Изменение состава глицеролипидов листьев в зависимости от факторов среды и вида растений

Родионов, Владимир Степанович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изменение состава глицеролипидов листьев в зависимости от факторов среды и вида растений
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Изменение состава глицеролипидов листьев в зависимости от факторов среды и вида растений"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

УДК 581.19.577:115

Родионов Владимир Степанович

ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА ГЛИЦЕРОЛИПИДОВ ЛИСТЬЕВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФАКТОРОВ СРЕДЫ И ВИДА РАСТЕНИЙ

03.00.12 — физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Киев — 1989

Работа выполнена в Институте леса Карельского филиала АН СССР и Институте биологии Карельского филиала АН СССР.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик АН Грузинской ССР

Санадзе Г. А.

доктор биологических наук, профессор

Судьина Е. Г.

доктор биологических наук

Мерзляк М. Н.

Ведущая организация — Институт биологии Казанского филиала АН СССР.

Защита состоится « » 1989 г. в 10 часов на

заседании специализированного Совета Д 016.57.01 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.12 — физиология растений при Институте физиологии растений и генетике АН УССР по адресу: 252127, Киев-127, ул. Васильковская, 31/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « . » 1989 г.

Ученый секретарь

специализированного

Совета Силаева А. М.

Принятые сокращения

ДГДГ — ацилдигалактозилдиацилглицерины

1МГДГ — ацилмоногалактозилдиацилглицерины

.СЛФА—Ы4 — ацетилсульфаниламид

Л — сумма гликолипидов

БН — восстановленный глютатион

1.АПФ — деацилированные производные фосфолипидов

[Д — длина дня (в часах)

[,ГДГ — дигалактозилдиацилглицерины

[ФГ — дифосфатидилглицерины

КК — жирные кислоты: (16:0 — пальмитиновая, 16:1

и 16:1 — гексадеценовые, 16:2 — гексадекадиено-вая, 16:3 — д7, ю, 13 — гексадекатриеновая, 18:0 — стеариновая, 18:1 — олеиновая, 18:2 — линоле-вая, 18:3 — линоленовая) 1ДС — индекс двойной связи (ИН — индекс ненасыщен-

ности), характеризующий степень ненасыщенности жирных кислот (СНЖК) ККС — жирнокислотный состав

к — люкс

1ФГ — лизофосфатидилглицерин

1ФХ — лизофосфатилхолин

1ФЭ — лизофосфатилэтаноламин

1ГДГ — моногалактозилдиацилглицерины

1ЭЖК — метиловые эфиры жирных кислот 1Л — сумма нейтральных липидов

1СС — продолжительность солнечного сияния (в часах

за декаду)

1ТСС — пластинки с тонким слоем силикагеля

-18:3 и С1б:з — растения. Растения, содержащие в МГДГ преимущественно линоленовую или линолеповую и А7, 10> 13 — гексадекатриеновую кислоту '■Л — сумма липидов

'■л — сульфолипид

:ЛК — содержание линоленовой кислоты

:ЛФ — суммарный липидный фосфор

1ЛФА — сульфаниламид >Г — фосфатидилглицерины

ФИ — фосфатидилинозиты

ФК — фосфатидные кислоты

ФЛ — сумма фосфолипидов

ФС — фосфатидилсерины

ФХ — фосфатидилхолины

ФЭ — фосфатидилэтаноламины

X — хроматография (ГХ, КХ, ТСХ — соответственш

газовая, колоночная и тонкослойная X, ХТСС — хроматография в тонком слое силикагеля) ЭР — эндоплазматический ретикулум

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Глицеролипиды, к которым относятся ГЛ и ФЛ, являются структурными компонентами мембран хлороплас-тов, митохондрий, пероксисом и других органелл фотосинтетических тканей. Они играют важную роль в процессе развития растений и их адаптации к условиям окружающей среды, в особенности, к изменениям освещенности и температуры. Однако, в качестве объекта исследований использовались преимущественно низшие растения, и пока мало сведений о характере изменений состава липидов в листьях высших растений. Поэтому возникла необходимость проведения систематических исследований по изменению состава глицеролипидов в процессе развития травянистых и древесных растений и их адаптации к различной освещенности и пониженной температуре. Актуальной является проверка выдвигаемой нами концепции о том, что в процессе эволюции растений и их адаптации к факторам среды в листьях выработался сложный механизм биохимической и структурной перестройки, в которой значительную роль играют глицеролипиды клеточных мембран. Кроме того, представляет интерес исследования по изменению ЖКС мембранных дипидов в зависимости от способности видов растений к клубне-, плодо- и корнеплодообразованию на длинном дне.

Цель и задачи исследования. Цель нашей работы состояла в установлении закономерностей изменения состава глицеролипидов листьев в процессе развития растений и их адаптации к различной освещенности и пониженной температуре. Достижение этой цели включало решение таких задач, как разработка и усовершенствование некоторых методов анализа глицеролипидов [I ацетил-Ко А-синтетазы, изучение внутриклеточного распределения глицеролипидов и ацетил-Ко А-синтетазы, расщепление глицеролипидов в результате гомогенизации листьев, влияния на состав липидов различной освещенности и пониженных температур, характера годичных и сезонных изменений состава глицеролипидов у древесных растений, а также изменения ЖКС глицеролипидов листьев в зависимости от способности видов к клубне-, пло-цо- и корнеплодообразованию на длинном дне.

Научная новизна. Выдвинута концепция, согласно которой в процессе эволюции растений и их адаптации к факторам среды

2 Зак. 2616

в листьях выработался сложный механизм .структурной и биохи мической перестройки, в которой значительную роль играют гли церолипиды. С помощью разработанных и усовершенствованны; методов анализа глицеролипидов показано, что наиболее интеп сивные изменения состава липидов наблюдаются при зелененш и росте листьев, адаптации растений к морозу и весенней потер! морозоустойчивости, когда интенсивно перестраивается ультра структура клеток.

При освещении этиолированных растений, когда в листья) формируются хлоропласты из этиопластов, после индукционногс периода значительно возрастает содержание хлоропластных липи дов — МГДГ, ДГДГ, Сл, ФГ; у древесных растений при этом спи жается содержание ФЛ, что связано с образованием центрально! вакуоли и деградацией части ЭР и диктиосом. На свету у С^з-растений увеличивается относительное содержание высокопепасы щепных жирных кислот (липоленовой кислоты сначала в МГДГ ДГДГ, Сл, затем в ФХ, ФЭ, ФГ и ФИ, Д7' 10> 13 — гексадекатриено вой в МГДГ, А3 — транс-гексадеценовой в ФГ) и уменьшаете концентрация ЖК с меньшей степенью ненасыщенности (липоле вой, олеиновой и пальмитиновой) в результате чего СНЖК воз растает, что направлено на обеспечение необходимой жидкостно сти мембранных липидов. Освещение растений с зелеными сфор мировавшимися листьями не приводит к существенному измене' нию состава глицеролипидов в листьях.

Нами обнаружен в хлоропластах, выделен и частично очище! фермент ацетил-Ко А-синтетаза, необходимый для образована ацетил-Ко А при синтезе ЖК из ацетата на свету. При затемнении растений расщепляются липиды хлоропластов, что коррели рует с деградацией гранально-ламеллярной системы хлоропластов в то время как впехлоропластные ФЛ и структура митохондрю существенно не изменяются. На состав липидов оказывает влияние и пониженная освещенность: в одно- и двулетней хвое сосны, растущей в нижнем ярусе лесного полога, содержится больше ФЛ и меньше ГЛ, чем у деревьев верхнего яруса и сво-боднорастущих, что указывает па мезотрофиый способ питания.

Под влиянием пониженных температур на растения отмечается разный характер изменения состава липидов листьев (иа примере картофеля): закаливающие температуры способствуют увеличению содержания ФЛ, заморозок с переохлаждением не вызывает существенных изменений состава глицеролипидов, заморозоь с льдообразованием способствует расщеплению галакто- и фос-фолипидов с образованием СЖК, лизофосфолипидов, ФК, кото рая ингибирует реакцию Хилла в хлоропластах. Промораживание хвои сосны приводит к расщеплению ФЛ и разрушению ультраструктуры клеток, а осеннее закаливание растений к морозу вы-

¡ывает возрастание содержания ФЛ и увеличение количества 1ембраи.

Обнаружены принципиальные различия в характере сезонных [зменепий ЖКС двух групп мембранных липидов — ФЛ и ГЛ: ! естественных условиях при осенней адаптации древесных рас-■ений к морозу СНЖК ФЛ повышается, а СНЖК ГЛ понижает-:я. При перезимовке сохраняется высокий уровень СНЖК ФЛ, •огда как СНЖК ГЛ продолжает снижаться. Весной с потерей шрозоустойчивости СНЖК ФЛ уменьшается, а СНЖК ГЛ рас-■ет. Подобным же образом изменяется в эти периоды содержание 1>Л и ГЛ. Эти различия обусловлены развитием и сохранением [юсфолипидсодержащих внехлоропластных мембран осенью—зи-юй и частичной деградацией гликолииндсодержащих хлоропласт-1ых. Весной, наоборот, фосфолипидсодержащие мембраны частично деградируют, гликолипидсодержащие — восстанавливаются. <аоактер сезонных изменений пенасыщенностн жирных кислот -1Л зависит от органа растения: в хвое сосны СНЖК снижается )сеныо—зимой и повышается весной, в то время как в почках :осны и березы этот показатель существенно не изменяется. Вы-[елены группы липидов, сезонные изменения СНЖК одной из них соррелируют с колебаниями температуры, другой — освещеннос-и, а ЖКС третьей существенно не изменяется в течение осени— !имы—весны. На основании этих фактов выдвинута гипотеза ) темиературо-, светозавнсимой и стабилирующей системах регу-1ЯИИН ЖКС у древесных растений.

Установлено, что содержание НЛ в хвое и почках древесных растений увеличивается летом — в первой половине осени, сии-кается во второй половине осени — зимой и, главным образом, ¡есной — летом следующего года в период набухания почек, роста тобегов и листьев, хвои. В растущих побегах снижение концен-■рации НЛ до минимума приводит к росту концентрации ГЛ, что оказывает па развитие хлоропластов и усиление интенсивности фотосинтеза. В январской хвое сосны обнаружено примыкание тлотного слоя сферосом, в которых у растении сосредоточены за-тасные НЛ, к плазмалемме, что согласуется с гипотезой об их /частии как высокоэнергетических соединений в репарации по-¡режденных участков плазмалеммы.

Выявлена зависимость изменения ЖКС различных групп ли-шдов и функциональной активности листьев от способности ви-!ов картофеля, томатов и свеклы к развитию запасающих органов 1а длинном дне.

Практическое значение работы. Предлагается использовать: ! селекционной работе при отборе более холодоустойчивых сортов и форм растений метод оценки повреждений мембран листьев ю снижению содержания глнцеролипидов.

Теоретические разработки, касающиеся установленных закопо-

мерностей изменения состава липидов в процессе развития растений и их адаптации к факторам среды, могут быть использованы в учебниках и при чтении соответствующих курсов по физиологии и биохимии растений.

Апробация работы. Наши результаты докладывались на научных конференциях Института биологии Карельского филиала АН СССР в 1965—1972 гг., на II, III, IV Всесоюзных биохимических съездах, Всесоюзном семинаре по методам выделения хло-ропластов (Пущино, 1969), втором Всесоюзном симпозиуме «Физиологические основы устойчивости растений к заморозкам и пониженным температурам» (Петрозаводск, 1971), симпозиумах «Биологические проблемы Севера» — V-ом (Магадан, 1972), VII-ом (Петрозаводск, 1976), VIII-ом (Апатиты, 1979), 1Х-ом (Сыктывкар, 1983), Х-ом (Якутск, 1986), Всесоюзном симпозиуме «Физико-химические основы функционирования надмолекулярных структур клетки» (МГУ, Москва, 1974), Ii-ом Международном ботаническом конгрессе (Ленинград, 1975), 1-ом Всесоюзном симпозиуме «Липиды биологических мембран» (Львов, 1976), Н-ом (Ташкент, 1980), Ш-ем (Пущино, 1984), Всесоюзном совещании по вопросам адаптации древесных растений к экстремальным условиям среды (Петрозаводск, 1981), Всесоюзной конференции по проблемам физиологии и биохимии древесных растений (Красноярск, 1982), П-ой Всесоюзной конференции по клеточным механизмам адаптации» в 1985 г. (Карадагская биостанция Института южных морей Крымской обл., 1985), Всесоюзном симпозиуме «Математические и вычислительные методы в биологии» (Пущино, 1985), Всесоюзной конференции «Экстрактивные вещества древесных растений» (Красноярск, 1986), Всесоюзном совещании «Организмы, популяции и сообщества в экстремальных условиях» (Москва, 1986), VI-ом Всесоюзном симпозиуме «Роль циклических пуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций» (Петрозаводск, 1988), Ш-ей Всесоюзной конференции по проблемам физиологии и биохимии древесных растений (Петрозаводск, 1989). Кроме того, наши результаты по расщеплению глицеролипидов листьев цитируются в фундаментальных изданиях: 9-томном Biochemistry of plants (1980), 2-томном Responses of plants to environmental stresses (1980), 1-томном Frdst survival of plants: responses and adaptation of freezing stress (1987) и международных журналах: Plant Physiology, Phytochemistry, Physiologia Plantarum.

Публикации и авторские свидетельства. Основные результаты работы опубликованы в 49 статьях. По материалам работ получено 2 авторских свидетельства и удостоверение на рационализа^ торское предложение.

На защиту выносятся результаты исследований и развиваемое автором представление о перестройке глицеролипидов и их жир-

покислотпого состава в процессе развития растений и их реакции на внешние условия, а также разработанные и усовершенствованные методы анализа глицеролипидов и ацетил-Ко А-синтетазы.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы и 2-х приложений. Работа изложена на 461 страницах, включая 247 стр. машинописного текста и иллюстрирована 111 рисунками и 56 таблицами. Список литературы включает 664 работы, отечественных 233, зарубежных 431.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Методика. Объектами исследования были хвоя и почки 15—18-летних деревьев сосны обыкновенной (Plnus silvestris L.), листья и почки 10—12-летних деревьев березы повислой (Betula pendula Roth.), произрастающих в сфагново-лишайниковом сосняке в 50 км к северо-западу от г. Петрозаводска, а также листья шпината (Spinacia oleraceae L.) и картофеля культурного (Solanum tuberosum L.), возделываемых на Агробиологической станции Института биологии Карельского филиала АН СССР. Использовали также листья различающихся по способности к клубне-, плодо- и корнеплодообразованию на длинном дне видов картофеля, томатов и свеклы, которые выращивали в полевых условиях в Пушкинских лабораториях ВИРа (Ленинградская обл.). Название видов и их характеристика дана в наших работах (Родионов, Захарова, 1985 и 1987).

Растения картофеля, являющиеся объектом исследования по влиянию света и пониженной температуры на состав глицеролипидов листьев, выращивали из клубней в контролируемых условиях. В одних опытах со светом выращенные в темноте в течение 21 суток растения картофеля затем выдерживали 28 суток при непрерывном освещении белым светом (освещенность 7,5 тыс. лк, лампы ЛБД-40), в других — растения выращивали в оранжерее при естественном освещении на смеси Кнопа до 17-дневного возраста, после чего переносили на аналогичную смесь, в которой нерадиоактивный ортофосфат заменен на 23-Р-ортофосфат, и выдерживали в течение 5 суток в этих же условиях, в-третьих — растения выращивали при постоянной освещенности 10 тыс. лк до 92-дневного возраста и затем переносили в водный раствор 1-14С-ацетата. Меченные по фосфору и углероду липиды анализировали с помощью одно- и двумерной ХТСС (Родионов, 1978). В следующей серии опытов 25-дневные растения картофеля, выращенные при 7,4 тыс. лк, затеняли различным количеством слоев марли или затемняли плотной черной тканью и выдерживали трое суток, а в пятой и шестой 28-дневные растения затемняли на срок от 0 до 121 часа.

3 Зак. 2616

В одной из серии опытов с пониженной температурой 52-диев-ные растения картофеля, выращенного в вегетационных сосуда* на смеси Кнопа, подвергали искусственному заморозку в холодильных камерах (Дроздов, 1966) —4° с льдообразованием (вс время заморозка на листья наносили кристаллики льда) и с пе реохлаждением —4° (кристаллики льда не наносили) или закаливания к заморозку (температура 0—2°, продолжительности трое суток). Во второй серии опытов, где исследовалась скорость реакции расщепления ФЛ, срезанные листья картофеля промораживали в холодильнике при —9° С в течение 1,5 час.; в третьей серии — срезанные листья устойчивого к заморозкам вида картофеля дикого (S. acaule var. scheiteri) и неустойчивых к заморозкам видов примитивного культурного (S. rybinii) и культурного, выращенных из семян, подвергали 1—1,25-часовым заморозкам 0, —2, —3, —4, —5, —6 и —8° С. В первой серии растения после заморозков выдерживали в оранжерее; во второй и третьей— при комнатной температуре; в четвертой серии опытов растения разных видов картофеля, выращенные из семян в полевых условиях, подвергались воздействию осеннего ночного заморозка, а днем отбирали пробы на анализ; в пятой серии январскую хвою сосны с мороза —19,5°, переносили в жидкий азот —196°, где выдерживали 16 часов, затем в течение суток оттаивали при 0—2° и двое суток при 21°. Контрольную пробу хвои оттаивали при 21° в течение трех суток, минуя промораживание в жидком азоте.

Июньскую двулетнюю хвою сосны, отобранную в лесу при температуре 22,2° С, промораживали при —10° С в течение 16 часов и оттаивали таким же способом, как и зимнюю.

В экспериментах по влиянию гомогенизации на состав глице-ролипидов листьев срезанные дольки листьев картофеля культурного и дикого (S. acaule var schreiten), а также шпината гомо-генезировали по методике Смирнова (1960, 1962).

Выделение органелл из листьев, получение ацетоновых порошков. Хлоропласты выделяли из листьев по методике Смирнова (1960, 1962), за исключением того, что их осаждали при 1000 g и в отдельных случаях очищали в градиенте плотности сахарозы (Родионов, 1970). Фракции хлоропластов (1000g), митохондрий + гран хлоропластов (18 000g), микросом (105 000g, осадок) и надосадочной жидкости получали путем дифференциального центрифугирования. Субклеточные фракции выделяли из листьев шпината в неводной среде по методу Кириченко (1965). Ацетоновые порошки из субклеточных фракций готовили по методу Беренса (Behrens, 1956).

Анализ липидов. Пробы хвои, листьев и почек древесных растений периодически отбирали в количестве 10 или 20 г с 3—5 ярусов сверху у 8—30 деревьев, а листьев травянистых растений тех

>ке ярусов (5 или 10 г), фиксировали в кипящем метаноле или этаноле. Сухой остаток после удаления растворителя измельчали у древесных растений с применением жидкого азота, липиды извлекали и очищали от нелипидных загрязнений (Folch et al., 1957). Липиды разделяли и идентифицировали с помощью разработанных или модифицированных нами методов (см. ниже).

ЖК глицеролипидов метилировали по методу Верещагина и др. (1963). МЭЖК получали без силикагеля или в присутствии сили-кагеля (Цыганов, 1971). МЭЖК разделяли ГХ. ЖК идентифицировали с помощью метчиков и по графикам зависимости относительных объемов удерживания от числа атомов углерода. Индекс ненасыщенпости (индекс двойной связи), характеризующий степень ненасыщенности ЖК липидов, вычисляли по методу Лай-онса и др. (Lyons et al., 1964).

Определение нуклеотидов, пигментов, белков и другие методы. Ссылки на использованные методы анализа нуклеотидов, белков даны в наших экспериментальных работах (Царегородцева, Родионов, 1968; Родионов и др., 1970; Родионов, Захарова, 1970 и др.). Хлорофилл, каротинойды определяли по Арнону (Arnon, 1949), интенсивность потенциального фотосинтеза листьев — по методу Заленского и др. (1955), суммарного расхода 14С-ассими-лятов на отток и дыхание — как описано нами ранее (Родионов, 1967), реакцию Хилла — по восстановлению феррицианида (Arnon, Wattley, 1963).

Глава 1. Новые методы анализа глицеролипидов и ацетил-Ко А-синтетазы листьев

Нами разработаны и модифицированы следующие методы:

а) идентификации и количественного определения гликолипи-дов. Сущность этого метода идентификации и количественного определения МГДГ, ДГДГ, Сл, АМГДГ и АДГДГ в липидно-пиг-ментной смеси листьев с помощью ХТС состоит в обнаруженном нами новом свойстве молибдатного реактива известного состава (Vaskovsky, Kostetsky, 1968) проявлять не только ФЛ в виде синих пятен на белом фоне, но и ГЛ в виде белых пятен на синем фоне. Количество указанных выше гликолипидов определяют по калибровочному графику, построенному в координатах: площадь пятеп — количество гликолипидов;

б) разделения липидов листьев картофеля па колонках с ДЭАЭ-целлюлозой в ацетатной форме. В оригинальный метод (Allen et al., 1966) внесены следующие изменения: 1) вместо си-ланизировапной использована несилапизированная ДЭАЭ-целлю-лоза, которая, как показали наши исследования, оказались пригодной для этой цели; 2) громоздкий весовой метод, требующий

выпаривания растворителей заменен па сиектрофотометрически£ (Marsh, Weinstein, 1966), который не требует выпаривание растворителей; 3) фракция МГДГ очищена от пигментов и НЛ путем удаления их на колонках хлороформом; 4) предложена формула для количественного определения липидов во фракциях.

В существующий метод разделения липидов фотосинтетически* тканей КХ на силикагеле нами внесены следующие изменения: дополнительное элюирование прочно удерживаемых силикагелем фосфолипидов 6н НСООН в метаноле с последующим удалением муравьиной кислоты перед выпариванием растворителя и объединением этой фракции ФЛ с другой, элюированной с силикагеля метанолом. Так, СЛ хвои, листьев и почек сосны и березы мы разделяли на фракции НЛ, ГЛ и ФЛ путем последовательной элюции хлороформом, ацетоном, метанолом и 6н НСООН в метаноле. При разделении ацетоинерастворимых липидов листьев картофеля на силикагеле установлена следующая последовательность их выхода из колонок: полярные пигменты + остаток НЛ, неидентифицированный липид, ФЭ + ФХ + ДГДГ + Сл, ФИ, ФХ (остатки), неидентифицированный фосфолипид;

в) выделения хроматографически чистых МГДГ, ДГДГ, Сл, ФХ, ФЭ, ФГ, ФИ, ДФГ и ФК в количестве, достаточном для анализа их ЖКС методом ГХ, что достигается путем двукратной ХТС СЛ листьев; сначала одномерной, в результате чего СЛ делятся на фракции МГДГ+ НЛ +пигментов, ДГДГ, Сл и ФЛ, затем двумерной, при которой каждая фракция переносится вместе с силикагелем на новые пластинки с ТСС и разделяется на индивидуальные глицеролипиды. При этом МГДГ отделяется от НЛ и пигментов с помощью предложенной нами системы растворителей, а другие глицеролипиды от загрязняющих веществ — с помощью уже известных систем. Преимуществом предложенного нами метода, который использовался для массовых анализов липидов листьев картофеля, томатов и свеклы, является быстрота разделения и малый объем растворителей;

г) идентификация деацилированных производных фосфолипидов. Сущность этого метода состоит в разделении ДАПФ с помощью одномерной бумажной хроматографии, разрезании хрома-тограмм на узкие полоски, минерализации полосок и ДАПФ в 42% хлорной кислоте при 200° С, определении содержания минерального фосфора и вычисления величины Rf ДАПФ по максимуму содержания фосфора.

Преимущество нашего метода перед существующим методом идентификации ДАПФ (реактив Хейнса и Ишервуда) состоит в большей его чувствительности и избирательности;

д) количественного определения ФЛ с помощью двумерной ХТСС, сущность которого состоит в том, что пробы фосфолипи-

IOB соскабливают с пластинок с ТСС, минерализуют в присутствии силикагеля в 42 или 57%-пой хлорной кислоте при температуре 200° С в алюминиевом блоке в течение 30 мин., к ним приливают хлорную кислоту, воду, молибдатный реактив и, после эазвития окраски, спектрофотометрируют при 820 им. Преимуществом модифицированного нами метода перед оригинальным является возможность одновременной минерализации 60 проб ^осфолипидов, использовании вместо серной кислоты + перекиси зодорода или 70%-ной хлорной кислоты, которая взрывоопасна три нагревании с липидами, более разбавленной хлорной кислоты, безопасной для минерализации, а также специфического для }юсфолипидов молибдатного реактива вместо неспецифического, например, 2',Т — дихлорфлуоресцеина;

е) анализа ацетил-Ко А-сиптетазы. Принцип одного из известных методов спектрофотометрического определения ацетил-Ко А-сиитетазы заключается в ацетилировапии сульфаниламида с об-оазоваиием Ы4-ацетилсульфаниламида.

В основу разработанного нами нового метода спектрофотометрического определения сульфаниламида и №-ацетилсульфапи-ламида в смеси без их разделения положены разные свойства СЛФА и АСЛФА в силыгокислой среде (Родионов и др., 1970). На основании различия свойств сульфамидов с учетом смещения их максимумов поглощения можно построить калибровочную кривую для определения концентрации их, например, в диапазоне рН от 0,1 до 0,5. При разработке нового метода нами решены следующие вопросы: 1) предложена формула для расчета концентрации и построена калибровочная кривая зависимости оптической плотности от содержания СЛФА и АСЛФА; 2) найден способ очистки этих сульфамидов от мешающих их определению веществ САТФ, АДФ, АМФ и других) на алюминиевом геле при рН 5—6; 3) установлена пригодность метода при внесении в инкубационную среду изолированных хлоропластов; 4) рассчитана точность метода в оптимальном для определения указанных сульфамидов интервале рН (0,1—0,5). В отличие от известных методов диазо-тирования и азосочетапия (Пребстинг, Гаврилов, 1939; Bratton, Marshall, 1938), предложенный нами способ не требует таких: соединений как Н-кислота и др., которые неустойчивы при хранении в растворах, высокочувствителен и позволяет определить АСЛФА, а не убыль СЛФА, как это предусмотрено в перечисленных выше методах.

Кроме того, предложен другой способ — разделение №-ацетил-сульфаниламида и сульфаниламида на ионообменной смоле Да-уэкс-1 100—200 меш в хлоридной форме (Родионов и др., 1970), а также чувствительный радиометрический метод определения ацетил-Ко А-сиптетазы по образованию 14-С-ацетогндроксамовой кислоты из 1-!4С-ацетата (Родионов, Захарова, 1970).

Глава 2. Внутриклеточное распределение глицеролипидов листьев

В результате исследований было установлено, что фракции хлоропластов, митохондрий + гран хлоропластов и микросом, выделенные из листьев шпината, содержат соответственно (в % от суммы каждого глицеролипида в этих фракциях): МГДГ — 58, 32 и 10; ДГДГ —52, 31 и 17; ФГ —66, 26 и 8; ФХ —22. 43 и 17; ФЭ —15, 54 и 29; ФИ —28, 45 и 26. Содержание МГДГ, ДГДГ и ФГ в этих фракциях коррелирует с концентрацией хлорофилла. В растворимой фракции (надосадочная жидкость 105 ООО g) не было обнаружено существенных количеств глицеролипидов. Хло-ропласты из листьев шпината и картофеля, очищенные в градиенте плотности сахарозы, содержат МГДГ, ДГДГ, Сл, ФГ, ФХ и ФИ.

Глава 3. Влияние света и темноты на биосинтез и расщепление глицеролипидов

При непрерывном освещении белым светом этиолированных ростков Ci6-3 — растения картофеля содержание хлорофиллов а, Ь, каротинойдов, МГДГ. ДГДГ + Сл, ФГ, ФХ. ФЭ, ФИ. линоле-новой кислоты в МГДГ, ДГДГ, а затем в ФХ. ФЭ. ФГ и ФТ, д7, ю, 13 — гексадекатриеи^вой кислоты в МГДГ (и слабее в ДГДГ), дз — транс-гексадеценовой — в ФГ в начале существенно не изменяется, а затем растет пропорционально времени освещения и, наконец, достигает «плато» (рис. 1).

Концентрация же других кислот Ci8:2, Cie:i и С]6:0 в период увеличения тоиеновых и моноеновой кислот, как правило, снижается. ЖКС внехлоропластных фосфолипидов — ФХ, ФЭ и ФИ существенно не изменяется в течение длительного периода освещения, но затем СЛК начинает увеличиваться, концентрация ли-нолевой — снижаться. Аналогичный замедленный рост СЛК наблюдается и в ФГ, причем стабилизации содержания этих кислот в ФХ, ФЭ и ФГ не наблюдается даже при 28-суточпом освещении. Сходное увеличение содержания Cie:3-кислоты и снижение С^-.г-кислоты наблюдается в ФЛ развивающихся листьев березы и этот процесс продолжается с конца весны до середины лета.

В течение 28 суток освещения содержание МГДГ возрастает в 20 раз, ДГДГ —в 6, ФГ —в 8,4; ФХ— 1,7: ФЭ—1,7; ФИ —2,1 и СЛФ — 2,1 раза. Содержание минорных фосфолипидов, таких как ДФГ, ФК и ФС существенно не изменяется в течение всего периода пребывания растений на свету. Следует отметить, что характер изменения ФЛ зависит от органа и вида растений. Так, в зеленеющих и растущих листьях березы, хвое сосны содержание ФЛ снижается, ГЛ повышается. Общим для зеленеющих ростков

мгдг

100 ISO 200 250 eso 700

ФЭ

'V 18: г

N-

'S O 18:3

— * *-*—A Ю-7

O 50 100 150 200 250 S50 700

40. 30 20

^Продолжительность освещения7 ч

10 f

/на-.

W-3. 18:2

* 4

18:0

0 50 100 150 .200 250 650 700

Рис. 1. Изменение жирнокислотного состава галакто- и фосфолипидов в процессе зеленения этиолированных ростков С16.-3—растений картофеля при постоянной освещенности (7,5 тыс. лк) и комнатной температуре

Обозначения липидов и жирных кислот, как и на рис. 2—5, даны в «Принятых сокращениях», объяснения —в тексте

картофеля и листьев (хвои) является повышение соотношения ГЛ/ФЛ.

Нами установлена способность растений включать почвенный ортофосфат и ацетат в липиды листьев на свету. Среди липидных фракций листьев картофеля меченый фосфор из 32Р-ортофосфата включался в ФХ, ФЭ, ФИ, ДФГ и ФК по Б-образной кривой, его содержание увеличивалось на 2-ые сутки и снижалось — на 3—4, а меченый углерод из 1-иС-ацетата — включался преимущественно в ЖК ФЛ и фракцию МГДГ + НЛ + пигменты, в меньшей степени, в ДГДГ, Сл. Полученные данные показывают, что источником ортофосфата и ацетата могут быть не только семена, по и почва.

Включение ацетата в ЖК хлоропластов стимулируется светом и это объясняется тем, что процесс синтеза ЖК зависит от наличия АТФ и НАДФН2. Оба эти соединения синтезируются на свету в результате фотосиптетического фосфорилировапия. Поэтому представляло интерес выяснить уровень снижения содержания АТФ в системе для биосинтеза ЖК из ацетата в изолированных хлоропластах шпината. Как показали наши опыты, уменьшение концентрации экзогенной АТФ сопровождается повышением содержания АДФ, АМФ и фракции А, т. е. водного элюата с колонок Дауэкс I. После хроматографического разделения содержимого элюата на бумаге были обнаружены адении, аденозин и не-идентифицировапное соединение. Сумма АТФ, АДФ, АМФ и фракции А практически равна сумме внесенного иеуклеотида.

Из полученных нами данных можно сделать вывод о более интенсивном снижении содержания АТФ в полной системе, чем в других вариантах опыта. Если в инкубационную систему вносили АДФ, то на свету хлоропласты синтезировали из нее небольшие количества АТФ, а главная часть АДФ расщеплялась до фракции А, АМФ и неорганического фосфата;

Таким образом, в изученной нами системе для биосинтеза ЖК из ацетата на свету происходит расщепление экзогенной АТФ, зависимое от ацетата, Ко и М^2+, т. е. связанное с биосинтезом ЖК, и независимое от этих компонентов, пе связанное с биосинтезом ЖК. При этом расщепление АТФ второго вида преобладало. Расщепление же АТФ первого вида указывает на возможность участия в процессе биосинтеза ЖК в хлоропластах фермента аце-тил-Ко А-синтетазы.

Для доказательства присутствия ацетил-Ко А-синтетазы (КФ 6.2.1.1) в хлоропластах листьев шпината были проведены следующие опыты: а) изучено распределение этого фермента в субклеточных фракциях, выделенных в водной (табл. 1) и неводной среде с использованием в качестве маркера хлорофилла. Было установлено, что наибольшей активностью обладает надо-садочная жидкость (105 ООО д). Однако в изолированных хлоро-

Таблица 1

Распределение аЦетил -Ко А-синтетазы в субклеточных фракциях листьев шпината

Субклеточные структуры Белок, мг АцетОгидро-ксамовая кислота, мкмоль

Хлоропласты 1,2 0,20

Митохондрии + граны хлоропластов 1,0 0,16

Микросомы 0,8 0,03

Надосадочная жидкость (105 ООО й) 2,0 0,34

пластах и во фракции митохондрий + граны хлоропластов содержится значительная часть ацетил-Ко А-синтетазы. В микросомах фермента обнаружено меньше, чем в других фракциях. При выделении субклеточных оргаиелл из листьев в неводной среде было установлено, что фракции плотностью 1,30 и 1,35 содержали основную массу хлорофилла и, следовательно, хлоропластов и около половины общего количества ацетил-Ко А-синтетазы; произведено выделение ацетил-Ко А-синтетазы из ацетонового порошка хлоропластов и очистка этого фермента путем фракционирования сульфатом аммония и на геле гидрата окиси алюминия (С^-гель) при температуре от 0° до 1°С. В результате очистки удельная активность фермента была повышена в 2 раза (табл. 2). Активность очищенного фермента зависела от АТФ, Ко А, Д^С12, ГБН, что было установлено по интенсивности включения 1-14С-ацетата в ацетогидроксамовую кислоту. Аналогичная зависимость была установлена при использовании меченого ацетата, хотя количества ацетогидроксамовой кислоты было мало; в) о присутствии

Таблица 2

Очистка ацетил-Ко А-синтетазы из хлоропластов

Общая актив- Удельная ак-

тивность,

Фракции Объем, Белок, ность, мкмоль мкмоль ацето-

мл мг ацетогидроксамовой кислоты, в час гидроксамовой кислоты на мг белка

Экстракт из ацетонового порошка 120 360 25,1 0,07

Осадок 65% насыщения 15 119 13,2 0,11

Надосадочная жидкость после очистки на геле С7 9 67 9,3 0,14

4 Зак. 2616 15

ацетил-Ко А-синтетазы в хлоропластах свидетельствует также их способность ацетилировать СЛФА с образованием АСЛФА с участием ацетата, Ко А, ГБН и АТФ.

До сих пор мы рассматривали стимулирующее действие света на биосинтез и содержание глицеролипидов. Однако возникает вопрос, какое влияние оказывает на содержание липидов снижение освещенности, которое имеет место в ценозах, когда одни растения затеняют другие. Нами было впервые показано, что при снижении освещенности с 7,4 тыс. до 1,6 лк (затенение) содержание МГДГ, ДГДГ Сл, ФГ и хлорофилла при расчете на г сухих листьев картофеля сначала повышается, затем снижается, а ФХ, ФЭ, ФИ и ФС непрерывно увеличивается. При расчете же концентрации на г сырых листьев содержание МГДГ, ДГДГ + Сл, ФГ и хлорофилла и ФХ понижается, а ФЭ, ФИ и ФС существенно не изменяется. Различие обусловлено исчезновением ассимилятов нелипидиой природы, что больше сказывается при расчете па г сухих, чем сырых листьев.

В одно- и двулетней хвое адаптированных к пониженной освещенности деревьев сосны нижнего яруса леса весной—летом менее интенсивно увеличивается концентрация ГЛ и снижается таковая ФЛ, а в ГЛ растущих почек содержится больше линолено-вой кислоты и меньше пальмитиновой, чем у аналогичной хвои и почек, неадаптированных к пониженной освещенности деревьев верхнего яруса или свободнорастущих.

Обнаружена зависимость содержания групп липидов от их внутриклеточной локализации и продолжительности затемнения. Так, концентрация в хлоропластных МГДГ, ДГДГ + Сл, и ФГ на г сырых листьев в результате трехсуточного затемнения снизилась соответственно в 4,9 и 14,6 раза по сравнению с указанными ли-пидами листьев, освещенных при 7,4 тыс. лк. Содержание же внехлоропластиых фосфолипидов — ФХ, ФЭ, ФИ, ДФГ и ФС существенно не изменилось, за исключением ФХ, концентрация которого уменьшилась на ]/з. Если же содержание липидов рассчитывали на г сухих листьев, то концентрация хлоропластных липидов снизилась, а внехлоропластиых увеличилась па Уз. Причиной этого увеличения является исчезновение веществ нелипидиой природы.

В следующей серии опытов было показано изменение концентрации липидов и ультраструктурной организации клеток листьев картофеля при затемнении от 0 до 121 часов. После затемнения в течение 18 часов существенных изменений в содержании глицеролипидов, пигментов, структуре хлоропластов и митохондрий не наблюдается, но в хлоропластах сокращается число крахмальных зерен и растворимых углеводов. После 48 часов затемнения наблюдается снижение концентрации МГДГ, ДГДГ + Сл, ФГ и ФХ, СЛФ, хлорофиллов и каротиноидов, а кон-

центрация ФЭ, ФЙ, ДФГ, ФК существенно ríe изменяется. Хло-ропласты набухают, внутриламеллярное пространство расширяется, мембраны ламелл утончаются, появляются пластоглобулы. Крахмал в пластидах исчезает полностью, а количество рибосом уменьшается. Митохондрии более плотно упакованы трубчатыми кристами. Через 121 час затемнения продолжает уменьшаться содержание ФГ, СЛФ, пигментов, а содержание других липидов и ламеллярная система хлоропластов существенно не изменяются. В пластидах наблюдается лишь незначительное количество граи, электронная плотность стромы хлоропластов снижается. Появляются пластоглобулы, Каких-либо признаков нарушения целостности пластид и выхода содержимого их в гиалоплазму не наблюдается, Структура хлоропластов приближается к структуре хромопластов. Митохондрии в клетках мезофилла листа картофеля имеют несколько более уплотненную упаковку крист, заполнивших большую часть объема органелл.

Глава 4. Изменение жирнокислотного состава глицеролипидов листьев в зависимости от способности видов к клубне-, плодо-и корнеплодообразованию и физиологическое значение этих изменений

В результате наших исследований ЖКС глицеролипидов листьев 41 образца картофеля, томатов и свеклы в период образования запасающих органов впервые обнаружено, что в CJI, ФЛ, ФХ, ФЭ и ФИ листьев клубнеобразующих видов картофеля культурного (S. tuberosum) и примитивного культурного (S. rybinii) содержится в 1,1—2,0 раза больше линоленовой кислоты и меньше линолевой, чем в аналогичных липидах листьев видов картофеля дикого (S. acaule, S. acaule: var. albicans, var. aemulans, var. depexum, var. schreiteri, S. demissum), не образующих клубней на длинном дне, а также видов томата волосистого (Lyco-persicon hirsutum var glabratum). Кроме того, в СЛ., МГДГ, ДГДГ + Сл листьев томата обыкновенного концентрация линоленовой кислоты выше, а линолевой ниже, чем в этих же липидах листьев томата волосистого, способность которого к плодообразо-ванию выражена слабее, чем у обыкновенного. В МГДГ листьев примитивного и культурного картофеля и указанных выше видов томатов содержится в 1,7—2,5 раза больше Cie.-з- и меньше Ci8:2- кислоты, чем у видов картофеля дикого. В ФГ листьев видов картофеля дикого содержится больше линолевой кислоты и меньше линоленовой по сравнению с видами культурного картофеля, томата волосистого и обыкновенного.

В СЛ, ГЛ + ФЛ, ФЛ, Сл и ФГ листьев видов свеклы, способных к корнеплодообразованию на длинном дне (В. vulgaris L.— свекла корнеплодная, включающая сорта сахарной, столовой,

кормовой свеклы, и В. maritima—ейекла приморская) или к образованию утолщенного корня (В. cicla — листовая) содержание триеновых кислот (Ci8:3 + Ci6:3 ) выше, а других менее ненасыщенных кислот ниже, чем в аналогичных липидах листьев видов, не образующих корнеплоды (В, orientalis, В. patellaris, В. рго-cumbens). Кроме того, в МГДГ листьев сахарной тетраплоидной свеклы сорта Кюн П и вида В. patellaris содержится больше Ci6:3- и меньше С18:з — кислоты, чем в МГДГ других видов и сортов свеклы.

Листья видов томатов и свеклы, образующих плоды и корнеплоды на длинном дне, характеризовались повышенным поглощением иСОг и расходом иС-ассимилятов на отток и дыхание пс сравнению с видами, не образующими их.

Глава 5. Расщепление глико- и фосфолипидов в листьях при воздействии различными факторами

Изменение состава глицеролипидов в результате гомогенизации листьев. В гомогенатах листьев картофеля культурного концентрация нативных МГДГ .снижается, а АДГДГ и АМГДГ увеличивается. Через 8 часов после выдерживания гомогенатов при комнатной температуре МГДГ и ДГДГ почти полностью исчезают и единственным галактолипидом, обнаруженным с помощью предложенного нами метода, является АДГДГ.

Нами исследовано ферментативное расщепление мембранных фосфолипидов в гомогенатах листьев картофеля. В цельных не-гомогенизированных листьях были найдены ФХ, ФЭ, ФГ, ФИ, ДФГ и ФС, а в гомогенатах, кроме того, ФК, ЛФХ, ЛФЭ и ЛФГ. Строение этих липидов было подтверждено путем хроматографии на бумаге их деацилированных производных. При температуре 24° С содержание ФХ, ФЭ, ФГ, ФИ и ДФГ интенсивно .снижается в течение 1—60 мин. после начала гомогенизации, а уровень ФК сначала увеличивается, затем уменьшается. Через 2 часа после начала гомогенизации все нативные фосфолипиды почти полностью утрачиваются, остаются лишь следовые количества ФК. СЛФ в хлороформенной фракции за этот период снижается на 93%, вследствие отщепления фосфосодержащих остатков от молекул ФЛ. При 0±1° содержание ФХ, ФЭ, ФГ, ФИ и СЛФ уменьшается через 2 часа соответственно на 30, 26, 27, 37 и 42%, а через 24 ч на 36, 50, 52, 44 и 68%. Содержание ФК сначала увеличивается, а затем снижается.

Для изучения механизма расщепления ФЛ важно установить возможность гомогенатов листьев расщеплять экзогенные 32Р-фосфолипиды. Для этой цели гомогенизировали листья картофеля в присутствии меченых экзогенных фосфолипидов, предварительно выделенных из листьев этого же вида. Было установлено, что по мере увеличения времени выдерживания гомогенатов при

гемпературе 20—21° содержание 32Р-ФЛ, 32Р-ФХ, -ФЭ, -ФГ, -ФИ, ДФГ и -ФК снижалось, но возрастало количество нелипидного печеного фосфора, что указывает на отщепление фосфорсодержащих остатков от молекул ФЛ или их деацилирование. Среди мерных нелипидных соединений, растворимых в водном метаноле, 5ыли идентифицированы по величине Rf ортофосфат, глицеро-3-фос-рат и глицерофосфорилхолин. Процесс наиболее активно происходил в первые 10 мин., а по истечении 1 часа он замедлялся. Ферментативное расщепление почти полностью прекращалось, 1С л и листья предварительно кипятили в дистиллированной воде. !^быль радиоактивного фосфора происходила как в присутствии сахарозы, так и без нее, что указывает на незначительное участие трансацилирующего фермента в расщеплении ФЛ, так как ;го активность замедляется без сахарозы (Heinz, 1967).

Изменение состава глицеролипидов листьев у холодостойких эастений при воздействии пониженных закаливающих и повреждающих температур исследовалось в нескольких сериях опытов. 3 помощью экспериментов в одной из них был установлен разный характер изменений в концентрации глицеролипидов при воздействии пониженных закаливающих и повреждающих температур. Гак, 3-суточное закаливание растений картофеля к заморозкам способствовало увеличению доли ФХ и ФГ в СЛ по сравнению с незакаленными растениями. Заморозок с льдообразованием —4° С (с последующим выдерживанием промороженных растений сартофеля в оранжерее от 0 до 72 часов) вызывает расщепление ЧГДГ, ДГДГ, ФХ, ФЭ, ФГ и ФИ с образованием ФК в листьях (рис. 2, табл. 3). Особенно интенсивно концентрация глицероли-

Изменение содержания фосфолипидов в листьях картофеля в результате ¡оздействия заморозка —4° с льдообразованием (в мкмолях на г сухих листьев)

Таблица 3

Снижение содержания нативных ФЛ и образование ФК

Фосфолипиды

15 мин. 2 часа 8 часов 24 часа

ФХ ФЭ ФГ ФИ+ФС

Суммарное снижение содержания ¡юсфолипидов

Обнаружено ФК

7,4 8,6 10,7 10,6

4,9 5,2 5,4 5,5

4,4 5,9 6,2 6,2

—0,4 1,3 1,6 1,5

15,4 21,0 23,9 23,8 13,8 7,4 3,5 3,7

мгдг

.4 д__

я! ДГДГ+Сл

зо

20 40 60 ео

20 40 60 во

Время после заморозка, ч

го ио во во - го 40 ~еП)о Время после заморозка, ч

СЛФ

м *

§■1

го 40 со ¡о Время после заморозка, ч

Рис. 2. Изменение содержания галакто- и фос-фолипидов листьев растений картофеля, подверг нутых воздействию заморозков —4° С с льдооб разованием (1), переохлаждением (2) и в контроле (3)

пидов снижается впервые 2 часа после прекращения заморозков, затем она стабилизируется. Через 15 мин. после заморозка количество образовавшейся ФК близко к количеству расщепившихся ФХ + ФЭ + ФГ + ФИ (табл. 3). Однако в последующие часы из-за снижения содержания ФК этот баланс нарушается. Заморозок —4° С с переохлаждением не оказал существенного влияния на концентрацию глицеро-липидов.

В следующей серии опытов более подробно исследовалась скорость расщепления ФХ, ФЭ, ФИ, ФГ, ДФГ, а также накопление ФК и ЛФХ, ЛФЭ и ЛФГ в зависимости от времени выдерживания при температуре 18°С предварительно промороженных при —9° в течение 1,5 час. долек листьев картофеля. Установлено, что начальная скорость расщепления зависит от класса фосфолипидов и снижается в следующей последовательности: ФХ, ФЭ, ФГ, ФИ. Так, за 1,5-часовой период промораживания и первые 10 мин. оттаивания расщепилось в мкмолях на 1 г сы~

рых листьев соответственно: ФХ 0,54 и 0,53; ФЭ 0,41 и 0,19; ФГ 0,04 и 0,17; а ФИ не расщепился. Образовалось: ФК 0,51 и 0,77; Л ФХ 0,31 и 16, а СЛФ снизилось на 0,28 и 0,76. По мере уменьшения концентрации фосфолипидов скорость их расщепления снижается. Этот процесс прекращается или сильно тормозится при концентрации ФХ и ФЭ около 7% от первоначального их содержания, ФГ—14%, ФИ — 33%. Содержание ФК достигает максимума после 30—60 мин. выдерживания листьев при 18° и затем ее содержание постепенно снижается (0,02—0,03 мкмоль/час.).

С помощью экспериментов, в которых исследовалось воздействие на срезанные листья заморозков от 0 до —8° С, была установлена зависимость расщепления фосфолипидов от устойчивости видов картофеля к заморозкам, изменение ЖКС СЛ летально промороженных листьев и их стабильность при аналогичных заморозках с льдообразованием, а также ингибирующее действие ФК на реакцию Хилла в хлоропластах. Начало расщепления ФХ, ФЭ + ФГ и образования ФК в срезанных листьях устойчивого к заморозкам вида (S. acaule var. schreiteri) было в интервале от —3 до —4°, а у неустойчивых (S. rybinii, S. tuberosum) от 0 до —3°. По мере дальнейшего усиления заморозков в листьях всех видов снижается СЛФ (причем более интенсивно у неустойчивых), а также концентрация ФХ, ФЭ + ФГ, и увеличивается СЖК, ФК, ЛФХ, ЛФЭ и ЛФГ. Содержание четырех последних фосфолипидов затем снижается, за исключением ФК у устойчивого вида. Так, концентрация СЖК составляла после промораживания листьев при температуре 0, —2, —3, —4, —5, —6 и —8° соответственно 0,1; 4; 3,2; 6,4; 5,8 и 8,9 мкмоль на г сырых листьев. Это значительно больше того количества, которое можно было ожидать при расщеплении всех фосфолипидов. По-видимому, ГЛ также расщепляются с образованием СЖК.

Охлаждение растений до 0° и воздействие на них заморозков — 2 и —4° с переохлаждением не влияло на концентрацию ФХ, ФЭг ФГ, ДФГ, ФК, а также на ЖКС СЛ. Однако заморозки —3 и —4° с льдообразованием вызывали снижение содержания фосфолипидов, накопление ФК и лизофосфолипидов. ЖКС СЛ не изменяется в первые сутки, а на третьи снижается СЛК и растет концентрация Ci6:o —кислоты (табл. 4).

В полевых условиях было обнаружено расщепление ФЛ листьев у неустойчивых к заморозкам видов картофеля при воздействии осеннего заморозка —4° С, в то время как у устойчивых видов сохранилась прежняя концентрация ФЛ.

Искусственное промораживание январской хвои сосны при —196° С в течение 16 часов с последующим постепенным или быстрым оттаиванием приводит к расщеплению ФХ, ФЭ, ФГ, ФИ и ДФГ и деструкции митохондрий, хлоропластов ЭР и других органелл клетки, а сферосомы ц клеточная оболочка сохраняют-

Таблица 4

Влияние заморозков —4° с постепенным переохлаждением и с льдообразованием на состав жирных кислот СЛ в листьях культурного картофеля

Время после заморозка Вариант с16:0 С1В:1 с16:2 С16:3 с18:0 с18:1 с18:2 с18:3

15 МИН Контроль Заморозок: 16,9 5,0 2,6 11,6 3,6 5,4 16,6 38,3

с переохлаждением 17,6 5,7 2,3 11,2 1,8 4,2 16,4 40,6

с льдообразованием 17,7 4,6 0,9 11,3 3,8 6,0 16,0 39,8

24 Ч Контроль Заморозок: 19,9 2,0 11,3 0,8 1,9 17,7 46,3

с переохлаждением 20,3 1,9 0,2 12,1 0,4 1,8 17,5 45,7

с льдообразованием 24,4 0,2 0,1 9,5 0,9 1,7 17,4 45,8

72 Ч Контроль Заморозок: 19,8 3,1 0,8 11,7 2,7 1,0 17,1 44,8

с переохлаждением 18,2 5,3 — 12,0 1,1 1,6 16,5 45,0

с льдообразованием 51,5 0,9 — 7,2 3,2 0,2 17,8 19,2

ся. Обнаружено примыкание плотного слоя сферосом к плазма-лемме клеток непромороженной хвои. Если же промораживали июньскую хвою при —10° С в течение этого же времени и аналогичных способов оттаивания, то ультраструктурные изменения в клетке указывают на закаливающий эффект (появление липид-ных капель, новых элементов ЭР в форме везикул, конденсированного хроматина в ядре, уплотнение гиалоплазмы за счет рибосом). При оттаивании хвои ФЛ расщепляются.

Изменение жирнокислотного состава глицеролипидов листьев разных по холодоустойчивости видов и сортов и физиологическое значение этих изменений. При сравнении ЖКС липидов листьев разных по холодоустойчивости видов картофеля, томатов, огурцов и свеклы не удалось установить четкой связи между СНЖК липидов и холодоустойчивостью вида или сорта, однако сорта столовой и кормовой свеклы, выведенные в северных районах СССР, содержат более высокую СНЖК ФХ, чем сорта сахарной свеклы южной селекции.

После воздействия пониженных ночных температур 14±9°С интенсивность дневной и сезонной ассимиляции ИС02 листьями холодоустойивого томата волосистого (Ь. Ыгэ^ит) была выше, чем у томата обыкновенного (Ь. е5си1еп1;ит).

Глава 6. Динамика содержания и жирнокислотного состава липидов хвои и почек сосны, листьев и почек березы в периоды их закаливания к морозу, перезимовки, весенней потери морозоустойчивости, роста и старения

В результате многолетних исследований было показано изменение содержания и ЖКС групп липидов хвои и почек сосны, листьев и почек березы при произрастании растений в естественных условиях, в периоды осенне-зимнего закаливания растений к морозу, перезимовки, весенней потери морозоустойчивости,роста и старения.

В период осеннего закаливания растений к морозу в хвое сосны растет содержание и СНЖК ФЛ, а в почках сосны и березы только СНЖК ФЛ. Концентрация Г Л и НЛ в хвое летом — в первой половине осени увеличивается, во второй — ГЛ колеблется, НЛ снижается. СНЖК ГЛ и НЛ хвои, ГЛ почек сосны и березы в этот период уменьшается из-за деструкции линолено-вой кислоты (а в НЛ хвои и октадекатетраеновой) и увеличения содержания пальмитиновой (ГЛ хвои) или линолевой и октаде-кадиеновой (ГЛ почек сосны) и линолевой (ГЛ почек березы). ЖКС НЛ почек березы и сосны существенно не изменяется в течение осени—зимы—весны.

Зимой содержание и СНЖК ФЛ хвои, почек сосны и березы существенно не изменяются, а СНЖК ГЛ и НЛ хвои, ГЛ почек обоих видов и концентрация НЛ хвои и почек сосны, почек березы продолжают снижаться. Весной в период потери у древесных растений морозоустойчивости в хвое сосны резко уменьшается содержание и СНЖК ФЛ, а в почках сосны и березы — СНЖК ФЛ. СНЖК ГЛ и НЛ хвои в этот период растет. Концентрация ГЛ хвои колеблется, а НЛ увеличивается. В почках сосны и березы содержание ГЛ и ФЛ существенно не изменяется.

Во второй половине весны—летом перед ростом побегов сосны и во время их роста в почках интенсивно уменьшается концентрация СЛ, НЛ, в то время как ГЛ и ФЛ сначала повышается, а затем снижается. При этом изменение СНЖК НЛ, ГЛ и ФЛ коррелирует с колебаниями факторов среды, а не с ростом побегов. Для одно- и двулетней хвои свободнорастущих деревьев с интенсивным среднегодичным приростом побегов и деревьев верхнего яруса с умеренным приростом характерно более высокое соотношение ГЛ/ФЛ, чем для деревьев нижнего яруса со

слабым приростом побегов. СНЖК ГЛ растущих побегов, наоборот, с ухудшением условий роста деревьев увеличивается. В рас-, тущих побегах по мере расхода НЛ увеличивается концентрация ГЛ, что косвенно свидетельствует о возрастании числа мембран хлоропластов. При одревеснении побегов содержание ГЛ резко снижается, а НЛ увеличивается. В растущей хвое концентрация НЛ существенно не изменяется до тех пор, пока интенсивно растут побеги. При замедлении их роста содержание НЛ в хвое увеличивается пропорционально времени наблюдения. Количество ГЛ непрерывно повышается независимо от роста побегов. В двулетней хвое содержание НЛ растет, если имеется достаточное количество НЛ в растущих побегах, но при приближении их содержания в побегах к минимуму, уменьшается и концентрация НЛ в хвое.

Содержание ФЛ снижается в почках, побегах и однолетней хвое в период их роста и в двухлетней хвое во время весенне-летней перестройки ее внутриклеточной организации.

При развитии листьев березы содержание СЛ, НЛ, ГЛ и ФЛ уменьшается (содержание ГЛ в растущих листьях после снижения повышается), особенно интенсивно в период их роста и старения, стабилизируясь в середине вегетационного периода. Для стареющих листьев березы (конец лета—осень) характерно снижение концентрации линоленовой кислоты и увеличение пальмитиновой в СЛ, ГЛ и ФЛ. Среди НЛ, ГЛ и ФЛ реакцию на пониженные температуры в этот период проявляют лишь НЛ, так как в них повышается СНЖК из-за снижения содержания пальмитиновой кислоты и увеличения линоленовой. СНЖК НЛ хвои снижается осенью—зимой и увеличивается весной, в то время как СНЖК НЛ почек сосны и почек березы существенно не изменяется в течение осени—зимы—весны.

Нами решен один из спорных вопросов адаптации древесных растений к пониженным температурам — способности их клеток повышать ненасыщепность глицеролипидов при закаливании древесных растений к морозу осенью — в начале зимы и снижать ее с потерей морозоустойчивости весной (рис. 3): Такой характер изменений обнаружен не у всех глицеролипидов, а только у одной группы (ФЛ хвои и почек сосны, почек березы). К этой же группе относятся НЛ листьев березы, так как СНЖК их снижается в конце весны — середине лета с повышением температуры и растет с ее понижением, во второй половине лета — осенью. Наоборот, СНЖК ГЛ и почек сосны, почек березы уменьшается осенью—зимой и увеличивается весной, коррелируя с освещенностью, а не с температурой. К этой же группе липидов относятся ФЛ листьев березы и хвои второго года жизни. СНЖК ФЛ этих органов растет в конце весны — середине; лета с повышением тем-

пературы. Наконец, ненасыщенность ЖК НЛ почек березы и, в меньшей степени, почек сосны существенно не изменяется в течение осени — зимы — весны, несмотря на изменение факторов окружающей среды.

Глава 7. Обсуждение результатов

Выдвинутая нами концепция об интенсивном из-' менении состава липидов листьев при перестройке ультраструктуры клеток в периоды адаптации растений к различной освещенности и пониженной температуре подтверждается на основании сопоставления полученных нами данных по изменению состава глицеро-липидов с ультраструктурными изменениями в листьях в разные периоды развития травянистых и древесных растений, что особенно наглядно продемонстрировано на примере однолетней хвои сосны (рис. 4).

В период зеленения и роста листьев, хвои, рост-

Рмс. 3. Различие в характере сезонных изменений жирнокислот-ного состава глико-, фосфоли-пидов и нейтральных липидов почек сосны и связь этих изменений с факторами среды 1980-1981 гг. (х —х), 1981-1982 гг. (•— •). Температуры максимальные (макс.) и минимальные (мин.) за 1980-1981 гг.

ков, когда из пропластид или этиопластов развиваются хлоропласты (James, Nichosl, 1966; Те-vini, 1977 и другие) и появляется центральная вакуоль (Полякова, Прес-нухина, 1977; Гамалей, 1980), а ЭР и аппарат Гольджи частично деградируют, резко увеличивается содержание ли-пидов хлоропластов — МГДГ, ДГДГ, Сл, ФГ и снижается концентрация внехлоропластных липидов —ФХ, ФЭ и ФИ.

При этом СНЖК повышается как в хлоро-пластных липидах (главным образом, за счет увеличения относительного содержания линолено-вой, Д7'10' 13 - гексадекат-риеновой и Д3-транс-гек-садеценовой и снижения линолевой, олеиновой и пальмитиновой), так и во внехлоропластных ФЛ (из-за увеличения концентрации линоленовой

Рис. 4. Сезонные изменения ультраструктуры клеток и состава суммарных, нейтральных липидов, глико- и фосфо-липидов в однолетней хвое сосны

Сопоставлены сезонные изменения состава липидов (Родионов и др., 1983; Родионов, Ильинова, 1987) с ультраструктурой клеток мезофилла (Новицкая, 1974; Новицкая и др., 1985; Полякова, Пресну-хина, 1977; Martin, Oquist, 1979; Soikkilo, 1980)

ÍH

г* 5Э-

ч р

to 4;

-VV

Y ^VV-w^ Ал jf /V v

_1_I_1_1_L.

2.0 1.8

s 16 ^

1.4

1Ш

<уидст/

« * *_

■2.5

¿O §

1.5

VI VU

чх x xi xii i a m iv v vi

Месяцы

кислоты и снижения лннолевой). Исключением является однолетняя хвоя сосны, СНЖК ФЛ которой в процессе зеленения в естественных условиях снижается.

Возрастание СНЖК ФЛ зеленеющих и растущих листьев березы, картофеля и зеленой хвои второго года жизни обусловлено тем, что определяющим фактором в изменении ЖКС ФЛ является в этот период свет, в то время как у хвои первого года жизни, имеющей, вероятно, слаборазвитую фитохромную систему, температура. Зависимость изменений СНЖК ФЛ зеленеющих листьев березы, произрастающей в естественных условиях, от света подтверждается тем, что в ФХ, ФЭ, ФГ и ФИ их увеличивается содержание линоленовой кислоты и снижается линолевой, как это наблюдается в аналогичных ФЛ листьев и ростков картофеля в контролируемых условиях.

Следовательно, для сформировавшихся на свету листьев березы, картофеля и хвои сосны второго года жизни необходимы липиды с более высоким содержанием триеновых кислот не только для мембран хлоропластов, но и внехлоропластных мембран, в то время как для хвои первого года жизни высокое содержание триеновых кислот необходимо только для мембран хлоропластов.

Ценность нашей работы состоит в том, что впервые показана кинетика изменения ЖКС липидов у зеленеющих Ci6:3 -растений.

На свету липиды листьев картофеля синтезируются из простых молекул, таких как ацетат и ортофосфат, и для синтеза ЖК из ацетата в хлоропластах на свету необходимы АТФ или АДФ. Одной из начальных реакций синтеза ЖК в хлоропластах на свету из ацетата является образование ацетил-Ко А, которое катализируется ацетил-Ко А-синтетазой. Этот фермент был впервые выделен нами из изолированных хлоропластов листьев шпината и частично очищен. Показана необходимость присутствия АТФ, Ко A, Mg2+, TSH для его максимальной активности. Впервые установленное нами (Родионов, Захарова, 1970) присутствие ацетил-Ко А-синтетазы в хлоропластах было позднее подтверждено несколькими авторами (Kannagara et al., 1973; Roughan, Slack, 1977; Хананашвили, Санадзе, 1980; Liedvogel, 1986 и др.). Фермент сосредоточен в строме хлоропластов и играет важную роль не только в синтезе жирных кислот (Stumpf, 1984)', но и терпенов (Goodwin, 1977), пренолов (Hemming, 1977), органических кислот (Mudd, McManus, 1962) и изопрена (Хананашвили, Санадзе, 1980).

При переходе от гетеротрофного питания к автотрофному увеличивается соотношение ГЛ/ФЛ (Tremolieres, Lepage, 1971; Родионов, Захарова, 1980). Следовательно, более низкое содержание ГЛ и высокое ФЛ в одно- и двулетней хвое адаптированных к пониженной освещенности деревьев сосны нижнего яруса по сравнению с аналогичной хвоей неадаптированных к этому фак-

тору деревьев верхнего яруса и сйободио-растущих (что отмечается в наших экспериментах), указывает на мезотрофный способ питания.

Создание условий освещения, выходящих за рамки адаптационных возможностей растений, например длительное затемнение растений картофеля, приводит к расщеплению ли-пидов хлоропластов, в то время как содержание внехлоро-пластпых ФЛ и структура митохондрий существенно не изменяются.

Установленное нами расщепление глицеролипидов при затемнении (Родионов, 1973; Родионов и др., 1975) было позднее подтверждено в экспериментах с изолированными хлоропластами овса (Dalgarn, Newman, 1979).

Возрастание содержания и СНЖК ФЛ в период осенней адаптации растений сосны к морозу (Родионов и др., 1983; Родионов, Ильинова, 1987) связано с развитием в клетках фосфолипидсо-держащих мембранных систем, включая ЭР, кристы в митохондриях, аппарат Гольджи, и исчезновением центральной вакуоли, с появлением серии мелких вакуолей (Новицкая, 1974; Новицкая и др., 1985; Полякова, Преснухина, 1977; Martin, Oquist, 1979). Сходные ультраструктурные изменения наблюдаются в листьях других видов древесных и зимующих травянистых растений (O'Neil et al., 1981; Pihakaski et al., 1987). В почках сосны и березы нам удалось показать только увеличение СНЖК ФЛ во время адаптации растений к морозу без увеличения концентрации ФЛ. Все же локальное повышение концентрации ФЛ, например в зачаточных микростробилах почек сосны, не исключается, поскольку в них осенью — в начале зимы наблюдаются изменения в фосфолипидсодержащих мембранных системах (Kupila-Ahven-niemi et al., 1984) во многом сходные с изменениями в хвое.

Содержание и СНЖК ФЛ хвои и почек сосны, почек березы зимой существенно не изменяется, что указывает на стабильность фосфолипидсодержащих мембранных систем. Весной с потерей морозоустойчивости древесных растений в их клетках уменьшается СНЖК ФЛ, а в хвое и концентрация ФЛ, что совпадает с появлением центральной вакуоли и частичной деградацией фосфолипидсодержащих мембранных систем.

Уменьшение осенью—зимой содержания линоленовой кислоты в ГЛ (Родионов и др., 1983; Родионов, Ильинова, 1987) и МГДГ (Oquist, 1982) хлорофиллов а и b (Оллыкайнен, 1967) в хвое сосны, а также снижение скорости транспорта электронов от воды к НАДФ в хлоропластах (Martin et al., 1979; Oquist, 1982) обусловлено деструкцией мембран хлоропластов (Martin, Oquist, 1979), которая имеет место в хвое ели и листьях диапензии (Senser et al., 1975; Pihakaski, 1987).

Не исключено, что одной из причин разрушения линоленовой

кислоты в ГЛ хвои и почек сосны, почек березы является образование сипглетного и супероксидиого радикала, как это имеет место в хвое сосны корейской (Jin et al., 1987). Кислород вызывает образование перекисей линоленовой кислоты (Мерзляк, По-госян, 1985), которые активируют хлорофилоксидазу (Lüthy, 1986), приводя к обесцвечиванию хвои (Ходасевич и др., 1973). Увеличение весной концентрации линоленовой кислоты в ГЛ направлено на восстановление разрушенных мембран хлоро-пластов.

Наши данные не подтверждают результаты других авторов о стабильности или слабом изменении ЖКС ФЛ при закаливании древесных растений к морозу (Yoshida, Sakai, 1973; Simino-vitch et al., 1975; Singh et al., 1975; Hallowarth et al., 1979; Simi-novitoh, 1981; Hellergren et al., 1984) или увеличении СЛК и СНЖК ГЛ хвои (De Yoe, Brown, 1979; Senser, Beck, 1982). Возможной причиной противоречий является несоответствие искусственных условий закаливания растений к морозу естественным и различия в климате.

В свете полученных нами данных о снижении СНЖК мембранных липидов с понижением сезонной температуры, ранее предложенные гипотезы о зависимости СНЖК липидов исключительно от растворимости кислорода в- воде (Harris, James, 1969; Robeile et al., 1980) или от активности десатураз, регулируемых текучестью мембранных липидов (Thompson, 1979), представляются маловероятными применительно к группе липидов, ЖКС которых коррелирует с освещенностью (ГЛ и НЛ хвои, ГЛ почек сосны и березы, ФЛ зеленеющих листьев березы и картофеля).

В контролируемых условиях пониженные температуры оказывают разное влияние на состав глицеролипидов (Родионов и др. 1973, 1977, 1978) и ультраструктуру клеток (Балагурова и др. 1980) листьев картофеля: закаливающие к заморозкам температуры способствуют увеличению содержания ФХ, ФГ и росту фосфолипидсодержащих мембран: ЭР, крист в митохондриях, ло-мосом, а также мембран хлоропластов (за счет извилистости ти-лакоиодов и наружной мембраны). Заморозок с льдообразованием вызывает расщепление МГДГ, ДГДГ + Сл, ФХ, ФЭ, ФИ и разрушение ультраструктуры клеток — везикуляцию ЭР, деградацию оболочек хлоропластов, рассеивание содержимого клеток по цитоплазме. Заморозок с переохлаждением не оказывает существенного влияния на состав глицеролипидов и ультраструктуру клеток. Расщепление ФЛ и разрушение ультраструктуры клеток наблюдалось нами также при искусственном промораживании зимней и летней хвои сосны (Родионов и др., 1985, 1989), что, по-видимому, связано с разрушением льдом плазмалеммы (Красавцев, 1988) и тонопласта (Ziegler, Kandier, 1980) и высвобождением фосфолипаз.

Установленное нами впервые ß 1972—1973 гг. расщепление глико- и фосфолипидов под действием мороза было подтверждено позднее в отношении ФЛ в ряде зарубежных и отечественных лабораторий на различных объектах (Yoshida, Sakai, 1974; Yoshida, 1978, 1979; Wilson, Rinne, 1976; Vigh et al., 1979; I-Jorvath et al., 1979; Sikorska, Kasperska-Pelacz, 1980; Сытник, Мануильский, 1981; Willemot, 1983 и другие).

На основании полученных данных по расщеплению глицероли-пидов при промораживании — оттаивании (идентификация промежуточных продуктов распада), а также литературных сведений по гидролитическим липидным ферментам в листьях (Kates, 1970), предположено функционирование в клетках листьев ферментной системы, расщепляющей глицеролипиды. Она включает галактолипазу, расщепляющую МГДГ и ДГДГ, фосфолипазу D, фосфатазу фосфатидной кислоты и деацилирующий фермент (основной путь расщепления ФЛ) и фосфолипазы Ai и Аг (дополнительный путь расщепления ФЛ). Льдообразование и последующее оттаивание приводит к разрушению внутриклеточных мембран; нарушению компартментализации, расщеплению не только глицеролипидов, но и нуклеиновых кислот, инактивации ферментов и гибели листьев (рис. 5А, 5Б).

Расщепление глицеролипидов наблюдается не только при воздействии мороза, но и низких положительных температур на теплолюбивые растения. Нами (Родионов, 1971) установлено и подтверждено другими исследователями (Martin et. al., 1981) снижение интенсивности дневной ассимиляции углекислоты листьями томата обыкновенного и, в меньшей степени, томата волосистого в результате воздействия пониженных положительных температур. Главная причина установленного факта является ингибиро-вание холодом реакции Хилла в хлоропластах свободными жирными кислотами (Smille, Not, 1979; Michalski, Kaniuga, 1980), которые образуются в результате расщепления МГДГ, ДГДГ, ФХ, ФЭ, ФГ и ФИ (Wright, Simon, 1973; Michalski, Kaniuga, 1980). Расщеплению глицеролипидов сопутствует появление мелких вакуолей и разрушение хлоропластов и других клеточных органелл листьев (Ilker et. al., 1979).

Ценность развиваемого нами направления об изменении состава липидов листьев и сопутствующей перестройке ультраструктуры под воздействием факторов среды состоит в том, что оно позволяет понять характер сезонных изменений НЛ, ГЛ и ФЛ у древесных растений. Так, НЛ, которые входят преимущественно в состав сферосом (Parker, Murphy, 1981) и среди которых преобладают триацилглицероли (Pihakaski et al., 1987), накапливаются летом — в первой половине осени и мобилизуются во второй половине осени — зимой и, главным образом, весной — летом следующего года в период роста побегов и листьев (Родионов,

Моногалактозиаанацилглнцернн гдпл^толипа*а , МОНОГАЛАК Т 03 ИЛ ГЛИЦЕРИН + СЖК

Летальное повреждение морозом

не 5 Расщепление галакто- (А), фосфолипидов (Б) и последовательность »пушения мембранных систем (В) при летальном промораживании листьев ■ 1 — фосфолипаза О, 2 — деацилирующий фермент, 2а —фосфатаза фосфатнд-ш кислоты 3 — глицеро-3-фосфатаза, 4 и 5 соответственно фосфолипаза А, А, 6 - глицерофосфорилфосфатаза. Пунктирными линиями обозначены пред" полагаемые реакции

Ильииова, 1987, 1988), Родионов и др., 1983, 1986, 1987, 1988). В январской хвое сосны (Родионов и др., 1985) и листьях диапен-зии (Pihakaski el at., 1987) сферосомы примыкают соответственно плотным и рыхлым слоем к плазмалемме, что косвенно указывает на использование триацилглицеролей как высокоэпергетиче-ских соединений в поддержании функциональной активности плазмалеммы. Восстановление же расходованных количеств НЛ в хвое сосны наблюдается в апреле—июне (Родионов, Ильииова,

1987), когда она интенсивно поглощает углекислоту (Болопдин-ский, Великайнен, 1987).

О мобилизации НЛ почек сосны и березы и их использовании как высокоэнергетических соединений в ростовых процессах свидетельствует резкое снижение концентрации НЛ в набухающих и растущих почках (Родионов и др., 1986; Родионов, Ильииова,

1988), сопровождающееся деградацией сферосом и появлением на их месте вакуоли (Ситнянская, Мартин, 1986, 1987). Аналогичное снижение содержания НЛ (Родионов, Ильинова, 1988) и вакуолизация клеток (Dodge, 1970) наблюдается в растущих листьях березы. В период роста побегов соспы содержание НЛ в них снижается, а при приближении концентрации НЛ к минимуму растет содержание ГЛ и уменьшается ФЛ, что свидетельствует об увеличении числа мембран хлоропластов и снижении сети фосфоли-пидсодержащих мембранных систем, т. е. об усилении автотроф-ности побегов. Кроме того, не исключается приток в растущие побеги продуктов деградации НЛ из двулетней хвои, так как концентрация их в хвое уменьшается. По мере замедления роста побегов и их одревеснения содержание в них НЛ увеличивается, ГЛ уменьшается, ФЛ стабилизируется, что может указывать на усиление гетеротрофности побегов.

Содержание и СНЖК ГЛ, входящих в состав мембран хлоропластов (Benson, 1964; Родионов и др., 1974) и представленных МГДГ, ДГДГ и Сл увеличиваются во время зеленения и роста листьев, поддерживаются на высоком уровне в период вегетации растений, заметно снижаются при осеннем старении листопадных (Родионов, Ильинова, 1988) и перезимовке вечнозеленых растений (Oquist, 1982; Родионов и др., 1983, 1986, 1987; Родионов, Ильинова, 1987, 1988) и снова повышаются весной, коррелируя с развитием и деградацией мембран хлоропластов.

Концентрация ФЛ — составных компонентов мембран митохондрий, пероксисом, ЭР, диктиосом, ядер листьев и представленных в этих оргаиеллах ФХ, ФЭ, ФИ и других ФЛ (Родионов и др., 1974; Mazliak, 1977; Yoshida et al., 1986, 1987), как правило, уменьшается при зеленении и росте листьев, их старении у листопадных растений и весенней потере морозоустойчивости вечнозеленых, увеличивается при осенней адаптации растений к морозу, поддерживается на высоком уровне во время перезимовки и на

низком — при вегетации растений, коррелируя с деградацией и развитием перечисленных выше органелл. СНЖК ФЛ изменяется аналогичным образом, за исключением периода зеленения, когда она увеличивается, и периода вегетации, в которой поддерживается высокий уровень СНЖК ФЛ.

Таким образом, в характере сезонных изменений НЛ, ГЛ и ФЛ имеются различия, которые связаны с разной ролью этих классов липидов в клетке и различной их локализацией.

Особое значение в свете выдвинутой нами концепции приобретают исследования на субклеточном уровне, в частности, характеристика липидиого состава органелл и мембранных систем. Нами (Родионов и др., 1974) было обнаружено, что во фракции митохондрий + гран хлоропластов и микросом сосредоточены основные количества ФХ, ФЭ, ФИ и ДФГ, а также доказано присутствие ФХ и ФИ в хлоропластах наряду с МГДГ, ДГДГ, Сл, ФГ. О содержании четырех последних глицеролипидов было известно раньше (Benson, 1964). Как обнаружено позднее (Mazliak, 1977; Parker, Murphy, 1981; Hellergren et al., 1984; Yoshida, Uemura, 1984; Heemskerk, Wintermans, 1987) ФХ, ФЭ и ФИ сосредоточены преимущественно в митохондриях, ЭР, аппарате Гольджи, ядре, а триглицериды, являющиеся главными липидами фракции НЛ (Новицкая, 1978; Pihakaski et al., 1987), в сферосомах. Главной трудностью в процессе выделения органелл является расщепление ФЛ и трансацилирование МГДГ, ДГДГ с образованием арте-фактных липидов. Поэтому дальнейшие исследования на субклеточном уровне по изменению состава их липидов в процессе развития растений и их адаптации к факторам среды весьма желательны, чтобы понять роль липидов в фотосинтезе, фотодыхании, гемновом дыхании, синтезе различных соединений и других процессах.

До сих пор мы обсуждали значение полученных данных по изменению состава липидов листьев в процессе развития растений и их адаптации к факторам среды. Возникает вопрос каков механизм связи между установленным нами (Родионов, Захарова, 1985, 1987) накоплением триеновых кислот в глицеролипидах листьев и клубне-, плодо- и корнеплодообразовапием. Предполагается, что причиной увеличения содержания триеновых кислот з мембранных липидах и более высокой скорости ассимиляции /глекислоты, расхода ассимилятов на отток и дыхание листьев зидов, развивающих запасающие органы на длинном дне (Родионов, 1962, 1963, а, б 1964, 1967,1971) по сравнению с видами не эбразующими их являются синтезируемые в листьях фитогормо-1Ы, ответственные как за развитие клубней, плодов и корнеплодов (Чайлахяи, 1984), так и за фотосинтетическую активность листьев (Мокроносов, 1985) и текучесть мембранных липидов (Ладыжин-жая, Караблев, 1985).

Таким образом, развиваемое нами направление, в которое вносят вклад и другие исследователи, проливает свет на стратегию адаптации растений к условиям среды, одним из звеньев которой является механизм биохимической и ультраструктурной перестройки в листьях растений.

выводы

1. Экспериментально подтверждена концепция, согласно которой в процессе эволюции растений и их адаптации к факторам среды в листьях выработался сложный механизм структурной перестройки, включающей изменения в составе глицеролипидов. Установлено, что наиболее интенсивные изменения состава липи-дов листьев наблюдаются при зеленении и росте растений, их адаптации к морозу, весенней потере морозоустойчивости, когда интенсивно перестраивается ультраструктура клеток. Создание же условий, выходящих за рамки адаптационных возможностей растений (длительное затемнение, мороз с льдообразованием), а также старение листьев приводят к расщеплению мембранных липидов и разрушению ультраструктуры клеток.

2. Установлена последовательность увеличения содержания три- и мононенасыщенных жирных кислот у Сш.-з -растений на свету в различных группах липидов. В процессе зеленения растений после индукционного периода в листьях (ростках) резко возрастает содержание липидов хлоропластов, три- и мононенасыщенных жирных кислот в них, а концентрация внехлоропластных ФЛ, как правило, снижается. Степень ненасыщенности жирных кислот листьев при этом увеличивается. При освещении сформировавшихся зеленых листьев состав липидов изменяется незначительно. На свету липиды листьев синтезируются из простых молекул таких как ацетат, ортофосфат. Одной из начальных реакций биосинтеза жирных кислот из ацетата в хлоропластах на свету является образование ацетил-Ко А, которое катализируется ацетил-Ко А-синтетазой. Фермент был впервые обнаружен нами в хлоропластах, выделен и частично очищен. Установлено расщепление липидов хлоропластов и сопутствующая ему деградация гран и ламелл хлоропластов, при затемнении, в то время как внехлоропластные ФЛ и структура митохондрий существенно не изменяются. При затемнении растений в листьях снижается содержание хлоропластных липидов — ГЛ и увеличивается внехлоропластных ФЛ, что указывает на мезотрофный способ питания, а в ГЛ почек растет СНЖК.

3. Пониженные температуры оказывают разное влияние на состав липидов листьев: закаливающие способствуют увеличению содержания ФЛ, заморозок с переохлаждением не вызывает су-

щественнЫх изменений в составе глицеролипидов, а заморозок с льдообразованием приводит к их расщеплению с образованием СЖК и ФК, которая ингибирует реакцию Хилла в хлороиластах, и небольших количеств лизофосфолипидов. При летальном промораживании хвои сосны процесс расщепления фосфолипидов сопровождается разрушением ультраструктуры клеток с сохранением лишь клеточной оболочки и сферосом.

4. При естественной осенней адаптации древесных растений к морозу увеличивается содержание и СНЖК ФЛ (хвоя) или только СНЖК (почки сосны и березы) и снижается содержание и СНЖК, ГЛ, НЛ (хвоя), или только СНЖК ГЛ (почки сосны и березы). Зимой поддерживается высокий уровень ненасыщенности жирных кислот ФЛ у всех исследованных органов, а СНЖК ГЛ (у хвои и СНЖК НЛ) продолжает снижаться. Весной, наоборот, СНЖК ГЛ (у хвои и СНЖК НЛ) растет, а СНЖК ФЛ (у хвои и содержание ФЛ) снижается. СНЖК НЛ почек березы и сосны существенно не изменяются в течение осени—зимы—весны, однако СНЖК НЛ листьев березы снижается весной и растет осенью. Сезонные изменения ненасыщенности жирных кислот одних групп липидов коррелируют с колебаниями освещенности, другой — температуры, ЖКС третьей остается стабильной в течение осени — зимы — весны, несмотря на изменение факторов среды.

5. Нейтральные липиды обычно накапливаются летом — в первой половине осени, расходуются частично во второй половине осени — зимой и главным образом весной — летом следующего года во время набухания почек, роста побегов и листьев. Установлена корреляция между содержанием НЛ и ГЛ в растущих побегах: снижение концентрации НЛ до минимума совпадает с резким ростом содержания ГЛ, что может указывать на развитие мембран хлорапластов и усиление фотосинтеза. Наоборот, при затухании роста и побурении побегов концентрация НЛ растет, а ГЛ снижается. В январской хвое сосны обнаружено примыкание плотного слоя сферосом, в которых у растений сосредоточены преимущественно НЛ, к плазмалемме.

6. В стареющих осенних листьях березы снижается концентрация НЛ, ГЛ, ФЛ и СНЖК ГЛ и ФЛ, в то время как СНЖК НЛ растет.

7. Развитие запасающих органов у видов картофеля, томатов и свеклы на длинном дне способствует увеличению СНЖК различных глицеролипидов листьев, а также скорости потенциальной интенсивности фотосинтеза, расхода ассимилятов на отток и дыхание.

8. На основании проведенных исследований по внутриклеточному распределению глицеролипидов листьев шпината и картофеля обнаружено, что хлоропласты помимо МГДГ, ДГДГ, Сл

и ФГ содержат ФХ и ФИ, а фракция митохондрий + гран хлоро-пластов, микросом — ФХ, ФЭ и ФИ. Гомогенизация листьев с целью выделения органелл приводит к трансацилированию га-лактолипидов с образованием АМГДГ, АДГДГ и к расщеплению фосфолипидов, которое наблюдается даже при 0° С.

9. Разработаны новые методы: а) идентификации и количественного определения МГДГ, ДГДГ, Сл, АМГДГ, АДГДГ листьев или их гомогенатов с помощью ХТСС (Авторское свидетельство № 340 937); б) определения Ы4-ацетилсульфаниламида и сульфаниламида в смеси без их разделения в чистых растворах и биологических жидкостях с изолированными хлоропластами (Авторское свидетельство № 233 385); в) оценки убыли концентрации глице-ролипидов листьев при воздействии на растения низких температур, затемнения и механического разрушения листьев. Кроме того, модифицированы уже известные методы анализа глицерола-пидов и ацетил-Ко А-синтетазы: выделение хроматографически чистых глицеролипидов из листьев с помощью двукратной ХТСС, определение фосфолипидов листьев с помощью двумерной ХТСС, хроматографии липидов на колонках ДЭАЭ-целлюлозы и силика-геля, идентификация на хроматограммах деацилированных производных фосфолипидов, радиометрическое определение ацетил-Ко -А-синтетазы и другие.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предлагается использовать:

1. В селекционной работе при отборе холодо- и морозоустойчивых сортов и форм растений метод оценки повреждения мембран листьев по снижению содержания глицеролипидов.

2. В научно-исследовательской работе при физиологических и биохимических исследованиях глицеролипидов и ацетил-Ко А-синтетазы следующие методы: а) идентификации гликолипидов на пластинках с ТСС; б) идентификации ДАПФ на бумажных хроматограммах; в) ускоренного выделения глико- и фосфолипидов с помощью одномерной и двумерной хроматографии в ТСС при ГХ и ЖКС; г) определения ФЛ с помощью двумерной хроматографии в ТСС; д) хроматографии липидов на колонках ДЭАЭ-целлюлозы и силикагеля; е) спектрофотометрического и изотопного анализа ацетил-Ко А-синтетазы.

Результаты исследований могут найти применение в научно-исследовательских учреждениях, занимающихся изучением развития растений и их адаптации к факторам среды: Институте физиологии растений АН СССР, Институте фотосинтеза и агрохимии А.Н СССР, Главном ботаническом саду АН СССР, Институте физиологии растений и генетики АН УССР, Институте биологии

Казанского филиала АН СССР, Казанском и Тбилисском государственных университетах. Их можно использовать при чтении курса лекций по физиологии и биохимии растений на биологических факультетах Московского, Ленинградского, Киевского и других вузов.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Родионов В. С. Интенсивность фотосинтеза и дыхания у некоторых видов юда Beta Ь.//Ботанический ж., 1962. Т. 47. Вып. 9. С. 1283—1291.

2. Родионов В. С. Сравнительная интенсивность фотосинтеза и дыхання г различных видов и сортов томатов//Физиологня растений. 1963 а. Т. 10. Вып. 6. 1 644—651.

3. Родионов В. С. Влияние длины дня на интенсивность фотосинтеза и ды-гания у листьев некоторых видов (сортов) томатов в послерассадный перн-)д//Сборник трудов аспирантов и молодых научных сотрудников. 1963 6. Зып. 3 (7). С. 188—195.

4. Родионов В. С. О соотношении вегетационных и видовых (сортовых) [зменений в интенсивности фотосинтеза у некоторых представителей рода Beta L.//Сборник трудов аспирантов и молодых научных сотрудников. Л., 1964. Зыл. 4. С. 39—49.

5. Родионов В. С. Интенсивность суммарного расхода ассимилятов —С14 на шхание и отток из листьев разных видов сортов свеклы и томатов//Физиология ¡астений. 1967. Т. 14. Вып. 3. С. 544—545.

6. Царегородцева С. О., Родионов В. С. О расщеплении АТФ в системе для жосинтеза жирных кислот в изолированных хлоропластах//Научные доклады ¡ысшей школы. Биол. науки. 1968. № 6. С. 87—89.

7. Родионов В. С. Биосинтез высших жирных кислот в изолированных хло-юпластах//Успехи современной биологии, 1968. Т. 66. Вып. 2 (5). С. 156—172.

8. Родионов В. С. Особенности выделения хлоропластов при иссле-тванни липидов//Методы выделения хлоропластов. 1977. Пущино-на-Оке.

126—134.

9. Родионов В. С. Итоги работы лаборатории биохимии липидов за !0 лет//Развитие науки в Карелии за 50 лет Советской власти. Ученые записки Петрозаводского государственного университета им. О. В. Куусинена. 1970. Г. 16. Вып. 4. С. 151—155.

10. Родионов В. С., Захарова Л. С. Исследование внутриклеточного рас-феделения ацетил-Ко А-синтетазы в листьях шпината Spinacia о1егасеае//Бно-{имия. 1970. Т. 35. Вып. 2. С. 319—328.

11. Родионов В. С., Лнзенко Е. И., Царегородцева С. О. Исследование аце-гилирования сульфаниламида в изолированных хлоропластах спектрофотометри-lecKiiM и хроматографическим методами//Бнохимия. 1970. Т. 35. Вып. 5. I 886—894.

12. Родионов В. С. Последствие пониженной положительной температуры на готенциальную интенсивность фотосинтеза некоторых видов Lycopersicon Tourn f Beta Ь.//Ботанический ж., 1971. T. 56. Вып. 7. С. 1019—1024.

13. Родионов В. С. Потенциальная интенсивность фотосинтеза листьев некоторых видов томатов и свеклы при различной влажности почвы//Физиология I биохимия культурных растений. 1972. Т. 4. Вып. 6. С. 641—643.

14. Дроздов С. Н., Сычева 3. Ф., Родионов В. С. Влияние пониженных по-южительных температур и заморозков на физиологические процессы в листьях iKTHBHO вегетирующих растений//Почвьг и растительность мерзлотных районов :ССР. 1973. Магадан. С. 256—259.

15. Родионов В. С. Изменение концентрации галакто- ц фосфолипидов

в листьях картофеля в зависимости от освещенности//Физиология растении. 1973. Т. 20. Вып. 4. С. 753—756.

16. Родионов В. С., Нюппиева К. А., Захарова Л. С. Изменение концентрации галакто- и фосфолипидов в листьях картофеля в результате воздействия пониженной температуры//Физиология растений. 1973. Т. 20. Вып. 3. С. 525—531.

17. Родионов В. С. Определение липндного фосфора в листьях расте-ний//Методы комплексного изучения фотосинтеза. 1973. Л.. С. 268—274.

18. Родионов В. С., Нюппиева К. А,, Захарова Л. С. Новый метод идентификации и количественного определения галактолипидов,//Методы комплексного изучения фотосинтеза. 1973. С. 275—279.

19. Родионов В. С., Нюппиева К. А., Захарова Л. С. Внутриклеточное распределение галакто- и фосфолипидов в листьях шпината и картофеля//Био-химия. 1974. Т. 39. Вып. 1. С. 215—224.

20. Родионов В. С., Холопцева Н. П. Определение фосфолипидов листьев растений с помощью двумерной хроматографии т? тонком слое силикагеля//Фи-зиология и биохимия культурных растении. 1974. Т. 6. Вып. 2. С. 201—204.

21. Родионов В. С. Микрометод для идентификации продуктов деаиилпро-вания фосфолипидов листьев растений на хроматограммах//Физиология и биохимия культурных растений. 1975. Т. 7. Вып. 6. С. 646—651.

22. Родионов В. С.. Козубов Г. М„ Тнхова М. А. Сулимова Г. М. Изменение концентрации глииеролипидов, ультпаструктуры хлороплас.тов и митохондрий в листьях картофеля при затемнении//Физиология растений. 1975. Т. 22. Вып. 2. С. 333—337.

23. Родионов В. С. Оценка интенсивности эндогенного расщепления глице-волипидов в листьях растений//Фпзиология растений 1976. Т. 23. Вып. 9. С. 554—557.

24. Родионов В. С.. Нюппиева К. А., Холопцева Н. П., Маркова Л. В., Дооздов С. Н. Расщепление фосфолипидов в листьях некоторых видов картофеля в зависимости от интенсивности заморозков//Физиология растении. 1977. Т. 24. Вып. 4. С. 845—853.

25. Родионов В. С. Влияние гомогенизации на расщепление экзогенных Р32-фосфолипидов листьев картофеля//Физиология растений. 1978. Т. 25. Вып. 6. С. 1295—1301.

26. Родионов В. С. Влияние низких температур на липндный обмен в растениях и фазовые переходы в мембранах//Эколого-физиологические механизмы устойчивости растений к действию экстремальных температур. 1978. Петрозаводск: Карельский филиал АН СССР. С. 37—51.

27. Родионов В. С. Об участии ортофосфата и ацетата в биосинтезе фосфолипидов листьев картофеля//Физиология растений. 1978. Т. 25. Вып. 4. С. 773—777.

28. Родионов В. С., Захарова Л. С. Определение состава жирных кислот мембранных липидов листьев разных по морозоустойчивости видов каптофе-ля//Эколого-ф|13иолоп1чсские механизмы устойчивости растений к действию экстремальных температур. 1978. Петрозаводск: Карельский филиал АН СССР. С. 51—56.

29. Родионов В. С., Захарова Л. С. О скорости эндогенного расщепления фосфолипидов в листьях картофеля в результате воздействия заморозков//Фи-зиология растений. 1978. Т. 25. Вып. 1. С. 175—178.

30. Родионов В. С. Методы хроматографии и количественного анализа галакто- и фосфолипидов листьев растений//Известпя АН СССР, сер. биол. 1979. № 2. С. 238—249.

31. Родионов В. С., Захарова Л. С. Исследования состава жирных кислот глицеролнпидов листьев картофеля//Биохимия. 1979. Т. 44. Вып. 9. С. 1706—1714.

32. Родионов В. С., Захарова Л. С. Динамика расщепления мембранных фосфолипидов в гомогенатах листьев картофсля//Фнзнология растений. 1980. Т. .27. Вып. 2. С. 380—389.

33. Родионов В. С„ Захарова Л. С. Динамика содержания галакто- и фос-

фолипидов и их жирных кислот при зеленении ростков картофеля//Физиология растений. 1980. Т. 27. Вып. 5. С. 1072—1081.

34. Родионов В. С., Захарова Л. С., Нюппиева К. А. Изменение концентрации фосфолипндов в листьях разных по устойчивости к заморозкам видов картофеля в течение вегетации/уФизиология и биохимия культурных растений. 1981. Т. 13. № 4. С. 411—415.

35. Родионов В. С., Захарова Л. С. Состав жирных кислот липидов листьев разных по холодоустойчивости сортов огурцов//Физиология и биохимия культурных растений. 1982. Т. 14. № 4. С. 327—331.

36. Родионов В. С. Изменения в мембранных липидах растений при пониженных температурах//Липидный обмен древесных растений в условиях Севера. 1983. Петрозаводск: Карельский филиал АН СССР. С. 4—78.

37. Родионов В. С., Захарова Л. С. Жирнокислотный состав суммарных липидов глпко- и фосфолнпидов листьев картофеля в зависимости от устойчивости видов к заморозкам//Известия АН СССР, сер. биол. 1983. № 1. С. 152—156.

38. Родионов В. С., Ильинова М. К., Степанов А. А. Динамика содержания жирных кислот нейтральных липидов, глико- и фосфолипндов однолетней хвои сосны обыкновенной в годичном цикле'.'Липндный обмен древесных растений в условиях Севера. 1983. Петрозаводск: Карельский филиал АН СССР. С. 78—96.

39. Родионов В. С., Ильинова М. К., Шуляковская Т. А., Саукконен Л. А. Динамика содержания нейтральных липидов, глико- и фосфолипндов в однолетней хвое сосны в течение года//Липидный обмен древесных растений в условиях Севера. 1983. Петрозаводск: Карельский филиал АН СССР. С. 69—77.

40. Родионов В. С., Захарова Л. С. Изменение жирнокислотного состава липидов листьев картофеля и томатов в зависимости от способности видов к клубне- и плодообразованию/'/Физиология и биохимия культурных растений. 1985. Т. 17. № 6. С. 581—588.

41. Родионов В. С., Фуксман И. Л., Новицкая Ю. Е., Тихова М. А., Сули-мова Г. М. Расщепление фосфолипндов и изменение ультраструктуры клеток зимней хвои сосны после ее промораживания//Известия АН СССР, сер. биол., 1985. № 6. С. 934—939.

42. Родионов В. С., Ильинова М. К-, Шуляковская Т. А. Годичные ритмы в изменении концентрации и жирнокислотного состава липидов почек сосны//Из-вестия Академии наук СССР, сер. биол. 1986. № 6. С. 898—907.

43. Родионов В. С., Захарова Л. С. Изменение жирнокислотного состава липидов листьев свеклы в зависимости от способности видов к-корнеплодооб-разованию//Физиология и биохимия культурных растений. 1987. Т. 19. № 5. С. 472—478.

44. Родионов В. С., Ильинова М. К., Шуляковская Т. А. Годичные ритмы концентрации и жирнокислотного состава липидов почек березы//Лесоведение. 1987. № 4. С. 57—64.

45. Родионов В. С., Ильинова М. К- Ритмичность сезонных колебании в содержании и жпрпокислотном составе липидов хвои сосны//Экофизиологические исследования древесных растений. Петрозаводск: Карельский филиал АН СССР. 1987. С. 36—50.

46. Ильинова М. К., Родионов В. С. Содержание и жирнокислотный состав индивидуальных фосфолипндов хвои сосны//Экофизио логические исследования древесных растений. Петрозаводск: Карельский филиал АН СССР. 1987. С. 50—56.

47. Родионов В. С., Ильинова М. К. Изменение жирнокислотного состава и содержания нейтральных липидов, глико- и фосфолипндов в процессе развития почек и листьев березы//Научные докл. высшей школы. Биологические науки. 1988. № 2. С. 74—79.

48. Родионов В. С., Новицкая Ю. Е., Полежаева Н. С., Макаревский М. Ф.,

ЙЛьинова М. К. Канючкова Г. К- Изменения в липидах почек, побегов и xboi в связи с ростом сосны//Лесоведение. 1988. № 4. С. 74—81.

49. Родионов В. С., Тихова М. А., Фуксман И. Л. Изменение ультраструктуры и концентрации липидов в летней хвое после ее промораживания//Извес-тия АН СССР. Сер. биолог. 1989. № 2. С. 238—244.

ИЗОБРЕТЕНИЯ И РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ:

50. Родионов В. С., Лизенко Е. И. Способ количественного определения Ы4-ацетилсульфанйламида и сульфаниламида в смеси. Авторское свидетельство за № 331639 Комитета по делам изобретений и открытий Совета Министров СССР//Б. И. 1968. № 36. С. 105.

51. Родионов В. С., Нюппиева К. А., Захарова Л. С. Способ количественного определения моногалактозилдиглицерида, дигалактозилдигдицерида и суль-фолипида в липидно-ппгментной смеси. Авторское свидетельство за Л» 340937 Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР//Б. И, 1972. № 18. С. 155—156.

52. Ильинова М. К., Родионов В. С. Способ разделения нейтральных липидов листьев растений. Институт леса Карельского филиала АН СССР от 03.03.1981 г.

Информация о работе

Родионов, Владимир Степанович
доктора биологических наук
Киев, 1989
ВАК 03.00.12

Автореферат

Похожие работы