Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение биохимических показателей сыворотки крови у лабораторных животных при введении наночастиц металлов per os

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изменение биохимических показателей сыворотки крови у лабораторных животных при введении наночастиц металлов per os"

На правах рукописи

ДУДАКОВА ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА

ИЗМЕНЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СЫВОРОТКИ КРОВИ У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ВВЕДЕНИИ НАНОЧАСТИЦ

МЕТАЛЛОВ PER OS

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 МАЙ 2G12

Ростов-на-Дону 2012

005016697

Работа выполнена на кафедре биохимии государственного бюджетного

образовательного учреждения высшего профессионального образования

«Саратовский государственный медицинский университет

им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Бородулин Владимир Борисович (г. Саратов).

доктор биологических наук, профессор Колмакова Татьяна Сергеевна (г. Ростов-на-Дону);

доктор биологических наук, профессор Волжина Надежда Григорьевна (г. Ростов-на-Дону).

ГБОУ ВГЮ «Волгоградский Государственный Медицинский Университет» Минздравсоцразвития России

(г. Волгоград).

Защита состоится «21» мая 2012 г. в 13-00 час, на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 по биологическим наукам в НИИ Нейрокибернетики им. А.Б. Когана ЮФУ (344090, г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/1, акт. зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУ ВПО «Южный Федеральный Университет» (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан « 0 »й/ЬелР 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, канд. биол. наук

Асланян Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Использование наночастиц находит широкое практическое применение в различных областях химии, биологии, экологии. Нанопорошки металлов, полученные различными методами, могут применяться в качестве источников микроэлементов в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве.

Особое внимание уделяется исследованию действия на организм нанонорошков биогенных металлов, в частности меди, цинка, железа, биологическая ценность которых определяется многогранностью функций в сложных биохимических процессах и активным участием в клеточном метаболизме, обеспечивающем нормальное функционирование организма. (Арсентьева И.П., 2008; Глущенко H.H., 2007; Давронов К.С., 2006).

Использование наночастиц несет не только несомненные преимущества, но и потенциальную опасность вредного воздействия на здоровье человека и природные экосистемы (Колесниченко A.B. и др., 2008). Взаимодействие наноструктур с такими биологическими компонентами, как молекулы нуклеиновых кислот, белков и клетками в целом, приводят к их уникальному распределению в тканях организма, возможному иммунному ответу и изменениям в метаболизме (Fischer Н.С., 2007; Geze А., 2007; Hall J.B., 2007; Jain Т.К., 2008; Zieziulewiez Т.J., 2003).

Цель работы. Целью данной работы явилось изучение действия наночастиц железа, меди, цинка и сплава данных металлов при их введении per os на обменные процессы у лабораторных животных.

Задачи исследования:

1) Изучить дозозависимые эффекты влияния наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [Fe Cu Zn] при их пероральном введении на углеводный, белковый и липидный обмены у лабораторных животных.

2) Провести сравнительный анализ действия исследуемых наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [FeCuZn], введенных пероральпо, на метаболизм у лабораторных животных.

3) Изучить безопасность перорального введения наночастиц железа, меди, цинка и сплава данных металлов путем оценки их цитогенетического эффекта и влияния на морфологию органов у лабораторных животных.

Научная новшна. Впервые исследовано влияние наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [Fe Cu Zn] в концентрации 0,05-5,0 мг/кг при пероральном введении лабораторным животным для оценки безопасности применения наночастиц в качестве биологически активных добавок. Комплексное использование биохимических, цитогенетических и морфологических методов анализа позволило выявить негативное влияние наночастиц металлов при их пероральном введении на организм лабораторных животных.

Впервые проведен сравнительный анализ действия наночастиц металлов на

изменение активности тканевых ферментов и на концентрацию метаболитов, характеризующих состояние белкового, липидного и углеводного обменов в сыворотке крови у лабораторных животных.

Установлено, что наночастицы железа в большей степени, чем другие исследуемые наночастицы, вовлекались в обмен углеводов и нарушали процессы утилизации глюкозы клетками. Введение наночастиц сплава металлов [Ре Си в диапазоне концентраций 0,05-5,0 мг/кг оказывало выраженное биологическое действие на обмен белков.

В воздействии исследуемых наночастиц металлов на организм лабораторных животных отслежен дозозависимый эффект: влияние на протекание биохимических процессов максимально при введении наночастиц в концентрациях 1,25-2,5 мг/кг.

Выявлено, что введение наночастиц пероралыю вызывало увеличение активности тканевых ферментов в сыворотке крови, что свидетельствует о цитолитическом действии металлов. Полученные данные характеризовали действие наночастицы исследуемых металлов как токсическое в отношении органов и тканей.

Установленные с помощью биохимических методов изменения активности тканевых ферментов под влиянием наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [РеСигп] подтверждены изменениями морфологии органов белых мышей. Впервые показано, что основными органами-мишенями для токсического действия наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [Бе Си 2п] при их попадании в организм пероралыю являлись печень и почки, что обусловлено участием данных органов в процессе детоксикации и выведении ксенобиотиков. Выявлен цитогенетический эффект воздействия данных наночастиц металлов на организм лабораторных животных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Влияние наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов ре Си Zn] на клеточный метаболизм у лабораторных животных определяется видом наночастиц и имеет дозозависимый эффект.

2. Введение наночастиц железа, меди, цинка и сплава [Ре Си Ъп\ в концентрации 0,05-5,0 мг/кг лабораторным животным пероралыю оказывает влияние на обменные процессы, характеризующееся нарушением метаболизма глюкозы по аэробному пути и накоплению в крови животных пировиноградной кислоты (ПВК) и лактата и усилением процессов распада белков.

3. Наночастицы железа, меди, цинка и сплава [РеСи2п] оказывают цитолитическое действие на органы лабораторных животных, проявляющееся в увеличении активности клеточных ферментов в сыворотке крови: креатинфосфокиназы (КФК), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ), гаммаглутамилтрансферазы (ГГТ).

4. Введение наночастиц железа, меди, цинка и сплава [Ре Си 7,п] лабораторным животным способствует развитию патологических процессов в печени и почках и появлению клеток с микроядрами.

Научно-практическая значимость. Проведенные биохимические исследования позволяют существенно расширить представления о влиянии наночастиц металлов: железа, меди, цинка и сплава [Fe Си Zn], введенных per os, на обменные процессы (углеводный, липидный и белковый), протекающие в организме лабораторных животных и создают предпосылки для дальнейшего изучения их механизма действия на организм человека. Установлено, что действие наночастиц на организм определяется их качественным составом: наночастицы железа оказывали влияние на углеводный обмен, наночастицы сплава металлов [Fe Си Zn] - на обмен белков.

Полученные данные могут быть использованы для оценки адекватности лечения при отравлении данными металлами и дальнейшего создания антидотов.

Выявлены дозозависимые эффекты воздействия наночастиц исследуемых металлов, которые дают возможность определять меры предосторожности при работе с данными частицами. Комплексными исследованиями активности клеточных ферментов, являющихся индикаторами цитолиза, и морфологии органов лабораторных животных установлены токсические аспекты действия наночастиц железа, меди, цинка и сплава данных металлов в отношении печени и почек. Полученные данные представляют интерес для оценки развития возможных патологий при применении наночастиц металлов, в частности, железа, меди, цинка, в качестве пищевых добавок и лекарственных средств, а также позволят разработать методы профилактики при отравлении данными наночастицами.

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе на кафедре биохимии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Миндравсоцразвитпя России.

Апробация результатов исследования. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на международной научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2007 г.); научно-практической конференции студентов и молодых ученых Саратовского Государственного Медицинского Университета с международным участием: «Молодые ученые -здравоохранению региона» (Саратов, 2008, 2009, 2010, 2011гг.); VII межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2008 г.); VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ и II Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 2009 г.); всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009 г); всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2009» (Москва, 2009 г.); межрегиональной научно-практической конференции «Инновации в медицинском образовании и науке» (Саратов, 2010 г.); всероссийском молодежном форуме «Инновационное творчество» (Селигер, 2010 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 работы, 4 из которых изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Общий объем публикаций составил 2,96 п.л., личный вклад в работу - 75 %.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 101 отечественный источник и 59 иностранных. Результаты исследования представлены в 8 таблицах. Работа иллюстрирована 74 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовались высокодисперсные нанопорошки металлов: железа, меди, цинка и сплава этих металлов [Fe Zn Cu], синтезированные на плазмохимическом комплексе филиала Федерального Государственного Управления РФ «1 осударственный научно- исследовательский институт химии и технологии элементоорганических соединений» (ФГУП РФ ГНЦ ГНИИХТЭОС г. Москва, лаборатория №33). Средний размер наночастиц колебался в пределах 5080 нм. Процентное содержание элементов в сплаве [Fe Zn Cu]: Fe - 25%, Zn -15%, Cu - 60%.

Исследования были выполнены на 170 белых беспородных мышах. Контрольные и экспериментальные группы формировались из 2-х месячных самцов весом 20±3 г. Мыши находились в стандартных условиях с естественной сменой освещения с соблюдением стандартного рациона питания. У всех животных был свободный доступ к пище и воде.

Экспериментальных животных распределили на 4 группы. Первая экспериментальная группа получала нанопорошок железа; вторая группа - меди; третья группа - цинка; четвертая группа - сплава [Fe Zn Cu],

В зависимости от суточной концентрации вводимого нанопорошка, каждая экспериментальная группа состояла из четырех подгрупп по 10 мышей в каждой. Первой подгруппе вводили 0,05 мг/кг, второй - 1,25 мг/кг; третьей - 2,5 мг/кг, четвертой - 5,0 мг/кг нанопорошка соответствующего металла.

Контрольной группе животных (10 мышей) вводили растительное масло в количестве 10 мкл без нанопорошков металлов.

Выбранные концентрации наночастиц не превышали максимальных переносимых доз для данных металлов (Venugopal В., 1978). Все нанопорошки вводились в течение 6 дней в виде масляных суспензий в количестве 10 мкл однократно в сутки перорально с использованием зонда.

Предварительно суспензии наночастиц размешивались на магнитной мешалке для предотвращения оседания частиц и образований конгломератов. По окончании эксперимента производили забор крови и органов. Экспериментальная часть работы была выполнена в соответствии с протоколами Женевской конвенции и принципами надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт Российский Федерации ГОСТ Р 53434-2009; Карпищенко Н.Н., 2010).

Определение биохимических показателей крови проводилось с помощью полуавтоматического биохимического анализатора «HOSPITEX» Screen master, оборудованного термостатом, фотометром и микропроцессором. Для работы на анализаторе использовались стандартные наборы реактивов производства ЗАО «Диакон-ДС». В сыворотке крови определяли концентрации метаболитов, характеризующих:

- обмен углеводов: глюкозу (глюкозооксидазным методом), лакгат (лактатоксидазным методом), ПВК (методом Умбрайта);

- обмен белков: общий белок (биуретовым методом), альбумин (по реакции с бромкрезоловым зеленым), мочевину (уреазным глутаматдегидрогеназным методом), креатинин (по реакции Яффе);

-обмен липидов: общий холестерин (холестеролоксидазным методом);

-пигментный обмен: общий билирубин (по реакции с дихлоранилином), прямой билирубин (по реакции с диазотированной сульфаниловой кислотой);

- активность индикаторных ферментов: АсАТ, АлАТ, лактатдегидрогеназы (ЛДГ), КФК. Методы являются унифицированными (Карпищенко А.И., 1999).

Обработка материала для исследования морфологии органов проводилась путем фиксации фрагментов органов, обезвоживания и заливки в парафин по схеме Волковой - Елецкого. Окрашивание производилось по методу Романовского (Микроскопическая техника, 1996).

Оценка цитогенетического воздействия нанопорошков металлов проводилась с использованием микроядерного теста в два этапа: приготовление клеточных суспензий и анализ полученного материала с подсчетом микроядер. Получение клеточных суспензий проводилось по «прямому» методу (Карпищенко А.И., 1999). Далее проводилась окраска препаратов по метод}' Романовского-Гимзе (Саркисов Д.С., 1996). Пригодными для анализа считались препараты с хорошо расправленными клетками (Буторина А.К., 2002).

Статистическая обработка данных проводилась согласно общепринятым методам (Реброва, 2002) с использованием пакета программ Statistica v7.0.61.0. О достоверности отличий учитываемых показателей контрольной и опытной групп судили по величине t - критерия Стыодеита и р - уровню значимости. При р<0,05 различия считались статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты биохимических исследований представлены в таблицах 1-2.

Таблица 1.

Изменение биохимических показателей сыворотки крови у мышей под влиянием паночастнц металлов

Биохимический показатели сыворотки крови

Исследуемьк концентраци наночастиц металлов Глюкоза, ммоль/л Лактат, ммоль/л ПВК, ммоль/л Общий белок, г/л Альбумин, г/л Мочевина, ммоль/л Креатинин, мкмоль/л Холестерш: ммоль/л Общий билирубю мг/дл Прямой билирубин, мг/дл Непрямой билирубин мг/дл

М±ш М±ш М±т М*т М±т М±т М±т М±ш М*т М±т М±т

Контроль

[7,12±0,76 |22,87±1,62 |0,11±0,01 1117,74±12,00 |58,08±0,27 |3,53±0,06 | 165,30±13,82 | 4,08±0,35 11,65±0,02 | 1,02±0,02 |0,63±0,01

Железо

0,05 мг/кг 14,09±0,67* 5,20±0,63* 0,71±0,01" 143,80*0,66* 57,20*0,59* 9,14±0,14*] 292,20*5,74*1 4,20*0,21 3,93*0,06* 1,85*0,01* 2,09*0,05*

1,25 мг/кг 21,74±0,69* 15,20±0,29* 0,84±0,01" 153,80*8,11* 144,00*2,65 6,07*0,32* 338,00±9,98* 3,34*0,09 4,20*0,07* 1,66*0,01* 2,54*0,06*

2,5 мг/кг 19,84±1,03* 14,84±0,69* 0,99*0,01* 157,00±5,38* 70,70±1,40* 5,81±0,29* 274,50±10,66' 5,49±0,36* 3,94*0,07* 1,19*0,01* 2,75±0,06*

5,0 мг/кг 17,22±0,35* Э,84±0,39* 1,29*0,03' 180,50±2,30* 77,90±3,83* 7,45*0,26* 247,70±7,38* 4,50*0,22 3,89*0,03* 1,58±0,03* 2,31*0,04*

Медь

0,05 мг/кг 9,28±0,80 24,55±0,75 0,48±0,0Г 151,98*8,88* 56,00±4,80 3,08*0,28 414,20*4,07* 7,29*0,51* 3,70*0,27* 1,30*0,03* 2,40*0,24*

1,25 мг/кг 7,88±0,21 16,87±0,43* 0,91*0,01' 153,40*9,24* 70,80±6,20 2,85±0,17* 392,80*7,99* 7,89*0,67* 4,18*0,29* 1,77*0,25* 2,45±0,15*

2,5 мг/кг 8,61±1,00 22,67±0,81 0,99*0,01* 135,06*7,34 55,40*2,90 3,76*0,29 421,33*1,94* 6,70*0,59* 3,89±0,08* 1,07*0,04* 2,82±0,06*

5,0 мг/кг 7,75±0,73 24,55±0,79 1,00*0,03*« 194,29± 18,43* 58,57±7,39 2,20±0,13* 130,37*5,04* 8,78*0,2 Н 3,57±0,39* 1,72*0,39* 1,85*0,16*

Цинк

0,05 мг/кг 5,94±0,27 8,22±0,31* 0,20*0,01 132,71±5,75 59,60±0,96 3,13±0,27 173,50±4,22 5,20±0,48 1,16*0,01* 0,07*0,01* 1,10±0,01*

1,25 мг/кг 12,01±1,15* 8,74±0,29* 0,74*0,011 262,53*11,25^ 51,70*1,26 4,6б±0,27* 188,50±1,95 3,48*0,03 3,13±0,01* 0,37±0,01 * 2,78*0,01*

2,5 мг/кг 12,05±0,70* 14,52±0,32* 0,05*0,01* 286,16*8,45* 51,00*1,22 4,23±0,48* 144,00±4,64 5,95*0,30* 3,30*0,03* 0,37*0,01* 2,91 ±0,03*

5,0 мг/кг 16,40±0,40* 9,73±0,74* 1,01*0,03" 300,65*7,34* 59,10±1,13 б,41±0,11* 156,00*6,21 4,99±0,39 3,67*0,04* 1,51±0,02* 2,16±0,04*

Сплав [Ге Си 7л]

0,05 мг/кг 10,99±0,12* 13,12±0,13* 0,30*0,01* 342,00*5,28* 175,70*1,78 2,38*0,02* 231,90±2,51* 5,39±0,06* 3,53*0,04* 1,41 ±0,02* 2,12±0,03*

1,25 мг/кг 21,82±0,25* 13,09±0,13* 0,91*0,01^ 298,00*3,00* 128,60*2,031 1,33±0,10* 158,60*1,82 8,65±0,11 ^ 1,58*0,02* 1,03*0,02* 0,54*0,02*

2,5 мг/кг 13,18±0,17* 18,69±0,12* 0,71*0,ОН 233,00*3,19* 79,40*1,17* 1,52±0,11* 129,20±1,54* 2,75*0,12* 2,07±0,02* 1,07±0,02* 1,00±0,03*

5,0 мг/кг 13,71±0,12* 11,78±0,10* 1,14*0,04' 233,20± 1,78* 138,30*5,64 1,78±0,06* 207,90*3,62* 5,14*0,12* 3,67*0,04* 2,5б±0,06* 1,11±0,04*

Примечание:

- статистически достоверные отличия (р<0,05) по сравнению с контрольной группой животных

Таблица 2.

Изменение активности ферментов в сыворотке крови под влиянием паночастнц металлов_

Биохимический показатели сыворотки крови

Исследуемые концентрации наночастиц металлов АсАТ, МЕ АлАТ, МЕ лдг, МЕ ГГТ, МЕ КФК, МЕ

М±ш М±т М±т М±ш М±ш

Контроль

|120,00±9,25 | 50,00±2,06 | 2025,00± 53.28 |ЮЗ,22±16,бб| 1290,00±60,88

Железо

0,05 мг/кг 327,00±12,8Г 82,40±0,62* 5312,50±72,88* 115,70±2,95 4636,00±181,00*

1,25 мг/кг 342,50±11,91 = 68,20±3,39* 12887,50±280,10* 131,40±2,99 2981,00±139,07*

2,5 мг/кг 372,50±15,33: 57,90±2,77 13786,50±303,бб* 140,50±1,17* 3474,00±46,05*

5,0 мг/кг 517,50±6.34* 56,80±2,76 14119,00±152,58* 135,00±2,98 3488,00±67,71*

Медь

0,05 мг/кг 142,70±10,15 66,00±4,27* 2414,20±27,27* 131,00±5,04 2478,60± 103,72*

1,25 мг/кг 112,40±2,93 78,40±3,61* 2770,40± 109,20* 155,50±6,43* 2412,00±58,21*

2,5 мг/кг 110,50±2,08 102,70±9,04* 3109,60±141,65* 175,00±1,29* 2552,00±61,46*

5,0 мг/кг 197,14±18,04' 103.29'6,03* 2884,57±226,76* 124,29±4,14 2562,57±24,51*

Цинк

0,05 мг/кг 138,90±8,46 70,90±4,18* 1935,40±72,77 132,00±3,59 1200,40±48,46

1,25 мг/кг 153,00±8,71* 54,80±2,17 2113,30±137,03 129,50±4,68 3498,80±42,70*

2,5 мг/кг 129,40±4,29 122,00±4,42* 2259,90± 124,62 140,00±3,25* 3653,90±10,84*

5,0 мг/кг 155,60±9,24* 69,00±6,74* 2025,40± 148,06 159,50±3,02* 2803,40±79,95*

Сплав [Ее Си Ъл]

0,05 мг/кг 283,60±2,95* 80,70±1,10* 2854,40± 16,87* 114,50±2,17 1264,90± 11,67

1,25 мг/кг 557,80±4,81* 79,1 (НО,78* 1489,20*10,30* 117,00±1,53 1939,60±23,15*

2,5 мг/кг 683,30±7,84* 243,20±9,07:' 1621,80± 12,62* 123,50±1,30 3247,00± 11,93*

5,0 мг/кг 354,50±2,60* 184,10^2,98' 1929,80±20Д8 126,40±2,18 3041,50±39,88*

Обозначения как в табл. 1.

В ходе проведенного исследования в сыворотке крови были выявлены статистически достоверные изменения (р<0,05) показателей, характеризующих углеводный обмен: увеличение уровня глюкозы и ПВК и снижение концентрации лактата(Рис. 1).

Анализируя полученные данные, было показано, что при введении исследуемых наночастиц в диапазоне концентраций 0,05-5,0 мг/кг обмен углеводов в меньшей мере был подвержен влиянию наночастиц меди. Влияние других наночастиц на углеводный обмен усиливалось в ряду: цинк<сплав [1-'с Си 7п]<желсчо. Наиболее выраженные изменения показателей углеводного обмена наблюдались при введении наночастиц железа в концентрации 1,25 мг/кг и 2,5 мг/кг. Введение наночастиц железа нарушало процесс утилизации глюкозы клетками. Увеличение уровня глюкозы в сыворотке крови экспериментальных животных по отношению к контролю при введении наночастиц железа в концентрации 1,25 мг/кг составляло 205%, при введении наночастиц железа в концентрации 2,5г/кг - 178%. Концентрация лактата в сыворотке крови у животных под влиянием наночастиц железа снижалась на 34% при введении

наночастиц в дозировке 1,25 мг/кг и на 37% - при введении наночастиц в дозе 2,5 мг/кг.

1200,0 юоо.о 800.0 600,0 400.0 200.0

°/о0-0

-200.0

I-1-1-1

* * *

г I: I: I;

Ц Й Й

ь ы ь

| /-. т. ~

Г 1 г| '.г]

Ре

а

ё ё ы

«г.

Си

г.иокоча I лактат

Ф л 4 Кг

Й Й Й Й Й

ь ь Ьз ы ы

•/", 'Г. о "л, «г,

! п I/-; | Ф

«с-*«.

Й Й ь ы

ги пвк

РеС'пгп

Рис. 1. Изменение показателей углеводного обмена под влиянием наночастиц металлов (в % к контролю). - статистически достоверные отличия (р<0,05) по сравнению с контрольными значениями

Увеличение содержания ПВК в сыворотке крови под влиянием наночастиц железа происходило прямо пропорционально увеличению вводимой дозы. Для более полной оценки воздействия наночастиц железа в сыворотке крови мышей была исследована активность ключевого фермента углеводного метаболизма -ЛДГ, катализирующего превращение ПВК в лактат в клетке (Табл. 2). В изменении активности ЛДГ под влиянием наночастиц железа проявлялась закономерность, наблюдавшаяся при исследовании уровня ПВК: увеличение активности ЛДГ происходило прямо пропорционально увеличению концентрации вводимых наночастиц железа.

ЛДГ - внутриклеточный фермент, увеличение активности которого в сыворотке крови может косвенно свидетельствовать о нарушении целостности мембран. Выход ЛДГ в сыворотку крови при введении наночастиц железа способствовал нарушению превращения ПВК в лактат в клетке, поэтому уровень лактата у экспериментальных животных был снижен. Увеличение концентрации ПВК в сыворотке крови могло наблюдаться при двух процессах: усиленном образовании ПВК или нарушении ее использования клеткой. Наблюдавшееся при введении наночастиц железа лабораторным животным явление гипергликемии, свидетельствовавшее о нарушении поступления глюкозы в клетку, выявило, что процесс гиперпродукции ПВК невозможен. Предположение о том, что наночастицы могли встраиваться в систему ферментов митохондриального окисления и нарушать аэробные процессы, также не подтвердилось ввиду несоответствия значений окислительно-восстановительного потенциала Ре°/Ре2^ окислительно-восстановительным потенциалам восстановленной (НАДН*Н) и окисленной формы (НАД^) накотинамиддинуклеотида и восстановленной (ФАДН*Н) и окисленной формы (ФАД*") флавинадениндинуклеотида. В связи с этим, наблюдаемое явление, вероятно, могло быть обусловлено генерацией гидроксильного радикала наночастицами железа в реакциях Фентона и

активацией перекисного окисления липидов (Г10Л) (Кухтина E.H., 1982). Развитие процессов ПОЛ способствовало выходу из поврежденных клеток ЛДГ и ПВК и увеличению их уровня в сыворотке крови. Образование лактата при этом было снижено.

Увеличение уровня холестерина в сыворотке крови как показателя липиднош обмена при введении наночастиц меди и сплава металлов предполагает повреждение мембран (Табл.1).

Влияние наночастиц на обмен белков оценивался по концентрации в крови общего белка и альбуминов и их конечных продуктов - креатинина и мочевины (Рис. 2).

2? 0.0 200.0

обидиП Ле.ток л.ньЛумнп ■ мочевин» и К|№:|Т1ШНМ

Рис. 2. Изменения показателей белкового обмена под влиянием наночастиц металлов (в % к контролю). Обозначения как на Рис. 1.

Было показано, что все исследуемые наночастицы в определенной степени могут оказывать влияние на состояние белкового обмена.

Под влиянием наночастиц, введенных животным перорально, происходило статистически достоверное увеличение концентрации общего белка в сыворотке крови во всех исследуемых группах животных. Наиболее выраженный биологический эффект в отношении белкового обмена оказывали наночастицы сплава металлов [Ре Си 2п]: при введении их мышам в концентрации 0,05 мг/кг увеличение содержания общего белка в сыворотке крови (по сравнению с контролем) составляло 1,9 раза. Введение наночастиц цинка также способствовало значительному увеличению уровня белка в сыворотке крови, при этом максимальное изменение концентрации общего белка по сравнению с контролем (в 1,5 раза) достигалось при введении наночастиц цинка в дозе 5,0 мг/кг.

Содержание альбуминов в сыворотке крови у экспериментальных групп мышей достоверно увеличивалось при введении наночастиц железа и сплава металлов ре Си ¿п] (Табл. 1).

Железо, в отличие от цинка и меди, может входить в состав ферментов митохондриальной цени, а также в состав цис-аконитазы, функционирующей в цикле Кребса. Таким образом, наночастицы, содержащие железо, потенциально

могут ускорять реакции цикла Кребса, направленные на образование аденозинтрифосфата (АТФ) (ЭйхгорнГ., 1978). Образующийся в ходе реакций цикла сукцинил-коэнзим А при этом может использоваться на синтез тема и гуанозинтрифосфата, энергия которого может расходоваться на синтетические процессы, в частности, на синтез белков (Марри Р., 1993). Вероятно, вовлечением в эти процессы можно объяснить увеличение концентрации альбуминов в сыворотке крови под воздействием наночастиц железа и сплава металлов [Ре Си гп] (Табл. 1).

В остальных случаях увеличение уровня общего белка в сыворотке крови лабораторных животных, вероятно, обусловлено увеличением глобулиновой фракции вследствие развития воспалительных и некротических процессов, что было выявлено при анализе гистологических срезов органов.

Увеличение белков в сыворотке крови сопровождалось усилением их распада с образованием компонентов остаточного азота: креатинина и мочевины. Это наблюдалось при введении наночастиц железа и цинка. Максимальное увеличение уровня мочевины наблюдалось при введении наночастиц цинка в дозировке 5,0мг/кг - на 81,6% и наночастиц железа в дозировках 5,0мг/кг и 0,05 мг/кг - на 111% и 159% соответственно.

Снижение концентрации мочевины наблюдалось при введении наночастиц меди и сплава (Ре Си Zn], что, возможно, обусловлено иншбирующим действием данных частиц на ферменты орнитинового цикла, в частности карбамоилфосфатситетазу, путем связывания по сульфшдрильным группам (Торчинский Ю.М., 1977).

Уровень креатинина в сыворотке крови у мышей, которым вводились наночастицы сплава металлов [Ре Си '¿п\, железа и меди, был повышен по сравнению с его содержанием в контрольной группе. Самое значительное увеличение концентрации креатинина наблюдалось при введении медных наночастиц в дозировке 0,05 мг/кг и 2,5 мг/кг - на 150% и 155% соответственно. Увеличение креатинина как продукта деградации креатина можно объяснить усиленным синтезом последнего с целью обеспечения сердечной мышцы макроэргами и адаптации сердца к гипоксии (Рослый И.М., 2003). Вероятно, в связи с этим происходило увеличение во всех исследуемых группах активности КФК - фермента, осуществляющего цикл превращения креатина в креатинфосфат и обратно.

Поскольку концентрация мочевины и креатинина в плазме крови отражает функцию гломерулярного аппарата почек (Назаренко Г.И., 2002), то выявленные изменения позволили предположить повреждения почек, что полностью подтвердилось анализом их морфологии (Рис. 3).

Характер изменений в почках под влиянием исследуемых наночастиц был представлен дистрофией эпителия и выраженным полнокровием, при этом интенсивность выявленных изменений увеличивалась прямо пропорционально концентрации вводимых наночастиц, что, вероятно, обусловлено избыточным накоплением частиц в органе. Выраженное повреждающее действие на почки проявлялось при введении наночастиц сплава металлов [Ре Си Zn] и меди. В

отношении почек медные частицы вызывали гибель клеток проксимальных канальцев, гломерулонефроз, массивный некробиоз (Рис. 3).

(а) (б)

Рис. 3. Изменение морфологии почек под влиянием наночастиц меди в концентрации 2,5 мг/кг (а) в сравнении с контрольной группой (б)

Так как к процессам цитолиза под воздействием свободных радикалов наиболее чувствительны мембраны эритроцитов, то было проведено определение концентрации общего билирубина и его форм: конъюгированной и неконыогированной (Рис.4).

В сыворотке крови в экспериментальных группах (по сравнению с контролем) под влиянием наночастиц происходило увеличение уровня общего билирубина. Максимальные отклонения наблюдались при введении наночастиц железа и меди, при этом самые высокие концентрации билирубина были отмечены при введении дозировки 1,25 мг/кг. Концентрация общего билирубина в данном случае увеличивалась на 154% под влиянием наночастиц железа и на 153% - под влиянием наночастиц меди.

°/о

0.0

* * МУШНЯЫмМ

¡зййййаййТг иййй

а ё ё а I а ё а .5 .ё а ё %

Л!

т общий бн. 111| • « <11111 11|)1111<)11 билирубин непрям«» 6u.iulp.v6uH

Рис.4. Изменения концентрации билирубина под влиянием наночастиц металлов (в % к контролю). Обозначения как на Рис. 1.

Было установлено, что концентрация билирубина в сыворотке крови у подопытных животных увеличивалась за счет обеих форм: прямого и непрямого

билирубина (Табл. 1). Увеличению непрямого билирубина могло способствовать развитие оксидативного стресса в ответ на действие металлов переменной валентности.

Повреждающее действие наночастиц могло распространиться также на мембраны гепатоцитов, результатом которого являлось увеличение концентрации прямого билирубина. Воздействие наночастиц на гепатоциты может осуществляться двумя способами. Активируя процессы ПОЛ, наночастицы способствуют цитолизу клеток желчных капилляров и выходу прямого билирубина в кровь. Второй способ заключается в механической закупорке желчных протоков скоплениями наночастиц, в частности, частиц |Ре Си ¿п], вследствие чего уровень прямого билирубина увеличивается. Анализ гистологических срезов печени у мышей, получавших наночастицы железа и меди, выявил патологические изменения морфологии данного органа: дистрофию гепатоцитов, очаги некрозов, в цитоплазме гепатоцитов, особенно в околососудистых областях, выявлялись скопления наночастиц (Рис. 5).

Рис. 5. Патологические изменения морфологии печени под влиянием наночастиц меди в концентрации 1,25 мг/кг.

О нарушении целостности мембран под влиянием наночастиц металлов может свидетельствовать увеличение активности в крови клеточных ферментов, повышение активности которых является признаком некроза ткани. Для диагностики морфофункционального состояния печени использовалось исследование активности трансаминаз (АсАТ, АлАТ) и ГТТ.

Статистически достоверное увеличение активности АсАТ наблюдалось при введении наночастиц цинка, железа и сплава металлов [Ре Сигп]. Максимальное отклонение от контрольной группы отмечалось под влиянием наночастиц железа и сплава металлов [ТеСигп]. Наиболее выраженное влияние на активность фермента наночастицы сплава металлов [Ре Си Ътх\ проявляли в концентрациях 1,25 мг/кг (увеличение активности АсАТ в 3,6 раза) и 2,5 мг/кг (в 4,7 раза). Активность АсАТ под влиянием наночастиц железа возрастала прямо пропорционально увеличению дозы вводимых наночастиц железа (Рис.6).

Изменение активности АлАТ в сыворотке крови наблюдалось во всех экспериментальных группах. Наиболее значительные сдвиги активности АлАТ происходили при введении наночастиц меди и сплава металлов [Ре Си Введение наночастиц сплава [Ре Си Zn] в концентрации 2,5 мг/кг способствовало увеличеншо активности АлАТ в 3,8 раза, а в концентрации 5,0 мг/кг - в 2,7 раза. Выявленные изменения активности трансаминаз в сыворотке крови у

лабораторных животных под влиянием наночастиц позволили предположить развитие цитолитических процессов под влиянием наночастиц меди в печени и под влиянием наночастиц железа - в миокарде.

500.0

* *

* * * *

100.0 -100.0 У 1 * * II! __* ** дЛ * » ■ II. * 1 ; \\\

Й Й 1 || р Л ы ■ АсАТ Й 1 а и % м Си АлАТ Й и 1 1 • 1 й л ги гт й й й ?; 1 1 и КФК Й Й Й £ % % Ь>< '\-i7w

Рис. 6. Изменение активности индикаторных ферментов сыворотки крови под влиянием наночастиц металлов (в % к контролю). Обозначения как на Рис. 1.

Рост активности трансаминаз в сыворотке крови при введении наночастиц сплава [Ре Си 1п\ позволил предположить, что данные частицы оказывали общетоксическое действие, способствуя развитию патологических процессов в печени и миокарде. Влияние наночастиц сплава металлов ре Си Ъъ\ на активность АсАТ схоже с влиянием на данный фермент наночастиц железа, а на активность АлАТ - с влиянием наночастиц меди.

Определение активности ТТТ в сыворотке крови является диагностическим критерием состояния печени и желчных путей. Повышение активности ГТТ наблюдается при заболеваниях желчевыводящих путей с явлениями обтурации, гепатитах, опухолях и метастазах в печень (Назаренко Г.И., 2002). Увеличение активности ГГТ отмечено под влиянием наночастиц меди в концентрации 2,5 мг/кг - на 69,5%.

Вывод о повреждающем действии исследуемых наночастиц в отношении печени, выявленном с помощью биохимических анализов, был подтвержден изучением морфологии этого органа (Рис.7).

(а) (б)

Рис. 7. Изменение морфологии печени под влиянием наночастиц меди в концентрации 5,0 мг/кг (а) в сравнении с контролем (б).

Общий характер влияния наночастиц на печень представлен выраженным полнокровием, диапедезными кровоизлияниями, явлениями сепарации крови, развитием зернистой и вакуольной дистрофии гепатоцитов. На срезах было выявлено большое количество клеток Купфера, относящихся к ретикуло-эндотелиальной системе, что позволило предположить активацию иммунного ответа на воздействие наночастицами. Изредка нарушалось балочное строение печени.

Повреждающее действие на гепатоциты оказывали все исследуемые наночастицы, но наиболее выраженным повреждающим эффектом обладали наночастицы железа и меди в концентрациях 2,5 мг/кг и 5,0 мг/кг.

Введение наночастиц в организм животных вызывало увеличение ферментов-маркеров поражения миокарда. Увеличение активности КФК в сыворотке крови происходило при введении животным наночастиц цинка и железа, что характеризует данные частицы как токсические в отношении миокарда.

Токсический эффект наночастиц был выявлен также при анализе морфологии легких (Рис.8).

(а) (б)

Рис. 8. Изменение морфологии легких под влиянием наночастиц сплава в концентрации 1,25 мг/кг [Ре Си Zn] (а) в сравнении с контролем (б)

Под влиянием наночастиц в них наблюдалось спадение альвеол, отслоение эпителия, диапедезные кровоизлияния, полнокровие сосудов, изредка -некротические явления (при введении наночастиц меди и сплава металлов ре Си Наночастицы железа в меньшей степени оказывали повреждающее действие на легкие. Это могло быть обусловлено малыми размерами атомного радиуса железа и меньшим размером самих наночастиц (следовательно, не распознаются макрофагами и относительно свободно циркулируют в кровотоке в комплексе с белками плазмы).

Характер выявленных изменений в органах под влиянием нанопорошков металлов зависел от концентрации наночастиц, и механизм повреждающего действия представляется следующим образом. В малых концентрациях наночастицы (в силу своих малых размеров) не распознаются клетками ретикулоэндотелиальной системы и могут взаимодействовать с белками плазмы крови или в свободном состоянии могут проникать внутрь клетки и вступать в реакции с метаболитами с образованием солей. Воздействие таких частиц будет проявляться как действие солей данных металлов (Афонина И.А, 2006).

Увеличение концентрации наночастиц приводит к тому, что они объединяются в конгломераты и распознаются макрофагами, активируя защитные системы организма. К ретикулоэндотелиальной системе отнесены моноциты крови, клетки Купфера печени, ретикулярные клетки кроветворных органов, эндотелиальные клетки капилляров и лимфатических узлов, поэтому основные проявления в ответ на растущую концентрацию наночастиц будут проявляться в увеличении количества макрофагов и повреждении структуры органов (в том числе, селезенки), вырабатывающих и утилизирующих данные клетки.

Значительные изменения в органах (особенно в печени и в легких) под влиянием наночастиц позволили предположить, что они могли обладать повреждающим действием на генетический аппарат клетки, что полностью подтвердилось анализом клеток с микроядрами (Рис. 9).

Рис. 9. Частота появления меток с микроядрами при введении наночастиц металлов по отношению к контролю. Обозначения как на Рис. 1.

В отношении клеток легких наиболее выраженное повреждающее действие на генетический аппарат оказали наночастицы сплава металлов [Ре Си ¿п]. Появление микроядер в данном случае - 3 микроядра на 1000 клеток -наблюдалось с дозировки нанопорошка 0,05 мг/кг и сохранялось при нарастании концентрации наночастиц. Изменения генетического аппарата клеток легких могли быть вызваны тем, что металлы переменной валентности активно участвовали в процессах ПОЛ и способствовали образованию активных форм кислорода, которые оказывали повреждающее действие на ДНК (Владимцева Т.М., 2002). В состав сплава |Ре Си Ъъ\ входят сразу три металла, поэтому генерация активных форм кислорода, вероятно, проходит интенсивнее, и повреждающее действие на процессы клеточного деления более значительно.

В отношении клеток печени наиболее выраженной генотоксической активностью обладали наночастицы меди: при их введении в концентрации 0,05 мг/кг частота появления клеток с микроядрами составляла 2% и сохранялась при увеличении дозировки нанопорошка. Это может свидетельствовать о том, что данные наночастицы интенсивно вовлекались в процессы деления клеточного 1 ядра. Максимальное количество ядер - 50 на 1000 клеток - отмечалось при введении наночастиц меди в концентрации 2,5 мг/кг. Дозировка 5,0 мг/кг

оказывала менее токсический эффект, что может быть обусловлено активированием процессов связывания наночастиц с белками и их дальнейшей элиминацией системой макрофагов.

Сравнительный анализ действия исследуемых наночастиц показал, что наиболее выраженный генотоксический эффект в отношении клеток селезенки и почек характерен для наночастиц меди (Рис. 9). Максимальная частота появления микроядер в селезенке составила 7% при введении дозировки 2,5 мг/кг, в почках -4% при дозировке 0,05 мг/кг.

В результате комплексного использования биохимических, цитологических и морфологических методов было установлено, что в исследуемом диапазоне концентраций наночастиц 0,05-5,0 мг/кг наименее повреждающим действием на организм животных обладали наночастиды цинка, что дает возможность их применения в качестве источника микроэлемента в биологических пищевых добавках. Наиболее выраженным негативным действием при пероральном введении обладали паночастицы железа, меди и сплава металлов [FeCuZn], Данные наночастицы оказывали цитолитическое действие на клетки печени и почек, что, вероятно, определялось пероральным способом введения, а также развитием процессов ПОЛ при попадании в организм.

В присутствии ионов железа (Fe2+, Fe34) и/или меди (Си2+), содержащихся в наночастицах, супероксид-радикал и перекись водорода могли вступать в реакции Фентона и Габера-Вайса и образовывать гидроксильный радикал, являющийся мощным окислителем (Dat J., 2000; Mitteler R., 2002): 02- + Fe+3 (Cu+2) = 02 + Fe+2 (Cif) Fe+2 (Cu1) + H202 = Fe+3 (Cu+2) + HO' + HO" 02" + H202 = HO- + HO" + o2

Образовавшиеся свободные радикалы могли повреждать мембраны клеток, что сопровождалось выходом цитозольных ферментов в кровь (АсАТ, АлАТ, ГГТ), а также нарушали деление клетки, проявлявшееся образованием микроядер.

В отличие от меди, цинк обладает антиоксидантными свойствами, ингибируя процессы ПОЛ на стадии инициирования (Halliwell В., 1990). Кроме того, цинк может оказывать опосредованное влияние на интенсивность ПОЛ, поскольку он входит в активный центр супероксиддисмутазы, регулирующей уровень ПОЛ на стадии инициирования цепей окисления (Глущенко H.H., 2000). Вероятно, этим объясняется меньшее повреждающее действие на организм наночастиц цинка по сравнению с другими исследуемыми наночастицами. Железо может проявлять антиоксидантную (входит в состав каталазы, пероксидазы) и прооксидантную функции (способно к образованию гидроксильного радикала в реакции Фентона), однако его влияние на процессы ПОЛ имеет сложный фазный характер с преобладанием реакций образования свободных радикалов (Кухтина E.H., 1982).

Полученные в данной работе результаты биохимического анализа по влиянию наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов ре Си Zn] на организм лабораторных животных значительно отличались от данных, имеющихся в литературе, по действию солей этих же металлов.

В работах, посвященных изучению биологического действия солей металлов, показано, что воздействие хлорида меди и хлорида цинка проявилось в снижении содержания общего белка, белковых фракций, величины тимоловой пробы (Афонина И.А, 2006). Все экспозиции меди и цинка уменьшали уровень билирубина в сыворотке крови у животных. Кроме того, при введении хлорида цинка отмечалось снижение содержания креатинина и активности АсАТ. Воздействие солей металлов на обменные процессы у лабораторных животных, показанное другими исследователями, принципиально отличалось от действия наночастиц, установленного в данной работе, однако, изменения морфологии органов под влиянием наночастиц коррелировало с действием солей металлов. По имеющимся в литературе данным соли меди и цинка вызывают многочисленные необратимые изменения во внутренних органах, которые проявляются тем выше, чем значительнее была концентрация тяжелого металла. Отмечались развитие дистрофии и явления кровенаполненности почек, мочекислый диатез, дряблость печени, ее жировое перерождение и очаги некроза, воспаление слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, кровоизлияния, изъязвление стенок органов (Афонина И. А, 2006).

Вызываемые введением наночастиц металлов повреждения проявляются не только на органном уровне, но и на молекулярном - происходит повреждение генетического аппарата клетки и формирование микроядер. Анализ имеющихся в литературе данных относительно действия солей цинка и меди на генетический аппарат выявил сходство проявляемых эффектов.

При хронической интоксикации солями цинка количество микроядер, в отличие от контрольной группы животных, увеличилось на 92,5 %, при интоксикации солями меди - на 118,5 % (Хантурина Г.Р., 2011). По сравнению с солями, наночастицы вызвали увеличение числа микроядер на 300% и более, что характеризует наночастицы как высокотоксические агенты в отношении ДНК.

Сравнение биологического эффекта исследуемых наночастиц железа с действием частиц большего размера, которые условно можно отнести к микрочастицам, выявило принципиальное отличие. Частицы диаметром 200 им не проявляли повреждающего действия на органы и оказывали рост стимулирующее действие на животных, что позволяет использовать их в качестве биологически активных пищевых добавок - источников микроэлементов (Коваленко Л.В., 2006).

Проведенное сравнение позволяет отнести наночастицы сплава металлов [РеС^п], железа и меди к условно токсичным при пероралыюм способе поступления в организм. Действие таких частиц может проявляться в активации ПОЛ и цитолитических процессов и сходно с действием солей данных металлов.

ВЫВОДЫ

1. Пероральное введение наночастиц металлов в концентрациях 0,05 -5,0 мг/кг нарушает процессы углеводного обмена. Наиболее выраженные изменения показателей углеводного обмена - нарушение утилизации глюкозы клетками и увеличение ее уровня в сыворотке крови, увеличение концентрации

ПВК и активности ЛДГ и снижение концентрации лактата - наблюдаются при введении наночастиц железа в концентрациях 1,25 мг/кг и 2,5 мг/кг.

2. Наночастицы железа, меди и сплава металлов [Fe Си Zn] изменяют гомеостатические показатели белкового обмена, способствуя увеличению уровня общего белка и креатинина в сыворотке крови лабораторных животных. Введение наночастиц меди и сплава металлов ре Си Zn] способствует снижению уровня мочевины в сыворотке крови животных. Наиболее выраженные изменения наблюдаются при введении наночастиц в концентрациях 0,05 -1,25 мг/кг.

3. Наночастицы железа повреждают мембраны клеток миокарда, способствуя увеличению активности АсАТ и КФК в сыворотке крови, при этом выраженное действие наблюдается при их введении в концентрациях 0,05 мг/кг и 5,0 мг/кг. Введение наночастиц меди вызывает развитие патологических процессов в печени, проявляющееся увеличением активности АлАТ, ГТТ и увеличением уровня билирубина в сыворотке крови. Наночастицы сплава металлов [FeCuZn] в концентрациях 1,25 мг/кг и 2,5 мг/кг оказывают токсическое действие на гепатоциты и клетки миокарда, схожее с действием наночастиц меди и железа.

4. Токсическое действие наночастиц металлов проявляется активацией воспалительных процессов, полнокровием органов, дистрофией, некрозом и появлением микроядер в клетках. В отношении печени и почек максимально повреждающим действием обладают наночастицы меди и железа. Усиление негативного воздействия при этом происходит прямо пропорционально концентрации наночастиц. Сплав [Fe Си Zn] проявляет общетоксическое действие на организм.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Дудакова Ю.С. Исследование токсического действия высокодисперсных порошков металлов / Дудакова Ю.С., Бабушкина И.В., Бородулин В.Б. // Аллергология и иммунология. 2009. Т. 10, № 2. С. 308. (0,04 п.л., личн. вк. - 75%).

2. Дудакова Ю.С. Антибактериальное действие наночастиц железа и меди на клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa и Mycobacterium tuberculosis / Бабушкина И.В., Дудакова Ю.С., Бородулин В.Б., Казимирова Н.Е., Иванова H.A. //Нанотехника. 2009. №3. С. 69-72.(0,16 п.л., личн. вк. 25%).

3. Дудакова Ю.С. Изучение биологического действия наночастиц цинка / Дудакова Ю.С., Бородулин В.Б. // Нанотехника. 2009. №3. С. 72 - 75. (0,16 п.л., личн. вк. 75%).

4. Дудакова Ю.С. Биологическое действие высокодисперсных порошков металлов на ферменты сыворотки крови мышей / Дудакова Ю.С., Бабушкина И.В., Попу калин А.Н., Бородулин В.Б. // Известия ВУЗов. Северо - Кавказский регион. Естественные науки. 2010. № 2. С. 84-88. (0,20 п.л., личн. вк. 50%).

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

5. Дудакова Ю.С. Исследование биологических аспектов действия нанопорошка железа на активность ферментов сыворотки крови мышей / Алиева З.А., Дудакова Ю.С., Бородулин В.Б. // Материалы 69 научно-

практической конференции студентов и молодых ученых СГМУ: «Молодые ученые - здравоохранению региона». Саратов. 2008. С. 145-146 (0,08 п.л., личн. вк. 75%).

6. Дудакова Ю.С. Изучение биологического эффекта нанопорошка железа на метаболизм лабораторных животных / Дудакова Ю.С., Бородулин В.Б., Алиева З.А. // Материалы 69 научно-практической конференции студентов и молодых ученых СГМУ: «Молодые ученые - здравоохранению региона». Саратов. 2008. С. 156-157. (0,08 п.л., личн.вк.75%).

7. Дудакова Ю.С. Влияние наноразмерных частиц на обменные процессы в почках / Дудакова Ю.С., Клименко И.А., Бородулин В.Б. // Материалы 69 научно-практической конференции студентов и молодых ученых СГМУ: «Молодые ученые - здравоохранению региона». Саратов. 2008. С. 157-159.(0,08 п.л., личн. вк. 75%).

8. Дудакова Ю.С. Влияние нанопорошка железа на обменные процессы самцов мышей / Дудакова Ю.С., Бородулин В.Б. // Материалы VII межвузовской конференции с международным участием: «Обмен веществ при адаптации и повреждении». Ростов-на-Дону. 2008. С. 52-57. (0,08 п.л., личн. вк. 75%).

9. Дудакова Ю.С. Исследование влияния нанопорошка сплава [FeCuZn] на показатели сыворотки крови самцов белых беспородных мышей / Бессонова О.С., Дудакова Ю.С., Чудин С.А. // Материалы 70 научно-практической конференции студентов и молодых ученых СГМУ: «Молодые ученые - здравоохранению региона». Саратов. 2009. С. 73-75.(0,12 п.л., личн. вк.75%).

10. Дудакова Ю.С. Исследование биологической активности нанопорошка меди / Дудакова Ю.С., Будунова Т.А. // Материалы 70 научно-практической конференции студентов и молодых ученых СГМУ: «Молодые ученые -здравоохранению региона». Саратов. 2009. С. 76-77.(0,08 п.л., личн. вк. 75%).

11. Дудакова Ю.С. Изучение действия нанопорошка железа на обменные процессы у самцов мышей / Дудакова Ю.С., Травиничев Д.В. // Материалы 70 научно-практической конференции студентов и молодых ученых СГМУ: «Молодые ученые - здравоохранению региона». Саратов. 2009. С. 77-79. (0,12 пл., личн.вк.75%).

12. Дудакова Ю.С. Изменение биохимических параметров сыворотки крови лабораторных животных при пероралыюм введении нанопорошка цинка / Чудин С.А., Дудакова Ю.С., Бессонова О.С. // Материалы 70 научно-практической конференции студентов и молодых ученых СГМУ: «Молодые ученые - здравоохранению региона». Саратов. 2009. С. 84-86.(0,12 п.л., личн. вк.-75%).

13. Дудакова Ю.С. Морфологические изменения в почках мышей при пероралыюм введении наночастиц железа, меди и цинка / Наволокин H.A., Сулейманова JI.B., Дудакова Ю.С., Хаутиева Э.А. // Материалы 70 научно-практической конференции студентов и молодых ученых СГМУ: «Молодые ученые - здравоохранению региона». Саратов. 2009. С. 274-275.(0,12 п.л, личн. вк.-50%).

14. Дудакова Ю.С. Исследование биологической активности нанопорошка железа / Дудакова Ю.С., Горошинская И.А., Бородулин В.Б // Материалы

конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии» -Москва. - 2009. - С. 35. (0,4 пл., личн. вк.-50%).

15. Дудакова Ю.С. Влияние введения нанопорошка меди па показатели углеводного, белкового и пигментного обмена белых беспородных мышей / Алиева З.О., Дудакова Ю.С. // Исследования молодых ученых в биологии и экологии. Сборник научных трудов: Саратов. Изд-во Саратовского университета. 2009. Вып. 7. С. 6-10. (0,20 пл., личн. вк.-75%).

16. Дудакова Ю.С. Биологическое действие нанопорошков биогенных металлов на организм белых беспородных мышей / Дудакова Ю.С. // Инновации в медицинском образовании и науке. Докторантские и аспирантские чтения. Сборник научных трудов. Саратов. Изд-во Саратовского медицинского университета. 2010. Вып. 1. С 66-70.(0,20 пл., личн. вк.-100%).

17. Дудакова Ю.С. Биологическое действие наночастиц цинка при пероральном введении лабораторным животным / Дудакова Ю.С. //Материалы российской конференции, посвященной 80- летию со дня рождения Р.И. Лифшица. Челябинск. 2009. С. 217 - 220. (0,16 пл., личн. вк.-100%).

18. Дудакова Ю.С. Действие наночастиц железа на процессы в почках / Бабурина Ю.О., Дудакова Ю.С. // «Молодые ученые - здравоохранению». Материалы 71 межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 65-летию со дня Победы в Великой отечественной войне. Часть 1. Саратов. Издательство Саратовского медицинского университета. 2010. 284 с. (С. 88-89). (0,08 пл., личн. вк.-75%).

19. Бебешина A.A., Дудакова Ю.С. Исследование биологической активности суспензий нанопорошка железа / Бебешина A.A., Дудакова Ю.С. // «Молодые ученые - здравоохранению». Материалы 71 межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 65-летию со дня Победы в Великой отечественной войне. Часть 1. Саратов. Издательство Саратовского медицинского университета. 2010. 284 с. (С. 90-91). (0,08 пл., личн. вк. 75%)

20. Дудакова Ю.С. Действие наночастиц цинка на обменные процессы / Гегеня Н.В., Дудакова Ю.С. // «Молодые ученые - здравоохранению». Материалы 71 межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 65-летию со дня Победы в Великой отечественной войне. Часть 1. Саратов. Издательство Саратовского медицинского университета. 2010. 284 с. (С. 92-93). (0,08 пл., личн. вк. 75%).

21. Дудакова Ю.С. Влияние суспензий наночастиц железа на организм лабораторных животных / Гусынская О.О., Дудакова Ю.С. // «Молодые ученые -здравоохраненшо». Материалы 71 межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 65-летию со дня Победы в Великой отечественной войне. Часть 1. Саратов. Издательство Саратовского медицинского университета. 2010. 284 с. (С. 94-95). (0,08 пл., личн. вк. 75%).

22. Дудакова Ю.С. Действие наночастиц цинка на процессы в почках / Мамедова Т.А., Дудакова Ю.С. // «Молодые ученые - здравоохранению».

Материалы 71 межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 65-летию со дня Победы в Великой отечественной войне. Часть 1. Саратов. Издательство Саратовского медицинского университета. 2010. 284 с. (С. 104-105). (0,08 п.л., личн. вк.-75%).

23. Дудакова Ю.С. Изучение влияния наночастиц цинка на организм лабораторных животных / Попова А.В., Дудакова Ю.С. // «Молодые ученые -здравоохранению». Материалы 71 межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 65-летию со дня Победы в Великой отечественной войне. Часть 1. Саратов. Издательство Саратовского медицинского университета. 2010. 284 с. (С. 110-111). (0,08 пл., личн. вк.-75%)

24. Дудакова Ю.С. Биохимические аспекты действия наночастиц меди / Ракуцкая Т.В., Жумаситов В.В., Дудакова Ю.С. // «Молодые ученые -здравоохранению». Материалы 71 межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 65-летию со дня Победы в Великой отечественной войне. Часть 1. Саратов. Издательство Саратовского медицинского университета. 2010. 284 с. (С. 113-114). (0,08 п.л., личн. вк.-75%).

25. Дудакова Ю.С. Влияние сплава наночастиц [Ре Си 7п] на организм лабораторных животных / Султанова А.Э., Дудакова Ю.С. // «Молодые ученые -здравоохранению». Материалы 71 межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 65-летию со дня Победы в Великой отечественной войне. Часть 1. Саратов. Издательство Саратовского медицинского университета. 2010. 284 с. (С. 117-118). (0,08 п.л.,-личн. вк.75%).

26. Краснов А.О. Оценка гепатотоксического действия наночастиц железа / Дудакова Ю.С., Краснов А.О. // Материалы 72-й межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием: «Молодые ученые - здравоохранению». Саратов. 2011. С. 84-85. (0,4 п.л., личн. вк. 75%).

27. Дудакова Ю.С. Исследование токсического действия наночастиц меди / Кушнир А.В., Будунова Т.А., Дудакова Ю.С. // Материалы 72-й межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием: «Молодые ученые - здравоохранению». Саратов. 2011. С. 89-90. (0,4 п.л., личн. вк. 75%).

28. Дудакова Ю.С. Влияние наночастиц сплава металлов |Те Си ¿п] на показатели углеводного и белкового обмена / Дудакова Ю.С., Персашвили М.А. // Материалы 72-й межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием: «Молодые ученые -здравоохранению». Саратов. 2011. С. 86-87. (0,4 п.л., личн. вк. 75%).

29. Дудакова Ю.С. Анализ токсического действия нанопорошка меди / Дудакова Ю.С., Чеботарева Е.Г. , Эльбубу М.М.А. , Саккала М., Бородулин В.Б. // Обмен веществ при адаптации и повреждении (дни медицинской лабораторной диагностики южного федерального округа):

материалы X межвузовской конференции с международным участием. Ростов-на-Дону. ГОУ ВПО РостГМУ. 2011. 207 с (С.62-63). (0,08 пл., личн. вк. 50%).

30. Дудакова Изменение активности лактатдегадрогеназы в опытах щ уйгопод влиянием наночастиц железа / Дудакова Ю.С., Чеботарева Е.Г., Эльбубу М.М.А., Саккала М., Бородулин В.Б. // Обмен веществ при адаптации и повреждении (дни медицинской лабораторной диагностики южного федерального округа): материалы X межвузовской конференции с международным участием. Ростов-на-Дону: ГОУ ВПО РостГМУ. 2011. 207 с. (С.63-64). (0,08 пл., личн. вк.50%).

31. Дудакова Ю.С. Исследование гепатотоксического действия нанопорошка железа / Дудакова Ю.С., Чеботарева Е.Г., Эльбубу М.М.А., Саккала М., Бородулин В.Б. // Обмен веществ при адаптации и повреждении (дни медицинской лабораторной диагностики южного федерального округа): материалы X межвузовской конференции с международным участием. Ростов-на-Дону: ГОУ ВПО РостГМУ. 2011. 207 с. (С.64-65). (0,4 пл., личн. вк.-50%).

32. Дудакова Ю.С. Изменение морфологии почек мышей под влиянием наночастиц металлов / Дудакова Ю.С., Чеботарева Е.Г., Эльбубу М.М.А., Саккала М., Бородулин В.Б. // Обмен веществ при адаптации и повреждении (дни медицинской лабораторной диагностики южного федерального округа): материалы X межвузовской конференции с международным участием. Ростов-на-Дону: ГОУ ВПО РостГМУ. 2011. 207 с. (С.65-66). (0,4 пл., личн. вк.-50%).

33. Дудакова Ю.С. Изменение биохимических показателей сыворотки крови у мышей при пероралыюм введении наночастиц металлов / Дудакова Ю.С.// Материалы I Международной научно-практической конференции «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области»: электронное научн. издание. ФГУП НТЦ «Информрегистр». Депозитарий электронных изданий. 2011. 835 с. (С. 536-539). (0,16 пл., личн. вк. 100%).

Список сокращений и условных обозначений:

АсАТ - аспартатаминотрансфераза, ЛДГ- лактатдегидрогеназа, АлАТ- аланинаминотрансфераза, ПВК- пировиноградная кислота,

ГТТ - гаммаглутамилтрансфераза, ПОЛ - перекисное окисление липидов.

КФК - креатинфосфокиназа,

Дудакова Юлия Сергеевна

ИЗМЕНЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СЫВОРОТКИ КРОВИ У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ВВЕДЕНИИ НАНОЧАСТИЦ МЕТАЛЛОВ PER OS

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 5.04.2012. Формат 60x84 '/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,45. Уч.-изд. л. 1,4. ' Тираж 100 экз. Заказ № 807.

Отпечатано в ООО Издательство «КУБиК» 410056 Саратов, ул. Чернышевского, 94а тел.: (845 2)60 33 20

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дудакова, Юлия Сергеевна, Ростов-на-Дону

61 12-3/934

ГБОУ ВПО САРАТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. В.И. РАЗУМОВСКОГО МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

На правах рукописи

ИЗМЕНЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СЫВОРОТКИ КРОВИ У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ВВЕДЕНИИ НАНОЧАСТИЦ МЕТАЛЛОВ PER OS

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Бородулин В.Б.

Ростов-на-Дону 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1.1. Использование наночастиц в биологии и медицине 11

1.2. Биологическая активность наночастиц железа 21

1.3. Биологическая роль меди 29

1.4. Области применения наночастиц цинка 34 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 37

2.1. Объекты исследования 3 7

2.2. Проведение экспериментальной работы 37

2.3. Биохимический анализ сыворотки крови 38

2.4. Изучение морфологии органов 48

2.5. Методы цитологических исследований 49

2.6. Статистические параметры, использованные в работе 51 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 52

3.1. Изучение биохимических показателей сыворотки крови у мышей при пероральном введении наночастиц металлов 52

3.1.1. Изменение биохимических показателей сыворотки крови у мышей под влиянием наночастиц железа 52

3.1.2. Воздействие наночастиц меди на биохимические показатели сыворотки крови белых беспородных мышей 66

3.1.3. Влияние наночастиц цинка на обменные процессы у мышей 76

3.1.4. Исследование действия наночастиц сплава металлов [Те Си Zn]

на метаболические процессы у мышей 86

3.2. Морфологические изменения в органах мышей при пероральном введении наночастиц металлов 98

3.2.1. Анализ морфологии органов под влиянием наночастиц железа 98

3.2.2. Характеристика изменений в органах при пероральном

введении нанопорошка меди 105

3.2.3. Влияние перорального введения нанопорошка цинка на морфологические параметры органов мышей 111

3.2.4. Морфологические изменения в органах при введении нанопорошка сплава наночастиц (Те Си Хп\ 117

3.2.5. Сравнительный анализ действия наночастиц металлов на морфологию органов мышей 122

3.3. Оценка генотоксичности наночастиц металлов 128

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 141

ВЫВОДЫ 157

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 158

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АлАТ -аланинаминотрансфераза,

АсАТ - аспартатаминотрансфераза,

ГГТ - у-глутамилтрансфераза,

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота,

КФК - креатинфосфокиназа,

ЛД50 -среднесмертельная доза,

ЛД100 -абсолютно смертельная доза,

лдг - лактатдегидрогеназа,

мпд -максимально переносимая доза,

мтд -минимально токсическая доза,

пвк - пировиноградная кислота,

пол - перекисное окисление липидов,

ЩФ - щелочная фосфатаза.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Использование наночастиц находит широкое практическое применение в различных областях химии, биологии, экологии.

Нанопорошки металлов, полученные различными методами, могут применяться в качестве источников микроэлементов в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве. В этом отношении металлы в виде наночастиц являются уникальной формой введения элементов в организм, поскольку обладают пролонгированным действием и высокой биологической активностью (Глущенко H.H. и др., 2002).

Особое внимание уделяется исследованию действия на организм нанопорошков биогенных металлов, в частности меди, цинка, железа, биологическая ценность которых определяется многогранностью функций в сложных биохимических процессах и активным участием в клеточном метаболизме, обеспечивающем нормальное функционирование организма (Арсентьева И.П., 2008; Глущенко H.H., 2007; Давронов К.С., 2006).

Использование наночастиц несет не только несомненные преимущества, но и потенциальную опасность вредного воздействия на здоровье человека и природные экосистемы (Колесниченко A.B. и др., 2008).

Взаимодействие наноструктур с такими биологическими компонентами, как молекулы нуклеиновых кислот, белков и клетками в целом, приводят к их уникальному распределению в тканях организма, возможному иммунному ответу и изменениям в метаболизме (Fischer Н.С., 2007; Geze А., 2007; Hall J.B., 2007; Jain Т.К., 2008; Zieziulewiez T.J., 2003).

В медицинской практике и биологии наночастицы наиболее часто используют в форме биосовместимых магнитных жидкостей, которые представляют собой взвесь магнитных частиц в водных буферных растворах разного состава, иногда в водно - масляных эмульсиях (Звездина Н.Д., 2007).

Цель работы. Целью данной работы явилось изучение действия наночастиц железа, меди, цинка и сплава данных металлов при их введении per os на обменные процессы у лабораторных животных.

Задачи исследования:

1) Изучить дозозависимые эффекты влияния наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [Fe Си Zn] при их пероральном введении на углеводный, белковый и липидный обмены у лабораторных животных.

2) Провести сравнительный анализ действия исследуемых наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [Fe Си Zn], введенных перорально, на метаболизм у лабораторных животных.

3) Изучить безопасность перорального введения наночастиц железа, меди, цинка и сплава данных металлов путем оценки их цитогенетического эффекта и влияния на морфологию органов у лабораторных животных.

Научная новизна.

Впервые исследовано влияние наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [Fe Си Zn] в концентрации 0,05-5,0 мг/кг при пероральном введении лабораторным животным для оценки безопасности применения наночастиц в качестве биологически активных добавок. Комплексное использование биохимических, цитогенетических и морфологических методов анализа позволило выявить негативное влияние наночастиц металлов при их пероральном введении на организм лабораторных животных.

Впервые проведен сравнительный анализ действия наночастиц металлов на изменение активности тканевых ферментов и на концентрацию метаболитов, характеризующих состояние белкового, липидного и углеводного обменов в сыворотке крови у лабораторных животных.

Установлено, что наночастицы железа в большей степени, чем другие исследуемые наночастицы, вовлекались в обмен углеводов и нарушали процессы утилизации глюкозы клетками. Введение наночастиц сплава

металлов [Бе Си Ъъ\ в диапазоне концентраций 0,05-5,0 мг/кг оказывало выраженное биологическое действие на обмен белков.

В воздействии исследуемых наночастиц металлов на организм лабораторных животных отслежен дозозависимый эффект: влияние на протекание биохимических процессов максимально при введении наночастиц в концентрациях 1,25-2,5 мг/кг.

Выявлено, что введение наночастиц перорально вызывало увеличение активности тканевых ферментов в сыворотке крови, что свидетельствует о цитолитическом действии металлов. Полученные данные характеризовали действие наночастицы исследуемых металлов как токсическое в отношении органов и тканей.

Установленные с помощью биохимических методов изменения активности тканевых ферментов под влиянием наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [Бе Си Ъп\ подтверждены изменениями морфологии органов белых мышей. Впервые показано, что основными органами-мишенями для токсического действия наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов {Те Си Хп) при их попадании в организм перорально являлись печень и почки, что обусловлено участием данных органов в процессе детоксикации и выведении ксенобиотиков. Выявлен цитогенетический эффект воздействия данных наночастиц металлов на организм лабораторных животных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Влияние наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [Бе Си на клеточный метаболизм у лабораторных животных определяется видом наночастиц и имеет дозозависимый эффект.

2. Введение наночастиц железа, меди, цинка и сплава [Бе Си в концентрации 0,05-5,0 мг/кг лабораторным животным перорально оказывает влияние на обменные процессы, характеризующееся нарушением метаболизма глюкозы по аэробному пути и накоплению в крови животных пировиноградной кислоты (ПВК) и лактата и усилением процессов распада белков.

3. Наночастицы железа, меди, цинка и сплава [FeCuZn] оказывают цитолитическое действие на органы лабораторных животных, проявляющееся в увеличении активности клеточных ферментов в сыворотке крови: креатинфосфокиназы (КФК), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ), гаммаглутамилтрансферазы (ГГТ).

4. Введение наночастиц железа, меди, цинка и сплава [Fe Си Zn] лабораторным животным способствует развитию патологических процессов в печени и почках и появлению клеток с микроядрами.

Научно-практическая значимость.

Проведенные биохимические исследования позволяют существенно расширить представления о влиянии наночастиц металлов: железа, меди, цинка и сплава [Fe Си Zn], введенных per os, на обменные процессы (углеводный, липидный и белковый), протекающие в организме лабораторных животных и создают предпосылки для дальнейшего изучения их механизма действия на организм человека. Установлено, что действие наночастиц на организм определяется их качественным составом: наночастицы железа оказывали влияние на углеводный обмен, наночастицы сплава металлов [Fe Си Zn] - на обмен белков.

Полученные данные могут быть использованы для оценки адекватности лечения при отравлении данными металлами и дальнейшего создания антидотов.

Выявлены дозозависимые эффекты воздействия наночастиц исследуемых металлов, которые дают возможность определять меры предосторожности при работе с данными частицами. Комплексными исследованиями активности клеточных ферментов, являющихся индикаторами цитолиза, и морфологии органов лабораторных животных установлены токсические аспекты действия наночастиц железа, меди, цинка и сплава данных металлов в отношении печени и почек. Полученные данные представляют интерес для оценки развития возможных патологий при применении наночастиц металлов, в частности,

железа, меди, цинка, в качестве пищевых добавок и лекарственных средств, а также позволят разработать методы профилактики при отравлении данными наночастицами.

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе на кафедре биохимии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Миндравсоцразвития России.

Апробация результатов исследования.

Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на международной научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2007 г.); научно-практической конференции студентов и молодых ученых Саратовского Государственного Медицинского Университета с международным участием: «Молодые ученые - здравоохранению региона» (Саратов, 2008, 2009, 2010, 2011 гг.); VII межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2008 г.); VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ и II Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 2009 г.); всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009 г); всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2009» (Москва, 2009 г.); межрегиональной научно-практической конференции «Инновации в медицинском образовании и науке» (Саратов, 2010 г.); всероссийском молодежном форуме «Инновационное творчество» (Селигер, 2010 г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 33 работы, 4 из которых изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Общий объем публикаций составил 2,96 п.л., личный вклад в работу - 75 %.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 101 отечественный источник и 59 иностранных. Результаты исследования представлены в 8 таблицах. Работа иллюстрирована 74 рисунками.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Использование наночастиц в биологии и медицине

Нанотехнологии представляют собой направление в науке и технологиях, активно развивающееся в последние десятилетия. Объектами для изучения в нанотехнологиях являются материалы размером, не превышающем значения 100 нанометров, к которым относятся нанотрубки, нанокомпозиты, фуллерены, ультрадисперсные порошки, мицеллярные системы и микроэмульсии, липосомы, биомембраны (Медведева Н.В., 2006; Олейников В.А., 2007; Huang S.S., 2001; Lai Y.L., 2003).

Переход от микроразмерных величин к наноразмерным является более не количественным, а качественным; это переход от манипуляции веществом к манипуляции отдельными атомами и молекулами. Сверхмалый размер наночастиц придает им новые физико-химические свойства и функции, существенно отличающиеся от тех, которыми обладают составляющие их молекулы и атомы веществ в частицах большего размера (Warren C.W., 2006).

Применение нанотехнологий и наноматериалов открывает новые возможности перед биологией и медициной.

Использование нанотехнологий в биологии легло в основу создания отдельной отрасли - нанобиотехнологии,одним из приоритетных направлений которой является использование нанопорошков металлов в качестве биодобавок к корму для решения проблем ветеринарии и сельского хозяйства, связанных с необходимостью применения микроэлементов (Арсентьева И.П., 2007). К настоящему времени доказана возможность введения металлов в виде наночастиц в организм, имеются разработки по подготовке металлов для введения в организм, изучены ключевые регуляторные биосистемы. Интерес к биологическим приложениям применения наночастиц определил ряд наиболее перспективных направлений изучения нанопорошков, например, для моделирования экологического прессинга металлов на организм (Глущенко H.H., 2002; Коваленко Л.В., 2006).

Использованию нанопорошков металлов в сельском хозяйстве посвящен ряд работ (Давронов К.С., 2008; Егоров Н.П., 2008; Коваленко JI.В., 2001; Павлов Г.В., 2002). Установлена высокая физиологическая активность нанопорошков металлов, что может характеризовать их как экологически чистые биологически активные препараты (Федоров Ю.И., 1983; Бурлакова Е.Б., 1979). Изучено действие нанопорошков биогенных металлов, в частности железа, меди и цинка, на целый ряд показателей: всхожесть семян, урожайность, устойчивость растений к болезням и некоторые другие физиолого - биохимические процессы (Давронов К.С., 2004; Кучкаров К.К., 2004; Павлов Г.В., 2002; Тухтабаева Ф.М., 2006; Павлов Г.В, 2003).

Интерес использования наночастиц металлов в животноводстве основан на оптимизации кормления животных и повышении коэффициента полезного действия кормов. Ряд исследований показал возможность применения наночастиц металлов в животноводстве как недорогих и нетоксичных препаратов, улучшающих состояние животных и позволяющих в значительной мере увеличить живую массу крупного рогатого скота (Глущенко H.H., 1988).

К настоящему времени установлено, что влияние порошков, состоящих из наночастиц металлов, на биологические объекты (микроорганизмы, растения, животные) существенно может отличаться от действия на те же объекты солей металлов, действие которых в низких концентрациях малоэффективно и кратковременно, а в высоких - токсично (Коваленко Л.В., 2001).

Медицинские приложения использования нанотехнологий привели к созданию отрасли науки - наномедицине, которая эффективно развивается в последния десятилетия (Каплун А.П., 2007). В области медицины возможности нанотехнологий направлены на управление с помощью наноматериалов и наночастиц физическими, химическими и биологическими процессами, протекающих в живых организмах на молекулярном уровне (Yu С.-Н., 2008). В настоящее время на основе нанотехнологий проектируются и внедряются в практику наноустройства, позволяющие выполнять все необходимые операции

от диагностики и мониторинга до уничтожения патогенных микроорганизмов, восстановления поврежденных органов, снабжения организма необходимыми веществами (РгейаБ Я.А., 2005, 2006).

Основные направления развития нанотехнологий в медицине представлены нанопротеомикой, созданием биосенсорных

нанодиагностикумов, разработкой нанопор для регистрации единичных олигонуклеотидов и секвенирования генома (Барачевский В.А., 2007). Наночастицы можно использовать в качестве лекарственных средств и как контейнеры для доставки лекарств (Иванов Ю.Д., 2007). Возможно использование нанотехнологий в регенеративной медицине, например, в тканевой инженерии (Аз1ат М., 2005; Ка^ Н., 2008).

Большое внимание в последнее время уделяется использованию магнитоуправляемых частиц в данных областях наномедицины (Брусенцов Н.А., 2008; Звездина Н.Д., 2007; Аз1ат М., 2005).

В биологии и медицине применяемые наночастицы, как правило, состоят из феррома�