Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение состава легких цепей миозина миокарда как возможный компенсаторный механизм при дилатационной кардиомиопатии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изменение состава легких цепей миозина миокарда как возможный компенсаторный механизм при дилатационной кардиомиопатии"

На правах рукописи

ХАЛИНА Яна Николаевна

ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА МИОКАРДА КАК ВОЗМОЖНЫЙ КОМПЕНСАТОРНЫЙ МЕХАНИЗМ ПРИ ДИЛАТАЦИОННОЙ КАРДИОМИОПАТИИ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2004

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций мышечных белков Инсттуга теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино и в Группе мышечной физиологии Макс-Дельбрук Центра молекулярной медицины, Берлин-Бух, Германия

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

З.А. Подлубная

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Н.И. Кукушкин

доктор медицинских наук, профессор В.И. Кобрин

Ведущая организация: Уральский Государственный университет

Защита состоится " /1 " февраля 2004 г. в 13 час 30 мин.

на заседании Диссертационного совета Д 002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН 142290, г. Пущино Московской обл.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат диссертации разослан " " января 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат физико-математических наук Н.Ф. Панина

200(0-4 2/9 013?-

\7 9 1 \ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема кардиомиопатий (КМП) -сравнительно новый раздел современной кардиологии. Несмотря на определенный прогресс в понимании патогенеза этих заболеваний и существенное расширение методов лечения, летальность остается высокой. Основным клиническим проявлением КМП является хроническая сердечная недостаточность, которая сопровождается ремоделированием сердца и проходит в своем развитии стадии компенсации и декомпенсации (Моисеев, 2000). Самой распространенной из всех КМП является дилатационная (ДКМП). Она поражает в основном молодых людей трудоспособного возраста. Диагноз ДКМП имеют более половины больных, ожидающих трансплантацию сердца (Шумаков В.И. и др., 1999). Многие из них умирают до операции от прогрессирующей сердечной недостаточности миокардиального генеза. За последние 20 лет достигнут заметный прогресс в изучении ДКМП. Однако это касается описания клиники и патологической анатомии, в то время как исследования на молекулярном уровне представлены недостаточно. Вместе с тем, решение многих проблем кардиологии на современном этапе зависит от понимания молекулярных механизмов адаптационной способности миокарда. Одна из трудностей проведения работ в этом направлении состоит в том, что ДКМП сопровождается изменением как внутрисаркомерных белков, и в частности миозина, так и факторов, регулирующих сопряжение возбуждения и сокращения, энергетический обмен и Р-адренергическую рецепцию (Биуп^ес^шу, 1998). Это усложняет выяснение вклада сократительных белков в изменение функциональной способности миокарда при патологии.

Молекула миозина, основного сократительного белка, состоит из двух тяжелых цепей (ТЦ) и двух пар легких цепей, ЛЦ (ЛЦ1 и ЛЦ2). ЛЦ существуют в виде изоформ, в норме строго специфичных для предсердий (ЛЦ1п и ЛЦ2п) и желудочков (ЛЦ1ж и ЛЦ2ж). При некоторых КМП в миозине желудочков были обнаружены замены эндогенных ЛЦ1ж на предсердные изоформы ЛЦ1п. Сделано предположение, что такая замена при патологии может вносить вклад в компенсацию ослабленной сократительной способности миокарда (БсЬаиЬ й а1, 1998), однако прямой эффект ЛЦ1п на структурные и ферментативные характеристики миозина желудочков и его нитей еще предстояло изучить. Среди КМП участие ЛЦ1п в компенсации обсуждается только для гипертрофической КМП (ГКМП), когда в желудочках до 30% ЛЦ1ж заменяется на ЛЦ1п. При проверке этой гипотезы для ДКМП были получены неоднозначные результаты, а низкий уровень этих замен, который составлял не более

17%, не позволял сделать вь образом, вопрос об участи): 1Щ1П в компенсащр

I- 'ПИЛ

вода об их физиологическом значении. Таким ослабленной функции

>00 «РК

сердца при ДКМП остается неясным.

Цель исследования. Провести in vitro изучение влияния предсердных легких цепей на функциональные свойства миозина желудочка для выяснения их участия в компенсаторном механизме при дилатационной кардиомиопатии. Задачи исследования:

1. Методами аналитической биохимии изучить изоформный состав легких цепей миозина желудочков при дилатационной кардиомиопатии;

2. Разработать методический подход для изменения изоформного состава сердечного миозина in vitro и заменить в миозине желудочка ЛЦ1ж и ЛЦ2ж на предсердные шоформы;

3. Методом электронной микроскопии изучить влияние присутствия предсердных ЛЦ1 и ЛЦ2 на структуру синтетических нитей гибридного миозина;

4. Изучить влияние предсердных ЛЦ1 и ЛЦ2 на ферментативную активность гибридного миозина желудочка;

5. Используя методы генной инженерии, получить предсердные ЛЦ1 человека;

6. С помощью разработанного методического подхода заменить ЛЦ1ж в миозине желудочка их предсердными изоформами;

7. Методом электронной микроскопии изучить влияние присутствия предсердных ЛЦ1 на структуру синтетических нитей гибридного миозина;

8. Изучить влияние предсердных ЛЦ1 на ферментативную активность гибридного миозина желудочка с разным количеством ЛЦ1п.

Научная новизна. Разработан новый методический подход для in vitro изменения в миозине желудочка изоформного состава легких цепей. Получено 2 типа модельных гибридных миозинов желудочка с ЛЦ1п, ЛЦ2п и только с ЛЦ1п, которые сохраняли способность формировать нормальные нити. Показано, что встраивание ЛЦ1п в миозин желудочкового типа увеличивает его ферментативную активность пропорционально степени замен. Это предполагает улучшение сократительных характеристик сердечной мышцы и тем самым демонстрирует возможность компенсации сердечной недостаточности при ДКМП.

Научная и практическая ценность. Полученные результаты расширяют представления о роли легких цепей сердечного миозина и их изоформ в процессе сокращения в норме, при адаптации и патологии. Кроме того, результаты являются основой для создания прогностического показателя, учитывающего, наряду с оценкой клинико-гемодинамического состояния больных ДКМП, степень трансформации структуры и свойств

сердечного миозина. Применение такого показателя позволит определять категорию больных с неблагоприятным ближайшим прогнозом и выполнить операции по пересадке сердца в более ранние сроки, снизив тем самым уровень дооперационной смертности. Полученные результаты также открывают перспективы для генной коррекции сердечной недостаточности.

Апробация работы. Материалы и основные положения работы были доложены и обсуждены на межд. конф. "Биологическая подвижность -новые направления исследования" (Пущино, 2001); конф. "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, Россия, 2002); 3-ей Всерос. конф. "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 2002); 31-ой и 32-ой Европ. мышечных конф. (Люнтерен, Нидерланды, 2002; Монпелье, Франция, 2003); Междун. конф. "Сердечные патологии: от молекулярных механизмов к клинической практике" (Словакия, Стара Лесна, 2002); заседании секции Ученого совета ИТЭБ РАН "Биологическая подвижность" от 10 ноября 2002; семинаре им. Волленберга в Центре Молекулярной Медицины, Берлин-Бух, февраль 2003. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 101 стр., содержит 20 рисунков и 2 таблицы. Список цитируемой литературы включает 174 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Экспериментальный материал: сердце свиньи (2); сердце быка (1). Клинический материал (предоставлен НИИТиИО, МЗ РФ, Москва): эндомиокардиальные биоптаты правого желудочка 33 больных ДКМП (из них 15 - с декомпенсацией, 18 - предположительно с компенсаторной стадией); миокард одного больного ДКМП, взятый при проведении пересадки сердца; миокард 15 больных с декомпенсацией ДКМП, взятый post mortem. За контроль принято сердце человека (1), не подошедшее для пересадки по причине иммунологической несовместимости.. Выделение и очистка миозина и актина проводились по методам (Margossian, 1985; Pardee & Spudich, 1982).

Изоляция двух легких цепей, ЛЦ1п и ЛЦ2п из миозина предсердий

осуществлялась согласно (Wagner & Weeds, 1977).

Получение ЛЦ1п. ЛЦ1п человека экспрессировали в Е. coli с использованием РНК-полимеразы бактериофага Т7 и соответствующей промоторной системы. Источником нуклеотидной последовательности

ЛЦ1п человека был клон hemp4 (Zimmermann et al., 1990). Участок ДНК, содержащий ген ЛЦ1п, был амплифицирован полимеразной цепной реакцией и клонирован в вектор экспрессии pRSET A (Invitrigen, Germany), гидролизованный рестриктазами ВатН1и Hindlll. Далее в BamHl-Hindlll участок встроили фрагмент BstYI-Hindlll из 812 пар оснований, кодирующий ЛЦ1 п человека плюс 18 добавочных нуклеотидов с 5'-конца и 200 нуклеотидов с 3'-конца. Лигирование ДНК гидролизованного вектора и вставки в смесь и экспрессию ЛЦ1п осуществляли согласно протоколу производителя для pRSET А. В ходе выделения получили полноразмерные ЛЦ1п человека, содержащие на N-конце 6 добавочных гистидиновых остатков (Mr слитого белка^Зб кДа), которые были удалены энтерокиназой «Enterokinase Мах» (Invitrogen, Germany). Слитый белок обрабатывали этим ферментом в течение 7 ч. при 4°С (1 ед. энтерокиназы на 10 мкг ЛЦ1п). Фермент отделяли от ЛЦ1п хроматографией на носителе «EK-away» (Invitrogen, Germany) в соответствии с протоколом призводителя. Конечный продукт имел Мг=28 к Да, что соответствует таковой ЛЦ1п человека и специфически окрашивался моноклональными антителами к ЛЦ1п человека. Изменение изоформного состава легких цепей миозина желудочка in vitro. Метода для in vitro изменения изоформного состава легких цепей сердечного миозина в литературе описано не было. Нами был разработан методический подход, основанный на диссоциации желудочкового миозина на тяжелые цепи, ЛЦ1ж, ЛЦ2ж, добавлении избытка ЛЦп к диссоциированному комплексу и быстрой реассоциации. Разработанный подход позволил заменить в миозине желудочка до 75% ЛЦж предсердными, сохранив нативность не только миозиновых головок (критерий - высокая АТФазная активность), но и стержневых участков тяжелых цепей (критерий - способность формировать нормальные по форме и размерам нити).

Выбор диссоциирующего агента и контроль реассоциации миозина. Агент, который избирательно экстрагирует из сердечного миозина ЛЦ1 или ЛЦ2 не известен. Были исследованы гуанидингидрохлорид и хлорид аммония, которые экстрагируют из сердечного миозина одновременно оба класса легких цепей в эквимолярном соотношении. Для того чтобы исключить влияние диссоциирующих агентов на свойства белка и проверить качество реассоциации миозиновых молекул, были изучены свойства миозина, подвергшегося диссоциации-реассоциации без изменения состава его легких цепей. Качество реассоциации тестировалось с помощью гель-электрофореза, измерения скорости АТФазной активности и электронной микроскопии. Для реассоциированного контрольного миозина (далее контрольный миозин) было определено число молей ЛЦ1ж и ЛЦ2ж и их отношение. Более

нативным оказался миозин, обработанный NH4C1. Молярное отношение ЛЦ1ж:ЛЦ2ж в этом случае не отличалось от нормального и составляло 0.95±0.1 (п=10). Такой миозин формировал нормальные по размерам и ультраструктуре нити и восстанавливал 80% и более актин-активируемой АТФазной активности исходного желудочкового миозина. Получение гибридного миозина желудочка с ЛЦ1п и ЛЦ2п. Миозик желудочка с концентрацией не более 5 мг/мл подвергался диссоциации добавлением кристаллического NH4C1 до концентрации 4.7 М. Диссоциация миозина приводила к быстрой (в течение 10 мин) и необратимой денатурации большей части ТЦж. Мы избежали этого быстрым (3 мин) и эффективным удалением NH4C1 посредством гель-фильтрации на носителе Sephadex G-50 (уравновешенном раствором 0.5 М KCl, 10 мМ имидазол-НС1, 1 мМ ДТТ, азид натрия, pH 7.0) при центрифугировании (5 тыс. об./мин, 2 мин). Непосредственно после этого для замены 75 % ЛЦ1ж предсердными (от количества всех ЛЦ1), к препарату добавлялся 10-кратный избыток ЛЦ1п и ЛЦ2п, изолированных из предсердного миозина. Через 3-5 часов достигалась полная реассоциация ТЦж миозина желудочка с ЛЦ1 и ЛЦ2 (как с эндогенными желудочковыми, так и с предсердными). Полученный гибридный миозин осаждался снижением ионной силы (диализом против раствора: 0.1 М KCl, 10 мМ имидазол-НС1, 1 мМ ДТТ, pH 7.0) с последующим центрифугированием (10 мин при 20 тыс. об./мин). При этом избыток легких цепей оставался в растворе. Для удаления следовых количеств свободных легких цепей, преципитат миозина промывался 2-3 раза тем же раствором. Состав гибридного миозина желудочка: ТЦж, ЛЦ1ж, ЛЦ1п, ЛЦ2ж, ЛЦ2п.

Получение гибридного миозина желудочка с ЛЦ1п проводилось таким же образом, как и получение гибридного миозина с ЛЦ1п и ЛЦ2п, с тем отличием, что к диссоциированному комплексу желудочкового миозина добавлялся 2, 3 и 5-кратный избыток экспрессированных ЛЦ1п человека для получения гибридного миозина с 17%, 24% и 42% ЛЦ1п (от количества всех ЛЦ1), соответственно. Состав гибридного миозина желудочка: ТЦж, ЛЦ1ж, ЛЦ1п, ЛЦ2ж.

Гель-электрофорез. Качество очистки и состав белковых препаратов тестировали диск-электрофорезом в 15% полиакриламидном геле (или 518% градиентном геле) в присутствии додецилсульфата натрия (Laemmli, 1970). Количественная обработка гелей проводилась на денситометре с программным обеспечением BioRad (Quantity One 4.2.1). Для расчета молярного соотношения были использованы следующие значения Mr: ЛЦ1п - 28 кДа, ЛЦ1ж - 25 кДа, ЛЦ2п - 19 кДа, ЛЦ2ж - 18 кДа (Могапо, 1999).

Формирование синтетических миозиновых нитей осуществлялось

диализом как описано (Podlubnaya et al., 1999).

Определение актин-активируемой АТФазной активности миозина.

Актомиозиновая система была реконструирована из нитей миозина и актина при одинаковом весовом соотношении. Максимальная скорость АТФазной реакции измерялась колориметрически по выходу неорганического фосфата при постоянной t=25° как описано (Lanzetta et al., 1979).

Электронно-микроскопические исследования. Суспензия

синтетических нитей наносилась на медные сеточки, покрытые угольной или укрепленной углеродом формваровой пленкой, и окрашивалась 1% водным раствором уранилацетата. Образцы просматривались на микроскопах JEM-100В и LEO ЕМ-910 при ускоряющем напряжении 80 кВ и электронно-оптических увеличениях от 5 ОООх до 65 ОООх. Статистическая обработка результатов проведена с помощью программного обеспечения GraphPad Prism Software (San Diego,USA). Данные, полученные при электронно-микроскопическом исследовании, обработаны с использованием программного обеспечения DigiVision Pro (Muenster, Germany). Значения представлены в виде среднего ± SD. Для определения уровня доверительной вероятности и значимости использован t-критерий Стьюдента. Величина р<0.05 считалась достоверной.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Часть I. Изучение изоформного состава легких цепей миозина

при ДКМП

Состав миозина в образцах клинического материала больных ДКМП определяли методом гель-электрофореза. В правом желудочке сердца у 33% пациентов с предположительно компенсаторной стадией были обнаружены и'зоформные замены в составе ЛЦ1 (частота встречаемости замен 1:3). В этом случае в миозине желудочка наряду с эндогенными ЛЦ1ж присутствовали ЛЦ1п, не типичные для этого отдела сердца в норме (Рис. 1, дорожки 1-3).

На стадии компенсации ДКМП в миозине желудочка от 10% до 30% ЛЦ1ж были заменены на ЛЦ1п (Рис. 1, дорожка 3). Таким образом, молярное соотношение ЛЦ1.ЛЦ2 во всех случаях, как и в контроле, составляло =1:1. Изучить состав легких цепей миозина левого желудочка на этой стадии не удалось из-за отсутствия соответствующего клинического материала, однако, согласно литературным данным замены происходят синхронно в обоих желудочках (Акопова и др., 1997; Ritter et al., 1999). На стадии декомпенсации ЛЦ1п в миозине обоих желудочков отсутствовали (Рис. 1, дорожка 4). В миозине предсердий изменения изоформного состава легких цепей не было выявлено.

кД»

40-

Рис. 1. Изоформный состав легких цепей миозина при ДКМП:

28

25-!

1 - правый желудочек человека (норма), 2 - предсердие человека (норма), 3 - правый желудочек сердца больного ДКМП (стадия

компенсации) с заменой 30% ЛЦ1ж

18-'

на ЛЦ1п, 4 - правый желудочек сердца больного ДКМП (стадия декомпенсации)

2

4

Обсуждение результатов. Известно, что в эмбриональном миозине желудочков до 50% ЛЦ1ж заменены на ЛЦ1п (Barton & Buckingham, 1985), что сопровождается улучшением сократительных свойств миокарда. На постнатальном этапе реэкспрессию эмбриональных генов сократительных белков некоторые авторы связывают с адаптационным ответом мышцы (Schiaffino & Reggiani, 1996). Замены, обнаруженные нами при ДКМП сравнимы с таковыми в эмбриональном миозине и при ГКМП и поэтому могут рассматриваться как факт адаптации. Однако эти данные расходятся с данными других исследователей, которые при ДКМП не обнаруживают замен легких цепей в желудочках (Trahair et al., 1993), или они составляют не более 17% (Могапо, 1999). Важно отметить, что большинство адаптационных молекулярных изменений эффективны только на коротком отрезке времени (Моисеев, 2000). Поэтому в определенный момент, когда адаптационные перестройки прекращаются, наступает декомпенсация, что при ДКМП проявляется в прогрессирующей сердечной недостаточности. С этими наблюдениями полностью согласуются наши результаты - на стадии декомпенсации в миозине желудочков ЛЦ1п не регистрировались. Вследствие того, что стадия компенсированной сердечной недостаточности протекает практически без симптомов, ДКМП диагностируется, как правило, на стадии декомпенсации, когда количество ЛЦ1п в желудочках уже снижено или их нет вообще.

Полученные результаты демонстрируют изменение состава миозина желудочков при компенсации ДКМП в сторону эмбрионального миозина, что предполагает адаптационную природу этой замены. Однако подтвердить или опровергнуть это предположение можно было только на основе изучения прямого влияния ЛЦп на свойства миозина желудочка.

Часть II. Изменение изоформного состава легких цепей миозина

желудочка in vitro. Свойства гибридного миозина с ЛЦ1п и ЛЦ2п

Несмотря на то, что ЛЦ1п появляются в желудочках на

компенсаторной стадии ДКМП, остается неизвестным, оказывают ли они прямой эффект на функциональные свойства самого миозина. Для исследования этого вопроса на первом этапе в желудочковом миозине оба класса легких цепей (ЛЦ1ж и ЛЦ2ж) были заменены предсердными изоформами (ЛЦ1п и ЛЦ2п) (Рис. 2, дорожка 1).

Рис. 2. Электрофореграмма. Изоформная замена в миозине желудочка ЛЦ1ж и ЛЦ2ж на ЛЦ1п и ЛЦ2п: 1 - гибридный миозин с заменой 75% ЛЦ1ж и ЛЦ2ж предсердными изоформами, 2 - миозин из левого желудочка быка, 3 - миозин из предсердий быка.

Замена ЛЦ1ж на ЛЦ1п в полученном гибридном миозине составила 75%. Молярное соотношение ТЦ:ЛЦ1:ЛЦ2 для гибридного миозина, как и для контроля, составляло =1:1:1. Визуализировать замену ЛЦ2 не удалось, так как из-за незначительной разницы в молекулярном весе ЛЦ2п (19 кДа) и ЛЦ2ж (18 кДа) эти легкие цепи мигрируют в геле одной полосой. Однако литературные данные, полученные при заменах легких цепей в головках скелетного миозина (Wagner, 1982), свидетельствуют, что in vitro замена ЛЦ2 происходит в такой же степени, как и для ЛЦ1.

Электронно-микроскопические наблюдения показали, что гибридный миозин желудочка с ЛЦ1п и ЛЦ2п формировал нормальные нити, которые не отличались по размерам и форме от нитей контрольного миозина. Однако миозиновые головки, расположенные на поверхности нитей гибридного миозина, приобретали сферическую форму (Рис. ЗБ, стрелки) в сравнении с продолговатыми головками контрольного миозина (Рис. ЗА, двойные стрелки).

кДа

200-

2825-

-тц

-ЛЦ1п ЛЦ1ж

-ЛЦ2

3

Рис. 3. Электронные микрофотографии синтетических нитей

контрольного миозина (А) и гибридного миозина желудочка с предсердными ЛЦ1 и ЛЦ2 (Б). Шкала - 100 нм

Таким образом, подход, примененный к изучению ультраструктуры миозиновых нитей, позволил провести сравнительное исследование препаратов контрольного и гибридного миозина и отнести изменения, наблюдаемые на субмолекулярном уровне, к изменению состава легких цепей.

Для изучения ферментативной способности гибридного миозина была измерена АТФазная активность его синтетических нитей в присутствии нитей актина. Это позволило изучить влияние замен легких цепей на системе, приближенной к in vivo условиям (ц=0.12, pH 7.0). Актин-активируемая АТФазная активность гибридного миозина с 75% заменой ЛЦ1ж на ЛЦ1п была на 63% выше, чем в контроле и приближалась к активности предсердного миозина (максимальная скорость АТФазной реакции для гибридного, контрольного и предсердного миозинов составила 115 ± 5 нмоль Фн/мг-мин, 70 ± 4 нмоль Фн/мгмин и 127 ± 7 нмоль Фн/мг мин, соответственно; п=12).

Обсуждение. Эксперименты, направленные на изучение эффекта замены ЛЦж на ЛЦп проводились и ранее, но только на интактных и демембранизированных волокнах (Schaub et al., 1998), что не позволяло исключить возможного влияния других компонентов мышечных волокон и миофибрилл. Получить однозначный ответ на вопрос о роли ЛЦп в улучшении сократительных свойств миозина и, тем самым, в компенсации сердечной недостаточности можно было, только изучив влияние предсердных легких цепей на свойства очищенного миозина желудочка. Мы попытались решить эту задачу с помощью модельного гибридного миозина, представляющего собой миозин желудочкового типа, в котором ЛЦ1 и ЛЦ2 частично заменены их предсердными изоформами.

Изучение структуры синтетических нитей гибридного миозина с ЛЦ1п и ЛЦ2п не выявило разницы в размерах и форме нитей в сравнении с контролем. Однако было отмечено изменение формы головок миозина на более округлую. Это наблюдение является свидетельством того, что состав легких цепей головок миозина изменился. О функциональной значимости такой замены свидетельствует то, что она сопровождалась увеличением ферментативной активности нитей гибридного миозина. Было сделано предположение о том, что причиной наблюдаемой активации является присутствие именно ЛЦ1п, а не ЛЦ2п. Далее сравнение эффекта проведенной замены с данными о замене только ЛЦ1 (Часть III) позволило охарактеризовать влияние ЛЦ1п на функциональные характеристики желудочкового миозина и проверить, имеется ли кооперативное влияние ЛЦ1п и ЛЦ2п.

Часть III. In vitro моделирование изоформных замен ЛЦ1, наблюдаемых при ДКМП. Свойства гибридного миозина желудочка с ЛЦ1п

Для подтверждения предположения о роли ЛЦ1п в активации свойств гибридного миозина с ЛЦ1п и ЛЦ2п, необходимо было получить гибридный миозин желудочка, у которого предсердными изоформами были заменены только ЛЦ1ж. В результате гибридизации были получены препараты желудочкового миозина с заменой 17%, 24% и 42% ЛЦ1ж предсердными изоформами (ЛЦ1п) (Рис. 4). Молярное соотношение ТЦ:ЛЦ1:ЛЦ2 для гибридных миозинов, как и для контроля, составляло «1:1:1.

»■•Да ____Рис. 4. Изоформная замена в

Т* миозине желудочка ЛЦ1ж на

'Г " ЛЦ1 п: 1 - миозин из левого

^- желудочка свиньи,

^ ■ 2 - контрольный миозин,

^ 3 - экспрессированные ЛЦ1п

&& Ш^»-ЛЦ1п человека, 4 - гибридный

ТТ^Ш,. ¡У*!!;ЛЦ1« миозин с заменой 17% ЛЦ1ж

на ЛЦ1 п, 5 - замена 24%

« ЛЦ2ж ЛЦ1ж, 6 - замена 42% ЛЦ1ж.

Электронно-микроскопическое наблюдение показало, что все препараты гибридного миозина формировали нормальные нити. Длина нитей гибридов варьировала от 350 нм до 2450 нм, длина нитей контроля - от 330 нм до 2220 нм. Анализ распределения длин таких нитей не выявил значительного отличия, если учесть полидисперсность системы синтетических'нитей (Рис. 5).

Й0-

it

t-

X м>-

о 03 40

и к 30

3-

20-

о

ьи 10

о-

__-

в Juti JO—, п

300 500 700 900 1200 1400 .1600 1X00 2000 2200

длина, нм

Рис. 5. Распределение длин синтетических нитей. Темные столбики соответствуют нитям контрольного миозина (п = 134), светлые - нитям гибридных миозинов с ЛЦ1п (л = 144)

Однако миозиновые головки, расположенные на поверхности нитей гибридного миозина, как и в случае замены обоих классов легких цепей (Часть II), приобретали сферическую форму (Рис. 3). Актин-активируемая АТФазная активность гибридных миозинов с разным уровнем замен ЛЦ1ж на ЛЦ1п была достоверно выше, чем в контроле (для гибридов с 17% замен - 86 ± 2 нмоль Фн/мг мин, р<0.001; с 24% замен - 92 ± 6 нмоль Фн/мг мин, р<0.0001; с 42% замен - 106 ± 5 нмоль Фн/мг мин, р<0.0001; для контроля - 73 ± 6 нмоль Фн/мг мин). Отмечена сильная положительная корреляция между количеством ЛЦ1п и увеличением активности миозина. Присутствие в гибридных миозинах 17%, 24% и 42% ЛЦ1п активировало их АТФазную активность на 18%, 26% и 45%, соответственно (коэффициент корреляции = 0.999) (Рис. 6).

Содержание ЛЦ1п в гибридных миозинах

(% от ЛЦ1)

Рис. 6. Зависимость актин-активируемой АТФазной активности гибридных миозинов от степени замены легких цепей на предсердные изоформы: ■ - данные для гибридных миозинов с заменами ЛЦ1ж, • - данные для гибридного миозина с заменами ЛЦ1ж и ЛЦ2ж.

Обсуждение. Результаты исследования структуры нитей гибридных миозинов с ЛЦ1п сходны с таковыми для гибридного миозина с ЛЦ1п и ЛЦ2п. Это подтверждает наше предположение о том, что наблюдаемый эффект является следствием присутствия в гибридном миозине именно ЛЦ1п, а не ЛЦ2п. Заряды ЛЦ1ж и ЛЦ1п различны (Могапо, 1999), поэтому их замена изменяет и заряд миозиновых головок, что может вызывать изменение их формы. Структурные перестройки являются индикатором того, что состав легких цепей в головках был изменен, а рост ферментативной активности (а не снижение) свидетельствует об отсутствии деструктивных последствий замены. При скольжении миозин-содержащих и актин-содержащих нитей друг относительно друга, ЛЦ1 взаимодействуют с актином (Prince et al., 1981), выполняя роль "якоря". Известно, что сродство ЛЦ1п к актину меньше, чем таковое ЛЦ1ж (Могапо & Haase, 1997). Следовательно, сила связи ЛЦ1п-актин для ЛЦ1п меньше, а скорость распада этой связи больше, чем для ЛЦ1ж. С этим согласуется активация актин-активируемой АТФазной активности

миозина желудочка, наблюдаемая при замене ЛЦ1, и корреляция активации с количеством ЛЦ1п. Данные об увеличении ферментативной активности гибридного миозина, у которого 75% ЛЦ1 и ЛЦ2 были заменены предсердными, подчеркивают отмеченную корреляцию. При объединении значений для двух типов гибридных миозинов, коэффициент корреляции остался почти неизменным и составил 0.98 (в сравнении с 0.999), что видно на рис. 6. Сравнение свойств двух типов гибридных миозинов позволило заключить, что основная роль в эффектах, наблюдаемых при изоформных заменах, принадлежит именно ЛЦ1п.

Важно подчеркнуть, что и структурные, и ферментативные следствия появления ЛЦ1п в миозине желудочка сходны с эффектами фосфорилирования миозина поперечно-полосатых мышц (Ьеуте е! а1., 1996), которое улучшает ферментативные свойства миозина и моделирует сокращение скелетных и сердечных мышц. При этом изменение заряда миозиновой головки за счет присоединения фосфатных групп сопровождается изменением формы головки на сферическую и увеличением ферментативной активности миозина. Сходство эффектов фосфорилирования и гибридизации миозина представляет еще одно свидетельство того, что наблюдаемый при гибридизации структурный эффект подтверждает факт встраивания новых ЛЦ1 в миозиновую головку, а не является деструктивным, поскольку не ухудшает ферментативных свойств миозина, а напротив, сопровождается их активацией.

Данные об активирующем эффекте ЛЦ1п на свойства миозина желудочка согласуются с результатами других исследователей. Так, при изучении параметров сокращения волокон желудочка больного ГКМП, у которого 20% ЛЦ1ж были заменены ЛЦ1п, было зарегистрировано двукратное увеличение скорости развития силы (БсЬаиЬ е! а1., 1998), которая, как известно, определяется ферментативной активностью миозина (Вагапу, 1967). Действительно, в наших экспериментах при подобном количестве ЛЦ1п в гибридном миозине мы наблюдали 18% активацию ферментативной активности. При сравнении этих данных необходимо принимать во внимание тот факт, что гиперсократимость при ГКМП, как правило, сопровождается мутациями в тяжелых цепях миозина, которые усиливают его актин-активируемую АТФазу (УатаБЬпЧа е1 а1., 2000). В наших экспериментах гибриды были получены на основе миозина контрольного сердца. Разница в величине эффекта ЛЦ1п на сократительные свойства волокон и чистого миозина можно отнести также к возможному влиянию минорных компонентов тонких нитей. Напротив, использованная нами система очищенного актомиозина показывает активацию гибридных миозинов за счет прямого влияния ЛЦ1п.

Представленные результаты свидетельствуют в пользу того, что появление ЛЦ1п в составе миозина желудочков на начальной стадии ДКМП должно приводить к повышению его АТФазной активности и к улучшению сократительной способности миокарда и, тем самым, вносить вклад в компенсацию сердечной недостаточности. Причем, эффективность последней будет определяться количеством ЛЦ1п. Максимальный уровень замен, обнаруженный нами при изучении образцов миокарда пациентов с ДКМП составил 30%, но ранее в нашей лаборатории был описан случай 70% замены (Akopova et al., 1998), что позволяет судить о важности ЛЦ1п в улучшении сократительной способности сердца при ДКМП. В проведенных in vitro экспериментах присутствие даже 17% ЛЦ1п в миозине желудочка существенно активировало его ферментативную активность. Очевидно, что подобные изменения должны значительно улучшать функциональные характеристики миокарда in vivo. С другой стороны, согласно некоторым данным, ферментативная активность миозина при ДКМП снижается, что, казалось бы, противоречит сказанному выше. Однако это наблюдение касается терминальной стадии заболевания, когда в миозине желудочков снижается не только уровень ЛЦ1п, но и количество ЛЦ2, что и отмечается авторами (Margossian et al., 1992; Akopova et al., 1998). Именно потерю ЛЦ2 при ДКМП связывают со снижением АТФазной активности миозина, что и было подтверждено в in vitro экспериментах на контрольном миозине (Chowrashi et al., 1989).

Наши данные позволяют предположить, что АТФазная активность миозина при ДКМП будет повышаться на стадии компенсации, когда ЛЦ1п экспрессируется в желудочке более интенсивно, и снижаться на стадии декомпенсации после прекращения этой экспрессии. Дальнейший сравнительный анализ ферментативной активности миозина желудочков на разных стадиях ДКМП у пациента может подтвердить это предположение.

Все обсуждаемые выше результаты демонстрируют возможность регуляции сократительной способности миозина желудочка на уровне изоформных замен в составе его ЛЦ1 в сторону эмбрионального миозина и позволяют рассматривать появление ЛЦ1п в миозине желудочков как важное звено в механизме компенсации сердечной недостаточности при ДКМП. Отсутствие заметного влияния ЛЦ2п на свойства миозина желудочка - ответ на вопрос, почему именно ЛЦ1п, а не ЛЦ2п появляется в миозине желудочков на компенсаторных стадиях и гипертрофической, и дилатационной кардиомиопатий.

выводы

1. Показано, что на стадии компенсации ДКМП в миозине желудочков до 30% ЛЦ1ж может заменяться ЛЦ1п. На стадии декомпенсации ЛЦ1п в миозине желудочков отсутствуют. Сделано предположение об адаптационной природе наблюдаемой изоформной замены.

2. Разработан методический подход для in vitro изменения в миозине желудочка изоформного состава легких цепей.

3. Впервые получен гибридный миозин желудочка, в котором 75% ЛЦ1ж и ЛЦ2ж заменены соответствующими предсердными изоформами. Такой миозин формировал нити нормальных размеров и формы и проявлял актин-активируемую АТФазную активность на 63% выше контрольйой. Сделано предположение о том, что наблюдаемая активация ферментативных свойств обусловлена ЛЦ1п.

4. Для подтверждения вклада ЛЦ1п в улучшение функциональных свойств миозина желудочков впервые получены модельные гибридные миозины желудочка с ЛЦ1п. Нити гибридных миозинов по форме и размерам не отличались от контрольных. Замена 17%, 24% и 42% ЛЦ1ж предсердными ЛЦ1 увеличивала актин-активируемую АТФазную активность гибридных миозинов на 18%, 26% и 46%, соответственно.

5. Отмечена сильная положительная корреляция между содержанием ЛЦ1п и уровнем ферментативной активности гибридного миозина (коэффициент корреляции = 0.999).

6. Анализ свойств двух типов гибридных миозинов свидетельствует о прямом активирующем эффекте ЛЦ1п на ферментативную активность миозина желудочков, что свидетельствует о роли изоформной замены в составе легких цепей при ДКМП в компенсации сердечной недостаточности.

7. Проведенное исследование открывает перспективы разработки методов генной терапии для пациентов с сердечной недостаточностью либо путем вирусного трансфера кДНК ЛЦ1п в кардиомиоциты, либо активацией транскрипции гена ЛЦ1п в желудочках сердца.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ • Легкие цепи миозина и прогностический тест развития ДКМП

Рекомендуется методом гель-электрофореза при денатурирующих условиях определять изоформный состав легких цепей миозина в эндомиокардиальных биоптатах из желудочков больных ДКМП. На начальной компенсаторной стадии заболевания в миозине желудочков появляются ЛЦ1п. Исчезновение ЛЦ1п будет свидетельствовать о снижении сократительной способности сердца и наступлении

терминальной стадии заболевания. Подобное поведение легких цепей при ДКМП является основой для создания нового прогностического теста для оценки стадии заболевания и степени поражения миокарда. Преимущества такого теста - отсутствие влияния сопутствующих заболеваний и его простота.

• Легкие цепи миозина и генная терапия сердечно-сосудистых заболеваний

Для лечения пациентов с сердечной недостаточностью при кардиомиопатиях могут быть разработаны методы генной терапии либо путем вирусного трансфера кДНК ЛЦ1п в кардиомиоциты, либо активацией транскрипции гена ЛЦ1п в желудочках сердца.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Макаренко И.В., Халина Я.Н. Изменения цитоскелетного саркомерного белка тайтина при дилатационной кардиомиопатии // Тезисы II конф. молодых ученых России с межд. участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 2001, Т. 1, с. 247.

2. Подлубная З.А., Вихлянцев И.М., Макаренко И.В., Халина Я.Н., Удальцов С.Н., Вишневская З.И. Роль белков цитоскелета саркомеров при адаптации и патологии // Тезисы ХУШ Съезда физиологов России, Казань, 2001, с. 195-196.

3. Халина Я.Н., Ильинский И.М., Подлубная З.А. Изменения содержания регуляторных легких цепей миозина в миокарде при ревматических поражениях сердца // Тезисы 2-ой Росс. конф. "Физика в биологии и медицине", Екатеринбург, 2001, с. 89-90.

4. Khalina Ya.N., Iljinsky I.M., Vishnevskaya Z.I., Podlubnaya Z.A. The changes in regulatory light chain content of cardiac myosin in reumatism of myocardium II Abstr. Intern. Symp. "Biological motility: new trends in research", Pushchino, Russia, 2001, p. 62-63.

5. Vikhlyantsev I.M., Makarenko I.V., Khalina Ya.N., Shpagina M.D., Udaltsov S.N., Malyshev S.L., Vishnevskaya Z.I., Podlubnaya Z.A. Myosin-associated protein titin of skeletal and cardiac muscles: behavior upon adaptation and pathology // Abstr. Intern. Symp. "Biological motility: new trends in research", Pushchino, Russia, 2001, p. 167-169.

6. Шумаков В.И., Хубутия М.Ш., Семеновский М.Л., Шумаков Д.В., Ильинский И.М., Халина Я.Н., Подлубная З.А., Некоторые аспекты морфологии и молекулярной биологии миксом сердца // Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2001, № 2, с. 63.

7. Халина Я.Н., Макаренко И.В., Шпагина М.Д., Малышев С.Л., Подлубная З.А. Присутствие предсердной изоформы ЛЦ1 в миозине желудочка сердца повышает его каталитическую активность: связь с дилатационной кардиомиопатией // Труды конф. "От современной

фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 2002, с. 140.

8. Халина Я.Н., Подлубная З.А. Анализ поведения легких цепей миозина миокарда человека при ишемической болезни сердца и ишемической кардиомиопатии как основа диагностики // Матер. 3-ей Всеросс. конф. с междунар. участием "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция", Москва, 2002, с. 134-135.

9. Халина Я.Н., Подлубная З.А. Состав легких цепей миозина миокарда человека: перспективы для диагностики заболеваний сердца // Биофизика, 2002, т. 47, № 2, с. 367-368.

10. Халина Я.Н., Удальцов С.Н., Подлубная З.А. Изменение состава легких цепей сердечного,миозина при дилатационной кардиомиопатии: влияние на функциональные свойства // Биофизика, 2002, т. 47, № 2, с. 361-366.

11. Khalina Ya.N., Makarenko I.V., Shpagina M.D., Malyshev S.L., Podlubnaya Z.A. In vitro study on light chain 1 isoform replacement in ventricular myosin: perspectives for prognostic test of dilated cardiomyopathy development // J. Muscle Res. & Cell Motil., 2002, v.23(l), p. 36-37 (Abstr. 31st Europ. Muscle Conf., Lunteren, Netherlands, 2002).

12. Khalina Ya., Udaltsov S.N., Podlubnaya Z.A. Ischemic myocardium: behaviour of myosin light chains // J. Mol. Cell. Cardiol., 2002, v.34, №6, p.A84 (Abstr. Intern. Conf. "The Failing Heart: From Molecular Mechanisms to Clinical Applications", Stara Lesna, Slovac Republic, 2002).

13. Подлубная 3.A., Халина Я.Н., Шпагина М.Д., Малышев С.JI. Изменение состава легких цепей миозина миокарда: влияние на функциональные свойства и связь с кардиомиопатиями // В кн. Горизонты биофизики: от теории к практике, Пущино, 2003, с. 126-130.

14. Khalina Y., Bartsh, Petzhold D., Haase H., Podlubnaya Z.A., Shpagina M.D., Morano I. Recombinant ALC-1 improves enzymatic properties of ventricle jnyosin: relevance to compensatory mechanism upon cardiomyopathies // J. Muscle Res. & Cell Motil., 2003, v. 24(4-6), p. 344345 (Abstr. 32nd Europ. Muscle Conf., Montpellier, France, 2003).

15. Халина Я.Н., Шпагина М.Д., Малышев С.Л., Подлубная З.А. Роль предсердных легких цепей миозина в модуляции функциональных свойств миокарда // Биофизика, 2003, т. 48, № 5, с. 900-904.

Исследование поддержано грантами РФФИ №№ 01-04-48195, 01-0497007; ДААД А/02/24072; ДФГ 362/22-1.

Основные сокращения: ТЦ, ТЦж - тяжелые цепи миозина желудочкового типа; ЛЦ1 - легкие цейи-1; ЛЦ2 - легкие цепи-2; ЛЦп -предсердные легкие цепи миозина (ЛЦ1п - предсердные ЛЦ1, ЛЦ2п -предсердные ЛЦ2); ЛЦж - желудочковые легкие цепи (ЛЦ1ж -желудочковые ЛЦ1, ЛЦ2ж - желудочковые ЛЦ2).

(

ч

РНБ Русский фонд

2006-4 17911

/ % \

I % \ Ч_

ч г

% г ч

V Ъ \ »

2 г ЯКО 2004

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Халина, Яна Николаевна

Список использованных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. СТРУКТУРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИОЗИНА И ЕГО НИТЕЙ.

1.1. Структура молекулы сердечного миозина.

1.1.1. Состав молекулы сердечного миозина.

1.1.2. Легкие цепи сердечного миозина.

1.1.3. Функциональная роль легких цепей сердечного миозина.

1.1.4. Изоформы легких цепей 'сердечного миозина.

1.2. Структура нитей миозина.

1.2.1. Нативные нити сердечного миозина.

1.2.2. Модели структурной организации нитей миозина.

1.2.3. Синтетические нити миозина.

1.2.4. Роль легких цепей в проявлении структурных характеристик нитей миозина.

1.3. Полиморфизм сердечного миозина.

1.3.1. Состав миозина предсердий и желудочков в норме.

1.3.2. Вариабельность состава миозина предсердий.

1.3.3. Вариабельность состава миозина желудочков.

1.3.4. Условия образования гетеромерных молекул миозина in vivo.v.

Глава 2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИОЗИНА

И ЕГО НИТЕЙ.

2.1. АТФазная активность миозина.

2.2. Взаимодействие миозина с актином. Активация АТФазы миозина актином.

2.3. Роль легких цепей в проявлении актин-активируемой АТФазной активности миозина.

Глава 3. ИЗМЕНЕНИЯ В МИОЗИНЕ МИОКАРДА ПРИ АДАПТАЦИИ И

ПАТОЛОГИИ.

3.1. Исполнительный аппарат кардиомиоцитов при гипертрофии сердца.

3.2. Исполнительный аппарат кардиомиоцитов при дилатационной кардиомиопатии.

3.3. Предсердные легкие цепи-1 и сократительные свойства миокарда желудочка.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменение состава легких цепей миозина миокарда как возможный компенсаторный механизм при дилатационной кардиомиопатии"

Проблема кардиомиопатий - сравнительно новый раздел современной кардиологии. Несмотря на определенный прогресс в понимании патогенеза этих заболеваний и существенное расширение методов лечения, летальность при кардиомиопатиях остается высокой.

Основным клиническим проявлением кардиомиопатий является хроническая сердечная недостаточность, которая сопровождается ремоделированием сердца и проходит в своем развитии стадии компенсации и декомпенсации. В зависимости от компенсаторных механизмов, причины сердечной недостаточности можно отнести к перегрузке сердца давлением (гипертрофическая кардиомиопатия), объемом (дилатационная кардиомиопатия) или к непосредственному поражению кардиомиоцитов (ишемическая болезнь сердца) (Schlant & Sonnenblink, 1998).

Самой распространенной из всех кардиомиопатий является дилатационная (ДКМП). Она поражает в основном молодых людей трудоспособного возраста. Более половины больных, ожидающих трансплантацию сердца, имеют диагноз ДКМП (Шумаков В.И. и др., 1999). Многие из них умирают до операции от прогрессирующей сердечной недостаточности миокардиального генеза. По данным комитета экспертов Всемирной Организации Здравоохранения пятилетняя летальность больных ДКМП составляет 35%. Страдающие этой патологией быстрее, чем при других сердечных заболеваниях, становятся стойкими инвалидами (Мухарлямов и др., 1986).

Анализ литературы показывает, что за последние 20 лет был достигнут заметный прогресс в изучении ДКМП. Однако это, в основном, касается описания клиники и патологической анатомии, в то время как исследования на молекулярном уровне представлены недостаточно. Вместе с тем, решение многих проблем кардиологии на современном этапе зависит от понимания молекулярных механизмов адаптационной способности миокарда. Одна из трудностей проведения работ в этом направлении состоит в том, что ДКМП сопровождается изменением как внутрисаркомерных белков, и в частности миозина, так и факторов, регулирующих сопряжение возбуждения и сокращения, энергетический обмен и p-адренергическую рецепцию (Swynghedauw, 1998). Это усложняет выяснение вклада сократительных белков в изменение функциональной способности миокарда при патологии.

Молекула миозина, основного сократительного белка, состоит из двух тяжелых цепей и двух пар легких цепей. Легкие цепи существуют в виде изоформ, в норме строго специфичных для предсердий и желудочков. При некоторых кардиомиопатиях в миозине желудочков были обнаружены замены эндогенных желудочковых легких цепей на предсердные изоформы. Сделано предположение, что такая замена при патологии может вносить вклад в компенсацию ослабленной сократительной способности миокарда (Schaub et al, 1998), однако прямой эффект предсердных легких цепей на структурные и ферментативные характеристики миозина желудочков и его нитей еще предстояло изучить. Кроме того, несмотря на то, что эта гипотеза поддерживается результатами некоторых экспериментов с трансгенными животными и интакгными или демембранизированными волокнами, однако они не исключают вклада других белков нервно-мышечной системы в наблюдаемую компенсацию. Среди кардиомиопатий участие предсердных легких цепей в компенсации обсуждается только для гипертрофической, когда уровень замен достигает 30%. При проверке этой гипотезы для ДКМП были получены неоднозначные результаты, а низкий уровень этих замен, который составлял не более 17%, не позволял сделать вывода об их физиологическом значении. Таким образом, вопрос об участии изоформных замен в миозине желудочка в компенсации ослабленной функции сердца при ДКМП остается неясным.

Целью настоящего исследования является проверка предположения о компенсаторной роли появления предсердных легких цепей в миозине желудочка при ДКМП. Для этого в работе был изучен изоформный состав легких цепей .миозина желудочков на разных стадиях этого заболевания. Для исследования функционального значения изменений, обнаруженных в составе желудочкового миозина при ДКМП, был разработан методический подход для in vitro изменения изоформного состава легких цепей сердечного миозина и, таким образом, моделирования состава при ДКМП. Новые функциональные свойства гибридных миозинов, способные улучшать сократительные параметры миокарда, позволили сделать заключение о функциональной значимости изоформных замен легких цепей при ДКМП.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Халина, Яна Николаевна

выводы

1. Показано, что на стадии компенсации ДКМП в миозине желудочков до 30% ЛЦ1ж может заменяться ЛЦ1п. В миозине желудочка на стадии декомпенсации ЛЦ1п отсутствуют. Сделано предположение об адаптационной природе наблюдаемой изоформной замены.

2. Разработан методический подход для in vitro изменения в миозине желудочка изоформного состава легких цепей.

3. Впервые получен гибридный миозин желудочка, в котором 75% ЛЦ1ж и ЛЦ2ж заменены соответствующими предсердными изоформами. Такой миозин формировал нити нормальных размеров и формы и проявлял актин-активируемую АТФазную активность на 63% выше контрольной. Сделано предположение о том, что наблюдаемая активация ферментативных свойств обусловлена ЛЦ1п.

4. Для подтверждения вклада ЛЦ1п в улучшение функциональных свойств миозина желудочков впервые получены модельные гибридные миозины желудочка с ЛЦ1п. Нити гибридных миозинов по форме и размерам не отличались от контрольных. Замена 17%, 24% и 42% ЛЦ1ж предсердными ЛЦ1 увеличивала актин-активируемую АТФазную активность гибридных миозинов на 18%, 26% и 46%, соответственно.

5. Отмечена сильная положительная корреляция между содержанием ЛЦ1п и уровнем ферментативной активности гибридного миозина (коэффициент корреляции = 0.999).

6. Анализ свойств двух типов гибридных миозинов свидетельствует о прямом активирующем эффекте ЛЦ1п на ферментативную активность миозина желудочка, что свидетельствует о роли изоформной замены в составе легких цепей при ДКМП в компенсации сердечной недостаточности.

7. Проведенное исследование открывает перспективы разработки методов генной терапии для пациентов с сердечной недостаточностью либо путем вирусного трансфера кДНК ЛЦ1п в кардиомиоциты, либо активацией транскрипции гена ЛЦ1 п в желудочках сердца.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю искреннюю признательность моему руководителю Подлубной З.А., сотрудникам лаборатории структуры и функции мышечных белков ИТЭБ РАН, где была выполнена основная часть работы: Алексеевой Ю.А., Борисовой З.П., Вихлянцеву И.М., Макаренко И.В., Малышеву С.Л., Сусеровой Т.С, Удальцову С.Н. Шпагиной М.Д., а также Вишневской З.И., Лежневу Э.И.; директору НИИТиИО МЗ РФ Шумакову В.И. и заведующим отделениями Клинической анатомии и Рентгено-дифракционной диагностики Ильинскому И.М. и Честухину В.В.; коллегам из Макс-Дельбрук Центра молекулярной медицины (Берлин-Бух, Германия), где была выполнена часть работы Бартч X., Зибилак С., Котичке М., Лютч Г., Морано И., Петцхолд Д., Хаазе X., Шлегель В., Эрдманн Б.

Сердечно благодарю моих родителей и сестру за понимание и поддержку, оказанную при подготовке работы и школьного учителя Иванкову А.И., которая вдохновила меня заняться научной деятельностью.

Исследование по теме диссертационной работы были поддержаны грантами РФФИ 01-04-48195; РФФИ 01-04-97007; Программы ОБН РАН «Интегративные механизмы регуляции функций в организме», Госконтракг № ОБН 7/2003 от 15/04/2003; ДААД А/02/24072; ДФГ 362/22-1.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Изучение способности миокарда поддерживать необходимый уровень функциональной активности при развитии сердечной недостаточности имеет не только фундаментальное, но и большое прикладное значение. Установление молекулярных механизмов такого адаптационного процесса может дать совершенно новое направление в диагностике, лечении и профилактике сердечно-сосудистых заболеваний, которые являются главной причиной смертности. Настоящая работа была посвящена исследованию адаптации на уровне миозина миокарда. Полученные результаты открывают перспективы для диагностики и лечения сердечной недостаточности как при ДКМП, так и при других сердечных заболеваниях.

• Легкие цепи сердечного миозина и прогноз развития ДКМП

Рекомендуется методом гель-электрофореза при денатурирующих условиях в эндомиокардиальных биоптатах из желудочков больных ДКМП определять изоформный состав легких цепей миозина. На начальной стадии заболевания в миозине желудочков экспрессируются ЛЦ1п. Отсутствие ЛЦ1п свидетельствует о конечной стадии ДКМП и прогрессирующей депрессии сократительной способности желудочков сердца.

Таким образом, определение изоформной композиции легких цепей миозина желудочков при ДКМП, наряду с клинико-гемодинамической оценкой состояния больных, может стать основой для создания прогностического теста развития ДКМП и может использоваться для оценки резервных возможностей миокарда. Тест, основанный на оценке состава основного сократительного белка - миозина, позволит более адекватно определять категорию больных с неблагоприятным ближайшим прогнозом заболевания и выполнять операцию по трансплантации сердца в более ранние сроки, снизив тем самым уровень дооперационной смертности. Преимущества такого теста - отсутствие влияния сопутствующих заболеваний и его простота.

• Легкие цепи сердечного миозина и генная терапия сердечно-сосудистых заболеваний

Как свидетельствуют результаты, полученные в данном исследовании, появление ЛЦ1п в желудочках может быть молекулярным адаптационным механизмом, который участвует в компенсации недостаточной сократительной способности сердечной мышцы к условиям повышенной нагрузки. Следовательно, для лечения пациентов с конечной стадией ДКМП и другими сердечными заболеваниями, сопровождающимися сердечной недостаточностью, могут быть разработаны подходы генной терапии либо путем вирусного трансфера кДНК ЛЦ1п в кардиомиоциты, либо активацией транскрипции гена ЛЦ1п в желудочках сердца.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Халина, Яна Николаевна, Пущино

1. Вихлянцев И.М., Алексеева Ю.А., Шпагина М.Д., Удальцов С.Н., Подлубная З.А. (2002) Изучение свойств С-белка скелетных и сердечных мышц сусликов Citellus undulatus на разных стадиях зимней спячки. Биофизика, т. 47, № 4: 701705

2. Ибрагимов А.Ю. (1989) Клинико-морфологические сопоставления при дилятационной кардиомиопатии. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3. Левицкий Д.И. (1987) Структурные особенности и функциональная роль молекул миозина. Структура и функции белков сократительных систем, Л.: Наука

4. Лукоянова Н.А., Игнатьев Д.А., Колаева С.Г., Подлубная З.А. (1997) Биофизика, 42:343-347.

5. Макаренко И.В., Шпагина М.Д., Вишневская З.И., Подлубная З.А. (2002) Изменение структурно-функциональных свойств цитоскелетного эластичного белка тайтина при дилатационной кардиомиопатии Биофизика, т. 47, № 4: 706710

6. Малышев С.Л. (2000) Роль легких цепей миозина в регуляции мышечного сокращения. Цитология, 42: 19-26

7. Мархасин B.C., Изаков ВЛ., Шумаков В.И. (1994) Физиологические основы нарушения сократительной функции миокарда. СПб.: Наука, 256 с.

8. Мацука Г.Х. (2000) Сравнительное исследование иммунореактивности тропонинового комплекса при дилатационной и ишемической кардиомиопатиях. Биополимеры и клетка, т. 16, № 2:40-45

9. Моисеев B.C. (2000) Сердечная недостаточность и достижения генетики. Достижения в изучении генома человека делают все более и более значимой оценку различных генетических аспектов при конкретных видах патологии. Consilium Mudicum. Т. 1,№4: 121-131

10. Мравян С.Р., Канвар С., Голухова Е.З. (1997) Клинико-инструментальные показатели в оценке прогноза миокардита и дилятационной кардиомиопатии. Кардиология, № 7: с. 67-72

11. Мухарлямов Н.М., Попович М.И., Затушевский И.Ф. (1986) Дилатационная кардиомиопатия. Кишенев: "Штиница", 158 с.

12. Пермяков Е.А. (1993) Кальцийсвязывающие белки. М., Наука, с. 191

13. Подлубная З.А. (1999) Состав, структура и структурные переходы в толстых нитях поперечно-полосатых мышц позвоночных. Биофизика, т. 44, № 4: 700-707

14. Терещенко С.Н., Джаиани Н.А. (2001) Дилатационная кардиомиопатия сегодня. Consilium Medicum. Т. 3, №2

15. Хубутия М.Ш. (2001) дилатационная . кардиомиопатия. Вестник трансплантологии и искусственных органов, № 3-4: 32-40

16. Шумаков В.И. и Толпекин В.Е. (1999) Искуссивенное сердце состояние проблемы и перспективы. Вестник трансплантологии и искусственных органов, №1:29-32

17. Шумаков В.И., Хубутия М.Ш., Ильинский И.М. Дилатационная кардиомиопатия. ООО «Издательство Триада», 2003,448 с.

18. Akopova I.S., Shpagina M.D., Malyshev S.L., Podlubnaya Z.A. (1998) Light chains of myosin in dilated cardiomyopathy: markers of adaptive and pathological stages. J. Mol. Cell Cardiol., v.30, p.A29

19. Arrell D.K., Neverova I., Fraser H., Marban E., Van Eyk J.E. (2001) Proteomic Analysis of Pharmacologically Preconditioned Cardiomyocytes Reveals Novel Phosphorylation of Myosin Light Chain 1. Circulation Research, 89:480

20. Atar D., Gao W.D., Marban E. (1995) Alterations of excitation-contraction coupling in stunning myocardium and in failing myocardium. J. Mol. Cell. Cardiol., 27: 783-791

21. Auckland L.M., Lambert S.J., Cummins P. (1986) Cardiac myosin light and heavy chain isotypes in tetralogy of Fallot. Cardiovasc. Res., 20: 828-836

22. Barany M. (1967) ATPase activity of myosin correlated with speed of muscle shortening. J. Gen. Physiol., 50:197

23. Behlke J., Lutsch G., Gaestel M., Bielka H. (1991) Supramolecular structure of the recombinant small heat shock protein hsp25. FEBS Lett., 288, 119-122

24. Bhayana V., and Henderson A.R. (1995) Biochemical markers of myocardial damage. Clin. Biochem. 28,1

25. Bouvagnet P., Leger J., Dechesne C.A., Dureau G., Anoal M., Leger J.J. (1985) Local changes in myosin types in diseased human atrial myocardium: a quantitative immunofluorescence study. Circulation. 72(2):272-9

26. Bristow M. (1998) Why does the myocardium fail? Insights from basic science. Lancet. 352: 8-14

27. Cantino M.E., Squire J.M. (1986) Resting myosin cross-bridge configuration in frog muscle thick filaments. J. Cell Biol., 102: 610-618

28. Chantler P.D. & Szent-Gyorgyi A.G. (1979) Regulatory light-chains and scallop myosin: full dissociation, reversibility and cooperative effects. J. Mol. Biol. 138: 473492

29. Cheney R.E. and Mooseker M.S. (1992) Unconventional myosins. Curr. Opin. Cell Biol., 4(l):27-35

30. Chin Т.К., Rowe A.J. (1982) Biochemical properties of native myosin filaments. J. Muscle Res. Cell Motil., v.3, № 1, p. 118

31. Chowrashi P.K., Pemrick S.M., Pepe F.A. (1989) LC2 involvement in assembly of skeletal myosin filaments. Biochim. Biophys. Acta, v. 990, p. 216-223

32. Dalla Libera L., Sartore S., Schiaffino S. (1979) Comparative analysis of chicken atrial and ventricular myosins. Bioch. Biophys. Acta, 574:283-294

33. Dow J. & Stracher A. (1971) Identification of the essential light chains "of myosin. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 68:1107-10

34. Dreizen P. & Lewis C.G. (1970) relationship of structure to function in myosin. II. Salt denaturation and recombination experiments. Biochemistry, 9:1688-1693

35. Eisenberg E. and Moos C. (1968) The adenosine triphosphatase activity of acto-heavy meromyosin. A kinetic analysis of actin activation. Biochemistry. 7(4):1486-1489

36. Elliott "A., Offer G. (1978) Shape and flexibility of the myosin molecule. J. Mol. Biol., v.123,№4, p. 505-519

37. Engelhard V.A., Lubimova M.N. (1939) Myosin and adenosinetriphosphatase. Nature, vol. 144, №3650, p. 668-669

38. Fewell J.G., Hewett Т.Е., Sanbe A., Klevitsky R., Hayes E., Warshaw D., Maughan D., Robbins J. (1998) Functional significance of cardiac myosin essential light chain isoform switching in transgenic mice. J.Clin.Invest. v.l01(12):2630-2639

39. Figulla H., Rahlf G., Nieger M„ Luig H., Kreuzer H. (1985) Spontaneous hemodynamic improvement or stabilization and associated biopsy findings in patient with congestive cardiomyopathy. Circulation, v. 71, № 6, p. 1095-1104

40. Fisher A.J., Smith C.A., Thoden J., Smith R., Sutoh K., Holden H.M., and Rayment I. (\ 995) Structural studies of myosin:nucleotide complexes: A revised model for themolecular basis of muscle contraction. Biophys. J., 68 Suppl.:19S-28S (b)

41. Franz W.M., Cremer M., Herrmann R., Grunig E., Fogel W., Scheffold Т., Goebel

42. H.H., Kircheisen R., Kubler W., Voit T. (1995) X-linked dilated cardiomyopathy. Novel mutation of the dystrophin gene. Ann. NY Acad. Sci., v. 752, p. 470-491

43. Freeman K., Colon-Rivera C., Olsson M.C., Moore R.L., Weinberger H.D., Grupp

44. L., Vikstrom K.L., laccarino G., Koch W.J., Leinwand L.A. (2001) Progression from hypertrophic to dilated cardiomyopathy in mice that express a mutant myosin transgene. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 280: H151-H159

45. Freydina N.A., Vishnevskaya Z.I., Udaltsov S.N. & Podlubnaya Z.A. (1986) Effect of C-protein and DTNB-light chains on actomyosin ATPase activity at various ionic strengths and Ca2+-level. Acta Biophys. Biochim. Hung. 21,247-256

46. Godfrey J.E.& Harrington W.F. (1970) Self-assotiation in the myosin system at high ionoc strength. II. Evidence for the presence of a monomer-dimer equilibrium. Biochemistry, 9: 894-908

47. Harrington W.F. (1971) A mechanochemical mechanism for muscle contraction. Prot. Natl. Acad. Sci. USA. v. 68 № 3: 685-689

48. Haselgrove J.C. (1980) A model of myosin crossbridge structure consistent with the low-angel X-ray diffraction pattern of vertebrate muscle. J. Muscle Res. Cell Motil., 1: 177-191

49. Hein S., Scholz D., Fujitani N., Rennollet H., Brand Т., Friedl A., Schaper J. (1994) Altered Expression of Titin and Contractile Proteins in Failing Human Myocardium. J. Mol. Cell Cardiol., v. 26, p. 1291-1306

50. Henry G.D., Winstanley M.A., Dalgarno D.C., Scott G.M., Levine B.A., and Trayer I.P. (1985) Characterization of the actin-binding site on the alkali light chain of myosin. Biochim. Biophys. Acta, 830:233-243

51. Heusch G., Schulz R. (1996) Hibernating myocardium: a review. J. Mol. Cell. Cardiol., 28: 2359-2372

52. Hirzel HQ, Tuchschmid CR., Schneider J, Krayenbuehl HE, Schaub MC. (1985) Relationship between myosin isoenzyme composition, hemodynamics, and myocardial structure in various forms of human cardiac hypertrophy. Circ. Res., 57(5):729-40

53. Ho G.Y., Chisholm R.L. (1997) Substitution mutations in the myosin essential light chain lead to reduced actin-activated ATPase activity despite stoichiometric binding to the heavy chain. J. Biol. Chem., 272, № .7:4522-4527

54. Hudson L., Harford J.J., Denny R.C., Squire J.M. (1997) Myosin head configuration in relaxed fish muscle: resting state myosin heads must swing axially by up to 150 A or turn upside down to reach the rigor. J. Mol. Biol., 273: 440-455

55. Huxley H.E. (1963) Electron microscope studies on the structure of natural and synthetic protein filaments from striated muscle. J. Mol. Biol., v.7, № 3:281-308

56. Huxley H.E., Brown W. (1967) The low angle X-ray diagram of vertebrate striated muscle and its behavior during contraction and rigor. J. Mol. Biol., v.30, № 2: 383-431

57. Huxley H.E. (1969) The mechanism of muscular contraction. Science, v.164, № 3886: 1356-1366

58. Kaji M., Kuno H., Turn Т., Sato Y., Oizumi K. (2001) Elevated serum myosin light chain I in influenza patients. Intern. Med., V.40(7): 594-597

59. Kasper E.K., Agema W.R., Hutchins G.M., Deckers J.W., Hare J.M., Baughman K.L. (1994) The causes of dilated cardiomyopathy: a clinicopathologic review of 673 consecutive patients. J. Am. Coll. Cardiol., v. 23, № 3: 586-590

60. Katoh T. & Lowey S. (1989) Mapping myosin light chains by immunoelectron microscopy. Use of anti-fluorescyl antibodies as structural probes. J. Cell. Biol. 109:1549-60

61. Kendrick-Jones J., Szentkiralyi E.M., Szent-Gyorgyi A.G. (1976) Regulatory light chains in myosins. J. Mol. Biol., 104:747-75

62. Kensler R.W., Stewart M. (1983) Frog skeletal muscle thick filaments are three-stranded. J. Cell Biol., 96: 1797-1802

63. Khaw B.A., Gold H.K., Fallon J.T., Haber E. (1978) Detection of serum cardiac myosin light chains in acute experimental myocardial infarction: radioimmunoassay of cardiac myosin light chains. Circulation, 58(6): 1130-6

64. Kielley WW & Harrington W.F. (1960) A model for the myosin molecule. Biochim. Biophys. Acta., V. 41:401-21

65. Kolaeva S.G., Kramarova L.I., Ilyasova E.N., Ilyasov F.E. The kinetics and metabolism of the cell of hibernating animals during hibernation (1980) Int. Rev. Cytol., v. 66: 147-70

66. Kretsinger R.H. (1980) Structure and evolution of the calcium-modulated proteins. CRC Crit. Rev. Biochem., 8: 119-174

67. Kurabayashi M., Komuro I., Tsuchimochi H., Takaki F., Yazaki Y. (1988) Molecular cloning and characterization of human atrial and ventricular myosin alkali light chain cDNA clones. J. Biol. Chem., v. 263: 13930-13936

68. Kurabayashi M., Shibasaki Y., Komuro I., Tsuchimochi H., Yazaki Y. (1990) The myosin gene switching in human cardiac hypertrophy. Jpn. Circ. J., 54(9): 1192-205

69. Laemmli H. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature V. 227: 680-685

70. Lanzetta P.A., Alvarez L.J., Reinach P.S., Candia O.A. (1979) An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochem., 100: 95-97

71. Lehman W. (1978) Thick-filament-linked calcium regulation in vertebrate skeletal muscle. Nature, v.274, № 5666: 80- 81

72. Levine RJ.C. (1993) Evidence for overlapping myosin heads on relaxed thick filaments of fish, frog and scallop striated muscles. J. Struct. Biol., 110: 99-110

73. Levine, R.J.C., Kensler, R.W., Yang, Z., Stull, J.T. & Sweeney, H.L. (1996) Myosin light chain phosphorylation affects the structure of rabbit skeletal muscle thick filaments. Biophys. J., 71: 898-907

74. Levine RJ.C. (1997) Differences in myosin head arrangement on relaxed thick filaments from Lethocerus and rabbit muscles. J. Muscle Res. Cell Motil., 18: 529-543

75. Levine R.J.C., Yang, Z„ Stull, J.T. & Sweeney, H.L. (1998) Structural and functional responses of mammalian thick filaments to alterations in myosin regulatory light chains. J. Struct. Biol., 122: 149-161

76. Levine R.J., Caulfield J.B., Norton P., Chantler P.D., Deziel M.R., Slayter H.S., Margossian S.S. (1999) Myofibrillar protein structure and assembly during idiopathic dilated cardiomyopathy. Mol. Cell Biochem., 195(1-2): 1-10

77. Lowey S., Slayter H.S., Weeds A.G., Baker H. (1969) Substructure of the myosin molecule. I. Subfragments of myosin by enzymic degradation. J. Mol. Biol., v.42, № 1: 1-29

78. Lowey S., Waller G.S., Trybus K.M. (1993a) Function of skeletal muscle myosin heavy and light chain isoforms by an in vitro motility assay. J. Biol. Chem., v. 268, № 27:20414-20418

79. Lowey S., Waller G.S., Trybus K.M. (19936) Skeletal muscle myosin light chains are essential for physiological speeds of shortening. Nature, v. 365, № 6465, p. 454-456

80. Lowey S., Trybus K.M. (1995) Role of skeletal and smooth muscle myosin light chain. Biophys. J., v. 68, № 2, p. 120s-127s

81. Maeda M., Holder E., Lowes В., Valent S., Bies R.D. (1997) Dilated cardiomyopathy associated with deficiency of the cytoskeletal protein metavinculin Circulation, v. 95, № 1, p. 17-20

82. Margossian S.S. (1985) Reversible dissociation of dog cardiac myosin regulatory light chain 2 and its influence on ATP hydrolysis. J. Biol. Chem., V. 260. № 25: 1374713754

83. Margossian S.A., White H.D., Caulfield J.B., Norton P., Taylor S., Slayter H.S. (1992) Light chain 2 profile and activity of human ventricular myosin during dilated cardiomyopathy. Circulation, v. 85, № 5: 1720-1733

84. Mestroni L., Milasin J., Vatta M., Pinamonti В., Sinagra G., Rocco C., Matulic M., Falaschi A., Giacca M., Camerini F. (1996) Genetic factors in dilated cardiomyopathy. Arch. Mai. Coeur. Vaiss., v. 89, spec № 2: 15-20

85. Milligan R.A., Whittaker M., Safer D. (1990) Molecular structure of F-actin and location of surface binding sites. Nature, v.348:217-221

86. Moos C. (1973) Cold Spring Harbor Symposium Quantitative Biology, 37: 137

87. Moore R.L., Palmer B.M. (1999) Exercise training and cellular adaptations of normal and diseased hearts. Exerc. Sport Sci. Rev., v. 27: 285-315

88. Morano I., Hadicke K., Grom S., Koch A., Schwinger R.H., Bohm M., Bartel S., Erdmann E., Krause E.G. (1994) Titin, myosin light chains and C-protein in the developing and failing human heart. J. Mol. Cell Cardiol., 26(3):361-8

89. Morano I., Ritter O., Bonz A., Timek Т., Vahl C.F., Michel G. (1995) Myosin Light Chain Actin Interaction Regulates Cardiac Contractility. Circ. Res., v. 76, № 5: 720725

90. Morano I. and Haase H. (1997) Different actin affinities of human cardiac essential myosin light chain isoforms. FEBS Lett. 408: 71-74

91. Morano I. (1999) Tuning the human heart molecular motors by myosin light chains. J. Mol. Med., 77: 544-555

92. Pardee J.D. & Spudich J.A. (1982) Purification of muscle actin. Methods Enzymol. V.85 Pt. B:164-181

93. Pemrick S.M. (1977) Comparison of the calcium sensitivity of actomyosin from native and LC-deficient myosin. Biochemistry, v. 16:4047-4054

94. Pepe F.A. (1971) Structure of the myosin filament of striated muscle. Progr. Biophys. Mol. Biol., v.22: 75-95

95. Perrie W.T. & Репу S.V. (1970) An electrophoretic study of the Iow-molecular-weight components of myosin. Biochem. J., 119:31-8

96. Pissarek M., Bigard X., Mateo P., Guezennec C.Y., Hoerter J.A. (1997) Adaptation of cardiac myosin and creatine kinase to chronic hypoxia: role of anorexia and hypertension. Am. J. Physiol., v. 272, № 4, pt.2: H1690-H1695

97. Podlubnaya Z.A., Kakol I., Moczarska A., Stepkowski D., Udaltsov S. (1999) Calcium-induced structural changes in synthetic myosin filaments of vertebrate striated muscles. J. Struct. Biol., v. 127, №1: 1-15

98. Prince H.P., Trayer H.R., Hemy G.D., Trayer I.P., Dalgamo D.C., Levine B.A., Cary P.D., Turner C. (1981) Proton nuclear-magnetic-resonance spectroscopy of myosin subfragment 1 isoenzymes. Eur. J. Biochem., v. 121:213-219

99. Pulliam D.L., Sawina V., Levine R.J.C. (1983) Calcium sensitivity of vertebrate skeletal muscle myosin. Biochemistry, v.22, № 10: 2324-2331

100. Rarick H.M., Opgenorth T.J., von Geldem T.W., Wu-Wong J.R., Solaro R.J. (1996) An essential myosin light chain peptide induces supramaximal stimulation of cardiac myofibrillar ATPase activity. J. Biol. Chem., 271(43):27039-43

101. Rayment I., Rypniewski W.R., Schmidt-Base K., Smith R., Tomchicl D.R., Benning M.W., Winkelmann D.A., Wesenberg G., Holden H.M. (1993) Three-dimensional structure of myosin sub fragment-1: a molecular motor. Science, v. 261: 50-58

102. Rayment I. (1996) The structural basis of the myosin ATPase activity. J. Biol. Chem., 271:15850-15853

103. Rees M. & Young M. (1967) Studies on the isolation and molecular properties of homogeneous globular actin. Evidence for a single polypeptide chain structure. J. Biol. Chem., 242:4449-4458

104. Ritter O., Haase H., Schulte H.D., Lange P.E., Morano I. (1999) Remodeling of the hypertrophied human myocardium by cardiac bHLH transcription factors. J. Cell. Biochem. 74:551-61

105. Schaper J., Froede R., Hein St., Buck A., Hashezume H., Speiser В., Friedl A., Bleese N. (1991) Impairment of the myocardial ultrastructure and changes of the cytoskeleton in dilated cardiomyopathy. Circulation, v. 83: 504-514

106. Schaub M.C., Tuhcshmid C.R., Srihari Т., Hirzel H.O. (1984) Myosin isoenzimes in human hypertophic hearts. Shift in atrial myosin heavy chains and in ventricular myosin light chains. Eur. Heart I, 5 (Suppl): 85-93

107. Schaub M.C., Hirzel H.O. (1987) Atrial and ventricular isomyosin composition in patients with different forms of cardiac hypertrophy. Basic Res. Cardiol., 82 Suppl. 2:357-67

108. Shaub M.C., Hefti M.A., Zuellig R.A., Morano I. (1998) Modulation of contractility in human cardiac hypertrophy by myosin essential light chain isoforms. Cardiovasc. Res., 37: 381-404

109. Schiaffino S & Reggiany C. (1996) Molecular diversity of myofibrillar priteins: gene regulation and functional significance. Physiol. Rew., 76 371423

110. Schlant R. & Sonnenblink A. (1998) Pathophysiology of heart failure. In: Hurst's The heart. Ed. Alexander R. Et al. McGraw-Hill, 687

111. Sellers J.R., Chantler P.D., Szent-Gyorgyi A.G. (1980) Hybrid formation between scallop myofibrils and foreign regulatory light-chains. J. Mol. Biol., 144:223-45

112. Sellers J.R. and Goodson H.V. (1995) in: Protein Profile, v.2, Motor protein 2: myosin. Sheterline, P., Ed., Academic Press, London, 1323-1423

113. Sivaramakrishnan M. & Burke M. (1982) The free heavy chain of vertabrate skeletal myosin subfragment 1 shows full enzymatic activity. J. Biol. Chem., 257: 1102-1105

114. Siu S.C., Sole M. J. (1994) Dilated cardiomyopathy. Curr. Opin. Cardiol., v. 9, № 3: 337-343

115. Skubiszak L. (1993) Force generation in muscle. I. Molecular organization in the thick filament. Biocyb. Biomed. Eng., v. 13, № 1: 75-96

116. Skubiszak L. (1996) Structure and functional significance of the thick filament. Biophysics, 41:40-57

117. Solaro R.J., Pang D.C., Briggs F.N. (1971) The purification of cardiac myofibrils with triton X-protein-100. Biochim. Biophys. Acta.,V. 245:259-262

118. Spry C.J. and Tai P.C. (1991) Dilated cardiomyopathy and myocarditis: monoclonal antibodies to diseased heart tissues. Eur. Heart. J., v. 12, Suppl. D: 130-133

119. Squire J. (1981) The structural basis of muscle contraction. N.- Y.-Lond., Plenum Press

120. Squire J.M., Luther P.K., Knupp C. (2003) Structural evidence for the interaction of C-protein (mybp-C) with actin and sequence identification of a possible actin-binding domain. J. Mol. Biol., 331(3):713-24

121. Stepkowski D., Babiychuk E.B., Danilova V.M. and Kakol I. (1994) Skeletal muscle myosin regulatory light chains conformation affects the papain cleavage of Al light chains. Biochim. Biophys. Acta Protein Struct. Mol. Enzymol., 1209:253-259

122. Stepkowski D., Efimova N., Paczynska A., Moczarska A., Nieznanska H., Kakol I. (1997) The possible role of myosin Al light chain in the weakening of actin-myosin interaction. Biochim. Biophys. Acta., v. 1340, № 1: 105-114

123. Strynadka N.C.J., James M.N.G. (1989) Crystal structures of the helix-loop-helix calcium binding proteins. Annu. Rev. Biochem., 58: 951-998

124. Sutoh K. (1982) Identification of myosin-binding sites on the actin sequence. Biochemistry, v. 21, № 15: 3654-3661

125. Sweeney H.L., Boeman B.F., Stull J.T. (1993) Myosin light chain phosphorylation in vertebrate striated muscle: regulation and function. Am. J. Physiol., v. 264: С1085-C1095

126. Sweeney H.L., Straceski A.J., Leinwand L.A., Tikunov B.A. Faust L. (1994) Heterologous expression of a cardiomyopathic myosin that is defective in its actin interaction. J. Biol. Chem., 269:1603-1605

127. Sweeney H.L. (1995) Function of the N terminus of the myosin essential light chain of vertebrate striated muscle. Biophys. J., 68 Suppl.:l 12S-119S

128. Swynghedauw B. (1986) Developmental and functional adaptation of contractile proteins in cardiac and skeletal muscles. Physiological reviews, v. 66, № 3: 710-771

129. Swynghedauw B. (1998) Molecular biology of heart failure. In: Advances in Cardiomyopathies. Eds. Camerini F., Gavazzi A., De Mira R. 147-159

130. Syrovy I. (1987) Isoforms of contractile proteins. Prog. Biophys. Molec. Biol., v. 49, No 1:1-27

131. Takahashi S. (1978) Topography of the myosin molecule as visualized by an improved negative staining method. J. Biochem., v.83, № 3: 905-908

132. Tate C.A., Hyerk M.F., Taffet G.E. (1994) Mechanisms for the responses of cardiac muscle to physical activity in old age. Medicine and science in sports and exercise, p. 561-567

133. Timson D.J., Trayer I.P. (1997) The myosin essential light chain: how it fine tunes a protein machine. J. Muscle Res. Cell. Motil., 18:260

134. Timson D.J., Trayer I.P. (1997a) The role of the proline-rich region in A 1-type myosin essential light chains: implications for information transmission in the actomyosin complex. FEBS Lett., 400: 31-36

135. Timson D.J., Trayer H.R., Trayer I.P. (1998) The N-terminus of Al-type myosin essential light chains binds actin and modulates myosin motor function. Eur. J. Biochem., 255: 654-662

136. Towbin J.A. (1993) Molecular genetic aspects of cardiomyopathy. Biochemical Medicine and Metabolic Biology, v. 49: 285-319

137. Trahern C.A., Gere J.B., Krauth G.H., Bigham D.A. (1978) Clinical assessment of serum myosin light chains in the diagnosis of acute myocardial infarction. Am. J. Cardiol., v. 41: 641-645

138. Trahair Т., Yeoh Т., Keogh A., Spratt P., Chang V., dosRemedios C., Ganniog P.1993) Myosin Light Chain Gene Expression Associated with Disease States of the Human Heart. J. Mol. Cell Cardiol., v. 26: 577-585

139. Trayer I.P., Trayer H.R., and Levine B.A. (1987) Evidence that the N-terminal region of A1-light chain of myosin interacts directly with the C-terminal region of actin. A proton magnetic resonance study. Eur. J. Biochem., 164:259-266

140. Trybus K.M. (1994) Role of myosin light chain. J. Muscle Res. Cell Motil., v. 15: 587-594

141. Van Buren P., Waller G.S., Harris D.E., Trybus K.M., Warshaw D.M., Lowey S.1994) The essential light chain is required for full force production by skeletal muscle myosin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 91: 12403-12407

142. Wagner P. & Giniger E. (1981) Hydrolysis of ATP and reversible binding to F-actin by myosin heavy chains free of all light chains. Nature, v.292, № 5823, p. 560-562

143. Wagner P. (1985) Preparation and fractionation of myosin light chains and exchange of the essential light chains. In: Methods in enzymology, 85: 72-81

144. Wagner P.D. & Weeds A.G. (1997) Studies on the role of myosin alkali light chains. Recombination and hybridization of light chains and heavy chains in subfragment-1 preparations. J. Mol. Biol., 109:455-473

145. Walker M., Knight P., Trinick J. (1985) Negative staining of myosin molecules. J. Mol. Biol. 184:535-542

146. Walzthony D., Bahler M., Wallimann Т., Eppenberger H.M., Moor H. (1983) Vizualization of freeze-dried and shadowed myosin molecules immobilized on electron microscopic films. Eur. J. Cell Biol., v.30, № 2: 177-181

147. Watterson J.G., Kohler L., Schaub M.C. (1979) Evidence for two distinct binding affinities in the binding of divalent metal ions to myosin. J. Biol. Chem., 254: 64706477

148. Weeds A.G., Pope B. (1977) Studies on the chymotryptic digestion of myosin. Effects of divalent cations on proteolytic susceptibility. J. Mol. Biol., v.l 11, № 1, p. 129-157

149. Weeds A.G., Lowey S. (1971) Substructure of'the myosin molecule. II. The light chains of myosin. J. Mol. Biol. v. 61 № 3:701-25

150. Wells J.A. and Yount R.G. (1979) Active site trapping of nucleotides by crosslinking two sulfhydryls in myosin subfragment 1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4966-4970

151. Williamson M.P. (1994) The structure and function of proline-rich regions in proteins. Biochem. J., 279: 249-260

152. Wikman-Coffelt J. (1980) Properties of the non-specific calcium-binding sites of rabbit skeletal-muscle myosin. Biochem. J. 185(l):265-268

153. Xie X., Harrison D.H., Schlichting I., Sweet R.M., Kalabokis V.N., Szent-Gyrgyi A.G., and Cohen C. (1994) Structure of the regulatory domain of scallop myosin at 2.8° resolution. Nature, 368:306-312

154. Yamashita H., Tyska M.J., Warshaw D.M., Lowey S., Tiybus K.M. (2000) Functional consequences of mutation in the smooth muscle myosin heavy chain at sites implicated in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy. J. Biol. Chem., v.275:36, 28045-28052

155. Zimmermann К., Kautz S., Hajdu G., Winter C., Whalen R.G., Starzinski-Powitz A. (1990) Heterogenic mRNAs with an identical protein-coding region of the human embryonic myosin alkali light chain in skeletal muscle cells. J. Mol. Biol., 211: 505513

156. Protein expression profiles, HEART-2D PAGE The human myocardial two-dimensional electrophoresis protein database, German Heart Institute, Berlin, http://userpage.chemie.fu-berlin.de/~pleiss/DCM-profiles.html