарата по его чистоте и биологической активности.

Изучение первичной структуры АФП позволило выявить в нем возможную сигнальную последовательность LDSYQCT (АФП14.20), отсутствующую в альбумине, в белковое семейство которого входит АФП (Терентьев А.А., 1997; Терентьев А. А., Татаринов Ю.С., 1997). Эта последовательность оказалась гомологичной подобным участкам в первичных структурах некоторых факторов роста и инсулина - белков, индуцирующих внутриклеточную тирозинкиназную активность путём действия на специфические цитоплазматические мембраны и поверхностные мембранные рецепторы соответствующих клеток-мишеней.

Определенную гомологию и сходные мотивы последовательности АФП 14.20 удалось выявить в ряде онкофетальных и плацентарных белков, в частности в гликоделине (Терентьев А.А., Татаринов Ю.С., 1999) белке, известном также под названием плацентарный альфа-микроглобулин (ПАМГ) и играющем важную роль в процессах репродукции (Петрунин Д.Д., Татаринов Ю.С. 1976).

Нами были учтены достижения в изучении регуляторных пептидов, в ходе которого выяснилось, что во многих случаях воздействие на физиологические процессы оказывают не целые макромолекулы, а их небольшие фрагменты олигопептиды. Это обстоятельство позволило сделать заключение о том, что регуляция и координация . функций организма могут осуществляться за счет ключевых фрагментов полипептидов, отщепляющихся от достаточно длинных молекул в соответствии с потребностями организма, а также самими этими фрагментами, презентированными на поверхности белковых молекул при белок-рецепторных взаимодействиях. Эти фрагменты обладают определенной направленностью действия, специфичностью и адекватной активностью [Гомазков О. А., 1991]. Синтетические фрагменты биологически активных белков и полипептидов могли бы, по нашему мнению, адекватно моделировать активность самих макромолекул и воспроизводить биологические и терапевтические эффекты этих макромолекул.

Представляло интерес исследовать в клеточных системах биологическую активность аналогов небольших аминокислотных последовательностей белков - синтетических пептидов: LDSYQC(acm)T - аналог последовательности АФЛ^о, ENYC(acm)N - гомологичной ей последовательности (17-21) ос-цепи инсулина - (а-ИНСп-ггин), HRTENNSC(acm) и QSMMC(acm)QY, имеющих с ней сходные по аминокислотному составу мотивы участков (59-66) и (115-121) последовательности гликоделина - плацентарного альфа2-микроглобулина (ПАМГ59.66-цин, ПАМГц5.121-тин).

Проверку биологической активности таких синтетических пептидов на .первом этапе целесообразно проводить на наиболее доступных клеточных системах: лимфоцитах, эритроцитах и спермальных клетках. Частотно иммунобиологические свойства пептида LDSYQC(acm)T были исследованы (Терентьев А. А., Казимирский А.Н. и др., 1999,2000, 2001, 2002, 2003 гг.) в различных модельных системах на лимфоцитах человека и были выявлены иммуномодуляторные эффекты синтетической последовательности АФПн.го. В данном исследовании в качестве модельных клеточных систем использовались эритроциты и спермальные клетки человека

Цель исследования. В связи с вышеизложенным, целью исследования нашей работы явилось изучение в наиболее доступных клеточных системах (изолированных и отмытых эритроцитах и спермальных клетках) биологической активности синтетических пептидов: LDSYQC(acm)T, ENYC(acm)N, HRTENNSC(acm) и QSMMC(acm)QY.

Задачи • исследования. Для выполнения этой цели поставлены следующие задачи:

• 1 - изучить влияние синтетических последовательностей АФП 14.20, ПАМГ59-66-цин, ПАМП 15.12i-тин и а-ИНС17-21-ин на поглощение глюкозы эритроцитами больных сахарным диабетом;

• 2 - сравнить влияние синтетических пептидов и инсулина на поглощение глюкозы in vitro эритроцитами больных сахарным диабетом I и II типа;

• 3 - сравнить интенсивность поглощения глюкозы эритроцитами больных различными типами сахарного диабета под влиянием синтетических пептидов и инсулина;

• 4 - изучить влияние синтетических пептидов АФП 14.20, ПАМГ59^6-цин, ПАМГц5.121-тин на подвижность спермальных клеток репродуктивной системы у человека;

• 5 - сравнить влияние синтетических пептидов: АФП14-20 и ингибиторов "Fertilization promote protein" (FPP), а также Ouabain (Оуабаин) на подвижность спермальных клеток.

Научная новизна работы. В данной работе впервые проведен анализ биологической активности синтетических пептидов - аналогов гомологичных пептидных последовательностей АФП 14.20, ПАМГ59.66, ПАМГ115.121 и сс-цепи инсулина17-21 в клеточных моделях in vitro. Проведено сравнение влияния синтетических пептидов на поглощение глюкозы in vitro эритроцитами больных сахарным диабетом I и II типов. Выявлены возможности распознавания биологической активности олигопепгидных последовательностей в структуре АФП 14.20, ПАМГ59-66, ПАМГ115.121 и а-цепи инсулина 17.21 в простых клеточных моделях на отмытых эритроцитах человека.

Выявленные эффекты действия изученных синтетических пептидов позволяют предположить вовлечение их в регуляторные механизмы клеточного метаболизма на уровне цито плазматических рецепторов. Впервые продемонстрировано различие во влиянии инсулина и изученных пептидных инсулиномиметиков на поглощение глюкозы эритроцитами больных сахарным диабетом, сочетанным с хроническим панкреатитом, при сравнении с эритроцитами от больных сахарным диабетом 1 и II типов. Эти данные дают дополнительное экспериментальное обоснование этиологической классификации нарушений гликемии (ВОЗ, 1999), согласно которой сахарный диабет, связанный с болезнями экзокринной части поджелудочной железы, относится к. другим специфическим формам диабета, отличным от диабета I и II типов.

Показано протективное действие последовательности АФП 14.20 на сохранение жизнеспособности и поддержание подвижности активной фракции сперматозоидов.

Практическая значимость. Практическим выходом проведенных экспериментов могут служить рекомендации по • применению теста поглощения глюкозы эритроцитами in vitro с использованием инсулина и изученных пептидов с целью выявления истинной резистентности к инсулину при сахарном диабете. Пептидный фрагмент АФП 14-20 может быть применен для сохранения подвижности и жизнеспособности сперматозоидов в андрологии при искусственном оплодотворении и создании банков спермы.

Внедрение результатов. Результаты исследования могут быть внедрены в. практическую работу Центрального научного исследовательского института гастроэнтерологии и Института урологии (больница №47), Москва, Россия, и в программу учебных и элективных курсов кафедры биохимии Российского Государственного Медицинского Университета (РГМУ).

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на ежегодных съездах ISOBM (International Society Oncodevelopmental Biology and Medicine) в 2001 и 2003 гг., на конференции «БЕЛКИ -МАРКЕРЫ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ», Астрахань, 2003 г., на заседаниях кафедры биохимии Российского государственного медицинского университета (РГМУ).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы и 2 находятся в печати.

Структура и объём работ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, изложения собственных результатов, обсуждения результатов, приложения и литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Наджиорум Нгам-Асра

Результаты исследования рекомендуется использовать в практической работе диагностических центров по выявлению истинной резистентности к инсулину при сахарном диабете, в андрологических отделениях центров репродукции и планирования семьи и при создании банков спермы, а также на семинарских занятиях и в лекционном курсе по биохимии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Наджиорум Нгам-Асра, Москва

1. Абелев Г.И. Альфа-фетопротеин: биология, биохимия, молекулярная генетика. // Иммунология 1994 - N3 С. 4 - 10.

2. Бегиашвили Т. В., Табадзе Н. Д. Изучение некоторых физическихи биохимических показателей спермы человека. // В кн. : Бесплодный брак. Тбилиси.: Б.И. -1967. с. 199.

3. Бриллиант М. Д. Эритроциты // Руководство по гематологии: В 2 Т./под. ред. И. А. Воробьева М: Медицина, 1985. - т.1 с. 115 -122.

4. Выдыборец С. В. Изменения эритроцитов при сахарном диабете. // Врачебное дело № 2, 1990, Киев с. 56-61.

5. Галенок В. А., Гостинская Е В., Диккер В. Е. Гомореология при нарушениях углеводного обмена Новосибирск. Наука - 1987. с. 261.

6. Геннис Р., // Биомембраны. Молекулярная структура и функция -М., 1997, с. 332-395.

7. Горпинченко И.И., Яковлев Г.М., Бойко Н.И., Хавинсон В.Х. Лечение полипептидным препаратом "простатилен" больных простатитом, осложненным расстройством половых функций. // Врачеб. Дело 1991, № 2, с. 48-51.

8. Евдокимов В. В., Ерасова В. И., Евсеев J1. П.// Подвижность сперматозоидов и содержание двухвалентных ионов в эякуляте человека у больных бесплодием. Тезисы докладов 1 съезда иммунологов России Новосибирск 1992. С. 506-507.

9. Евсеев Л. П., Севрюков Е. А., Акимов А. В. // Цинк в эякуляте человека. I съезд иммунологов России. Новосибирск 1992. С. 506-507.

10. Ефимов А. С., Науменко В. Г. Перекисное окисление липидов в эритроцитах больных сахарным диабетом с диабетическими ангиопатиями. // Пробл. эндокринологии 1985, т. 31, № 1, с. 6-9.

11. Ефимов А. С., Скорбонская Н. А., Петах Н. Н. Сорбитоловый путь окисления глюкозы и осложнения сахарного диабета // Пробл. эндокринологии 1980, т. 26, № 3, с. 86-90.

12. Жумагалиева Г.Д., Скрябина Э.Г., Смирнов В.В., Микаелиян Н.М., Петракова К.В., Князев Ю.А., Чередеев А.Н. Инсулинсвязывающая активность иммунокомпетентных клеток у детей с сахарным диабетом. // Клиническая эндокринология. — 1997, с." 9-11.

13. Фанченко Н. Д. Применение современных лабораторных технологий в обследовании бесплодных пар. // Клиническая, лабораторная, диагностика 2000, №4. с. 10-14.

14. Фонталин JT Н. Молекулярно-клеточные механизмы иммунологической толерантности. // М.: Наука, 1994. с. 79.

15. Ившценко А. Т., Т. Ли., Бушнева И. А. Свойства анионной АТФазы эритроцитов. // Вопр. мед. химии 1985. том. 31., вып. 1, с. 117-121.

16. Иващенко А. Т. Некоторые свойства аниончувствительной АТФазы эритроцитов. // Вопр. мед. химии 1980. том. 26., вып. 5, с. 668-671.

17. Казеннов А. Н., Маслова М. Н., Савина Г. В. Журнал эволюционной биохимии и физиологии, том. хх, № 2,1984.с.68-74.

18. Каган С. А. Патология сперматогенеза. Медицина, Ленинградское отделение, 1969. -224.

19. Казимирский А. N. Особенности иммунопатогенеза воспалительных заболеваний различного происхождения. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. — Москва 2002.

20. Казимирский А.Н., Салмаси Д. , Терентьев А.А. Индукция рецептора активационного апоптоза -CD95 под влиянием альфа-фетопротеина человека и его поверхностного пептида АФП о. 19. XXIIISOBM., Амстердам. 1994, с.115.

21. Казимирский А.Н., Терентьев А.А., Салмаси Ж.М. // Эмбриоспецифические белки в коррекции иммунопатологических состояний. // Аллергия и иммунопатология.: М. 1999. - Глава 18, С. 251-269.

22. Касаткина Э.П., Одуд E.A., Сичинава И.Г., Сивоус Г.И., Долль С.Э. Профилактика и лечение поздних осложнений сахарного диабета у детей и подростков. // Клиническая эндокринология. -2000. с. 3-7.

23. Куклина М. А. Об исследовании эякулята человека // Лабораторное дело. 1976. № 12, с. 744-746.

24. Кунин М. А. Бесплодие в браке // Вопросы сперматологии. -М: Медицина, 1973. с. 232.

25. Кушманова О. Д., Ивченко Г. М. // Руководство по лабораторным занятиям по биологически химии. Москва Медицина . 1983, с. 134-135.

26. Иванова ЛИ. // Диабет образ. Жизни. 1/2000 с. 26 27.

27. Максимова О.В., Солун М.Н. Особенности липидного состава эритроцитных мембран у больных сахарным диабетом. // Пробл. эндокринол. 1989, № 2. с. 14-18.

28. Максина А.Г., Тихомиров А.Н., Дайняк Б.А. Изменение структурного состояния мембран эритроцитов при дегидратации. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1996, т. 122. № 10, с.402-404.

29. Маслянко В.А. Инсулиндепонирующая функция эритроцитов и углеводный обмен у больных хроническим активным гепатитом.// 4-й Всесоюзный съезд гастроэнтерологов. 17-20 октября 1990г. с. 178-179.

30. Маслов Д. Л. Сравнительное изучение гипогликемической активности нового пептидомиметика инсулина и лейкоантоцианидинов, выделенных из экстракта листьев черноплодной. Автореферат канд. дисс. Институт биомедицинской химии Москва 2002.

31. Микаелян Н. П. , Максина А. Г., Дайняк Б. А., Князев Ю. А. Регистрация методом спинового зонда изменений потенциала поверхностного мембран эритроцитов крови больных инсулинозависимым сахарным диабетом. // Биофизика — 1985, т. 39, вып. 3. с. 475.

32. Микаелян Н. П. , Максина А. Г., Князев Ю. А. Состояние мембран эритроцитов при сахарном диабете. // Лаб. дело № 9 1991., с. 41 -46.

33. Молнар Е. Общая сперматология: пер. с нем./под. ред. Порудоминского И. М. Будапешт: Академия Наук Венгрии, 1969. С.-295.

34. Никифоров О. Н., Сазонова Л. Я., Князькова Л. Г., Галенок В. А. Перекисное окисление липидов и состояние системы антиоксидантной защиты у больных инсулинзависимым сахарным диабетом. // Пробл. эндокринологии 1997, т. 43, № 5, с. 16-22.

35. Панков Ю. А. Новые гормоны и проблемы молекулярной эндокринологии. // Биохимия 1998, т.44, № 5, - с. 3-7.

36. Панков Ю.А. Гормоны регуляторы жизни в современной молекулярной эндокринологии. // Биохимия - 1998, т. 63, № 12, с. 1600-1615.

37. Панков Ю.А. О фундаментальной эндокринологии. // Биохимия -1997, т.62, № 10, с. 1373-1375.

38. Питер Дж. Уоткинс. Сахарный диабет. //Санкт-Петербург. Невский диалект. 2000. с. 10-16.

39. Сандуляк JI. И. Свойство эритроцитов депонировать и транспортировать инсулин. // Успехи современной биологии., том. 103, вып. 2, 1987. с. 82-84.

40. Сунцов Ю. И., Кудрякова С. В. Эпидемиология нарушенной толерантности к глюкозе. // Проб. Эндокринологии 1999. т. 45., № 2, с. 48-52.

41. Сунцов Ю. И., Дедов И.И., Кудрякова С.В. Государственный ригистр сахарного диабета: эпидемиологическая характеристика инсулиннезависимого сахарного диабета. // Сахарный диабет -1998, № 1, с. 41-43.

42. Татаринов Ю.С. Трофобластический Р-гликопротеин // Успехи совр. биол., 1983, Т.95, вып. 1, С. 57-64.

43. Татаринов Ю.С., Меснянкина Н.В., Никулина Д.М. Иммунохимическая идентификация pi-глобулина и "зоны беременности" в сыворотке крови больных с пузырным заносом и хорионэпителиомой // Акуш. и гин., 1974, №5, С. 67-68

44. Татаринов Ю.С., Меснянкина Н.В., Никулина Д.М., Новикова JI.A., Толокнов Б.О., Фалалаева Д.М. Иммунохимическое Pjглобулина в сыворотке крови больных хорионэпителиомой // Бюлл. эксп. биол. и мед., 1974, №9, С. 79-82.

45. Татаринов Ю. С., Тагирова А.К., Евдокимов В. В., Терентьев А. А. // Иммунохимическая оценка состояния фертильности у мужчин. Тезисы докладов I съезда иммунологов России 23-25 июля Новосибирск, 1992. с. 473.

46. Татаринов Ю.С., Посисеева JI.B., Петрунин Д.Д. Специфический альфаг-микроглобулин (гликоделин) репродуктивной системы человека. Москва-Иваново. 1998.

47. Терентьев А.А. Выявление гомологичных участков в первичных структурах альфа-фетопротеина, инсулина и некоторых факторов роста. // Вестник Российского государственного медицинского университета. 1997 - N 1 (3), С. 76-79.

48. Терентьев А.А. Выявление гомологичных последовательностей в первичных структурах альфа-фето протеина и некоторых онкофетальных белков человека. // Вестник РГМУ 2001 - № 5 (20), С. 52-54.

49. Титов В. Н. Изогликемический интервал крови и механизмы его регуляции: факты и гипотезы. // Клиническая лабораторная диагностика, № 3, 2001, с. 3-10.

50. Хавинсон В. X., Кветнон И. М., Ашмарин И. П. // Пептидергическая регуляция гомеостаза. Успехи современной биологии, 2002, Том. 122, № 2, с. 190 203.

51. Хомасуридзе А. Г. И Руководство по лабораторному исследованию спермы человека и взаимодействия спермы с цервикальной слизью -Тбилиси Грузия - 1989.

52. Чещевик А. Б., Микулич 3. И., Ваткевич Л. К. Оксидоредуктазные реакции в эритроцитах больных сахарным диабетом. //Здравоохранение Белоруссии 1981, № 10, с. 46-47.

53. Чещевик А. Б. // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической эндокринологии: Тез. Докл. III съезда эндокринологов УССР 1982. с. 159.

54. Ширшев С. В. Белки фетоплацентарного комплекса в регуляции иммунных реакций. // Успехи совр. Биол., 1993 -, т. 113, вып 2, с. 230 -246.

55. Ширшев С. В. Цитокины плаценты в регуляции иммуноэцдокринных процессов при беременности. // Успехи совр. Биол., 1994, т. 114, вып. 2, с. 223-239.

56. Щербачева Л.П., Сунцов Ю.А., Рыжкова С.Г., Дедов И.И., Петеркова В.А. Мониторинг основных эпидемиологических характеристик сахарного диабета у детей в Москве. // Сахарный диабет 1999, № 1, с. 13-17.

57. Яковлев Г. М., Кожемякин А. Л., Раков А.Л., Дрыгин А.Н., Яковлев В.А. Внутриклеточный метаболизм у больных инсулинзависимым и инсулиннезависимым типами сахарного диабета // Пробл. эндокринологии. -1991, т. 37, № 2, с. 11-14.

58. Abel Е D, Kim Y-B, Boss О, Hadro Е, Minneman Т, Shulman G I, Kahn В В. Adipose-selctive targeting of the GLUT4 gene impairs insulin action in muscle and liver. Nature 409: 729-733, 2001.

59. Abel, E.D.; Peroni O; Kim, J.K.; Kim, Y-B; Boss, O; Hadro, E; Minneman, T; Shulman, G.I.; Kahn, B.B. Adipose-selective targeting of the GLUT4 gene impairs insulin action in muscle and liver. Nature 409:729-733, 2001.

60. Agus D.B.; Gambhir, S.S.; Pardridge, W.M.; Spielholz, C.; Baselga, J.; Vera, J.C.; Golde, D.W. Vitamin С crosses the blood-brain barrier in the oxidized form though the glucose transporters. // J. Clin. Invest. 100: 2842-2848, 1997.

61. Auroux M, Collin C, Couvilliers M L. Do non-spermatozoal cells mainly stem from spermiogenesis. Study of 106 fertile and 102 subfertile men. // Arch Androl. 1985 - vol. 14, N- 1, P. 73-80.

62. Aussel C, Fehlmann M. Effect of alpha-fetoprotein and indomethacin on arachidonic acid metabolism in P388DI macrophages: role of leucotrienes. Prostaglandins. // Leucot.Med. 1987 - V.28, N.3, P.325-331.

63. Baldini P., Yncerpi S., Pascal E., et al. Insulin effects on human red blood cells. // Mol. Cell. End. Enol.- 1986. vol. 46, N2, P. 93.

64. Barrett, H P; Walmley AR; Gould GW/ Structure and function of facilitative sugar transporters. // Curr. Opin. Ctll. Biol. 11 (4) : 496 -502, 1999.

65. Barrett P H, Bogardus C, Tuomiletho J, Zimmet P, // Anuall text book of Diabetes Mellitus New york. 1995. P. 147 - 171.

66. Bauman, C.A.; Ribon, V; Kanzaki, M; Thurmond, D.C.; Mora, S; Shigematsu, S; Bickel, P.E.; Pessin, J.E.; Saltiel, A.R. CAP defines asecond signaling pathway required for insulin-stimulated glucose transport. // Nature 407: 202-207,2000.

67. Beier W., Birkhollz C., Sewing K.F. Effects of flavonoids on parietal cell acid secretion, gastric mucosal prostaglandin production and helicobacter pylori growth. // Arzneim-Forsch Drug Res., 1995, v. 45, p. 690-700.

68. Bell, G.I; Kayano, T; Buse, J.B; Burant, C.F.; Takeda, J; Lin, D; Fukumoto, H.; Seino, S. Molecular biology of mammalian glucose transporters. Diabetes Care 13: 198-208,1990.

69. Bell, G.I; Murray, J.C.; Nakamura, Y.; kayano, Т.; Eddy, R.L.; Byers, M.G.; Shows, T.P. Polymorphic human insulin-responsive glucose-transporter gene on chromosome 17pl3. Diabetes 38: 10721075,1989.

70. Birnbaum, M.J. Identification of a novel gene encoding an insulin-responsive glucose transporter protein. Cell 57: 305-315,1989.

71. Boyum A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. // Scand. J. Lab. Invest. 1968. - V. 21, Suppl. 97, P. 9-109.

72. Branton D, Cohen С M, Tyler J. Interaction of cytoskeletal proteins on the human erythrocyte membrane. // Cell. 1981, vol. 24 N 1, P. 2432.

73. Brockmann, K.; Wang, D.; Korenke, C.G.; Moers, A.; Ho, Y-Y.; et al. Autosomal dominant Glut-1 defisiency syndrome and familial epilepsy. Ann. Neurol. 50: 476-485, 2001.

74. Engelman E G, Charron D J, Benike С J, Stewart G J. Ia antigen on peripheral blood mononuclear leucocytes in man. I. Expression,biosynthesis and function of HLA-DR antigen on non-T-cells. //J.Exp.Med. 1980 - V. 99, P. 152.

75. Fraser L. R., Hanyalogu A., Cockle S. M. A fertilization promoting peptide (FPP)-related tripeptide competitively inhibits responses to FPP: a cause of male subfertility. // Mol Reprod Dev. 1997 Dec; N. 4, p.529-535.

76. Felhman M., Carpentier J. L., De Cam A. et al. Biochemical and morphological evidence that the insulin receptor is internalized with insulin in hepatocytes. J. Cell. Biol., 1982, v. 93, p. 82-83.

77. Hanabata M, Ohyanagi H, Saitoh Y, Itoh H. Immunohistochemical study on hepatic tumors KM01 stains compared with AFP, CEA, CA19-9 andRASP21. // Kobe.J.Med.Sci. 199i - V. 37. N. 2, P. 81 -93. •

78. Heskecth Т. R., Smith G .A., Houslay M. D. Annular lipids determine the ATPase activity of a calcium transport protein complexed with dipalmitoyllecithin. // Biochemistry. 1976 Sep 21 vol. 15., N. 19., p. 4145-51.

79. Hilies R. M., Jones W. R. Molecular heterogeneity of pregnency-specific pi-glukoprotein (SPi) // J. Repr. Immunol. 1982 V. 36, N. 4, P. 157-165.

80. Hooper D. C., Padiga E., Marguerita R. A. Susppression of primary and secondary lymphocyte reactions by murine alpha-fetoprotein. // Oncodev. Biol. Med. 1982 - V. 157, P. 3.

81. Houslay MD, Hesketh TR, Smith GA, Warren GB, Metcalfe JC. The lipid environment of the glucagon receptor regulates adenylate cyclase activity. // Biochim Biophys Acta. 1976 Jun 17;vol. 436., N. 2., p. 495-504.

82. Julkunen M., Apter D., Seppala M., Stenman U.H., Bohn H. Serum levels of placental protein 14 reflect ovulation in nonconceptional menstrual cycles. // Fertil. Steril. 1986. - vol. 45 - p. 47-50.

83. Julkunen M., Koistinen R., Sjoberg J., Rutanen E.M., Wahlstrom Т., Seppala M. Secretory endometrium synthesizes placental protein 14. //Endocrinology. 1986.-vol. 118.-p. 1782-1786.

84. Julkunen M., Seppala M., Janne O. Complete amino acid sequence of human placental protein 14: A progesterone-associated uterine protein homologous to beta-lactoglobulins.// Proc. Natl. Acid. Sci. USA. -1988. vol. 85. - p. 8845-8849.

85. Koda M., Hori Т., Maeda N., Kato S., Murawaki Y., et al. Lectin-reactive paterns of markedly elevated serum alpha-fetoprotein in patients with chronic active hepatitis. // Am.J.Gastroenterol. 1991 -V. 86, N. 7, P. 861-869.

86. Kurtz A., Jelkmann W., Bauer C. Insulin stimulates erythroid colony formation independently of erythropoietin. // Br J Haematol. 1983 Feb; vol. 53., N. 2., p. 311-316.

87. Laakso M., Edelman S. V., Brechtel G., Baron A. D. Impaired insulin-mediated skeletal muscle blood flow in patients with NIDDM. Diabetes. 1992 Sep; vol. 41, P. 1076 1083.

88. Marshall S., Green A., Olefsky J. M. Evidence for recycling of insulin receptors in isolated rat adipocytes. // J Biol Chem. 1981 Nov 25; vol. 256. P.'l 1464- 11470.

89. Marshall S, Olefsky JM. Tris (hydroxmethyl) aminomethane permits the expression of insulin-induced receptor loss in isolated rat adipocytes. // Biochem Biophys Res Commun. 1981 Sep 30; vol.102., N. 2., p. 646-653.

90. Marshall S, Olefsky JM. Tris (hydroxmethyl) aminomethane permits the expression of insulin-induced receptor loss in isolated rat adipocytes. // Biochem Biophys Res Commun. 1981 Sep 30; vol. 102., N. 2., p. 646-53.

91. Marchand-Brustel Y., Jeanrenaud В., Freychet P. Insulin binding and effects in isolated soleus muscle of lean and obese mice. // Amer. J. Physiol., 1978, vol. 4, p. 348-358.

92. Mayer, D., Klimek, F., Rempel, A., Bannasch, P. ; Hexokinase expression in liver preneoplassia and neoplasia. Biochem. SOS. Transactions, 1997, v. 25(Pt.I), p. 122-127.

93. Mayer, D. Carcinogenic and anticarcinogenic effects of dehydroepiandrosterone in the liver of male and female rats. The Aging Male, 1998, v. 1, p. 55-66.

94. Naval J, Villacampa M-J, Coguel A-F, Uriel J. Biological activities of alpha-fetoprotein Eds G. Mezejewski, H. Jacobson- 1987 - V. 1, P. 189,

95. Nehrba G. J., Bannasch, P-: Overexpression of insulin receptor substrate-1 emerges early in hepatocarcinogenesis and elicits preneoplastic hepatic glycogenosis. Amer. J. Pathol., 1998, v. 152, p. 341-345.

96. Nehrba G. J., Klimek F, Bannasch, P-: Expression von insulin-receptor-substrat-1 in neoplastischen glykogenotischen leberzellherden. Verh. Dtsch. Ges. Path., 1997, v. 81, p. 470.

97. Nunez E A, Benassayag C, Vallette G, Martin, Vranckx R, Christeff N, Garreau B, The physicochemical and biolgical properties of alpha-fetoprotein depend of its ligand environnment. J. Nucl. Med. Allied.Sci. - 1989 - V. 33, N. 3. P. 18 - 25.

98. Okada Т., Kawano Y., Sakakibara Т., Hazeki O., Ui M. Essentiel role of phosphatidylinositoll 3-kinase in insulin induced glucose transport and antilipolysis in rat adipocytes. J. Biol. Chem., 1994, v. 269, p. 3568-3573.

99. Pao S S, Paulsen I T, Saier M N, Majer facilitator superfamily. //Microb. Mol. Bio. Rev. 62: 1- 34, 1998.

100. Pitkanen S, Salo M K, Kuusela P, Holmberg C, Simell A I, Heikinheimo M. Serum levels of oncnfetal markers CA 125, CA 19-9,and alpha-fetoprotein in children with hereditary tyrosinemia type I. // Pediatr. Res. 1994 - V. 35, N. 2 P. 205 - 209. '

101. Schwartzman J S, Sole D, Naspits С К. Ataxia-telangiectasia: a clinical and laboratory review study of 14 case. // Allergol. Immunopathol. Madr. 1990 - v. 18 - N. 2. P. 105.

102. Qi C, Pekala P H. The influence of mRNA stability on glucose transporter (GLUT-1) gene expression. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 263(2): 265-9, 1999.

103. Ropars C, Chassaigne M, Villereal MC, Avenard G, Hurel C, Nicolau C. Reseated red blood cells as a new blood transfusion product. // Bibl Haematol. 1985;(51):82-91.

104. Saad MF, Knowler WC, Pettitt DJ, Nelson RG, Charles MA, Bennett PH. A two-step model for development of non-insulin-dependent diabetes. // Am J Med. 1991 Feb;Vol. 90 P. 229 235.

105. Rahmani-Jourdheuil D, Mourayre Y, Vague P, Boyer J, Juhan-Vague I. In vivo insulin effect on ATPase activities in erythrocyte membrane from insulin-dependent diabetics. Diabetes. 1987 Sep; vol. 36, N. 9, P. 991. '•

106. Regazzi R, Verchere CB, Halban PA, Polonsky KS. Insulin production: from gene to granule. // Diabetologia. 1997 Oct; vol. 40. P. 833-838.

107. Sadoul K, Berger A, Niemann H, Regazzi R, Catsicas S, Halban PA. SNAP-25 can self-associate to form a disulfide-linked complex. // Biol Chera. 1997 Oct; vol. 378., N. 10., p. 1171-1176.

108. Sigg С, Hornstein OP. Cytologic classification of immature germ cells in the spermatological "syndrome" of increased desquamation of spermatogenic cells. // Andrologia. 1987 May-Jun; vol. 19, P. 378 -391.

109. Small DM// The physical chemestry of lipids. From Alkanes to phospholipide. Handbook of Research. New york; London, 1986 P-517.

110. Shows T B, Eddy R L, Byers M G, Fukushima Y, Dehaven С R, Murray J C. Polymorphic human glucose transporter gene (GLUT) is on chromosome Ip31.3-p35. // Diabete 36: 546 549, 1987.

111. Sperling K, Kaden R. Meiotic studies of the ejaculated seminal fluid of humans with normal sperm count and oligospermia. // Nature. 1971 Aug 13; vol. 232-P. 481.

112. Vasterling H W, Praktische spermatologie, Stuttgart . // G. Thieme verag 1960. 304p.

113. Watson R T, Passin J E. Intracellular organisation of insulin signaling and GLUT-4 translocation. Recent. Prog. Horm. Res. 56: 175 93, 2001.