Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение антимутагенной активности ряда ингибиторов свободно-радикальной реакций при спонтанном и химическом мутагенезе

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение антимутагенной активности ряда ингибиторов свободно-радикальной реакций при спонтанном и химическом мутагенезе"

АКАДЕМИЯ НАУК АЗЕРБАЙДЖАНСКОЙ РЕСПУБЛИКИ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ

На правах рукописи

ЗЕЙНАЛОВ АГИБАТ ГУСЕЙ» оглы

ИЗУЧЕНИЕ АНТИМУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ РЯДА ИНГИБИТОРОВ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫХ РЕАКЦИИ ПРИ СПОНТАННОМ И ХИМИЧ ЕС КОМ МУТАГЕНЕЗЕ

(03. 00. 15 —Генетика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации иг соискание ученой степени кандидата биологических наук

БАКУ—1992

Работа выполнена в Азербайджанском Педагогическом Университете 'имени Н- Туси.

Научные руководители:

доктор химических наук, А. М. СЕРЕБРЯНЫЙ доктор биологических наук, профессор« М- Ш. БАБАЕВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И. М. АХУНД-ЗАДО доктор биологических наук, Р. А- АГАБЕЙЛИ

Ведущее учреждение!

Институт Обшей генетики РАН.

Защита диссертации состоится « » и&МК 1992 г. в « » часов на заседании Специализированного совета Д. 004.20. 01 по присуждению ученой степени доктора биочо-гнчсских наук в Институте генетики и селекции АН Азербайджанской Республики (370105, г. Баку, пр. Азадлыг, 155) -

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института генетики и селекции АН Азербайджанской Республики.

Автореферат разослан «

Учгный секретарь Специализированного совета доктор биолггнчсских наук

А. А/ АЛИЕВ

СБЭАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы, з условиях постоянно усиливающегося загрязнения окружающей среди иутэгеннымн к см депонтами различно;! физико-химической и биологической природы, все больнее внимание исследователей привлекает проблещи сохранения и защиты генофонда всех насзлязцих блссферу б:л -логических видов. Несомненно, что оетение этой проблема находится в тесной взаимосвязи с все возрастающими усилиями по охране окру^апдай среды, направленными на максимальное сокращение до полной ликвидации .содержащихся в ней мутагенов. Однако, огром-лое количество существующих и привносимых з -биосферу мутагенных компонентовг- нерешенность задач создания про« игле пеых предприятий с замкнутым экологическим циклом, з тз:с-:е копре-дотврэтимость на сегодняшний день поступления з охрулайщуэ среду таких мутагенов, как пестициды, продукты сгорзнпя топлива и т.д., отдаляет резание указанной проблемы нэ долгие годи.

3 ьтоЯ ситуации одшнл из наиболее реальных путей синиечля ущерба от воздействия генотохсизоз является исследование ант::-мутзгеноз - веществ, способных осуществлять коррекция слснтзн-ного и индуцировззного мутагенеза и, тем самим, позызатн, устойчивость оргзнизмов к существующему урознд мутагенов в скрунап-цей среде ( иоссэ, 197А-; Алекперов,1979;?.ппе1 , А1скпег=у е* а1., 1325).

За период с момента открытия явления антимутагенезз (]1от1ск.. I БгИагй 1952) и по сегодняшний день гонозащитиыз сзойствз зарегистрированы у препаратов, относящихся к сэиш различны;! классам химических соединения и, соответственно, различающихся механизмом коррекции многоэтапного процесса возникновения мутаций (см.3асухина,1983; Аяекпероз,1934; Поропеи-^э, Абилев,1988; Алиев,1989; йе Пога,1989; НагЪааа , ЗЬапке1 .

, 1990). Поиск генозвщитных препаратов сродя ингибиторов свободнорадикзлъных процессов, изучении антимутзгенноЯ активности некоторых из которых и посвящена настоящая работа, обоснован их влиянием на процесса клеточного метаболизма, существенный образом определяющим ыутабильность клеток (Тарусой,1954; Пзг-пал ,1956; Эмануэль,1963).

Цель я задачи исследования. Целью настоящего исследования являлась комплексная оценка антиыутаганного действия ряда вновь синтезированных нитроксильных радикалов, их диамагнитных аналогов, пространственно-затрудненных фенолов - калиевой и литиевой солей фенозана, простого фенола - 5 -метилрезорцина и химически ' чистого антиоксиданта заводского производства - сантохина, а таю^е разработка методических приемов для их практического применения.

Для достижения поставленной целя в работе решались следующие основные задачи:

1. Выявить новые анткиутагеаы среди соединений, относящихся я различный классам химических веществ, и определить степень их эффективности и универсальности.

2. Дифференцировать диапазоны доз испытываемых препаратов по нрятериян их антиуутзгешшй активности и физиологичности.

3. Проанализировать зависимость антимутагенной активности препарата от его химической структуры для .нескольких классов химических соединений: нитроксильных радикалов, их диамагнитных аналогов, пространственно-затрудненных фенолов, простого фенола и гетероциклического соединен, л.

Разработать методические приемы для повышения устойчивости оргзнизмоз к мутагенам округавцей среды.

Нзучная новизна работы. Впервые установлены ан;яиутагенные свойства у ряда нитроксильных радикалов и их диамагнитных аналогов, а тэк;;е у пространственно-затрудненных фенолов - у каллезой и лит'.юеой солей фепо^на. Установлено, что, несмотря нз .. существенные различит 2 строении,соединения ряда стабильных нитроксильных радикалов и их диамагнитных аналогов являются эффективными гекозащитными препаратами, превосходящими по антиыутагснноыу потенциалу такой известный биоантиоксидант, как альфа-токоферол, хотя производные, содеркзщие цестичленныД гетеродикл, более активны, чей пятичленные.

Кроме того, на примере соединений Iii и ГУ, а токгз калиевой соли фенозана показана ранее неизвестная широкая универсальность антимутагенного действия изученных стабильных нитроксильных радикалов, ех диамагнитных аналогов а пекоторчх пространстваяно-

затрудненных фенолов, которая з условиях спонтанного и лндупя-ровэнного мутагенеза продемонстрирована на объектах с различные уровней биологической организации (клетки Е. со15, растения рзз-ншс видов, перевиваемая культура амниона клеток человека и первичная культура лимроцитов периферической крова человека), при воздействии разных химических соединения (нитрозсметиямочезинз, 4 нитрохянолин-1- оксид, пестициды граноззн и "эфир 12-19") л путем регистрации различающихся механизмом формирования клзссоь мутаций (генные и ядерные хлорофильнке мутации, аберрации хромосом, сестринские хроматидные обмены).

I

Нзучко-прзктпческсе значение работы. Открыт« 7 новых з.чти-мутзгенов, дифференцированы диапазоны их доз по критериям анти-мутагеяяой активности и ^зиологичзости, а такге рззрабстяяы методические приемы для практического применения изученных ингибиторов свободнорадикальных процессов при спонтанном чутзг.'-незе и индуцированном химическими мутагензм;:.

Установлена зависимость эффективности антацутагьнпэго дел-ствия ряда стабильных нитроксильных радикалов и диамагнитных зналогоз от.их химической структуры, что имеет большее значение для целенаправленного синтеза соединений с желаемой генетической активностью.

Апробация работы. Основные пояснения диссертации докладывались, демонстрировались и обсуждались на ЗсесоазнсЗ конференций "Биоантиоксидант" (Москва,1984-,1986), аз Всесс.озлом симпозиуме "Современные проблемы теории химического мутагенеза" (Таллин,1987) и на 7 съезде ВОГиС нм.Я.Л.Зэзилозэ (Москва,1937).

Публикации. По материалам диссертации опубликозано 7 работ.

. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, «етодоз и услсгн:! проведения экспериментов, пяти глав, поезяцеяных изло-енга результатов и их обсуждению, заключения, выводоз и списка литературы. Работа излокена на 132 страницах машинописного текста (без списка литературы), содержит 26 таблиц и 13 рисунков. Описок литературы включает 263 наименований.

- Б -

МАТЕРИАЛ Я МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Используемые з работе объекты исследования и мутагенные факторы предстазлена в таблице I.

Объекты исследования Мутагенные факторы

1. Семена лукз-бзтунз

2. Семена пзеницы

3. Семена врзбидоясяса

Клетки Е. coli 3/ti!?2 ( trp£"/

5. Хультурз клеток амнионз чзлоьекв

6. Лимфоциты периферической крови человека

В качества знтимутагеноа в работе испытаны следующие создиезн;:л (отруктуря^з формулы прздстззлеяы нз ряс.Г):

1. Стабильные нлгрсксильныа рэдикэли - 2,2,6,6 - тетрзметил--4-ке го-пяле ркдлн-1-оксилз (соединение• П); 2,2,6,6-тетраые тил--4-оксишшеридин-1-оксила(соединение 1У); 2,2,5,5- тетрамегял-З-кзрбоксипирролидин-Т-окснлз.(соединение У).

2. Дпзмагнятниз ; .¡алггя стзбильзих янтроксильных радикалов

- тслзргндрзтэ 2,2,6,6 -тетрзиетил-4-кетс-1-сксипиперид:ша (соединение I); 2,2,б,6-1етрзметил-4-окс2Пиперидина (соединение 1Ь").

3. Простой фенол-5-иетилрезорцан.

4. Пространственно-затрудненные фенолы - фенозана кислота

( - (3,5-д:!-третбутлл-4-окспфзаил)- пропионовой кислоты), литиевая к калиевая соли феноззнз - кислоты.

5. Гетероциклическое соединение - сэнтохин (этокепквкн).

- спонтанный аутагевез;пестя-цид "эфир 12-19»

- спонтанный мутагенез;и -ни-трозо-N- метилыочевинэ

( НММ): 4 нитрохинолин-1-оксид (4 НХО)

- ЕИ; 4НХ0

- спонтанный мутагенез; НЫМ;

4 НХ.0

- ггестиэдидн гранозан и "эфир

- Ш1; 4 НХО

II

ш

IV

]/ 5—метимрезорци'н

(сн3)с.м п(см3)3 с~л-о

СИ3

^ ' ^ лн; Млво*

^^ ^СНз ■

СИ2СН2С00Н

н

(рено зам ' сантохин

Рис.1. Структурные формулы изученных соединений

Соединения ПДУ и У являются стабильными нирокоильными радикалами, их молекула содержит радикальный центр - группу

О.имеяаул нечетное число электронов. Соединения I и Ш являются диамагнитными аналогами этих радикалов. В молекуле этих соединений радикального центра нет.

Савтохин и 5-иетилрезорцин - химически чистые препараты заводского производства; стабильные нитроксильныз радикалы и их диамагнитные ан^оги, з такзе фенозан-кислота синтезированы з Институте химической физики АЯ СССР и лабезно предоставлены для работы д.х.н.В.В.Ераовыы и к.х.н.Л.С.Криницкой.

Одно из изученных соединений - фенозан является нерастворимой з воде кислотой и поэтому в работе испытаны ее растворимые в воде литиевая и калиевая соли.

Исследования заполнены г •лепользовзнием следующих методов генетического знагизэ:

1', Анализ частоты генных мутаций путем регистрации обратных мутаций от ауксотро*ностя по триптофану к прототрофности у штампов ЛИНИИ Е. coli E/ru"F, /trpE /.

2. Регистрация частоты хлорофильных ядерных мутаций у растений арабидопсиса с использованием эмбрион-теста (Müller ,1963).

3. Анализ чзстоты структурных перестроек хромосоа в мета-фазнах и аЕэфззных клетках по стандартный методикой, .

4-, Учет ч-'о'юты сестринских хремзтидных обменов з лимфоцитах периферической крови человека (perry , .Volff ,1974).

Кроме того, поставленные в работе задачи вевались с помощью:

1. Анализа митотической активности в клетках апикальной ме-рнстеыы проростков ccühl' растений.'

2. Регистрад;::: дзйо-*"торной зсхсгсестя семян растений.

Экспериментально пел ученные данные подвергались статистической обработке с использованием критериев Стьэдента, Пирсона и -5иььра (Ро;-щкия,1974; Лзкин, 1980;Зайцев, 1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ант, чутзгзнкан активность иигибитоооз <,зободно-

эздикзлькас процессов в условиях спонтанного цутэгенеза

3 этой серии экспериментов, в которой прл спонтанной мута-- б -

генезе »спытызались все девять препаратсз, з качестве зб'-гхтоз слузили семенз пшеницы а луна-бэтуяэ, хранившиеся з течение зого годз з условиях, исключающих воздействие какгх-лн? о э:;;~е-рпментальных вактороз. Семена растаяла з течение ¿0 часов зарабатывались сзегсепр^готовленны:.!:: зодныии растворами :1сг:ит::з:-е:.'ых соединений, а затеи до фиксация инкубировались на зсде.

Результаты выполненного исследования обнаружили у всех, за исключением сантохина, ингябитороз сзободнорадлкэльяых лртзсзо достаточно высокие геяоза^инке свойстза. Вместе с том, л~ -выявленной антимутагенной активности, обнаружены некоторые р.з-личия в доз озз вис им см характера и з стзпзнн э^Зектизяссти -х г: нозацитного действия (рис.2). В частности, рассматривая рззуь-тзты испытания нитроксильяых радикалов л :гх диамагнитных аналогов на семенах пшеницы, обращает яз себя внимание, что см;;; .?■• ние I у2з в наименьшей из используемых доз уменьшает кол:-!-.с""1 аберратных клеток. Наиболее эффективнее энгячутэгеласз дейсг.>:: этот препарат проязляег в концентрациях 2-4 •«!!. Сселит Я г ■ рактсризуется менее эффективной, з срззпзлп:: с соединением I, антимутагенной активностью. Причем, прояэля:* з диапазоне Д'">з 0,5-4 мМ генозащлтясе действие, при лспользсвзнин его 3 -н'.' концентрации обнаружена тенденция к презнпен-.о спснтзннто • яз. Соединения И и 1У выделяются из числа группы препарате:, наиболее высокой зптимутзгеняой зктлвлостьэ, которая ззрегнетрн'г взнэ при их применении во всех используемых концентрациях. ' -иболее эффективным в настоящих экспериментальных условиях з:.:.-мутагексм является соединенна У, которое проявляет слабые ге::г-ззщитные свойства липь з диапазоне концентраций 2-3 мУ.

Наряду с соединения!.!:!, отнсспсг.-ися к группе нитроксиль--1 ч рздикалоз и их диамагнитное зяэлогоз, з работе з условиях спонтанного мутагенеза испытаны пространственно- ззтрудпенныз *ен:. калиевая и литиевая соли ¡Твнозанз, простой фенол - 5 металгеэс ция я гетероциклическое соединение - езнтохин (рпс.2). Яст эта установлено, что особенностью знтимутагеннсгэ действия солей феяозэна является широта диапазона .доз, при которых акгииутзгенный эффект. 5-метилреэорпня проявляет знтяыутаг^чп л активность з узком диапазоне концентраций, а езнтохиз з нчзыих

концентрациях не модифицирует спонтанный мутзгенез, а з высоко;

- ? -

б

1-

о

4

Соедикем/е /

г4-гЬ

X

г*

ъ

ъ /■

о*» *

Л

<5 1. к " 1\

N

^ о ■

г«

32 /А

о

Соединение Ч

-ь

Соедине//ис III

Соединение IV

гЬ нн

-ь 4-1

1 1

Нл

Соединем/е^

1,0 2,0 3,0 %0 1,0

/Ссицеятрация />/>е1щрато,нМ

5 ¡1-з-

Я/О ■

5

3-1 г / о

5л

Л /■ ¿7

ч

3210

Ч

Полисная сом фенозана

Латиебая саль сренозона

гЬъ

5-ме тшрезорцш

Сантохин

0,Ш 0,010,!' 0,210,5 /,0 Кояцехтреиия препарата, Ж

Рис.2. Модификация испытанными ингибиторами

сзободнорадикальных процессов спонтанного ■' мутагенеза з клетках сзмяк пиеницы.

из используемых дз:га проявляет иутэгопзов действие.

Тают образом, предстазлешше экспериментальные дачные зываят па то, что, за исключением сантсхнна, все пггл:; >г.:-:-? препараты с некоторыми различиями з характере и в оЪх■:■:■. :?,! ствия, ониавх»® частоту мутаций, зознякаэ!;дх при дг.цг?::•..: "п-нки семян растений. Основанием этому слугяг $эхг;гсесн:л1 '. " представленный на рис.2, а такав относительные взличина г. г . ля фактора эффективности антимутагекезз, вычислен., яо взг;:г;г.Т! экспериментов по участкам дозовых нривнх. В соответствии с суммированными в таблице 2 результатами, антцмутэгенные сзсйстзз многих из испытанных препаратор сопоставимы,..! дане презипээ? таковые одного из эффективных биоэнт:ю::спдаптоз - альфз-токс:1еролз, Наиболее высока энтимутагеняая активность соединений П,1У и каллезой соли фенозана. Близкие по значениям показатели ОЗА для кэгдс го из испытанных препаратов получены к з опытах из семенах лу:са-батунз.

Таблица 2

Эффективность антимутагенного деГ.зтзил' испытанных.антиоксидаятов при спонтанном . ■мутагенезб в клетках семян пшеницы

Препарат _' Ф, Э А

максимальный минимальный средний

Соединение I 0,74 0,49 0,61

Соединение П 0,63 0,36 0,50

Соединение Ш 0,90 0,68 0,79

Соединение 1У 0,92 0,53 0,72

Соединение.У 0,49 0,34 0,41

Калиевая соль фенсзанз 0,92 0,62 0,77

Литиевая соль фенозана 0,71 0,38 0,54

5-метилрззорцин 0,61 0,61 0,61

Сантохин 0,18 0,11 0,14

Дльфз-токоферол. 0,48 0,45 0,47

(Алекперов,1984) '

Следует отметить, что з экспериментах, выполненных на луке-батуне и пиеницс установлено, что зитимутзгеняое действие испытанных соединения проявляется практически при всех срокэх темпоральной фиксации-клеток апикальной меристемы в динамике инкубации

- 9 -

ссмяя к, при этом па фона сниаения частоты спонтанных аберраций хроиосом, они не оказывают существенного влияния на соотношение в об^еу спектре доли отдельных типов структурных перестроек хромосом. 'Ах антимутагенное действие не сопровождается в большинстве случаев, депрессией млтотического индекса и наблюдается в определенных концентрациях дате на фоне стимуляции деления клеток. Не сопровождается оно такзе ни изменениями в продолжительности клеточного цикла, ни в распределении клеток по фазам митоза. Все это свидетельствует в пользу-того, .что генсзащитное действие испытанных в настоящей работе ингибиторов свободнорадикальных процессов носит истинный антпмутагзвный характер, связанный с коррекцией процесса возникновения мутаций.

Влияние гтпбиторсз свободкорадикэльных .

процессов кэ лабопзторну 5схсчесть семян пиеницы л лука-бзтуна

Специальные эксперименты предусматривали определение физио-. логичности ::сп:2таняых препаратов, .которое базировалось на анализе лабораторной всхожести свегих семян растений и хранившихся в течение года в лабораторных условиях.

Подученными данными ус1~ловлзно, что в пределах используе-. мых кокг,сптрзцпЯ соединения 1-17 (0,5-5,0 ыМ), а такзе соли фено-заьа и 5-1:сТ.1..р^зорцин.(0,01-1,0^) ке оказывают существенного-влипни? нз лзб^аторнуд всхожесть свсаих семян пшеницы и лука-бату-на, не и_гнбаруя и не стимулируя ее. Напротив, в «определенном д !зп&..<-':;е эффективных внтииутагсннах концентраций, соединения Ш,-1У, иое соли дзнозанг я I- ^етилрезорцин повышают нпзнеспособнссть сзикн рассекай, псдз7-:.л?гул в результате длительного их хранения,

3 отличие от них, соединение- У и сансохкя в низких дозах нз модифицирует показатель всхожести семян, зарегистрированный в контрольна образцах, однако, в высоких дозах (в болызей степени сантонин) достоверно подавляют жизнеспособность и свеккх, и хранившихся нз протяжении года сеыяя растений.

_ У""вз-сз^ьпость знтимутагенг-гэго действия_

И-С-ДЬ'.лц.чных ингибиторов своболногадикальяых процессов

В соответствии с задачами настоящего исследования, одной

I

Соединение!!!

W-r Myraw

4

ю-

-f

"f

i

sL

Хо.чтро/и Н-1-1-1-1—I

Ч яо

§

•ъ

ъ**

Ii: s 1

i'prie.vi /гупт'е//?

4-J

й.

■ I I

Г

I 9

6

\ 3 t ,

t/page,-а гч'ргагела

jJ- §1

I l ^T"*? I

0J f,0 3,0 3,0 4,0 Концентрация, мМ

\ I

4

iS T

ß-

l!oa£etfö fltfraretfa

IT

Х".гт~олг> _ ZJ

1-1-1-(- -J —

0,5 10 2,0 3,0

fo/ttte>/zf>/ytm,?, sfM

\

30-

¡0-

10-

^ 0

Соединение IV

H-Н

sl

Хе.чгро.п Н-1-1-1

з> so

%

Г; /5 <»5

Г ^ 0

Урове.ы

Г

-J-1

6]

I 1 I Xc/rpPO/li

х m

•г

% 6

Ч о

Уро$ш nifTcrem

-Р

OJ t,0 3,0 %0 Xокце.чтрация , мМ

§L

t

4

/5 tt -8-

t/faßem Msm/v/ta

М/гтуам

i—i г • i—i г)

0,5 1,0 2,0 3,0 %0 Хо/гц. ен грация , яМ

Ркс.З. Модификация соединениями Ш и 17 ыутзгенеза, индуцирозэнного у .объектов, различающихся уровнем биологической организации, нитрозо-ыетилмочевиной, э - клетки В.coli i <5 ~ семенз пшеницы; в - семена эрзби-допсиса; г - лимфоциты периферической крови человека.

о

из которых-являлось определение степени универсальности антимута-генного.действия испытанных препаратов, .специальная серия опытов, наряду .с изучением.их-влияния не спонтанный.мутагенез, предусматривала оценку антимутагенной активности..антиоксидантов в условиях мутагенеза,.индуцированного по-механизму мутагенного действия химическими соединениями: алкилирувдего .соединения - нитрозометил-мочевины и мутагена !'У<£-типа? действия 4 нитрохинолш-Ьгсксида. Эксперименты..выполнены на..объектах с.различным уровнем, биологической организации, которые, кроме.того, позволяют регистрировать конечные .мутационные, события.на уровне качественно различающихся механизмом формирования-классов мутаций.. В качестве энтимутагенов в па стояще й-серии экспериментов испытаны -стабильный иитроксильный рэд'-тал-- соединение-1У,. диамагнитный аналог соединение Щ, а . Т8кгсз .пространственно-затрудненный-фенол -.калиевая соль-феноза-на, то-есть, антиоксиданты, которые,-помимо принадлекности-к-раз-нш.1 классам химических соединений,--кроме того,- по совокупности, критериев, оценки .их действия в-опытах .на-семенах-пшеницы.и луна-батуна выделяются из числа изученных наиболее высокой эффективностью. -.......... ' . - ........

..... Результаты-комплексного изучения - антимутагенной активности

испытываемых препаратов,-на-примере соединений Ш и 1У .при-их применении в широком, диапазоне концентраций до ..обработки объектов нитрозометишочевиной представлены на рис.3. Подобная-серия экс-перлментов-вылолнена и с использованием в качестве-антимутагена калиевой соли фенозана. Причем,.эти эксперименты предусматривали различную .вариабельность последовательности комбинированного-применения антиоксидантов-в сочетании-с .обоими-химическими мутагенами. .... -В-целом,-полученные-в работе экспериментальные данные систематизированы в таблице-3, где .приведены .относительные-.вели -чины-фактора эффективности антимутагенеза каждого из.испытанных препаратов в наиболее эффективных концентрациях--Дифференциальный -их анализ .указывает на то, что -выявленные, антимутагены.обладают универсальными генозацитными.свойствами...Данный..вывод подкрепляется-результатами испытания ингибиторов свободноради -кзльных .процессов в-условиях-спонтанного мутагенеза и- инду--цированнога.резными химическими-мутагенами. На их универсаль -ность, кроме того, указывают результаты опытов,.которыми обна-ругено отсутствие зависимости геаозацитного действия нитро-

Таблица 14

Универсальность антзиутагеиного действия испытанных препаратов (ФЭА)

Спонташшй Индуцированный -мутагенез

Ивдуцкро ванный 4 НХО-ом

Семо- Сема-Кле- Ген- Абар- с х 0

на на тки ние рагйи ° л и

пше- лука- тйпии му- хромо-

ницц бату- - талии со"

Гап- Хлоро- Абор-нне филь- рации

с х о

на е. Семе- Само- Лимфоциты Ё. Семена Самана Лимфоциты

на ара- на пше- перифори- . араби- пианицц перифари-

бидоп- нпцы ческой

сиса_крови че-

до пос- до пос- лочека ле лв до поело

допсиса

ческой

до после до посла крови человека до после

Диамагнитный а! алог -соединение Ш

0,90 0,84 0,52 0,47 0,57 0,50 0,62 0,56 0,44 0,39 0,43 0,55 0,53 0,54 0,47 0,42 0,40

шй1вадитЬ®«32 0,88 0,51 0,51 0,59 0,57 0,'63 0,59 0,49 0,45 0,48 0,57 0,56 0,61 0,50 0,47 0,42 0,92 0,75 0,57 0,54 0,61 0,61 0,67 0,71 0,54 0,49 0,55 0,60 0,58 0,65 0,55 0,53 0,44

ний ради-1 кал-соедИ' нение 1У Калиевая соль фе~ нозана

ксильяого рэдикэлз, диамагнитного аналога п пространственно-зэтрудкеиного фенояз: от уровня биологической оргзЕизации и вида используемого объекта исследования, от вариабельности последовательности комбинированного применения антпоксидзнтов в сочетании с химическими кутагенаип, а таете от класса регистрируемых нутаций - аберраций хромосом, сестринских хрома ткдтп: обменов, генных и ядерных хлорофнльных мутаций.

Антиыутзгеннзя активность' соединений Р. ГУ

и ка'ливвой соли феноззна в условиях мутагенеза,

инлтпировзиного "пестицидами гранозаном п "эфиром 12-19"

Универсальность действия антшаумагонов, а таете ях эффективность и флзиологичность является основными критериями,- определяющими перспективу .приыенения-генозащитних--препаратов, в практическом онтиаутзгекеза. С целью определения возможности использования изученных в работе антлоксидантов, соединения Ш,ЛУ, а такге калиевая соль фенозана испытшзались в.услозиях воздействия химических соединений,..прииенявщихся в сельскохозяйственных работах. -Исследования выполнены на семенвх пшеницы .и-.лука-батуна, 8 такне на.культуре перевиваемых клеток амниона человека,.

В результате установлено, что прединкубация-семян растений г;а рзстворах соединений Ш, ГУ п калиевой соли фапоззна с последующей обработкой кг пестицидами, достоверно снинает частоту аберраций хромосом, в 2-3 раза -возраставшей в клетках апикальной меристемы проростков под воздействием производных различных классов химических Еецеств: гранозана и "эфире 12-19" в дозах, рекомендованных для использования-в практике сельскохозяйственных работ-(тзблЛ), При отсутствии в культуральной среде испытываемых антиоксидантов, гранозан и "эфир Г2-19" достоверно увеличивают частоту аберраций хромосом и в перевиваемых клетках омнио-" нв человека (тзбл.5). Однако, при введении'в среду культнвировз-ния соединений Ш,1У и калиевой соли фенозвна, как до, так и посла воздействия ..естицидаии, обнаружен статистически значимый эффект защиты наследственных структур клеток человека, хотя пред-ыутагенное использование внтчоксидантов более эффективно, чей применение их после введения в среду культивирования клеток гранозана и "эфира Г2-Г9".

Модификация соединениями Ш, I? и калиевой солью фенозана (КСФ) мутзгенного действия пестицидов з ~ле ткзх се мял пшеницы а лукэ-бзтунз

ЕН

К ®

о о

Варианты опыта

доза Частота анти-- 9баРРазт'

к

к

. ных нле- контролю пести-дэнта ток

Ш

я

ЕС

аэ а аз о

к >>

ы

СП

чэ I

та «

>1 И

X аэ 2 аз .XI .

Контроль 2,12+0,28

Гранозан 8,63+0,34 0,001

+соединение И ЗмЦ 5,08+0,63 0,001 0,01 0,4

гэ +соединение П 4,67+0,71 0,001 0,001 С,4-'

о от +. ЯСФ одг» 4,21+0,65 0,01 0,001 0,51

о< Г-ч

Контроль 2,34+0,45

_ "Эри? 12-19"- 6,31+0/88 0,001

сл )—1 1 +сседнкениз Ш ЗмУ 3,84+0,66 0,05 0,01 С, '111

си 1—< +соединение 1У 4мМ 3,76+0,65 0,05 0,01 г» 45

о к + КСФ 0,1? 3,01+0,55 0,05 0,001 0, 56

Полученные.данные позволяют рзкомендозэть испытан:-::^ знти-оксидзнты.для практического применения в кзчестзе средств по~ з«пения устойчивости рзстительных.оргаяизмов к мутагенному действию пестицидов и, креме того,.создзют реальные предпосылки для.использования их.в целях профилактики и нейтрализации гено-токсичности пестицидов у организмов различных.видов в регионах с интенсивным использованием этих химических соединений.

Модификация соединениями Ш,1У и калиевой солью фенозана-(КСФ) мутагенного действия пестицидов в клетках амниона человека

« & Варивнты опыта Доза 8НТИ- До пестицида После пестицида

£ о оксиданта частота • • абеооапий ФЗА Частота ФЗА .аберраций хромосом

с: ■ • ' хромосом

ш £ + ™ ' — т

Контроль 2,58+1,02 2,58+1,02

Гранозан .. 14,19+2,29 14,19+2,29 -

со Соединение Ш ЗмМ 6,33+1,51 0,55 7,56+1,59 0,47

о к Соединение 1У Зы5! 5,97+1,49 0,58 7.,03+1,54 0,50

со а. К С Ф • ■ 0,1% 5,32+1; 45 0,62 6,28+1,50 0,56

сК "Эфир 12-19" 10,24+1,91 10,24+1,91 .

1 го ы Соединение Ш З.ОмН 4,62+1,33 0,55 5,18+1,36 0,49

Соединение 1У 3,0мМ 4,18+1,27 0,59 4,81+1,33 0,53

о. >е< со - К С Ф ' 0,1% 3,76+1,22 0,63 4,32+1,31 0,58

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

.....Наряду с-открытием новых генозащитных препаратов, а-также

с .определением .их-эффективности,..физиологичности, .универсальности-и возможности использования в практическом аатимутагенезе, принципиально важным в плане.задач-настояцего .исследования итогом-работы является, кроме того, выявление взаимосвязи антиму-твгенной-активности соединений разных классов от их химической структуры___ . -- --

-.В работе изучена антимутэгенная активность нитроксильных радикалов..и их диамагнитных-внэлогов, пространственно-затрудненных фенолов, простого фенола и гетероциклического соединения - сэнтохина (см.рис.I). Первая группа веществ включает 4 соединения, являющиеся производными тетраметил-пиперидина и

содержащие пестичленное гетероциклическое кольцо (соединения 1-17), а такзсе одно соединение,-которое является производным тетраметилпирролидина и содержит пятичленнсз гетероциклическое кольцо (соединение 7). Соединения П, Ш и 17 являются нейтральными незаряженными веществами, соединение I имеет в своей структуре положительно, заряхенный атом.азота, а соединение 7 имеет ионогенную карбоксильную группу, способную диссоциировать с образованием отрицательно заряженного иона. Результатами экспериментов -впервые показзно, что, несмотря на столь существенные различия з строении, все соединения зтого ряда, за^ исключением соединения 7, проявляют высокоэффективные антимутагенные свойства. ........... . ..... ...... . .

-..-Первый вывод, .который мозло сделать из сопоставления антимутагенной активности этих соединений, -заключается-в-том, что. производные, содержащие иестичленный гетерсцикл, более активны, чем пятичлеяяые.-.ВтороЯ-вызод, который-следует .из конкретных результатов, это выводг что присутствие-нитроксяльного, сзсбодно-рздикзльного-центра .не является необходимым условием наличия у соединения высокой-антимутагенной активности. Конечно, при обсуждении. зависимости антимутагенной активности от.строения з этом ряду-еледует..принимать во внимание, что нитроксильпыз радикалы .ыог'ут.восстанавливаться в .соответствующие диамагнитные производные, а последние в езою очередь могут-быть окислены (Лужков,1983; Промыслов.и др.,1985). Поэтому вопрос о значении нитроксяльного -центра л .соединении для поязления-антимутагенной

активности .требует дальнейиего.углубленного изучения.--.....

...... Вторая группа-.изученных.соединений включает две-соля анти-

оксиданта.- фенозана, двухатомный фенол.- 5-метилрезорция я.час-то-используемый -в-прзктике. для стабилизация гироз.я каротина ан-тиоксидант - сантохин. Результаты работы покззывзют,.что энтнму-тэгеннэя активность солей фенозанз-выне .антимутагенной активности их блиаайэего-аналога и известного антямутагена- ионола. ПоЕызение антимутагенной активности обусловлено, вероятно,тем, . что .в молекуле феноззяа имеется солеобразующая карбоксизтильнал группа, обеспечивающая.ему растворимость з воде. .. .

5-метилрезорцин уступает по антимутагенной активности лям фенозанз,..у него узе интервал концентраций, при котор:..; проявляет антимутагенные свойства. Вероятно, наличие ? мс::.: антиоксиданта трет-бутильных групп в орто-полс^ен::;' г.

' - 17 -

и, вследствие этого, растворимость его в липидзх, является суаественнын условием существования у фенола высокой знтиму-тэгенной активности и наличие.второго гидроксилэ нз компенсирует полностью отсутствие этих.групп.

Неожиданны результаты изучения антимутагенных свойств сзн-тохине. Ожидалось, что подобно.другим антиоксидантам, он окажется ентимутегеноы. Опыт покззал, .что.сантохин не способен сникать частоту спонтанных-Зберраций хромосом в клетках семян пшеницы. Ранее У...К.Алекперов (1984) обнаружил, что еще .один снтиоксидант-нордигидрогваяретовзя-кислота также'не является антимутагеном. Эти факты ставят.под-сомнение проступ причинно-следственную сзязь между способностью-ингибировать свободно-радикальные реак- '. ции и -способностью снижать частоту спонтанных и индуцированных-аберраций.хромосом и поднимают проблему уточнения-природы кише^ пей внтимутэгенного действия знтиоксидантоЕ-и других.аптимутз-геноЕ. -Вместе с тем, упомянутые выше выявленные в. нзстоящей.работе закономерности взаимосвязи актимутагенной- активности соединений разных' классов от юс химической структуры могут служить ь качестве предпосылки .для целенаправленного синтеза соединений с необходимой генетической активностью.

ВЫВОДЫ:

. I. Открыты ?-антимутагенов среди вновь синтезированных стаоильных нитроксилькых радикалов, их диамзгнитных аналогов и пространственно-затрудненных-фенолов, что.указывает .на пер-т .. спектизу поиска генозащитных препаратов из этих классов химических соединений» .....-...........- - - .... .......

------2,-Установлено,-что за исключением сантохинз все испытанные

внтиоксиданты-с различной эффективностью и в .пределах .определен-зого.диапазона..концентраций -ингибируют спонтанный мутагенез, а также индуцированный нитроэометцлмочевиной, 4 нктрохинолин-1-оксидом, пестицидами г гранозаном и "эфиром -12-19".. ... -

З...На модели, соединений.Ш и 1У, а такяе.калиевой..соли фено-зана. выявлена универсальность антимутагенного.действия-испытан-ных препаратов, которая-в условиях спонтанного и индуцированного мутагенезе продемонстрирована на клетках прокариотов ( г<0011 и эукзристов рззличных видов (семена пшеницы, лукз-бзтуна, ара-

бидопсиса; культура поревиваеыих клеток амниона человека; первичная культура лимфоцитов периферической крови человека» путем регистрации конечных нутационных.событий на уровне различных классов мутаций (гепше.и ядерные хлорофияьные мутации, аберрации хромосом,.сестршские хромзтидные обмены).

Установлено, что ^тинутагенныа свойства соединений И, 1У и калиевой соли .фенозанз-проявляются вне зависимости от вариабельности .последовательности комбинированного.их применения в.сочетании с химическими мутагенами, хотя предмутагеяная обработка более .эффективна, .чем..другие-режимы воздействия. — -

- '5. Покззопо, что-испытанные соединения оказывают антимутагенное, действие при всех сроках-фиксации з-.динамика инкубации семян .лука-батуна.и пианицн иг при этом, на фоне.снизения частоты аберраций-хромосом,, не оказывают существенного, влияния, на соотношение в.-общем спектре доли отдельных категорий структурных первстроек-.хромосои. ...... -......- ....

6. Установлено, что.в эффективных антимутагенных концентрациях испытанные препараты не ингибируют клеточную пролиферацию и не влияют..на соотношение клеток по-фззам-митоза,-а,.напротив, в-определенных-дозах стимулируют деление клеток.и восстанавливают кизнеспособность -семян лука-батуна и псеницы, подавленные в результате длительного их хранения. ......

. 7. Впервые показано, что производные-из .ряда нитроксильных радикалов и их диамагнитных-аналоговт содержащиешстичленный гетероцикл,-обладают более высокой.антимутагенной активностью,-чем пятичле нные,..Наличие этой зависимости.является предпосылкой для целенаправленного синтеза соединений, с необходимой генетической активностью... . ........- ...

-.....8...Дифференцированы эффективные-и.-физиологичные дозы.испы-

тзнных .препзратов,-продемонстрирована.принципиальная .возмонность и разработзны-способы их практического применения в целях..профилактики ¡¡-нейтрализации мутагенеза, возникающего при старении организмов, а такке при воздействии химических мутагенов.

ОСНОВНЫЕ, РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ

Б.СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ • I. ..Бабаев М.Ш., Зейналов А.Г., Серебряный A.M., Ершов В.В., Плеханова .Л.Г. Снижение..уровня спонтанного мутагенеза с помсзыо антиоксидантов и стабильных радикалов // Цитология и генетика.-1985 - т.19 - й 5. С.367-372.

- 19 -

2. Бабаев М.И., Зейналов А.Г., Зоз H.H., Серебряный A.M. Контроль за.спонтанным и индуцированным типами мутирования хромосом растений биоантиоксиданташк // Сборник "Современные проблемы теории химического мутагенеза".-Таллин-1987- С.5-12.

3. Бабаев М.Ш..Зейналов А.Г., Серебряный A.M. Сниненио уровня спонтанного мутирования с помощью стабильных радикалов. //Лезисы Всесоюзн.совещания '!Бцс2нтиоксидантп.-Москва-Черпого-ловко. 1983- с.205.

4. Зейналов А.Г..Бабаев М.Ш., Криницкая Л,А., Серебряный A.M. Антимутагенная активность ингибиторов свободно-радикальных реакций---производных-тетрацеЕилпиперндипз./Дезисы П.Все-ссззн.-конференции пБиоаьтиоксидант".-Цосква-Чер;юголовка.-1986. с. 183-184. . ... . - ..-.:

5. Бабб35.М.Ш.,Зейпалов--А»Г»т..Серебряный.A.M.-Связь структуре активность в различных-классах модификаторов спонтанного

и-индуцированного мутагенеза. // Тезисы докладов У сьезда ЕОГКС. Москва.-1988. .- • ...

... б. Белкев Н.М-, Зейналов АЛ1. .Бабаев-11.Ш. Влияние некоторых.синтетических 8Нтиоксидаптсв на частоту сестринских хрома-хидных-обменов, индуцированных в. лимфоцитах периферической крови человека нитрозометилмочевиной //ВИНИТИ.1991. №3507-В91 от

20.08.91. . .. .......

--7. Мирза-ззде Г.Г....Зейналов А.Г.,-Бабаев 1Г.В. Кодификация некоторыми антиоксидантаыи индуцированного мутагенеза у араби-допсиса //ВИНИТИ. 1991. J6 3508-B9I.