Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата растений пшеницы при недостатке азота

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изменение структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата растений пшеницы при недостатке азота"

р гi од

2 0 мй 1997

На правах рукописи

МАКАРОВА Валерия Викторовна

Изменение структурно-функциональной организации

фотосинтетического аппарата растений пшеницы при недостатке азота.

03.00.02 - биофизика; 03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва. 19У7

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук

профессор Кренделева Т.Е.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Иванов Б.Н.

доктор физико-математических наук, профессор Борисов А.Ю.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится 1997г. в 15 ч. 30 мин.

на заседании Диссертационного Совета К.053.05.68 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899 Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет (ЛИК).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "а^/^е^ЛЭЭ! г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук профессор

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Рост растений во многом определяется вза-иодействием процессов фотосинтеза и азотного метаболизма. В последние >ды достигнуты большие успехи в понимании механизмов их взаимодей-зия на метаболитом уровне (Wallsgrove & Lea, 1983; Stulen, 1986). Однако эпросы взаимной регуляции пока остаются открытыми. Многие работы, освященные этой проблеме, выполнены на одноклеточных водорослях, редставляющих собой одновременно и клетку и целый организм кнедиктов, 1990; Tuprin, 1992; Huppe et. al., 1994). Получены многочислен-ые доказательства зависимости скорости фиксации СОг от условий азотного итания вследствие изменения активности ключевых ферментов цикла Кальяна, а также зависимости важнейших ферментов азотного метаболизма от нгенсивности фотосинтеза (Marek & Frank, 1984; Evans & Terashima, 1987). Изменение скорости и направленности темнового метаболизма обеспечивает груктурные перестройки тнлакондных мембран у водорослей; в частности, ахопление продуктов углеводного метаболизма служит сигналом к инакти-1ЩШ ФС2 (Венедиктов, 1990). Показана также светозависнмая метаболит-ая репрессия синтеза белков фотосинтетического аппарата невостебованны-и ассимилятами (Семененко, 1978). Один из механизмов метаболитного энтроля активности ФС2 у водорослей связан с активацией хлоропластного ыхания (Чемерис, 1996). В случае высших растений взаимосвязь фотосинте-I и азотного метаболизма еще сложнее вследствие разной организации их в ространстве и во времени (Алехина н др., 1996). Даже в хлоропластах. где ;сь фотосинтез и восстановление нитрита до азота органических соединений роисходят п одном объеме с использованием одних и тех же энергетических восстановительных -эквивалентов, попрос о .механизмах регуляции ocraerc;i гкрьггым. Мнения о том, насколько нарушения питания азотом влияют на ыакоилнме мембраны, неоднозначны, а экспериментальные факты протп-эречнвы (Caemmcrer & Farquhar, 1981; Tuprin & Weger, 1992).

Цели и задачи исследования. В связи с изложенным выше, целью работы явилось комплексное исследование изменений пигментного аппарата и фотосинтетической активности листьев на начальных этапах азотного голодания, а также функциональной организации электронтранспортной цепи и сопряженных процессов трансформации энергии в изолированных из них хлоропластах.

Необходимо было решить следующие конкретные задачи:

1. изучить фотосинтетическую активность листьев растений, страдающих от недостатка азота в среде;

2. на изолированных из них хлоропластах исследовать организацию и эффективность работы электронтранспортной цепи (ЭТЦ) фотосинтеза;

3. изучить соотношение процессов циклического н нециклического фо-тофосфорнлирования в хлоропластах растений, выращенных в разных условиях снабжения азотом;

4. изучить влияние экзогенного шпрота на первичные процессы фотосинтеза в хлоропластах растений, выращенных в разных условиях снабжения азотом.

Научная новизна. Было проведено комплексное исследование фотосин-тстической активности листьев растений, страдающих от недостатка азота в питательной среде, и первичных процессов фотосинтеза в изолированных из них хлоропластах. Впервые было изучено влияние экзогенного нитрита на процессы трансформации энергии в хлоропластах пшеницы. Было показано, что на начальных этапах азотного голодания первым нарушается синтез сопрягающих Комплексов. Потеря сопрягающих комплексов происходит в большей степени за счет гранального компартмента. Получены дополнительные доказательства того, что недостаток АТФ в стрессовых ситуациях может компенсироваться за счет циклического фотофосфорилирования. Впервые показапо, что первичные процессы фотосинтеза в хлоропластах растений, выращенных без азота, в отличие от контрольных нечувствительны к добавлению чтг'.огсчптсго нитрита.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты, харакгери-тощие функциональные изменения фотосинтетического аппарата на на-шьных этапах азотного голодания, важны для понимания взаимодействия грвичных процессов фотосинтеза с последующими процессами темнового етаболизма у высших растений, а также механизмов адаптации к изменяются условиям среды. Эти результаты могут быть использованы при разра-этке методов мониторинга состояния растений в неблагоприятных условиях инерального питания.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались заседании [ОИП секции биофизики (Москва, 1993); I съезде Белорусского общества отобиологов и биофизиков (Минск, 1994); Ежегодном симпозиуме ВОФР Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1996); Междуна-одной конференции "Биоэнергетика фотосинтеза" (Пущино, 1996); ESF ourse "Biology, Biochemistry and Molecular Biology of Photosynthesis" (Liege, ?96); 10th FESPP Congress "From Molecular Mechanisms to the Plant: an itegrated Approach" (Florence, 1996). Основные результаты доложены и об-/ждены на научном семинаре кафедры биофизики МГУ.

Публикации. Материал опубликован в 7 печатных работах. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на /^"страницах ашинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания етодов исследования, изложения и обсуждешгя результатов, заключения, ыводов и списка цитированной литературы, который включает наиме-

ований на русском и английском языках.

Экспериментальные данные представлены в виде /таблиц и /^рисунков.

Содержание работы Обмр литературы посвящен вопросам взаимосвязи углеродного и зотного метаболизма в растении, а также взаимодействию реакций восста-овления азога я хлоропласте с первичными процессами фотосинтеза.

Объекты исследования. Объектом исследования являлись проростки озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта "Инна", выращенной в водной культуре на 1/10 питательной среды Хоагланда (контроль) и с исключением из среды азота (опыт). Выполнение задач исследования требовало получения хлоропластов, обладающих высокой функциональной активностью и, в то же время, изолированных из листьев, полностью закончивших рост. В связи с этим была изучена динамика накопления хлорофилла, сухой и сырой массы растения, содержания азота в листьях проростков пшеницы. Эти исследования позволили показать, что таким требованиям удовлетворяет второй лист растений пшеннцы в возрасте 17-19 суток. К этому времени полностью закончен рост листовой пластинки, отсутствуют какие-либо признаки старения. Лист играет роль донора в системе донорно-акцепторных отношений растения.

Методы исследовашш. Выделение хлоропластов класса С ("тилакоиды") га листьев пшеницы проводили, как описано ( Кириченко и др., 1993). Суспензию хлоропластов замораживали и хранили в жидком азоте после добавления к ней 20-30% (V/V) глицерина. Содержание хлорофилла (Хл) в суспензиях определяли по формуле Arnon (1949). Пигменты из листьев экстрагировали 80% (V/V) ацетоном. Для расчета содержания Хл а и Хл b использовали коэффициенты Mac-Kixmey (1941). Протопласты выделяли эизи-матическим методом (Leegoоd, Walker, 1979). Интактные хлоропласты (класс А) выделяли из протопластов. Чистоту препаратов контролировали на люминесцентном микроскопе (Lilley et al.,1975). Содержание белка определяли по методу Lowry (1951). Содержание азота C-N- связей определяли после сжигания высушенного растительного материала H2SO4 методом Любошин-ского-Зальта (1954). Нитратный азот в высушенном материале определяли потенциометрическим методом (Разумова и др., 1978). Для измерения количества АТФ в листьях использовали люциферин-люциферазный метод (Strehler, Totter, 1952). Интенсивность фотосинтеза в листьях (при концентрации СОг 0,03% и СО2 0,30%) определяли по скорости поглощения ,4СОг. Кинетику замедленной флуоресценции суспензии хлоропластов регистрировали

а установке, собранной на базе фосфороскопа с интервалом между освеще-ием и измерением 3 мс. Интенсивность возбуждающего света (7. >650 им) 40 т/м2. Содержание Р700 определяли по сигналу ЭПР1 от катион-радикала 700+ (g=0,0025) на радиоспектрометре 3-см диапазона (РЭ -130, НТО РАН ) а свету (Д>700 им) 300 Вт/м2 в присутствии 5 мМ феррицианида калия и 0,5% л!У) тритона Х-100. Расчет концентрации проводили с помощью двойного мигрирования площади сигнала ЭПР 1 . Интенсивность флуоресценции изъяли с помощью импульсного флуориметра. Fmax измеряли в присутствии нурона и гидроксиламина после восстановления Qa постоянным действующи светом галогеновой лампы КГМ-150. Электронный транспорт, фото-юсфорилирование и Н+-АТРазную активность определяли в суспензиях ти-акоидов (Krendeleva, et al., 1996). Спектры низкотемпературной флуорес-;енпии (77° Ю были записаны на флуорнметре СПИЛ (СКБ РАН).

Результаты и обсуждение.

1. Содержание различных форм азота в листьях пшеницы, выращенной . разных условиях питаиия азотом. Второй лист проростков растений, выра-ценных без азота, существенно отличался от контроля по количеству азот-одержащих соединений (табл. 1). Общее содержание восстановленных форм зота (азот -C-N- связей) в 1,5-2 раза выше в листьях контрольного варианта. )собенно велики различия между вариантами на целый лист: у контрольного арианта второй лист содержал азота почти в 3 раза больше, чем второй лист ¡астений, выращенных на среде с исключением азота. Еще большие различия [аблюдались в содержании нитратов. В листьях опытного варианта они [рактически отсутстаоиати.

Обращает на себя внимание тот факт, что протопласты, изолированные п листьев, значительно различающихся по содержанию общего азота, не су-дественно отличались по содержанию бежа на 1 мг Хл. Это позполяег ду-ííiTb, что различия в содержании азота в листьях разных вариантов связаны , большей степени с небелковыми формами азота (азот свободных амшюкис-

лот и амидов). Полученные данные указывают также на отсутствие деструктивных процессов в клетках листа обоих вариантов. Некоторая разница между вариантами в содержании белка в шггактных хлоропластах может быта связана, как отмечалось ранее (Huppe & Tuprin, 1994), с уменьшением содержания РБФК в хлоропластах растений, выращенных при недостатке азота Тилакоиды разных вариантов по соотношению белок/ Хл не различались.

Таблица 1. Содероюание различных форм азота во втором листе 17-дневных

проростков пшеницы.

Форма Контроль Опыт

в мкг на лист 830,35±13,8 338,07±5,40

Азот в мг на дм2 листа 7,8010,12 4,47±0,07

-C-N- в мкг на мг сыр. массы 6,27±0,10 4,16±0,07

в мкг на мг сух. массы 59,40±1,10 28,10±0,40

Азот в мкг на лист 359,65+30,31 2,19+0,17

NOy " в мкг на мг сух. массы 25,54+2,30 0,23±0,02

протопластов (мг/1 мгХл) 7,12±0,09 6,65±0,07

Белок шггактных хлоропластов (-) 5,10±0,23 4,26±0,05

тилакоидов (-) 3,46±0,12 3,46±0,17

2. Содержание хлорофилла во втором листе 17-дневкых проростког пшеницы, выращенной в разных условиях питания азотом. Kaie показали на ши исследования, второй лист 17- дневных проростков пшеницы, выращен ных без азота, несмотря на существенные различия по суммарному содержа шло азота, по содержанию хлорофилла отличался от контроля в меньше; степени: содержание Хл во втором листе растений составило около 60% Хл от контроля (табл. 2). При этом различия в содержании Хл на 1 г сырой массы i единицу площади листа невелики; на 1 г сухой массы листа у опытных расге пий содержание Хл на треть ниже, чем у контрольных. Существенных томе нений в величине отношения Хл а/Хл b нет, что при недостатке азота в сред* отмечалось неоднократно (MacNab, et al., 1986: Evans & Terashima,1987), i

отличие от других стрессов. Это позволяет думать, что, по крайней мере на начальных этапах голодания по азоту, соотношение основных макромолеку-лярных пигмент-белковых комплексов, входящих в механизм трансформации световой энергии на мембранах тилакоидов, изменяется несущественно.

Таблица 2. Содержание хлорофилла во втором листе 17-дневных проростков пшеницы.

Хлорофилл в мг Контроль Опыт

на лист 0,24±0,02 0,15±0,01

на дм2 листа 2,26+0,29 1,79±0,14

на 1 г сыр. массы 2,01±0,27 1,87±0,11

на 1 г сух. массы 18,95±2,58 12,64±0,83

Хля/ХлЬ 2,49±0,07 2,62±0,09

3. Фотосинтетическая активность второго листа 17-дневных проростков пшеницы, выращенной в разных условиях питания азотом. Реальная скорость фиксации ,4СОг в расчете на лист или единицу сухой массы листа при обычной концентрации СОг в воздухе (0,03%) у проростков, выращенных при недостатке азота, примерно на 25% ниже, чем у контрольных (табл. 3). На единицу поверхности листа скорость фотосинтеза при этой концентрации СОг примерно одинакова у обоих вариантов растений. Однако, как было показано выше, содержание Хл в расчете на единицу площади на 20% ниже у растений, выращенных без азота. Следовательно, па 1 мг Хл интенсивность фотосинтеза у них не только не ниже, чем у контрольного варианта, но даже превышает ее. Еше большие различия между вариантами наблюдались при измерении фотосинтеза при 0,30% СОг- Скорость потенциального фотосинтеза несколько ниже у растений, выращенных без азота на лист, на единицу сухой массы и единицу площади. В расчете на 1 мг Хл различий в скорости потенциального фотосинтеза не было. Т. о., фиксация СОг примерно одинакова у контрольных и опытных растений на единицу Хл. Однако увеличение кон-

центрации СО2 в среде повышало фотосинтез контрольных проростков на 80%, в то время как у страдающих от недостатка азота - только на 50%. Таблица 3. Скорость фотосинтеза второго листа 17-дневных проростков пшеницы.

Фотосинтез мкмоль 14СОг /мин при 0,03% СОг при 0,30% СОг

Контроль Опыт Контроль Опыт

на лист 1,55±0,10 1,1110,07 2,76Ю,04 1,6910,07

на дм2 листа 14,52±1,01 13,77+0,89 25,91Ю,44 20,9810,89

на 1 г сух. массы 110,0017,66 86,3315,56 196,3413,38 131,9715,61

на 1 мгХл 5,80+0,40 6.8310,45 10,3510,18 10,44Ю,45

Определение содержания АТФ в листьях в темновой период и после краткого освещения листьев подтверждает, что in vivo процессы фотосинтеза имеют большую скорость у контрольных растений. Известно, что содержание АТФ поддерживается на определенном уровне и является суммарным результатом процессов ее синтеза и расхода, поэтому изменения в содержании более заметны во время "переходных" процессов (Бухов, 1988). Полученные нами результаты показывают (табл. 4), что у опытного варианта содержание АТФ на 1 г сух. массы листа примерно такое же как у контроля. При перенесении растений на свст АТФ расходуется на процессы активации РБФК и включение фотосинтеза. При этом через 2 мин освещения в листьях контрольных растений содержание АТФ уменьшалось на 35 %, в го время как у опытных эти изменения гораздо меньше.

Таблица 4. Содержание АТФ (мкг хг'1 сух. веса) во втором листе 17- дневных проростков пшеницы, выращенных в разных условиях питания азотом.

Контроль Опыт

в темноте 243,80±21,87 256,10120,48

после 2 мин освещения 156,60±10,92 244.30119,52

4. Фотохимическая активность хлоропластов, изолированных из 17-невных проростков пшеницы, выращенной в различных условиях питания зотом. Поскольку хлоропласты растений, выращенных без азота, на этой гадии развития растений мало отличаются по скорости фотосинтеза в расче-г на Хл, но различаются на единицу сухой массы, представляло интерес из-чить функциональную организацию первичных процессов фотосинтеза.

Была исследована фотохимическая активность хлоропластов, выделен-ых из второго листа 17-дневных проростков, выращенных в присутствии и ез азота в питательной среде. Определение скорости электронного транспора в шолированных тилакоидах показало, что нет разницы между варианта-[И по скорости восстановления 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) габл. 5). ДХФИФ акцептирует электроны после ФС2, относится к акцепто-ам третьего класса, и поток электронов от воды к ДХФИФ не сопряжен с [роцессами запасания энергии (ЭаЬа е1 а!., 1971, ТгеЬв!, 1972). Полученные езультаты позволяют думать, что нет существенных различий у тилакоидов азных вариантов по содержанию функционально активных реакционных (ентров ФС2. Это предположение хорошо согласуется с результатами изучены параметров флуоресценции, генерируемой в ФС2. Показано, что отно-иение переменной флуоресценции к максимальной (Ру/Р'тах), характери-ующее эффективность использования энергии возбуждения открытыми ре-жционными центрами, примерно одинаково: 0,78 для хлоропластов кон-рольного варианта и 0,77 для хлоропластов растений, выращенных прн не-(остаттсе азота.

Линейный поток электронов от воды к феррицианиду обеспечивается |бенмн ФС. Из данных табл. 5 видно, что скорость восстановления ферри-(нанида несколько выше в хлороиластах опытного варианта. Это может >ыть следствием частичного разобщения процессов электронного транспорта I фотофосфорнлнровання. Действительно, добавление разобгщггеля (2 мМ N Н4С1) сильнее увеличиваю поток электронов к феррицианиду у контроль-шх хлоропластов (табл.6). Еще большая разница между вариантами наблго-;алась в случае сопряженного с образованием АТФ потока электронов. До-

бавлегше фосфатакцепторной системы (АДФ+Ф) более чем вдвое увеличивало скорость восстановления феррицианида контрольными хлоропластамк и только наполовину- опытными. Таблица 5. Фотохимическая активность хлоропластов пшеницы, изолирован-

ных из второго листа 17-дневных проростков, в мкмолъхмг1 Хлхч1.

Комплекс Реакция Контроль Опыт

ФС2 восстановление ДХФИФ 84,6 83,8

ФС1+ФС2 восстановление феррицианида 72,5 91,2

В таблице приведены данные одного из пяти опытов с 3-кратной аналитической повторностью..

Таблица 6. Влияние ЫН4С1 и АДФ+Ф на скорость восстановления феррицианида хлоропластами.

Стимуляция, %

Добавка Контроль Опыт

2 мКШН4С1 221 167

1,7 мМ АДФ+ 1,7 мМ К2НР04 236 142

Таким образом, эффективность работы ЭТЦ фотосинтеза в таких хло ропластах снижена: электронный транспорт в меньшей мере сопряжен с запа санием энергии в виде АТФ. Это подтверждается измерениями скорости фо тофосфорилирования в присутствии метилвиологена (МВ), восстановлен» которого также обеспечивается обеими ФС. Скорость нециклического фото фосфорилирования более чем в два раза выше у контрольных, чем у опытны: хлоропластов (табл.7).

Полученные нами данные по соотношению Р700/Хл (ммоль/моль) по казали, что у хлоропластов контрольного варианта эта величина равна 3,03 в то время как у хлоропластов растений, выращешшх без азота - 2,41. Эт< указывает на снижение содержания комплексов с РЦ ФС1. В то же время ско

рость линейного электронного транспорта, как было показано выше, не снижалась. Ранее уже отмечалось, что ФС1 не ограничивает линейный электронный транспорт (Leong, Anderson, 1983).

Чтобы оценить вклад ФС1 в запасание энергии в хлор о пластах двух вариантов было изучено фотофосфорилирование. с феназинметосульфатом (ФМС) или пиоцианином в качестве кофакторов в присутствии диурона. В этих условиях работа ФС2 полностью блокирована и фотофосфорилирование сопряжено исключительно с циклическим потоком электронов, индуцируемым ФС1. Обращает на себя внимание то обстоятельство, что, несмотря на метшее содержание Р700, в присутствии обоих кофакторов выход АТФ при фотофосфорилировании достоверно выше в суспензии опытных хлороплас-тов по сравнению с контрольными (табл. 7). ФМС и пиоцианин индуцируют модельный циклический поток электронов, который, в отличие от нативного цикла, зависит только от числа функционально активных копмлексов ФС1 и растворимости кофакторов в липидном матриксе мембраны тилакоида и не имеет "узких мест", характерных для нативного циклического потока электронов через ферредоксин и ЬвГ-цитохромный комплекс. Нециклический поток электронов, сопряженный с функционированием только ФС1, индуцируемый в присутствии диурона от искусственного донора (ДХФИФ-Щ ) к MB, также сопряжен с образованием АТФ. В отличие от описанных выше модельных циклов он включает Ьб/f и пластоцнанин (Trebst, 1980). Как видно из табл. 7, скорость образования АТФ сопряженно с этим потоком одинакова для обоих вариантов.Количества сопрягающих комплексов в тилакоидах, видимо, достаточно для обеспечения высоких скоростей циклического фото-фосфорилирования.

Активность светоиндуцированной Mg2+-3aBncnMofi Н+-АТФазы, также определяемая функционированием сопрягающего комплекса хлоропластов. существенно выше в тилакоидах контрольных растений (табл. 7). Причиной снижения эффективности запасания энергии в виде АТФ у хлоропластов растений, выращенных при недостатке азота, может бьпъ уменьшение числа сопрягающих комплексов. Об этом говорит снижение активности АТФазы,

измеряемой в условиях, когда скорость гидролиза АТФ определяется только их числом. Выходы АТФ в процессах нециклического фотофосфорилирова-ния, осуществляющегося с участием обеих ФС, падали у тилакоидов растений, страдающих от недостатка азота; а в циклическом фотофосфорилирова-нии, так же как и нециклическом с участием только ФС1, не изменялись или даже возрастали. Можно предположить, что потеря части сопрягающих комплексов в этих тилакоидах происходит в большей степени за счет гранального компартменга.

Таблица 7. Скорость фотофосфорширования и активность М^-зависимой Н* - А ТФазы в хлоропластах пшеницы, изолированных из второго листа

17-дневных проростков, в мкмолъхмг'1 Хлхн1.

Комплекс Реакция Контроль Опыт

ФС1+ФС2 фотофосфорилирование в присутствии МВ 112,2 51,0

ФС1 фотофосфорилирование в присутствии ФМС* 58,1 88,3

фотофосфорилирование в присутствии пиоциштиа* 53,6 81,3

фотофосфорилирование по цепи ДХФИФ-Нг-*ФС 1 ->МВ* 28,5 28,8

СР|-СР0 Н+-АТФаза 45,0 28,8

* Реакции проведены в присутствии диурона.

В таблице приведены данные одного из пяти опытов с 3-кратной аналитической повторностыо.

5. Влияние разобщитедей и фосфатакцепторной системы на характеристики замедленной флуоресценции (ЗФ) хлоропластов пшеницы, выращенной в различных условиях питания азотом. Изучение кинетики ЗФ, генерируемой в ФС2, позволяет получить информацию об эффективности запасания энергии. На кинетических кривых ЗФ изолированных тилакоидов, утративших ферменты цикла фиксации СОг, обычно наблюдаются две компо-

ненты- быстрая (Oi Ii) и медленная (DiPi). Показано, что величина медленной компоненты качественно коррелирует с величиной фотоиндуцирован-ной ДрН на мембране, быстрая зависит в основном от числа рекомбини-руюгцих центров ФС2 и электрической составляющей электрохимического потенциала (Д<р) (Evans & Crofts, 1973 Malkin & Barber, 1978). При выравненном содержании Хл в суспензиях тилакоидов величина медленной компоненты у контрольного варианта несколько больше, что может указывать на большую величину стационарной ДрН (рис.1А). Так как величина несопряженного электронного транспорта в тилакоидах опытного варианта даже выше, чем у контроля, причиной снижения стационарной величины ДрН в тилакоидах растений, страдающих от недостатка азота, может быть увеличение неспецифической ионной проводимости вследствие дефектов мембраны.

Добавление в среду АДФ+Ф в большей степени ускоряло разрядку ДрН у контрольных тилакоидов (рис. 1Б). 2,5 мМ (АДФ+Ф) было достаточно, чтобы величина отношения Oili/ DiPi в кошрольном варианте снизилась почти втрое, в то время как снижение в опытном варианте не превышало 30%. Эти данные хорошо согласуются с результатами экспериментов по определению скорости нециклического фотофосфорилирования.

Причиной снижения эффективности запасания энергии в виде АТФ у хлоропластов растений, выращенных при недостатке азота, может бьггь уменьшение числа сопрягающих комплексов (см. пред. раздел). Добавление комбинации нигерицина и валиномицина в концентрациях, полностью дис-сипирующих Дцнъ одинаково влияло на спад кинетических кривых ЗФ (рисЛБ); видимо свойства мембран примерно одинаковы у обоих вариантов тилакоидов. Вся регистрируемая ЗФ генерируется в ФС2, однако в разрядке мембраны в присутствии разобщителей или АДФ+Ф могут участвовать сопрягающие комплексы, связанные с работой любой из ФС, и все участки мембраны- как гранальные, так и стромальные.

А

Контроль Ю с Опыт

1. ~ *

[АДФ+Ф], мМ (10-7[Вм]+10-8[Нг]),М

Рис.Г(А) Индукционная крийая ЗФ тилакоидов, изолированных из 17-дневных проростков пшеницы, выращенных в присутствии (контроль) и без азота (опыт). Olli - быстрая фаза индукционной кривой DiPj - медленная фаза индукционной кривой

Стрелка вверх- включение света, стрелка вниз- выключение света.

(Б) Влияние фосфатакцепторной системы АДФ+Ф (сплошная линия) и комбинации валиномицина и нигерицина Вм+Нг (пунктирная линия) на отношение Olli/ DiPi , 1- контроль; 2 - опыт

Для того, чтобы вычленить участок электронного транспорта, связанный с работой только ФС2, а следовательно с гранальным компартментом тилакоидов, бьша исследована короткая модельная электротранспортная цепь НгО -»ФС2-» ДБТХ ->ФДА (р-фенилендиамин).

Функционирование этого участка ЭТЦ сопряжено с энергизацией мембраны хлоропластов и сопровождается образованием АТФ (Наивка, ТгеЬв1, 1977). Добавление одного ДБТХ к суспензии тилакоидов нарушает электронный транспорт и изменяет характер индукционной кривой ЗФ аналогично диурону, вызывая тушение медленной компоненты. Поскольку электронный транспорт блокирован, энергазация мембран отсутствует. ФДА является акцептором электронов от ФС2 (ЭаЪа, Ош1гаки1, е1 а1., 1971). Добавление ФДА в концентрации 1(И М возобновляет транспорт электронов через ФС2. При этом восстанавливается медленная компонента индукционной кривой, что указывает на появление энергизации на мембране (индукционные кривые приведены в диссертации). Вид кривых для контрольного и опытного варианта примерно одинаков, что согласуется с ранее приведенными данными, указывающими на равное число РЦ ФС2 в расчете на единицу Хл у обоих вариантов. Изменения кинетических кривых при добавлении разобщителей одинаковы в обоих вариантах, что указывает на отсутствие существенных различий в свойствах мембран гранального компартмента.

Для снижения энергизации мембраны на участке Н20-»ФС2->ДБТХ-»ФДА необходимы меньшие концентрации АДФ+Ф, в отличие от тилакоидов, где работают обе ФС. Количество сопрягающих комплексов в гр анальном компартменте меньше, чем в сгромальных тилако-идах (только в торцовых и маргинальных участках мембраны), поэтому достаточно низкой концентрации АДФ+Ф, чтобы обеспечить функционирование всех сопрягающих комплексов, связазанных с ФС2. Концентрация АДФ+Ф, вызывающая насыщающий эффект, в 2 раза ниже для хлоропластов растений, выращенных без азота. Это соответствует предположению, что потеря сопрягающих комплексов у опытных растений может быть в большей степени за счет гранального компартмента.

6. Влняиие экзогенного нитрита на первичны«; процессы фотосинтеза хлоропластов пшеницы, выращенной в разных условиях питания азотом.

Нитрит, образующийся в цитозоле путем восстановления нитрата, является начальным звеном пути восстановления азота в хлоропласте. Нитрит - водорастворимый анион, поэтому, поступив внутрь хлоропласта, должен находиться в водной фазе стромы и, скорее всего, будет взаимодействовать с положительно-заряженными группами белков на внешней поверхности тилако-ида. С этих позиций было интересно изучить влияние экзогенного нитрита на первичные процессы фотосинтеза в тилакоидах, поскольку in situ нитрит находится по отношению к ним во внешней водной фазе в строме хлоропласта. Имеющиеся в литературе данные по влиянию нитрита на процессы фотосинтетического электронного транспорта немногочисленны и противоречивы'(Spiller & Boger, 1977; Stemmler & Murphy; 1985). Высказывались предположения, что нитрит может ингибировать электронный транспорт и влиять на перераспределение энергии возбуждения между ФС (Sinclair, 1987). Данные по влиянию нитрита на процессы запасания энергии нам неизвестны. В связи с этим было изучено действие нитрита на фотофосфорилирование в присутствии разных кофакторов. Показано, что 5 мМ шпрот существенно подавлял нециклическое фотофосфорилирование с MB в препаратах тилако-идов из контрольных растений. В отличие от этого, экзогенный нитрит увеличивал циклическое фотофосфорилирование с ФМС, также как и нециклическое, сопряженное с модельным потоком электронов от искусственного донора только через ФС1. Аналогичная зависимость получена также для Mg24-зависимой Н+- АТФазы. Следует отметить, что влияние нитрита специфично, другие одновалентные анионы такого действия не оказывали. Можно думать, что ингибирование нециклического фотофосфориллровании связано с ингибированием нециклического потока электронов, которое отмечалось ранее (Sinclair, 1987). Реакции самого АТФазиого комплекса стимулировались нитритом; второй причиной стимулирования фотофосфорилиропания. сопряженного с ФС1, может быть перераспределение энергии поглощенных

свантов в пользу ФС1. Это согласуется с результатами, указывающими на стимуляцию потока электронов от ДХФИФ-Нг через ФС1 и МВ к кислороду реакция Мелера).

. ' Следует отметить, что все приведенные выше реакции тнлакоидов на тобавление экзогенного нитрита отсутствовали в хлоропластах растений, зыращенных без азота (табл.8). Создается впечатление, что тилакоиды этого варианта лишены специфичного для Н1ггрита места посадки. Другое объяснение может быть связано с предположением о том, что в отсутствие нитрата в питательной среде структура изменяется таким же образом, как прн добавле-[ши экзогенного нитрита к изолированным хлоропластам. Поэтому хлоро-пласты растений, страдающих от недостатка азота, больше не могут измениться при добавлении нитрита, в отличие от контрольных.

Таблица 8. Влияние нитрита на фотофосфорилировапие, Н+- А ТФазную

активность и реакцию Мелера, мкмолъхмг1 Хлхч'.

Комплекс Реакция Контроль Опыт

- +К02 - +N02

ФС1+ФС2 фотофосфорилировапие в присутствии МВ 109,15 73,85 (68%) 68,31 68,31 (100%)

ФС1 ф отоф осфорилирование в присутствии ФМС* 141,70 207,60 (147%) 158,93 158,94 (100%)

фотофосфорилировапие ДХФИФвоссг. ->ФС1-»МВ 28,50 * 42,70 (150%) 28,80 28,80 (100%)

реакция Мелера* 120,60 228,10 (189%) 156,00 150,10 (96%)

;опрягающий комплекс Н+-ЛТФаза 45,90 57,24 (124%) 32,26 32,26 (100%)

* Реакции проведены в присутствии диурона.

В таблице приведены данные одного из пяти опытов с 3-кратной аналитической повторностыо.

Для проверки предположения о возможном влиянии нитрита на процессы перераспределения энергии поглощенных квантов было изучено его влияние на спектры низкотемпературной флуоресценции хлоропластов. Спектр низкотемпературной флуоресценции тилакоидов пшеницы (спектр приведен в диссертации) включает три полосы 685 нм, 695 нм и 740 нм. Две первые связаны с ФС2, последняя возникает за счет испускания флуоресценции ФС1 (Mullet, 1980; Hipkins & Baker, 1986). Соотношение основных полос позволяет оценить распределение энергии возбуждения между двумя фотосистемами (Strasser & Butler, 1977; Butler, 1978). Не обнаружено различий в спектрах низкотемпературной флуоресценции контрольного и опытного варианта, снятых до и после предварительного освещения хлоропластов. Изменения отношения максимумов полос в спектрах низкотемпературной флуоресценции (Fl АО/ F695) хлоропластов под действием 5 мМ нитрита после 15-минутной экспозиции приведены в табл. 9.

Таблица 9. Влияние нитрита на соотношение полос низкотемпературной флуоресценции (F740/F695) хлоропластов

_контрольного и опытного вариантов._

Контроль_Опыт_

в темноте 3,34 3,17

после 15 мин освещения 4,53(136%) 3,34(111%)

В отсутствие экзогенного нитрита величина отношения F740/F695 у контрольного варианта в темноте и после 15 мин освещения одинакова. В присутствии нитрита после освещения величина отношения возрастала. Полученные результаты свидетельствуют о перераспределении энергии возбуждения в пользу ФС1 в присутствии нитрит-иона в тилажоидах контрольного варианта пшеницы. Эти данные подтверждают полученные ранее для шпината (Sinclair, 1987). На спектры низкотемпературной флуоресценции тилакоидов, выращенных без азота, добавление нитрита влияло ь меньшей степени.

Дополнительная информация о влиянии нитрита п тилакондах была получена по параметрам ЗФ. Добавление нитрита до конечных концентра-

цнй в реакционной среде 0,5-2,5 мМ снижало величину отношения Olli / D1P1 для тилакоидов контрольного варианта (рис.2). Влияние нитрита на параметры ЗФ контрольных тилакоидов в условиях функционирования "короткой" электронтранспортной цепи от НгО через ФС2 имело тот же характер, хотя величина эффекта меньше.

Была сделана попытка изучить влияние шприта на ЗФ системы, реконструированной на основе иитактных хлоропластов, подвергнутых процедуре "замораживание-оттаивание". В отличие от тилакоидов, представляющих собой систему накопительную, нативные хлоропласты таковой не являются, энергия расходуется на процессы фиксации СОг, поэтому медленная компонента в кинетической кривой ЗФ отсутствует. Такую же кинетику ЗФ имеют эти хлоропласты после процедуры "замораживания-оттаивания". При этом они теряют ннтактность, их наружные оболочки нарушаются, водорастворимые белки стромы выходя!' в раствор, где могут происходить фермента-тивгале процессы, в том числе из циклов восстановления углерода и азота, потребляющие восстановители и энергшо. Кинетическая кривая ЗФ такой системы аналогична кривым для интактных хлоропластов и клеток микроводорослей, где идут все процессы метаболизма (Веселовский и др., 1983). Быстрое падение ЗФ объясняется расходом АТФ в энергозависимых реакциях.

Добавлением ДБТХ в комбинации с ФДА, обеспечивающим электронный транспорт только через ФС2, удалось получить сопряженный поток электронов и, соотвественно, двухфазную кинетику, аналогичную таковой для тилакоидов. Изучение влияния нитрита на эту систему показало, что оно сходно с действием нитрита на ЗФ тилакоидов (рис.2). Система, реконструированная на основе нативных хлоропластов опытных растений оказалась нечувствительной к действию экзогенного нитрита, в отличие от контрольных хлоропластов (рис.2). Эти данные хорошо согласуются с отсутствием действия шприта на фотохимические процессы и предположением об отсутствии мест посадки, специфичных для шприта.

[N02"] , мМ

Рис. 2. Влияние экзогенного нитрита на характеристики ЗФ.

1 - тилакоиды контрольного варианта без экзогенных кофакторов;

2 - те же тилакоиды, "короткая" цепь (Н20-»ФС2-»ДБТХ->ФДА);

3 - система, реконструированная на основе интактных хлороплас-тов контрольного варианта;

4 - аналогичная система на основе интактных хлороплаетов опытного варианта.

Заключение

Уже на начальных этапах голодания по азоту в листьях растений про-сходят существенные изменения: в 2,5 раза снижается содержание восстано-ленных форм азота (в основном за счет небелкового азота), заметно умень-тается сухая масса и площадь листьев. Величина отношения белок/Хл измелется несущественно, скорость фиксации СОг при ее обычной концентрации воздухе в расчете на единицу Хл не только не снижается, но даже прсвы-iaer таковую для контрольного варианта. Повышение концентрации СО2 в ольшей степени увеличивает фотосинтез у контрольных растений, при этом корости фотосинтеза на единицу Хл становятся одинаковыми у обоих вари-нтов. Таким образом, потенциальные возможности фотосинтеза контроль-ых хлоропласгов выше; у растений, страдающих от недостатка азота, часть резервных возможностей" уже использована и при обычной концентрации Ю2.

Изучение структурно-функциональной организации тилакондов пока-ало, что нет существенных различий меэвду вариантами по потенциальной ктивности линейной ЭТЦ. При недостатке азота, в отличие от одноклеточ-:ых водорослей (Венедиктов, 1990), в изолированных из второго листа хло-опластах не изменялось число РЦ ФС2 и эффективность использования ими оглощенных квантов света. Число РЦ ФС1 на 1 мг Хл уменьшалось на 20%, днако, у высших растений это не ограничивает линейный электронный ранспорт, как было показано ранее (Leong & Anderson, 1983). Меньшая сти-[уляция нециклического потока электронов разобщителями и АДФ+Ф и меныпение скорости нециклического фотофосфоршшрования указывают на нижение эффективности запасания энергии в виде АТФ.

Одним из первых заметных изменений в организации тилакоидов при едостатке азота является уменьшение числа сопрягающих комплексов, прием в большей степени за счет гранального компартмента. Недостаток АТФ южет компенагроваться в некоторой степени за счет увеличения скорости апатического фотофосфоршшрования. Это является частью механизма адап-ации, который позволяет' хлоропластам in situ сохранить достаточно высо-

кую скорость фиксации СОг на ранних этапах голодания но азогу. Видимо, имеют место и другие изменения в мембране. Некоторая разобщенность нециклического потока электронов указывает на существование песпецифиче-ских дефектов самой мембраны тилакоида, видимо, также в большей степени в гранальном компартменте.

Наиболее четко различия в мембранах хлоропластов проявляются по влиянию экзогенного шприта, добавление которого к среде хорошо моделирует ситуацию in situ. Нитрит - водорастворимый анион, поэтому, поступив внутрь хлоропласта, должен находиться в водной фазе стромы и взаимодействовать с положительно-заряженными группами растворимых белков и доступных снаружи мембранных белков тилакоида. По изменению соотношения полос низкотемпературной флуоресценции было подтверждено высказанное ранее предположение, что добавление шприта к нормальным хлоро-пластам влияет на перераспределение энергии возбуждения между ФС в пользу ФС1 (Sinclair, 1987) аналогично тому, как это имеет место при фосфо-рилировании белков ССК (Bennett, 1984). Не исключено, что шпрот влияет и на сам сопрягающий комплекс, как это было показано для других анионов (Malyan, 1994). Нами показано, что нитрит увеличивает активность мембранной А'ГФазы; ранее отмечалось, что он ингибирует световую активацию латентной АТФазы (Shahak, 1982). Добавление экзогенного нитрита к тила-коидам вызывает конформационные изменения, снижающие константу связывания бикарбонат-иона ФС2 (Steraler & Murphy, 1985). Хлоропласты растений, страдающих от недостатка азота, должны отличаться от контрольных но составу белкой, т. к. локализованные в хлоропластах ферменты цикла восстановления нитрита имеют адаптивный характер и могут отсутствовать при недостатке азота или находиться в неактивной конформации (Beevers & Hageman, 1980). Пока остается открытым вопрос о том, какие именно изменения мембран, имеющие место при недостатке азота в среде выращивания растений, делают их нечувствительными к экзогенному нитриту. Его решение требует продолжения исследований.

Феноменологическая схема организации первичных процессов фотосинтеза в мембранах тилакоидов у разных вариантов приведена на рис.:

Выводы

1. У второго листа 17-дневных проростков пшеницы, выращенных без азота, содержащего в 2 раза меньше восстановленного азота по сравнению с контролем, содержание хлорофилла снижено в значительно меньшей степени, при этом величина отношения Хл а/ХлЪ существенно не изменяется.

2. Скорость фотосинтеза снижалась на 25-30% при обычной концентрации СОг (0,03%) в газовой среде. При насыщающей фотосинтез концентрации СОг (0,3%) скорость фотосинтеза у опытных растений также снижена на целый лист, единицу его поверхности и сухой массы, но не на 1 мг Хл.

3. Хлоропласты растений, страдающих от недостатка азота, не отличались от контрольных по числу РЦ ФС2 и эффективности использования ими энергии возбуждения, но характеризовались меньшей величиной отношения Р700/Хл.

4. У этих хлоропластов ниже скорость нециклического фотофосфорили-рования, сопряженного с электронным транспортом через обе ФС.

5. Несмотря на снижение содержания Р700, скорость циклического фосфорилирования в присутствии ФМС и пиоцианина, а также сопряженного с модельным потоком электронов через ФС1, была выше в хлоропластах растений, страдающих от недостатка азота.

6. Показано, что наиболее ранней реакцией растений на недостаток азота в среде было снижения содержания в мембранах хлоропластов сопрягающих комплексов, причем в большей степени за счет гранального ком-партмента.

7. Добавление к реакционной среде с хлоропласгами экзогенного нитрита ингибировало нециклическое фотофосфорилирование, но стимулировало циклическое и нециклическое фосфоршшроиание, сопряженное с модельным электронным транспортом через ФС1, а также М^2*-зависимую 11' -АТФазу. На эти же реакции хлоропластов растений, страдающх от недостатка азота, экзогенный нитрит не влиял.

Синеок работ, »публикованных но теме диссертации.

1. Макарова В.В., Ннзовская Н.В., Лаврухина О.Г., Кукарских Г.П., Изучение фотосинтетического аппарата проростков пшеницы в условиях азотного голодания.// Доклады МОИП, Общая биология, 1993-1994, с.11-80. Депонировано в ВИНИТИ № 909-В96 от 25.03.96

I. Макарова В.В., Кукарских Г.П., Низовская Н.В., Лаврухина О.Г., Кренделева Т.Е., Фотохимическая активность изолированных хлоропластов пшеницы, выращенной в различных условиях питания азотом. // Тезисы докладов I съезда Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (22-23 ноября 1994, Минск), Мн. изд. БГУ, 1994,с.193.

3. Makarova V., Kukarskikh G., Nizovskaya N., Lavrukhina O., Krendeleva Т., Effects of nitrate nutrition on photochemical activity of isolated wheat chloroplats. // Abstracts Annual symposium RSSP "Physical-Chemical Basis of Plant Physiology" (5-8 February 1996, Penza), Penza, 1996, P.30.

1. Макарова В.В., Кукарских. Г.П., Низовская Н.В., Лаврухина О.Г., Кренделева Т.Е., Влияние азотного питания на энергетические характеристики гоолированных хлоропластов пшеницы. // Тезисы докл. международной конференции "Биоэнергетика фотосинтеза" (17-21 июня, 1996, Пущино), Пущино, 1996, с.5б.

>. Makarova V., Kukarskikh G., Nizovskaya N., Lavrukhina O., Krendeleva T. Photochemical activity of chloroplats of wheat seedlings grown without nitrogen. // Plant Physiology and Biochemistry, Special issue, 1996, P.85.

5. Кренделева Т.Е., Макарова В.В., Кукарских Г.П., Низовская Н.В., Лаврухина О.Г., Фотохимическая активность хлоропластов пшеницы, выращенной при недостатке азота. // Биохимия, ¡996, т.61, вып.12, с.2158-2164.

К Makarova Y.V., Kukarskikh G.P., Nizovskaya N.Y. Lavrukhina G.Ci. Krendeleva Т.Е. Ellecls of nitrate nutrition on photochemical activity of wheal chloroplats. // In: Bulletin de la Society Royak- Jc-s odc-nces Лс 1 .lege , ! 496. Vol. 65(-! -5), P.363