Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Изменение параметров генома растительных объектов при совместном воздействии сенсибилизаторов и лазерного излучения
ВАК РФ 06.01.14, Агрофизика
Автореферат диссертации по теме "Изменение параметров генома растительных объектов при совместном воздействии сенсибилизаторов и лазерного излучения"
РГб ОА
4 - Д [] Г ' На правах рукописи
Пащенко Василий Михайлович
Изменение параметров генома растительных объектов при совместном воздействии сенсибилизаторов и лазерного:
излучения
Специальность - 06.01.14 - агрофизика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Рязань, 1998
Работа выполнена в Институте генетики АН РМолдова, Рязанской государственной сельскохозяйственной академии-им. проф. Костычева П.А.
Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор Лискер И. С., доктор биологических наук, профессор Медведев С. С., доктор биологических наук Питнримова М. А.
Ведущее учреждение - Всероссийский НИИ сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии (г. Обнинск).
Защита диссертации состоится " 3 <9 " сгл-ГлЗ^А. 1998 г. в часов на заседании Диссертационного Совета Д 020.21.01 в Агрофизическом научно-исследовательском институте по адресу: 195220, Санкт-Петербург, Гражданский проспект, 14.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Агрофизического научно-исследовательского института.
Автореферат разослан " /У" си? ту-сГе^. 1998 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук
М.В. Архипов
Общая характеристика работы.
Актуальность темы.
Достижения научно-технической революции за последние десятилетия привели к появлению новых высокоэффективных методов селекции. Особое место, традиционно, занимает среди них индуцированный мутагенез, который является продолжением и развитием методов селекции, основанных на выявлении и использовании спонтанных мутаций. К основным, вполне сформировавшимся в виде самостоятельных разделов науки, методам индуцирования мутаций у растений, в настоящее время относятся прежде всего химический мутагенез и радиационный мутагенез, посредством которых было получены множество сортов основных сельскохозяйственных культур, созданы научные и практические предпосылки для повышения эффективности медицины, животноводства, рыбоводства и лесоводства. Между тем, к концу 20 века обострилась проблема создания ценного исходного материала для селекции новых сортов. Выяснилось, что имеющийся в распоряжении селекционеров генофонд той или иной культуры уже не может полностью обеспечить решение поставленных задач, так как интенсивная селекционная практика в значительной степени исчерпала потенциальные возможности большинства сельскохозяйственных культур. Вся совокупность массива современных данных свидетельствует о высоком уровне генетической стабильности сельскохозяйственных растений, что затрудняет получение новых исходных форм для селекции. В сложившейся ситуации существует необходимость в разработке принципиально новых способов и методов изменения наследственности, потому что возможности химического и радиационного мутагенеза, как показывает многолетний опыт и теоретические исследования, все же доста-
точно ограничены. В связи с этим, были проведены исследования, из которых вытекает возможность развития, изучения и широкого применения в практике нового средства индуцированного мутагенеза, а именно, сенсибилизированного фотомутагенеза. Как известно, в начале 60-х годов были созданы оптические квантовые генераторы -лазеры. Спустя весьма непродолжительное время, было выяснено, что лазерное излучечие (ЛИ) обладает мутагенным действием. Это обусловило попытку формирования нового направления экспериментального мутагенеза, а именно лазерного мутагенеза. В литературе описан целый ряд работ по мутагенному воздействию ЛИ на бактерии и одноклеточные организмы, в районе длины волны излучения X ~ 260 нм. Было исследовано воздействие ЛИ различных длин волн, различной интенсивности и дозы на другие биологические объекты и обнаружено множество фотобиологических эффектов. Однако, оказалось, что выявление мутагенного эффекта ЛИ, при воздействии на высшие организмы, связано с большими трудностями или вообще невозможно, главным образом из-за чрезвычайно низкой проникающей способности ЛИ на длине волны X ~ 260 нм, спектр поглощения ДНК на которой, к тому же практически полностью перекрывался спектрами поглощения содержащихся в клетках белков. Возможно, вследствие этих причин, интерес к лазерному излучению, как возможному средству индуцирования генетической изменчивости у высших растений, резко снизился, и число публикаций по использованию ЛИ как мутагенного фактора по отношению к высшим растениям, начиная с (80-90)-х годов, практически отсутствовало. Между тем, как показали исследования, ЛИ в сочетании с хромофорными группировками молекул-сенсибилизаторов в качестве посредника между ЛИ и биологической молекулой, вполне может служить в качестве мощного средства экспериментального мутаге-
неза. Недавно предложенный, этот метод переживает период становления. Уже известен ряд работ и интересных результатов, по его использованию в системах in vitro, для фотомодификации препаратов нуклеиновых кислот. И, несмотря на то, что до настоящего времени не сформировано общепринятой теории, удовлетворительно раскрывающей механизмы передачи энергии с молекулы сенсибилизатора на ДНК, объем проведенных, в системах in vitro, исследований и теоретических разработок, позволяют составить достаточно ясную картину механизмов взаимодействия лазерного излучения с хромофорной группой сенсибилизаторов и передачи световой энергии с возбужденной молекулы сенсибилизатора на ДНК. Вместе с тем, несмотря на очевидную перспективность метода сенсибилизированного фотомутагенеза в системах in vitro, до настоящего времени практически отсутствуют работы по использованию совместного действия сенсибилизаторов и ЛИ в системах in vivo, для индуцирования генетической изменчивости у высших организмов, в частности, у растений. Известны лишь единичные публикации по цитоге-нетической оценке воздействия системы лазер-сенсибилизатор на меристемные клетки, в которых показано достоверное увеличение числа хромосомных аберраций в оетках томата только при совместном воздействии на них сенсибилизаторов и ЛИ. Отсутствие работ, по использованию совместного действия лазеров и сенсибилизаторов в системах in vivo объясняется, по-видимому, новизной метода, его необычностью и отсутствием статистически значимого количества научных экспериментов, рекомендующих метод совместного использования сенсибилизаторов и ЛИ для широкого внедрения в селекционную практику.
Помимо актуальности основной проблемы, поставленной в настоящей работе, полученные результаты могут иметь значение и для
экологических исследований. Актуальность экологического аспекта проблемы связана с тем, что бурное развитие промышленйости в конце 20 века, способствует появлению большого количества новых химических веществ искусственного происхождения и мощных источников электромагнитного излучения. Можно предположить возникновение таких ситуаций, когда химические вещества, считавшиеся до сих пор биологически неактивными, при совместном действии с возросшей по интенсивности УФ-частью солнечного спектра или с оптическими источниками искусственного происхождения, могут создавать неожиданные физиологические и мутагенные эффекты. Причем, опасность представляет не только прямое попадание луча на биологический объект, но, при наличии в воздухе определенных веществ — сенсибилизаторов, могут возникать объемные пространственные области с индуцированными в них долгоживу-щими радикалами, являющимися не менее опасными, чем прямое воздействие луча.
Цель и задачи исследований.
В соответствии с вышеизложенным, была поставлена целевая проблема по комплексной оценке мутагенной активности совместного действия сенсибилизаторов и лазерного излучения на растительные объекты. В процессе разрешения указанной проблемы, она была разбита на следующие логически связанные этапы:
- Поиск, по разработанным методикам, новых эффективных прижизненных сенсибилизаторов, с перспективой их применения в системах in vivo.
- Поиск, по разработанной методике, эффективных прижизненных «тушителей радикалов», с перспективой их применения в системах in vivo.
- Проведение на молекулярном уровне исследований по фрагментации ДНК различными системами лазер-сенсибилизатор в различных режимах воздействия. Определение механизмов передачи световой энергии ЛИ с молекулы-сенсибилизатора на ДНК. Расчет вероятностей образования разрывов ДНК, при использовании различных систем лазер-сенсибилизатор, в различных режимах воздействия.
- Исследование токсичности используемых сенсибилизаторов для растительных объектов. Изучение динамики миграции молекул сенсибилизаторов в растительные ткани и расчет числа молекул-сенсибилизаторов, поглощенных одним прорастающим семенем через разные промежутки времени проращивания.
- Исследование проникающей способности ЛИ для различных длин волн излучения X. Определение реальной интенсивности ЛИ внутри растительных объектов и пыльцевых зерен.
- Проведение цитогенетической оценки мутагенной активности раздельного и совместного воздействия сенсибилизаторов и ЛИ на меристемные митотические клетки. Разработка методики и ее использование для определения числа молекул сенсибилизаторов, вступивших в комплексообразование с геномной ДНК ме-ристемных клеток. Этот этап включал в себя исследование спектра хромосомных аберраций меристемных клеток при воздействии систем лазер-сенсибилизатор.
- Изучение эффектов раздельного и совместного действия сенсибилизаторов и ЛИ на прорастающую пыльцу растений.
- Изучение возможности индуцирования генетических изменений у растений при раздельном и совместном воздействии на них систем лазер-сенсибилизатор.
- Обобщение результатов, полученных на различных этапах исследований, с целью вынесения общей оценки мутагенной эффективности метода совместного воздействия сенсибилизаторов и ЛИ на растительные объекты, как возможного перспективного способа индуцированного мутагенеза. Выработка практических рекомендаций по использованию систем лазер-сенсибилизатор в практике с целью расширения спектра исходных форм растений для селекционных нужд.
Поставленные задачи определяли необходимость:
1. Создания лабораторных установок для облучения ЛИ препаратов ДНК и комплексов ДНК-сенсибилизатор;
2. Создания лабораторных установок для облучения ЛИ корешков, проростков, пыльцы;
3. Разработки методик поиска эффективных прижизненных сенсибилизаторов и «тушителей радикалов»;
4. Разработки методик оценки проникновения молекул сенсибилизаторов в ткани проростков и пыльцевые зерна, и их связывания с геномом;
5. Разработки унифицированных методик оценки эффективности фрагментации ДНК различными системами сенсибилизатор-лазер.
Научная новизна.
Научная новизна работы состоит в том, что:
- Предложена концепция нового способа индуцированного мутагенеза — сенсибилизированный лазерный фотомутагенез.
- Разработана методика выявления новых прижизненных сенсибилизаторов. Посредством нее выявлены новые сенсибилизато-
ры 6-меркаптопурин (6МП) и хлорохин (ХЛ). Причем, 6МП, в комбинации с лазером ЛГИ-21 (X. = 337 нм) по эффективности фрагментации ДНК многократно превосходит ранее известные.
- Предложены механизмы комплексообразования ДНК-6МП и передачи световой энергии ЛИ с молекулы 6МП на ДНК.
- Определены вероятности образования разрывов при воздействии на ДНК различных систем лазер-сенсибилизатор и предложен единый подход к оценке эффективности системы лазер-сенсибилизатор по фрагментации ДНК.
- Определены доминирующие механизмы передачи световой энергии ЛИ с молекулы сенсибилизатора на ДНК.
- Разработана методика и выявлен эффективный прижизненный фотопротектор - аскорбиновая кислота (АСК).
- Проведена цитогенетическая оценка мутагенного эффекта совместного действия сенсибилизаторов и ЛИ на меристемные клетки корешков кукурузы. Обнаружено резкое увеличение числа хромосомных аберраций (ХА) и изменение спектра хромосомных ХА, при совместном воздействии на корешки 6МП и ЛГИ-21 (X = 337 нм).
- Обнаружен эффект ингибирования прорастания пыльцы, выдержанной после воздействия стимулирующих доз ЛИ, перед внесением в питательную смесь.
- Обнаружен эффект нелинейного снижения прорастания пыльцы при ее обработке совместным действием сенсибилизаторов и ЛИ в различные моменты времени после помещения в питательную смесь.
- Предложена методика и по ней произведены расчеты прижизненного попадания и связывания с ДНК генома молекул-сенсибилизаторов в меристемных клетках и пыльцевых зернах.
- Продемонстрировано увеличение числа однонитевых разрывов в геномной ДНК пыльцы, при совместном воздействии на нее 6МП и ЛГИ-21 (Я, = 337 нм).
- Разработаны методики подбора параметров систем сенсибилизатор - ЛИ и обработки проростков и пыльцы растений совместным действием сенсибилизаторов и ЛИ для индуцирования генетической изменчивости.
- Впервые, при обработке совместным действием 6МП и ЛИ (А = 337 нм) проростков кукурузы и льна, получены наследственно измененные в Мг и Мз формы растений.
- Впервые, при опылении пыльцой, обработанной совместным действием сенсибилизаторов и ЛИ, получены наследственно измененные в М2 формы растений кукурузы.
По результатам исследований получено 7 патентов.
Практическая ценность.
- Практическая ценность исследования заключается в разработке и комплексной оценке нового метода индуцирования наследственной изменчивости у растений — сенсибилизированного лазерного фотомутагенеза.
- Выявлен эффективный прижизненный сенсибилизатор 6-меркаптопурин.
- Выявлен эффективный прижизненный «тушитель радикалов» восстановленная форма аскорбиновой кислоты.
- Созданы методики по компонованию эффективных систем лазер-сенсибилизатор, для использования на практике.
- Созданы методики обработки проростков и пыльцы совместным действием сенсибилизаторов и лазерного излучения.
- Предложен метод защиты экзогенного генетического материала от гидролитического расщепления нуклеазами прорастающих пыльцевых зерен.
Научные положения, выносимые на защиту.
1. Предлагаемый способ сенсибилизированного лазерного фотомутагенеза, может служить новым эффективным средством индуцированного мутагенеза для получения наследственно измененных форм растений.
2. 6-меркаптопурин является эффективным прижизненным фотосенсибилизатором при совместном использовании с лазером ЛГИ-21 (А. = 337 нм) для воздействия на растительные объекты.
3. Доминирующим механизмом передачи световой энергии ЛИ с молекулы сенсибилизатора на ДНК, при использовании системы 6МП-ЛГИ-21 (А, = 337 нм), является механизм по радикальному типу.
4. Аскорбиновая кислота является эффективным прижизненным «тушителем радикалов» в растительных объектах при совместном воздействии на них сенсибилизаторов и лазерного излучения с длиной волны излучения X > 300 нм. Применение аскорбиновой кислоты уменьшает число хромосомных аберраций в меристем-ных клетках корешков кукурузы и повышает вероятность функционирования резонансного механизма передачи энергии ЛИ с молекулы сенсибилизатора на ДНК генома.
5. Эффективное комплексообразование сенсибилизаторов с ДНК генома пыльцы зависит от временных параметров и вида растений.
6. Защита экзогенного генетического материала от гидролитического расщепления нуклеазами прорастащей пыльцы может осуще-
ствляться посредством использования прижизненных молекул интеркаляторов акридина оранжевого (АО) и этидия бромистого (EtBr).
7. Предложен способ получения мутаций кукурузы и льна, путем обработки проростков совместным действием сенсибилизаторов и лазерного излучения.
8. Предложен способ получения мутаций кукурузы путем опыления пыльцой, которая предварительно обрабатывается совместным действием сенсибилизаторов и лазерного излучения.
Апробация работы.
Результаты исследований представлены в виде докладов на: Первой Всесоюзной конференции по генетическим основам интродукции и акклиматизации растений, 1991, Новосибирск; Всесоюзной научной конференции «Экологическая генетика растений, животных и человека», 1991, Кишинев; конференции ученых СНГ «Актуальные проблемы физиологии растений и генетики», 1992, Киев; IV съезде генетиков и селекционеров Молдовы, 1992, Кишинев; ученом Совете института генетики АН РМолдовы, 1993, Кишинев; ученом Совете во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н.И. Вавилова, 1993, Санкт-Петербург; международном симпозиуме «Probleme si perspectivele radioecologie in Republica Moldova», 1996, Chisinau; международной конференции «18 Conference on genetics, biotechnology and breeding of maize and sorghum», 1996, Thessaloniki, Greece; ученом Совете института генетики АН РМолдовы, 1997, Кишинев; ученом Совете Рязанской государственной сельскохозяйственной академии им проф. П.А. Косты-чева, 1998, Рязань; расширенном семинаре лаборатории моделирования адаптивных агротехнологий АФИ, 1998, Санкт-Петербург.
Публикация исследований.
По результатам исследований получены 7 патентов, опубликованы 8 журнальных статей и 6 тезисных докладов.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 315 страницах машинописного текста, включает 50 таблиц, 34 рисунка, состоит из введения, 9 глав, заключения, общих выводов и практических рекомендаций. Список используемой литературы включает 278 источников, в том числе 148 иностранных авторов.
Условия, исходный материал и методика исследований.
Основная экспериментальная работа проводилась в группе адресной изменчивости Института генетики АН Республики Молдова (АН РМ) и в Рязанской государственной сельскохозяйственной академии им. Проф. П.А.Костычева в 1989-1997 гг. Часть работ, связанных с облучением препаратов, проводилась в Институте физики АН РМ. Денситограммы электрофореграмм снимались в Центре га-метной и клеточной селекции АН РМ, ЭПР-спектры были получены в Институте химии АН РМ. Полевые опыты закладывались на экспериментальных полях ИГ и в теплицах Ботанического сада АН РМ.
Объектами исследований' служили кукуруза, томат, лен. Линии кукурузы НМУ404, А346, ХЬ18 были получены из лаборатории новой технологии селекции (ИГ, Кишинев). Томат районированных сортов «Нистру», «Факел» получен из коллекции ИГ АН РМ. Лен сорта «Новоторжский» получен из ВНИИ льна (г.Торжок, Россия). •
Применялось стандартное оборудование для биохимических, цитологических и спектрофотометрических исследований, располо-
женное в ИГ АН РМ, институте физики АН РМ и институте химии АН РМ, а также в лабораториях РГСХА им проф. П. А. Костычева.
Выделение ДНК из проростков кукурузы и томата производилось по методу Дж. Дрейпера и Р.Скотта, оптимизированному для выделения ДНК из пыльцы кукурузы. Качество выделенных препаратов ДНК, образование однонитевых и двунитевых разрывов в ДНК регистрировалось методом гель-электрофореза в агарозных гелях в нативных и денатурирующих условиях.
В работе были использованы известные из цитологической практики сенсибилизирующие красители акридин оранжевый (АО) и этидий бромистый (Е1Вг), а также, впервые выявленные в качестве сенсибилизаторов, 6-меркаптопурин (6МП) и хлорохин (ХЛ).
Для облучения использовались лазеры ЛГИ-21 (X = 337 нм, т = 9-10~9с, Рм = 10" Вт/м2), ЛТИПЧ-8 (X = 532 нм, т = 15-10"9с, Рм = Ю10Вт/м2), экспериментальный лазер Института прикладной физики АН РМолдова (Я = 532 нм, т = 30-10-12с, Рм = 2-1013Вт/м2), УФЛ-1 (А. = 632 нм, режим непрерывный, Р = 2-10'2Вт).
При проведении цитогенетической оценки действия сенсибилизирующих агентов и лазерного излучения на меристемные мито-тические клетки использовались известные ана-телофазные методики.
Анализ возникших фенотипических отличий у растений и их наследование проводилось по семьям для поколений Мь М2, Мз. При отсутствии или недоразвитии репродуктивных органов у обработанных растений, принудительное опыление, по возможности, проводилось с контрольных сестринских растений.
Блок-схема экспериментальных исследований.
Отбор сенсибилизаторов по литературным источникам. Поиск новых эффективных прижизненных сенсибилизаторов среди групп веществ имеющих высокое химическое сродство к ДНК, для определенных лазеров с длинами волн излучения 337 нм, 532 нм, 632 нм.
Спектрофотометрические исследования Термодинамические исследования Ингибирование нуклеазной активности
г ^^
Изучение фрагментации ДНК при облучении выявленных комплексов ДНК-сенсибилизатор лазерами с разными X, Рм, Рд, т, 1, г. ч- Выявление эффективных фотопротекторов для систем in vitro и in vivo.
Выявление эффективных пар лазер-сенсибилизатор для систем in vitro. Составление таблиц вероятностей С0| и сог индуцирования однонитевых и двунитевых разрывов ДНК для различных систем и условий воздействия
Выводы и рекомендации.
Содержание работы.
Исследования фотомодификации нуклеиновых кислот, индуцированной сенсибилизаторами и лазерным излучением.
Поиск эффективного прижизненного сенсибилизатора проводился по оригинальной разработанной методике среди большой группы веществ, использование которых предполагает избирательное связывание с ДНК генома. Было проанализировано более 150 препаратов, используемых в биохимии, в цитологической и гистологической практике и при лечении онкологических заболеваний. Сенсибилизаторы подбирались под длины волн излучения лазеров X = 337 нм и Я = 532 нм. В работе были использованы известные из цитологии сенсибилизирующие красители акридин оранжевый (АО) и этидий бромистый (EtBr), а также впервые выявленные в качестве сенсибилизаторов 6-меркаптопурин (6МП) и хлорохин (XJI).
Эффективность сенсибилизаторов оценивалась по количеству однонитевых и двунитевых разрывов (ОНР и ДНР) ДНК, при облучении комплексов ДНК-сенсибилизатор лазерным излучением (ЛИ). Молярное отношение г (сенсибилизатор-нуклеотид) менялось в экспериментах от 1:90 до 1:1. При этом выяснилось, что зависимость степени фрагментации ДНК от величины г имеет характер, близкий к линейному. Выявлено, что нахождение ДНК в комплексе с сенсибилизаторами 6МП, ХЛ, EtBr, АО, в течение длительного времени (t = 6 часов), не приводит к фрагментации ДНК. Установлено, что для всех используемых сенсибилизаторов степень фрагментации ДНК при воздействии на комплексы ДНК-сенсибилизатор лазера ЛГИ-21 (к = 337 нм) не зависит от плотности мощности ЛИ в интервале от 107Вт/м2 до 10иВт/м2, при постоянной плотности дозы излучения Рд
= 1,6-105Дж/м2. Для изучения доминирующих механизмов передачи световой энергии с молекулы сенсибилизатора на ДНК проводились исследования с использованием эффективного «тушителя радикалов» - 2-меркаптоэтанола (2МЭ). Определены численные значения количества ОНР и ДНР ДНК, при облучении комплексов ДНК-сенсибилизатор ЛИ, с предварительным добавлением к облучаемым комплексам 2МЭ в конечных концентрациях 10"3М, 10'2М, 10"'М, 0,5М, 1М. Установлено, что добавление к облучаемым комплексам 2МЭ в возрастающих концентрациях, приводит к уменьшению числа разрывов ДНК, однако, начиная с концентраций (0,1 - 0,5)М, дальнейшее снижение числа разрывов ДНК прекращается (Рис. 1). Определено, что при плотности мощности Рм ЛИ в интервале от 107 Вт/м2 до 1011 Вт/м2, остаточное число разрывов ДНК составляет для 6МП - 12,7%, для ХЛ - 15,5%, для EtBr - 14,3%, для АО - 19,8% от контрольных значений.
Определено, что отношение числа ОНР ДНК к числу ДНР ДНК, возникающих в молекулах ДНК, при воздействии на комплексы ДНК-сенсибилизатор ЛИ (к = 337 нм, X = 532 нм) с Рм из интервала от 107 Вт/м2 до 1011 Вт/м2, для сенсибилизаторов 6МП, ХЛ, EtBr, АО находится в пределах от 12 до 14, что соответствует расчетному отношению числа ОНР и ДНР ДНК, при условии возникновения ДНР ДНК как следствие двух близкорасположенных ОНР ДНК. Для ЛИ (к = 532 нм) с Рм = 2-1013 Вт/м2, при воздействии на комплекс ДНК-АО, отношение числа ОНР к ДНР ДНК составляет 11-12, что указывает на появление одноударного механизма индуцирования ДНР ДНК при такой плотности мощности ЛИ. Установление условий функционирования одноударного механизма образования ДНР ДНК в системах in vitro может иметь особое значение при перенесении воздействий на системы in vivo.
Рис 1. Зависимость числа ОНР в ДНК N при облучении комплексов ДНК-сенсибилизатор ЛИ (X = 337 нм) в присутствии различных концентраций 2-МЭ. Обозначения: ДНК+ЛИ,
------ ДНК-ХЛ+ЛИ, ----- ДНК-АО+ЛИ,
....................... ДНК-ЕШг, - ДНК-6МП+ЛИ.
Установлено, методом ЭПР спектроскопии, отсутствие радикалов в растворах ДНК-сенсибилизатор, выдержанных в течение времени 1=6 часов при 25°С. Зафиксировано появление радикалов в растворах комплексов ДНК-сенсибилизатор, при воздействии на растворы ЛИ (А, = 337нм, X = 532нм) в интервале Рм от 107 Вт/м2 до 10п Вт/м2, а также при воздействии ЛИ (к = 532 нм) с Рм = 2-Ю13 Вт/м2, при плотности дозы излучения, во всех случаях, равной Рд = 1,6-105 Дж/м2. Выяснено, что время жизни радикалов т для всех случаев не превышало 10 минут при температуре 25°С.
Установлено, что при воздействии ЛИ (Я. = 337 нм) с плотностью мощности Рм = 107 Вт/м2 и с плотностью дозы Рд = 1,6-105 Дж/м2, на растворы сенсибилизаторов, наблюдается деградация молекул 6МП - в 12 раз, ХЛ - в 1,4 раза, Е1Вг - в 1,7 раза, АО - в 1,6 раз.
Вышеприведенные исследования свидетельствуют о наличии, как минимум, двух механизмов передачи энергии ЛИ с молекулы сенсибилизатора на ДНК. При плотности мощности ЛИ Рм < 10м Вт/м2, доминирует механизм передачи световой энергии по радикальному типу, связанный с ионизацией молекулы сенсибилизатора и последующего гидролитического расщепления ФЭС ДНК. При плотности мощности ЛИ Рм > 1013 Вт/м2, начинает выделяться механизм передачи световой энергии по безрадикальному резонансному типу, при котором могут возникать одноударные двунитевые разрывы ДНК.
Исследования с выделенным впервые в качестве сенсибилизатора 6МП показывают, что комплексообразование ДНК-
6МП не сопровождается повышением температуры плавления ДНК *
и смещением максимума оптического спектра поглощения.
Установлено, что степень фрагментации ДНК, при облучении лазером (X = 337 нм) с Рн = 109 Вт/м2 и с Рд = 1,6-105 Дж/м2 комплексов ДНК-6МП при температуре I = 50°С, превышает степень фрагментации ДНК, облученной в комплексе с 6МП при температуре I = 25°С, в 1,3 раза. Для интеркалирующих сенсибилизаторов Е1Вг, АО, ХЛ увеличение фрагментации ДНК, при облучении комплексов ДНК-сенсибилизатор ЛИ в различных температурных условиях не превышало 1,1 раза. Последующие эксперименты с защитой экзогенного генетического материала от нуклеаз прорастающей пыльцы показали, что комплексообразование ДНК-6МП не связано с изменением пространственной конформации сахаро-фосфатного остова ДНК. Вышеприведенные исследования и анализ пространственных параметров молекул ДНК и 6МП предполагают электростатическое связывание молекулы 6МП в главном, минорном желобках спирали ДНК или между основаниями соседних нуклеотидов одной цепи, а также в местах локального расплетания аденин-тимин обогащенных участков ДНК, число которых возрастает с увеличением температуры раствора.
Исследования по обнаружению эффективного прижизненного «тушителя радикалов» позволили впервые выявить аскорбиновую кислоту в качестве фотопротектора в растительных системах. Установлено отсутствие оптического поглощения Ь-аскорбиновой кислоты на длинах волн X = 337 нм и X = 532 нм, а также устойчивость аскорбиновой кислоты (АСК) к воздействию лазеров ЛГИ-21 и ЛТИПЧ-8. Обнаружено снижение числа однонитевых и двунитевых разрывов ДНК, при воздействии ЛИ (X = 337 нм) с Рм = 109 Вт/м2 и Рд = 1,6-105 Дж/м2 на растворы ДНК-6МП, с предварительным добавлением в растворы АСК до конечных концентраций 0,1М и 1М.
Сравнение фотопротекторных свойств АСК и 2-меркаптоэтанола (2МЭ) показывает, что впервые предложенная в качестве прижизненного фотопротектора АСК уступает по восстановительным качествам известному для систем in vitro «тушителю радикалов» 2МЭ не более, чем в 3,2 раза.
С целью выработки объективных критериев оценки эффективности сенсибилизаторов, используемых в работе и ожидаемых в дальнейшем, предложена оценка эффективности сенсибилизаторов, с использованием вероятностей со, и а>2 индуцирования однонитевых и двунитевых разрывов ДНК одной молекулой сенсибилизатора, вступившей в комплексообразование с ДНК, при воздействии ЛИ в течение 1 секунды, или в течение 1 импульса. Гелий-неоновый лазер УФЛ-1 непрерывного действия обладает крайне низкой интенсивностью, недостаточной для двухквантового возбуждения молекул сенсибилизатора. Вскоре после начала экспериментов стала очевидной его непригодность для фрагментации ДНК в системах in vitro, и тем более в системах in vivo. Произведен расчет вероятностей coj и а>2 (Табл.1). Из Табл.1 следует что наибольшая вероятность индуцирования разрывов ДНК, при воздействии ЛИ в течение 1 с, приходится на молекулу сенсибилизатора 6МП во всем диапазоне используемых интенсивностей лазера ЛГИ-21 (Я. = 337 нм). Вероятность фрагментации ДНК, вызываемая 1 молекулой сенсибилизатора и 1 импульсом ЛИ достаточна высока и для системы пикосекундный лазер (X = 532 нм) -АО, которая все же заметно ниже, чем у системы ЛГИ-21 -6МП. Так, в режиме максимально возможных интенсивностей работы лазеров, в расчете на один импульс в системе пикосекундный лазер (X. = 532 нм) - АО, coi = 2,67-10"12 разрыв/(сенс-имп), а в системе ЛГИ-21 - 6МП, С0| = 8,88-10'12 разрыв/(сенс-имп), т.е., система ЛГИ-
21 - 6МП, в расчете на один импульс лазера эффективнее, примерно, в 3,3 раза. Самую низкую эффективность фрагментации ДНК показали все сенсибилизаторы при использовании с лазером ЛТИПЧ-8 (X = 532 нм). Например, при работе с 6МП, впервые используемым в качестве сенсибилизатора, эффективность фрагментации ДНК системой ЛГИ-21 — 6МП превзошла аналогичный параметр для системы ЛТИПЧ-8 - 6МП в 217 раз, а эффективность фрагментации ДНК системой ЛГИ-21 - EtBr, превзошла аналогичный параметр для системы ЛТИПЧ-8 - EtBr в 23 раза. Соответственно, система ЛГИ-21 -АО опередила систему ЛТИПЧ-8 в 8,7 раз и система ЛГИ-21 - ХЛ оказалась эффективнее системы ЛТИПЧ-8 - ХЛ в 15,7 раз. Столь низкая эффективность фрагментации ДНК лазером ЛТИПЧ-8 в системе in vitro указывает на нецелесообразность применения этого лазера в системе in vivo для индуцирования генетических изменений. Между тем, хорошие результаты по фрагментации ДНК, показанные лазером ЛГИ-21, особенно в сочетании с 6МП, позволяют предполагать его эффективность и в системе in vivo. Полученные результаты указывают на возможное эффективное использование in vivo системы ЛГИ-21 - EtBr, а также на использование in vivo систем ЛГИ-21 - АО и ЛГИ-21 - ХЛ, но со значительно меньшей вероятностью успеха. Значительные перспективы для использования in vivo могут быть связаны с системой пикосекундный лазер (Я. = 532 нм) - АО, которая, значительно уступая по эффективности фрагментации ДНК in vitro системе ЛГИ-21 - 6МП, имеет определенные преимущества. Из дальнейших исследований следует, что свет с длиной волны X = 532 нм превосходит по способности проникать в живую клетку свет с длиной волны X = 337 нм примерно в 1,14 раз. Кроме этого, как
Вероятность возникновения однонитевых со, и двунитевых юг разрывов нативной ДНК, индуцированных 1-ой молекулой сенсибилизатора, вступившей в комплексообразование с ДНК, при воздействии ЛИ в течение 1 секунды.
т
Р„, Вт/М
КГ
10*
10у
10
ттг
10'
2-10'
Сенсибилизатор
Ш,
хЮ"1
0)2
хЮ
,•16
£0| хЮ"14
©2
хЮ
,-15
СО,
хЮ"'
ш2 хЮ"1
ш,
хЮ
,-12
С02
хЮ"
ю, хЮ
,-и
С£>2 хЮ"12
ю, хЮ'1
С02
хЮ
,-13
Лазер ЛГИ-21, X = 33/нм, т = 9-10'9с, V = 10 Гц;
АО 0,96 0,71 1,02 0,73 1,01 0,70 1,02 0,75 0,96 0,73
Е1Вг 2,42 1,67 2,52 1,69 2,38 1,68 2,46 1,68 2,46 1,67
6МП 8,81 5,99 8,57 6,79 8,85 6,33 8,51 5,91 8,88 6,08
ХЛ 0,83 0,64 0,76 0,59 0,82 0,68 0,82 0,64 0,80 0,65
Лазер ЛТИПЧ-8, А, = 532 нм, т = 15-10"ас, V = 10 Гц;
АО 1,17 0,90
Е1Вг 1,07 0,73
6МП 0,41 0,28
ХЛ 0,51 0,42
Пикосекундный лазер, X = 532 нм, т = 30-10"12с, V = 1 Гц;
АО
2,67 2,41
следует из вышеприведенных исследований, использование пикосе-кундного лазера с Рм = 2- 10й Вт/м2 выделяет резонансный механизм передачи световой энергии с АО на ДНК, с возможностью образования одноударных двунитевых разрывов ДНК, что может иметь особое значение в селекционной практике для индуцирования определенного спектра генетической изменений и в изучении роли двунитевых разрывов ДНК в индуцировании генетической изменчивости растений.
Изучение возможности прижизненного использования сенсибилизаторов в растительных объектах.
Согласно разработанным методикам, одними из главных требований, изначально предъявляемых к сенсибилизаторам, должна быть их достаточно низкая собственная токсичность и способность молекул сенсибилизаторов проникать внутрь клеток и ядер. В исследованиях изучалась динамика прорастания семян и роста корешков в различных концентрациях сенсибилизаторов, а также миграция молекул сенсибилизатора в растущие корешки и проростки. Результаты по измерению длин корешков кукурузы через 36 и 72 часов выдержки семян в растворах сенсибилизаторов и АСК показывают, что воздействие сенсибилизаторов и АСК на рост корешков имеет нелинейный характер, т.е., наряду с ингибированием роста имеющего место при высоких концентрациях порядка (10'3-10'4)М, при малых концентрациях порядка (10'6-10"8)М имеет место и стимулирующий эффект. Он выражается в том, что у семян кукурузы, замоченных на этих концентрациях, наблюдается более быстрый рост корешков, нежели у контрольных семян, пророщенных в воде. Причем, максимумы концентраций, при которых стимулируется или угнетается рост, отличаются у разных сенсибилизаторов. Как известно, ускорение роста растений может быть следствием ускорения про-
цессов деления клеток или увеличения объема клеток, т.е., их растяжением. Для выяснения доминирующей причины ускорения роста корешков в стимулирующих концентрациях сенсибилизаторов и АСК, параллельно с измерением длины корешков, определялся ми-тотический индекс (МИ) в меристеме растущих корешков кукурузы. Анализ показывает, что ингибирование роста корешков высокими концентрациями сенсибилизаторов и АСК, связано с уменьшением МИ клеток апикальной меристемы. В то же время, стимулирование роста корешков малыми концентрациями сенсибилизаторов и АСК не приводит к заметному увеличению МИ, и, значит, ускорение роста в этом случае следует объяснять процессом увеличения размером клеток, т.е. их растяжением. После 72 часов проращивания в растворах сенсибилизаторов и АСК, проросшие семена отмывались в течение 1 часа в проточной воде, высаживались в грунт и анализировались по динамике роста и развития. Выяснено, что после 2-х недель роста, с момента посадки, растения постепенно начали выравниваться в росте. К концу 3-ей недели высота и развитие проростков, для всех вариантов составляло одинаковые величины. В полевых условиях растения доводились до вегетации. Анализ вегетирующих растений и початков не выявил достоверных различий между вариантами. Растения в поколениях Мь М2 и Мз развивались нормально, не проявляя различий между вариантами и контролем. Таким образом установлено, что проращивание семян кукурузы в растворах сенсибилизаторов и АСК, в интервале концентраций от 10"4М до 10"8М, в течение 72 часов, с последующим отмыванием и пересаживанием в чистый грунт не оказывает в дальнейшем угнетающего и мутагенного действия на развитие и плодоношение растений. Особый интерес на этом этапе работы вызывало проращивание семян в растворе с одновременным добавлением одного сенсибилизатора и АСК. Ока-
залось, что в этом случае ни в одном сочетании используемых сенсибилизаторов и АСК не проявилось синергического эффекта. Для примера, в Табл.2, приведены результаты проращивания семян в раздельных и совместных растворах 6МП и АСК. Из Табл.2 видно, что динамика увеличения длины корешков и изменения митотиче-ского индекса в растворе, содержащем одновременно сенсибилизатор 6МП и аскорбиновую кислоту, происходят, примерно, так же как в присутствии только более угнетающего из этих двух факторов. Обращает на себя внимание чрезвычайно малое изменение значений длин корешков Ь и митотического индекса МИ клеток апикальной меристемы, по отношению к диапазону изменений концентраций сенсибилизаторов и АСК от 10'3М до 10'8М. Т.е., изменение концентраций сенсибилизаторов и АСК в растворах в 105 раз, вызывало изменение длин корешков Ь и митотического индекса МИ всего лишь в 2-3 раза! Параллельно с измерением длин корешков Ь и митотиче-ских индексов МИ клеток апикальной меристемы, производились спектрофотометрические исследования растворов сенсибилизаторов и АСК, в которых происходило проращивание семян. Динамика изменения спектров поглощения растворов позволяла судить о миграции молекул сенсибилизатора и АСК в прорастающие семена. В Табл.3 приведены результаты спектрофотометрических исследований по определению числа молекул N и массы ш сенсибилизаторов и АСК, из которой следует, что изменение скорости миграции молекул сенсибилизаторов и АСК неодинаково для разных препаратов. Наиболее стабильной является интенсивность миграции в семена молекул 6МП, наиболее быстро убывает интенсивность миграции молекул ЕШг и АСК. Для оценки прижизненного попадания молекул АО в ядра клеток апикальной меристемы корешков кукурузы, была разработана оригинальная методика. Флуоресценция комплек
Длины Цмм) корешков кукурузы линии НМУ404 и МИ(%) в меристемных клетках корешков после 36 и 72 часов
проращивания в растворах 6МП, АСК и 6МП+АСК, температура проращивания I = 25°С.
С, моль ю-3 ю-4 ю-5 Ю"6 10"7 10"8 Контроль, Н20
После 36 часов про ращивания
6МП Ь, мм 3,0 ± 1,2 5,1 + 1,8 7,9 ± 2,7 6,1 ±2,4 5,0 ±2,2 6,6 ± 2,3 6,8+1,8
МИ,% 5,84 ± 1,12 6,98 ±0,68 11,59 ±0,44 14,83 ±0,83 17,38 + 0,69 16,93 ±0,57 16,28 ±0,61
АСК Ь, мм 0 4,8 ±1,5 5,9 ±2,5 7,4 ±3,1 8,5 ± 2,7 7,3 ±2,4 6,8 ±1,8
ми,% Гибель клеток 5,73 ±0,49 13,92 ±0,48 17,59 ±0,34 16,89 + 0,87 17,83 ±0,33 16,28 ±0,61
6МП + АСК Ь, мм 0 4,7 ±1,7 6,2 ± 2,5 6,9 ±2,7 7,3 ±3,1 6,9 ± 2,9 6,8 + 1,8
ми,% Гибель клеток 6,19 ±0,81 10,64 ±0,58 15,92 ±0,73 16,35 ±0,81 16,22 ±0,79 16,28 + 0,61
После 72 часов проращивания
6МП Ь, мм 18,8 ±6,2 15,9 ±5,4 20,6 ± 6,9 31,9 ±7,3 28,0 ± 7,2 28,9 ± 4,8 27,3 ± 4,3
МИ,% 7,46 ±0,82 10,88 ±0,75 15,10 ±0,57 14,02 ±0,96 15,76 ±0,89 16,22 ±0,41 15,93 ±0,48
АСК Ь, мм 0 11,3 ±5,2 19,2 ±6,3 27,5 ± 5,8 29,2 ± 5,7 28,6 ±6,1 27,3 ±4,3
МИ,% Гибель клеток 9,86 ± 0,74 14,36 ±0,72 15,92 ±0,73 16,92 ±0,34 16,21 ±0,63 15,93 ±0,48
6МП + АСК Ь, мм 0 12,3 ±4,9 21,3 + 7,3 29,4 ± 6,5 28,7 ± 8,3 26,9 ±7,4 27,3 ± 4,3
МИ,% Гибель клеток 9,55 ± 0,94 14,83 ±0,91 15,34 ±1,27 15,96 ±0,75 16,12 ±1,34 15,93 ±0,48
са ДНК-АО в видимой области (530 нм) позволяет визуально сравнивать свечение эталонных комплексов ДНК-АО и ядер клеток, на основании чего можно утверждать, что в клетках апикальной меристемы корешков кукурузы, пророщенных в 10"5М растворе АО, через 72 часа проращивания присутствует АО в молярном отношении к нуклеотидам ДНК меньше, чем 1:1000. Корешки предварительно отмывались в течение 4-х часов в проточной воде, замораживались в жидком Ы2 (77К) и рассматривались в замороженном состоянии, что исключало возможную тепловую миграцию молекул АО в ядра клеток в момент приготовления и рассматривания препарата. Исследования проводились в холодной комнате на замораживающем столике оригинальной конструкции. Время нахождения скола в замороженном состоянии (10-20 с), позволяло увидеть характерное свечение связанного АО и его локализацию в ядре.
Таблица 3
Число N и масса т молекул сенсибилизаторов и АСК, поглощенных одним прорастающим семенем кукурузы линии НМУ404,1 = 25°С
Используемый препарат АО ЕШг 6МП ХЛ АСК
N. через г = 24 часа, х 1013 5,49 4,82 3,51 5,52 4,97
т, через 1 = 24 часа, хЮ^г 2,75 3,15 1,02 4,73 1,45
N. через г = 12 часа, хЮ15 5,96 5,82 4,98 5,96 5,94
т, через 1 = 72 часа, х10"6г 3,00 3,80 1,40 5,10 1,74
Исследования с томатом и льном показывают, что для этих культур используемые сенсибилизаторы и АСК, в диапазоне концентраций от 10"3М до 10~8М, могут оказывать значительно более сильно выраженное ингибирующее действие. Найденные, приемлемые для проращивания, концентрации сенсибилизаторов и АСК, примерно на (0,5-1) порядок были ниже, по сравнению с концентрациями, опре-
деленными для кукурузы. Подобный результат связан как с видо-специфичностыо семян, так и с их строением. Известно, что малые по размерам семена при замачивании впитывают в удельном отношении значительно больше воды, чем крупные, что способствует миграции растворенных в воде веществ.
Исследование способности светового излучения проникать в растительные ткани.
Эксперименты проводились на изготовленных препаратах эпидермы кукурузы и томата с нижней стороны листа. Результаты приведены в Табл.4. Так как, поглощение происходит каждым монослоем клеток, то зависимость Рм ЛИ после прохождения светом п слоев клеток может определяться по закону геометрической прогрессии: Рм(п) = Ро-9", где Р0 - начальная плотность мощности ЛИ. Проведенный анализ возможного уменьшения интенсивности ЛИ за счет отражения и рассеивания показывает, что на каждые 10 слоев клеток происходит дополнительное снижение Рм примерно на порядок. В этом случае обобщенная формула для оценки реальной плотности мощности ЛИ после прохождения п слоев клеток имеет вид : Рм(п) = Ро-аМО-(а"0). Исследования, проведенные со свежей пыльцой томата и кукурузы показывают, что внутри пыльцевых зерен развивается плотность мощности Рм ЛИ всего лишь на (1-2) порядка меньше исходной интенсивности Ро- В этом смысле, использование пыльцы, как объекта совместного воздействия сенсибилизаторов и ЛИ при индуцировании генетических изменений, должно представлять особый интерес. Воздействие ЛИ на сухие, прорастающие семена или проростки должно проводиться только при максимальном обеспечении оптического пути для световых волн. Исследования показывают, что семенные оболочки практически полностью пере-
Зависимость коэффициента пропускания Э от длины световой волны X (нм) для монослоя клеток эпидермы кукурузы линий НМУ404, ХЫ8 и томата сорта «Факел».
Длина волны X, нм 200 250 _ 300 350 400 500 600 700
Кукуруза линии НМУ404
Коэффициент пропускания 9 0,036 0,44 0,67 0,75 0,77 0,82 0,83 0,84
Кукуруза линии ХЫ 8
Коэффициент пропускания 9 0,032 0,44 0,65 0,71 0,76 0,80 0,84 0,86
Томат сорта «Факел»
Коэффициент пропускания 3 0,029 0,38 0,58 0,66 0,74 0,82 0,86 0,87
Как следует из результатов, приведенных в Табл.4., для разных видов растений, выполняется одинаковая закономерность: через живые растительные клетки плохо проникает свет с длиной волны X < 300 нм и относительно хорошо проникает свет с длиной волны X > 300 нм. По всей видимости, именно в этом кроется одна из причин малого числа публикаций о мутагенном воздействии УФ-лазеров на высшие растения, в то время, как много публикаций о высокой мутагенной активности УФ-лазеров (X = 260 нм) при воздействии на бактерии и клеточные культуры.
крывают оптический путь для лучей лазера в УФ и видимой областях света в интервале используемых интенсивностей. Цитогенетическая оценка чувствительности растительных клеток к раздельному и совместному воздействию сенсибилизаторов и ЛИ.
Как известно, цитогенетический метод оценки чувствительности клеток к воздействию мутагенных факторов, является одним из наиболее тонких методов оценки реакции растений на непосредственное воздействие мутагенов. Для облучения клеток апикальной меристемы кукурузы использовался лазер ЛГИ-21 (X = 337 нм), как показавший хорошие результаты по фрагментации препаратов ДНК в системах in vitro. Использовались сенсибилизаторы 6МП, ХЛ, EtBr, АО и АСК. Обнаружено, что при воздействии ЛИ с Р„ = 0,7-108 Вт/м2 на клетки меристемы, достоверного увеличения числа ХА (%) не наблюдается. Начиная с плотности дозы Рд = 3,8-103 Дж/м2, наблюдается снижение МИ (%) митотических клеток, по достижении плотности дозы Рд = 7,6-104 Дж/м2, наблюдается полное отсутствие делящихся клеток (Табл.5)
Таблица 5
Митотический индекс и хромосомные аберрации в облученных клетках меристемы корешков кукурузы НМУ404, Рм = 0,7-108 Вт/м2.
Время облучения Рд, Дж/м2 МИ,%. Кол-во ана-телофаз ХА, % Гибель корешков,%
Контроль 16,6410,37 547 0,54+0,31 ----
2 сек 1,26-102 16,67±0,30 792 0,63+0,28 0
10 сек 6,3 • 102 15,58+0,31 625 0,80±0,36 0
30 сек 1,89-103 1б,б2±0,27 788 0,76±0,31 0
1 мин 3,78-103 15,10±0,29 528 0,94±0,42 0
3 мин 1,13-104 13,18±0,26 719 0,97+0,36 10
6 мин 2,26-104 5,40±0,1б 278 1,08±0,62 70
10 мин 3,78-104 0,80±0,07 49 2,04+2,01 100
20 мин 7,56-104 Отсутствие делящихся клеток
Выяснено, что при проращивании семян кукурузы в растворах сенсибилизаторов 6МП, ЕШг, АО, ХЛ и АСК, в диапазоне концентраций от 10"8М до 10°М, ни в одном случае не наблюдается достоверного увеличения числа ХА (%) в меристемных клетках корешков, однако, во всех случаях отмечается достоверное снижение МИ (%) с ростом концентрации сенсибилизаторов и АСК. Не обнаружено си-нергического эффекта снижения МИ (%) в меристемных клетках корешков при использовании совместных растворов сенсибилизаторов и АСК в любых комбинациях. Снижение МИ (%) во всех вариантах происходило примерно так же, как в присутствии одного, более токсичного компонента. Зафиксировано достоверное увеличение числа ХА(%) в меристемных клетках корешков кукурузы, обработанных совместным действием сенсибилизаторов, ЛИ и АСК (Табл.6,7). Причем, для линии НМУ404, в варианте совместного воздействия 6МП и ЛГИ-21 процент ХА увеличился в 13,2 раза (1 = 3,79), для линии А346 — в 15 раз, в варианте совместного воздействия ЕШг и ЛГИ-21 увеличение ХА у линии НМУ404 - в 11,3 (г = 2,89) раза, у линии А346 - в 7,9 раз. Выявлены дозовые кривые с максимумом, зависимости числа ХА(%) в клетках апикальной меристемы корешков кукурузы, пророщенных в растворах 6МП и Е1Вг, и облученных ЛИ (X = 337 нм), от концентрации сенсибилизаторов в растворах. Обнаружено изменение спектра ХА (%) в меристемных клетках корешков кукурузы, при совместном воздействии на них 6МП, ЕШг и ЛИ (А. = 337 нм), относительно контроля. В этих случаях отмечается появление множественных мостов и фрагментаций хромосом в ана-телофазах митозов. (Табл.8). Обнаружено снижение числа ХА (%) в 1,5-2,1 раза и увеличение МИ (%) в 1,1- 1,3 раза в меристемных клетках корешков кукурузы, пророщенных в растворах 6МП и Е1Вг
Митотический индекс МИ(%) и хромосомные аберрации ХА(%) в клетках апикальной меристемы корешков кукурузы линии НМУ404, пророщенных в растворах с различной концентрацией сенсибилизаторов и облученных лазером ЛГИ-21(Х = 337 нм). Рм = 0,7-105 Вт/м2, Рд = 3,8-103 Дж/м2.
С, моль 10"8 10"7 10"6» ю-5 10"4 ю-3 Контроль, Н20
АО +ЛИ МИ,% 16,17±0,37 14,50+0,29 15,2610,35 10,78+0,26 6,4010,22 5,9610,21 16,48 + 0,33
ХА, % 0,50±0,29 0,49+0,28 0,9410,38 1,0110,45 1,4010,80 1,5210,87 0,43 ± 0,25
ЕШг + ЛИ МИ,% 12,95±0,26 11,22+0,30 5,0210,19 2,38+0,14 0,3110,04 Гибель клеток 14,40 + 0,34
ХА, % 0,98+0,49 2,76+1,11 4,5011,39 2,25+1,57 Не достоверно 0,40 + 0,28
6МП + ЛИ МИ,% 15,60±0,32 14,94+0,29 6,4310,22 4,83+0,19 1,5110,11 0,1310,04 18,22+0,38
ХА, % 0,69+0,40 2,00±0,55 5,90+1,41 8,56+2,06 4,55+2,57 Не достоверно 0,6510,32
ХЛ + ЛИ МИ,% 15,31+0,33 18,09+0,34 12,39+0,31 7,42+0,22 1,18+0,10 0,1610,04 15,8010,29
ХА, % 0,47+0,28 0,68±0,39 0,69+0,34 0,82+0,47 1,69+0,68 Не достоверно 0,47+0,28
Митотический индекс МИ(%) и хромосомные аберрации ХА(%) в клетках апикальной меристемы кукурузы линии А346, пророщенных в растворах с различной концентрацией сенсибилизаторов в присутствии или в отсутствие АСК (с = 1(ИМ) и облученных лазером ЛГИ-21, Рм = 0,7-Ю8 Вт/м2, Рд = 2,7-Ю3 Дж/м2.
Условия обработки АО+ЛИ АО+АСК + Ж ХЛ+ЛИ ХЛ+АСК + ЛИ ЕгВг+ЛИ ЕШг+АСК + ЛИ 6МП+ЛИ 6МП+АСК + ЛИ
Контроль н2о ми,% 20,4510,58 28,19±0,74 18,75+0,63 24,86+0,62 25,16±0,58 22,19+0,64 26,1410,81 21,4310,66
ХА, % 0,7410,32 0,68+0,32 0,64+0,34 0,7310,44 0,6510,37 0,68+0,41 0,6910,38 0,7210,36
10"8 МИ,% 20,22±0,б2 26,47+0,81 18,44+0,72 22,25+0,64 22,15±0,63 20,88+0,61 21,1810,49 19,3910,45
ХА, % 0,72±0,29 0,64+0,43 0,68+0,37 0,73+0,56 0,92+0,42 0,84±0,39 0,7110,38 0,7410,39
ю-7 МИ,% 18,49±0,34 26,2210,64 18,45+0,61 25,3810,60 19,17+0,55 20,12+0,59 20,8810,41 19,9210,54
ХА, % 0,70+0,32 0,6610,45 0,72+0,41 0,70±0,54 2,98+1,21 2,3311,13 2,45+0,61 1,9610,82
10"6 МИ,% 17,98±0,3б 26,92±0,57 15,12+0,55 21,84+0,85 9,48+0,71 11,2010,88 12,3810,62 11,8810,72
ХА, % 0,9510,41 0,73±0,52 0,84±0,39 0,79+0,38 5,15+1,48 3,4511,18 6,8911,42 4,01+1,37
ю-5 МИ,% 11,88±0,38 9,93±0,74 9,18+0,72 14,49±0,73 3,68+0,35 3,5410,82 10,8810,32 9,3210,47
ХА, % 1,07+0,52 0,95±0,54 1,21 ±0,84 * 0,94±0,47 2,11+1,62 2,51+1,75 10,3412,12 4,4111,89
10"4 МИ,% 7,18+0,29 8,14+0,67 2,42+0,58 5,23±0,94 1,53+0,17 1,2210,21 2,4410,36 3,5610,38
ХА, % 1,52+0,86 1,21+0,66 2,25+1,93 1,95±0,92 Не достоверно 5,4212,66 3,9511,51
Ю-3 МИ,% 6,34+0,32 6,22+0,44 0,92+0,05 1,69±0,12 Не достоверно 1,0510,11 0,9910,15
ХА, % 1,64±0,95 1,59+0,89 Не достоверно
гг
с последующим воздействием ЛИ (к ~ 337 нм), при условии добавления к растворам сенсибилизаторов АСК (Табл.7,9).
Таблица 8
Распределение Щ%) хромосомных аберраций в клетках меристемы корешков кукурузы при совместном воздействии на них сенсибилизаторов 6МП, Е1Вг и ЛИ (X = 337 нм, Рм = 0,7-10' Вт/м2, Рд= 3,8-103 Дж/м:).
Вариант Одиночные Множеств. Фрагменты, Отставания,
воздействия мосты мосты потери забегания
Контроль 11 0 0 89
6МП+ЛИ 37 23 18 22
EtBr+ЛИ 31 19 24 26
Таблица 9
Митотический индекс МИ (%) и хромосомные аберрации ХА (%) в клетках апикальной меристемы корешков кукурузы, пророщенных в растворах 6МП, Е1Вг с добавлением АСК и облученных ЛГИ-21.
Вариант воздействия МИ,% ХА,%
Контроль, Н20 14,92 + 0,54 0,46 ±0,21
6МП +ЛИ 4,74 ±6,61 6,61 ±1,58
(6МП+АСК) + ЛИ 6,14 + 0,87 3,15 ± 1,72
EtBr + ЛИ 6,1210,45 5,01 ± 1,29
(EtBr+ACK) + ЛИ 7,58 ±0,64 3,13 ±1,18
Таблица 10
Сравнение результатов по индуцированию ОНР ДНК в системе in vitro и цитологическими исследованиями по обнаружению ХА (%) в системе in vivo, при совместном воздействии сенсибилизаторов и
Фактор воздействия ЛИ 6МП+ ЛИ EtBr+ ЛИ ХЛ+ ЛИ АО+ ЛИ
Вероятность а>| образования ОНР ДНК, х10"н --- 8,81 2,52 0,76 1,02
Снижение Ю| при использовании АСК, кол-во раз ---- 6,3 — — —
Возрастание ХА (%) по отношению к контролю, кол-во раз ---- 13,17 11,25 Достоверное возрастание отсупггв.
Снижение ХА (%) при использовании АСК, кол-во раз ---- 2,1 1,6 ---- —
Исследование эффектов совместного действия сенсибилизаторов и лазерного излучения на пыльцу.
Известно, что в качестве одного из критериев чувствительности клеток к мутагенным факторам, могут быть эффекты, наблюдаемые при воздействии мутагенов на пыльцу. При этом, использование пыльцы как объекта совместного воздействия сенсибилизаторов и ЛИ может представлять особый интерес, так как при попадании в пыльцевое зерно плотность мощности Рм снижается всего на 1-2 порядка. В ходе исследований был подтвержден эффект стимулирования прорастания пыльцы томата и кукурузы воздействием ЛИ (X = 337 нм) с Рм = 0,5-108 Вт/м2. При этом, плотность дозы стимулирования прорастания пыльцы томата составила Рд = 1,4-103 Дж/м2, плотность дозы стимулирования прорастания пыльцы кукурузы составила 2,2-103 Дж/м2. Максимальный эффект стимулирования для пыльцы кукурузы составил 21,8%, для пыльцы томата - 20,5% от контроля. Превышение стимулирующей плотности дозы Рд для пыльцы во всех случаях приводило к снижению процента прорастания пыльцы. Обнаружен эффект ингибирования прорастания пыльцы томата и кукурузы, после воздействия стимулирующих плотностей доз Рд ЛИ и выдерживания пыльцы в течение одного часа перед внесением в питательную смесь (ПС). Выяснено, что добавление к ПС сенсибилизаторов и АСК в диапазоне концентраций от 10'8М до 10"3М во всех случаях приводит к ингибированию прорастания пыльцы томата и кукурузы. Определены концентрации сенсибилизаторов и АСК, не снижающие процент прорастания пыльцы более чем на 30%. Обнаружено отсутствие синергического эффекта при одновременном добавлении к ПС сенсибилизаторов и АСК. В этом случае прорастание пыльцы кукурузы и томата в ПС происходит, примерно так же как в присутствии одного более токсичного компо-
нента. По разработанным оригинальным методикам спектрофото-метрического анализа определены количества молекул сенсибилизаторов 6МП, ЕШг, ХЛ, АО, мигрирующих в одно пыльцевое зерно томата через различные промежутки времени после начала замачивания пыльцы в ПС с добавленными сенсибилизаторами (Табл. 11).
Таблица 11
Усредненное число п молекул сенсибилизаторов 6МП, ХЛ, ЕШг, АО, мигрировавших в одно пыльцевое зерно томата за время I выдержки в ПС с добавленным сенсибилизатором. Концентрация сенсибилизаторов в ПС во всех случаях бралась равной с =
Время 1 замачивания в ПС, мин 0,5 1 3 5 10
Сенсибилизатор
6МП 900 1500 1700 1700 1800
Е1Вг 600 1200 1300 1400 1400
ХЛ 600 1300 1400 1500 1500
АО 700 1400 1400 1500 1500
Параллельно методикам спектрофотометрического анализа, была разработана методика изучения динамики миграции молекул сенсибилизатора АО в пыльцевые зерна по изменению свечения растущих пыльцевых трубок при рассматривании в УФ свете в люминесцентном микроскопе. На основании исследований сделан вывод о том, что миграция основного количества молекул сенсибилизаторов в пыльцевые зерна происходит в течение первой минуты замачивания пыльцы в ПС. Обнаружен эффект нелинейной зависимости процента прорастания томатной и кукурузной пыльцы от времени выдержки пыльцы в ПС, с добавленными сенсибилизаторами, перед воздействием ЛИ (Табл.12). На основании обнаруженного эффекта сделан вывод о том, что интервал времени, необходимый для миграции молекул сенсибилизаторов в пыльцевые зерна и их комплексообразо-
Таблица 12
Процент прорастания пыльцы Р(%) томата сорта «Факел» и кукурузы линии НМУ404, облученной ЛИ (X = 337 нм) после замачивания пыльцы в ПС, в течение различных интервалов времени. Р„ = 0,7-108 Вт/м2, Рд = 3,8-Ю3 Дж/м2.
Среда прорастания Прорастание Р пыльцы в ПС, % Прорастание Р пыльцы в ПС с сенсибилизаторами, % Время 1 от начала замачивания пыльцы до облучения ЛИ, мин.
0,5 1 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
Пыльца томата сорта «Факел»
ПС 34,1 34,1 38,3 31,4 33,2 28,6 24,7 23,9 21,2 20,6 23,3 25,9 24,6 26,1
ПС + 6МП 53,4 31,3 31,1 20,8 13,6 10,2 2,8 3,5 6,7 5,7 7,3 12,2 14,8 15,2
ПС + ХЛ 44,5 32,8 33,1 30,5 32,8 18,2 7,9 8,3 0 0 0 2,3 6,5 5,8
ПС + АО 39,8 37,2 34,2 36,1 38,4 24,5 20,8 24,3 8,1 10,2 6,3 3,5 5,7 6,2
ПС + Е1Вг 44,5 37,3 36,2 24,8 18,5 4,2 5,3 1,7 0 0 4,3 11,2 6,5 7,6
Пыльца кукурузы линии НМУ404
ПС 24,1 24,1 24,9 25,6 23,4 24,8 19,7 20,3 Прорастание пыльцевых трубок
ПС + ЕгВг 32,9 28,4 29,2 25,3 26,1 22,5 17,6 8,4
ПС + 6МП 36,7 26,7 24,4 18,6 17,4 10,9 4,3 1,1
вания с ДНК генома пыльцы, составляет для пыльцы томата (40-60)% от общего времени прорастания пыльцы томата, а для пыльцы кукурузы, соответственно - (70-80)% от общего времени прорастания. Определено количество ОНР ДНК, приходящихся на одну молекулу ДНК генома пыльцы томата, после раздельного и совместного действия на пыльцу 6МП и ЛГИ-21 (X = 337 нм). Зафиксировано прижизненное увеличение числа ОНР в ДНК генома пыльцы при совместном действии на пыльцу 6МП и ЛИ (X = 337 нм) (Табл.13)
Таблица 13
Усредненное количество ОНР, приходящихся на одну молекулу ДНК, выделенной из пыльцы томата сорта «Факел», обработанной раздельным и совместным действием 6МП (с = 10'5М) и ЛИ (к - 337 нм, Рм = 0,9-108 Вт/м2,1о6л = 30 минут).
Вариант воздействия 6МП ЛИ 6МП +ЛИ
Число ОНР ДНК 1,2+ 1,1 1,6+1,4 5,3 ± 1,9
Обнаружено, что добавление АСК к ПС совместно с сенсибилизаторами, приводит к снижению ингибирования прорастания пыльцы при воздействии ЛИ (X = 337 нм), примерно, на 3-4% (Рис.2). Предложена методика обработки пыльцы совместным действием сенсибилизаторов, АСК и ЛИ, с целью индуцирования генетической изменчивости растений.
Возможность защиты экзогенного генетического материала ог гидролитического расщепления нуклеазами пыльцы, посредством молекул - интеркаляторов. при трансформации растений с помощью процессов опыления - оплодотворения.
I, МИН
Рис. 2 Графики зависимостей процента прорастания Р(%) пыльцы томата сорта «Факел», от времени ^мин), выдержки пыльцы в ПС, с добавлением 6МП, Е1Вг и АСК, перед воздействием ЛИ (X = 337 нм). Обозначения вариантов ПС:
1.-ПС; 2.---ПС + 6МП + АСК; 3.---ПС + 6МП;
4.---ПС + ЕШг; 5..............ПС + Е1Вг + АСК.
Внедрение чужеродного экзогенного генетического материала в живую клетку является актуальной задачей, попытки решения которой сегодня предпринимаются по нескольким направлениям. Особый интерес представляет использование пыльцы в качестве средства для переноса чужеродных генов. Использование пыльцы позволяет обходить трудности, связанные с регенерацией растений из протопластов и избегать сомоклональной изменчивости. Одна из основных проблем трансформации посредством опыления-оплодотворения, не разрешенная до настоящего времени - это преодоление нуклеазной активности прорастающей пыльцы. При проведении исследований было установлено:
1. С увеличением количества пыльцы в ПС резко возрастает нукле-азная активность, выражающаяся в более быстрой деградации плаз-мидной или линейной форм ДНК, используемых в качестве субстратов.
2. Выяснено, что линейная форма ДНК деградирует от нуклеаз прорастающей пыльцы быстрее, нежели кольцевая плазмидная форма.
3. При добавлении в ПС молекул-интеркаляторов эффект деградации экзогенной ДНК нуклеазами пыльцы резко снижается (Табл. 14). Выяснено, что встраивание интеркаляторов в ДНК сопровождается изменением пространственной конформации сахаро-фосфатного остова ДНК, что приводит к нарушению фермент-субстратных комплексов и ослаблению стерического взаимодействия активных центров нуклеаз пыльцы с фрагментами молекул ДНК.
Предложена методика реализации предложенного способа трансформации растений посредством опыления-оплодотворения с использованием молекул-интеркаляторов в качестве ингибиторов нуклеаз прорастающей пыльцы при переносе экзогенного генетического материала внутрь пыльцевого зерна.
Деградация (%) плазмиды рВЫ322 и нативной ДНК, выдержанных в питательной смеси с прорастающей пыльцой томата сорта «Факел» в отсутствии и в присутствии интеркаляторов в зависимости от времени выдержки г. Температура I = 22°С.
Время выдержки 1, мин 0 1 3 5 10 20 40 60
Плазмидная форма ДНК
ПС 0 4 12 20 40 80 100 100
ПС + АО 0 0 1 2 5 9 15 30
ПС + ЕШг 0 0 1 1,5 3 7 12 20
ПС + 6МП 0 3 12 19 40 75 100 100
ПС + ХЛ 0 0 1 1,5 4 8 14 26
Нативная линейная ДНК
ПС 0 5 15 25 50 100 100 100
ПС + АО 0 1 3 5 10 20 40 60
ПС + ЕШг 0 1 2 4 8 15 30 45
ПС + 6МП 0 5 14 25 50 100 100 100
ПС + ХЛ 0 1 2 4,5 9,5 17 35 50
Индуцирование генетической изменчивости у растений посредством совместного воздействия сенсибилизаторов и лазерного излучения.
Поставленная в работе проблема не могла бы считаться решенной при отсутствии заключительных исследований по непосредственному воздействию выявленных и оптимизированных систем лазер-сенсибилизатор на растения. Исследования проводились с линиями кукурузы НМУ404, А346, со льном сорта «Новоторжский» и с томатом сорта «Нистру». Изучались возможности систем сенсибилизатор-лазер при воздействии на проростки и на пыльцу, с последующим принудительным опылением. На каждый вариант обработки проростков кукурузы бралось по 30 растений. Анализ вегети-рующих растений кукурузы линии НМУ404 в М, показал наличие резко выраженных фенотипических отличий от контроля для всех растений в варианте совместного воздействия 6МП+ЛИ (А. = 337 им). Растения этого варианта условно можно было разбить на 4 группы:
1. Растения, развитие которых прекращалось со стадии 3-4 листьев. В темпах развития растения сильно отставали от контрольных. В группу 1 было отнесено 9 растений.
2. 15 растений, у которых отмечалось снижение высоты растений за счет уменьшения расстояния в междоузлиях (110-120 см против 150 см у контрольных). Метелки и початки формировались нормально. Завязываемость как у контроля (85-90)%.
3. 3 растения с высотой куста 40-50 см. Количество листьев уменьшено (8-10 против 14-16 у контроля). Листья жесткие, скрученные, чрезвычайно ломкие. На верхушках растений наблюдалось одновременное развитие метелки и початка. Завязываемость при самоопылении составила 10-15%.
4. 3 растения. Высота куста 25-30 см. Фактически, куст представлял собой 1-2 недоразвитых початка, растущих почти от земл^ Метелки отсутствовали. При опылении с контрольных сестринских растений завязываемости семян не происходило. В других вариантах в М] наблюдалось достоверное уменьшение высоты куста у 5-ти растений, обработанных совместным действием ХЛ+ЛИ (X = 337 нм). При анализе растений в поколении М2 сильно выраженные фенотипические отличия наблюдались только у растений, выращенных из семян группы 3, давших начало семьям А, Б, В (рис.3). Изменения затрагивали размеры и форму куста, листьев и репродуктивную систему, что приводило к частичной или полной стерильности. Семья А имела три условно объединенных фенотипа, в которых соотношение между растениями с отличиями и схожими с контролем составило 23:11. Соответственно, в семье Б соотношение составило 25:19, в семье В - 9:31. В поколении М3 во всех семьях наблюдалось расщепление, причем наряду с повторением измененных фенотипов и появлением растений с новыми измененными количественными признаками, наблюдались растения, которые по фенотипу через промежуточные состояния приближались к контрольным, при этом общее количество растений с измененными признаками в Мз составило 65,1%.
Изучение растений льна, проростки которых были обработаны раздельным и совместным действием сенсибилизаторов и ЛИ (А. = 337 нм) показало, что в М] у 26 растений (из 100 на каждый вариант обработки) наблюдалось сильное утолщение стебля, причем утолщение в верхней части сопровождалось срастанием верхних веточек. При толщине контрольных стеблей 1,9 мм, у измененных растений толщина стебля в нижней части была 3-4 мм, а ширина сросшейся верхней части достигала 15-20 мм. Схожие изменения имели в М, 14
Рис.3.
Растения кукурузы линии НМУ404 в поколении М% отнесенные к семье А1. Завязываемость при опылении с контрольных сестринских растений составила (5-10)%.
растений в варианте Е1Вг+ЛИ и 17 растений в варианте ХЛ+ЛИ. Созревание и наполнение коробочек у измененных растений происходило неодинаково. Содержание семян в варианте 6МП+ЛИ было 2-4, против 6-12 у контроля. При этом, примерно 1/3 семян были очень мелкими, деформированными, не давшими впоследствии всходов. В остальных вариантах измененных растений число коробочек и семян в них варьировало в широких пределах. Но семена в коробочках были нормально сформированы. Из них были получены растения, не имеющие в М2 достоверных отличий от контроля. Между тем, в поколении М2, выращенном из семян измененных растений варианта 6МП+ЛИ наблюдалось большое количество растений с измененными признаками:
1. 41 растение по строению и темпам развития не имело отличий от контроля.
2. У 23 растений наблюдались нарушения, Лсожие с хлорофильны-ми мутациями. Эти, полностью желтые проростки, прекращали развитие при высоте растения 5-10 см. Проростки были миниатюрными, с очень тонким стеблем, толщина которого составляла 0,5-0,7 мм против 1,2 мм толщины стебля у контроля.
3. У 34 растений наблюдалась желтая верхушка роста. Эти растения были ниже контрольных на 10-15 см (рис.4). Желтая верхушка составляла 3-5 см. В период вегетации у 63% растений была одна коробочка, в 37% случаев коробочек было две. Семена во всех случаях были очень мелкими, недоразвитыми. Из них 82% не прорастало, в остальных случаях наблюдалась ранняя гибель желтых проростков на стадии 2-3 листьев.
При изучении эффектов опыления растений пыльцой, обработанной совместным действием сенсибилизаторов и ЛИ, воздействие производилось на свежесобранную пыльцу кукурузы, после чего немед-
[ . " г ' '
Г ' • ' ' .
фъ, - Г*
ДШГ^4*-4 ЛгмЖЛг
Б^? /
'Ь *
1— „а
Рис. 4. Низкорослые растения льна сорта «Новохоржский» с желтой верхушкой роста, в поколении Мг-
Таблица 15
Частота появления измененных форм растений в М^ и в Мз при совместном воздействии на проростки кукурузы и льна сенсибилизаторов и лазерного излучения, %.
Вариант Воздействия Количество обработанных проростков Процент измененных растений в М( Процент измененных растений в М2 Процент измененных растений в Мз
Кукуруза НМУ404
Контроль 30 0 0 0
ЛИ(Х=337нм) 30 0 0 0
ЕИЗг 30 (+100) 0 0 0
Е1Вг + ЛИ 30 0 0 0
АО 30 (+100) 0 0 0
АО + ЛИ 30 0 0 0
ХЛ 30 (+100) 0 0 0
ХЛ + ЛИ 30 16,7% 0 0
6МП 30 (+100) 0 0 0
6МП + ЛИ 30 100% 53% 65,1%
Лен сорта «Новоторжский»
Контроль 100 0 0 Поколения М3 не анали зировались
ЛИ(Х,=337нм) 100 0 0
Е1Вг 100 0 0
ЕШг +ЛИ 100 14% 0
АО 100 0 0
АО + ЛИ 100 0 0
ХЛ 100 0 0
ХЛ + ЛИ 100 17% 0
6МП 100 0 0
6МП+ЛИ 100 26% 41,8%
ленно следовало опыление. Результаты по завязываемости семян,
при опылении початков кукурузы, приведены в Табл. 16.
Таблица 16
Вариант обработки Кол-во початков Завязываемость семян, %
Контроль 10 88
ПС 10 29
Сухая пыльца + ЛИ 10 93
ПС + ЛИ 10 2
ПС+6МП 10 21
ПС + АСК 10 23
ПС + 6МП + АСК 10 18
ПС + 6МП + ЛИ 10 0,5-1,5
ПС+6МП+АСК+ЛИ 10 0,5-1,5
В вариантах 6МП+ЛИ и 6МП+АСК+ЛИ были обнаружены морфо-
логические изменения зерновок (Табл. 17).
Таблица 17
6МП+ ЛИ 6МП + АСК + ЛИ
Всего се- Белый Бледно- Всего се- Белый Бледно-
мян на по- эндосперм, желтый эн- мян на по- эндосперм, желтый эн-
чатке, шт. шт. досперм, шт чатке, шт. шт. досперм,шт.
6 2 1 9 2 3
4 1 1 3 - 1
2 - - 7 - 3
2 - - 2 - -
7 2 1 4 - 1
3 - - 6 1 2
4 1 - 5 - -
5 - 1 2 - -
3 - - 8 3 4
5 - 1 6 1 1
При анализе поколений в М2 обнаружено наличие большой доли
растений с измененными признаками (Табл. 18). В Мг были получены растения с измененными признаками по окраске всходов (мутации типа White и Yellow) и взрослых растений (мутации типа Stribe и Striata), растения с гофрированными листьями, растения карлики (мутации типа br2 и типа lazy culm), растения с измененной структурой соцветий и початка (мутации типа Ьа2), озерненная метелка без
Таблица 18
Распределение измененных в М2 форм растений кукурузы НМУ404, полученных в результате опыления пыльцой, обработанной раздельным и совместным действием сенсибилизатора 6МП, аскорбиновой
Морфологические изменения в Мо Кол-во Зерен Признаки измененных в М2 форм растений %
Вариант воздействия на пыльцу: 6МП + ЛИ
Белый эндосперм 6 Всходы белого цвета. Гибель на стадии 2-х листьев. 14,6
Бледно-желтый эндосперм 5 Гибель на самых ранних стадиях развития проростка. 12,2
б Низкорослые растения. Кол-во листьев уменьшено. 14,6
4 В початке образуются мужские и женские цветки. В метелке происходит зернообразование. Завязываемость (10-15)%. Изменение цвета эндосперма у семян. 9,8
Желтый эндосперм 3 Растения карликовые (60-70)см. Мужское соцветие уплотнено. Пыльцы мало. Завязываемость (5-6)%. Семена бледно-желтые, недоразвитые. 7,3
2 Развитие растений прекращалось со стадии 4-х листьев. Высота не более 20 см, листья узкие, жесткие. 4,9
15 Растения, фенотипически"сходные с контрольными. 36,6
Вариант воздействия на пыльцу: 6МП+АСК+ЛИ
Белый эндосперм 6 Гибель белых или бледно-желтых всходов. 11,5
Бледно-желтый 9 Желто-зеленоватые всходы. Гибель на стадии 2-4 листьев 17,3
эндосперм 6 Светло-зеленые всходы. Низкорослость. Кол-во листьев уменьшено. Завязываемость (40-50)%. 11,5
6 Осеменение метелки. Листья жесткие, скрученные, их кол-во уменьшено. Растения низкорослые. Завязываемость 10% 11,5
Желтый 4 Терминальное расположение початка. Метелки отсутствуют. Низкорослость (40 см). Листья гофрированные. Завязываемость при опылении с контроля (25-30)%. Расщепление семян по цвету эндосперма. 7,7
эндосперм 5 Низкорослость. Кол-во листьев 4-6. Початки отсутствуют. Метелки компактные. Пыльца на ПС не прорастала. Завязываемости не было. 9,6
7 Одиночная осевая метелка. Пыльца стерильна. Низкорослость. Листья широкие, гофрированные, кол-во их уменьшено. Початок недоразвит. 13,5
9 Растения, фенотипически сходные с контролем. 17,3
початков, без метелки с одним початком, растения с различными степенями мужской и женской стерильности, с измененным цветом и качеством эндосперма (мутации типа sugary). При этом обращают на себя внимание следующие особенности:
1. Расширение спектра генетической изменчивости при воздействии 6МП+ЛИ на пыльцу, с последующим опылением, по отношению к воздействию 6МП+ЛИ на проростки. При воздействии на проростки, так же как и на пыльцу, наблюдалось большое количество фенотипических отличий, связанных с количественными признаками. Однако, только при воздействии на пыльцу, с последующим опылением, в М2 наблюдалось значительное число хло-рофильных нарушений.
2. Более широкий спектр фенотипических изменений кукурузы в М2, при обработке пыльцы совместным действием 6МП+АСК+ЛИ, *по отношению к варианту обработки пыльцы 6МП+ЛИ, т.е., без аскорбиновой кислоты. С учетом результатов более ранних исследований, можно предполагать, что АСК, выступая в роли эффективного фотопротектора, действительно снижает угнетающее действие свободных радикалов, возникающих в объеме клетки, что с большей вероятностью приводит к проявлению возникающих изменений ДНК генома.
В Табл.19 приведены результаты завязываемости семян томата после опыления пыльцой, обработанной раздельным и совместным действием сенсибилизатора 6МП и ЛИ (1 = 337 нм). Как видно из результатов, только 2% плодов нормально развиваются и дают семена, при опылении пыльцой, обработанной совместным действием 6МП+ЛИ, хотя количество семян в них снижено, примерно, в 3 раза относительно контроля. При высаживании семян, полученных в М0, в варианте обработке пыльцы 6МП+ЛИ в грунт, в условиях тепли-
цы, достоверных фенотипических отличий растений, выращенных из этих семян, по отношению к контролю, не обнаружено. Представляется вероятным, что это связано с рецессивным проявлением мутаций, обнаружить которые можно будет при анализе последующих поколений.
Таблица 19
Вариант обра- Проведено Завязалось Развилось Среднее
ботки пыльцы опьиений, плодов, нормальных Количество
кол-во кустов количество плодов, давших семена семян в плоде
Контроль 30 21 21 74
ЛИ 30 25 24 82
ПС 30 7 5 63
ПС+6МП 30 5 5 58
ПС+ЛИ 30 12 10 71
ПС+6МП+ЛИ 150 6 3 26
Таким образом, впервые получены генетически измененные
формы растений кукурузы в поколениях М2 и М3 и льна в поколении
*
М2 при обработке проростков совместным действием сенсибилизатора 6МП и лазера ЛГИ-21. Генетически измененные формы растений отличаются размером и формой куста, количеством и состоянием листьев, темпами развития, хлорофильными нарушениями, а также состоянием репродуктивной системы, что связано с частичной или полной стерилизацией. Возникновение наследственно измененных форм растений связано с синергическим эффектом этих воздействующих факторов, так как ни в одном варианте раздельного воздействия сенсибилизатора и ЛИ, наследственно измененных форм растений не обнаружено. Впервые получены наследственно измененные в М2 формы растений кукурузы, в результате опыления пыльцой, обработанной совместным действием 6МП+ЛИ. Причем, использование выявленного фотопротектора АСК привело к расширению спектра генетических изменений в варианте 6МП+АСК+ЛИ.
Заключение.
Таким образом, проведенные на молекулярном, клеточном и организменном уровнях исследования, подтверждают высокую мутагенную активность системы сенсибилизатор-лазер, в результате проявления синергического эффекта, возникающего при совместном воздействии на геном растений сенсибилизаторов и лазерного излучения. В работе выявлен эффективный прижизненный сенсибилизатор 6МП, эффективный прижизненный фотопротектор АСК, раскрыты основные закономерности и условия проявления синергического эффекта совместного действия сенсибилизаторов и лазерного излучения. Установлена преемственность и взаимозависимость результатов, по модификации генетического аппарата растений, начиная с воздействия на препараты ДНК и заканчивая воздействием на высшие растения. Продемонстрированы возможности и достоинства предлагаемого направления индуцированного мутагенеза, к которым, прежде всего, следует отнести:
1. Специфичность воздействия именно на геном клетки;
2. Возможность адаптации метода применительно к любому растительному объекту;
3. Возможность повышения избирательности метода, вплоть до сайт-специфичности, т.е., адресного воздействия на выбранную область генома.
4. Технологическая доступность метода для применения в широкой практике.
Автор выражает надежду, что метод совместного воздействия сенсибилизаторов и лазерного излучения, найдет свое место в арсенале средств индуцированного мутагенеза, а его применение в селекционной практике выявит новые достоинства и возможности.
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ:
1. Совокупность проведенных исследований на молекулярном, клеточном и организменном уровнях организации живой материи, позволяют утверждать о перспективности совместного воздействия сенсибилизаторов и лазерного излучения, как возможного направления индуцированного мутагенеза.
2. Разработанные оригинальные методики позволили выявить вещества 6-меркаптопурин и хлорохин, до сих пор в качестве сенсибилизаторов, не применяемые. Среди них, сенсибилизатор 6-меркаптопурин, по эффективности фрагментации ДНК при совместном воздействии на препараты ДНК б-меркаптопурина и лазера ЛГИ-21 (X = 337 нм), не имеет известных на сегодняшний день аналогов.
3. На примерах выявления сенсибилизаторов 6-меркаптопурина и хлорохина, изучения их сенсибилизирующих свойств, а также условий их использования в системах in vivo, продемонстрирована возможность выявления и применения по предложенным методикам сенсибилизаторов для любых лазеров, что делает новое направление индуцированного мутагенеза, посредством совместного воздействия сенсибилизаторов и лазерного излучения, наглядным и доступным для широкого применения в практике.
4. На молекулярном, клеточном и организменном уровнях установлено наличие мутагенного эффекта при совместном действии сенсибилизаторов и лазерного излучения на растительные объекты.
5. Доказано, что при обработке проростков кукурузы и льна сенсибилизаторами и лазерным излучением, только в варианте совме-
стного воздействия сенсибилизаторов и ЛИ в М2 и М3 наблюдается появление генетически измененных форм растений.
6. Доказано, что при опылении кукурузы пыльцой, обработанной сенсибилизаторами и лазерным излучением, только в варианте совместного воздействия на пыльцу сенсибилизаторов и ЛИ в М2 наблюдается появление генетически измененных форм растений.
7. Обнаружено достоверное увеличение числа ХА(%) и изменение спектра ХА в клетках апикальной меристемы корешков кукурузы, обработанных совместным действием сенсибилизаторов и ЛИ.
8. Зафиксировано достоверное снижение числа хромосомных аберраций в клетках меристемы корешков кукурузы, индуцируемых совместным действием сенсибилизатора и лазерного излучения, при использовании аскорбиновой кислоты в качестве прижизненного «тушителя радикалов». Впервые, для оптических квантовых генераторов была доказана возможность применения аскорбиновой кислоты в качестве фотопротектора.
9. По предложенной методике, произведены расчеты и определены количества молекул сенсибилизаторов 6МП и ЕШг, вступивших в прижизненное комплексообразование с ДНК генома клеток апикальной меристемы корешков кукурузы.
10. Подтвержден эффект стимулирования прорастания пыльцы томата и кукурузы малыми дозами лазерного излучения и обнаружен эффект ингибирования прорастания пыльцы томата и кукурузы, после воздействия стимулирующих малых доз лазерного излучения и выдерживания пыльцы в течение одного часа перед внесением в питательную смесь.
11. Обнаружено, что при прорастании пыльцы в ПС, с добавленными сенсибилизаторами, миграция основного количества молекул сенсибилизаторов в пыльцевые зерна, происходит в течение первой минуты замачивания.
12. Обнаружен эффект нелинейного снижения прорастания пыльцы кукурузы и томата, в зависимости от времени выдерживания пыльцы в ПС, с добавленными сенсибилизаторами, перед воздействием лазерным излучением.
13.Зафиксировано достоверное, прижизненное увеличение числа однонитевых разрывов в ДНК пыльцы при совместном воздействии на пыльцу 6МП и ЛГИ-21.
14. Обнаружена возможность защиты экзогенного генетического материала от гидролитического расщепления нуклеазами прорастающей пыльцы за счет использования молекул-интеркаляторов.
15. Сделан вывод о перспективности систем ЛГИ-21-6МП (+АСК, X = 337 нм) и пикосекундный лазер-АО (+АСК, X = 532 нм) для прижизненного индуцирования разрывов ДНК в системах in vivo, и о непригодности лазеров УФЛ-1 (X = 632 нм) и ЛТИПЧ-8 (А. = 532 нм) для индуцирования генетической изменчивости у растений совместно с сенсибилизаторами 6МП, XJI, EtBr, АО.
РЕКОМЕНДАЦИИ:
1. Рекомендовать метод совместного воздействия сенсибилизаторов и лазерного излучения для внедрения в практику, как перспективное направление индуцированного мутагенеза.
2. Рекомендовать разработанные методики по выявлению сенсибилизирующих веществ для любых лазеров и изучению возможностей прижизненного использования выявленных сенсибилизаторов в системах in vivo, применительно к конкретному объекту воздействия.
3. При индуцировании мутаций растений рекомендовать производить обработку проростков на ранних стадиях развития, обеспечивая максимальное освобождение оптического пути для попадания лазерного излучения в инициальные клетки.
4. Рекомендовать метод опыления растений пыльцой, обработанной совместным действием сенсибилизаторов и лазерного излучения.
5. Рекомендовать время выдержки пыльцы в ПС с добавленным сенсибилизатором перед воздействием ЛИ, как составляющее (40-60)% от общего времени прорастания пыльцы.
6. Для усиления избирательности индуцируемых мутаций у растений рекомендовать впервые выявленную в качестве фотопротектора аскорбиновую кислоту.
7. Рекомендовать, при разработке систем лазер-сенсибилизатор для воздействия на конкретные растительные объекты использовать импульсные лазеры с длиной волны излучения X > 300 нм и мощностью в импульсе Рм > 107 Вт/м2.
8. Рекомендовать для использования в селекционной практике систему 6МП-ЛГИ-21 (+-АСК, X = 337 нм), показавшую высокую му-
тагенную активность при воздействии на проростки растений и на пыльцу с последующим опылением.
9. Рекомендовать проведение испытаний на растениях в условиях in vivo системы АО-пикосекундный лазер (+АСК, X = 532 нм), как показавшей высокую эффективность при фрагментации ДНК, в условиях in vitro.
Ю.Рекомендовать использование в практике предложенной методики оценки эффективности системы сенсибилизатор-лазер, по вероятностям ей] и CÜ2 индуцирования однонитевых и двунитевых разрывов ДНК одной молекулой сенсибилизатора, вступившей в комплексообразование с ДНК за одну секунду, что позволило бы при пользовании метода в практике создать единую методологию оценки самых разных систем сенсибилизатор-лазер, при воздействии на различные растительные объекты.
1 ¡.Рекомендовать использование молекул-иЬтеркаляторов для защиты экзогенного генетического материала от нуклеаз прорастающей пыльцы при трансформации растений, посредством введения экзогенного генетического материала в прорастающие пыльцевые зерна.
12.Рекомендовать ознакомиться с результатами работы организациям, работающим в области экологической генетики и генетической безопасности, в частности, Институту Общей генетики им. Вавилова Н.И. РАН, Российскому мутагенному обществу при этом институте, а также целому ряду институтов и лабораторий, занимающихся проблемами изучения генетических последствий загрязнения окружающей среды.
ИЗЛОЖЕНИЕ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ В ПУБЛИКАЦИЯХ:
1. Пащенко В.М., Патент 1Ш, № 2007908 С1, А 01 Н 1/04 «Сенсибилизатор-интеркалятор», 1992, Москва;
2. Пащенко В.М., Патент 1Ш, № 2002406 С1, А 01 Н 1/04 «Способ получения мутаций растений», 1993, Москва;
3. Бурилков В.К., Чесноков Ю.В., Пащенко В.М., Патент ЯД № 2037291 С1, А 01 Н 1/04
«Способ образования одно-и двунитевых разрывов в ДНК и индуцирования хромосомных аберраций у кукурузы», 1995, Москва;
4. Клейменов Э.В., Пащенко В.М., Патент 1Ш № 2094385, «Способ
опреснения воды», 1997, Москва. »
5. Пащенко В.М., Патент 1Ш № 96120570, «Способ трансформации растений», приоритет от 23.10.1996, Москва; положительное решение от 08.04.1998.
6. Пащенко В.М., Новикова Н.Н., Патент 1Ш № 97121025, «Способ трансформации растений», приоритет от 02.12.1997, Москва; положительное решение от 28.05.1998.
7. Клейменов Э.В., Пащенко В.М., Мишина Т.О., Патент ГШ № 97121024/25, «Способ опреснения воды», Москва; положительное решение от 07.05.1998.
8. Пащенко В.М., Бурилков В.К., Лысиков В.Н., «Совместное действие красителей-сенсибилизаторов и ЛИ на митотические клетки кукурузы», В кн: Сборник трудов Всес. научн. конф. «Экологическая генетика растений, животных, человека», 1991, Кишинев, с.55-56.
9. Пащенко В.М., «Мутагенный эффект действия сенсибилизаторов-интеркаляторов и ЛИ на растения», В кн: Сборник трудов «Актуальные проблемы физиологии растений и генетики», 1992, Киев, с. 122.
Ю.Пащенко В.М., Чесноков Ю.В., Бурилков В.К., Лысиков В.Н., «Эффекты совместного действия УФ ЛИ и красителей-сенсибилизаторов на прорастающую пыльцу», //Известия АН РМ, сер. Биологические и химические науки, 1992, № 5, Кишинев, с. 19-24.
11.Чесноков Ю.В., Пащенко В.М., «Транспорт экзогенной ДНК посредством прорастающей пыльцы», В кн: Сборник трудов IV съезда МОГиС, 1992, Кишинев, с.50.
12.Пащенко В.М., Бурилков В.К., Чесноков Ю.В., «О возможном механизме взаимодействия ЛИ с комплексом ДНК-6-меркаптопурин», //Известия АН РМ, сер. Биологические и химические науки, № 1, 1993, Кишинев, с.33-36.
13.Чесноков Ю.В, Пащенко В.М., «Ингибирование нуклеаз прорастающей пыльцы посредством интеркаляторов», //Биополимеры и клетка АН Украины, № 1, 1994, Киев, с. 30-33.
14.Burilkov V.K., Paschenko V.M., Lysikov V.N., «Mutagenic effects of laser radiation and 6-mercaptopurine on seedlings», //Maize genetics cooperation. Newsletter, U.S. Department of Agriculture University of Missouri, № 68, 1994, p.50-51.
15.Пащенко B.M., Басова И.Н., «Мутагенный эффект совместного действия сенсибилизаторов и лазерного излучения на растения», В кн: Сборник трудов по агрономии с/х ВУЗов России, Рязань, 1995, с.98-99.
16.Пащенко В.М., Басова И.Н., «Новые средства экспериментального мутагенеза», В кн: Сборник научных трудов специалистов аг-ропром. комплекса России, Рязань, 1996, с. 253-256.
17.Басова И.Н., Пащенко В.М., «Фотомодификация геномной ДНК кукурузы методом двухквантовой афинной модификации: цито-генетическая оценка», В кн: Сборник трудов конференции //Materialele Simpoziomului international «Problemele si perspectives radioecologiei in República Moldova», Chisinau, 1996, p.63.
18.Basova I.N., Pashenko V.M., «Action of method to produce maize mutations using the combined laser irradiation and sensitizers»,//Maize and Sorghum EUCARPIA, 18 Conference on genetics, biotechnology and breeding of maize and sorghum, Thessaloniki, Greece, 1996,p.l87.
19.Basova I.N., Pashenko V.M., «Meristem cells of maize rootlets cytogenetic assessment of sensitizer and laser irradiation effects on»,//Maize and Sorghum EUCARPIA, 18 Conference on genetics, biotechnology and breeding of maize and sorghum, Thessaloniki, Greece, 1996, p.411.
20.Новикова H.H., Пащенко B.M., «Изучение механизмов передачи световой энергии лазерного излучения для систем лазер-сенсибилизатор», В кн: Сборник трудов научных сотрудников ВУЗов РФ, Рязань, 1997, с. 108-111.
21.Burilkov V.K., Paschenko V.M., Lysikov V.N., «Mutagenic effects of laser radiation and 6-mercaptopurine on maize seedlings»//Maize genetics cooperation. Newsletter, U.S. Department of Agriculture University of Missouri, № 71, 1997, p.65.
22.Пащенко B.M., Новикова H.H., «Соотношение однонитевых и двунитевых разрывов в ДНК, при воздействии на комплексы ДНК-сенсибилизатор лазерным излучением с разной интенсивно-
стью», Тез. докл. в сборнике 10-й научно-практической конференции вузов Поволжья и Предуралья, Чебоксары, 1998, с. 116-
23.Пащенко В.М., Новикова H.H., Лысиков В.Н., «Возможные механизмы индуцирования однонитевых и двунитевых разрывов ДНК посредством совместного воздействия сенсибилизаторов и лазерного излучения», //Биофизика, 1998,3-4 с, (в печати)
24.Пащенко В.М., Лысиков В.Н., «Возможности сенсибилизированного фотомутагенеза по индуцированию генетической изменчивости у растений», //Радиационная биология и радиоэкология, 1998, 4-6 с, (в печати).
117.
-
Пащенко, Василий Михайлович
-
доктора биологических наук
-
Рязань, 1998
-
ВАК 06.01.14
- Мутагенный эффект совместного действия сенсибилизаторов и лазерного излучения на растения
- Молекулярные механизмы деструктивного и защитного действия оптического излучения на микроорганизма
- Оптические методы исследования фотобиологических реакций высших и низших растений
- ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ВЫСШИХ И НИЗШИХ РАСТЕНИЙ
- Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процессы роста и развития в растительной ткани
