Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение ассоциации генов AGT, AGT1R и MTHFR с сердечно-сосудистыми заболеваниями

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение ассоциации генов AGT, AGT1R и MTHFR с сердечно-сосудистыми заболеваниями"

На правахрукописи

БАБУНОВА НАДЕЖДА БОРИСОВНА

ИЗУЧЕНИЕ АССОЦИАЦИИ ГЕНОВ АОТ,АОТ1ЯиМТИРЯ С СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Валерий Вячеславович Носиков.

Научный консультант.

кандидат биологических наук, Кирилл Викторович Савостьянов.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Алий Юрьевич Асанов.

доктор биологических наук Марина Вячеславовна Немцова.

Ведущая организация:

Институт Молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Защита состоится «_»_2004г. в_часов

на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика». Реферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного сов кандидат биологических наук

И . Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование молекулярно-генетических основ многофакторных заболеваний относится к одной из наиболее серьезных задач современной генетики. Сердечно-сосудистые заболевания, в том числе гипертония и ишемическая болезнь сердца, по-прежнему остаются основной проблемой в медицине развитых стран мира в связи с высокой заболеваемостью, инвалидизацией и смертностью.

Для подобных многофакторных заболеваний характерен сложный механизм формирования фенотипа, являющегося результатом взаимодействия генетических факторов с факторами внешней среды. Однако, для каждого конкретного заболевания можно выделить группу, так называемых, генов-кандидатов, продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие данной патологии.

Одним из наиболее перспективных направлений современной молекулярной генетики заболеваний является поиск полиморфных маркеров в генах-кандидатах и выявление их ассоциации с наследственными заболеваниями.

При исследовании ассоциации сравнивают распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера, расположенного внутри или рядом с геном-кандидатом, в группах больных и здоровых доноров. Наличие достоверных различий в распределении данных частот свидетельствует об ассоциации полиморфного маркера с заболеванием.

Установление ассоциации гена с заболеванием и последующая оценка индивидуального генетического риска имеют важное значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению данной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конфетного пациента.

Цель и задачи работы. Целью данной работы явилось изучение ассоциации полиморфных маркеров нескольких генов-кандидатов: ангиотензиногена (AG7), рецептора ангиотензина II типа 1 (AGT1R) и метилентетрагидрофолат-редуктазы (MTHFR) с развитием ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда и гипертонии при сахарном диабете типа 2 (СД 2).

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.

1. Изучение ассоциации полиморфных маркеров Т174М и М235Т гена ангиотензиногена с ишемической болезнью сердца, инфарктом миокарда и гипертонией при сахарном диабете типа 2.

2. Изучение ассоциации полиморфных маркеров А1166С и Л(-153)С гена рецептора ангиотензина II типа 1 с ишемической болезнью сердца, инфарктом миокарда и гипертонией при сахарном диабете типа 2.

3. Изучение ассоциации полиморфных маркеров С677Т и А1298С гена метилентетрагидрофолат-редуктазы с ишемической болезнью сердца и инфарктом; миокарда.

Научная новизна работы. В данной работе впервые исследована ассоциация полиморфного маркера М235Т гена ангиотензиногена, а также полиморфных маркеров С677Т и А1298С гена метилентетрагидрофолат-редуктазы с ишемической болезнью сердца, инфарктом миокарда и гипертонией при сахарном диабете типа 2 среди русских пациентов г.Москвы. Для полиморфного маркера Т174М гена ангио-тензиногена в данной популяции впервые изучена ассоциация с развитием ишеми-ческой болезни сердца и гипертонии при сахарном диабете типа 2: Для полиморфного маркера А1166С гена рецептора ангиотензина II типа 1 у русских г. Москвы впервые исследована ассоциация с развитием гипертонии при сахарном диабете типа 2. Впервые в мире осуществлен анализ ассоциации полиморфного маркера А(-153)С гена ангиотензина II типа 1 с развитием ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда и гипертонии при сахарном диабете типа 2.

Показана ассоциация полиморфного маркера Л(-153)в гена рецептора ангиотензина II типа 1 и полиморфного маркера А1298С гена метилентетрагидрофолат-редуктазы с развитием ишемической болезни сердца. С развитием инфаркта миокарда ассоциирован только маркер А1298С гена ЛвТ. Установлено, что с гипертонией при сахарном диабете типа 2 ассоциированы оба полиморфных маркера А1166С иЛ(-153)в генаЛвТ1Р.

Все вышеизложенные результаты получены впервые.

Практическая ценность работы. Полученные результаты позволяют оценить вклад генетических факторов риска в развитие сердечно-сосудистых заболеваний и диабетических ангиопатий для русских г. Москвы и могут быть использованы для прогнозирования течения и профилактики осложнений данных заболеваний.

Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секций' молекулярной 'биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 26

марта 2004 г. Результаты настоящей работы докладывались на ежегодных конференциях Государственной подпрограммы «Геном человека» (2000 г.), на IV Всероссийском конгрессе эндокринологов (Россия, Санкт-Петербург, 2001 г.), на конгрессах международной организации по изучению генома человека - HGM (Великобритания, Эдинбург, 2001г.; Шанхай, КНР, 2002 г.), на Втором Российском Диабетологическом Конгрессе (Россия, Москва, 2002 г.), на 38-ом Конгрессе Европейской ассоциации диабетологов (Венгрия, Будапешт, 2002 г.), на ВНПК «Современные возможности эффективной профилактики, диагностики и лечения артериальной гипертонии» (Россия, Москва, 2001 г.), на Российских национальных конгрессах кардиологов (Россия, Москва, 2001 г., 2003 г.), а также на конгрессе кардиологов стран СНГ (Россия, Санкт-Петербург, 2003 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, включая 2 статьи, а также тезисы докладов и сообщений на международных конференциях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 130 страницах машинописного текста и содержат 28 таблиц и 2 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с

ишемической болезнью сердца (ИБС).

Изучение ассоциации полиморфных маркеров нескольких генов-кандидатов с ИБС проводили, используя две группы, общая характеристика которых приведена в таблице 1. В группу пациентов с ИБС вошло 223 человека без сахарного диабета в анамнезе (возраст 64,3 ± 0,7 лет, мужчины/женщины 132/91). Диагноз ставили на основании клинических и биохимических исследований и данных коронароангиографии (у части больных). Группу контроля составили 115 человек старше 40 лет без ИБС и сахарного диабета.

з

Таблица 1.

Общая характеристика обследованных групп больных с наличием (ИБС+) и отсутствием (ИБС-) ишемической болезни сердца.

Контроль ИБС

Показатель п = 115 п = 223

Среднее значение ± в.й.

Пол (и/ж) 47/68 132/91

Возраст, лет 56,6 ±5,5 64,3 ± 0,7

Индекс массы тела (ИМТ) 30,8 ±3,1 ■ 27,0 ±0,3

Уровень общего холестерина, мМ 5,3 ±1,0 6,1 ± 1,0

Крупноочаговый инфаркт в анамнезе - 93

Систолическое давление, мм. рт. ст. 200,1 ±3,2 195,0 ±2,2

Диастолическое давление, мм. рт. ст. 114,5 ±1,9 06,8 ±1,2

* S.D. - стандартное отклонение

Геномную ДНК больных ишемической болезнью сердца исследовали по шести полиморфным маркерам. Это однонуклеотидные полиморфные маркеры в генах АвТ(Т174М, М235Т), АвТ1Я(А1166Т,А(-153)0) иМТНРЯ(С677Т, А1298С).

1.1. Ассоциация полиморфных маркеров Т174М и М235Т гена ангиотензино-

гена (ЛвГ) с ИБС.

За регуляцию тонуса кровеносных сосудов отвечает ренин-ангиотензиновая система (РАС). Важным компонентом РАС является ангиотензиноген, при последовательном действии на который двух карбоксипептидаз: ренина и фермента, превращающего ангиотензин I, образуется ангиотензин II. Ангиотензин II обладает сосудосуживающим действием, стимулирует пролиферацию клеток гладкой мускулатуры сосудов и миокарда. Таким образом, вовлеченность гена ангиотензиногена в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний очень вероятна.

Ген ангиотензиногена расположен на хромосоме ^42^43. Содержит два основных полиморфных участка, расположенные во втором экзоне. Это однонуклео-тидные полиморфизмы, которым соответствуют аминокислотные полиморфизмы (треонин или метионин) в положениях 235 (М235Т) и 174 (Т174М) полипептидной цепи.

В результате амплификации участка ДНК гена А0Т, содержащего оба полиморфных участка Т174М и М235Т, образуется фрагмент длиной 313 п.н.

Таблица 2. Фрагмент ДНК, содержащий

Распределение частот аллелей и генотипов аллель М174 расщепляется рест-полиморфного маркера Т174М гена ангио-тензиногена у здоровых доноров и в группе больных ИБС.

риктазои Ncol, образуя фрагменты

Аллели и генотипы Частота Уровень значимости

Контроль п = 102 ИБС П = 223

Аллель Т 0,887 0,836 НЗ

Аллель М 0,113 0,164

Генотип 7Т 0,784 0,709 НЗ

Генотип ТМ 0,206 0,256 НЗ

Генотип ММ 0,010 0,036 НЗ

размером 211 и 102 п.н., а фрагмент ДНК, содержащий аллель Т174, остается нерасщепленным.

При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера Т174М в фуппе больных ИБС по сравнению с контролем статистически достоверных различий получено не было (табл. 2). Таким образом, полиморфный маркер Т174М гена ангиотензиногена не ассоциирован с ишемической болезнью сердца у русских г. Москвы.

Наши результаты не согласуются с данными, полученными при исследовании русского населения Томской области, где обнаружена ассоциация между полиморфным маркером Т174Мп коронарным атеросклерозом (Спиридонова и соавт., 2001).

В случае маркера М235Т, фрагмент ДНК, содержащий аллель М235, расщепляется рестриктазой Sfahfl, образуя продукты размером 276 и 37 п.н., в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель 7235, остается нерасщепленным.

Таблица 3. При сравнении распределения Распределение аллелей и генотипов поли- аллелей и генотипов полиморфно-морфного маркера М235Т гена ангиотени-зиногена у здоровых доноров и в группе

го маркера М235Т гена ЛвТ в

больных ИБС.

Аллели и генотипы Частота Уровень значимости

Контроль п = 100 ИБС п = 223

Аллель Т 0,535 0,565 НЗ

Аллель М 0,465 0,435

Генотип 7Т 0,280 0,341 НЗ

Генотип ТМ 0,510 0,448 НЗ

Генотип ММ 0,210 0,211 НЗ

фуппах больных с наличием и отсутствием ИБС статистически достоверных различий между группами обнаружено не было (табл. 3). Эти данные свидетельствуют о том, что в исследованной популяции русских ассоциация между полиморфным маркером М235Т гена ЛвТИ ИБС отсутствует.

Результаты исследований возможной ассоциации полиморфных маркеров Т174М и М235Тгена AGTc ИБС в различных популяциях противоречивы. Так, у датчан (Sethi et al, 2001) и китайцев (Ко et al, 1897) такой ассоциации не обнаружено, в то время как во французской популяции показана связь аллеля Г полиморфного маркера Т174М со степенью поражения коронарных артерий (Jeunemaitre et al, 1997). В японской популяции подобная ассоциация была установлена для генотипа 7Тв положении 174 (Cong et al, 1998). У североамериканских европейцев (Ludwig et al, 1997), новозеландцев (Katsuya et al, 1995), итальянцев (Olivieri et al, 2001) и жителей Канарских островов (Rodriguez-Perez et al, 2001; Hernandez Ortega et al, 2002) в качестве фактора риска выступает аллель Т235. Результаты исследований в немецкой популяции также противоречивы (Gardemann et al, 1999; Winkelmann et al, 1999; Wenzel et al, 1997; Reinhardt et al, 2000).

Подобные расхождения в результатах исследований, прежде всего, могут быть связаны с различными подходами к формированию выборок больных и здоровых индивидов. Выборки, используемые разными авторами, могут отличаться по возрастному и половому составу, по этническим признакам, по факторам риска ИБС, что, несомненно, отражается на полученных данных. Кроме того, частоты аллелей и генотипов данного полиморфного маркера значительно различаются в разных популяциях, что дает возможность говорить также о различном вкладе гена ангиотензи-ногена в генетическую предрасположенность к ИБС в зависимости от исследуемой популяции.

1.2. Ассоциация полиморфных маркеров А1166С и A(-153)G гена рецептора ангиотензина II типа 1 (AGT1R) с ИБС.

Ген сосудистого рецептора ангиотензина II типа 1 находится на хромосоме 3q21-q25. Продукт экспрессии гена AGT1R - рецептор ангиотезина II типа 1. Через посредство данного рецептора ангиотензин II реализует свои биологические функции в отношении сосудов.

Предполагается, что различные аллельные варианты рецептора могут приводить к различиям в эффективности связывания ангиотензина II и как следствие этого к определенным различиям в функционировании стенок сосудов.

Полиморфный маркер А1166С гена AGT1R расположен в З'-нетранслируемой области и представляет собой однонуклеотидный полиморфизм А/С в положении

б

1166. Аллели данного полиморфного маркера выявляют после расщепления ам-плифицированного фрагмента длиной 352 п. н., содержащего полиморфный участок, рестриктазой BstDB. Фрагмент ДНК, содержащий аллель А1166, остается нерасще-пленным, в то время как фрагмент, содержащий аллель С1166, расщепляется, образуя продукты размером 114 и 238 п. н.

При сравнении частот аллелей и генотипов полиморфного

маркера А1166С в обеих исследованных группах не было выявлено статистически достоверных различий (табл. 4). Таким образом, полиморфный маркер А1166С гена рецептора ангиотензина II типа 1 не ассоциирован с ишемической болезнью сердца у русских пациентов г. Москвы.

Результаты исследований среди других популяций противоречивы: одни исследователи указывают на связь полиморфизма А1166С с ИБС, тогда как другие такой связи не обнаруживают. Положительная ассоциация полиморфного маркера А1166С гена AGT1R с развитием ИБС демонстрируется в польской (Buraczynska et al, 2003), китайской (Xiang et al, 1998) и японской (Nakauchi et al, 1996) популяциях. В популяции Нидерландов (van Geel et al, 2001), Великобритании (Rice et al, 1999), Италии (Fatini et al, 2000) и Испании (Alvarez et al, 1998) положительная ассоциация генотипа СС маркера А1166С с развитием ишемических случаев была показана в присутствии генотипа DD гена АСЕ. В то же время у жителей Канарских Островов (Hernandez Per-era et al, 2002) и у французов (Jeunemaitre et al, 1997) не обнаружено ассоциации данного полиморфного маркера гена AGT1R с развитием ишемической болезни сердца. Также не обнаружено ассоциации полиморфизма А1166С с ИБС у мужчин в европейской популяции Германии (Gardemann et al, 1998).

Как и в случае полиморфных маркеров гена AGT, для полиморфного маркера А1166С гена AGT1R подобные расхождения в результатах исследований, прежде

Таблица 4.

Распределение частот встречаемости, аллелей и генотипов полиморфного маркера А1166С гена рецептора ангиотензина II типа 1 в фуппе пациентов больных ИБС в срав-

Аллели и генотипы Частота Уровень значимости

Контроль п = 108 ИБС п = 203

Аллель А 0,713 0,690 НЗ

Аллель С 0,287 0,310

Генотип АА 0,518 0,488 НЗ

Генотип АС 0,389 0,404 НЗ

Генотип СС 0,093 0,108 НЗ

всего, могут быть связаны с различными подходами к формированию выборок больных и здоровых индивидов.

По мнению Пуаре и соавт. (1998), полиморфизм А1166С гена ДОТ1Я находится в нетранскрибируемой области гена и поэтому не может влиять ни на пространственную структуру молекулы мРНК, ни на ее полиаденилирование; скорее он находится в неравновесии по сцеплению с еще неустановленными функциональными вариантами, которые могут оказывать влияние на регуляцию экспрессии гена. В связи с этим среди других полиморфизмов гена ДОТ1Я заслуживает внимания недавно выявленный однонуклеотидный полиморфизм Д(~153)О, расположенный в промо-торной области гена.

При амплификации полиморфного участка ДНК гена ДОТ1Я, содержащего полиморфизм Д(-153)О, образуется фрагмент длиной 350 п.н. Фрагмент ДНК, содержащий аллельА(-153), расщепляется рестриктазой Бвр\, образуя фрагменты размером 327 и 23 п.н., а фрагмент ДНК, содержащий аллель О(-153), остается нерасщеп-ленным.

При сравнении частот аллелей и генотипов полиморфного маркера Д(- 153)О в исследованных группах были обнаружены весьма существенные отличия (табл.5).

Таблица5.

Распределение частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфного маркера 153)0 гена рецептора ангиотензина II типа 1 в группе пациентов больных ИБС в сравнении с контрольной группой.

Аллели и генотипы Частота Уровень значимости ОК(95%С1)

Контроль п = 80 ИБС п = 183

Аллель Л 0,869 0,582 2,80*10-" 0,20 (0,12-0,32)

Аллель в 0,131 0,418 4,75(2,87-7,87)

Генотип АА 0,775 0,290 2,09*10-13 0,12 (0,06-0,22)

Генотип Ав 0,188 0,585 1,67* Ю-9 6,10(3,24-11,50)

Генотип 66 0,037 0,125 0,026 3,69 (1,07-12,67)

В группе больных ИБС по сравнению с контролем статистически значимые различия были обнаружены для обоих аллелей, при этом наибольшим значением относительного риска (ОЯ - 4,75) характеризовался аллель G, а наименьшим - ал-

лель A (OR = 0,20). Статистически достоверные различия показаны и в распределении генотипов (табл.5). Таким образом, маркер A(-153)G показал выраженную ассоциацию с ИБС в русской популяции г. Москвы. При этом для изученного заболевания генетическим маркером повышенного риска может служить аллель G (OR = 4,75) и генотип GG (OR = 3,69), тогда как аллель A (OR = 0,20), и, особенно, генотип АА (OR = 0,12), напротив, являются маркерами пониженного риска (табл. 5).

Данное исследование проведено нами впервые в мире, поэтому отсутствуют данные об ассоциации полиморфного маркера A(-153)G гена AGT1R с ИБС в других популяциях.

1.3. Ассоциация полиморфных маркеров С677Т и А1298С гена

метилентетрагидрофолат-редуктазы (MTHFR) с ИБС.

Экспериментально показано, что повышенная концентрация гомоцистеина в крови приводит к ишемии сердца. Это связано с разрушающим воздействием гомо-цистеина на эндотелий сосудов и его влиянием на образование внутрисосудистых тромбов.

Нормальный (сравнительно низкий) уровень гомоцистеина в крови поддерживается за счет его превращения в метионин при высокой концентрации активной формы фолиевой кислоты (5 - метилтетрагидрофолата). Основным ферментом, обеспечивающим превращение фолиевой кислоты в ее активную форму, является 5, 10 - метилентетрагидрофолат-редуктаза (MTHFR). Снижение активности этого фермента (особенно на фоне снижения фолатного статуса) - может быть одной из важ-ньх причин накопления гомоцистеина в организме.

Ген MTHFR расположен на коротком плече первой хромосомы (1д36.3). Существует несколько аллельных вариантов этого гена, вызывающих тяжелую недостаточность МТ-^, но большинство из этих вариантов очень редки. В настоящее время практическое значение имеют только два полиморфизма: С677Т и A1298C.

Полиморфный маркер С677Т гена MTHFR расположен в экзоне 4 и представляет собой однонуклеотидный полиморфизм (С/Т) в положении 677, которому соответствует полиморфизм аминокислотных остатков (аланин или валин) в положении 222 аминокислотной последовательности.

В результате амплификации участка ДНК гена MTHFR, содержащего полиморфизм С677Т, образуется фрагмент длиной 198 п.н. Фрагмент ДНК, содержащий

аллель Т677, расщепляется рестриктазой Н1пЛ, образуя фрагменты размером 175 и 23 п.н., а фрагмент ДНК, содержащий аллель С677, остается нерасщепленным.

Таблица 6. В результате сравнительно-

Распрадвленив частот встречаемости ал- го анализа частот аллелей и гено-лелей и генотипов полиморфного маркера

типов полиморфного маркера

С677Т гена метилентетрагидрофолат-

редуктазы в группе больных ИБС в срав- С677Г была выявлена тенденция к

накоплению генотипа 7Т в группе контроля по сравнению с группой больных ИБС (0,104 и 0,055, соответственно). Однако статистически достоверных различий в распределении данного генотипа между исследуемыми группами выявлено не было (табл.6).

В настоящий момент не совсем ясно, ассоциирован ли полиморфный маркер С677Тгена МТНРЙ с развитием ИБС. Во всяком случае, в популяции Москвы предохраняющий эффект генотипа ТТ выражен сильнее, чем предрасполагающая роль генотипа СС, но при этом связь с патологией у полиморфного маркера С677Т гена МТНРЙ отсутствует.

Наши данные подтверждают результаты, полученные при исследовании населения Западной Сибири, где показано, что полиморфный маркер С677Т гена МТНРЙ не ассоциируется с коронарным атеросклерозом (Spiridonova et al, 2000).

Полиморфный маркер А1298С гена МТНРЙ расположен в экзоне 7 и представляет собой однонукпеотидный полиморфизм А/С в положении 1298, которому соответствует полиморфизм аминокислотных остатков (глутаминовая кислота или апанин) в положении 429 аминокислотной последовательности. Обнаружено, что у носителей генотипа СС1298 активность фермента составляет около 50% по сравнению с носителями генотипа АА1298.

При амплификации участка ДНК гена МТНРЙ, содержащего полиморфизм А1298С, образуется фрагмент длиной 143 п.н. Фрагмент ДНК, содержащий аллель С1298 расщепляется рестриктазой Рвр4Н\, образуя фрагменты размером 115 и 28 п.н., а фрагмент ДНК, содержащий аллель А1298 остается нерасщепленным.

нении с кон Аллели и генотипы тролем. Уровень значимости

Контроль п = 115 ИБС п - 218

Аллель С 0,704 0,736 НЗ

Аллель Т 0,296 0,264

Генотип СС 0,513 0,528 НЗ

Генотип СТ 0,383 0,417 НЗ

Генотип ТТ 0,104 0,055 НЗ

В результате сравнительного анализа распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера А1298С в общей группе больных ИБС и в контроле выявили значительное (р = 0,021) накопление аллеля С и особенно генотипа СС (р = 0,0347) при одновременном снижении аллеля А и генотипа АА (р=0,049) у пациентов с ИБС по сравнению с контролем (табл. 7).

Таблица 7.

Распределение частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфного маркера А1298Сгена метилентетрагидрофолат-редуктазы в группе больных'

ИБС и в контрольной группе.

Аллели и генотипы Частота Уровень значимости ОЯ (95% О)

Контроль п = 115 ИБС п = 216

Аллель А 0,630 0,537 0,021 0,41 (0,18-0,93)

Аллель С 0,370 0,463 1,68 (1,02-2,78)

Генотип АА 0,330 0,227 0,049 0,59 (0,36-0,98)

Генотип АС 0,600 0,620 НЗ

Генотип СС 0,070 0,153 0,0347 2,41 (1,07-5,41)

В группе больных ИБС по сравнению с контролем статистически достоверные различия были обнаружены для обоих аллелей, при этом наибольшим значением относительного риска (OR - 1,68) характеризовался аллель С, а наименьшим - аллель A (OR = 0,41). Статистически достоверные различия показаны и для генотипов АА и СС (табл.7). Именно носители аллеля С и генотипа СС имеют повышенный риск развития ИБС, тогда как носители аллеля А и генотипа АА имеют пониженный риск развития ИБС

Наши данные свидетельствуют о вовлеченности полиморфного маркера А1298С гена MTHFR в развитие ишемической болезни сердца у русских г. Москвы и соответствуют результатам работы Чанго и соавт. (2000). Эффект данного полиморфизма на риск развитития ИБС объясняется тем, что у пациентов, носителей генотипа СС значительно снижена специфическая активность MTHFR и повышен уровень общего гомоцистеина в плазме.

Результаты исследований возможной ассоциации полиморфных маркеров С677Т и А1298С гена MTHFR с ИБС противоречивы. Так, у австралийцев ^п

Bockxmeer et al, 1997), испанцев (Gonzalez-Perez et al, 2002), индусов (Mukherjee et al, 2002), швейцарцев (Todesco et al, 1999) и корейцев (Kim et al, 2001) не обнаружено ассоциации полиморфизма С677Тс ИБС, в то время как у голландцев (Klerk et al, 2002), поляков (Szczeklik et al, 2001), японцев (Ou et al, 1998), евреев (Mager et al, 2002) и чехов (Benes et al, 2001) показана связь аллеля Г и/или генотипа 7Тс высоким риском развития ИБС. В польской популяции риск раннего развития ИБС существенно выше у носителей генотипов АС и СС полиморфного маркера А1298С (Szczeklik et al, 2001). Результаты исследований среди китайцев (Xu et al, 1999; Zheng et al, 2000; Dai et al, 2001; Wang et al, 2001; Hsu et al, 2001; Zhang et al, 2001), итальянцев (Girelli et al, 1998; Friso et al, 2002; Abbate et al, 1998), европейского населения США (Dunn et al, 1998; Hanson et al, 2001 ; Wu et al, 2001 ; Payne et al, 2001 ; Anderson et al, 1997), англичан (Spence et al, 2002; Wierzbicki et al, 2000; Malik et al, 1998) и немцев (Rassoul et al, 2000; Rothenbacher et al, 2002) также противоречивы.

Вероятно, что в данной исследованной популяции именно полиморфизм А1298С, а не С677Тв гене MTHFR приводит к образованию фермента со сниженной активностью. В результате, 5-метилтетрагидрофолата (активная форма фолиевой кислоты) может не хватать для эффективного перевода гомоцистеина в метионин, и гомоцистеин начинает накапливаться в организме.

Ишемическая болезнь сердца представляет собой сложное многофакторное заболевание с многочисленными звеньями патогенеза. Поэтому ассоциации с заболеванием можно, прежде всего, ожидать от генов, продукты которых могут непосредственно влиять на состояние сосудистой стенки. Это, в первую очередь, гены, продукты которых вовлечены в регуляцию сосудистого тонуса. Подтверждением этого служит полученная нами ассоциация полиморфного маркера A( - 153)G гена рецептора ангиотензина II типа 1 с развитием ИБС.

Ранее считалось, что основное повреждающее действие на эндотелий оказывают продукты окисления липидов, в частности, холестерин. Однако в последнее время, авторы многочисленных исследований склоняются к тому, что первичное повреждение стенок сосудов происходит под действием гомоцистеина, вызывающего образование «царапин» на их внутренней выстилке. С этой точки зрения наиболее вероятными кандидатами на ассоциацию с развитием ИБС являются гены, продукты которых участвуют в превращении гомоцистеина. Ассоциация полиморфного маркера А1298С гена MTHFR с развитием ишемической болезни сердца подтверждает данную гипотезу.

2. Изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с развитием инфаркта миокарда (ИМ) у больных ишемической болезнью сердца (ИБС).

Изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с ИМ проводили, используя две группы, общая характеристика которых приведена в таблице 8. В группу пациентов, перенесших инфаркт миокарда, вошло 93 человека (возраст 64,1± 1,1 лет, мужчины/женщины 58/35). Данная группа была выделена из ранее описанной группы больных ИБС (п=223). В качестве контроля использовали группу больных ИБС этой же группы без ИМ в анамнезе (п=124).

Таблица 8.

Общая характеристика обследованных групп больных ИБС с наличием (ИМ+) и

отсутствием (ИМ-) инфаркта миокарда.

Показатель ИМ- ИМ+

п = 124 п = 93

Среднее значение ± Б.О.

Пол (м/ж) 71/53 58/35

Возраст, лет 64,1 ±1,0 64,1 ±1,1

Индекс массы тела (ИМТ) 26,8 ±0,4 26,9 ±0,4

Уровень общего холестерина, мМ 6,1 ± 0,2 6,1 ±0.1

Систолическое давление, мм. рт. 197,4 ±2,7 191,8 ±3.6

Диастолическое давление, мм. рт. 106,8 ±1,5 107,1 ±2,0

Геномную ДНК больных ИМ исследовали по шести полиморфным маркерам генов ЛвТ(Г174М, М235Т), ЛвТ1Я (А1166Т, Л(-153)в) и МТИРЙ (С677Т, А1298С).

2.1. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Т174М и М235Тгена АвТ* полиморфных маркеров А1166С и А(-153)в гена АвТ1й с ИМ.

При изучении ассоциации полиморфных маркеров Т174М и М235Т гена ЛвТу1 полиморфных маркеров А1166С и Л(-153)в гена ЛвТ1Я с развитием ИМ у больных ИБС статистически достоверных различий в распределении аллелей и генотипов между обеими группами не обнаружили. Таким образом, данные полиморфные маркеры не ассоциированы с развитием ИМ в популяции русских г. Москвы.

Результаты исследований возможной ассоциации полиморфных маркеров Т174М и М235Т гена ДвТ, а также полиморфного маркера А1166С гена ДвТ1Я с ИМ в других популяциях противоречивы. Данные об исследовании ассоциации полиморфного маркера Д(-153)в с развитием ИМ у больных ИБС вообще отсутствуют.

2.2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров С677Т и А1298С гена ШИРЯ с ИМ.

При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера С677Т и А1298С гена МТНГЯ в группе больных ИБС перенесших ИМ по сравнению с группой больных ИБС без этого осложнения статистически достоверные различия были обнаружены лишь для маркера А1298С. В группе больных ИБС с ИМ значимо (р = 0,020) повышена частота встречаемости генотипа СС по сравнению с группой больных ИБС без этого осложнения (0,220 против 0,101) (табл 9).

Таблица 9.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера А1298С гена метилентетрагидрофолат-редуктазы в группе больных ИБС с наличием (ИМ+)

и отсутствием (ИМ-) инфаркта миокарда.

Агшели и генотипы Частота Уровень значимости СУ? 05% СО

Группа'ИМ-" п = 119 Группа"ИМ+" п = 91

Аллель А 0,580 0,484 НЗ

Аллель С 0,420 0,516

Генотип АА 0,260 0,187 НЗ

Генотип АС 0,639 0,593 НЗ

Генотип СС 0,101 0,220 0,020 2,51 (1,16-5,46)

Анализируя данные, представленные в таблице 9, очевидно, что носители генотипа СС имеют повышенный риск развития ИМ (OR = 2,51). Таким образом, в популяции русских г. Москвы полиморфный маркер А1298С гена МТНГЯ ассоциируется с развитием инфаркта миокарда у больных ишемической болезнью сердца. Носи-тельство гомозиготного генотипа СС является генетическим фактором риска развития патологии.

Связь генотипа 77 полиморфного маркера С677Т с высоким риском развития ИМ показана у мужчин в японской (Nakai et al, 2000) и турецкой (Gulec et at, 2001) популяциях. В исследованиях, проведенных на североамериканской (Anderson et al, 1997; Schwartz et al, 1997; Ma et al, 1996; Schmitz et al, 1996), польской (Goracy et al, 1999; Goracy I., 2000), китайской (Hsu et al, 2001; Zhang et al, 2001), австралийской (Wilcken et al, 1996) и индусской (Mukherjee et al, 2002) популяциях, ассоциации полиморфного маркера С677Т с ИМ не обнаружено. Результаты исследований среди итальянцев противоречивы (Margaglione et al, 1999; Mannucci et al, 2003). К сожалению, отсутствуют данные об исследовании ассоциации полиморфного маркера А1298С гена MTHFR с развитием инфаркта миокарда в других популяциях, что не дает возможности сравнить полученные нами выводы с результатами других исследований.

Развитие инфаркта миокарда связано с формированием острой недостаточности кровоснабжения сердечной мышцы. При этом ведущую роль в развитии патологии играет закупорка коронарных артерий. Можно предположить, что в данном контексте генетический риск развития ИМ будет связан, прежде всего, с продуктом экспрессии гена метилентетрагидрофолат-редуктазы - гомоцистеином. Так как, известно, что повышенный уровень гомоцистеина не только повреждает стенки сосудов, но и участвует в процессах окисления холестерина, и усиливает тромбообра-зование. Ассоциация полиморфного маркера А1298С гена MTHFR с развитием инфаркта миокарда у больных ишемической болезнью сердца подтверждает данную гипотезу.

Статистически недостоверные различия в распределении аллелей и генотипов полиморфного маркера A(-153)G гена рецептора ангиотензина II типа1, возможно, объясняются тем, что продукт данного гена вовлечен в начальные стадии формирования ИБС и не играет значительной роли в развитии инфаркта миокарда.

3. Изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов кандидатов с

развитием артериальной гипертонии (АГ) при СД типа 2.

Гипертоническая болезнь (ГБ) - общее заболевание организма, характеризующееся стойким повышением артериального давления. Сочетание сахарного диабета типа 2 и АГ несет в себе угрозу преждевременной инвалидизации и смерти больных от сердечно-сосудистых осложнений.

Геномную ДНК больных гипертонией и СД типа 2, исследовали с использованием четырех полиморфных маркеров генов-кандидатов ЛвТ и ЛОТ1И. Это одно-нуклеотидные полиморфные маркеры Т174М и М235Т гена ЛвТ и полиморфные маркеры А1166С и Л(-153)в гена ЛвТ1й.

Группы больных были сформированы из числа пациентов Эндокринологического центра РАМН. В группу "СД2 АГ+" вошло 134 человека (возраст 59,8±11,14; женщины/мужчины 74/60). В качестве контроля была использована группа больных сахарным диабетом типа 2 без артериальной гипертонии ("СД2 АГ-") в количестве 80-ти человек (возраст 56,9±7,11; женщины/мужчины 34/46). Общая характеристика обследованных групп приведена в таблице 10.

Таблица 10.

Характеристика больных сахарным диабетом типа 2 с артериальной

гипертонией ("СД2 АГ+") и без артериальной гипертонии ("СД2 АГ-").

Показатель "СД2АГ+" п = 134 "СД2АГ-" п = 80

Среднее значение ± Б-Р.

Возраст, лет 59,8 ±11,14 56,9 ±7,11

Пол, (ж/м) 74/60 34/46

Уровень НВА1с % 11,08 + 0,35 10,8 ±0.1

Наследств, по СД 78/56 68/12

Наследств, по АГ 67/67 51/29

Систолическое давление, мм. рт. ст. 149,2 ±1,1 126,1 ± 8,2

Диастолическое давление, мм. рт. ст. 88,6 ±0,9 75,4 ±6,3

3.1. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Т174М и М235Тгена

ЛвТо артериальной гипертонией при СД типа 2.

При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера Т174М и М235Тгена ЛвТв группе "СД АГ+" по сравнению с группой "СД АГ-" статистически достоверных различий обнаружено не было.

Таким образом, данные полиморфные маркеры гена ангиотензиногена не ассоциированы с развитием артериальной гипертонии у пациентов с СД типа 2 в популяции русских г. Москвы.

Ассоциацию полиморфных маркеров Т174М и М235Т с развитием гипертонии на фоне диабета в других популяциях практически не исследовали. Есть только од-

на работа, в которой показано отсутствие ассоциации между полиморфными маркерами Т174М и М235Т гена AGT и развитием артериальной гипертонии в семьях французских европейцев, больных сахарным диабетом типа 2 (_еэаде е1 а1, 1997).

3.2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров А1166С и A(-153)G гена AGT1R с артериальной гипертонией при СД типа 2.

В результате сравнительного анализа двух групп были обнаружены статистически достоверные различия для всех аллелей и генотипов. Наибольшим значением относительного риска характеризовался аллель A (OR = 3,36) и генотип АА (OR = 4,54;, наименьшим - аллель С (OR = 0,22; и генотипы СС (OR = 0,30) и AC (OR = 0,31;(табл. 11).

Таблица 11.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера А1166С гена сосудистого рецептора ангиотензина II типа 1 у больных СД типа 2 с наличием АГ ("СД2 АГ+") и отсутствием АГ("СД2 АГ-").

Аллели и генотипы Частота Уровень значимости ОК (95% С1)

"СД2АГ-" п = 77 "СД2АГ+" п= 132

Аллель А 0,591 0,811 2,24x10"® 3,36 (1,08-10,43)

Аллель С 0,409 0,189 0,22 (0,12-0,40)

Генотип АА 0,299 0,659 7,64*10"7 4,54 (2,48-8,32)

Генотип АС 0,584 0,303 7,98*10'5 0,31 (0,17-0,56)

Генотип СС 0,117 0,038 0,042 0,30 (0,09-0,92)

Из значений ОЯ видно, что носители аллеля А и генотипа АА имеют повышенный риск развития артериальной гипертонии при СД типа 2, тогда как носители ал-леля С и особенно генотипа СС имеют пониженный риск развития артериальной гипертонии при СД типа 2. Эти результаты подтверждают ассоциацию полиморфного маркера А1166С гена AGT1R с артериальной гипертонией у пациентов с СД типа 2 в исследованной популяции (табл. 11).

При сравнении частот аллелей и генотипов полиморфного маркера A(-153)G гена AGT1R в обеих группах были обнаружены весьма существенные различия. У

носителей аплеля G и генотипа AG был выявлен повышенный риск развития артериальной гипертонии при сахарном диабете 2-го типа (ОЯ = 4,62 и Of? = 5,27, соответственно), в то время как носители аллеля А и генотипа АА, напротив, имели тенденцию к пониженному риску развития гипертонии при сахарном диабете типа 2 (OR = 0,3 и ОЯ = 0,22, соответственно) (табл. 12).

Таблица 12.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера А(-153)С гена сосудистого рецептора ангиотензина II типа 1 у больных СД типа 2 с наличием

АГ ("СД2 АГ+") и отсутствием АГ ("СД2 АГ-").

Аллели и генотипы Частота Уровень значимости СК(95%С1)

"СД2АГ-" п = 74 "СД2АГ+" п= 100

Аллель А 0,932 0,805 0,000585 0,3 (0,14-0,62)

Аллель в 0,068 0,195 4,62 (2,07-10,32)

Генотип АА 0,878 0,610 7,37*10"5 0,22 (0,10-0,48)

Генотип Ав 0,108 0,390 2,75*10"5 5,27(2,28-12,18)

Генотип вв 0,014 0,000 НЗ

На основании полученных данных, можно утверждать, что нам удалось обнаружить выраженную ассоциацию между полиморфным маркером Л(-153^ гена рецептора ангиотензина II типа 1 и развитием гипертонии у больных сахарным диабетом типа 2 в русской популяции.

Поиску ассоциации полиморфного маркера А1166С гена рецептора ангиотензина II типа 1 с развитием гипертонии у больных сахарным диабетом типа 2 посвящено всего несколько работ. Так, у китайцев ассоциация данного маркера с развитием гипертонии показана, преимущественно, у лиц больных сахарным диабетом типа 2 с повышенным систолическим давлением крови (Хие е! а1, 2002). В то же время исследования, проведенные на семьях французских европейцев, не подтвердили подобной связи (1_еваде е! а1, 1997). Данные об исследовании ассоциации полиморфного маркера A(-153)G с развитием гипертонии у больных СД типа 2 вообще отсутствуют.

Обнаруженная нами ассоциация между полиморфными маркерами А1166С и A(-153)G гена рецептора ангиотензина II типа 1 и развитием артериальной гипертонии на фоне диабета типа 2 подтверждает теорию, согласно которой ведущую роль

в формировании данного процесса играют гены, продукты которых связаны с регуляцией сосудистого тонуса.

Полиморфные маркеры Т174М и М235Т гена АвТ, вероятно, не являются маркерами риска развития артериальной гипертонии при сахарном диабете типа 2 в данной исследованной популяции. В любом случае, желательно дальнейшее исследование подобной взаимосвязи на увеличенных выборках с подтверждением полученных результатов с использованием анализа семей.

ВЫВОДЫ

1. Изучено распределение аллелей полиморфных маркеров Т174М и М235Тгена ангиотензиногена, А1166С и Л(-153)С гена рецептора ангиотензина II типа 1, С677Т\л А1298С гена метилентетрагидрофолат-редуктазы в группах больных ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда, гипертонией при сахарном диабете типа 2, а также в группе здоровых индивидов среди русских г. Москвы.

2. Для полиморфных маркеров Т174М и М235Т гена ангиотензиногена не показано ассоциации с сердечно-сосудистыми патологиями.

3. Полиморфный маркер А1166С гена рецептора ангиотензина II типа 1 ассоциирован с гипертонией при сахарном диабете типа 2. Факторами риска развития данной патологии является носительство аллеля А и гомозиготного генотипа АА, в то время как аллель С и гомозиготность по данному аллелю связаны с пониженным риском развития заболевания. С ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда данный полиморфный маркер не ассоциирован.

4. Для полиморфного маркера А(-153)в гена рецептора ангиотензина II типа 1 обнаружена ассоциация с ишемической болезнью сердца и гипертонией при сахарном диабете типа 2 у русских пациентов г. Москвы. Генетическим маркером повышенного риска развития данных заболеваний является аллель в, тогда как аллель А и генотип АА, напротив, ассоциированы с пониженным риском развития АГ. С развитием инфаркта миокарда у больных ишемической болезнью сердца данный маркер не ассоциирован.

5. Полиморфный маркер С677Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы не ассоциирован с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

6. Для полиморфного маркера А1298С гена метилентетрагидрофолат-редуктазы показана ассоциация с ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда. Установлено, что носительство аллеля С и гомозиготного генотипа СС предрасполагает к развитию ишемической болезни сердца у русских пациентов г.Москвы. Носители Аллеля А имеют пониженный риск развития ИБС. Вероятность развития ИМ, также значительно возрастает в группе больных ишемической болезнью сердца, гомозиготных по аллелю С.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бабунова Н. Б., Минушкина Л. О., Затейщиков Д. А., Сидоренко Б. А., Носиков В. В. Ассоциация полиморфных маркеров Т174М и М235Т гена ангиотензиногена с ишемической болезнью сердца в популяции русских города Москвы // Молекулярная биология. 2003. Т. 37(1). С. 57-60.

2. Горашко Н. М., Шестакова М. В., Чистяков Д. А., Воронько О. Е., Чугунова Л. А., Бабунова Н. Б., Шамхалова М. Ш., Зотова Е. В., Дебабов В. Г., Дедов И. И., Носиков В. В. Ассоциация полиморфных маркеров генов-кандидатов с диабетической нефропатией у больных сахарным диабетом типа 1 // Сахарный диабет. 2002. Т. 1(14). С. 38-42.

3. Савостьянов К. В., Чистяков Д. А., Горашко Н. М., Шестакова М. В., Воронько О. Е., Чугунова Л. А., Бабунова Н. Б., Шамхалова М. Ш., Зотова Е. В., Дедов И. И. Носиков В. В. Полиморфные маркеры генов-кандидатов и предрасположенность к развитию диабетической нефропатии // Сборник отчетов за 2000 год подпрограммы Твном человека". 2001. С. 122-124.

4. Nosikov V. V., Shestakova M. V., Chistyakov D. A., Gorashko N. М., Shamkhalova M. V., Voron'ko О. Е., Chugunova L A., Babunova N. В., Zotova E. V., Debabov V. G., Dedov I. I. Polymorphic markers of candidate genes and susceptibility to diabetic nephropathy in Russian patients with diabetes type 1 // Abstracts of Human Genome Meeting HGM'2001. Edinburgh, Scotland (April 19-22,2001). P. 67 (Abstract 245).

5. Горашко Н. М., Шестакова М. В., Чистяков Д. А., Воронько О. Е., Чугунова Л. А., Бабунова Н. Б., Шамхалова М. Ш., Зотова Е. В., Дебабов В. Г., Дедов И. И., Носиков В. В. Изучение генетической предрасположенности к развитию диабетической нефропатии с использованием полиморфных маркеров генов-кандидатов // Материалы IV Всероссийского конгресса эндокринологов "Актуальные проблемы

современной эндокринологии". Санкт-Петербург, Россия (1-5 июня 2001 г.). С. 48-49.

6. Кудряшова О. Ю., Бабунова Н. Б., Минушкина Л. О., Затейщикова А. А., Затейщиков Д. А., Хотченкова Н. В., Бабков А. И., Носиков В. В., Сидоренко Б. А. Состояние ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и полиморфизм гена ангиотен-зиногена у больных с артериальной гипертонией // Материалы Всероссийской научно-практической конференции 'Современные возможности эффективной профилактики, диагностики и лечения артериальной гипертонии". Москва, Россия (5-6 июня 2001 г.). С. 41.

7. Минушкина Л. О., Бабунова Н. Б., Затейщикова А. А., Кудряшова О. Ю., Затейщиков Д. А., Носиков В. В., Сидоренко Б. А. Полиморфные маркеры гена ангиотен-зиногена у пациентов с артериальной гипертонией // Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Современные возможности эффективной профилактики, диагностики и лечения артериальной гипертонии". Москва, Россия (5-6 июня 2001 г.). С. 43.

8. Затейщиков Д. А., Затейщикова А. А., Кудряшова О. Ю., Минушкина Л. О., Бабунова Н. Б., Носиков В. В., Сидоренко Б. А. Нестабильная стенокардия: связь полиморфизма гена ангиотензиногена с прогнозом // Тезисы докладов Российского национального конгресса кардиологов. "Кардиология: эффективностьи безопасность диагностики и лечения". Москва, Россия (9-11 октября 2001 г.). С. 143.

9. Минушкина Л. О., Затейщикова А. А., Кудряшова О. Ю., Затейщиков Д. А., Бабунова Н. Б., Носиков В. В., Хотченкова Н. В., Бобков А. И., Сидоренко Б. А. Полиморфизм гена ангиотензиногена у больных артериальной гипертонией: активность ренина и альдостерона // Тезисы докладов Российского национального конгресса кардиологов. "Кардиология: эффективность и безопасность диагностики и лечения". Москва, Россия (9-11 октября 2001 г.). С. 256.

10. Voron'ko О. Е., Zateishchikov D. A., Gorashko N. М., Minushkina L. О., Babunova N. В., Zateyshchikova A. A., Ignatiev I. V., Kudryashova О. Yu., Sidorenko В. A., Nosikov V. V. Polymorphic markers of candidate genes and genetic predisposition to ischaemic heart disease in Russian patients // Abstracts of Human Genome Meeting HGM2002. Shanghai, China (April 14 -17,2002). P. 176 (Abstract 368).

11. Шестакова M. В., Горашко H. M.f Чистяков Д. А., Чугунова Л. А., Воронько О. Е., Шамхалова М. Ш., Бабунова Н. Б., Викулова О. К., Зотова Е. В., Дебабов В. Г., Дедов И. И., Носиков В. В. Поиск полиморфных маркеров генов-кандидатов, ассо-

циированных с развитием диабетической нефропатии при диабете типа 1 // Тезисы докладов Второго Российского Диабетологического Конгресса. Москва, Россия (3-5 июля 2002 г.). С. 33-34.

12. Voron'ko О. Е., Zateishchikov D. A., Gorashko N. М., Mmushkina L. О., Babunova N. В., Kudryashova O.Yu., Ignatiev I. V., Privalov D. V., Sidorenko B. A., Nosikov V. V. Comparative analysis of genetic susceptibility to coronary artery disease in patients with and without type 2 diabetes // Abstracts of the 38th Annual Meeting of European Association for the Study of Diabetes. Budapest, Hungary (September 1 -5, 2002). P. A136 (Abstract N412).

13. Минушкина Л. О., Бабунова Н. Б, Бражник В. А., Затейщиков Д. А., Носиков В. В., Сидоренко Б. А. Ассоциация полиморфных маркеров гена метилентетрагидро-фолат редуктазы с уровнем артериального давления // Тезисы Конгресса кардиологов стран СНГ "Фундаментальные исследования и прогресс в кардиологии". Санкт-Петербург, Россия (18-20 сентября 2003 г.). С. 190.

14. Привалов Д. В., Бабунова Н. Б., Затейщикова А. А., Чумакова О. С, Минушкина Л. О., Затейщиков Д. А., Носиков В. В., Сидоренко Б. А. Полиморфный маркер А1298С гена метилтетрагидрофолат редуктазы: ассоциация с инфарктом миокарда // Тезисы Конгресса кардиологов стран СНГ "Фундаментальные исследования и прогресс в кардиологии". Санкт-Петербург, Россия (18-20 сентября 2003 г.). С. 238.

15. Чумакова О. С, Бабунова Н. Б., Затейщиков Д. А., Минушкина Л. О., Затейщикова А. А., Носиков В. В., Сидоренко Б. А. Полиморфизм гена метилтетрагидрофолат редуктазы у больных с нестабильной стенокардией: ассоциация с уровнем липи-дов крови // Тезисы Конгресса кардиологов стран СНГ "Фундаментальные исследования и прогресс в кардиологии". Санкт-Петербург, Россия (18-20 сентября 2003 г.). С. 315.

16. Чумакова О. С, Бабунова Н. Б., Затейщиков Д. А., Затейщикова А. А., Минушкина Л. О., Носиков В. В., Сидоренко Б. А. Анализ ассоциации полиморфных маркеров С677Т и А1298С гена MTHFR с уровнем липидов крови у больных с нестабильной стенокардией // Тезисы Российского национального конгресса кардиологов "От исследований к стандартам лечения". Москва, Россия (7-9 октября 2003 г.). С. 345.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 26.04.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 492. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.ВЛомоносова.

1132 0 б

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бабунова, Надежда Борисовна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Полиморфные маркеры. Типы полиморфизмов и методы их исследования.

2.1.1. Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики многофакторных заболеваний.

2.2. Характеристика многофакторных заболеваний, исследованных в данной работе.

2.2.1. Ишемическая болезнь сердца (ИБС). Основные аспекты этиологии и патогенеза ИБС.

2.2.1.1. Генетические факторы риска ИБС.

2.2.2. Инфаркт миокарда (ИМ).

2.2.2.1. Генетические факторы риска ИМ.22,

2.2.3. Сахарный диабет типа 2 (СД 2). Сосудистые осложнения, возникающие при сахарном диабете типа 2.

2.2.3.1. Артериальная гипертония при сахарном диабете типа 2.

2.2.3.2. Ишемическая болезнь сердца при сахарном диабете типа 2.

2.3. Характеристика исследованных в работе генов и полиморфных маркеров.

2.3.1. Ренин-ангиотензиновая система (РАС).

2.3.1.К Ген ангиотензиногена (AGT).

2.3.1.2. Ген рецептора ангиотензина II типа 1 (AGT1R).

2.3.1.3. Гомоцистеин. Ген метилентетрагидрофолат-редуктазы (MTHFR).

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Реактивы и ферменты.

3.2. Буферные растворы.

3.3. Формирование групп больных и здоровых индивидов.

3.4. Выделение геномной ДНК человека методом фенол/хлороформной экстракции.

3.5. Аплификация ДНК.

3.6. Расщепление продуктов амплификации рестриктазами.

3.7. Электрофоретическое разделение ДНК.

3.8. Статистическая обработка результатов.

3.8Л . Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов. Точный критерий

Фишера. Поправка Бонферрони.

3.8.2. Оценка относительного риска. Odds ratio. Доверительный интервал.

4: РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Изучение ассоциации полиморфных маркёров ряда генов-кандидатов с ИБС.

4.1.1. Исследование ассоциации полиморфных маркеров 7774М и М235Т гена AGTc ИБС.

4.1.2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров AllббС и A(~153)G гена AGT1R с ИБС.

4.1.3. Исследование ассоциации полиморфных маркеров С677Т и А1298С гена MTHFR с ИБС.

4.2. Изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с ИМ.

4.2.1. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Т174М иМ235Т гена

AGTc ИМ.

4.2.2: Исследование ассоциации полиморфных маркеров А1166С и A(-153)G гена

AGTlRcWU.

4.2.3. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Сб77ТиА1298С гена MTHFR с ИМ.

4.3: Изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с ИБС при СД типа 2.

4.3.Г. Исследование ассоциации полиморфных маркеров 7774М и М235Тгена AGT c ИБС при СД типа 2.

4.3.2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров А1166С yl A(-153)G гена AGT1R с ИБС при СД типа 2.76?

4.3.3. Исследование ассоциации полиморфных маркеров С677ТиА1298С гена MTHFR с ИБС при СД типа 2.

4.4. Изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с артериальной гипертонией при СД типа 2.80;

4.4.1. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Т174Ми М235Т'гена; AGTc артериальной гипертонией при СД типа 2.

4.4.2. Исследование ассоциации полиморфных маркеро в All ббС и A(-153)G AGT1R с артериальной гипертонией при СД типа 2.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение ассоциации генов AGT, AGT1R и MTHFR с сердечно-сосудистыми заболеваниями"

Исследование молекулярно-генетических; основ1, многофакторных заболеваний ? относится к одной из наиболее серьезных задач современной генетики;

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), в том • числе гипертония т и ишемиче-ская болезнь сердца, по-прежнему остаются основной проблемой в медицине развитых стран мира в связи с высокой заболеваемостью, инвалидизацией и смертностью.

Для- подобных, многофакторных заболеваний характерен; сложный» механизм формирования фенотипа, являющегося результатом взаимодействия генетических факторов ! с факторами ? внешней) среды. Однако, для ? каждого * конкретного » заболевания < можно выделить группу, так называемых, генов-кандидатов; продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие данной патологии.

Одним из наиболее перспективных направлений современной молекулярной генетики > заболеваний является поиск полиморфных маркеров в; генах-кандидатах: и: выявление их ассоциации с наследственными заболеваниями.

При исследовании ассоциации. сравнивают; распределение частот аллелей и: генотипов1: полиморфного, маркера; расположенного» внутри5 или; рядом с геном-кандидатом, в группах больных и здоровых доноров. Наличие достоверных различий в распределении данных частот свидетельствует об ассоциации полиморфного маркера с заболеванием.

Установление ассоциации гена с заболеванием и последующая оценка индивидуального генетического риска имеют важное значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению данной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного пациента. Цель и задачи работы.

Целью данной работы явилось изучение ассоциации полиморфных маркеров нескольких генов-кандидатов: ангиотензиногена(AGT), рецептора ангиотензина II типа 1 (AGT1R) и метилентетрагидрофолат-редуктазы (MTHFR) с развитием ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда и гипертонии при сахарном диабете типа 2 (СД 2). Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучение ассоциации полиморфных, маркеров? 7774М и- М235Т гена ангиотензиногена с ишемической болезнью сердца; инфарктом; миокарда; и гипертонией при сахарном диабете типа 2.

2. Изучение ассоциации полиморфных маркеров А1166С wA(-153)G гена рецептора ангиотензина II типа 1 с ишемической болезнью сердца, инфарктом миокарда и гипертонией при сахарном диабете типа 2.

3. Изучение ассоциации-полиморфных маркеров С677Т и А1298С гена метилен-тетрагидрофолатредуктазы с ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В данной- работе впервые исследована ассоциация : полиморфного маркера' М235Т гена ангиотензиногена, а также полиморфных маркеров С677Т и А1298С гена метилентетрагидрофолат-редуктазы с ишемической болезнью сердца, инфарктом миокарда и гипертонией при сахарном диабете типа 2 среди русских пациентов г. Москвы. Для полиморфного маркера 77 74М гена ангиотензиногена в данной популяции впервые. изучена ассоциация с развитием ишемической болезни сердца и гипертонии при сахарном диабете типа 2. Для полиморфного маркера Л 1166С гена рецептора ангиотензина II типа 1 у русских г. Москвы впервые исследована ассоциация с развитием гипертонии; при сахарном диабете типа 2. Впервые в мире осуществлен анализ ассоциации полиморфного маркера A(-153)G гена ангиотензина II типа 1 с развитием ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда и гипертонии при сахарном диабете типа 2.

Для полиморфных маркеров 7774М и М235Т гена ангиотензиногена не показано ассоциации с сердечно-сосудистыми патологиями. Для полиморфного маркера А1166С гена рецептора ангиотензина II типа 1 показана ассоциация с гипертонией при диабете типа 2. Факторами риска развития данной патологии является носительство аллеля А и гомозиготного генотипа АА, в то время как аллель С и гомозиготность по данному ал-лелю связаны с пониженным риском развития заболевания. Для полиморфного маркера A(-153)G этого же гена обнаружена ассоциация с ишемической болезнью сердца и гипертонией при сахарном диабете типа 2. Генетическим маркером повышенного риска развития данных заболеваний является аллель G, тогда как аллель А и генотип А А, напротив, являются маркерами предохраняего действия. Полиморфный маркер С677Т гена метилентетрагидрофолат-редуктазы не ассоциирован с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Для полиморфного маркера А1298С этого же гена показана ассоциация с ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда. Установлено, что носительство аллеля С и гомозиготного генотипа СС предрасполагает к развитию ишемической болезни сердца. Аллель А является защитным аллелем. При ишемической болезни сердца, отягощенной сахарным диабетом типа 2, риск развития ИБС повышен у пациентов, в геноме которых присутствует аллель С. Вероятность развития ИМ, также значительно возрастает в группе больных ишемической болезнью сердца, гомозиготных по аллелю С.

Все вышеизложенные результаты получены впервые. Они позволяют оценить вклад генетических факторов риска в развитие сердечно-сосудистых заболеваний и диабетических ангиопатий для московской популяции и могут быть использованы для прогнозирования течения и профилактики данных заболеваний и их осложнений.

2: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1М1олиморфные маркеры. Типы полиморфизмов и методы их исследования.,

Полиморфные маркеры нашли широкое применение в различных областях современной молекулярной генетики — от физического картирования хромосом до ассоциации с заболеванием и идентификации личности.

Под полиморфным маркером понимают вариабельный участок ДНК с уникальной хромосомной локализацией. Явление полиморфизма выражается < в эволюционно закрепленном существовании в популяции нескольких вариантов (аллелей) одного > и того же участка ДНК.

Существует два основных типа'полиморфизма генов. Первый из них связан с изменениями в кодирующей области генов,. приводящими к замене аминокислотных остатков в белковом продукте и часто (но не всегда) к его структурно-функциональным модификациям. К этому типу полиморфизма близки вариации в регуляторных областях-генов, приводящие к изменению уровня экспрессии информационной РНК (мРНК) и, как следствие, концентрации t конечного продукта < (белка). Второй тип полиморфизма прямо не связан с; изменениями концентрации, структуры и (или) функции продукта генной экспрессии. Такие виды полиморфизма могут даже располагаться на некотором расстоянии от гена-кандидата. В этом случае полиморфный: участок рассматривается ■ лишь как удобный генетический маркер, который, по-видимому, физически сцеплен с каким-то другим полиморфным участком, пока не идентифицированным, но имеющим свою функциональную, т.е. фенотипическую (признаковую) выраженность.

Различают три варианта полиморфных участков ДНК.

1. Полиморфные мини- и микросателлитные последовательности ДНК;

2. Однонуклеотидные полиморфизмы (замена одного t нуклеотида другим), приводящие к появлению полиморфных сайтов узнавания рестриктаз или к аминокислотной замене в полипептидной цепи продукта;

3. Полиморфизм типа "вставка/отсутствие вставки" (insertion/deletion, I/D).

Микро- и минисателлитные последовательности представляют собой многочисленную группу рассеянных по всему геному относительно коротких тандемных повторов. Микросателлиты — это класс нуклеотидных повторов, включающих от двух до пяти звеньев. Размер повторяющихся единиц; в минисателлитных последовательностях может изменяться от 6 до 70 нуклеотидов. Отличительной особенностью микро- и ми-нисателлитов! является наличие среди; них: большого количества участков, вариабельных по числу копий в кластере.

Вариабельные: микро- и минисателлитные повторы. являются * чрезвычайно информативными системами. Это связано с тем, что они, как правило, состоят из большого количества аллелей с уровнем гетерозиготности, достигающим 70-90%.

Количество ' высокоизменчивых микро- и» минисателлитных последовательностей в геноме человека, по-видимому, превышает несколько десятков тысяч; они достаточно плотно и равномерно расположены на каждой из хромосом. Так, более 90% из 5000 идентифицированных повторов (С-А)„ являются полиморфными,. причем в большинстве из них уровень гетерозиготности значительно превышает 50% [277].

Микросателлиты, или STR (short tandem repeats), стабильно наследуются и также обладают высоким уровнем полиморфизма, исходя из числа «коровых» единиц. Подобно другим повторам,- STR обычно встречаются в некодирующих. частях генов, однако, изменение числа этих повторов в сторону их увеличения может приводить к нарушению функции генов вплоть до полного блока экспрессии и быть причиной ряда тяжелых наследственных заболеваний.

К гипервариабельным; минисателлитным последовательностям относят варьирующие по числу тандемные повторы — VNTR (variable number of tandem repeats). Общее число высокополиморфных минисателлитных последовательностей в геноме превышает 1500 [41]. С помощью ДНК-зондов, сконструированных на основе тандемно повторяющихся I "коровых" последовательностей; можно анализировать индивидуальную изменчивость в единичных или множественных высокополиморфных локусах, несущих однотипную "коровую" последовательность.

Примером (VNTR может служить полиморфизм в 4-ом интроне гена эндотели-альной NO-синтетазы — минисателлит, аллели < которого содержат либо четыре, либо пять 27-членных повторов.

Однонуклеотидные полиморфные участки могут быть локализованы как в некодирующих (интроны, промоторные и регуляторные участки), так и в кодирующих областях генов: Подобный полиморфизм в некодирующих областях гена проявляет себя t как нейтральная мутация, т.е. представляет собой такой полиморфный вариант, нуклео-тидной последовательности гена, который не приводит к заметному нарушению функции, определяемой продуктом этого гена. Наличие полиморфных сайтов рестрикции в регуляторных и промоторных областях сопровождается количественными изменениями соответствующего продукта гена, не затрагивающими структуру и функциональную активность белка. Проявление мутации, в конечном счете, определяется пороговым уровнем концентрации белка, при котором его функция еще сохранена; Наличие нук-леотидной замены в кодирующей части гена довольно часто приводит к аминокислотным заменам в полипептидной цепи белка и может влиять на функциональную активность продукта:

Полиморфизмы типа вставка/отсутствие вставки (I/D) наблюдаются как в межгенных областях, так и внутри генов. Полиморфные участки, возникающие в результате вставок и делеций; встречаются гораздо реже нуклеотидных замен. Как правило, они локализованы вне кодирующих областей генов. Размеры вставок могут сильно различаться (от одного до нескольких десятков нуклеотидов). Примером крупноразмерной вставки может послужить наличие элемента AIu длиной 287 п.н. в 16-м интроне гена ангиотензин!-превращающего фермента {АСЕ) [199]. Изредка'полиморфизм типа //£> встречается в кодирующих областях. Так, в участке, кодирующем сигнальный пептид гена аполипопротеина В (ароВ) варьирует вставка из 9 п.н, приводящая к существованию молекулярных вариантов ароВ с лидерным пептидом длиной 24 или 27 аминокислотных остатков [219].

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является наиболее оптимальным методом идентификации полиморфных маркеров,; использующихся при изучении их ассоциации с конкретными заболеваниями.

ПЦР представляет собой методг амплификации ДНК, заключающийся в многократном умножении специфического участка ДНК,. ограниченного ■ парой праймеров, комплементарных его последовательности < в условиях in; vitro с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. Эффективность данного подхода мало зависит от количества'и, в существенной мере, , независима от качества анализируемой ДНК. Метод впервые использовали в 1985 г. для амплифицикации фрагмента р-глобинового гена человека [211].

Типичная ПЦР представляет собой непрерывный трехступенчатый процесс, повторяемый в каждом цикле и, состоящий * из денатурации ДНК, отжига праймеров и; синтеза новой цепи. На первой стадии каждого цикла при 90-95°С происходит разделение цепей ДНК, затем при 45-65°С (в зависимости от используемой пары праймеров) — присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным : последовательностям^ на ДНК-мишени. Синтез новых цепей ДНК осуществляется термостабильной. ДНК-полимеразой из свободных dNTPs путем достраивания присоединившихся праймеров в направлении 5 '->3как; правило, при температуре 70-72°С. Обычно за 25-40 циклов амплификации можно синтезировать ДНК в количестве, достаточном для последующего анализа. Чувствительность метода позволяет анализировать минимальные количества ДНК, сравнимые с ее количеством в одной клетке [132].

После амплификации продукты ПЦР анализируют рядом способов. Их электро-форетически • разделяют в агарозном или полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием или азотнокислым серебром для визуализации полос ДНК. При этом окраска препаратами серебра является более чувствительным методом, чем использование бромистого этидия, т. к. позволяет обнаружить до 10 нг ДНК. Еще один вид анализа; однонуклеотидных полиморфизмов носит сокращенное название ПЦР-ПДРФ (ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов). В этом случае амплифицированный продукт расщепляют соответсвующей рестриктазой. Если полиморфизм изменяет последовательность участка узнавания < рестриктазы, то фрагмент остается нерасщепленным; если полиморфизм не затрагивает данный, участок, то фермент узнает его и расщепляет ДНК. Примером такого анализа может служить детекция < полиморфизма 7774М (замена треонина на метионин) гена ангиотензиногена,- выявляемого с помощью рестриктазы Ncol, либо определение полиморфизма.С677Т (замена аланина на валин в 677-м положении) гена метилентетрагидрофолатредуктазы с помощью рестриктазы Hinfl. Полиморфизм типа I/D определяют по разнице длин амплифи-цированных фрагментов: аллель /, содержащий-вставку будет превышать по размеру аллель!).

Если полиморфизм не создает и не разрушает сайтов опознавания рестриктаз, то такие сайты могут быть созданы искусственно путем внесения отдельных изменений в последовательность праймеров. Для этого амплифицируемый участок ДНК. выбирают таким образом, чтобы 3'- конец одного из праймеров непосредственно примыкал к полиморфному участку. В этом праймере изменяют один из нуклеотидов на 3 - конце так,, чтобы в сочетании с нуклеотидом полиморфного участка в этом месте образовывался сайт.рестрикции для какой-нибудь рестриктазы [57, 164]. Этот метод был использован в данной работе для идентификации аллелей полиморфного маркера М235Т в гене ангиотензиногена, когда в обратный праймер была введена нуклеотидная замена для создания искусственного участка узнавания для рестриктазы SfaNL

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Бабунова, Надежда Борисовна

5. ВЫВОДЫ

1. Изучено • распределение аллелей полиморфных: маркеров: 77 74М и М235Т гена<ан-гиотензиногена, А1166С и A(-153)G гена рецептора ангиотензина II .типа 1, С677Т и А1298С гена метилентетрагидрофолат-редуктазы в группах; больных- ишемической < болезнью сердца и инфарктом; миокарда, гипертонией при сахарном; диабете 2-го типа, а также в группе здоровых индивидов среди русских г. Москвы.

2. Для полиморфных маркеров 7774М и М235Т гена ангиотензиногена - не показано ассоциации с сердечно-сосудистыми патологиями.

3. Полиморфный маркер All ббС гена рецептора ангиотензина II типа 1 ассоциирован с гипертонией при сахарном диабете 2-го типа. Факторами риска развития данной патологии является носительство аллеля А и гомозиготного генотипа АА, в то время. как аллель С и гомозиготность по данному аллелю связаны с пониженным риском, развития заболевания. С ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда данный полиморфный маркер не ассоциирован.

4. Для полиморфного маркера A(-153)G гена рецептора ангиотензина II типа» 1 обнаружена ассоциация с ишемической болезнью сердца и гипертонией при сахарном диабете типа 2 у русских пациентов г. Москвы. Генетическим; маркером повышенного риска развития данных заболеваний является аллель G, тогда как аллель А и генотип АА, напротив, являются маркерами предохраняете действия. С развитием инфаркта миокарда у больных ишемической болезнью, сердца данный■ маркер не ассоциирован.

5. Полиморфный маркер С677Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы не ассоциирован с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

6. Для полиморфного маркера А1298С гена метилентетрагидрофолат-редуктазы показана ассоциация с ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда. Установлено, .что?носительство аллеля\С и;гомозиготного генотипа.СС предрасполагает,к развитию ишемической: болезни сердца у русских пациентов г. Москвы. Аллель А является защитным аллелем. При ишемической болезни сердца, отягощенной сахарным диабетом типа 2, риск развития ИБС повышен у пациентов; в геноме, которых, присутствует аллель С. Вероятность развития , ИМ, также значительно возрастает в группе больных ишемической болезнью сердца, гомозиготных по аллелю С.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бабунова, Надежда Борисовна, Москва

1. Anvari A., Schuster E., Gottsauner- Wolf M., Wojta J., Huber K. PAI-I 4G/5G polymorphism and sudden cardiac death in patients with coronary artery disease // Thromb Res. 2001.Vol.l03(2). P. 103-107.

2. Aoki S„ Mukae S., Itoh S„ Sato R., Nishio K., Ueda H„ Iwata Т., Katagiri T. Genetic background in patients with acute myocardial infarction // Jpn Heart J. 2001. Vol. 42(1). P. 15-28.

3. Bai H., Saku К., Jimi S. Angiotensin II type lreceptor gene polymorphisms in both hypertensives and coronary heart disease patients // Abstracts 16 th Sci. Meeting In-ternat. Soc: Hypertension. Glasgow, UK, 1996. Abstract P70.0157.

4. Benetos A., Topouchian J.', Ricard S. Influence of angiotensin. II type 1 receptor, polymorphism on aortic stifness in never-treated hypertensive patients // Hypertension. 1995. Vol. 26. P. 44-47.

5. Bengtsson K., Orho-Melander M:, Melander O:, Lindblad U., Ranstam J., Rastam L., Groop L. Beta(2)-adrenergic receptor gene variation and hypertension insubjects with type 2 diabetes // Hypertension. 2001; Vol. 37(5). P. 1303-1308.

6. Berliner J. A., Heinecke J. W. The role of oxidized lipo-proteinsin atherogenesis // Free Radic Biol Med. 1996. Vol. 20. P. 707-727.

7. Boers G. H., Smals A. G., Trijbels.F. J. et al. Heterozygosity for homocystinuria in premature peripheral and cerebral occlusive arterial disease // N. Engl. J. Med. 1985. Vol. 313. P; 709-715.

8. Boulanger С. M., Tanner F. С., Bea M. L. Oxidised low density lipoproteins induce, mRNA expression and release of endothelin from human and porcine endothelium // Circulation Res. 1992. Vol. 70. P: 1191-1197.

9. Brattstrom L., Wilcken D. E., Ohrvik J., Brudin L. Common methylenetetrahydro-folate reductase gene mutation leads to hyperhomocysteinemia but not to vascular disease: the result of a meta-analysis // Circulation. 1998. Vol. 98(23). P. 2520-2526.

10. Brown D. L., Gorin M. Bj, Weeks D. E. Efficient strategies for genomic searching using the affected-pedigree-member, method of linkage analysis // Am. J. Hum. Genet 1994: Vol: 54. P. 544-552.

11. Buraczynska M., Ksiazek P., Lopatynski J., Spasiewicz D., Nowicka Т., Ksiazek A. Association of the renin-angiotensin system gene polymorphism with nephropathy in type II diabetes // Pol Arch Med Wewn. 2002. Vol. 108(2). P. 725-730.

12. Buraczynska M.; Ksiazek P. , ZaluskaW., Spasiewicz D:, Nowicka Т., Ksiazek A: Angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism in end-stage renal disease // Nephron. 2002. Vol. 92(1). P. 51-55.

13. Buraczynska M:, Pijanowski Z., Spasiewicz D., Nowicka T., Sodolski T., Widomska — Czekajska Т., Ksiazek A. Renin-angiotensin system gene polymorphisms: assessment of the risk of coronary heart disease // Kardiol Pol: 2003. Vol. 58(1). P; 1-9.

14. Bydlowski S. P. , Novak E. M., Issa J. S., FortiN., Giannini S. D., Diament J. DNA polymorphisms of apolipoprotein В and AI-CII-AIV genes in a Brazilian population: a preliminary report // Braz J Med Biol Res. 1996. Vol. 29(10). P. 1269-1274.

15. Canavy I., Henry M:, Morange P. E„ Tiret L., Poirier O., Ebagosti A:, Bory M„ Julian- Vague I. Genetic polymorphisms l and coronary artery disease in the south of France // Thromb Haemost. 2000. Vol. 83(2). P. 212-216.

16. Carter A. M:, Mansfield M. W., Stickland M. H., Grant P. J.Beta-fibrinogen gene-455 G/A polymorphism and fibrinogen levels. Risk factors for coronary artery disease in subjects withNIDDM // Diabetes Care. 1996: Vol; 19(11). P. 1265-1268.

17. Caulfield M„ Lavender P., Farral M:, Munroe P:, Law son M., Turner P., Clark A. J. Linkage of the angiotensinogen gene to essential hypertension // New Engl. J. Med; 1994. Vol. 330(23). P. 1629-1633.

18. Charlesworth C., Sniegovski P., Stephan W. The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes // Nature. 1994. Vol. 371. P. 215-220:

19. Chen D., Zhang M., Fan W„ Shi H., Li Y., Chen Q., Zhang J., Gu X. A molecular variant of angiotensinogen gene is associated with myocardial infarction in Chinese // Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 1998. Vol. 10;15(3). P. 133-135.

20. Chistiakov D. A., Kobalova Zh. D., Tereshchenko S. N., Moiseev S. V., Nosikov V. V. Polymorphism of vascular angiotensin II receptor gene and cardiovascular disorders //Ter.Arkh. 2000. Vol. 72(4). P. 27-30.

21. Chistiakov D. A., voron'ko О. E., Savost'ianov К. V., Minushkina L. О. Ро1утофЬ1с markers of endothelial NO-synthase and angiotensin II vascular receptor genes and * predisposition to ischemic heart disease// Genetika. 2000. Vol. 36(12). P. 1707-1711.

22. Cong N. D., Hamaguchi K., Saikawa T., Нага M., Sakata T. A polymorphism of angiotensinogen gene codon 174 and coronary artery disease in Japanese subjects // Am. J. Med. Sci. 1998. Vol; 316. P. 339-344.

23. Eiken H.G., OdlandE., Boman H//NAR. 1991. Vol. 19(7). P. 1427-1430;

24. Fatini C., Abbate R., Pepe G„ Battaglini В., Gensini F., Ruggiano G., Gensini G. F., Guazzelli R; Searching for a better assessment of the individual coronary risk profile.

25. The role of angiotensin-converting enzyme, angiotensin II type 1 receptor and angio-tensinogen gene polymorphisms // Eur Heart J. 2000. Vol. 21(8). 633-638.

26. Fernandez-Llama P., Poch E., Oriola J., Botey A:, de la Sierra A.,.Revert L., Rivera F., Darnell A. Genetic polymorphisms of the renin-angiotensin system and essential hypertension//Med. Clin. (Bare). 1999. Vol. 1;112(15). P. 561-564.

27. Fogarty D. G., HarronJ. C., Hughes A: E., Nevin N. C., Doherty С. C., Maxwell A. P. A molecular variant of angiotensinogen is associated with diabetic nephropathy in IDDM // Diabetes, 1996. Vol. 45(9). P. 1204-1209.

28. Folsom A. R., Aleksic N., Ahn C., Boerwinkle E., Wu К. K. Beta-fibrinogen gene — 455G/A polymorphism and coronary heart disease incidence: the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study // Ann Epidemiol 2001. Vol. 11(3),P. 166-170.

29. Fornage M, Turner S. Т., Sing C. F., Boerwinkle E. Variation at the M235T locus of the angiotensinogen gene and essential hypertension: a population-based case-control study from Rochester, Minnesota // Hum. Genet. 1995. Vol. 96(3). P. 295-301.

30. Frosst P., Blom H'J.Milos R„ Goyette P., Sheppard C. A:, Matthews R. G., Boers

31. G.J.H., M.den Heijer, Kluijtmans L. A. J., van den Heuvel L. P. & Rozen R. A candidate genetik risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase // Genetics Volume. 1995. Vol. 10. P. 111-113.

32. Gambino R., Scaglione L., Alemanno N. Pagano G., Cassader M. Human lipoprotein lipase Hindlll polymorphism in young patients with myocardial infarction // Metabolism. 1999.'Vol. 48. P. 1157-1161.

33. Gardemann A., Strieker J;, HummeJ., Nguyen Q. D., KatzN., Philipp M., Tillmanns

34. H., Hehrlein F. W., Haberbosch W. Angiotensinogen Т174M and M235T gene polymorphisms are associated with the extent of coronary atherosclerosis // Atherosclerosis. 1999. Vol. 145. P. 309-314.

35. Glisic S„ PrljicJ., Radovanovic N., Alavantic D. Study of apoB gene signal peptide insertion/deletion polymorphism in a healthy Serbian population: no association with serum lipid levels // Clin Chim Acta. 1997. Vol. 263(1). P. 57-65.

36. Goracy L, Goracy J., Suliga M., Ciechanowicz A. C677T gene polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) in patients with myocardial infarction // Pol Arch Med Wewn. 1999. Vol: 102(4). P. 849-854.

37. Goracy I. Polymorphism of genes coding for angiotensin I converting enzyme and methylenetetrahydrofolate reductase in. patients with ischemic heart disease //Ann Acad Med Stetin. 2000: Vol. 46. P. 97-108.

38. Guan L., Zhang A:, Song B.', Xiao S., Gao Y. The relationship between angiotensino-gen gene CD235 met—>Thr substitution polymorphism and brain infarction in Chinese // Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 2000. Vol. 17(5). P: 336-339:

39. Gulec S., Aras O., Akar E, Tutar.E., OmurluK, Avci F., Dincer /., Akar N., Oral D. Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism and risk of premature myocardial infarction // Clin Cardiol. 2001; Vol. 24(4). P. 281-284:

40. Hegele RjA., Huang L. S, Herbert P. N. Blum С. В., BuringJE., Henneken С. H., Breslow J. L. Apolipoprotein B-gene DNA polymorphisms associated with myocardial infarction//N. Engl. J; Med. 1996. V. 315. P. 1509-1515.

41. Heinecke J. W., Lusis A. J. Paraoxonase -gene polymor-phisms associated with coronary heart disease: Support forthe oxidative damage hypothesis? // Am J Hum Genet. 1998. Vol. 62. P. 20-24.

42. Hingorani A. D., Sharma P., Jia H. Blood pressure and ро1утофЫзт5 in the angiotensin converting enzyme and angiotensin 1Г receptor gene // Abstracts 16 th Sci. Meeting Intemat. Soc. Hypertension: Glasgow, UK, 1996. Abstract PI02." 1667.

43. Hong S. H:, Lee C. C., Kim J. Q. Genetic variation of the apolipoprotein В gene in Korean patients with coronary artery disease // Mol Cells. .1997. Vol. 7(4). P. 521525.

44. Ichihara S:, Yamada.Y., Fujimura Т., Nakashima N., Yokota M. Association of a polymorphism of the endothelial constitutive nitric oxide synthase gene with myocardial infarction in the Japanese population // Am. J. Cardiol. 1998. Vol. 81. P. 83-86.

45. James R. W., Leviev I., Ruiz J., Passa P., Froguel P., Garin M. C. Promoter polymorphism T(-107)C of the paraoxonase PON 1 gene is a risk factor for coronary heart disease in type 2 diabetic patients // Diabetes. 2000 Vol. 49(8). P. 1390-1393.

46. Jeunemaitre X.,.Gimenez-Roqueplo A. P., Celerier J., Corvol P. Angiotensinogen variants and human hypertension // Curr Hypertens Rep. 1999. Vol. 1(1). P. 31-41.

47. Jiang Z., Zhao W., Yu F., Xu G. Association of angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism with essential hypertension // Chin Med J (Engl). 2001. Vol. 114(12). P. 1249-125U.

48. Katsuya T., Koike G., Yee T. W., Sharpe N., Jackson R, Norton R., Horiuchi M„ Pratt R. E., D?au V.J., MacMahon S. Association of angiotensinogen gene T235 variant with increased risk of coronary heart disease // Lancet. 1995. Vol. 345. P. 1600-1603;

49. Kishimoto T., Suyama A:, Igarashi A., Osaki:Y., Okamoto M.Yamamoto Т., Nanba> E., Kurosawa Y;, Fukumoto S. Angiotensinogen gene variation and hypertension in a cohort study, in Japanese // J Epidemiol. 2001. Vol. 11(3). P. 115-119:

50. Y12.Klerk M., Verhoef P., Clarke R., Blom H. J., Кок F. J., Schouten E. G. MTHFR Studies Collaboration Group. MTHFR' 677C—>T polymorphism and risk of coronary heart disease: a meta-analysis // JAMA. 2002. Vol: 288(16). P. 2023-2031.

51. Lacquemant C., Lepretre F., Pineda Torra L. Manraj M., Charpentier G., Ruiz J„ Staels В., Froguel P. Mutation screening of the PPARalpha gene in type 2 diabetes» associated with coronary heart disease // Diabetes Metab. 2000. Vol. 26(5). P. 393401.

52. Z/ H., Gyllensten U. Bi, GuiX., Saiki P. K, Erlich H. A., Arncheim N. Amplification and) analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells // Nature. 1988. Vol. 335. P. 414-417.

53. Li X, WangL., Han X. Association between angiotensin system gene polymorphism and essential hypertension // Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 2001.Vol . 18(4). P; 292-295.,

54. LIX.-M., Wei Y.-F., Hao H.-L., Hao Y.-B., He L.-S., Li J.-D., Mei B., Wang S.-Y., Wang C., Wang, J.-X, Zhu J.-Z., Liang J.-Q: Hyperhomocysteinemia and-the MTHFR C677T mutation in Budd-Chiari syndrome // Am. J; Hemat 2002. Vol. 71. P. 11-14.

55. Malik N. M., Syrris P., Schwartzman R., Kaski J. C., Crossman D. C., Francis S. E., Carter N. D., Jeffery S. Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism (C-677T) and coronary artery disease // Clin Sci (Lond). 1998. Vol. 95(3). P. 311-315.

56. Miettinen H. E:, Korpela K, Hamalainen LI, Kontula К. Polynunphisms of the apol-ipoprotein f and ■ angiotensin converting enzyme genes in young North Karelian patients with coronary heart disease // Hum Genet 1994: Vol. 94(2). P. 189-192.

57. Mills J. L., Kirke P. N., Molloy Al M., Burke H„ Conley M. R., Lee Y. J., Mayne P: D., Weir D. G., Scott J. M Methylenetetrahydrofolate reductase thermolabile variant and oral clefts // Am. J. Med. Genet 1999. Vol. 86. P. 71-74.

58. Miyamoto Y., Yoshimasa Т., Itoh H. Association of angiotensin II type 1 receptor gene polymorfism t with essential hypertension in Japanese // Abstracts 16 th < Sci. Meeting Intemat. Soc. Hypertension. Glasgow, UK, 1996. Abstract Р84.123Г.

59. MorrisB. J., Glenn C.L., Wilcken D.E„ WangX. L. Influence of an inducible nitric oxide synthase promoter variant on clinical variables in patients with coronary artery disease // Clin Sci (Lond). 2001. Vol. 100(5). P. 551-556.

60. Morris B. J. Insulin receptor gene in hypertension // Clin Exp Hypertens. 1997. Vol. 19(5-6). P. 551-565:

61. Mukherjee M.; Joshi S., Bagadi S., Dalvi M. , Rao A., Shetty K. R: A low prevalence of the C677T mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene in Asian Indians // Clin Genet. 2002. Vol. 61(2). P. 155-159.

62. Nikpoor. В., Turecki G., Fournier C., Theroux PJ, Rouleau G. A; A functional myeloperoxidase polymorphic variant is associated with coronary artery disease in French-Canadians // Am Heart J. 2001. Vol. 142(2). P. 336-339.

63. HA.Ortlepp J R., Lauscher J., Hoffmann R., Hanrath P., Joost H. G. The vitamin D receptor gene variant is associated with the prevalence of type 2 diabetes mellitus and coronary, artery disease // Diabet Med. 2001; Vol. 18(10). P. 842-845.

64. Osei-Hyiaman D., Hou L., Mengbai F:, Zhiyin R., Zhiming Z, Капо K. Coronary artery disease risk in Chinese type 2 diabetics: is there a role for paraxonase 1 gene (Q192R) ро1утофЫзт? // Eur J Endocrinol. 2001. Vol. 144(6). P. 639-644.

65. ПЪ.РапаМоо A., Andresi C., Mohamed-Ali; V., Gould M. M, Talmud P., Humphries S. E„ Yudkin J. S. The insertion allele of the ACE gene I/D polymorphism. A candidate gene for insulin resistance? // Circulation. 1995. Vol. 15;92(12).P: 3390-3393:

66. Petrovic D., Zorc M., Kanic V., Peterlin B. Interaction between gene polymorphisms, of renin-angiotensin system and i metabolic risk factors in premature myocardial infarction // Angiology. 2001. Vol. 52(4). P. 247-252.

67. Ш.Petrovic A, Zorc M., Keber. /., Peterlin BI Joint effect of G1691A factor V point mutation and factor VII Arg/Gln(353) gene polymorphism on the risk of premature: coronary artery disease // Ann Genet. 2001,Vol. 44(1). P. 33-36.

68. Petrovic D., Zorc M., Peterlin B. Effect of apolipoprotein E polymorphism and apolipoprotein- A-l gene promoter polymorphism on lipid? parameters and t premature coronary artery disease // Folia Biol (Krakow). 2000: Vol: 46(5). P. 181-185.

69. PfohlM., Koch M., Enderle M. D., Kuhn Rl, Fullhase J, Karsch К R:, Haring H. U. Paraoxonase 192 Gln/Arg gene polymorphism, coronary artery disease, and myocardial infarction in type 2 diabetes // Diabetes. 1999. Vol. 48(3). P. 623-627.

70. Puzniak A., Dzida G., Sobstyl J., Bilan Al, Hanzlik J. Angiotensin converting enzyme gene polymorphism in type 2 diabetes mellitus // Pol Arch Med Wewn. 1999. Vol. 102(2). P. 685-690.

71. Rassoul F„ Richter V. V., Kuntze Т., Mohr F. W„ Geisel J., Herrmann W. Genetic Polymorphism of Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) and Coronary Artery Disease // INTERNATIONAL JOURNAL OF ANGIOLOGY. 2000. Vol. 9(4). P. 205-207.

72. Reguero J. R., Cubero G. I., Batalla A:, Alvarez V., Hevia S„ Cortina A., Coto E. Apolipoprotein A1 gene polymorphisms and risk of early coronary disease // Cardiology. 1998. Vol. 90. P. 231-235.

73. Reinhardt D., Sigusch Я. H., Vogt S. F., Zeiss С., Farker K., Hoffmann A., Muller S. A common variant of the angiotensinogen gene and the risk of coronary artery disease in a German population // Pharmazie. 2000. Vol. 55. PJ 69-71.

74. V.Ringel J., Kreutz R„ Distler A:, Sharma A. M. The Trp64Arg polymorphism of the beta3 -adrenergic receptor gene is associated; with hypertension in men with type 2 diabetes mellitus // Am J Hypertens. 2000. Vol. 13(9). P. 1027-1031.

75. Rong J. X., Rangaswamy S., Shen L. et a/. Arterial:injury by cholesterol oxidation products causes endothelial dysfunction and arterial wall cho-lesterol accumulation // Arterioscler Thromb Vase Biol. 1998. Vol. 18. P. 1885-1894:

76. Rutledge D. R:, Browse S. E., RossC. A: Friquencies of the angiotensinogen gene; and angiotensin I converting enzyme (ACE) gene polymorphisms in African Americans // Biochem: Mol: Biol. Int. 1994. V. 34(6). P. 1271-1275;

77. Schmidt S., Beige J., Walla-Friedel M„ Michel M. C., SharmaA. M., Ritz E. A polymorphism in the gene for the angiotensin II type 1 receptor is not associated with hypertension//J Hypertens. 1997. Vol. 15(12 Pt 1). P. 1385-1388.

78. SchmitzC., Lindpaintner K,, Verhoef P., Gaziano J. M., Buring J. Genetic polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase and myocardial infarction, A case-control study // Circulation. 1996. Vol: 94(8). P. 1812-1814.

79. Schonfeld G. Genetic variation of apolipoprotein В can produce both low and high levels of apoB-containing lipoproteins in plasma // Can. J, Cardiol. 1995. Vol: 11. Suppl. G. P. 85G-92G.

80. Seremak-Mrozikiewicz A., Drews К., Chmara E„ Mrozikiewicz P. M, Slomko Z. Gestational hypertension (GH) and al 166c polymorphism of angiotensin II type 1 receptor // Ginekol Pol. 2000. Vol. 71(8). P. 783-788.

81. Serrato M., Marian A J. A variant of human paraoxonase/arylesterase (HUMPONA); gene is a risk factor for coronary artery disease // J. Clin. Invest. 1995. Vol; 96. P. 3005-3008.

82. Shaw G. M, RozenR., Finnell R. Щ TodoroffK., Lammer E. J. Infant C677T mutation in MTHFR, maternal periconceptional vitamin use, and cleft lip // Am. J. Med. Genet. 1998. Vol. 80. P. 196-198;

83. Sierra C., Coca A., Gomez-Angelats E., Poch E., Sobrino J., de la Sierra A. Renin-angiotensin system genetic polymorphisms and cerebral white matter lesions ■■ in essential hypertension // Hypertension. 2002. Vol. 39(2 Pt 2). P; 343-347.

84. Sohda S„ Arinami T:, Hamada H., Yamada N., Hamaguchi H., Kubo T. Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism and pre-eclampsia // J. Med. Genet. ,1997. Vol. 34. P. 525-526.

85. Stankovic A , Zivkovic M., Glisic S., Alavantic D. Angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism and; essential hypertension. in Serbian s population ? // Clin; Chim Acta. 2003 Vol. 327(1-2). P. 181-185.

86. Steinberg D., Witztum J. L. Lipoproteins and atherogenesis // JAMA. 1990. Vol. 264(23). P. 3047-3052.

87. Stevenson R. E., Schwartz С. E., Du Y.-Z., Adams M. J., Jr. Differences in methylenetetrahydrofolate reductase genotype frequencies, between whites and blacks. (Letter) // Am. J. Hum. Genet 1997. Vol. 60. P. 229-230.

88. StuppiaL., Gatta V., Gaspari A. R., Antonucci L, Morizio E:, Calabrese G., PalkaG. C677T mutation in the 5,10-MTHFR gene and risk of Down syndrome in Italy // Eu-rop. J. Hum. Genet 2002. Vol. 10. P. 388-390;

89. Tabara Y, Kohara K., Nakura J., Miki T. Risk factor-gene interaction in? carotid atherosclerosis: effect of gene polymorphisms of renin-angiotensin system // J Hum Genet. 2001. Vol. 46(5). P. 278-284:

90. Thomas G. N., Young R. P., Tomlinson В., Woo K. S„ Sanderson J. E., Critchley J. A. Renin-angiotensin-aldosterone system gene polymorphisms and hypertension in Hong Kong Chinese // Clin Exp Hypertens. 2000. Vol. 22(1). P. 87-97.

91. Tiret L. Deletion polymorphism in angiotensin-converting enzyme gene associated with parental history of myocardial infarction // Lancet. 1993. Vol. 343. P. 1991-1992.

92. Todesco L., Angst C., Litynski P., Loehrer F., Fowler В., Haefeli W. E. Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism, plasma homocysteine and age // Eur J Clin Invest. 1999. Vol. 29(12). P. 1003-1009.

93. Tsai С. Т., Fall in D., Chiang F. Т., Hwang J. J., Lai L. P., HsuKL., Tseng C. D., Liau C. S., Tseng Y.Z. Angiotensinogen gene haplotype and hypertension: interaction with ACE gene I allele // Hypertension: 2003. Vol. 41(1). P; 9-15.

94. Wang W. Y., Zee R. Y„ Morris B.J. Association of angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism with essential hypertension // Clin Genet. 1997. Vol. 51(1). P. 31-34:

95. Wang X, Gu D:, Sun F„ Wu X, Yu Q., Jia X, Zhao J., Chen ■ Y. Study on the relationship between, methylenetetrahydrofolate reductase gene C677T mutation and coronary heart disease // Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 2001: Vol. 18(3). P. 206-208.

96. Warner D., Mansfield M. W., Grant P. J. Coagulation factor XIII and cardiovascular disease in UK Asian patients undergoing coronary angiography // Thromb Haemost. 2001. Vol. 85(3). P. 408.

97. WeisbergJ., Tran P., Christensen В., Sibani S„ Rozen R. A second genetic polimor-phism in methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) associated with decreased enzyme activity//Mol Genet Metab. 1998. Vol. 64. P. 169-172.

98. Weissenbach J., Gyapay G., Dib C. et. al. A second-generation linkage map of the human genome // Nature. 1992. Vol. 359. P. 794-801:

99. Witztum J. L., Steinberg D. Role of oxidized low density lipoprotein in athero-genesis // J Clin Invest. 1991. Vol: 88. P; 1785-1792.

100. Wu A. H„ Tsongalis G. J. Correlation of ро1утофЫзт8 to coagulation and biochemical risk factors for cardiovascular diseases // Am J Cardiol. 2001: Vol., 87(12). P. 1361-1366.

101. Xue Y; M., Zhou L., Luo R. Correlation between angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism and type 2 diabetes mellitus complicated by hypertension // Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao. 2002. Vol. 22(5): P. 444-446:

102. Ye Q., Wu K„ Xie L., Zeng K., Lin J., Lin C. The relationship of polymorphism of angiotensinogen and angiotensin converting enzyme with essential hypertension // Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 2000. Vol. 17(1). P. 28-31.

103. Young R. P., Chan J. С., CritchleyJ: A., PoonE:, NichollsG., Cockram C. S. Angiotensinogen T235 and ACE insertion/deletion polymorphisms associated with albuminuria in Chinese type 2 diabetic patients // Diabetes Care. 1998. Vol. 21(3). P. 431-437.

104. Zeiher A. M: Endothelial vasodilator dysfunction: pathogenetic link to myocardial ischaemia or epiphenomenon // Lancet. 1996. Vol. 348. P. 10-12.

105. Zeiher A: M. Fisslthaler В., Schray-Utz В., Busse R. Nitric oxide modulates the expression of monocyte chemoattractant protein 1 in cultured human endothelial cells // Circ Res. 1995. Vol. 76. P. 980-986.

106. Zhang G., Dai C. Gene polymorphisms of homocysteine metabolism-related' enzymes in Chinese patients with occlusive coronary artery or cerebral'vascular diseases // Thromb Res: 2001. Vol. 104(3). P. 187-195.

107. Zhang G., Dai C. Correlation» analysis.between plasma homocysteine level and polymorphism of homocysteine metabolism related enzymes in ischemic cerebrovascular or cardiovascular diseases // Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2002. Vol; 23(3). P. 126-129.

108. Zheng Y.Z., Tong J., Do X. P., Pu X. Q., Zhou В. T. Prevalence of methylenetetrahydrofolate reductase C677T and its association with arterial and venous thrombosis in the Chinese population // Br J Haematol 2000. Vol; Vol: 109(4). P. 870-874.

109. Дедов И. И., Шестакова М. В: Сахарный диабет. Руководство для врачей // Универсум Паблишинг. Москва. 2003.

110. Ъ02.Спиридонова М.'Г., Степанов В. А. Анализ взаимосвязи полиморфизма С677Т гена метилентетрагидрофолат-редуктазы с клиническими проявлениями коронарного атеросклероза//Генетика. 2000. Том 36. С. 1269-1273.

111. Спиродонова М. Г., Степанов В: А;, Пузырев В. П., Косянкова Т. В., Карпов Р: С. Связь полиморфного варианта Т174М гена ангиотензиногена с коронарным ; атеросклерозом в томской популяции // Молекуляр. биология. 2001. Том 35. С. 14-18.

112. Чистяков Д. А., Туракулов Р. И. Генетические маркеры гипертонической болезни // Генетика. 1999. Том 35. С. 565-573.

113. Чистяков Д. А., Туракулов Р. И. Полиморфизм 77 74М гена ангиотензиногена и сердечно-сосудистые болезни в московской популяции // Генетика. 1999. Том 35. С. 1160-1164.

114. Шулутко Б. И., Макаренко С. В: Ишемическая болезнь сердца // Ренкор. Санкт-Петербург. 1998: