Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение биологических особенностей кроликов, трансгенных по генам кластера регуляторов активации комплемента RCA

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение биологических особенностей кроликов, трансгенных по генам кластера регуляторов активации комплемента RCA"

Л-Z 3lBf

На правах рукописи

ДОЦЕВ АРСЕН ВЛАДИМИРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ КРОЛИКОВ, ТРАНСГЕННЫХ ПО ГЕНАМ КЛАСТЕРА РЕГУЛЯТОРОВ АКТИВАЦИИ КОМПЛЕМЕНТА RCA

03.00,23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологически* наук

Московская область, п. Дубровицы - 2003

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства РАСХН

Научные руководители:

академик РАСХН

Эрнст Лев Константинович

доктор биологических наук Зиновьева Наталия Анатольевна

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Шихов Игорь Яковлевич

кандидат биологических наук, доцент Новикова Людмила Федоровна

Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства им.СА/Ц*чл«,ева

Защита состоится «» фесЬалЛ 2004 года, в 10 часов, на заседании диссертационного совета ДОСОСИ 3.01 при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, лос. Дубровицы, ВИЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЖа. Автореферат разослан <(?%2003 года.

Учс- ■ ......

ДИСС' . ¡- .¡»¡:ОГО СОВеТ1у Л1 -ч ^

кан". I • ^ : ш! и-;сски/н Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы;

Одним из путей решения ряда прикладных задач в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве является создание генетически модифицированных (трансгенных) животных. Основным лимитирующим фактором практического использования трансгенных сельскохозяйственных животных является наблюдаемая в большинстве случаев относительно низкая экспрессия трансгенов, а также пониженная жизнеспособность трансгенных особей.

Для обеспечения экспрессии трансгена, независимой от участка интеграции, находят применение векторные системы на основе искусственных хромосом дрожжей - YAC [Camper, Saunders, 2ООО]., способные к стабильному сохранению геномных фрагментов ДНК длиной до 1 млн. п.о. [Burfa et а!., ¡987].У сельскохозяйственных животных использование векторов на основе VAC рассматривается, главным образом, в двух направлениях: направленная экспрессия рекомбинантных белков в молоко трансгенных животных и ксенотрансплантация.

Следует отметить, что успешное использование трансгенных животных в практике, в том числе и в области ксенотрансплантации, предусматривает наряду с наличием экспрессии биологически функциональных трансгенных белков, необходимость стабильного наследования трансгена в ряде поколений, а также возможность длительного ведения трансгенной линии без снижения жизнеспособности трансгенных индивидуумов. Риск отрицательного влияния интеграции трансгена на организм животных возрастает при интеграции в геном животных фрагментов ДНК большой длины (несколько сот тысяч пар оснований).

Таким образом, актуальной задачей сельскохозяйственной биотехнологии, как в фундаментальном, так и в прикладном аспекте, является исследование влияния интеграции трансгена на различных уровнях организации индивидуумов (генетическом, цитологическом, тканевом, орган измен ном).

В рамках изучения проблемы ксевотрансплантацни актуальным является проведение исследований влияния экспрессии трансгена на реакцию отторжения на модели in vitro.

Цель и задачи исследований:

Целью работы являлось исследование биологических особенностей кроликов, трансгенных по генам кластера регуляторов активации комплемента RCA, на различных уровнях организации индивидуумов

Для достижения цели диссертационной работы были поставлены и решены следующие задачи:

1. Получить три поколения трансгенных кроликов, несущих генную конструкцию RCA YAC, при разных типах спаривания и изучить наследование трансгена.

2. Изучить некоторые физиологи ческне-показателн трансгенных кроликов (размер гнезда, падеж)Ень МСХА

i фонд! i ¡,:iv4>'-ó>* nw'i'OpavjjH

3. Получить препараты хромосом трансгенных кроликов и их аналогов и выявить частоту встречаемости хромосомных аномалий.

4. Исследовать влияние трансгека на структуру органов и тканей трансгенных кроликов.

5. Изучить влияние экспрессии трансгена на поддержание клеток трансгснного происхождения в культуре in vitro.

Научная новизна:

Впервые изучена влияние интеграции фрагмента ДНК размером 700 тыс. п. о., полученного на основе искусственных хромосом дрожжей (YAC), на трансгенные индивидуумы на различных уровнях их организации (генетическом, цитологическом, тканевом, организменном). Впервые выполнено исследование культур клеток транс генных кроликов, несущих гены-ингибиторы комплемента генного кластера RCA, на устойчивость к лизису сывороткой крови человека.

Практическая значимость работы:

Показало, что наличие интеграции генной конструкции RCA на основе YAC не оказывало существенного влияния на жизнедеятельность трансгенных кроликов, что позволяет рассматривать этих животных в качестве функциональной модели для изучения проблемы ксенотрансплантации. Установлена повышенная устойчивость клеток трансгенных кроликов к лизису сывороткой крови человека, что позволяет рассматривать гены-ингибиторы комплемента генного кластера RCA как гены-кандидаты для генетической модификации животных с целью использования их в клеточной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На уровень хромосомных аномалий у трансгснных животных оказывают влияние как наличие трансгена, так и происхождение животного.

2. При исследовании гистологической структу ры печени, почек, селезенки и сердца кроликов, трансгенных по генам-ингибиторам комплемента кластера RCA, существенных различий по сравнению с контрольными животными выявлено не было.

3. При спаривании по типу трансген х трансген наблюдается снижение жизнеспособности потомков по сравнению со спариванием по типу трансген х нетрзнсген.

4. Интеграция генов генного кластера RCA повышает устойчивость клеток трансгенного происхождения к лизису сывороткой крови человека по сравнению с контрольными культурами.

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены:

• на международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», ВИЖ, п. Дубровицы, 200J;

• на конференции аспирантов и молодых ученных, ВИЖ, н. Дубровл-цы, 2001;

• на международной научно-практи1ческой конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», РАМЖ, Московская обл., Подольский р-н, п. Быково, 2002;

• на международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, п. Ду брови цы, 2002;

• на международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, п. Дубровнцы, 2003,

Публикация результатов исследований:

По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем работы:

Диссертация изложена на 324 страницах, содержит 10 таблиц, 19 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и обсуждения, выводов, практических предложений. Список литературы включает 281 источник, в том числе 242 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа проводилась в лаборатории молекулярной генетики и цитогене-тнки животных отдела биотехнологии и физиологическом дворе ВГНИИ животноводства.

Общая схема исследований представлена на рис. I.

В качестве объекта исследований были взяты кролики, несущие генную конструкцию RCA YAC размером 700 тыс. п.о., а также ннтактные особи. От двух трансгонных самцов первого поколения при различных типах спаривания было получено три поколения кроликов. Анализ наличия трансгена осуществляли методом ПЦР-анализа

Оценку стабильности на организменном уровне оценивали по физиологическим показателям, таким как размер гнезда и падеж.

Для изучения стабильности кариотипа получали препараты метафаз-ных хромосом лейкоцитов крови кролика по общепринятым методам /Алено-вицкий и др.. 1999}. Анализ препаратов хромосом проводился с использованием системы Image Scope 1 (ООО «Системы для микроскопии и анализа», г, Москва). Поиск метафаз для анализа проходил при увеличении 20\ Анализ отобранных метафаз проводился при увеличении 100я.

В качестве критерия сохранения стабильности на тканевом уровне использовали гистоструктуру печени, почек, селезенки н сердца трансгенных кроликов. Фиксацию препаратов проводили в жидкости Карнуа. Для окрашивания препаратов использовался гематоксилин-эознн.

Рисунок L

Схема исследований.

Для опенки экспрессии генов-ингибиторов комплемента исследовали пролиферацию клеток трансгенных и контрольных кроликов в присутствии сыворотки крови человека. Культивирование провод мое ь в среде Игла, содержащей 10% сыворотки КРС, 2 мМ глютамнна и антибиотик в обычной концентрации.

На основании полученных результатов делали вывод о влиянии интеграции на сохранение стабильности на различных уровнях организации индивидуумов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Изучение наследования трансгена.

В ходе выполнения диссертационной работы было исследовано три поколения животных от трансгенных кроликов, полученных методом микро-шгьекцни. Для уменьшения эффекта инбридинга при разведении использовались интактные кролики.

Всего методом ПЦР-анализа было исследовано 164 кролика, в том числе 57 кроликов второго поколения, 55 кроликов третьего н 52 кролика четвертого поколения. Для получения потомства использовалось скрещивание по типу трансген х нетрансген и трансгсн х трансгек.

Из 57 исследованных кроликов поколения ^ количество трансгенных жнвотных составило 21 (36,8%), в том числе 17 животных, полученных от спаривания трансген х нетрансген и 4 животных, полученных от спаривания трансген х трансген,

В Р) из 55 исследованных кроликов 23 оказалось траисгенными (41,8%), в том числе 13, полученных от спаривания трансген х нетрансген и 10, подученных от спаривания трансген х трансген.

Из 52 исследованных кроликов поколения Р4 27 были идентифицированы как трансгенные (51,9%), из них 11 были получены от спаривания по типу трансген х нетрансген и 16 от спаривания по типу трансгек х трансген.

В таблице 1 представлены данные о наследовании трансгена в зависимости от типа спаривания.

Таблица !■

Наследование трансгена в поколениях в зависимости от типа спаривания. _

Поколение Тип спаривания

Трансген х нетрансген Трансген х трансген

Транс генные Нетрансгенные Трансгенные Нетрансгенные

п 34,7±б,8 65,3±6,8 50,0±20,4 50,0*20,4

ТЪ 31,7±7,3 683±7,3 71,4±12,1 28,6± 12,1

Р4 36,7±8,8 63,3±8,8 72,7±9,5 2 7,3 ±9,5

В среднем 34,2*4,3 65,8±4,3 б8,2±7,0 31,8±7,0

Как следует из данных таблицы 1, заметных различий в наследовании трансгена при спаривании по типу трансген х нетрансген в трех исследованных поколениях кроликов выявлено не было.

С другой стороны, заметные различия в наследовании трансгена были выявлены при спаривании животных по типу трансген х трансген. Так, если в поколении Р2 было получено 50% трансгенных потомков, то в последующих двух поколениях - 71,4 и 72,7%. Такую высокую вариабельность в наследовании трансгена можно объяснить более высокой степенью инбридинга при спаривании животных первого поколения, когда большинство трансгенпых животных было представлено полусибсами.

Бьшо установлено, что на наследование трансгена существенное влияние оказывает происхождение животных. Первоначально были отобраны 2 трансгенных самца поколения р] (№ 025 и № 074), которые были использованы для дальнейшего разведения трансгенной линии. В таблице 2 представлены данные о наследовании трансгена в зависимости от используемого трансгенного самца. Было установлено, что при анализирующем скрещивании с нетрансгенными самками более высокая доля трансгснного потомства наблюдалась у самца №025 - 40,9%, в то время как доля трансгенных потомков, полученных ог самца №074, составляла 29,6%.

Таблица 2.

Наследование трансгена в зависимости от происхождения.

Полученное Исследуемые трансгенные самцы

потомство № 025 №074

п % п %

Транс генные особи 9 40,9± 10,48 8 29,б±8,79

Нетрансген и ые особи 13 59,1± 10,48 19 70,4±8,79

Всего 22 100 27 100

3.2. Влияние наличия трансгена на некоторые физиологические показатели животного.

Исследование влияния интеграции трансгена на плодовитость показало, что при спаривании по типу трансген х трансген наблюдалось уменьшение размера гнезда по сравнению со спариванием по типу трансген х нетраисген. Данные о размере гнезда в поколениях и Рз представлены в таблице 3, Так, среди и 14 размер гнезда при спаривании по типу трансген х трансген составил 4,9 крольчонка, что приблизительно в два раза меньше, чем при спаривании по типу трансген х нетрансген (8,1 крольчонка). Необходимо также отметить, что в нескольких случаях при спаривании по типу трансген х трансген были зафиксированы случаи выкидыша недоразвитых плодов. Возможно, что повышенная эмбриональная смертность и привела к уменьшению размеров гнезда в данной группе. Хотя также нельзя отрицать и факт пониженной оплодотворяем ости у трансгенных особей.

Таблица 3.

_ Изменения к размере I и езда при различных типах скрещивания.

Тип спаривания ___Количество крольчат в гнезде (шт.)

Анализируя данные таблицы 3, можно отмстить некоторое уменьшение размера гнезда в поколении при спаривании по типу трансген х нетрансгсн (7,5 голов) по сравнению с поколением Г2 аналогичного скрещивания (8,7 голов). Это можно объяснить тем, что при получении поколения Г3 частично использовались нетрансгениые кролики, полученные при спаривании трансгенных особей, в то время как для получения поколения в качестве не-трансгенных самок использовались только интактные кролики. Пели в поколении Р, при спаривании по типу трансген х нстрансгеп рассмотреть размер гнезда в зависимости от происхождения негра и с генных особей, участвовавших в скрещивании, получается следующая картина. Средний размер гнезда у нетрансгенных самок, полученных от спаривания с трансгенными самцами, составил 6,6 голов, в то время как у интактных особен при аналогичном спаривании данный показатель равнялся 8,3 головы, что практически не отличается от показателя поколения У2-

Данные о жизнеспособности кроликов исследуемых поколении в зависимости от типа спаривания представлены в таблице 4.

Таблица 4

Показатели надежа у кроликов поколений Кг и в зависимости от тина спаривания. ________„____

Тип спаривания I [ропент смертности, %

Р, В среднем

Трансген-трансген 33,3 44,0 41,2

Трансген-нетранс ген 20,5 31,7 25,4

В среднем 21,8 35,3 2К.5

Как следует из данных таблицы 4, процент падежа при спаривании по типу трансген х трансген был несколько выше, но сравнению со спариванием по типу трансген х иетрансген, как в поколении Г- так и в поколении что. возможно, было вызвано повышенным уровнем гомози готпости при спаривании первого типа.

Нами был» зафиксированы некоторые случаи ненормального поведения среди транегешшх особей, такие как алибидность, агрессивность.

3.3. Изучение плинния трансгена на стабильность карнотииа транс генных кроликов.

В ходе выполнения диссертационной работы было обследовано 35 потом ко и кроликов поколения нз них 17 трансгеиных и 18 нетранс генных животных. Нами не было обнаружено ни одного случая конституциональных нарушений кариотипа, а также отклонений в хромосомной формуле пола. Хромосомный набор всех обследованных животных соответствовал видовой норме и содержал 44 хромосомы. Однако у части из них был обнаружен повышенный уровень клеток с хромосомными аберрациями (рис, 2).

а - хроматидаые разрывы; 6 - изохроматидныг? разрыв: к - дицен-

трик.

Хромосомные аномалии у этих животных были представлены, главным образом, хроматидными и изохроматидными пробелами и разрывами. Доля днцентриков составила около 3% от числа аберраций. Около 37% пораженных клеток несли множественные аберрации, а в 27,5% были выявлены изохромитидные аберрации. Причем около 11 % клеток одновременно содержали и множественные перестройки и изохроматидные аберрации.

В результате проведенного анализа обнаружена определенная закономерность в распределении аберраций по хромосомам набора. В 45,3% случаев были поражены хромосомы 1 пары. Аномалии примерно в равной степепи затрашвали как короткое, так и длинное плечо. Точки разрывов располагались преимущественно в зонах, соответствующих светлым бондам, выявляемым при инкубации с Э'ВгсШ и бромистым этилием, в прителомерных и прицентромериых районах обоих плеч 1-й хромосомы. Это указывает на наличие связи хромосомной нестабильности с особенностями нуклеотидного состава определенных участков ДНК,

Рисунок 2.

Аберрации хромосом у кроликов, трансгенных по 11СА.

б

а

Подтверждением этому могут служить и следующие отмеченные нами факты. Во-первых, у одного из носителей повышенной хромосомной нестабильности - трансгенного кролика №205, частота клеток с аберрациями сохранилась практически на одном уровне, спустя 2 месяца после первого обследования, 52 и 42%, соответственно. Во-вторых, отмечено неслучайное их распределение fio клеточному циклу. Только 20% аберрации было выявлено в профазе, 50% из них встречались в средней и 30% в поздней метафазе, 90% клеток с изохроматидными и множественными аберрациями приходится на метафазу и 10% на позднюю метафазу. В профазе таких клеток не обнаружено.

Все это позволяет утверждать, что в данном случае мы имеем дело с перестройками, выявляемыми под действием модифицирующих агентов, по, несомненно, связанных с особенностями генотипа животных. Об этом свидетельствуют данные, приведенные в таблицах 5 и 6.

Таблица 5,

Уровень хромосомной изменчивости у кроликов поколения Fi, в зависимости от наличия трансгена и происхождения.

Группа потомков Отцы В среднем

№ 025 |№ 074

Петра не генные особи 7,17% 2,60% (п=9) ) (П=9) 4,88% (п=18)

Трансгениые особи 19,44% 1 6,05% (п-9) (п=8) 13,14% (п-17)

В среднем 13,31% 4,22% (п=18) 1 <п-17) 8,89% (п-35)

Из данных таблицы 5 видно, что повышенный уровень хромосомной нестабильности имеет место у трансгенных потомков самцов №025 и №074. Но наибольший его уровень отмечен у трансгениых особей, полученных от кролика №025. Интересно, что и нетрансгениые его потомки имеют более высокий уровень аберрантных клеток по сравнению с животными той же группы, происходящими от кролика №074.

Из таблицы 5 также видно, что во всех случаях количество аберраций у трансгенных животных приблизительно в 3 раза превышает уровень у нетрансгенных особей. Это позволяет нам утверждать, что наличие трансгепа оказывало негативное влияние па уровень хромосомной стабильности поколения

Данные цитогеиетического анализа потомков самца № 025, полученных при двух типах спаривания представлены в таблице 6. Из приведенных в таблице б данных видно, что в обоих вариантах подбора трансгенные потомки имел» более высокий уровень хромосомной изменчивости в сравнении с нетраисгенными енбеами.

Тад.'пма 6.

Влияние наличия грансгенз и вариантов спаривания на частоту хромосомных аберраций у потомков грансгенного кролика №025.

Группа потомков

Н етрансгснн ыс

Трансгенные В среднем

Тип спаривания

трансгеи х трансген

6,63 (п-3)

37,35 (п~2) 18,14 (п-5)

трансген х нетрансген__ 4,42

(п~3) _

15,5

9,96 (п-б)

В связи с тем, что при исследовании животных поколения Г? повышенная нестабильность кариотнпа отмечена у потомков кролика №025, а минимальная - у потомков №074, в поколении Г3 был проведен пнтогенетический анализ с учетом происхождения животных (табл. 7). Было исследовано 20 кроликов, из которых 7 были трансгенными и 13 нетранс] енными.

Таблица 7.

Уровень хромосомной изменчивости у третьего поколения кроликов в зависимости от про!¡схождсмня.___

Показатели Родственные группы

№ 025 ] № 074 Кросс

Число исследованных потомков 7 2 11

Клеток с аберрациями, % 14,33 | 1,25 5,84

Как следует из данных таблицы 7, в случае, когда потомки №025 и №074 не были кроссированы, уровень аберраций у них был соответственно равен 14,83 и 1,25%, а при кроссс - 5,84 %. Следовательно, при скрещивании потомков №025 и №074 негативное влияние кролика№>025 подавляется.

При исследовании животных Р2 было отмечено, что на уровень аберраций влияет наличие транс гена. Поскольку наибольшее число трансгенкых животных выявлено при скрещивании потомков № 025 и №074, мы провели сравнение трансгенных и интактных животных в этой группе. Анализ показал, что у интактных животных этой группы частота аберрантных клеток составила 5,1, а у трансгенных - 6,4%. Следовательно, н в этом случае наблюдается тенденция к росту нестабильности хромосом у трансгенниых особей, но, вероятно, генотип кролика №074 подавляет негативное действие трансгена. Сравнение уровня хромосомной изменчивости в поколениях К3 и представлено в таблице 8.

Из таблицы 8 видно, что уровень хромосомной изменчивости среди трансгенных особей поколения уменьшился приблизительно в 2 раза, в то время как среди нетрамсгешшх животных этот показатель остался на том же

уровне. Это позволяет нам предположить, что произошла некоторая стабилизация уровня хромосомной изменчивости среди трансгенных особей.

Таблица 8.

Сравнение уровня хромосомной изменчивости в поколениях трансгенных кроликов.____________________

Группы потомков Клеток с абе ррациями, %

F3 F3

Трансгенные 13,88 (п=17) 6,42 (ПГб)

Нетранс генные 4,8$ (n=IS) 5,14 (n=5)

В среднем 8,89 (n=35) 5,88 (п=И)

Результаты проведенных исследований позволяют предположить, что уровень нестабильности хромосом у обследованных животных зависит от взаимодействия их генотипа и внешних факторов, характер которого изменяется в присутствии трансгена. Независимо от функции последнего, его интеграция в геном хозяина оказывает дестабилизирующее влияние на хромосомный набор.

3.4. Гистологические исследования тканей трансгенных и контрольных кроликов.

Для гистологических исследований отбирали пробы печени, почек, селезенки и сердца трансгенных (п=9) и нетранс генных кроликов (п=9).

Изучение гистологических срезов печени показало, что структура печени у трансгенных по RCA кроликов ничем существенно не отличается от структуры органа контрольных животных. Структура ткани почки характеризуется одними и теми же признаками, как в опыте, так и в контроле. Селезенка на гистопрепаратах, изготовленных из опытных и контрольных образцов, выглядит одинаково. Как в опытных, так и в контрольных образцах ткань миокарда одинаково структуризнрована в части плазматических элементов и ядерного вещества.

Таким образом, проведенные нами исследований показали, что интеграция и экспрессия траисгена в условиях настоящего опыта не оказывала существенного влияния на гистологическое строение печени, почек, селезенки и сердца трансгенных кроликов. Следует отметить лишь выявление циррозного видоизменения печени у одного из трансгенных кроликов, которое, однако, не может однозначно рассматриваться как следствие экспрессии транс гена.

3.5. Исследование экспрессии трансгена в культуре клеток на модели in vitro.

В качестве косвенного метода оценки экспрессии трансгена может рассматриваться их повышенная устойчивость к лизису сывороткой крови чело-

века, обусловленная экспрессией генов-ингибиторов комплемента крови человека.

В эксперименте использовалось 6 животных, из которых были сформированы опытная и контрольная группы по 3 животных в каждой.

Для оценки экспрессии трансгена нами были получены первичные культуры клеток поджелудочной и щитовидной желез. По достижении монослоя клетки рассевагш и культивировав в присутствии 50% сыворотки крови человека.

Поджелудочная железа.

Начиная со 2-го дня культивирования в присутствии 50% сыворотки крови человека наблюдалось более активное деление клеток трансгенных кроликов, что проявлялось в их более высоком количестве ио сравнению с нетрансгеннымн животными. Если через сутки после добавления сыворотки крови человека число клеток поджелудочной железы трансгенных кроликов было меньше на 40 млн. или 12%, то уже на вторые сутки культивирования наблюдалась более активная пролиферация клеток трансгенных кроликов: число их клеток было выше на 60 млн. или 30,2%. В последующие дни культивирования данная тенденция сохранялась: число клеток трансгенных кроликов превышало аналогичный показатель нетрансгенных кроликов на 60118 млн. или 16,6-41,1%.

Оценивая в качестве косвенного показателя пролифератнвной активности клеток время, требующееся им для достижения монослоя после их пересева, следует отметить более высокую потенцию к делению клеток поджелудочной железы траксгеиного происхождения. Так, если культура клеток трзнсгенного кролика 1 пассажа достигала монослоя через 19 дней культивирования, то контрольной культуре требовалось более 25-ти дней.

На втором пассаже данная тенденция сохранялась - клетки трансгенного кролика достигали монослоя через 9 дней, в то время как контрольная культура - через 15 дней. На третьем пассаже различий между группами выявлено не было.

Щитовидная железа.

Первые двое суток культивирования в присутствии 50% сыворотки крови человека различий в числе клеток трансгенного и нетрансгенного происхождения выявлено не было. Через три дня культивирования наблюдалась более высокая пролиферативная активность контрольной культуры клеток.

Через 4 я 5 суток культивирования в присутствии сыворотки крови человека в культуре трансгениого происхождения идентифицировалось большее число клеток ио сравнению с нетрансгенной культурой.

Оценка временного интервала, требующегося для достижения клетками щитовидной железы монослоя после их пересева, как и в случае клеток поджелудочной железы, выявила более высокую потенцию к делению клеток трансгенного происхождения. Только на первом пассаже была выявлена несколько более высокая потенция к росту контрольных клеток. Так, культуры клеток 'транс ген но го происхождения достигали монослоя в среднем через 21,3 дня культивирования, в то время как контрольным культурам требова-

лось в среднем 19,8 дня. На втором и третьем пассажах культивирования клетки трансгенного происхождения характеризовались значительно более высокой пролиферирующей активностью. На втором пассаже они достигали монослоя в среднем через 3,3 дня, а на третьем пассаже - через 7 дней, в то время как контрольные клетки - соответственно, через 14,5 и 12 дней.

Таким образом, проведенные нами исследования влияния экспрессии трансгена на реакцию отторжения на модели in vitro показали большую устойчивость клеток трансгенного происхождения к лизису сывороткой крови человека по сравнению с контрольными культурами, что полностью согласуются с литературными данными.

4. ВЫВОДЫ.

1. Изучение наследования трансгена при спаривании по типу трансген х нетрансген не выявило существенных различий поколениях Fj-F* трансгенных кроликов (соответственно, 36,8, 41,8, 51,9%). При спаривании по типу трансген х трансген отмечено значительное снижение доли трансгенных особей в поколении F2 (50%), по сравнению с поколениями Fj, F,, (соответственно, 71,4 и 72,7%).

2. Показано влияние интеграции трансгена на некоторые физиологические показатели трансгенных кроликов. Установлено влияние типа спаривания на плодовитость. Так, средний размер гнезда при спаривании по типу трансген х трансген был практически в два раза ниже по сравнению со спариванием по типу трансген-нетрансген (соответственно, 4,9 и 8,1 крольчонка на гнездо). Выявлен повышенный отход крольчат, полученных при спаривании по типу трансген х трансген по сравнению со спариванием по типу трансген х нетрансген в двух исследованных поколениях трансгепных кроликов (соответственно, 41,2 и 25,4%).

3. Показано, что количество хромосомных аберраций зависит не только от наличия трансгена, но также и от происхождения животных. Так, при сравнении потомков поколений F^, F}, полученных от кроликов № 025 и № 074, исходно используемых дм разведения трансгенной линии, наибольший уровень аберраций наблюдался как у трансгенных, так и нетрансгениых потомков кролика №025 (13,31% и 14,83%) по сравнению с животными, происходящими от кролика Na 074 (4,22% и 1,25%).

4. Выявлено снижение нестабильности кариотипа у животных последующих поколений. Так, нестабильность кариотипа у трансгенных животных в поколении Fj приблизительно в три раза превышала уровень у нетрансгениых аналогов (соответственно, 13,88 и 4,88% аберраций на клетку). Уровень хромосомной изменчивости среди трансгенных особей поколения F3 уменьшился приблизительно в 2 раза, в то время как среди нетрансгенных животных этот показатель остался на том же уровне.

5. Анализ нарушений кариотипа показал, что хромосомные аномалии у трансгенных кроликов представлены, главным образом, хроматидными и нзохроматидными пробелами и разрывами. Доля дицентриков составила около 3% от числа аберраций. Около 37% пораженных клеток несли множественные аберрации, а в 27,5% были выявлены изохромитидные аберрации. В 45,3% случаев были поражены хромосомы 1 пары. Аномалии примерно в равной степени затрагивали, как короткое, так и длинное плечо.

6. Анализ гистоструктуры органов и тканей трансгенных кроликов не выявил существенного влияния на структуру печени, почек, селезенки и сердца животных.

7. Изучение экспрессии трансгена на реакцию отторжения на модели in vitro показало большую устойчивость клеток трансгенного происхождения к лизису сывороткой крови человека по сравнению с контрольными культурами.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Научно-исследовательским лабораториям, занимающимся созданием и исследованием трансгенных животньсх, рекомендуем при разведении трансгенных линий учитывать уровень хромосомных аберраций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Кленовицкий П,М„ Доцев A.B., Гладырь Е.А., Эрнст JI.K,, Брем Г., Зиновьева H.A. Изучение наследования и влияния интеграции генной конструкции MCP ВАС на стабильность генома трансгепных кроликов И В сб. межд. научн. кокф. ДНК-технологип в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных. - Дубровицы- 2001. -С.74-77,

2. Zinovieva N-, Klemvitskij P., Dotsev A,, Cladir E., Ernst L, Brem G. Breeding and cytogenetic study of RCA YAC transgenic rabbits // В сб. межд. научн, конф. ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных. - Дубровицы - 2001. - C.125-Í26.

3, Допев A.B. Изучение влияния интеграции трансгена на хромосомную изменчивость у кроликов// В сб. научн. конф. Быково - 2002. - C.21S-219.

4, Кленовицкий П.М., Багиров В.А., Нгбодо Ж.В., Доцев A.B., Иолчнев Б.С. Использование прикладных программ обработки изображений, совместимых с Windows, в цитогенетнческих исследованиях. - Дубровицы - 2002. -20 с.

5. Доцев A.B., Кленовицкий П.М., Зиновьева H.A. Изучение наследования стабильности генома у кроликов, трансгекных по генной конструкции RCA // В сб. мсжд. научи, конф. Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных, - Дубровииы - 2002. - С.126-J27.

6. Кленовицкий П.М, Багиров В.А., Доцев A.B. Получение хромосомных препзрагов и кариотипирование кроликов И Школа-практикум. Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных под. Ред. Зиновьевой H.A. - Дубровицы - 2002, - с.62-66.

7. Кленовицкий П.М., Багиров В.А., Иолчиев Б.С., Доцев A.B. Вопросы прикладной цитогенетикк сельскохозяйственных животных // Достижения науки и техники АПК -2003. - №10. - С. 17-19.

8. Доцев A.B. Исследование влияния интеграции генной конструкции RCA на основе YAC на морфологическую структуру органов трансгенных кроликов // В сб. межд. научи, конф. Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных. - Дубровицы - 2003. -С. 105-106.

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл., Подольский р-и, п. Дубровицы Тел. (8 - 27) 65-14-24, (8 - 27) 65-14-07

Сдано в набор 23.12.2003. Подписано в печать 24.12.2003 _Заказ К» 30. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Доцев, Арсен Владимирович

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Трансгенные животные

1.2. Методы получения трансгенных животных

1.2.1. Микроинъекция

1.2.2. Ретровирусные векторы

1.2.3. Эмбриональные стволовые клетки

1.2.4. Спермии и липосомы

1.2.5. Перенос ядер

1.2.6. Перенос генов с помощью искусственных хромосом

YAC, ВАС)

1.3. Применение трансгенных животных

1.3.1. Трансгенные животные с новыми хозяйственнополезными свойствами

1.3.2. Создание трансгенных животных устойчивых к различным заболеваниям

1.3.3. Создание животных биореакторов для синтеза рекомби-нантных белков фармакологического и технологического назначения

1.3.4. Ксенотрансплантация 22 1.3.4.1. Проблемы при ксенотрансплантации 24 1.3.4.2.Экспериментальные наработки в ксенотрансплантации

1.3.4.3. Создание генетически модифицированных доноров

1.3.4.4. Исследования в области ксенотрансплантации

1.3.4.4.1. Экспрессия в культуре клеток

1.3.4.4.2. Создание трансгенных мышей

1.3.4.4.3. Создание трансгенных свиней

1.4. Негативное действие трансгенов

2. Материалы и методика исследований

2.1. Реактивы и оборудование

2.2. Схема исследований

2.3. Молекулярно-генетический анализ

2.4. Цитогенетические исследования

2.5. Гистологические исследования

2.6. Культивирование клеток трансгенных кроликов

3. Результаты и обсуждение

3.1. Ведение трансгенной линии и изучение наследования трансгена

3.2. Влияние наличия трансгена на некоторые физиологические показатели животного

3.3. Цитогенетические исследования

3.3.1. Описание нормального кариотипа кролика

3.3.2. Изучение влияния экзогена на стабильность кариотипа трансгенных кроликов

3.4. Гистологические исследования печени, почек, селезенки и сердца

3.5. Исследование влияния экспрессии трансгена на реакцию отторжения на модели in vitro

4. Выводы

5. Практические предложения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение биологических особенностей кроликов, трансгенных по генам кластера регуляторов активации комплемента RCA"

Актуальность темы.

Одним из путей решения ряда прикладных задач в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве является создание генетически модифицированных (трансгенных) животных. После получения первых трансгенных сельскохозяйственных животных в 1985 году [Brem et ah, 1985, Hammer et ah,

1985] был достигнут значительный прогресс в области трансгенеза, проявившийся как в разработке новых более эффективных способов получения трансгенных организмов, так и в создании качественно новых генных конструкций, обеспечивающих высокие уровни экспрессии трансгенов в организме животных, независимо от участка их встраивания в геном.

Основным лимитирующим фактором практического использования трансгенных сельскохозяйственных животных является наблюдаемая в большинстве случаев относительно низкая экспрессия трансгенов, а также повышенный отход среди трансгенных особей.

Значительное влияние на экспрессию генных конструкций размером до 15 т.п.о., полученных с использованием стандартных векторов, оказывает участок интеграции трансгена в геном (позиционный эффект) [Wilson et ah, 1990, Sippel et ah, 1997]. В этом случае экспрессия трансгенов в организме животных зависит от последовательностей, прилегающих к участку интеграции, что является причиной большой вариабельности уровня экспрессии. Кроме того, ограниченные знания регуляторных последовательностей большинства генов приводят к использованию зачастую полностью не охарактеризованных геномных фрагментов, что и является причиной низкой эффективности экспрессии в экспериментах по переносу генов [Palmiter, Brinster,

1986].

Для того чтобы преодолеть позиционный эффект и таким образом увеличить вероятность оптимальной экспрессии трансгенов, интегрированных в случайной локализации, был применен целый ряд различных стратегий, одной из которых является включение в генные конструкции, по возможности, всех регуляторных элементов, ответственных за его экспрессию.

Стандартные плазмидные, космидные или фаговые векторы в большинстве случаев не могут быть использованы для этой цели вследствие их ограниченной емкости. Для реализации данной стратегии нашли применение так называемые искусственные хромосомы, обладающие повышенной клонирующей способностью.

Наиболее широкое применение для получения трансгенных животных нашли векторные системы на основе искусственных хромосом дрожжей -YAC [Montoliu etal., 1993, Forget et al., 1993, Jakobovits, 1994, Peterson, 1997, Peterson et al., 1997, Camper, Saunders, 2000]. YAC способны к стабильному сохранению геномных фрагментов ДНК длиной более 1 миллиона п.о. [Burke etal., 1987].

В настоящее время опубликовано лишь несколько работ об успешном создании YAC-трансгенных сельскохозяйственных животных. Были получены трансгенные свиньи [Yanoutsos et al., 1995], кролики [Brem et al., 1996, Rouy et al., 1998] и крысы [Fujiwara et al., 1997, 1999], при этом эффективность трансгенеза была сопоставимой с результатами, достигнутыми на мышах.

У сельскохозяйственных животных использование векторов на основе YAC рассматривается, главным образом, в двух направлениях: направленная экспрессия рекомбинантных белков в молоко трансгенных животных и ксе-нотрансплантация.

С помощью ксенотрансплантации можно получить неограниченное количество донорского материала. Для этого необходимо лишь, чтобы пересаженные органы животных не отторгались, т.е. максимально приблизить на молекулярном уровне к человеку. Это может быть достигнуто с помощью трансгенеза посредством внесения дополнительной генетической информации в геном животного или, наоборот, выключения некоторых генов животных.

Вместе с тем, следует отметить, что после многочисленных экспериментов, проводимых во многих лабораториях во всем мире, исходное представление о трансгенезе, как о процессе, сводящемся только к появлению у генетически трансформированных особей нового признака, контролируемого внесенным геном, значительно усложнились. Оказалось, что интеграция чужеродного генетического материала не является процессом индифферентным по отношению к состоянию генома реципиента [Кленовицкий и др., 1999]. При обследовании трансгенных животных обнаружено, что микроинъекции чужеродной ДНК обуславливают дестабилизацию генома потомства [Кленовицкий и др., 1998, Медведев, 1992, Brem, 1993, Constantini et al, 1989, Gasaryan et al, 1987].

В ряде исследований было показано, что интеграция чужеродной ДНК может сопровождаться мутагенным эффектом. Негативной стороной транс-генеза является повышенная эмбриональная и постнатальная смертность, а также пониженная жизнеспособность животных. Часть особей бывают стерильными. Введение чужеродной ДНК может приводить к хромосомным аберрациям [Завада, 1994, Кленовицкий и др., 1994, Manon et al, 1988, Marx, 1985].

Успешное использование трансгенных животных в практике, в том числе и в области ксенотрансплантации, предусматривает наряду с наличием экспрессии биологически функциональных трансгенных белков, необходимость стабильного наследования трансгена в ряде поколений, а также возможность длительного ведения трансгенной линии без снижения жизнеспособности трансгенных индивидуумов. Риск отрицательного влияния интеграции трансгена на организм животных возрастает при интеграции в геном животных фрагментов ДНК большой длины (несколько сот тысяч пар оснований), что стало возможным благодаря использованию технологии искусственных хромосом.

Таким образом, актуальной задачей сельскохозяйственной биотехнологии как в фундаментальном, так и в прикладном аспекте, является исследование влияния интеграции трансгена на различных уровнях организации индивидуумов (генетическом, цитологическом, тканевом, организменном). В рамках решения проблемы ксенотрансплантации актуальным является проведение исследований влияния экспрессии трансгена на реакцию отторжения на модели in vitro.

Цели и задачи исследования.

Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы явилось исследование биологических особенностей кроликов, трансгенных по генам кластера регуляторов активации комплемента RCA, на различных уровнях организации индивидуумов $ Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Получить три поколения трансгенных кроликов, несущих генную конструкцию RCA YAC, при разных типах спаривания и изучить наследование трансгена.

2. Изучить некоторые физиологические показатели трансгенных кроликов (размер гнезда, падеж).

3. Получить препараты хромосом трансгенных кроликов и их аналогов и выявить частоту встречаемости хромосомных аномалий.

4. Исследовать влияние трансгена на структуру органов и тканей трансгенных кроликов.

5. Изучить влияние экспрессии трансгена на поддержание клеток трансгенного происхождения в культуре in vitro.

Научная новизна.

Впервые изучено влияние интеграции фрагмента ДНК размером не-~ сколько сот тысяч пар основании, полученного на основе искусственных хромосом дрожжей (YAC), на трансгенные индивидуумы на различных уровнях их организации (генетическом, цитологическом, тканевом, организ-менном). Впервые выполнено исследование культур клеток трансгенных кроликов, несущих гены-ингибиторы комплемента генного кластера RCA, на устойчивость к лизису сывороткой крови человека.

Практическая значимость работы.

Показано, что наличие интеграции генной конструкции RCA на основе YAC не оказывало существенного влияния на жизнедеятельность трансгенных кроликов, что позволяет рассматривать этих животных в качестве функциональной модели для изучения проблемы ксенотрансплантации. Установлена повышенная устойчивость клеток трансгенных кроликов к лизису сывороткой крови человека, что позволяет рассматривать гены-ингибиторы комплемента генного кластера RCA как гены-кандидаты для генетической модификации животных с целью использования их в клеточной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. На уровень хромосомных аномалий у трансгенных животных оказывают влияние как наличие трансгена, так и происхождение животного.

2. При исследовании гистологической структуры печени, почек, селезенки и сердца кроликов, трансгенных по генам-ингибиторам комплемента кластера RCA, существенных различий по сравнению с контрольными животными выявлено не было.

3. При спаривании по типу трансген х трансген наблюдается снижение жизнеспособности потомков по сравнению со спариванием по типу трансген х нетрансген.

4. Интеграция генов генного кластера RCA повышает устойчивость клеток трансгенного происхождения к лизису сывороткой крови человека по W сравнению с контрольными культурами.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», ВИЖ, п. Дубровицы, 2001; на конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, п. Дубровицы,

2001; на международной научно-практической конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», РАМЖ, Московская обл., Подольский р-н, п. Быково, 2002; на международной научной конференции «Современные достижения и ♦ проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, п. Дубровицы, 2002; на международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, п. Дубровицы, 2003.

Публикация результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 124 страницах, содержит 10 таблиц, 19 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и обсуждения, выводов, практических предложений. Список литературы включает 281 источник, в том числе 242 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Доцев, Арсен Владимирович

4. ВЫВОДЫ

1. Изучение наследования трансгена при спаривании по типу трансген х нетрансген не выявило существенных различий поколениях F2-F4 трансгенных кроликов (соответственно, 36,8, 41,8, 51,9%). При спаривании по типу трансген х трансген отмечено значительное снижение доли трансгенных особей в поколении F2 (50%), по сравнению с поколениями F3, F4 (соответственно, 71,4 и 72,7%).

2. Показано влияние интеграции трансгена на некоторые физиологические показатели трансгенных кроликов. Установлено влияние типа спаривания на плодовитость. Так, средний размер гнезда при спаривании по типу трансген х трансген был практически в два раза ниже по сравнению со спариванием по типу трансген-нетрансген (соответственно, 4,9 и 8,1 крольчонка на гнездо). Выявлен повышенный отход крольчат, полученных при спаривании по типу трансген х трансген по сравнению со спариванием по типу трансген х нетрансген в двух исследованных поколениях трансгенных кроликов (соответственно, 41,2 и 25,4%).

3. Показано, что количество хромосомных аберраций зависит не только от наличия трансгена, но также и от происхождения животных. Так, при сравнении потомков поколений F2, F3, полученных от кроликов № 025 и № 074, исходно используемых для разведения трансгенной линии, наибольший уровень аберраций наблюдался как у трансгенных, так и нетрансгенных потомков кролика №025 (13,31% и 14,83%) по сравнению с животными, происходящими от кролика № 074 (4,22% и 1,25%).

4. Выявлено снижение нестабильности кариотипа у животных последующих поколений. Так, нестабильность кариотипа у трансгенных животных в поколении F2 приблизительно в три раза превышала уровень у нетрансгенных аналогов (соответственно, 13,88 и 4,88% аберраций на клетку). Уровень хромосомной изменчивости среди трансгенных особей поколения F3 уменьшился приблизительно в 2 раза, в то время как среди нетрансгенных животных этот показатель остался на том же уровне.

5. Анализ нарушений кариотипа показал, что хромосомные аномалии у трансгенных кроликов представлены, главным образом, хроматидными и изохроматидными пробелами и разрывами. Доля дицентриков составила около 3% от числа аберраций. Около 37% пораженных клеток несли множественные аберрации, а в 27,5% были выявлены изохромитидные аберрации. В 45,3% случаев были поражены хромосомы 1 пары. Аномалии примерно в равной степени затрагивали как короткое, так и длинное плечо.

6. Анализ гистоструктуры органов и тканей трансгенных кроликов не выявил существенного влияния на структуру печени, почек, селезенки и сердца животных.

7. Изучение экспрессии трансгена на реакцию отторжения на модели in vitro показало большую устойчивость клеток трансгенного происхождения к лизису сывороткой крови человека по сравнению с контрольными культурами.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Научно-исследовательским лабораториям, занимающимся созданием и исследованием трансгенных животных, рекомендуем при разведении трансгенных линий учитывать уровень хромосомных аберраций.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Доцев, Арсен Владимирович, Моск. обл., п. Дубровицы

1. Восток К., Самнер Э. Хромосома эукариотической клетки. М., Мир.- 1981.-592 с.

2. Брем Г., Зиновьева H.A., Эрнст JI.K. Генные фермы новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными // Сельскохозяйственная биотехнология. - 1993. - №6. — С. 3-27.

3. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве. Пер. с нем. М.: Россельхозакадемия, 1995. - 326 с.

4. Волкова Н. А., Волкова JI.A. Локальная инфекция молочной железы как альтернатива получения сельскохозяйственных животных-продуцентов рекомбинантных белков // Достижения науки и техники АПК №10. - 2003.

5. Гладырь Е.А., Зиновьева H.A., Попов А.Н., Марзанов Н.С., Эрнст Л.К., Брем Г. Методические рекомендации по определению вариантов каппа-казеина и бета-лактоглобулина крупного рогатого скота методом ПЦР-ПДРФ анализа // Дубровицы 2001. - 15 с.

6. Глебов O.K. Генетическая трансформация соматических клеток. — Л. -Наука. 1989.-251 с.

7. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология: принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 589 с.

8. Гольдман И.Л., Разин C.B., Эрнст Л.К., Кадулин С.Г., Гращук М.А. Молекулярно-биологические аспекты проблемы позиционно-независимой экспрессии чужеродных генов в клетках трансгенных животных // Биотехнология 1994. - №.2. - С.3-8.

9. Дыбан А.П., Городецкий С.И. Трансгенные млекопитающие: изучение фенотипических эффектов гена гормона роста человека, индуцированного животным. Биотехнология 1987. - №3. - с.352-357.

10. Елагин В.В. Изучение интеграции, наследования и экспрессии рекомбинантных генов с молоком кроликов // Канд. дисс. Горки Ленинские -2002.-149 с.

11. Завада А.Н. Анализ хромосомной локализации фрагмента вируса лейкоза коров у трансгенных кроликов // Молекулярно-генетические маркеры животных.- Киев.- Аграрная наука.-1994.-С.56-57.

12. Зиновьева H.A., Попов А.Н., Эрнст Л.К. и др. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. Дубровицы: ВИЖ, 1998. - 47 с.

13. Зиновьева H.A., Эрнст Л.К., Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве. ВИЖ, 2000. 128 с.

14. Картель H.A., Макеева E.H., Мезенко A.M. Генетика: Энциклопедический словарь. Мн.: Тэхналопя, 1999. - 448 с.

15. Кленовицкий П.М., Завада А.Н., Живалев И.К. Ядрышкообразующие районы у трансгенных свиней (шТ-1/hGRF) // Генноинженерные с.-х. животные. Сб. науч. тр. — В. 1. 1995. - М. - С.64-68.

16. Кленовицкий П.М., Миталлипова М.М., Цветкова Т.Г. Анализ дифференциальной структуры хромосом у кролика, трансгенного по гену mMTI/bGHatt // Бюлл. науч. работ ВИЖ.- В. 109.-1994.- С.80-83.

17. Кленовицкий П.М., Моисейкина Л.Г., Марзанов Н.С. Цитогенетика сельскохозяйственных животных. Элиста: Джангар, 1999. — 142 с.

18. Кленовицкий П.М., Некрасов A.A. Мутационные изменения у трансгенных животных // Актуальные проблемы развития животноводства. -Дубровицы. 1998. -С. 184-191.

19. Коржикова C.B. Выделение, характеристика и трансплантация сперматогоний типа А хряка // автореф. канд. дисс. Дубровицы — 2002. — 27 с.

20. Медведев С,Ю. Перенос гена рилизинг-фактора гормона роста человека кроликам, овцам и свиньям // автореф. канд. дисс. С.-П.-Пушкин -1992- 17 с.

21. Медведев С.Ю., Козикова JI.B., Кравцов В.Ю., и др. Нестабильность генома кроликов и свиней, полученных из зигот в которые, микроинъецировали ген рилизинг-фактора гормона роста человека // Киев.: Аграрная наука. 1994. — С.116.

22. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. — М.: Мир, 2000. 592 с.

23. Савченкова И.П., Зиновьева H.A., Булла Й., Брем Г. Эмбриональные стволовые клетки, их генетическое изменение путем гомологичной рекомбинации и использование в получении трансгенных животных // Успехи современной биологии, 1996, Т. 116, № 1, с. 78-91.

24. Сингер M., Берг П. Гены и геномы: В 2-х т. Т.1. Пер. с англ. — М.: Мир, 1998.-373 с.

25. Сингер М., Берг П. Гены и геномы: В 2-х т. Т.2. Пер. с англ. — М.: Мир, 1998.-391 с.

26. Титова В.А., Волкова H.A., Зиновьева H.A., Шатайло В.Н., Эрнст JI.K. Использование ретровирусных векторных систем для получения реком-бинантных белков в молоке сельскохозяйственных животных // Сельскохозяйственная биология, 2002, № 6, с. 53-58.

27. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. М.: Агар, 1999. - 512 с.

28. Чабан И.М. Влияние трансгенеза на биологические и хозяйственно-полезные признаки свиней // Диссертация на соискание звания кандидата биологических наук Дубровицы - 2001. — 141 с.

29. Шан Лицзуань, Бенюмов А. О., Голиченков В.А. Аномалии эмбриогенеза у трансгенных Danio rerio (pisces). Генетика — 1994. №30. - С. 180.

30. Шевелуха B.C., Калашникова Е.А, Дегтярев C.B., Кочиева Е.З., Прокофьев М.И., Новиков H.H., Ковалев В.М., Калашников Д.В. Сельскохозяйственная биотехнология. М.: Высшая школа, 1998. 416 с.

31. Щит И.Ю., Кузнецов A.B., Каурова С.А., Кузнецова И.В., Гусев В.В. Негативное действие экзогенной ДНК на оплодотворение // Проблемы репродукции 1998. - №4.

32. Эрнст Л.К. Проблемы селекции и биотехнологии сельскохозяйственных животных. М.: Россельхозакадемия, 1995. - 360 с.

33. Эрнст Л.К., Гольдман И.Л., Кадулин С.Г. Генная инженерия в животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубца // Биотехнология — 1993. №.5. - С.2-14.

34. Эрнст Л.К., Зиновьева H.A., Волкова H.A., Титова В.А. «Некоторые аспекты использования ретровирусных векторов для переноса чужеродной ДНК in vivo и in vitro», Москва, РАСХН, 2003, 84 с.

35. Эрнст Л.К., Прокофьев М.И. Биотехнология сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1995. - 192 с.

36. Эрнст Л.К., Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных. М.: Агропромиздат, 1989. - 302 с.

37. Accardo Р., Sánchez-Corral Р., Criado О., García Е., Rodríguez de Córdoba S. Binding of human complement component C4b-binding protein (C4BP) to Streptococcus pyogenes involves the C4b-binding site // J. Immunol. -1996. V.157. - P.4935-4939.

38. Adams D.H., Chen R.N., Kadner A. Cardiac xenotransplantation: clinical experience and future direction // Ann. Thorac. Surg. 2000. - V.70. -P.320.

39. Adams D.H., Kadner A., Chen R.H., Farivar R.S. Human membrane cofactor protein (MCP, CD46) protects transgenic pig hearts from hyperactive rejection in primates // Xenotransplantation — 2001. — V.8. — P.36-40.

40. Ahearn J.M., Rosengard A.M. Complement receptors // In: The Human Complement System In Health And Disease. Eds: Volanakis J.E., Frank M.M. New York: Marcel Dekker- 1998. P. 167-202.

41. Akiyoshi D.E., Denaro M., Zhu H., Greenstein J.L., Banerjee P., Fishman J.A. Identification of a full-length cDNA for an endogenous retrovirus of miniature swine // J. Virol. 1998. - V.72. - P.4503-4507.

42. Anderson D.J., Abbott A.F., Jack R.M. The role of complement component C3b and its receptors in sperm-oocyte interaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993. - V.90. - P. 10051-10055.

43. Asghar S.S. Pharmacological Manipulation Of The Complement System In Human Diseases // Frontiers in Bioscience 1996. - V. 1. - P. 15-25.

44. Auchincloss H.J., Sachs D.H. Xenogeneic transplantation // Annu. Rev. Immunol. 1998. - V. 16. - P.433-470.

45. Bach F.H. Xenotransplantation: problems and prospects // Ann. Rev. Med. 1998. - V.49. - P.301-310.

46. Bach F.H. et al. Barriers to xenotransplantation // Nature Medicine -1995.- V.l. -P.869-873.

47. Bailey L., Nehlsen-Canarella S., Concepción W., et al. Baboon-to-human cardiac xenotransplantation in a neonate // Journal of the American Medical Association (JAMA) 1985. - V.254. - P.3321-3329.

48. Ballard L., Seya T., Teckman J., et al. A polymorphism of the complement regulatory protein MCP (membrane cofactor protein or gp45-70) // J. Immunol. 1987. - V.138. - P.3850-3855.

49. Barilla-LaBarca M., Liszewski M., Lambris J., Hourcade D., Atkinson J. Role of Membrane Cofactor Protein (CD46) in Regulation of C4b and C3b Deposited on Cells // The Journal of Immunology 2002. - V.168. - P.6298-6304.

50. Basrur P.K., Piheiro L.E., Berepubo N.A. et al. X-chromosome inactivation in X autosome translocation carries cows // Genome 1992. — V.35. -P.617-625.

51. Bergelson J.M., Mohanty J.G., Crowell R.L., St John N.F., Lublin D.M., Finberg R.W. Coxsackievirus B3 adapted to growth in RD cells binds to decay-accelerating factor (CD55) // Journal of Virology 1993. - V.69(3). - P. 1903.

52. Berggard K., Johnsson E., Mooi F.R., Lindahl G. Bordetella pertussis binds the human complement regulator C4BP: role of filamentous hemagglutinin. Infect. Immun. 1997. - V.65. - P.3638-3643.

53. Berkower C., Ravins M., Moses A.E., Hanski E. Expression of different group A streptococcal M proteins in an isogenic background demonstrates diversity in adherence to and invasion of eukaryotic cells // Mol. Microbiol. -1999.-V.31 — P.1463-1475.

54. Bhatti F., Zaidi A., Schmoeckel M., Cozzi E., Chavez G., Wallwork J., White D., Friend P.J. Survival of life-supporting HDAF transgenic kidneys in primates is enhanced by splenectomy // Transplant. Proc. 1998. - V.30. -P.2467.

55. Bickmore W.A., Longbottom D., Oghene K., Fletcher J.M., van Heyningen V. Colocalization of the human CD59 gene to 1 lpl3 with the MIC11 cell surface antigen//Genomics 1993.-V. 17(1).-P. 129.

56. Bigam D., Zhong R., Levy G., Grant D. Xenotransplantation // Can. J. Surg. 1999. - V.42. - P. 12-16.

57. Bora N.S., Post T.W., Atkinson J.P. Membrane cofactor protein (MCP) of the complement system: a Hind III RFLP that correlates with expression polymorphism // J. Immunol. 1991. - V. 146. - P.2821-2825.

58. Brem G. Transgenic animals // Byotecnology 1993. - V.2. - P.745

59. Brem G., Besenfelder U., Aigner B., Muller M., Liebl I., Schutz G., Montoliu L. YAC transgenesis in farm animals: rescue of albinism in rabbits // Mol. Reprod. Dev. 1996. - V.44. - P.56-62.

60. Brinster R., Avarbock M. Germline transmission of donor haplotype following spermatagonial transplantation // PNAS USA 1994. - V.91. -P.l 1303-11307.

61. Burke D.T., Carle G.F., Olson M.V. Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast by means of artificial chromosome vectors // Science -1987.-V.236.-806-812.

62. Byrne G.W., McCurry K.R., Kagan D., Quinn C., Martin M.J., Platt J.L., Logan J.S. Protection of xeno-geneic cardiac endothelium from human complement by ex-pression of CD59 or DAF in transgenic mice // Transplantation 1995.-V.60.-P.l 149-1156.

63. Byrne G.W., McCurry K.R., Martin M.J., McClellan S.M., Platt J.L., Logan J.S. Transgenic pigs expressing human CD59 and decay-accelerating factor produce an intrinsic barrier to complement-mediated damage // Transplantation -1997. V.63(l).-P.149.

64. Campbell K.H.S., McWhir J., Ritchie W.A., Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line // Nature 1996. - V.380 - P.64-66.

65. Camper S.A., Saunders T.L. Transgenic rescue of mutant phenotypes using large DNA fragments // In: Accili D. (ed.) Genetic manipulation of receptor expression and function. Wiley, NY. 2000. - P. 1-22.

66. Carrington C.A., Richards A.C., Cozzi E., Langford G., Yannoutsos N., White D.J. Expression of human DAF and MCP on pig endothelial cells protectsfrom human complement // Transplantation Proceedings 1995. - V.27(l). -P.321.

67. Carroll M.C. The role of complement and complement receptors in induction and regulation of immunity // Annu. Rev. Immunol. 1998. — V.16. -P.545-568.

68. Casasnovas J.M., Larvie M., Stehle T. Crystal structure of two CD46 domains reveals an extended measles virus-binding surface // EMBO J. — 1999. -V.18.-P.2911-2922.

69. Chapman L.E. Xenogenic infections and public health // Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 1999. - V.26. - P.l005-1008.

70. Chapman L.E., Folks T.M., Salomon D.R., Patterson A.P., Eggerman T.E., Noguchi P.D. Xenotransplantation and xenogeneic infections //New England Journal of Medicine 1995. - V.333 - P. 1498-1501.

71. Cole J., Housley G.A., Dykman T.R., MacDermott R.P., Atkinson J.P. Identification of an additional class of C3-binding membrane proteins of human peripheral blood leukocytes and cell lines // Proc. Natl. Acad. Sci. USA — 1985. — V.82. -P.859-863.

72. Constantini F., Radoce G., Lee G. Insertional mutations in transgenic mice // Progr. Nucl. Acid Res. And Mol. Biol. San Diego. 1989. - V.36. - P. 159169.

73. Cooper D. Xenografting: how great is the clinical need? // Xenotranspl. 1993. - V. 1. — P.25-26.

74. Cooper D. Xenotransplantation state of the art // Frontiers in Bioscience - 1996. - V. 1. - P.248-265.

75. Cooper D., Lanza R. // In: Xeno: the promise of transplanting animal organs into humans // Oxford Univ. Press 2000. - P. 180-184.

76. Cooper D.K., Koren E., Oriol R. Oligosaccharides and discordant xenotransplantation // Immunol. Rev. 1994. - V.141. - P.31-58.

77. Cooper N.R. Evasion of complement-mediated damage by microorganisms // In The Complement System. Edited by Rother K., Till G.O., Hânsch G.M. Berlin: Springer 1998. - P.309-322.

78. Copeland N.G., Jenkins N.A., Lee B.K. Association of the lethal yellow coat color mutation with ecotropic murine leukemia virus // Proc. Nat. Aad. Sci. USA. 1983. - V.80. - P.247-249.

79. Cozzi E., White D. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans // Nature Medicine 1995. - V.l. - P.964-966.

80. Dahlbâck B. Protein S and C4b-binding protein: components involved in the regulation of the protein C anticoagulant system // Thromb Haemost 1991. — V.66. -P.49-61.

81. Davies A. Policing the membrane: cell surface proteins which regulate complement // Res. Immunol. 1996. - V.147. - P.82-87.

82. Davies A., Lachmann P.J. Membrane defense against complement lysis: the structure and biological proper-ties of CD59 // Immunol. Res. 1993. - V.12. - P.258-275.

83. Diamond L., McCurry K., Martin M.J., McLennan S., Oldham E., Piatt J., Logan S. Characterization of transgenic pigs expressing functionally active human CD59 on cardiac endothelium. // Transplantation 1996. - V.61. — P. 1241.

84. Diamond L.E., McCurry K.R., Oldham E.R., Tone M., Waldmann H., Piatt J.L., Logan J.S. Human CD59 expressed in transgenic mouse hearts inhibits the activation of complement // Transpl. Immunol. 1995. - V.3. - P.305-312.

85. Diamond L.E., Oldham E.R., Piatt J.L., Waldmann H., Tone M., Walsh L.A., Logan J.S. Cell- and tissue-specific expression of a human CD59 minigene in transgenic mice // Transpl. Proc. 1994. - V.26. - P. 1239.

86. Dorig R.E., Marcil A., Chopra A., Richardson C.D. The human CD46 molecule is a receptor for measles virus (Edmonston strain) // Cell 1993. - V.75. -P.295-305.

87. Dorig R.E., Marcil A., Richardson C.D. CD46, a primate-specific receptor for measles virus // Trends Microbiol. 1994. - V.2. - P.312-318.

88. Ernst L.K., Zakcharchenko V.I., Suraeva N.M., Ponomareva T.I., Miroshnichenko O.I., Prokofev M.I., Tikchonenko T.I. Transgenic rabbits with antisense RNA gene targeted at adenovirus H5. // Theriogenology 1991. - V.35. - P.1257-1271.

89. Evans D.J., Almond J.W. Cell receptors for picornaviruses as determinants of cell tropism and pathogenesis // Trends Microbiol. 1998. - V.6. -P. 198-202.

90. Evans R.W., Orians C.E., Ascher N.L. The potential supply of organ donors. An assessment of the efficacy of organ procurement efforts in the United States // JAMA 1992. - V.267. - P.239-246.

91. Fabre J.W. Nudging xenotransplantation towards humans // Nature Medicine- 1995.-V.1.-P.403-404.

92. Fearon D.T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte and monocyte // J. Exp. Med. 1989. - V. 152. - P.20.

93. Fearon D.T., Carter R.H. The CD 19/CR2/TAPA-1 complex of B lymphocytes: linking natural to acquired immunity // Annu. Rev. Immunol. -1995. V.13. -P.127-149.

94. Fischer E., Appay M. D., Cook J., Kazatchkine M.D. Characterization of the human glomerular C3 receptor as the C3b/C4b complement type one (CR1) receptor//J. Immunol. 1986.-V.13 6. - P. 1373.

95. Fishelson Z. Complement-related proteins in pathogenic organisms // Springer Semin Immunopathol 1994. - V.15. - P.345-368.

96. Fletcher C.M., Harrison R.A., Lachmann P.J., Neu-haus D. Structure of a soluble, glycosylated form of the human complement regulatory protein CD59 // Structure 1994.-V.2.-P. 185-199.

97. Fodor W., Squinto S. // Xeno 1995. - V.3. - P.23-29.

98. Fodor W.L., Rollins S.A., Guilmette E.R., Setter E., Squinto S.P. A novel bifimctional chimeric complement in-hibitor that regulates C3 convertase and formation of the membrane attack complex // J. Immunol. 1995. - V.155. -P.4135-4138.

99. Forget B.G. YAC transgenes: bigger is probably better// PNAS USA -1993. V.90. - 7909-7911.

100. Fujiwara Y., Miwa M., Takahashi R., Hirabayashi M., Suzuki T., Ueda M. Position-independent and high-level expression of human alpha- lactalbumin in the milk of transgenic rats carrying a 210-kb YAC DNA // Mol. Reprod. Dev. -1997. V.47. - P.157-163.

101. Fujiwara Y., Takahashi R., Miwa M., Kameda M., Kodaira K., Hirabayashi M., Suzuki T., Ueda M. Analysis of control elements for positionindependent expression of human alpha-lactalbumin YAC // Mol. Reprod. Dev. -1999. -V.54. — P. 17-23.

102. Galili U., Rachmilewitz E.A., Peleg A., Flechner I. A unique natural human IgG antibody with anti-alphagalactosyl specificity // J. Exp. Med. 1984. -V.164. -P.1519.

103. Gandolfi F. Spermatozoa, DNA binding and transgenic animals // Transgenic Research 1998. - V.7(3). - P.147-155.

104. Gasaryan K.G., Nabirochkin S.D., Shibanova E.N. et al. Unstable visible mutations indused Drosophile melanogaster by injections of oncogenic virus DNA into the polar plasm of early embryos // Mol. Gen. Genet. 1987. -V.207. - P.130-141

105. Gordon J.W., Scangos G.A., Plotkin D.J., Barbosa J.A., Ruddle F.H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA //

106. Proc. Natl. Acd. Sci. USA 1980. - V.77. - P.7380-7384.

107. Groth C.G., Korsgren O., Tibell A., et al. Transplantation of porcine fetal pancreas to diabetic patients: histological and biochemical evidence of xenograft survival // Lancet 1994. - V.34. - P. 1402-1404.

108. Hammer R.E., Pursel V.G., Rexroad Jr. C.E., Wall R.J., Palmiter R.D., Brinster R.L. Production of transgenic rabbit, sheep and pigs by microinjection // Nature 1985. - V.315 - P.680-683.

109. Hancock W.W. Beyond hyperacute rejection: strategies for development of pig-to-primate xenotransplantation // Kidney Int. 1997. - V.58. -P.36-40.

110. Harber K., Kuehn M., Delius H., et al. Insertion of retrovirus into the first intron an a. collagen gene leads to embryo lethal mutation in mice // Proc. Nat. Aad. Sci. USA. 1984. - V.81. - P. 1504-11506.

111. Henricson B., Backstrom L. Translocation heterozygosity in a boar // Herditas- 1964. V.52. - P.166-170.

112. Hiroki 0., Osamu T., Hirayuki N. Microtia as an autosomal dominant mutation in a transgenic mouse line: a possible animal model of branchial arch anomalies // Anat. Anz. 1991. - V. 172. - P. 1 -9.

113. Howard J., Justus D.E., Totmenin A.V., Shchelkunov S., Kotwal G.J. // J. Leukocyte Biol. 1998. - V.64. - P.68-71.

114. Jakobovits A. YAC vectors. Humanizing the mouse genome // Curr. Biol. 1994. - V.4. - 761-763.

115. Jaenisch R., Haeber K., Schnicke A. et al. Leukemia virus of Mov 13 locus leads to recessive letale mutation and early embryonic death // Cell — 1983. -V.32. -P.209-216.

116. Jin H., Inoshima Y., Wu D., Morooka A., Sentsui H. Expression of porcine endogenous retrovirus in peripheral blood leukocytes from ten different breeds // Transplant Infectious Disease 2000. - V.2. - P. 11-14.

117. Jonak J., Habrova V., Takac M., Macha J., Reinis M., Pokorna H. Transfer of Rouse sarcoma virus DNA to ova by Xenopus laevis spermatozoa. Biology International 1994; 18(5): 465.

118. Kagan D., Piatt L., Logan J., Byrne G. Expression of complement regulatory factors using heterologous promoters in transgenic mice // Transpl. Proc. 1994. - V.26. - P. 1242.

119. Kallstrom H., Liszewski M.K., Atkinson J.P., Jonsson A-B. Membrane cofactor protein (MCP or CD46) is a cellular pilus receptor for pathogenic Neisseria // Mol. Microbiol. 1997. - V.25. - P.639-647.

120. Keller S.A., Lyptay S., Hajra A., et al. Transgene-induced mutation of murine steel locus // Proc. Nat. Aad. Sci. USA. 1990. - V.87. - P. 10019-10022.

121. Kemper C., Leung M., Stephensen B., Pinkert C.A., Liszewski M.K., Cattaneo R., Atkinson J.P. Membrane cofactor protein (MCP; CD46) expression in transgenic mice // Clinical and Experimental Immunology 2001. - V.124. -P. 180-189.

122. Kinoshita T., Medof M.E., Silber R., Nussenzweig V. Distribution of decay-accelerating factor in the peripheral blood of normal individuals and patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria // J. Exp. Med. 1985. - V.162. — P.75-92.

123. Kitamura M., Matsumiya M., Yamanaka M., Takahara S., Hara T., Matsumoto M., Namiki M., Okuyama A., Seya T. Possible association of infertility with sperm-specific abnormality of CD46 // J. Reprod. Immunol. 1997. — V.33. — P.83-88.

124. Kooyman D, Byrne G, McClellan S, Nielsen D, Kagan D, Coffman T, Masahide T, Waldmann H, Piatt J, Logan J. Erythroid-specific expression of human CD59 and transfer to vascular endothelial cells // Transpl. Proc. 1994. -V.26.-P.1241.

125. Lambris J.D., Sahu A., Wetsel R. The chemistry and biology of C3, C4, and C5. // In: Volanakis J.E., Frank M. Eds. The Human Complement System in Health and Disease. Marcel Dekker, New York 1998. - P.83-118.

126. Le Tissier P., Stoye J.P., Takeuchi Y., Patience C., Weiss R.A. Two sets of human-tropic pig retrovirus // Nature 1997. - V.389. - P.681-682.

127. Lin T.P. Microinjection of mouse eggs // Science 1966. - V.l51. — P.333-337.

128. Lindahl G., Sjobring U., Johnsson E. Human complement regulators: a major target for pathogenic microorganisms // Current Opinion in Immunology — 2000. V.12. — P.44-51.

129. Liszewski M.K., Atkinson J.P. Membrane cofactor protein // Curr Top Microbiol Immunol. 1992. - V.l78. - P.45.

130. Liszewski M.K., Farries T.C., Lublin D.M., Rooney I.A., Atkinson J.P. Control of the complement system // Adv. Immunol. 1996. - V.61. - P.201-283.

131. Liszewski M.K., Post T.W., Atkinson J.P. Membrane cofactor protein (MCP or CD46): newest member of the regulators of complement activation gene cluster//Ann. Rev. Immunol. 1991.-V.9.-P.431-455.

132. Logan J.S., Sharma A. Potential use of genetically modified pigs as organ donors for transplantation into humans // Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 1999. - V.26. - P. 1020-1025.

133. Lublin D.M., Liszewski M.K., Post T.W., Arce M.A., Le Beau M.M.,

134. Maiore B., Lavitrano M., Spadatora C., e.a. // Mol. Reprod. Dev. -1998. V.50. — P.406-409.

135. Makowka L., Cramer D.V., Hoffman A. The use of a pig liver xenograft for temporary support of a patient with fulminant hepatic failure. // Transplantation 1995. - V.59. - P.1654-1659.

136. Malhotra R., Ward M., Sim R.B., Bird M.I. Identification of human complement factor H as a ligand for L-selectin // Biochem. J. 1999. - V.341. — P.61-69.

137. Manchester M., Liszewski M.K., Atkinson J.P., Oldstone M. Multiple isoforms of CD46 (membrane cofactor protein) serve as receptors for measles virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994. - V.91. - P.2161-5.

138. Manon K., Overbeek P.,Westphal H. Prenatal letality in a transgenic mouse line is the result of a chromosomal translokation // Proc.Nat.Acad.Sci.USA 1988. — V.85. — P.l 165-1168.

139. Mark W., Signorelli E., Lacy E. An insertional mutation in a transgenic mouse line results in developmental arrest at day 5 of gestation // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1985. - P.453-460.

140. Martin U., Kiessig V., Blusch J.H., Haverich A., von der Helm K., Herden T., Steinhoff G. Expression of pig endogenous retrovirus by primary porcine endothelial cells and infection of human cells // Lancet. 1998. - V.352. — P.692-694.

141. Marx J. Making mutant mice by gene transfer // Science 1985. -V.228. -P.1516-1517.

142. McCurry K.R., Kooyman D.L., Alvarado C.G., Cotterell A.H., Martin M.J., Logan J.S., Piatt J.L. Human complement regulatory proteins protect swine-to-primate cardiac xenografts from humoral injuiy // Nat. Med. 1995. — V.l. — P.423-427.

143. Medof M.E., Kinoshita T., Nussenzweig V. Inhibition of complement activation on the surface of cells after incorporation of decay-accelerating factor (DAF) into their membranes // Journal of Experimental Medicine 1984. — V.l 60(5). - P. 1558.

144. Meri S., Jarva H. Complement Regulatory Proteins I I Encyclopedia of life sciences/Nature Publishing Group 2001. - P. 1-7.

145. Meri S., Waldmann H., Lachmann P.J. Distribution of protectin (CD59), a complement membrane attack inhibitor, in normal human tissues // Laboratory Investigation 1991. - V.65(5). - P.532.

146. Michaels M.G., Simmons R.L. Xenotransplant-associated zoonoses. Strategies for prevention // Transplantation 1994. - V.57. - P. 1-7.

147. Miyagawa S., Hirose H., Shirakura R., Naka Y., Nakata S., Kawashima Y., Seya T., Matsumoto M., Uenaka A., and Kitamura H. The mechanism of discordant xenograft rejection // Transplantation 1988. - V.46. - P.825-830.

148. Miyagawa S., Mikata M., Matsuda H., Ikawa M., Okabe M., Nagasawa S., Matsumoto M., Seya T., Shirakura R. In vitro and in vivo studies to prevent hyperacute rejection // Transplantation Proceedings 1996. - V.28(2). - P. 1031.

149. Miyagawa S., Shirakura R., Iwata K., et al. Effects of transfected complement regulatory proteins, MCP, DAF, and MCP/DAE hybrid, on complement-mediated swine endothelial cell lysis // Transplantation 1994. -V.58. -P.834.

150. Molines T.E., Fiane A.E. Xentransplantation: how to overcome the complement obstacle? // Molecular Immunology 1999. - V.36. - P.269-276.

151. Montoliu L., Schedl A., Kelsey G., Lichter P., Larin Z., Lehrach H., Schutz G. Generation of transgenic mice with yeast artificial chromosomes // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1993. - V.58. - 55-62.

152. Morgan B.P. Regulation of the complement membrane attack pathway // Crit. Rev. Immunol. 1999. - V.19. - P. 173-198.

153. Morgan B.P., Harria C.L. Complement Regulatory Proteins // San Diego: Academic Press, 1999.

154. Murray J.D., Nancarrow C.D., Marshall J.T. et al. Production of transgenic merino sheep by microinjection ofmetallotionein bovine growing hormone fusion genes // J. Reprod. Fertil. Dev. 1989. - V.l. - P. 147-155.

155. Nancarrow C.D., Marshall T.A., Clarkson J.L., Murray J.D., Millard R.M., Shanahan C.M., Wynn P.C., Ward K.A. Expression and physiology of performance regulating genes in transgenic sheep// J. Reprod. Fert. Suppl. 1991. - V.43. - P.277-291.

156. Naniche D., Varior-Krishnan G., Cervoni F., Wild T.F., Rossi B., Rabourdin-Combe C., Gerlier D. Human membrane cofactor protein (CD46) acts as a cellular receptor for measles virus // J. Virol. 1993. - V.67. - P.6025-6032.

157. Nicholson-Weller A., Wang C.E. Structure and function of decay accelerating factor CD55 // J. Lab. Clin. Med. 1994. - V.123. - P.485-491.

158. Niekrasz M., Ye Y., Rolf L.L. The pig as organ donor for man // Transplant. Proc. 1992. - V.24. - P.625.

159. Ninomiya H., Sims P.J. The human complement regulatory protein CD59 binds to the alpha-chain of C8 and to the "b"domain of C9 // Journal of Biological Chemistry 1992. - V.267(19).-P.13675.

160. Norin A.J., Brewer R.J., Lawson N., Grijalva G.A., Vaynblatt M., Burton W., Squinto S.P., Kamholz S.L., Fodor W.L. Enhanced survival of porcineendothelial cells and lung xenografts expressing human CD59 // Transplant. Proc. 1996. - V.28. - P.797-798.

161. Norman D.G., Barlow P.N., Baron M., Day A.J., Sim R.B., Campbell I.D. Three-dimensional structure of a complement control protein module in solution //J. Mol. Biol. 1991. -V.219. -P.717-725.

162. Oglesby T.J., Allen C.J., Liszewski M.K., White D.J., Atkinson J.P. Membrane cofactor protein (CD46) protects cells from complement-mediated attack by an intrinsic mechanism // J. Exp. Med. 1992. - V. 175. - P. 1547-1551.

163. Okada N., Liszewski M.K., Atkinson J.P., Caparon M. Membrane cofactor protein (CD46) is a keratinocyte receptor for the M protein of the group A streptococcus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995. - V.92. - P.2489-2493.

164. Palmiter R.D., Brinster R.L. Germ-line transformation of mice// Annu. Rev. Genet. 1986. - V.20. - P.465-499.

165. Palmiter R., Brinster R., Hammer R., Trumbauer M., Rosenfeld M., Birhberg N., Evans R. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothioneingrowth hormone fusion genes // Nature 1982. -V.300.-P.611-615.

166. Palmiter R.D., Wilkie T.M., Chen H.G. et al. Transmission distortion and mosaicism in unusial transgenic mouse pedigree // Cell -1984. V.36. -P.869-877.

167. Patience C., Patton G.S., Takeuchi Y., Weiss R.A., McClure M.O., Rydberg L., Breimer M.E. No evidence of pig DNA or retroviral infection in patients with short-term extracorporeal connection to pig kidneys. Lancet. 1998. - V.352. - P.699-701.

168. Patience C., Takeuchi Y., Weiss R.A. Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs. Nat. Med. 1997. - V.3. - P.282-286.

169. Peterson K.R. Production and analysis of transgenic mice containing yeast artificial chromosomes// Genet. Eng. 1997. - V.19. - P.235-255.

170. Peterson K.R., Clegg C.H., Li Q., Stamatoyannopoulos G. Production of transgenic mice with yeast artificial chromosomes // Trends Genet. 1997. -V.13.-P.61-66.

171. Petranka J., Zhao J., Norris J., Tweedy N., Ware R., Sims P., Rosse W. Structure-Function Relationships of the Complement Regulatory Protein, CD59 // Blood Cells, Molecules, and Diseases 1996. - V.22. - P.281-296.

172. Piatt J., Logan J. The transplantation of organs and tissues between species // In: Xenotransplantation, Eds: Cooper D., et al Springer - 1997. -P.650-658.

173. Piatt J.L, Parker W. Another step towards xenotransplantation // Nature Medicine 1995. - V. 1. - P. 1248-1250.

174. Piatt J.L. Approaching the clinical application of xenotransplantation. Am. J. Med. Sci. 1997. - V.313. - P.315.

175. Piatt J.L. New directions for organ transplantation // Nature 1998. -V.392. -P.l 1-17.

176. Piatt J.L. Xenotransplantation: recent progress and current perspectives. // Current Opinion In Immunology 1996. - V.8(5). - P.721.

177. Piatt J.L., Fischel R.J., Matas A.J., Reif S.A., Bolman R.M., Bach F.H. Immunopathology of hyperacute xenograft rejection in a swine-to-primate model // Transplantation 1991. - V.52. - P.214.

178. Piatt J.L., Nagayasu T. Current status of xenotransplantation // Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 1999. - V.26. - P. 1026-3102.

179. Pursel V., Cambell R., Miller K., Behringer R., Palmiter R., Brinster R. Growth potential of transgenic pigs expressing a bovine growth hormone gene // J. Anim. Sci. 1988. - V.66. - P.267.

180. Pursel V.G., Pinkret C.A., Muller K.F., Bolt D.J., Campbell R.G., Palmiter R.D., Brinster R.L., Hammer R.E. Genetic engineering of livestock // Science 1989. - V.244. - P.1281-1288.

181. Pursel V.G., Rexroad C.E. Jr., Bolt D.J., Miller K.F., Wall R.J., Hammer R.E., Pinkret C.A., Palmiter R.D., Brinster R.L. Progress in gene transfer in farm animals // Vet. Immunol. Histopath. 1987. - V.17. - P.303-312.

182. Ram S., Gulati S., McQuillen D.P., Boden R., Elkins C., Pangburn M.K., Rice P.A. Interactions between Neisseria gonorrhoeae and C4b-binding protein: a molecular basis for gonococcal serum resistance // Mol. Immunol. Abstr. 1999.-V.36.-P.297.

183. Reemtsma K., McCracken B., Schlegel J. Renal heterotransplantation in man // Annals of Surgery 1964. - V.160. - P.3 84-408.

184. Rexroad C.E., Hammer R.E., Behringer R.R., Palmiter R.D., Brinster R.L. Insertion, expression and phisiology of growth-regulating genes // J. Reprod. Fert. Suppl. 1990. - V.41. - P. 119-124.

185. Rollins S.A., Sims P.J. The complement-inhibi-tory activity of CD59 resides in its capacity to block incorpo-ration of C9 into membrane C5b-9 // J. Immunol. 1990. -V. 144. - P.3478-3483.

186. Rollins S.A., Zhao J., Ninomiya H., Sims P.J. Inhibition of homologous complement by CD59 is mediated by a species-selective recognition conferredthrough bind-ing to C8 within C5b-8 or C9 within C5b-9 // J. Immunol. 1991. -V. 146. - P.2345-2351.

187. Rooney I.A., Oglesby T.J., Atkinson J.P. Complement in human reproduction: activation and control // Immunol. Res. 1993. - V.l2. - P.276-294.

188. Rose E.A., Pepino P., Fuzesi L., Sanchez J. A. Cardiac xenotransplantation // Prog. Cardiovasc. Dis. 1990. - V.33. - P. 105.

189. Rottmann O.J., Stratowa Ch., Hornstein M., Hughes J. Tissue specific expression of hepatitis B surface antigen in mice following liposome-mediated gene transfer into blastocytes // Zbl. Vet. Med. A. 1985. - V.32. - P.676-682.

190. Rowe J.A., Moulds J.M., Newbold C.I., Miller L.H. Plasmodium falciparum rosetting mediated by a parasite-variant erythrocyte membrane protein and complement-receptor 1 // Nature 1997. - V.388. - P.292-295.

191. Rowe P.M. Xenotransplantation: from animal facility to the clinic? // Molecular Medicine Today 1996.-V.2(l).-P.10-15.

192. Saadi S., Piatt J.L. Role of compliment in xenotransplantation // Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 1999. - V.26. -P.1016-19.

193. Saadi S., Takahashi T., Nagayasu T., Holzknecht R.A., Piatt J.L. The role of cytokines in rejection of discordant xenotransplantants // Transplantation Proceedings 1999. - V.31. - P. 911 -912.

194. Sachs D.H. The pig as a potential xenograft donor // Vet Immunol Immunopathol 1994. - V.43. - P. 185.

195. Sahu A., Lambris J.D. Complement inhibitors: a resurgent concept in anti-inflammatory therapeutics // Immunopharmacology 2000. - V.49. — P. OS-MS.

196. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA-polymerase // Science 1988. - V.239. - P. 487-491.

197. Sandrin M., Osman N., McKenzie I. Transgenic approaches for the reduction in expression of GalD(l,3)gal for xenotransplantation // Frontiers in Bioscience 1997.-V.2.-P. 1-11.

198. Sandrin M.S., McKenzie I.F. Gal alpha (l,3)Gal, the major xenoantigen(s) recognised in pigs by human natural antibodies // Immunological Reviews- 1994. V.141.-P.169-190.

199. Sandrin M.S., Vaughan H.A., McKenzie I. Identification of Gala(l,3)Gal as the major epitope for pig-to-human vascularized xenografts // Transplant. Rev. 1994. - V.8. - P. 134-149.

200. Santoro F., Kennedy P.E., Locatelli G., et al. CD46 is a cellular receptor for human Herpesvirus 6 // Cell 1999. - V.99. - P.817-27.

201. Sawada R., Ohashi K., Anaguchi H., et al. Isolation and expression of the full-length cDNA encoding CD59 antigen of human lymphocytes // DNA Cell Biol. 1990. - V.9. - P.213-220.

202. Schieke A., Habers K., Jaenisch R. Embrionic letal mutation in mice induced by retrovirus insertion into the alpha-1 (I) collagen gene // Nature. — 1982. -V.302.-P.315-320.

203. Schilling A, Land W, Pratschke E, Pielsticker K, Brendel W. Dominant role of complement in the hyperacute xenograft rejection reaction // Surgery, Gynecology & Obstetrics 1976. - V.142. - P.29.

204. Schnieke A.E., Kind A.J., Ritchie W.A., Mycock K., Scott A.R., Ritchie M., Wilmut I., Colman A., Campbell K.H. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts // Science -1997. V.278 -P.2130-2133.

205. Seya T., Atkinson J.P. Functional properties of membrane cofactor protein of complement // Biochem. J. 1989. - V.264. - P.581-588.

206. Seya T., Hirano A., Matsumoto M., et al. Human membrane cofactor protein (MCP, CD46): multiple isoforms and functions // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999. - V.31. - P.1255-1260.

207. Seya T., Turner J.R., Atkinson J.P. Purification and characterization of a membrane protein (gp45-70) that is a cofactor for cleavage of C3b and C4b // Journal of Experimental Medicine 1986. - V.163(4). - P.837.

208. Shafren D.R., Dorahy D.J., Ingham R.A., Burns G.F., Barry R.D. Coxsackievirus A21 binds to decay-accelerating factor but requires intercellular adhesion molecule 1 for cell entry // Journal of Virology 1997. - V.71(6). -P.4736.

209. Sippel A.E., Saueressig H., Hubler M.C., Faust N., Bonifer C. Insulation of transgenes from chromosomal position effects //In: Houdebine L.M. (ed.) Transgenic Animals, Generation and use. Harwood Academic Publishers, NL 1997. -P.267-272.

210. Song W-C., Sarrias M.R., Lambris J.D. Complement and innate immunity I I Immunopharmacology 2000. - V.49. - P. 187-198.

211. Stanimirovic Z., Soldatovich B., Vucinic M. et al. Abberant karyotype on a experimental rabbit (Orictolagus cuniculus L.) with heterozygous first autosomal pair//Acta vet. Scand.- 1972.- V. 13.-P. 151-160.

212. Starzl T., Fung J., Tzakis A., Todo, A., Demetris, A. J., Marino, I. R., Doyle, H., Zeevi, A., Warty, V., Michaels, A., Kusne, S., Rudert, W. A., Trucco, M // Baboon-to-human liver transplantation // Lancet. 1993. - V.341. - P.65-71.

213. Starzl T.E. et al. Clinical xenotransplantation // Xenotransplantation1994. V.l. — P.3-7.

214. Steele D.J., Auchincloss H.J. Xenotransplantation// Annu. Rev. Med.1995. V.46. — P.345-360.

215. Stevens R.B., Piatt J.L. The pathogenesis of hyperacute xenograft rejection // American Journal of Kidney Diseases 1992. - V.20(4). - P.414.

216. Stoye J.P., Coffin J.M. The dangers of xenotransplantation // Nature Medicine 1995. - V.l. - P.l 100.

217. Sugita Y., Nakano Y., Oda E., et al. Determination of carboxyl-terminal residue and disulfide bonds of MACIF (CD59), a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored membrane protein // J. Biochem. (Tokyo) 1993. -V.14. -P.473-477.

218. Takeuchi Y., Patience C., Magre S., Weiss R.A., Banerjee P.T., Le Tissier P., Stoye J.P. Host range and interference studies of three classes of pig endogenous retrovirus // J. Virol. 1998. - V.72. - P.9986-9991.

219. Thern A., Stenberg L., Dahlback B., Lindahl G. Ig-binding surface proteins of Streptococcus pyogenes also bind human C4b-binding protein (C4BP), a regulatory component of the complement system // J. Immunol. 1995. — V.l 54. -P.375-386.

220. Thern A., Wastfelt M., Lindahl G. Expression of two different antiphagocytic M proteins by Streptococcus pyogenes of the OF + lineage // J. Immunol. 1998. - V.60. - P.860-869.

221. Todaro G.J., Benveniste R.E., Lieber M.M., Sherr C.J. Characterization of a type C virus released from the porcine cell line PK(15) // Virology 1974. - V.58. - P.65-74.

222. Wagner E.F., Covasrubias L., Stewert R., et al. Prenatal lethalitis in mice homozygous for human growth hormone gene sequences integrated in germ line // Cell 1983. - V.35. - P.647-655.

223. Wall K., Kerr D., Bondioli K. Transgenic engineering on a large scale // J. Dairy Sci. 1997. - V.80. - P.2213-2224.

224. Walsh L. A., Tone M., Waldmann H. Transfection of human CD59 complementary DNA into rat cells confers resistance to human complement // Eur. J. Immunol. 1991. - V.21. -P.847-850.

225. Ward K.A., Nancarrow C.D., Murray J.D. et al. // J. Cell Biochem. -1989.-V.13.-P.164.

226. Weiss R.A. Transgenic pigs and virus adaptation // Nature 1998. -V.391. -P.327-328.

227. Weiss R.A. Xenografts and retroviruses // Science 1999. - V.285. -P.1221-1222.

228. White D., Braidley R., Dunning J., e.a. Hearts from pigs transgenic for human DAF are not hyperacutely rejected when xenografted to primates // 3rd Int. Congr. Xenotranspl. 1995. - P. 128.

229. White D., Langford G., Cozzi E., V. Young. Production of pigs transgenic for human DAF. A strategy for xenotransplantation // Xenotransplantation 1995. - V.2. - P.213-217.

230. Wilson C., Bellen HJ., Gehring W.J. Position effects on eukaryotic gene expression // Annu. Rev. Cell. Biol. 1990. - V.6. - P.679-714.

231. Wilson J.G., Tedder T.F., Fearon. D.T. Characterization of human T lymphocytes that express the C3b receptor // J. Immunol. 1983. - V.131. -P.684.

232. Wilton A.N., Johnstone R.W., McKenzie I., et al. Strong associations between RFLP and protein polymorphism for CD46 // Immunogenetics — 1992. -V.36. -P.79-85.

233. Wolf E. Expressionbedingte Veränderungen bei Wachstumshormong-transgenen Mausen // München, Diss. med. vet. 1990.

234. Xu C., Mao D., Holers V.M., Palanca B., Cheng A.M., Molina H. A critical role for murine complement regulator crry in fetomaternal tolerance // Science 2000. - V.287. - P.498-501.

235. Yannoutsos N., Langford G.A., Cozzi E., Lancaster R., Elsome K., Chen P., White D.J. Production of pigs transgenic for human regulators of complement activation//Transplant. Proc. 1995. - V.27. - P.324-325.

236. Ye Y., Luo Y., Kobayashi T., Taniguchi S., Li S., Kosanke S., et al. Secondary organ allografting after a primary "bridging" xenotransplant // Transplantation 1995. - V.60(l). - P. 19-22.

237. Yeatman M., Daggett C.W., Parker W., Byrne G.W., Logan J.S., Piatt J.L., Davis R.D. Complement-mediated pulmonary xenograft injury studies in swine-to-primate orthotopic single lung transplant models // Transplantation — 1998. V.65. - P. 1084-1093.

238. Yu J., Dong S., Rushmere N., Morgan B., Abagyan R., Tomlinson S. Mapping the Regions of the Complement Inhibitor CD59 Responsible for Its Species Selective Activity // Biochemistry 1997. - V.36. - P.9423-9428.

239. Zipfel P.F., Jokiranta T.S., Hellwage J., Koistinen V., Meri S. The factor H protein family // Immunopharmacology 1999. - V.42. - P.53-60.