Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменения активности лизосомальных ферментов при экспериментальных поражениях роговицы и лечении их экстрактами прополиса

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изменения активности лизосомальных ферментов при экспериментальных поражениях роговицы и лечении их экстрактами прополиса"

РГБ ОД

,15 нон

На правах рукописи

Колесников Олег Юрьевич

ИЗМЕНЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПОРАЖЕНИЯХ РОГОВИЦЫ И ЛЕЧЕНИИ ИХ ЭКСТРАКТАМИ ПРОПОЛИСА

03.00.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Рязань - 1999

Работа выполнена в Рязанском государственном медицинском университете имени академика И.П. Павлова

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор В.Г. Макарова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

И.И. Дубинина

кандидат медицинских наук А.В. Дмитриев

Ведущая организация: Воронежская медицинская академия

имени Н.Н. Бурденко

Защита состоится "_"_ 1999 года в " " часов на

заседании Диссертационного Совета Д 084.67.02 при Рязанском государственном медицинском университете имени академика И.П. Павлова (391000, РФ, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Рязанского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова (390026, РФ, г. Рязань, ул. Шевченко, д. 34)

Автореферат разослан "_"_ 1999 года

Учёный секретарь Диссертационного Совета,

кандидат биологических наук Е.А. Рязанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Современными научными исследованиями установлено, что лизо-сомальные ферменты играют важнейшую роль в патогенезе воспалительных и деструктивных заболеваний глаз. Избыточная активность гидро-лаз оказывает прямое повреждающее действие на ткани глаза. Кроме того, лизосомальные протеазы посредством реакций ограниченного про-теолиза осуществляют запуск функциональных биохимических систем, участвующих в развитии воспалительного процесса (В.Н. Орехович и др., 1984; O.A. Кот, В.А. Проценко, 1987; Н.Б. Чеснокова, 1991; В.Ф. Данили-чев, 1996 и др.).

Наиболее тяжёлыми заболеваниями глаз, в патогенезе которых ведущую роль играют гидролитические ферменты, являются химический ожог и гнойная язва роговицы. Установлено, что при ожогах глаз происходит значительное повышение активности ряда лизосомальных гидролитических ферментов: калликреина, эластазы, трипсиноподобных про-теаз, ß-ппокуронидазы, ß-N-ацетилглюкозаминидазы (P.A. Гундорова и др., 1987; Н.Б. Чеснокова, 1991; Т.П. Кузнецова и др., 1994; Е.В. Ченцова, 1996 и др.). Развитие язвенного процесса роговицы также связано с увеличением активности в воспалительном очаге протеолитических ферментов: коллагеназы, плазминоподобных и трипсиноподобных протеаз (B.JI. Осташевский, Т.У. Горгиладзе, 1984; Р.И. Нахикян и др., 1991; В.В. Корчагин и др., 1992; И.А. Макаров, 1993). В связи с этим одним из важнейшим направлений лечебных мероприятий при данных поражениях является снижение избыточной активности гидролитических ферментов.

Наряду с другими лизосомальными гидролазами важную роль в развитии воспалительных и деструктивных процессов играют катепсин D и ß-галактозидаза. Катепсин D обладает широким спектром протеолити-ческого действия, а также кининогеназной активностью. Фермент ß-галактозидаза участвует в катаболизме многих галактозосодержащих суб-

стратов, в том числе, основного мукополисахарида роговицы - кератан-сульфата (A.A. Покровский, В.А. Тутельян, 1976; О.Г. Оглобина и др., 1980; А. Д. Баррет, М. Ф. Хит, 1980; Л.Е. Панин, H.H. Маянская, 1987). Однако, кагепсин D и ß-галактозидаза при ожогах глаз и гнойной язве роговицы остаются неизученными, что определило целесообразность исследований в этом направлении.

Несмотря на многообразие предложенных средств лечения ожогов глаз и гнойных язв роговицы, эта проблема остаётся не до конца решённой, а изучение новых эффективных средств, обладающих комплексным терапевтическим действием, является актуальным.

В последние годы значительно повысился интерес к продуктам пчеловодства в связи с их многогранным и физиологичным действием, а также дешевизной и доступностью. Наиболее широким спектром биологической активности обладает прополис, однако, он практически не растворим в воде, что ограничивает его использование в офтальмологии. Выделенная из прополиса водорастворимая полифенольная фракция (А.И. Тихонов и др., 1974) отличается сложностью производства, в связи с чем глазные лекарственные формы на её основе не получили широкого распространения. Механизмы действия прополиса при глазных заболеваниях практически не изучались. Исходя из этого актуальным является углублённое и всестороннее изучение офтальмологических лекарственных форм прополиса, полученных простыми и доступными способами.

Цель исследования.

Цель настоящей работы состояла в установлении влияния экстрактов прополиса на свободную активность лизосомальных ферментов тканей глаза при тяжёлых экспериментальных поражениях роговицы, а также в оценке их эффективности при данной патологии.

Задачи исследования.

1. Изучить активность катепсина D и ß-галактозидазы в тканях радужки, цилиарного тела и камерной влаге глаза при экспериментальном

щелочном ожоге роговицы III степени и лечении его экстрактами прополиса.

2. Изучить активность катепсина D и ß-галактозидазы в тканях радужки, цилиарного тела и камерной влаге глаза при экспериментальной стафилококковой гнойной язве роговицы и лечении её экстрактами прополиса.

3. Оценить влияние экстрактов прополиса на клиническое течение щелочного ожога роговицы III степени и стафилококковой гнойной язвы роговицы в эксперименте.

4. Исследовать состав, некоторые физико-химические свойства и антимикробную активность водного (1:5) и масляного (1:20) экстрактов прополиса.

5. Дать сравнительную оценку эффективности изучаемых экстрактов прополиса.

Научная нозизна.

Впервые изучена динамика свободной активности катепсина D и ß-галактозидазы в тканях радужки, цилиарного тела и камерной влаге глаза при экспериментальном щелочном ожоге роговицы III степени и стафилококковой гнойной язве роговицы: выявлено значительное повышение активности данных ферментов во все сроки наблюдения, кроме 1-х суток при ожоге, когда она снижалась.

Раскрыт один из биохимических аспектов механизма действия прополиса при изученной глазной патологии: установлено его нормализующее влияние на свободную активность катепсина D и ß-галактозидазы в исследованных тканях глаза.

Впервые изучен качественный состав водного (1:5) и масляного (1:20) экстрактов прополиса: выявлено наличие в них важнейших биологически активных компонентов, а также особой группы веществ - эк-дистероидов; определено количественное содержание полифенолов в водном экстракте прополиса и его осмотическое давление.

Установлена отчётливая антимикробная активность водного и мае ляного экстрактов прополиса in vitro и in vivo.

Практическая значимость.

Установленное нормализующее влияние водного (1:5) и масляногс (1:20) экстрактов прополиса на свободную активность катепсина D и ß галактозидазы в тканях радужки, цилиарного тела и камерной влаге гла за при экспериментальном щелочном ожоге роговицы III степени и ста филококковой гнойной язве роговицы позволяет рассматривать лропо лис как средство патогенетически направленного действия в лечении за болеваний, сопровождающихся повышением свободной активности ли зосомальных ферментов. Высокая эффективность экстрактов прополис* при изученной экспериментальной патологии, наличие в них важнейшю биологически активных веществ, а также отчётливая антимикробная ак тивность определяют перспективность их применения в клинике глазны; болезней.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на V i YI Российских научно - практических конференциях по апитерапш (Сочи, 1996; Рыбное, 1997), Российской научно - практической конферен ции "Ожоги глаз и их последствия" (Москва, 1997), Межрегионально! научно - практической конференции "Офтальмология Центральной Черноземья и Среднего Поволжья в решении проблемы слепоты и слабо видения" (Тамбов, 1997), Российской научно - практической конферен ции "Клинико-инструментальные и физические методы диагностики i лечения постгравматических изменений органа зрения" (Москва, 1998] на клинических конференциях глазных отделений Рязанской клиническо: больницы им. H.A. Семашко и кафедры глазных и JIOP-болезней Раза} ского государственного медицинского университета им акад. И.П. Па! лова (1997, 1998).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы (214 отечественных и 41 иностранный источник). Диссертация иллюстрирована 13 таблицами, 13 графиками, 20 фотографиями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на 123 кроликах, на обоих глазах которых в разных группах воспроизводились щелочной ожог роговицы III степени и стафилококковая гнойная язва роговицы. В каждой группе поражений животные были разделены на 3 серии: без лечения, с лечением водным экстрактом прополиса, с лечением масляным экстрактом прополиса. Экстракты прополиса инсталлировались в конъюнктивальную полость глаза 6 раз в сутки. Для наблюдения за клинической картиной поражений использовались методы фокального освещения, биомикроскопии, проходящего света, офтальмоскопии. Для контроля за динамикой эпителиза-ции роговицы использовались красители (1% раствор метиленового синего и 1% раствор флюоресцеина). Животные забивались методом воздушной эмболии на 1, 3, 7, 14, 21, 28-е сутки после начала наблюдения и печения.

Щелочной ожог роговицы III степени вызывался по методике Н.Б. Чесноковой и др. (1990) в нашей модификации диском из хлопчатобу-нажной ткани диаметром 10 мм, пропитанной 5% раствором гидроксида гатрия с экспозицией 10 сек. Степень тяжести ожога определялась через 3 тса, после чего начиналось лечение.

Стафилококковую гнойную язву роговицы получали по методик« Н.А. Адамовой и др. (1990) в нашей модификации. В пределах трепана ционной насечки диаметром 5 мм и глубиной 0,3 мм ткань роговицы рас спаивалась, отсепарованные слои удалялись и в образовавшийся дефег втиралалась одна стандартная петля (107-108 КОЕ) чистой культуры St aureus 209Р. Через трое суток развивались гнойные язвы роговицы с экс судацией в переднюю камеру глаза, после чего начиналось лечение.

Для проведения биохимических исследований из энуклеированны: глаз выделяли радужку, цилиарное тело и камерную влагу. К камерно] влаге добавляли 0,9% раствор хлорида натрия в соотношении 1:1. Раду* ку и цилиарное тело гомогенизировали, добавляли 0,9% раствор хлорид натрия в соотношении 1:20 и центрифугировали при 3000 об/мин в теч( ние 15 минут. Исследование активности ферментов производили в надс садочной жидкости.

Активность ферментов определялась спектрофотометрическим м< тодом: катепсина D - по гидролизу гемоглобина, Р-галактозидазы - п гидролизу п-нитрофенил-Р-О-галактопиранозида (А.Д. Баррет, М.Ч Хит, 1980). Методы модифицированы для работы с малыми количеств; ми ткани. Белок определяли микробиуретовым методом (Г.А. Кочето: 1980).

Экстракты прополиса готовили по методике, разработанной в Р. занском государственном медицинском университете им. акад. И.П. Па лова, отличающейся простотой и доступностью для аптечных услови Водный экстракт (1:5) получали экстрагированием прополиса дистилл рованной водой на кипящей водяной бане в течение 1 часа с использов нием обратного холодильника, масляный экстракт (1:20) - экстрагиров нием прополиса оливковым маслом на кипящей водяной бане в течен 30 минут.

Исследование изотоничности водного экстракта прополиса npov водили по осмотической резистентности эритроцитов макроскопическ! методом Лимбека и Рибьера. Содержание полифенолов в водном э

тракте определяли методом УФ-спектрофотомегрии. Показатель окис-ляемости водного экстракта определяли по реакции с калия пермангана-том. Состав экстрактов был исследован с помощью качественных химических реакций на флавоноиды и фенольные соединения: цианидиновой, реакции с 3% раствором хлорного железа, реакции с 1 % раствором щёлочи. Качественный состав фенольных соединений экстрактов прополиса анализировали одно- и двумерной хроматографией на бумаге, а также методом хроматографии в тонком слое на пластинах "Силуфол". Рассматривали хроматограммы в обыкновенном и УФ-свете до и после проявления хромогенными реактивами.

Микробная обсеменённость экстрактов прополиса определялась общепринятыми методиками с использованием среды N1. Антимикробная активность экстрактов in vitro проверялась методом серийных разведений в питательном бульоне с использованием Staphylococcus aureus 209Р, Streptococcus pneumoniae, Bacillus micoides HB, Escherichia coli Ml7. Антимикробная активность in vivo оценивалась по уровню микробной обсеменённости отделяемого гнойной язвы роговицы в 4-х группах: без лечения, с лечением 0,25% раствором левомицетина и 30% раствором сульфацила-натрия, с лечением водным экстрактом прополиса, с лечением масляным экстрактом прополиса. Выделение и идентификация микрофлоры производились общепринятыми методиками.

Статистическая обработка материала проведена на компьютере типа IBM PC 486 в среде Windows 3.11 с использованием программы Microsoft Excel 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Активность катепсина D и ß-галактозидазы при щелочном ожоге роговицы III степени.

При ожоге роговицы без лечения (контроль) свободная активность катепсина D в радужке на 1 -е сутки снижалась (56,42 %, р < 0,05), а во все последующие сроки наблюдения достоверно превышала норму (Рис. 1).

28 Сутки

1 Интактная ткань

Лечение водным экстрактом прополиса

□ Лечение масляным экстрактом прополиса

Рис. 1. Динамика активности катепсина D в ткани радужки при щелочном ожоге роговицы III степени. Достоверность различий (р < 0,05) обозначена: * - по сравнению с серией "без лечения", ** - по сравнению с серией "лечение водным экстрактом прополиса".

VD и

X В"

I Интактная ткань

1 3

□ Без лечения

7 14

Е Лечение водным экстрактом прополиса

21

28 Сутк]

□ Лечение масляным экстрактом прополиса

Рис. 2. Динамика активности катепсина D в камерной влаге глаза при щелочном ожоге роговицы III степени. Достоверность различий (р < 0,05) обозначена: * - по сравнению с серией "без лечения", ** - по срав нению с серией "лечениеводным экстрактом прополиса".

Максимальное значение активности фермента зафиксировано на 7-е сутки (353,9 %, р < 0,001). На 14-й день наблюдалось резкое её падение относительно предыдующего срока. Второй, менее значительный подъём активности отмечен на 21-е сутки, а к 28-му дню она несколько снижалась.

В цшшарном теле наблюдалась аналогичная динамика изменений свободной активности катепсина Б: достоверное её снижение относительно нормы на 1-е сугки (57,98 %, р < 0,001) и значительное повышение в последующие сроки с максимальными показателями на 7-е сутки (276,2 %,р< 0,001).

В камерной влаге глаза общий характер изменений показателей был таким же, как в радужке и цилиарном теле, однако, активность фермента на 14-е сутки снижалась менее выраженно, а к 28-м суткам она более значительно превышала уровень интактной ткани (Рис. 2). Максимальная активность катепсина Б также отмечена на 7-е сутки (240,8 %, р <0,001).

При лечении ожога роговицы водным и масляным экстрактами прополиса активность катепсина О в радужке на 1-е сутки повышалась относительно серии ожога без лечения, но оставалась ниже нормы (Рис. 1). На 3-й сутки существенных различий между контролем и сериями с лечением не выявлено. На 7-е сутки, в момент пика активности катепсина О, отмечалось наибольшее снижение показателя относительно контроля при применении обоих экстрактов, более выраженное у водного (в 1,44 раза). На 14-е сугки она падала относительно предыдующего срока не так резко, как в контроле, и достоверно превышала уровень активности при ожоге без лечения. К концу срока наблюдения активность катепсина И в радужке незначительно превышала уровень интактной ткани.

В цилиарном теле и камерной влаге глаза (Рис. 2) влияние экстрактов прополиса на активность катепсина О было аналогичным радужке. На 1-е сутки она была выше, чем в серии без лечения, достоверно в обоих тканях при использовании водного экстракта (р < 0,05). Наиболее значи-

тельное снижение показателей относительно контроля установлено также на 7-е сутки, более выраженное при использовании водного экстракта (в 1,46 раза в цшгаарном теле, р < 0,001; в 1,52 раза в камерной влаге). В ци-лиарном теле так же, как и в радужке, на 14-е сутки активность катепсина В была выше контроля, достоверно при использовании водного экстракта (р < 0,05). В камерной влаге на 14-е сутки активность фермента, в отличие от радужки и цилиарного тела, была достоверно ниже контроля (Рис. 2). К концу срока наблюдения в обоих тканях показатели незначительно превышали норму. Достоверные различия между действием водного и масляного экстрактов прополиса во всех тканях установлены на 7-е сутки, в момент пика активности катепсина О.

Свободная активность р-галактозидазы так же, как и катепсина Б, на 1-е сутки при ожоге без лечения в радужке достоверно снижалась (61,32 %, р < 0,001), а в последующие сроки повышалась относительно нормы, достоверно с 7-х суток (Рис. 3). Наибольший показатель отмечен на 14-е сутки (274,2 %, р < 0,001). На 21-й день активность фермента значительно снижалась относительно предыдующего срока, а на 28-й день отмечался повторный её подъём.

В цилиарном теле и камерной влаге (Рис. 4) динамика изменений активности р-галактозидазы была аналогичной радужке. На 14-е сутки в цилиарном теле активность фермента составляла 249,3 % (р < 0,001). Е камерной влаге отмечено более значительное, по сравнению с радужкой и цилиарным телом, повышение активности фермента: уже на 3-й суткг она достоверно превышала норму (р < 0,001), а на 14-е сутки составляла 334,4 % (р < 0,001). К концу срока наблюдения активность (3 галактозидазы в обоих тканях значительно превышала норму.

При лечении ожога роговицы экстрактами прополиса активност] р-галактозидазы в радужке на 1-е сутки практически не отличалась о' контроля (Рис. 3). Во все последующие сроки она была ниже контроля;

я

u «о

и о S

X

20 10 о

1 Интактная ткань

7

14

21

28 Сутки

□ Без лечения

3 Лечение водным экстрактом прополиса

□ Лечение масляным экстрактом прополиса

Рис. 3. Динамика активности ß-галактозидазы в ткани радужки при щелочном ожоге роговицы III степени. Достоверность различий (р < 0,05) обозначена: * - по сравнению с серией "без лечения", ** - по сравнению с серией "лечение водным экстрактом прополиса".

¡83 Интактная ткань

□ Без лечения ЕЗ Лечение водным экстрактом прополиса

□ Лечение масляным экстрактом прополиса

Рис. 4. Динамика активности ß-галактозидазы в камерной влаге глаза при щелочном ожоге роговицы III степени. Достоверность различий (р <0,05) обозначена: * - по сравнению с серией "без лечения", ** - по сравнению с серией "лечение водным экстрактом прополиса".

различия были достоверны на 7, 14 и 28-е сутки при использовании обоих экстрактов. Наиболее значительное снижение активности фермента установлено на 14-е сутки, соответственно максимальному её значению, более выраженное у водного экстракта (в 1,48 раза). К 28-му дню показатель активности приближался к норме.

Влияние экстрактов прополиса на активность ß-галактозидазы в цилиарном теле и камерной влаге глаза (Рис. 4) было аналогичным радужке: отмечалось некоторое её повышение относительно контроля на 1 -е сутки и снижение в последующие сроки, достоверное (р < 0,05) в большинстве случаев. Наиболее значительное снижение активности также установлено на 14-е сутки, более выраженное при лечении водным экстрактом (в 1,49 раза в цилиарном теле, р < 0,01; в 1,7 раза в камерной влаге). Достоверные различия между действием водного и масляного экстрактов прополиса установлены во всех исследованных тканях на 14-е сутки, в момент пика активности ß-галактозидазы.

Таким образом, щелочной ожог роговицы III степени сопровождался значительными изменениями свободной активности лизосо-мальных гидролитических ферментов катепсина D и ß-галактозидазы в тканях радужки, цшшарного тела и камерной влаге глаза. Снижение свободной активности катепсина D и ß-галактозидазы на 1-е сутки после ожога, по-видимому, связано со смещением pH тканей в щелочную сторону и нарушением проницаемости лизосомных мембран (А.Г. Булычев и др., 1987). Повышение показателей в дальнейшем, видимо, обусловлено резкой лабилизацией мембран лизосом при ожоговой болезни глаз (О.Г Гусева и др., 1989; Д.Ф. Иванов и др., 1985). Значительное снижение по казателей активности после максимального их повышения может был связано с опустошением депо фермента в лизосомах после значительной: их выброса. Однотипный характер изменений показателей в изучаемы) тканях связан с их анатомическим и функциональным родством.

При лечении щелочного ожога роговицы экстрактами прополиса наблюдалось отчётливое снижение повышенной активности катепсина D и ß-галактозидазы во всех исследованных тканях, более выраженное в моменты наибольшего её подъёма. Происходило также выравнивание колебаний активности ферментов как в сторону её понижения, так и повышения. Некоторое повышение активности ферментов на 1-е сутки на фоне лечения экстрактами прополиса, по-видимому, связано с цитопро-текторными свойствами прополиса, а также с кислотными свойствами входящих в экстракты соединений, выполняющих, по-видимому, в данном случае роль антидота и нормализующих внутриклеточый pH при щелочном ожоге. Значительное снижение свободной активности изучаемых ферментов в периоды наибольшего её подъёма, а также предотвращение её резких колебаний при назначении экстрактов прополиса свидетельствует о мембраностабилизнрующем действии прополиса при данной патологии. Не исключаются также и другие виды влияния на активность ферментов, так как в литературе имеются данные об ингиби-рующем действии компонентов прополиса на некоторые ферменты (Ю.Н. Чернов, А.Н. Пашков, 1980; Мирзоева O.K. и др., 1995; J. Simuth et al., 1986; Е. Strehl et al., 1994). Отмечена общая тенденция более выраже-ного влияния на свободную активность лизосомальных гидролаз водного экстракта прополиса по сравнению с масляным, а также значительно большее количество достоверных относительно контроля результатов при использовании водного экстракта. Различия между действием водного и масляного экстрактов статистически достоверны для всех исследованных тканей в момент наибольшего подъёма активности ферментов: для катепсина D - на 7-е сутки, для ß-галактозидазы - на 14-е сутки.

Клинически течение щелочного ожога роговицы без лечения было тяжелым. Наблюдалось позднее начало (на 3-й сутки) и длительное отсутствие полной эпителизации (до 28-го дня) с рецидивированием эрозий роговицы. Почти в половине случаев (в 46,67%) отмечалось развитие

токсического увеита и васкуляризации роговицы. Наибольшая выраженность воспалительно-деструктивных процессов тканей глаза отмечена на 6 - 8-е сутки. В эти же сроки отмечалось резкое повышение активности изучаемых ферментов во всех тканях глаза, что свидетельствует о несомненном их участии в развитии патологического процесса. В конце 3-й недели (18 - 21-е сутки) происходило рецидивирование эрозий роговицы и увеличение их размера, что совпадало со второй волной подъёма активности ферментов. В исходе процесса формировались грубые васкуляри-зированные бельма.

При лечении ожога роговицы водным и масляным экстрактами прополиса отмечалось значительно более лёгкое его течение. Наблюдалась активная регенерация эпителия уже с 1-х суток, а полное завершение эпителизации роговицы отмечалось при использовании водного экстракта на 9-й день, при назначении масляного - на 11-й день; эрозии не рецидивировали. Токсический увеит возникал в 16,67% при применении водного экстракта, в 27,78% - масляного, а васкуляризация роговицы - в 12,5% и 16,67%, соответственно. В исходе процесса формировались неинтенсивные, практически аваскулярные помутнения роговицы, несколько более выраженные при применении масляного экстракта.

Таким образом, благоприятное течение ожога при лечении экстрактами прополиса соответствовало более низкой активности ферментов (кроме 1 -х суток) и сглаживанию её колебаний по срокам наблюдения. Влияние экстрактов прополиса на течение ожога было сходно с эффектом от применения ингибиторов ферменов, которые также снижают воспалительную реакцию, ускоряют эпителизацию роговицы, уменьшают степень её васкуляризации (P.A. Гундорова и др, 1987; Н.Б. Чеснокова, 1992; Е.В. Ченцова, 1996). Некоторое повышение активности ферментов на 1 -е сутки при применении прополиса относительно ожога без лечения является благоприятным фактором, так как в этот срок рекомендуется использование ферментных препаратов для лучшего отторжения некро-тизированных тканей (Е.В. Ченцова, 1996; Ю.А. Капитонов и др., 1996).

2. Активность катепсина В и ¡З-галактозидазы при стафилококковой гнойной язве роговицы.

При гнойной язве роговицы без лечения (контроль) свободная активность катепсина Б уже на 1-е сутки и во все последующие сроки наблюдения значительно превышала норму (р < 0,001) в радужке, цилиар-ном теле (Рис. 5) и камерной влаге. Максимальные показатели активности зафиксированы на 3-й сутки (в радужке - 440,1 %, р < 0,001; в цили-арном теле - 413,9 %, р < 0,001; в камерной влаге глаза - 871,7 %, р < 0,001). В дальнейшем активность фермента во всех тканях постепенно снижалась, но даже на 28-е сутки значительно превышала норму.

Лечение гнойной язвы роговицы водным и масляным экстрактами прополиса приводило к отчётливому снижению относительно контроля активности катепсина Б во все сроки наблюдения и во всех тканях, наиболее значительному на 3-й сутки, в момент максимального её подъёма. В этот срок при использовании водного экстракта прополиса активность фермента снижалась относительно контроля в радужке в 1,55 раза (р < 0,001), в цилиарном теле в 1,56 раза (Рис. 5), в камерной влаге глаза в 1,74 раза (р < 0,001); при назначении масляного экстракта - в радужке в 1,28 раза (р < 0,01), в цилиарном теле в 1,3 раза (Рис. 5), в камерной влаге глаза в 1,4 раза (р < 0,001). В последующие сроки наблюдения происходило дальнейшие снижение активности катепсина Б и к 28-м суткам она приближалась к норме в радужке и цилиарном теле, а в камерной влаге глаза достоверно её превышала (р < 0,001). Более низкая активность фермента в подавляющем большинстве случаев установлена при использовании водного экстракта прополиса по сравнению с масляным. Различия между действием водного и масляного экстрактов прополиса статистически достоверны для катепсина О во всех тканях на 3 сутки, в момент наибольшего подъёма активности (р <0,05).

Динамика активности Р-галактозидазы при гнойной язве роговицы без лечения была аналогичной катепсину Б в радужке, цилиарном теле и

1 3 7 14 21 28 Сутки

Интактная □ Без лечения ВЛечение И Лечение

ткань водным масляным

экстрактом экстрактом

прополиса прополиса

Рис. 5. Динамика активности катепсина О в ткани цилиарного тела при стафилококковой гнойной язве роговицы. Достоверность различий обозначена: * - по сравнению с серией "без лечения" (р <0,01), ** - по сравнению с серией "лечение водным экстрактом прополиса" (р < 0,05).

14 21

28 Сутки

1 Интактная ткань

□ Без лечения

В Лечение водным экстрактом прополиса

□ Лечение масляным экстрактом прополиса

Рис. 6. Динамика активности р-галактозидазы в камерной влаге глаза при стафилококковой гнойной язве роговицы. Достоверность различий обозначена: * - по сравнению с серией "без лечения" (р < 0,001), ** -по сравнению с серией "лечение водным экстрактом прополиса" (р < 0,05).

камерной влаге глаза (Рис. 6). Показатели значительно превышали норму в указанных тканях на протяжении всего периода наблюдения. Наибольших значений активность фермента достигала также на 3-й сутки и составляла в радужке 332,9% (р < 0,001), в цилиарном теле - 378,6% (р < 0,001), в камерной влаге глаза - 919,8% (р < 0,001). В последующем активность р-галактозидазы понижалась, но и к концу срока наблюдения оставалась значительно выше нормы во всех тканях.

При лечении гнойной язвы роговицы экстрактами прополиса наблюдалось существенное снижение относительно контроля активности р-галактозидазы во все сроки наблюдения во всех тканях. Наиболее выраженное снижение показателей отмечалось на 3-й сутки, соответственно их максимальному значению, когда при использовании водного экстракта прополиса активность р-галактозидазы снижалась относительно контроля в радужке в 1,56 раза (р < 0,001), в цилиарном теле в 1,69 раза (р < 0,001), в камерной влаге глаза в 1,82 раза (Рис. 6). При лечении масляным экстрактом на 3-и сутки активность фермента в радужке была ниже контроля в 1,26 раза (р <0,001), в цилиарном теле в 1,4 раза (р < 0,001), в камерной влаге глаза в 1,46 раза (Рис. 6). В дальнейшем активность фермента продолжала снижаться и к 28-м суткам в радужке и цилиарном теле практически она не отличалась от нормы, а в камерной влаге значительно её превышала (р < 0,001), При лечении водным экстрактом прополиса по сравнению с масляным в большинстве случаев установлены более низкие показатели активности фермента. Различия между действием экстрактов прополиса для Р-галактозидазы, также как и для катепсина О, во всех тканях статистически достоверны на 3-й сутки (р < 0,05).

Таким образом, при гнойной язве роговицы без лечения установлено значительное повышение относительно нормы активности катепсина Б и р-галактозидазы в исследованных тканях глаза во все сроки наблюдения, наиболее выраженное в камерной влаге. Показатели активности ферментов были существенно выше, чем при ожоге роговицы, что, оче-

видно, связано с преобладанием при гнойной язве воспалительного компонента, приводящего к повреждению клеток и лабилизации мембран лизосом, а также с миграцией в ткани большого количества лейкоцитов, являющихся важным источником лизосомальных ферментов (O.A. Кот, В.А. Проценко, 1987; В.Ф. Даниличев, 1996).

Лечение гнойной язвы роговицы экстрактами прополиса сопровождалось значительным снижением повышенной активности изучаемых ферментов. Более выраженное снижение активности ферментов при гнойной язве, по сравнению с ожогом, видимо, обусловлено помимо мембраностабилизирующего, противовоспалительным действием прополиса, приводящим к уменьшению лейкоцитарной инфильтрации тканей, Более значительное снижение активности катепсина D и ß-галактозидазы в камерной влаге, по сравнению с радужкой и цилиарным телом, по-видимому, связано с воздействием прополиса также и на проницаемосп тканевых барьеров. Водный экстракт прополиса по сравнению с масляным в большинстве случаев вызывал большее снижение активности катепсина D и ß-галактозидазы. Достоверные различия между действием экстрактов установлены для обоих ферментов во всех тканях на 3-й сутки, в момент пика активности.

Клинически гнойная язва роговицы без лечения представляла собо£ тяжёлый гнойно-деструктивный процесс, который сопровождался замед ленной регенерацией (начало эпителизация отмечено на 2 - 3-й сутки, за вершение - к 21-му дню), длительным вовлечением в процесс сосудистогс тракта (гипопион рассасывался только к 13-му дню), высокой частого! васкуляризации роговицы (в 46,67%). Наибольшая выраженность пато логического процесса отмечена на 2 - 4-е сутки наблюдения, что соответ ствовало значительному повышению активности катепсина D и ß галактозидазы во всех иследованных тканях глаза. В исходе процесс формировались грубые, васкуляризированные помутнения роговицы.

При применении экстрактов прополиса наблюдалось быстрое ослабление гнойной инфильтрации роговицы, эпителизация начиналась уже на 1-е сутки и завершалась при использовании водного экстракта на 7-й день, масляного - на 9-й день; рассасывание гипопиона происходило на 7-й и 9-й день соответственно. Васкуляризация роговицы возникала в в 13,33% при применении водного экстракта и в 20,0% - масляного, а к концу наблюдения отмечено полное запустевание сосудов. Формировались слабоинтенсивные и ограниченные помутнения роговицы, несколько более выраженные при лечении масляным экстрактом.

Как следует из полученных данных, более лёгкое течение гнойной язвы роговицы при лечении экстрактами прополиса сответствовало значительному снижению уровня активности катепсина О и [3-галактозидазы в изучаемых тканях глаза во все сроки наблюдения. Выявленное влияние водного и масляного экстрактов прополиса на клинические проявления гнойной язвы роговицы, заключающееся в уменьшении воспалительной реакции, ускорении процессов регенерации, подавлении васкуляризации роговицы было аналогичным эффекту от применения ингибиторов ферментов при данном заболевании (В.Л. Осташевский, Т.У. Горгиладзе, 1984; Р.И. Нахикян и др., 1991).

Таким образом, как при щелочном ожоге, так и при гнойной язве роговицы имелось соответствие клинических проявлений поражения динамике изменений активности катепсина О и р-галактозидазы в тканях глаза, что подтверждает несомненное участие этих ферментов в патогенезе данных патологических процессов. Чёткая корреляция между положительным клиническим эффектом изученных экстрактов прополиса и снижением свободной активности катепсина О и Р-галактозидазы позволяют предположить, что выявленное влияние прополиса на свободную активность лизосомальных ферментов может лежать в основе его регенераторного и противовоспалительного действия.

3. Исследования состава и свойств экстрактов прополиса.

Качественные химические реакции показали наличие в экстрактах прополиса флавоноидных и фенольных соединений. Установлено наличие в них лепсоокисляющихся веществ (показатель окисляемости обоих экстрактов - 1 сек.) и деценовых кислот (в водном экстракте 0,1%, в масляном - 0,3%). При хроматографическом анализе экстрактов прополиса в них идентифицированы флавоноиды, оксикумарины, фенолкарбоновые кислоты, терпены. В водном экстракте обнаружено большое количество сапонинов, безусловно, играющих роль в терапевтическом действии гидрофильных препаратов прополиса. Впервые установлено присутствие в обоих экстрактах относительно новой группы веществ - экдистероидов, которые обладают выраженными репаративными, анаболическими, противовоспалительными, обезболивающими и другими свойствами (В.Н. Сыров, 1994). Наличие их в прополисе может дополнить объяснение его важнейших биологических свойств и должно учитываться при его стандартизации. Количественное содержание полифенолов в водном экстракте составило 0,24%. Осмотическое давление водного экстракта прополиса находится выше уровня минимальной осмотической резистентности эритроцитов и соответствует таковому 0,48 - 0,85% раствора хлорида натрия. Микробная обсеменённость водного и масляного экстрактов составила 0-2 КОЕ/ мл; различий по этому показателю между экстрактами не выявлено. Выделенная микрофлора была непатогенной и, по-видимому, имела аэрогенное происхождение.

Установлена антимикробная активность водного экстракта прополиса in vitro. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) составила для S. aureus 209Р, S. pneumoniae, В. micoides HB. 250 мкг экстракта на 1 мл, бактерицидная концентрация - 500 мкг/мл; для Е. coli М17 МИК и бактерицидная концентрации - 500 мкг/мл. Высокая антимикробная активность водного и масляного экстрактов прополиса выявлена также in vivo. При лечении экстрактами прополиса стафилококковой гнойной язвы роговицы полное исчезновение патогенной микрофлоры из отде-

ляемого происходило в 1,5 - 2 раза быстрее, чем при лечении традиционными антибактериальными средствами (сочетание 30% раствора сульфа-цила-натрия и 0,25% раствора левомицетина) и в 2,5 - 3 раза быстрее, чем без лечения. Уровень обсеменённости отделяемого в одни и те же сроки был в 5 - 10 раз ниже, чем без лечения, и в 2 - 4 раза меньше, чем при лечении традиционными антибактериальными средствами; различия были статистически достоверны (р < 0,05). Обсеменённость отделяемого при использовании водного экстракта во все сроки была достоверно ниже, чем при назначении масляного (р < 0,05). Установленная высокая антимикробная активность экстрактов прополиса in vivo, помимо прямого антибактериального действия, по-видимому, обусловлена иммуностимулирующими свойствами прополиса, а также отсутствием резистентности к нему микроорганизмов.

Таким образом, водный (1:5) и масляный (1:20) экстракты прополиса содержат в достаточном количестве важнейшие биологически активные вещества и обладают отчётливой антимикробной активностью.

По всем исследованным показателям водный экстракт прополиса оказался эффективнее масляного, что, по-видимому, можно объяснить различным фракционным составом биологически активных соединений, извлекаемых из прополиса водным и масляным экстрагированием, а также их меньшей биодоступностью из масляной основы.

ВЫВОДЫ

1. При экспериментальном щелочном ожоге роговицы III степени на 1-е сутки происходит снижение свободной активности катепсина D и Р-галактозидазы в радужке, цилиарном теле и камерой влаге глаза. В последующие сроки активность данных ферментов во всех исследованных тканях повышается, достигая максимальных значений на 7-е сутки для катепсина D и на 14-е - для р-галактозидазы.

2. Применение водного и масляного экстрактов прополиса при щелочном ожоге роговицы III степени приводит к снижению повышенной свободной активности катепсина D и ß-галактозидазы во всех исследованных тканях глаза, наиболее выраженному в моменты пика активности ферментов: на 7-е сутки для катепсина D и на 14-е - для ß-галактозидазы. На 1-е сутки лечения экстрактами прополиса активность обоих ферментов несколько повышается относительно показателей при ожоге без лечения.

3. Экспериментальная стафилококковая гнойная язва роговицы сопровождается значительным повышением свободной активности катепсина D и ß-галактозидазы во все сроки наблюдения в радужке, цилиар-ном теле и камерой влаге глаза с максимальными показателями на 3-й сутки.

4. Применение водного и масляного экстрактов прополиса при стафилококковой гнойной язве роговицы приводит к снижению свободной активности катепсина D и ß-галактозидазы в исследованных тканях глазг во все сроки наблюдения, наиболее выраженному на 3-й сутки, в момент максимального подъёма активности ферментов.

5. Водный и масляный экстракты прополиса оказывают отчётливог положительное влияние на клиническую картину щелочного ожога poro вицы III степени и стафилококковой гнойной язвы роговицы, значителъ но ускоряя регенерацию, оказывая противовоспалительное действие i улучшая исходы процесса.

6. Водный (1:5) и масляный (1:20) экстракты прополиса содержат i достаточном количестве важнейшие биологически активные соединени! (флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, сесквитерпены, сапонины), ¡ также особую группу веществ - экдистероиды. Изученные экстракть прополиса обладают отчётливой антимикробной активностью in vitro i in vivo.

7. Действие водного экстракта прополиса по сравнению с масляным экстрактом более выражено по всем исследованным показателям.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Выявленное влияние водного (1:5) и масляного (1:20) экстрактов трополиса на свободную активность лизосомальных ферментов в радуж-<е, цилиарном теле и камерой влаге глаза при экспериментальном щеточном ожоге роговицы III степени и стафилококковой гнойной язве роговицы позволяет рекомендовать прополис в качестве средства патогенетической терапии при заболеваниях глаз, сопровождающихся повышением активности лизосомальных гидролаз.

2. Высокая эффективность изученных экстрактов прополиса при тяжёлой экспериментальной патологии глаз, достаточное содержание в шх важнейших биологически активных веществ, а также отчётливое антимикробное действие определяют возможность и перспективность их трименения в клинике глазных болезней.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Колесников О.Ю. Лечение тяжёлых химических ожогов глаз про-голисом в эксперименте II Апитерапия сегодня (Сборник V): Матер. V [ауч. - практ. конф. по апитерапии "Пчёлы и ваше здоровье". - Рыбное, 997.-С. 126-128.

2. Колесников О.Ю. Масляная вытяжка прополиса в лечении экспе-тментальных химических ожогов глаз // Ожоги глаз и их последствия: Латер. науч. - практ. конф. - М., 1997. - С. 30-31.

3. Колесников О.Ю. Прополис в лечении тяжёлых химических ожо-ов глаз // Диагностика и реабилитация физического состояния человека: :б. науч. тр. - Рязань, 1997. - Том 2. - С. 26-28.

4. Колесников О.Ю. Экспериментальное исследование прополиса ри гнойной язве роговицы // Офтальмология Центр. Черноземья и

Средн. Поволжья в решении проблемы слепоты и слабовидения: Те; межрегион, науч. - практ. конф. - Тамбов, 1997. - С. 150-151.

5. Макарова В.Г., Колесников О.Ю. Влияние прополиса на актив носгь р-галактозидазы при экспериментальном химическом ожоге роге вицы // Юпшико-инструментальные и физические методы диагностики 1 лечения посттравматических изменений органа зрения: Науч. - практ конф. - М., 1998.-С. 152-153.

6. Макарова В.Г., Колесников О.Ю. Влияние прополиса на актш носгь лизосомальных ферментов в тканях глаза при экспериментально! химическом ожоге II Апитерапия сегодня (Сборник 6): Матер. VI науч. практ. конф. по апитерапии. - Рязань, 1998. - С. 60-62.

7. Колесников О.Ю., Смирнов И.В., Силин К.А. Микробиологичс екая оценка эффективности лечения прополисом гнойной язвы роговищ // Апитерапия сегодня (Сборник 6): Матер. VI науч. - практ. конф. п апитерапии. - Рязань, 1998. - С. 124-126.

8. Колесников О.Ю., Смирнов И.В., Силин К.А. Новые подходы лечению гнойной язвы роговицы экстрактами прополиса в эксперимент (микробиологические аспекты) // Рос. медико-биол. вестн. им. акад. И.Г Павлова. - 1998. - N1-2. - С. 46-50.

9. Исследование изотоничности водного экстракта прополиса / Т.А Коваленко, О.Ю. Колесников, М.А. Колесникова, Н.Г. Селезенев II Сс временные проблемы фармацевтической науки и практики: Сб. науч. рг бот НИИ фармации. - М., 1999. - Ч. 1. - Т. 38. - С. 184-188.

МИНСКИЙ ОШСТИОЧ ¿¡ЖЙГО

государственной си^ептш/

ЗАЕ* ¿// ТИР

псигкос ■ мип /С- Рб- л?А