Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение антибиотиков с широким спектром действия из почвенных актиномицетов Казахстана

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение антибиотиков с широким спектром действия из почвенных актиномицетов Казахстана"

АКАДЕМИЯ ШК КАЗАХСКОЙ ССР Институт микробиологии и вирусологии

На правах рукописи

КОПЫТИНА. Маргарита Николаевна

ИЗУЧЕНИЕ АКШБШТИКОВ С ШМКЖИМ СПЕКТРОМ ДЕЙСТВИЯ ' ИЗ ПОЧВЕННЫХ ЛНТИНОЛЩЕТОО КАЗАХСТАНА

03,00.0? - микробиология

Авторе ф е' р а т

диссертации но соискание ученой степени кпцлидлта биологических нпук

«ЫМ-ЛТА - 1991

Работа выполнена в Институте микробиологии и вирусологии АН КазССР и Всесоюзном научно-исследовательском институте по изысканию новых антибиотиков АМН, г.Москва.

Научные руководители -

доктор биологических иау Л.А.БКТ'ЛУШНА

кандидат биологических н Г.Б.ФЕДОРОВА

Официальные оппоненты -

доктор химических наук,

профессор Г.С.КАТРУХА

доктор биологических нау профессор Е.ТЛШИТИНА

'Ведущее учреждение-, ¿¡сесоюзний научно-исследовательский технологический институт антибиотико и ферментов медицинского назначения,

заседании специализи, . _ащите

кандидатских диссертаций при йнституте микробиологии и виру сологии АН КазССР (4Ь0100, г.Алма-Ата, ул.Н'ироьа, ЮЗ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии АН КазССР

г.Санкт-Петербург

Защита состоится

часов

Автореферат разослан

Учений секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

и У • С. Myхаме,пне ва

г

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы и состояние вопроса. В настоящее время не вызывает сомнений ведущая роль антибиотиков в лечении инфекционных заболеваний человека. Антибиотики широко используются в сельском хозяйстве, а также в качестве инструмента исследования в различии областях биология. Однако широкое использование антибиотиков в медицине и других отраслях народного хозяйства создало проблему возникновения усто1тчивости к этим веществам. Появление устойчивых возбудителей болезней требует внедрения в медицинскую практику и ветеринарию новых антибиотиков, постоянного обновления арсенала лечебных средств. Поэтому изысканно и изучение новых эффективных антибиотиков, по-прежнему, остается одной из-актуальных проблем современно!! микробиологии, химии и медицины.

Среди возбудителей хирургического сепсиса, развивающегося на фоне тяжелых острых гнойных заболеваний и обширных посттравматических и послеоперационных ран, первое место занимают стафилококки. Однако, в последнее время наблюдается преобладание среди возбудителей гнойных инфекций грамотрицательных бактерий (синегнойная палочка, различные виды возбудителей из группа кишечных бактерий и др.), устойчивых к традиционным антибиотикам, что требует необходимости поиска новых препаратов с широким антимикробным спектром действия. Известно, что грамотрицатель-ные бациллярные пневмонии предстаатают большую опасность для хронически больных пациентов в отделениях интенсивного ухода и при злокачественных -.заболеваниях. Пневмонии, вызванные такими бактериями, чрезвычайно трудно контролировать и они являются причиной высокой смертности. Одной пэ самых распространенных

;;нф:щируюар1Х бактерий является К1еЪв1б11в'рпеипюп1ао, которая внзивает около 25$ граштрицательнык госпитальных пневмоний. Ь'лкроорганнзш это!; группы являются частыми возбудителями заболеваний ЛОР-органов ( синуситы, отиты, мастоидиты), дыхательных путей (пневмонии, бронхоэктазы, эмпиемы), реяе - желудочно-кишечного тракта, мочевых путей, раневых инфекций, остеомиелитов, менингитов, В лаборатории антибиотиков Института микробиологии и вирусологии Акадешш наук Казахской ССР ведется поиск актиноми-цетов - продуцентов антибактериальных антибиотиков. В результате проведенной работы отобрана группа активошцетов (20 штаммов) -продуцентов антибиотиков с широким спектром действия, которые явились объектами наших исследований. Большинство отобранных шташов в сильной степени подавляли рост граыотрицателышх бактерий, включая КХсЬоЮНа рпеиагош.ае.

Цель настоящей работы - поиск к изучение новых антибиотиков с широким спектром действия из актнкошцетов.

Задачи исследований включали:

Т, Изучение условии биосинтеза, вццоленля и первичную идеп-". иадкацп:-:) антибиотиков, из отобранных щздшв актНно;,нщетов.

Я» }^1рактср;1стшсу ЗкгерЪотусс-о саа(11с1'ц£; сиЪзр. а1иатаса.ги ™»Ьзр. пот. 425 - продуцента нош го ашгибиогчша алиатэдп

3, Изучение и овтодоцдо условий биосинтеза антибиотика .'•.шагащт,

■и Выделение, очистку и а&учгшлв ¿дологических п фиэико-тяюгавохях свойств нового иикролвдйэго антибиотика алттадина.

№ГШШ нош13на и практичная. шн'лпг.тт,, Ь' процессе скри-..лнга продуцентов ковах антибактериальна;; шшбдеъшш из почв :Сазй:«жша отобрано 20 вквсяов актиношцатов, ооллданда широкий оп&ктрои дейо-ши. Некоторые щгсибпояакн идопти} шдароэаиы о рано.

известными или определена их групповая ^ринадлелпюсть. Получен новый макролидный антибиотик, названный ^агглатацином. Новизна антибиотика доказана на основании изучения, его фазико-хишческих свойств и антимикробного спектра с последувднм сравнением с известными антибиотиками, с использованием компьютерной базы данных биологически активных веществ, разработанной Д.Бардн (Венгрия) . Продуцент ашатацина - штамм /ЬШ 425 наиболее близок к виду Streptomyces Candidus (ex Krassilnico'v 1970), HO отличается от него способностью образовывать новый антибиотик. На основании этого он выделен В новый ПОДВИД - S. candidua aubap.almataeini subsp. nov. Методом математического планирования подобрана и-оптимизирована среда для биосинтеза алиатацииа, на которой продуктивность штамма увеличена в два раза. Алматашн подавляет рост

i

грампололштелъных, грамотрицательных, кислотоустойчивых бактерий, фитопатогенных грибов, дерматофитов и значительно превосходит по активности (¡.¡ПК 0,5 мкг/мл) в отношении Kleba, pneumoniae известные макролидиыи антибиотики. Ташш образом, антибиотик алматапин предсгашшот интерес длл дальнейшего иоучешш, как перспективное лечебное средство.

Положения. niiiiocHi.iHa на з;ш;пту.

- Актуальность поиска новых антибиотиков с широким спектром действия.

- Новизна продуцента ц образуемого им антибиотика, высокоактивного против Klebsiella pneumoniae.

- Возможность значительного повышения продуктивности шташа актиношцета подбором условий культивирования.

Апробация диссертационной работ». Материалы диссертации доло;.;енн на Ii' симпозиуме социалистических стран но биотехнологии (Болгария, 1066), I Совотсно-Акериканскри симпозиуме по ан~

тибиотикам и химиотерапии СМосква, 1988), ¡Дезду народном симпозиуме по экологии микроорганизмов (Япония, 1989), II Всесоюзном семинаре "Актуальные направления поиска антибиотиков" (Алма-Ата, 1939).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературн, экспериментальной часта (5 глав), заключения, выводов и приложения. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками, 31 таблицей и I схемой. Список цитированной литературы составляет 149 публикаций, из них зарубежных 100.

ОБШТЫ И ЫЕТОДЫ ¡гСййЩВАШЙ

Объектами исследований явились 20 шташов актпношцетов из РОДОВ 31;гьр-1отусеа, Ас1;1потвйига, НосагсИа, изолированных ИЗ различных почвенник образцов Казахстана.

• Биосинтез антибиотиков осуществляли глубинным методом на круговой качалке (180-200 об/мин) в течение четырех суток при температура 28°0 на органических средах (А4, 5339,° 6613 и сахарозная) и на синтетической среде Красильникова I. Посевным материалом дли биосинтеза антибиотика алиатацина слу>гшла 48-часовая глубинная культура, выращенная на органической среде следующего состава {%)% кукурузный экстракт - 0,5; (ш^зо^ - 0,35; НаС1 -0,5; крахмал кераствориишИ - 1,5; глюкоза - 1,0; рН 7,4-7,6. При изучении биосинтеза антибиотика алыатацина било испытано 28 синтетических и органических сред, нриыешошх во Всесоюзном научно-исследовательской институте по изысканию новых антибиотиков АШ СССР, Всесоюзном каучно-исследователъско.л института антибиотиков Министерства медицинской а шкробиологйческоЯ прошшлонностц СССР,

Институте микробиологии и вирусологии АН КазССР.

Фоном для, последующей оптимизации методом ортогональных латинских прямоугольников (Бирюков, 1968) послужила лучшая по уровню накопления антибиотика среда с рыбной мукой следуккого состава (/>): рыбная мука - 1,0; пептон - 0,5; лактоза - 2,0; глюкоза - 2,0;

(ИН4)2304 _ 0,1; ШС1- 0,5; С-зОО'3 - 0,5. В качестве критериев ' оптимизации питательной среди использовали следундпо показатели: накопление бломассн (г/л), величину антибиотической активности куль-туральных жидкостей и ацетоновых экстрактов из мицелия (од.разводе ния/мл).

Выделение стабильных вариантов шта.-.ш 426 проводили по мотодике моноспорового рассева (Кузнецов, li/72), Сравнительное изучение биологических свойств полученных вариантов и исхедноп культуры проводили по ойи:спрпттт-.методикам и схемам (Бондарцев, 1Э54; Гаузе и др. ,1957, 1ШЗ; .ihirling, Gottlieb, 1966; Красилышков, 1970).

С цель и выявления потенциальных возможностей актиношцета шт. 425 использовали рекомендшцш К.Т.Ншштано»;, и др.(1&)9) о целесообразности индукции вторичного роста у исследуемой культуры. Фоновой средо/. в это;.; ¿хода*; juOoth data среда иридхзма-Готтлиба. ¡1с~ точшшогл углурло елумнлн: ликтояи, глюкоза, ксилоза, сахароза, галактоза, араоипиза, ¡.¿игьтоза, ируктоза, рауигиноза.

ArroiiiKOTiiKn ivjnneKivM лз культуpa'ibuoii жидкости .и мицелия продуцентов зкстр'шшоп органическими растворителями. Очистку антибиотика .алг.итлцнна ос;и«оигчляли методом колоночной хроматографии на кпзояьгслв мчрки 'Torek ", "Kteaeigel 6о " и водной кремневой кислоте. Антибиотическую активность культуралышх жидкостей, экстрактов из мицелии, сырцов и. очвдоншк препаратов определяли методом ;пм.'!-у.-а::! я -imp (¿¡горо», Антимикробный спектр полученных препаратов изучали в отношении граг,то ло:;а', тельных, 'грамотрица-

телышх, киолотоустоЙчиьых бактерий, дрожжей , дрожжепидооаых и фитопатотшшс грибов и до^г-птофитов.

Для хроиатографичесшго иоследова ¡пл антибиотиков использовали методы тонкослойной хроматограф (ТСУ.) на пластинах "üliutoi" марок Ii й И 254 ( Avalier, ЧССР) и пластинах фирш " Merck" DC-Alufolien Kieselgel 60 и бумажной хроматографии (Блинов, Хохлов, 1970). Антибиотики обнаруживали громатограмках по свечении в УФ-света и öuo автогра<|ичес ним методом с использованием тест-организмов Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Bacillus aub-tilis, Bacillus mycoides.

Спектры коглоценин антибиотиков в этаноле, метаноле, воде, ОДн HCl и 0,1н Неон измеряли на спектрофотометре "Unicam зр 800" и " Specord М 40*, ИК-иноктры в таблшках с КВг на приборах " Beckman " "PYE Unios» LTD " и он- 75. ).1асс-спектры получали на приборе УУ -50 ТС ( Kratoa, Великобритания) методом бомбардировки, помещенных в глицериновую матрицу веществ, ускоренными атомами Хе с энергией 8 каВ. Удельное вращение определяли" на поляриметре "Perkin-Elmer 241".

1иаролиз антибиотика алматацина проводили в м<й?анольном растворе 1н HCl при 150°С в течение 4-х часов. По окончании гидролиза смесь нслиралд-зовалй, загы. окстригировали хлороформом. Продукт гиирол}!-а, полученный при концентрироиашш хлороформенного раствора, оос&дали гексшюм. Ац« тлнровакле антибиотика проводили ук-суснц'и алгицридои ь пиридине (¿¡:1) в течение 18 часов при комнатной тенп»'рат,'4-0. -Ъмоь упны^сив шкууив и осаждали гексаном.

РЕЬУЛР T/i'lU КССЛЩ0Ва-Ь!л1 I. Биосинтез, выделение и иде;г№^к.г1еш антибиотиков с широким спектром действия из актииомицотов

Нервнй этап наших исследований заключался в поиске актпио-мицетов - продуцентов ангибяэтиков с широким спектром действия. Отобрано 20 активных штамг-ззв, обладамлих внра.'мшш.1 действием в отношении грамлоложителгмпос и граиотрицательных 6aKTopnii, в том числе .Klebsiella pneranonine , Второй этап работы состоял в подборе питательных е^ед для биосинтеза антибиотиков, а такке опти-дальных условий выделения антибиотиков из культур продуцентов и получение их в виде частично очшенных спиртовых концентратов или порошков-сырцов и последующего определения их минимально действующей концентрации на различные тест-организмы. Луч™мп средами для биосинтеза антибиотиков JHf 2, 153, 531, 6t>I, 790, Ь09, 1Э56, 2008 оказалась среда А4, препаратов 35К, 310. Э!>4, I-Пь, 1505, 1880 - среда 5339, Л- 2029 - сахарозная. 11ро.цуктчШ'>стт. рдцд итп.иш; ( 4,И5К, 1970) была высокой на средах Лл >• 53.'j:).

Антибиотики извлекали из культуральной ;;шдкооти (.V.1-" 4, 25/779, 1505) и из мицелия (№ 531, 153, 35К, П5К, 681, 1970, 310, I860) органическими растворителями. Ряд антибиотиков (JfJ'- 790, 609, 954, 1415, 1958, 2UUd) содержатся как в мицелии, так и в ({«льтрате кулътуральной жидкости.

Изучение антимикробного спектра показало, что все антноиогаки обладают широким спектром действия, подавляя рост граыположи-телышх и граыотрнцательных бактерий, в том числе Klebs. pneumonie (M 2, 4, 35К, II5K, 153, 310, 531, 681, 790, 80Э, «54, 1415, J. J5, 195«, 2029) и Hacherichia coll (» 4, 25/779, ft'i«). Ряд антибиотиков активны такие в отношении дромей и грибов (J№ 2, 35К, 25/779, b.'3I, 6bi, 954, 1505, 1970, 1Ш0, 2008, 'ШЭ).

IÜ

В процесса поиска новых антибиотиков неизбежно выделение уже известных веществ, в связи с чем проведение химической идентификации на ранней стадии исследования, является практически важной задачей и составлял третий атап нашей работы. Использование раз-дачных методов хроматографии в сочетании с биоавтографическим проявлением, а такае спектральных методов показало, что большинство изученных антибиотиков представляют собой сложные комплексы антибиотических веществ, относящихся к различным классам химических соединений С табл.1). Анализ основных свойств антибиотиков показал, что некоторые из них идентичны или сходны с известными.

Четверим этапом исследования являлось определение токсичности и химиотерапевтических свойств выделенных антибиотиков. Для проведения этих исследований концентраты были передани во ВНШНА А1Ж СССР. Ряд концентратов (М' 153, 531, 681, 790, 609, 1880,200В) по разним.причинам (отсутствие лечебного эффекта, высокая токсичность) положительных результатов не дала.

• Наибольший интерес представлял штамм ¿ЫЗ 425 s. Candidus и образуемый им оригинальный антибиотик, которым и посвящены последующие разделы работы. 0

2. Streptomycea Candidus ШТ. ШВ 425 - продуцент нового антибиотика алматацина

Актиношцет штамм 425 выделен из каштановой почвы Павлодарской области на селективной среде 2 Гаузе с антибиотиком стрептомицином. Установлено, что патогенными свойствами этот штамм на обладает. Мташ 425 депонирован во ВНИИА и ВНИИ Генетика.

На основании культурально-морфологических и физиолого-био-хишческих признаков продуцент алматацина шт. 425 наиболее близок К ВИДУ 3. Candidus {ex Krassilnikov 1970) nom.rev.comb.nov.,

Некоторые свойства полученных ансяс.котиков

;; анти- г ..............." ------- |........... " т— - -т

биотика ¡Продуцент ! Антиг.ш кро б ный! УФ-спектр л-! паи хрома- Первичная

!спектр тогшсизозании идентификация

* ! ал на оплуфоле з системах (I); (II

! | г !

т 2 > я > 4 5 6

2 Серия Лигеив 379(^он) 0;0,1-;0,39; 3,5У(П) Комплекс гэксаена а антибактериального антибиотика

4 3.зепйа1епз1о 278(2-ЬОН; 0,1н(НС1) 0.46:0,62(1); 0,3:0,4(11) Идентичен хлораы-фениколу

25/773 .оПсиэ Г+,Г*,к.б.,гр. 235,289 (Егон) комплекс трех компонентов, основной - макролшг

35К С. А1Ъосо1сга1;из Г+,Г~,к.б.,гр. гбоСзгон} 0,23(1) Полипептид

115К С. Не1уо11з Г\Г",к.б. 257(Згон: - Нейтоальное соединение

153 ооеги1еасбпз 4 Г*,Г",к.б. 250Ш<?Н) 0,36(11) йейттзальное соединение

310 С. СЬгопк^епее Г4", Г" 261,295,349 0,17:С.?(1) Нейтральное сое-

динение

531 Косагс^а щт.ЩВ 531 Г^Г'.гр. 22 5,(270), - Идентичен илами-

1 33 5 (¡¿еОН ) ЦИЩ"

681 З-ЬгерЪотусез ШТ.ШВ 681 Г1",Г~,к.б.,гр, 259(Егон) Нейтральное сое-

динение

730 Зггерхотусез шт. ИЫВ 730 Г1",Г" 230,264-265 0,14;0,41(II) Близок к хромоми-

420-422 цинак

(Е1:он)

продолжение таблицы I

I ! 2 ! 3 ! 4 ! 5 ! 6

'8СЛ Б. £1ат1йо£иасив , 280(410) Е-ЬОН 0,03;0,15 Обладает кислыми свойствами

Э54 Актиномицет шт.ИМВ 954 с 1У типом клеточной стенки ГР- , 240,262(БtOH) - Обладает кислыми свойствами

1415 Актиномидет шт.ШВ 1415 261 ШОН) Полипептид

1505 C.Ac¡lгomogenes 250,284,318, 333,350№0Н) 0,36;0,33 0,26(11) Комплекс пентаена и антибактериального антибиотика

1880 Э1;гер1;о1пусеэ ШТ.ИМВ 1880 Г\Г,гр. 228,265(Е1;0Н) 2б0(Но0),262 (одн нс1; и (ОДн н2304) 0,51;0,8б(1) 0,66;0,8(11) Обладает кислыми свойствами Сходен с муза-рином

1358 З-сгерЪотусеа шт.ИМБ 1958 Г+,Г~ 305(Е-Ь0Н) 0,04; 0,1; 0,Зб(И) Нейтральное сое-" динеяке

1970 Э^ергоиусеа шт.К'Ш 1970 Г^.Г'.гр. (265),278,289, 302,31б(Ег0Н) 0,39;0,78(1) Комплекс гетраена и антиоазл-еталь-ного антибиотика

20СЙ Э-Ьгер-Ьотусез ШТ.ИМВ 2006 о Iй",Г",ч?. 264 (ЕМН) 262(0-,1н НС1) 0,8(11); 0,61(1) Нейтральное соединение

2029 Дс41ш>та.с1ига Г+Д^.гр. 264,395,500 <Е«)Н) 0,19:0,39; 0,55(11) Нейтральное соединение

Примечание: система I - хлороформ-метанол (20:3)

система II - хлороформ-бензол-метанол (30:20:7)

Г4- - грамположительные бактерии; Г" - грамотрицательные бактерии;

но отличиатоя способностью к образованию нового антибиотика, lia основании этого отличия штамм.ИМВ 425 выделен в новый подвид -Я. candidua аиЪар, almatacini aubap. nov.

Предполагалось разработать метод иоддорживащей селеквди штамма-продуаднта. С этой целью изучался состав популяции штамма 425. Рассов культуры проводился на двадцати двух средах (Кузнецов, 1972). Лоличяна антибиотической активности полученных вариантов не превосходила таковую исходного штамма. Не било выявлено также различий из культур вторичных колоний, полученных на среде Придаэма-Готтлиба с фруктозой, лактозой и ксилозой.

Из полученных данных можно сделать вывод, что популяция а, Candidus subsp. almatacini subap. nov. шт. ИМВ 425 усТОЙЧИВЦ

по признаку антибиотикообразования. На ш!гамм ИМВ 425 подана заявка № 4829896/13. Приоритет 29.05.90.

3. Подбор питательной среды для биосинтеза нового антибиотика алматацина и ее оптимизация

Биосинтез антибиотика протекает с образованием бесцветных или бледно-желтых нативных жидкостей и бесцветного зернистого или хлопьевидного мицелия почти на всех испытанных 28 средах.

Наиболее оптимальными для накопления антибиотика оказались кукурузная среда 0,7%, органическая Ваксмана, соевые среды № 2, кд, 5339 и рыбная среда 8. Лучше результаты были получены на среде рыбной 8 (табл.2).

» Дальнейшие исследования были посвящены оптимизации состава питательной среды рыбной 8 с целью повышения уровы образования антибиотика в культуре методом ортогональных латинских прямоугольников.

На основе полученных данных рассчитаны оптимагп.пые варичнга

Таблица 2

Влияние питательной среды на образование антибиотика алматацина

Наименование среды

Активность (вд.разведения/мл)

Ас

Соевая А^ Соевая 5339 Соевая № 2 0,7$ кукурузная Органическая Вакилана Рыбная 8

243 81 243 729 243 540

540 243 810 270 800 1620

Примечание: КЖ - культуральная жидкость АЗ - ацетоновый экстракт

питательной среды - рыбная 8 (табл.3): 1а, оптимизированная невыходу биомассы, На - по величине антибиотической активности культуралъной жидкости, Illa - по величине антибиотической активности ацетоновых экстрактов из мицелия.

Наиболее оптимальной до выбранным критериям явлгг-точ среда Illa, на которой антибиотическая активность возросли и 1,5 р-к-а (в ед/мг), выход антибиотического вещества (в мг/л) - в 2 раза. Оптимизированная математическим методом среда Illa отличается от исходной повышенным содержанием рыбной муки (1,75$) и чотугечшьм - пептона (0,1$), лактозы (1,5$) и (ira^so, (0,075?).

4. Выделение, очистка и изучение ои'»логических и физико-химических свойств порог1» литийч^т;:^ > алматацина

Разработан экстракционный метод, позволят;;? п м-i -»т»-биотик, как из мипелия, так и яд ччтивиого [псч"1:"' (ри-.J). Очистку препарата осуществляли .кодоч-'"но« -/¡«мат >п>» .-íi на »си-

хаолица о

Сравнительная характеристика оптимизированных сред для биосинтеза алматашна

Выход ¡Выход ан-i Активно- ¡Суммар-

биошссы*тибиотика^тическая ¡нал ак-

г/л i мг/л ¡акткв- ¡тивность, ;ность,ед.¡ ед/л

iразвеле- f

¡ния ¡

! ¡

Питательная ; .среда

■о и я >> РЦ 2

---------

й сб о

ж m ст и 1-1

о о о OJ о

E-i Ен М ..—* а

С К Q

ш д ей 1=3 Рн §

гч

о о й о

(исходная). 1,0 0,5 2,0 2,0 0,1 0,5 0,5 28,5 427 270 II5290

Среда 1а. . 2,0,. 0,3 2,5 0,025 0,5 0,5 44,3 446 270 131220

Среда На.. 0,5 _ 1,5 . 3,0 0 0,5 0,5 29,3 768 384 294912

Среда 1Ш.. I¿7& 0,1. 2,0 0,075 0,5 0,5 33,5 840 486 408240

М CJ1

СХЕМА

ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ АНТИБИОТИКА АЛМАТШНА

КУЛЫУРАЛЬНАЯ ЖИДКОСТЬ (фильтрация или центрифугировали®)

Фшплчэат

| "Экстракция хлороформом

Хлороформенный экстракт

Концентрирование в вакууме, осаядение гексаном.фильтрация

Мгшшшй

«же традтя ацетоном

Адатоновый эксттэакт

I Концентрирование в вакууме, экстракция н-Оутанолом_

аутажльный экстракт

' Концентрирование в вакууме, осазщение гексажж_

Ашракый порошок кремового ..'г-..:

ХРОМАТОГРАФИЯ НА К010НКЕ С КИЗЕЛЬГЕЛЕМ (элвдия хлороформом)_

фракции антибиотика

Концентрирование в вакууме, осаждение гексаном

БелшГ'аморфный порошок

¿ршадя желтых пигментов

Рис. I.

»чльгвле " Kaebelgei бо " и водной кремневой кислота. Контроль за очисткой ъели методов ЮХ на пластинах кизелъгеля в системе июроформ-бензолылетанил (30:20:7) с биоавтографическим проявле-шем, с использованием Klebsiella pneumoniae в качестве тест->рганизда, а0,также анализом хроматограмм в УФ^СЕьте при длине вол-ил 254 нм. Биологически активный компонент с Rf 0,6 на хроматог-)а«е светится голубоватым цьетом и проявляется при опрыскивании срома то граммы \% КМиО^ . Очшцешшй препарат представляет собой ¡елый аморфный пороиик.

11рн иоследуадом анилизе подученного антибиотика х]юыатогра-[«ай на бумаге в 12 оиотомах растворителей и проявлении биоавтог-зафичеоши методом (■reciv-opmiiu им Klaba. pneumoniae) обнаруживайся одна биологически активная noua. По'"хроматеграфическое шектру" алматацин отличается от всех известных антибактериальных штибиотиков, классифицированных Н.О.Блиновым и л.п.Хохловым .1970).

Антибиотик алыатацин подавляет рост г^шлполо./итолъных, гр&м~ >трицательных, кислотоустойчивых бактерий, фитопатогенных гряоов I дерматофитов (табл.4). Он значительно превосходит по активности .ШК 0,5 мкг/мл) в отношении К1еЪз. pneumoniae известные «акролидные антибиотики.

Препарат антибиотика хорошо растворим в спиртах, хлороформе> щетоне, н-бутаноле, бензоле, слабо растворим в воде, этиловом ¡фире, концентрированной азотной, соляной кислотах, растворах ;елочей, нерастворим в петролейном эфире, четыреххлористом угле-юде, гексане.

Ультрафиолетовый спектр антибиотика в этаноле характеряэует-;я шксимумом поглощения при 278 ic.t V^cn ^^ • ^~сиектР :ащша (таблетки с КВт ) представлен на рис.2. Антибиотик нл .%•

Таблица 4

Антимикробный, спектр антибиотика алматацина

Тест-организм

| Минимальная подавляющая j концентрация, мкг/ш

Staphylococcus aureus 209 P Bacillus mycoid.es Bacillus subtilia ATCO 6633 Micrococcus luteus ATCCr9341 Bacterium carato-rorum 19 Comamonas terrigena ATCC-8461 Klebsiella pneumoniae 444 Mycobacterium citreum Fusarium solani Rhizoctonia solani Helminthosporium sativum Botrytis cinerea Verticillium dahliae Trichophyton gypseuro Epidermophyton rubrum

4,1

- 7,0

.4,1

37.0

0,5 2,1 0,5 4,1 4,1

11.1 3,6 3,6 4,1 3,6 8,3

тацин оптически неактивен.

В масс-спектре антибиотика обнаружены пики двух глолскуляр! ионов с m/z S84 и II64. На основании олопентног" анализа и м< лекулярной массы, предложены суммарные Оориули шггиЯиотикп ато тацина I (425-1), G^j^Ojq и антибиотика ллишшш 11 (<12!>-1,

Анализ спектральных данных (Уа», ЫС, «асс-с«<.'!:тгхиютрвя) позволил отнести изучаемый антибиотик алынтшуш к грушп 5 лидов. Сравнение алматацана, иротоиноо с псиольгопw

ИК-спектр антибиотика алтатацина

Рис.2

компьютерно It базы данных биологически активных веществ, разработанной Д.Берда (Венгрия) показало его отличие от всех известных антибиотиков по молекулярной массе и другим физико-химическим показателям. •

В кислотном гидролизате обнаружен углеводный фрагмент. Молекулярная масса агликона антибиотика - 513. Получен диацетат алматацина I, соответствующий брутто-формуле молекулярная масса 1071.

ВЫВОДЫ

1. В результате изучения антибиотической активности штаммов актиномицетов отобрано 20 культур с широким антимикробным спектром действия, большинство из которых подавляли в сильной степени рост грамотрицателышх бактерий, в том числе Klebsiella pneumoniae . Из четырех питательных сред -с соевой мукой лучшими для биосинтеза антибиотиков оказались среды А^ и 5339,

2. Изучение антимикробного спектра л некоторых апзпк^-хнми-

ческих свойств выделенных из этих штаммов антибиотиков показало, что препарат Jê 4 идентичен хлорамфениколу (левомицетину), й 531 сходен с иламицшами, JS I88G - ад зарином, Jê 790 - хромошцинашк Антибиотики ,J№ 35К и 1415 отнесены к полипептидам. Препараты 2, 1505 и 1970 представляют собой антибиотические комплексы полцене (гексаена, пентаена и тетраена соответственно) с антибактериальными антибиотиками широкого спектра действия. Антибиотик 25/779 комплекс трех антибиотически активных компонентов, основной из которых является макрокодом.

3. Наибольшую антибиотическую активность в отношении грам-отрицательнцх бактерий проявил штамм ШВ 425. Этот штамм наиболее близок К ВИДУ 3. Candidus (ex Krassilnicor 1970) nom. rev.

» comb. no". , но отличается способностью к биосинтезу нового ыакр лидного антибиотика ашатащша. На основании этого отличия штам ШВ 425 выделен Б НОВЫЙ ПОДВИД. S. Candidus subsp. almatacini subsp. nov , Изучение естественной изменчивости штамма и получе ние культур из его вторичных колоний показало, что он устойчив признаку антабяоишообразовашш.

4. Для биосинтеза алматацина испытано 28 известных синтетг ческих и органических сред, лучшей по уровню накопления антибне тика является среда - рыбная 8. Методом ортогональных латински) прямоугольников проведена ее оптимизация, вследствие чего bhxoj антибиотического вещества увеличен в 2 раза (до 1,2 г/л), антибиотическая активность возросла в 1,5 раза.

5. Разработан метод выделения аяматацина, заключающийся ъ экстракции антибиотика органическими рас творш елями из ыицезлш и фпльтрата культуральной яидкости, упаривании экстрактов и ос. дениа избигком гсксана. Ьолучоншй енрец очищается хромнтоцаф на кнзельгэла или кремневой кяслоте.

3. Изучены физико-химические свойства алматацина. Масс-спектрометрическим методом установлено, что он представляет собой комплекс двух биологически активных компонентов, ашатацина I, с52а?2°18 11 алматацина II, ^^у^йЗ®' В кислотном гидролизате обнаружен углеводный фрагмент. °

Анализ физико-химических и биологических данных позволил отнести антибиотик алматацан к группа иакролвдных антибиотиков. Сравнение изучаемого антибиотика с известными, с использованием компьютерной базы данных биологически активных веществ, .разработанной Д.Верди (Венгрия), показало его отличие от всех известных антибиотиков.

7. Установлено, что алматацан подавляет рост граг.шолокителъ-ных, гршлотрицательнцх, осЬбенно Klebaifella pneumonias , кислотоустойчивых бактерий, фитопатогенных грибов и дерматофитов. Изучаемый антибиотик значительно превосходит по активности в отношении Kleba, pneumoniae известные шкролиднне антибиотики.

шзлшдаи ио 'm.ü десотщи

'. Тортаева S.A., Кэдотина I.l.H. Акганошцот штамм 4 и образуемое км антибиотическое всцестпо // Ш Республиканская научно-теоретическая конференция пожщнх учэшге-мпкробпологов. Тезисы доктэдов.-'faiüKüHT, IS83.-C. 113.

Никитина H.A., Ветлугина .'i.A., Копытина М.Н., Дукравоц H.A., Блинов И.О. Некоторые данные о составе липидной фракции актиношщета штамма 25/77Э // Прим.биохимия и микробиол.-Ш5.~ Т.21.-0,467—170.

3. Алпятова К.Ф,, Рымчанова З.А., Копнтииа ГЛ-If. Ан?ибиота--.оскоя шпяшость актшюмикетоз. чндвлеингяс из поч;з Павл' ^.oinv/al и Кустгшайсгаи областей // Известия АН fcasCJP, сор.биол,

0.53-56.

4. Ветлугина Л.А.8 Адиятова Ж.Ф., Хожамуратова С.Ш., Копыта на М.Н., Треножникова Л.П., Дауренбекова A.C., Ниязгалиева P.M. Выделение и идентификация антибиотиков из актиномицетов, изолированных из почв Казахстана // 1У симпозиум соц.стран по биотехнологии. Тез. докл.-Болгария, Варна.-1986.-С.113.

5. Ветлугина Л.А., Хожамуратова С.Ш., Адиятова Ж.Ф., Рымжа-нова З.А,, Музапбаров Б., Треножникова Л.П,, Копытина М.Н., Ниязгалиева P.M. Распространение редких родов актиномицетов в почвах Казахстана.// Международный симпозиум по экологии микроорганизмов, Тез.докл.-Япония, Киото.-1989.-С.191.

6. Копытина М.Н., Ветлугина Л.А., Федорова Г.Б., Докучаева Т.А., Архангельская H.H., Потапова Н.П, Антибиотик из группы мак-ролидов. Выделение, очистка, изучение физико-химических свойств, идентификация // II Всесоюзный семинар "Актуальные направления поиска антибиотиков". Тез.докл.-Алма-Ата, I989.-C.23.

7. Ветлугина Л.А., Хокамуратова С.Ш., Адиятова Е.Ф., Рымжа-нова З.А., Треножникова Л.П., Копытина М.Н. Выделение актиномицетов из почв Казахстана на селективных средах с антибиотиками // Антибиотики и медицинская биотехнология.-1990.2.-С.3-5.