Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Изменчивость структуры популяций колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say под влиянием трансгенного картофеля и инсектицидов

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Изменчивость структуры популяций колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say под влиянием трансгенного картофеля и инсектицидов"

/ .л На правах рукописи

ГОЛОВАТЕНКО Наталия Алексеевна

ИЗМЕНЧИВОСТЬ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИЙ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА ЬЕРТШОТЛЯБЛ БЕСЕМЬШЕЛТЛ БЛУ ПОД ВЛИЯНИЕМ ТРАНСГЕННОГО КАРТОФЕЛЯ И ИНСЕКТИЦИДОВ

06.01.11. - защита растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар - 2004

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте биологической защиты растений Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИБЗР РАСХН)

Научный руководитель: - кандидат сельскохозяйственных наук В.И. Киль

Официальные оппоненты:

Ведущая организация - Краснодарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства им. П.П Лукьяненко

Кубанском государственном аграрном университете по адресу: 350044, г.Краснодар, ул. Калинина, 13, КГАУ, корпус защиты растений

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КГАУ.

- профессор, доктор сельскохозяйственных наук Зеленский Г.Л.

- кандидат биологических наук Черкезова С Р.

Защита состоится 2004 г.

в /О ч на заседании диссертационного совета Д.220.038.06 в

г.

Ученый секретарь диссертационного сове'к доктор биологических наук, профессор г

ета.

В.П. Сокирко

2005-4

21691

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Картофель (Solanum tuberosum L) -одна из наиболее , экономически значимых продовольственных культур России, где ее называют «вторым хлебом». Основным вредителем, повреждающим картофель, является колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata Say), приводящий к потерям до 30 % урожая даже при использовании химических средств защиты.

Ситуация осложняется тем, что колорадский жук (КЖ) приобрел резистентность ко многим химическим инсектицидам, которая приводит к увеличению их расхода, загрязнению окружающей среды и продуктов урожая. Это предопределяет необходимость поиска новых средств защиты картофеля от этого вредителя и управления развитием резистентности.

Использование биологических средств защиты растений относится к перспективным направлениям в борьбе с КЖ. Одним из направлений биологической защиты картофеля является использование энтомопатогенных микроорганизмов и биопрепаратов на их основе. Основным действующим веществом этих препаратов является экзо- и эндотоксины бактерии Bacillus thuringiensis (Bt).

Наиболее перспективным направлением является использование генно-модифицированных биозащищенных от КЖ сортов картофеля, в геном которых перенесен бактериальный ген Bt-эндотоксина СгуЗА. Основанием этому служит тот факт, что исследования, проведенные во ВНИИБЗР в течение пяти лет, показывают абсолютную толерантность генно-модифицированных сортов американской и отечественной селекции картофеля к вредителю и экологическую безопасность их в отношении нецелевых объектов биоценоза (энтомофагов, фитофагов, микроорганизмов).

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы -выявление закономерностей изменчивости структуры популяций КЖ в условиях взаимодействия с Bt-картофелем и химическими инсектицидами и разработка прогноза развития резистентности к Bt-токсину по фенетическим маркерам. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: разработать новый подход к описанию рисунка переднеспинки имаго КЖ; изучить влияние трансгенного картофеля и химических инсектицидов на фенетиче-скую структуру популяций КЖ; оценить изменчивость структуры географических популяций КЖ по признаку «окраска яиц»; оценить чувствительность различных географических популяций КЖ

к трансгенному картофелю; исследовать молекулярно-генетический полиморфизм популяций КЖ по признакам пола, окраски яиц и в зависимости от их географической удаленности; идентифицировать фены-маркеры определяющие чувствительность КЖ к трансгенному картофелю.

Научная новизна работы.

- определены новые феноформы и разработан комплексный подход к описанию рисунка центральной части переднеспинки имаго КЖ, который может быть использован при анализе изменчивости структуры популяций;

- впервые проведена сравнительная оценка исходной чувствительности пяти популяций КЖ Краснодарского края к трансгенному картофелю;

- разработана оригинальная методика выделения ДНК из КЖ, пригодная для реакции амплификации;

- оценен генетический полиморфизм ряда популяций КЖ по ДНК-маркерам и определена генетическая обусловленность признака «окраска яиц»;

- выявлены закономерности изменчивости структуры популяций КЖ под влиянием инсектицидов и трансгенного картофеля и фено-формы специфической и неспецифической устойчивости;

- разработана математическая модель прогноза изменения чувствительности популяций колорадского жука к трансгенному картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго.

Научно-практическая значимость работы. Разработанный новый комплексный подход к описанию рисунка центральной части переднеспинки имаго КЖ, можно использовать в генетико-популяционных исследованиях КЖ; выявлены закономерности изменчивости популяций КЖ под влиянием трансгенного картофеля и химических инсектицидов; предложен новый метод мониторинга и прогноза резистентности популяций КЖ к трансгенному картофелю по фенетическим маркерам.

Основные положения выносимые на защиту:

- система оценки структуры популяций КЖ, основанная на описании феноформ рисунка переднеспинки имаго по СР. Фасулати, является недостаточной для описания популяций юга России.

- структура популяций КЖ подвержена значительным изменениям под действием инсектицидов, причем характер этой изменчивости

определяется как географическим положением популяции (ее генетическими особенностями), так и природой пестицида.

- фенооблик структуры популяций КЖ определяется, главным образом, соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих различную неспецифическую устойчивость к стрессовым факторам среды.

- мониторинг резистентности КЖ к трансгенному картофелю можно проводить по феноформам рисунка переднеспинки имаго, используя в качестве индикатора Bt -чувствительности феноформы группы V и проводить прогноз по разработанной формуле.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 3-ей и 5-ой региональных научно-практических конференциях молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (15-16 ноября 2001г. и 18-19 декабря 2003 г. Краснодар, КГАУ); на научно-практической конференции посвященной, 100-летию со дня рождения Е.М. Степанова (8-9 октября 2002, Краснодар, ВНИИБЗР); на международных конференциях «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (г. Москва, 6-12 июня 2004 г) и «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (г.Краснодар, 29 сентября -1 октября 2004 г. ВНИИБЗР); на И-ом Московском международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г.Москва, 10-14 ноября 2003 г).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, методики проведения исследований, результатов исследования, выводов, практических рекомендаций, приложения и содержит 20 таблиц и 16 рисунков. Список использованной литературы включает 165 источников, в том числе 117 на иностранном языке.

Благодарность. Автор приносит глубокую благодарность научному руководителю диссертационной работы к.с-х.н. В.И. Килю; д. с.-х. на>к В.И. Терехову; д. с.-х. наук В.Е. Болахоненкову и к.б.н. В.Я. Исмаилову за помощь, оказанную при выполнении исследований и оформлении работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обобщены литературные данные о распространении и использовании в сельскохозяйственном производстве генетически модифицированных культур. Анализируются сведения о Bt - защищенном картофеле New Leaf (растение-инсектицид). Рассматриваются вопросы мониторинга резистентности КЖ к Bt-растениям, а так же освещены вопросы управления развитием резистентности КЖ к Bt-картофелю. Обсуждаются генетические и биохимические механизмы резистентности к Bt-токсинам.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Диссертационные исследования выполнялись в течение 2000-2004 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте биологической защиты растений ВНИИБЗР г.Краснодар.

Объектами исследования служили популяции КЖ из разных районов Краснодарского края и Ленинградской области. Исследования проводили на экспериментальной базе сектора биотехнологии ВНИИ биологической защиты растений. Жуков собирали ранней весной до обработки инсектицидами на территории Краснодарского края. Описывали фенооблик популяций и проводили обработку жуков инсектицидами лептоцид и дурсбан (пиретроид и ФОС соответственно). Наблюдали динамику смертности по феноформам предложенной нами комплексной системы описания рисунка пе-реднеспинки и описывали фенетическую структуру популяций в момент гибели 80-90% насекомых.

Оценку базовой чувствительности популяций вредителя к Bt-картофелю проводили в лабораторных условиях. Объектом исследования служили яйцекладки жуков весенней генерации которые инкубировали в лаборатории до отрождения личинок. Их доращивали до необходимого возраста на листьях обычного картофеля и затем помещали в чашки Петри с листьями трансгенного картофеля. Чувствительность КЖ к трансгенному картофелю оценивали на отродившихся личинках I-IV возраста в лабораторных условиях. Выживаемость личинок определяли ежедневно до полной элиминации всех испытываемых особей, после чего определяли среднюю продолжительность их жизни для каждой повторности.

Сравнение частот и средних по выборке проводили по стандартным критериям с использованием общепринятых методов и пакетов прикладных программ (Statistica 6.0 и SPSS 11.0).

Генетический полиморфизм оценивали по RAPD-маркерам с использованием праймера ОРВ-08 (Operon Technology): 5'-GTCCACACGG-3'. Выделение ДНК проводили из головы и перед-неспинки имаго КЖ по Д.Б. Дорохову и Э. Клоке (1997) с некоторыми модификациями.

Амплификацию ДНК проводили в амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология) по Д.Б. Дорохову и М.Н. Лаптевой (1997г.). Визуализацию продуктов амплификации осуществляли в 2%-ном ага-розном геле.

Статистическую обработку данных электрофореза проводили методом канонического дискриминантного анализа (Дж.-О. Ким, Ч.У. Мьюллер, У.Р. Клекка и др., 1989). Оценивали также коэффициенты различия (генетические расстояния) между генотипами и проводили построение дендрограмм методом кластерного анализа (программа TREECON). Полиморфными считали те фрагменты, которые встречались не во всех RAPD-спектрах анализируемых особей жуков. Уровень полиморфизма определяли как отношение количества полиморфных фрагментов к общему количеству полученных фрагментов, выраженное в процентах.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 НОВЫЙ КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ОПИСАНИЮ РИСУНКА ПЕРЕДНЕСПИНКИ ИМАГО КОЛОРАДСКОГО ЖУКА

В настоящее время оценку фенетической структуры популяций КЖ проводят, по рисунку переднеспинки взрослых особей по методике разработанной СР. Фасулати (рис. 1). Однако, данный подход не учитывает всего многообразия фенов в популяции и в частности слияние фенов А внизу между собой и с фенами Р и М. Поэтому мы предложили использовать дополнительно к 9-ти фе-ноформам (по СР. Фасулати) еще феноформы группы А, описанные Ф.С Кохманюк и новые феноформы описанные нами (VP; HP; VHP; HY). Такой комплексный подход, сочетающий 17 фено-комплексов оказался оправданным при анализе ряда популяций КЖ Краснодарского края.

V УУ г

Т»шХ»1 Тип №2 ТипХаЗ

V ГУ У

Тип №4 Тип №5 Тип №6

V 1ГУ V

Тип №7 Тип №8 Тип №9

уууу

V н ун у

иууу

Нр У11Р НУ

Рис. 1. Основные типы (феноформы) рисунка центральной части

переднеспинки имаго колорадского жука (феноформы 1-9 по С.Р.Фасулати; V, Н, УИ, Y по Ф.С. Кохманюк; VP; ИГ; VHP; ГО по В.И.Киль, Н.А. Головатенко, Л.П. Есипенко)

Описание фенооблика трех исследованных популяций КЖ Краснодарского края по 17 феноформам предложенной комплексной системы описания рисунка переднеспинки представлено в табл.1.

При сравнении фенооблика трёх исследованных популяций можно заметить, что все они характеризовались примерно одинаковым спектром распределения частот феноформ. И хотя наблюдались некоторые различия в фенетической структуре и между популяциями КЖ Краснодарского края, но они оказались статистически незначимыми. Однако различия достоверны в сравнении с фенооб-ликом популяции Ленинградской области. В целом наиболее часто встречаемыми оказались феноформы ИР, 6, 9 и 3, и редкими феноформы 4, 5,7,8, V, УР, УИР, УИ (частота менее 4 %).

Таким образом, рисунок переднеспинки имаго КЖ в различных географических популяциях вредителя можно считать диагностическим признаком, что явилось основанием для его использования при оценке чувствительности КЖ к Б^картофелю и химическим инсектицидам.

Таблица 1 - Средняя частота встречаемости феноформ некоторых

популяций колорадского жука Краснодарского края, % __(2001-2003гг.) _,

Феноформа Краснодарская Темрюкская Староминская

1 4,7 4,3 5,0

2 3,7 12 1,7

3 14,0 10,1 10,3

4 1,0 2,0 1,8

5 2,6 2,0 2,2

6 13,6 13,7 13,2

7 1,2 3,0 2,4

8 0,8 2,4 2,1

9 10,7 13,9 12,0

V 2,2 3,4 1,5

Y 4,0 5,0 3,7

УР 1,7 0,2 3,2

ОТ 27,6* 27,5* 32,1*

Ж 5,5 2,7 3,5

Н 4,6 6,5 2,7

УИР 1,4 2,0 2,6

уи 0,1 0,1 0,2

* достоверно отличается от других феноформ

3.2. ВЛИЯНИЕ ТРАНСГЕННОГО КАРТОФЕЛЯ И ХИМИЧЕСКИХ ИНСЕКТИЦИДОВ НА СТРУКТУРУ РАЗЛИЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА

Предложенный нами новый подход к описанию рисунка пе-реднеспинки КЖ позволил оценить изменчивость структуры некоторых популяций вредителя под влиянием инсектицидов и транс-генного картофеля (табл. 2). Влияние Bt-картофеля на структуру популяций фактически сохраняло доминирующее положение часто встречаемых феноформ HP, 3, 6 и 9 (%2факт<Х205)> то есть фенооблик популяций сохранился таким же, как и в контроле. В то же время, действие лептоцида в Краснодарской популяции и действие дур-

сбана в Темрюкской популяции значительно влияло на структуру популяций (%2=26,2; 27,2 > однако и в этом случае указанные феноформы оставались наиболее часто встречаемыми, причём изменчивость определялась как генотипическими особенностями популяций, так и природой инсектицида. Частота встречаемости феноформы HP оставалась одной из самых высоких или самой высокой и под влиянием пестицидов, т. е. сохранялась на уровне контроля. Однако относительно других феноформ картина резко менялась в зависимости от природы пестицида и популяции.

В то же время важно отметить, что характеристика популя-ционной структуры на основании анализа только лишь частот распределения феноформ с нашей точки зрения не может позволить объективно понять закономерности развития их устойчивости к действию инсектицидов. Поэтому, наряду с частотой встречаемости мы оценивали также выживаемость особей различных феноформ в условиях действия стрессового фактора (инсектицид) (табл.3). Оценка выживаемости наиболее часто встречаемых феноформ выявила тот факт, что они не являются наиболее устойчивыми к воздействию Bt-картофеля и инсектицидов. Выживаемость феноформ в условиях пестицидного пресса не коррелировала с исходной частотой их встречаемости в популяциях. Так, например, редко встречаемые феноформы Краснодарской популяции 7; Y и V? являлись в среднем наиболее устойчивыми к инсектицидам, а часто встречаемые феноформы 3 и НР характеризовались невысокой выживаемостью. Это указывает на то, что фенетическая структура популяций КЖ определяется не только пестицидным фактором, но и другими стрессовыми факторами окружающей среды.

По всей видимости, чувствительность различных феноформ к инсектицидам не является решающим признаком, определяющим фенооблик популяций КЖ, так как более высокую устойчивость к инсектицидам имеют, как правило, редкие феноформы.

Эти данные позволили нам сделать вывод о том, что механизмы становления структуры популяций КЖ определяются наличием и соотношением внутрипопуляционных групп особей, имеющих неспецифическую устойчивость к различным стрессам. Он подтверждается данными статистической обработки в результате которой установлено, что феноформы 3; 6; 9 и НР характеризовались наименьшей дисперсией, которая оказалась на порядок ниже

Таблица 2 - Изменчивость частоты встречаемости фенов и феноформ в популяциях колорадского жука под влиянием В (картофеля и инсектицидов

разного спектра действия, % (2002-2003 гг)

Популяция Феноформ я

' 2 3 4 5 ( 6 | 7 8 9 V У | V? НР НУ Н УН УНР | Х2

В£-картофель

Краснодарская 2,2 1,2 7,1 2,2 1>> 16,6 1,1 0 17Д 3,4 3,4 2,3 24,0 10,5 2,7 0 0 12,6

Темрюкская 1,1 0 11,5 0 1.1 13,2 8,2 6,1 8,7 8,2 0 0 33,0 2,1 6,5 0 0 21,7

Старом инская 2,4 1,6 12,0 0 13,0 5,1 3,2 2,4 10,7 0 0 2,6 26,4 5,6 8,9 0 0 20,4

Лепгоцид •

Краснодарская 0 0 6.8 1,6 0 11.1 1,6 1,6 8,6 0 13,7 2,5 26,2 12,8 7,5 0,8 0 26,2*

Темрюкская 2,0 2.0 15,7 5,0 0 15,0 0 5,0 10,7 1,0 5,0 0 25,7 9,0 4,0 0 0 18,6

Староминская 4,4 0 7,2 0 0 12,1 3,3 3,8 «,6 1.1 5,0 3,8 36,3 7,2 8,9 0 0 16,1

Дурсбан

Краснодарская 0 2.2 12Д 5,5 5,5 24,4 1,1 0 8,9 1,1 го. 2Д 18,8 8,9 3,3 3,3 0 1 23,5

Темрюкская 1,1 0 4,6 5,0 12,3 11.2 1.1 0 27,0 2,3 5,0 0 15,9 9,3 11,2 0 0 27,2*

Старом инская 1,0 0 15.4 3,8 5,8 10,6 1,0 3.0, 23,3 1,9 1,9 1,0 17,6 10,7 2,9 0 0 | 16,8

Контроль

Краснодарская 5,4 4.3 14,7 0,7 2,4 11,5 1,1 0,5 11,0 2,7 43 1,0 24,7 8,2 6,8 0,1 0,06 9,73

Тем рюкская 3,5 1,8 10,3 0,9 2,0 17,5 4,5 1,6 16,8 2,1 3,3 «г» 2\а 4,0 7,1 0,2 0 6,50

Староминская 4,3 1,6 13,4 0,8 3,3 14,0 1,6 1,2 13,0 23 3,5 1,8 29,5 5,2 4,1 0,2 0 4,56

* - достоверно отличается от контроля (х^кт< Х3««)-

12

Таблица 3 - Выживаемость им aro колорадского жука различных фенов под влиянием Bt-картофеля и инсектицидов, % (2002-2003 г.)

Популяция Фен

1 | 2 | 3 ( 4 | 5 | 6 | 7 | » | 9 | V | Y j VP | НР | HY | Н |VH ! VHP

Краснодарская

Bt-картофель 6,6 12,5 17,8 20,0 41,6 35,4 33,3 0 35,7 32,5 23,6 66,6 24,7 32,0 25,0 - -

Лептоцид/. 0 а 8,9 10,0 0 26,4 33,3 33,3 31,4 0 55,5 75,0 15,6 35,0 22,5 6,6 0

Дуре бе н^ 0 15,0 12,0 16,6 10,0 28,4 33,3 0 19,0 10,0 16,6 33,3 8,9 11,4 7,5 0 0

14,5 64,6 20,4 25,9 471 22,3 0 370 75,2 277 430 486 62,9 165 89,6 - 0

Тем рюкская

Bt-токсин 4,1 0 18,6 0 I 25,0 13,3 26,1 50,0 93 55,5 0 0 24,3 7,1 1 11,1 - -

Лептоцид ÍÍ 16,6 16,6 26,1 50,0 0 13,8 0 25,0 12,8 10,0 16.6 - 23,! 31,0 7,4 0 0

Дурсбан/ 4,1 0 6,9 75,0 66,6 10.S 4,5 0 29,7 40,0 18,7 - 14,5 28,5 22,2 0 0

о1 52,1 91,8 93,6 1460 | ИЗО 3,16 195 625 119 S35 105 - 28,6 173 59,3 - -

Старом инская

Bt-токсин 8,3 40,0 18,1 0 68,7 8,0 57Д I 75,0 16,7 433 0 12,5 203 38,8 61,1 - -

Лептоцид^ 22,2 0 7,8 0 0 14,3 42,8 25,0 7,9 10,0 17,5 50,0 17,9 29,1 22.2 0 0

Дурсбан/ 2.7 0 21.9 25,0 25,0 П,2 7.1 I 7S.0 32,4 20,0 10,0 12,5 12Í 43,8 16,6 0 0

о2 101 533 53,2 208 1210 9,92 665 1 833 154 292 77,1 469 173 55,8 587 - -

Норма расхода (кг/га; л/га) Лептоцид, КЭ (50 г/л) Дурсбан, КЭ (480 г/л)

чем у других феноформ. При этом закономерность прослеживается для всех трех исследованных популяций. Это указывает на то, что данные фенетические группы особей характеризуются неспецифической устойчивостью к различным стрессовым факторам внешней среды, что в конечном итоге и обусловливает их наибольшую представленность в популяциях КЖ Краснодарского края. Таким образом, фенооблик структуры популяций КЖ, в первую очередь, определяется соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих различную неспецифическую устойчивость к различным стрессам,, включая и пестицидный фактор. Вот почему, с нашей точки зрения, было бы неправильным связывать адаптивность тех или иных феноформ в той или иной географической зоне возделывания картофеля исключительно с их резистентностью к применяемым инсектицидам без учета почвенно-климатических факторов.

Результаты проведенных исследований делают более понятными механизмы адаптивности популяций вредителей к неблагоприятным факторам внешней среды и развития резистентности к инсектицидам. Одинаковый потенциал адаптивности четырех указанных феноформ на столь различные стрессовые воздействия (В^ картофель и химические инсектициды разного спектра действия), выявляемый одинаковой выживаемостью в различных географических популяциях, вероятно, указывает на универсальный характер данных взаимосвязей. Становится, понятным роль редких феноформ в структуре популяций КЖ. Скорее всего, именно эти фене-тические группы насекомых являются своего рода резервом генов резистентности, отвечающих за специфическую устойчивость. Благодаря селективному давлению неблагоприятного фактора, эти особи могут выдержать значительный пестицидный пресс и получить дальнейшие преимущества, по сравнению с другими особями, что позволяет популяции в целом выжить. Особи редких фенов, ставшие доминирующими в популяции, могут дать потомство, в котором произойдет расщепление по признаку резистентности, приводящее в конечном итоге к реверсии популяции к исходной структуре.

Таким образом структура популяций КЖ подвержена значительным изменениям под действием инсектицидов. Высокая частота встречаемости феноформ НР, 3, 6 и 9 в популяциях Краснодарского края объясняется неспецифической устойчивостью данных групп особей к неблагоприятным факторам внешней среды.

3.3. ПРОГНОЗ ФОРМИРОВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА К ТРАНСГЕННОМУ КАРТОФЕЛЮ ПО ФЕНОФОРМАМ РИСУНКА ПЕРЕДНЕСПИНКИ ИМАГО

Для целей мониторинга резистентное™ популяций КЖ к трансгенному картофелю исходным пунктом исследований является оценка базовой (природной) чувствительности популяций вредителя к В^картофелю. Нами была проведена сравнительная оценка природной чувствительности исследуемых популяций Краснодарского края к трансгенному картофелю в зависимости от их географического положения (табл.4).

Таблица 4 - Продолжительность жизни личинок колорадского жука различных географических популяций при инкубации с

Bt - картофелем, сутки (2002-2003 г.)

Популяция Возраст личинок

I II III IV

Краснодарская 2,5±0,2 2,9±0,4 4,3±0,8 5,4±1,0

Темрюкская 2,6±0,2 3,1±0,2 4,1±0,3 5,7±0,8

Лабинская 2,0*0,1 * 2,3±0,2* 3,2±0,3* 3,8±0,3*

Староминская 3,0 2,9 6,6 8,0

Славянская 2,4±0,2 2,8±0,2 3,7±0,8 5,1±1,2

* - достоверно отличается от Краснодарской и Староминской популяций

Как видно, устойчивость КЖ к трансгенному картофелю зависит не только от возрастной структуры популяции, но и от ее генотипических особенностей. Так, личинки всех возрастов Лабин-ской популяции КЖ были более чувствительными к действию трансгенного картофеля, чем личинки Краснодарской, Темрюкской, Староминской и Славянской популяций. Важно отметить, что указанные показатели характеризуют природную устойчивость популяций КЖ к трансгенному картофелю.

В природных условиях при взаимодействии с трансгенным картофелем так или иначе, все популяции КЖ становятся чувствительными к действию токсина и в течение короткого времени полностью элиминируются. Тем не менее, эти данные свидетельствуют о необходимости конкретизации программ по мониторингу КЖ для каждой отдельной зоны выращивания трансгенного картофеля и оценки «базовой» чувствительности популяций в тех местах, где планируется возделывать В^сорта.

Оценка чувствительности популяций вредителей традиционными методами являются трудоемкой и дорогостоящей процедурой, так как требует определения концентрации В^токсииа в листьях картофеля. Вот почему в ряде работ предпринимаются попытки оценки данного показателя на основе простого описания структуры популяций по фенетическим маркерам.

Чтобы определить информативность феноформ в оценке чувствительности популяции КЖ к В^картофелю, мы использовали множественный регрессионный анализ с пошаговым отбором информативных признаков, где в качестве результирующего признака использовали «чувствительность личинок к трансгенному картофелю», а в качестве переменных - частоты феноформ в условиях взаимодействия с трансгенным картофелем. В результате применения данного статистического подхода оказалось, что наиболее информативными в оценке изменчивости чувствительности популяции к В^картофелю были редкие феноформы группы V, а результирующим признаком являлась «продолжительность жизни личинок IV возраста». В этой связи можно предположить, что увеличение частоты встречаемости в весенней генерации исследуемых популяций КЖ феноформ группы V, вероятно, будет вести к формированию резистентности к трансгенному картофелю. По полученным данным проведена формализация исследуемой зависимости, на основании которой можно оценить продолжительность жизни личинок КЖ (ГУвозраста) в зависимости от частоты встречаемости феноформ группы V:

У=

{

5, если Х< 6,5;

5 + 1,4 (Х-6,5), если X > 6,5, где

У - продолжительность жизни личинок КЖ IV возраста (сутки); X - частоты встречаемости феноформ группы

Предложенная математическая модель достаточно адекватно описывает исследуемые закономерности в данной группе популяций и может быть использована при проведении мониторинга резистентности популяций КЖ на полях с Bt-картофелем.

3.4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ ПОПУЛЯЦИИ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА ПО ПРИЗНАКАМ ПОЛА И ОКРАСКИ ЯИЦ

К числу внешних признаков, взаимосвязанных с основными экологическими адаптациями внутрипопуляционных форм КЖ, наряду с рисунком переднеспинки имаго можно отнести также оттенки пигментации яиц, пять из которых визуально хорошо различимы (СР. Фасулати, 2000). В этой связи актуально исследование взаимосвязи адаптивности жуков к пестицидам с окраской яиц, из которых они отродились. В случае выявления таких взаимосвязей это может дать в руки исследователю простой фенотипический маркер резистентности популяций КЖ к трансгенному картофелю. Однако, литературные источники указывают на высокую зависимость признака «окраска яиц» от внешних факторов среды. В этой связи встает вопрос о соотношении генотипической и средовой компонент в изменчивости этого признака. Исследование данного вопроса возможно с использованием современных молекулярно-генетических методов и, в частности, ПЦР анализа ДНК.

Методика выделения ДНК по Д.Б. Дорохову и Э. Клоке (1997) была нами модифицирована для КЖ следующим образом.

После заключительной стадии растворения осадка в 100 мкл ТЕ-буфера в каждую пробирку добавляли 14 мкл. рабочего раствора РНКазы и инкубировали в течение одного часа в суховоздушном термостате при 37°С. Затем добавляли 100 мкл смеси хлороформ/фенол (1:1) и 2 мкл изоамилового спирта, перемешивали и центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин. Отбирали суперна-тант в чистые пробирки. К супернатанту добавляли 0,1 объёма 3 М ацетата натрия и 2,5 объёма охлажденного при -20°С 96%-ного этанола, перемешивали и оставляли на ночь при -20°С (либо на 2 часа при -70°С). Далее центрифугировали 10 мин при 8 000 об/мин, осадок промывали дважды 70% этанолом, а затем растворяли в 100 мкл ТЕ-буфера. Концентрацию ДНК измеряли на двухлучевом спектрофотометре Perkin-Elmer Model 124 (Hitachi) или в 0,8%-ной

агарозе электрофорезом. При оценке популяции жуков из Ленинградской области в &ЛРБ-анализе было выявлено от 12 до 26 фрагментов ДНК, в зависимости от окраски яиц и пола исследованных насекомых (рис.2 и 3).

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 М п.н

«Д» 4В* тш

ЯР ¡В> 5""

' **" 88

Рис. 2. КЛРБ-спектр продуктов амплификации ДНК самок КЖ Ленинградской популяции, отродившихся из яиц различной окраски. Дорожки 1-6 желтой, 7-12-оранжевой, 13-14-красной. М -маркеры молекулярной массы (пар нуклеотид).

Рис.3. КЛРБ-спектр продуктов амплификации ДНК самцов КЖ Ленинградской популяции, отродившихся из яиц контрастных цветов. Дорожки 1-9 желтой, 10-17 красной. М-маркеры молекулярной массы (пар нуклеотид).

Уровень полиморфизма составил 67-82%. Размеры фрагментов варьировали от 100 до 1100 пар нуклеотидов. Частота встречаемости отдельных ДНК-фрагментов различалась у самок и самцов. Отмечалось наличие большего уровня полиморфизма ДНК-фрагментов у самок по сравнению с самцами. Данные электрофореза обрабатывали методом кластерного анализа. Были построены дендрограммы распределения различных групп особей в зависимости от окраски яиц и оценены генетические расстояние между ними (рис.4).

Самки

Рис. 4. Дендрограмма распределения жуков Leptinotarsa de-cemlineata (Say) на группы по окраске яиц, построенная на основе оценки полиморфизма RAPD-фрагментов. "Ж" - особи, отродившиеся из желтых яиц, "К" - красных, "О" - оранжевых.

Статистический анализ данных выявил (особенно в отношении самок), кластеры по признаку «окраски яиц». Это указывает на возможное сцепление этого признака с полом. Картина распределения «окраски яиц» представляется несколько более сложной и неоднозначной в отношении самцов. Тем не менее, четкое разделение на кластеры, по крайней мере в отношении самок, указывает на то, что признак «окраска яиц» имеет в своей основе ярко выраженную генетическую компоненту.

В то же время, понятно, что в целом детерминация признака «окраска яиц» обусловлена, в том числе и средовыми факторами. Однако можно с полной уверенностью утверждать, что определяющую роль в изменчивости признака «окраска яиц» играет гене-

тический фактор и почти строгое распределение особей по группам цветов - яркое тому подтверждение. Это позволяет сделать вывод, что признак «окраска яиц» может являться надежным маркером популяционных процессов и наряду с рисунком переднеспинки имаго, использоваться в фенетическом анализе структуры популяций КЖ.

3.5. ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИЙ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ИХ ГЕОГРАФИЧЕСКОЙ УДАЛЕННОСТИ

Необходимо отметить, что фенетические маркеры могут использоваться только в качестве грубой (предварительной) оценки чувствительности популяций КЖ к инсектицидам, т.к. подвержены действию факторов внешней среды. Тестирование генетического разнообразия в популяциях КЖ по ДНК-маркерам позволяет проводить мониторинг их состояния вне зависимости от средовых эффектов. Изучение генетического полиморфизма различных географических популяций КЖ проводили по RAPD- маркерам (вариант ПЦР анализа).

Сравнительная характеристика молекуля'рно-генетической структуры популяций КЖ из различных агроклиматических зон представлены на рис. 2, 3 и 5.

п.н.

- Ш » *• §«г Ж **Ц - - ~ *

т

1000 500

Рис.5. RAPD-спектр продуктов амплификации ДНК КЖ Краснодарской популяции.

Можно заметить, что Ленинградская популяция карактери-зуется высокой частотой встречаемости ДНК-фрагментов в низко-

молекулярной области (ниже 500 пар нуклеотид), тогда как у Краснодарской (и других исследованных популяциях края) - в высокомолекулярной области КАРБ-спектра. Обработку КАРБ-спектров проводили с использованием кластерного анализа и канонического дискриминантного анализа.

На рис. 6 представлены различия популяций Е пространстве первой и второй дискриминантных функций.

Рис.6. Дискриминация особей четырех популяций КЖ в пространстве первой и второй дискриминантных функций

Все особи Краснодарской, Темрюкской и Староминской популяций попали в полуплоскость, образованную отрицательной полупрямой оси абсцисс (ОП) и осью ординат (БР2). Наиболее четко отличается от них Ленинградская популяция: расстояние от ее центроида до центроидов Краснодарской, Темрюкской и Староминской популяций равны соответственно 20,89, 22,19 и 21,64. Другими словами, она наиболее удалена в пространстве дискрими-нантных функций от всех остальных анализируемых популяций (расстояния между популяциями Краснодарского края колебались в пределах 2,3-9,6). Эти же данные были обработаны кластерным анализом (метод Ворда) (рис.7).

Результаты анализа показали, что все изученные особи объединялись в 2 кластера при расстоянии их связывания, равном примерно 25. На этом расстоянии связывались два кластера: популяция Ленинградской области и отдельный кластер образовывали все изученные популяции Краснодарского края.

Рис.7. Кластерный анализ особей 4-х популяций колорадского

жука

В результате проведенных исследований можно заключить, что генотипические различия в популяциях КЖ определяются их географическим положением, что подтверждается молекулярно-

генетическим анализом исследуемых популяций по RAPD-маркерам. При этом, праймер ОРВ-08, вероятно, может быть использован в дальнейшем анализе генетической изменчивости внут-рипопуляционных групп насекомых-вредителей, различающихся чувствительностью к инсектицидам.

1. Определены новые феноформы и разработан комплексный подход к описанию рисунка центральной части переднеспинки имаго колорадского жука, который может быть использован при анализе изменчивости структуры популяций;

2. Структура популяций подвержена значительным изменениям под действием Bt-картофеля и инсектицидов (лептоцид, дурсбан), причем характер этой изменчивости определяется как географическим положением популяции (ее генетическими особенностями), так и природой пестицида.

3. Фенооблик структуры популяций колорадского жука определяется, главным образом, соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих различную неспецифическую устойчивость к стрессовым факторам среды ^-картофель, лептоцид, дурсбан и др.). Редко встречаемые фенетические группы насекомых имеют, как правило, высокую устойчивость к определенным инсектицидам и, вероятно, выполняют в популяции роль своего рода резерва генов резистентности, отвечающих за специфическую устойчивость к воздействию инсектицидов.

4. Мониторинг резистентности популяций колорадского жука к трансгенному картофелю можно проводить по феноформам рисунка переднеспинки имаго, используя в качестве индикатора Bt - чувствительности феноформы группы V и прогноз развития резистентности по разработанной формуле:

Y - продолжительность жизни личинок КЖ ГУвозраста (сутки); X - частота встречаемости фенов группы У(%).

5. Признак «окраска яиц» детерминирован, главным образом, ге-нотипическими факторами, вероятно сцеплен с полом, и может

ВЫВОДЫ

быть использован в анализе популяционных процессов КЖ наряду с рисунком переднеспинки имаго.

6. Генетические различия в популяциях КЖ определяются в основном их географической изоляцией.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для целей мониторинга популяций колорадского жука по морфологическим признакам использовать предложенный нами комплексный подход для описания центральной части переднеспинки имаго КЖ.

При проведении мониторинга популяций колорадского жука применять математическую модель, разработанную нами (см. с. 22 п. 4), которая дает возможность проводить прогноз развития резистентности вредителя к трансгенному картофелю.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Еронина (Головатенко) Н.А Комплексный подход к описанию рисунка переднеспинки имаго колорадского жука // Материалы 3-й региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса». Краснодар, КГАУ,15-16 ноября 2001 г. С. 38

2. Киль В.И., Головатенко НА, Есипенко Л. П. Новый подход к описанию рисунка переднеспинки имаго колорадского жука на примере некоторых его популяций в Краснодарском крае // Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем. Материалы докладов науч.-практ.конф., посвященной 100-летию со дня рожд. Е.М.Степанова, 8-9 октября 2002 г, Краснодар -2004.-Выпуск 1,с.12б-133.

3. Головатенко Н.А., Киль В.И., Есипенко Л.П. Изменчивость фенетической структуры популяций колорадского жука под влиянием Bt-картофеля и инсектицидов на основе комплексного описания рисунка пгреднеспинки имаго жуков // Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем. Материалы докладов науч.-практ.конф., посвященной 100-летию со дня рожд. Е.М.Степанова, 8-9 октября 2002 г, Краснодар -2004.- Выпуск 1, с. 133-147.

4. Исмзилов В.Я., Ширинян Ж.А., Пушня М., Головатенко Н.А., Киль В.И. Методы мониторинга резистентности колорадского жука к Bt-картофелю // Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития. Вавиловское общество генетиков и селекционеров (III ВОГиС), Москва, 6-12 июня 2004 г. С.500.

5. Головатенко Н.А., Киль В.И. Оценка базовой чувствительности различных географических популяций колорадского жука к трансгенному картофелю // Материалы 5-ой региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса». Краснодар, КГАУД8-19 декабря 2003 г. С.82-83.

6. Киль В.И., Игнатов А.Н., Калисниченко СМ., Головатенко НА, Крутенко Д.В., Дорохов Д.Б. Молекулярно-генетический анализ популяций колорадского жука по признакам пола и окраски яиц // Биотехнология: состояние и перспективы развития. II Московский международный Конгресс 10-14 ноября 2003 г. Часть 1. С. 200-201.

7. Киль В.И., Головатенко Н.А., Крутенко Д.В. Резистентность вредителей к трансгенному картофелю и другим Bt-защищенным культурам // Агрохимия.-2004-№7-с.77-91.

8. Киль В.И., Головатенко Н.А. К вопросу о механизмах формирования структуры популяций колорадского жука в связи с резистентностью к инсектицидам // Биологическая защита растений -основа стабилизации агроэкосистем. Материалы докладов международной науч.-практ.конф. 29 сентября - 1 октября 2004 г, Краснодар -2004.- Выпуск 2, с.201-209.

9. Киль В.И., Головатенко Н.А., Крутенко Д.В., Гронин В.В. RAPD-анаяиз ДНК имаго колорадского жука Leptinotarsa decem-lineata (Say) различных географических популяций // Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем. Материалы докладов международной науч.-практ.конф. 29 сентября - 1 октября 2004 г, Краснодар -2004.- Выпуск 2, с.209-222.

10. Киль В.И., Головатенко Н.А. Возможность оценки продолжительности жизни личинок колорадского жука, питающихся Bt -картофелем, по фенам рисунка переднеспинки имаго// Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем. Материалы докладов международной науч.-практ.конф. 29 сентября - 1 октября 2004 г, Краснодар -2004.- Выпуск 2, с. 222-229.

Лицензия ИД № 02334 от 14.07.2000

Подписано в "¡еч?ль19Л0.04 Формат 60 х 84

Бумага Офсет ная Офсетная печать

Печ.л. "-,0 Заказ №618. Тираж 100

Отпечатано в типографии КубГАУ, 350044, Краснодар, Калинина, 13

Р2027 0

í

РНБ Русский фонд

2005-4 21691

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Головатенко, Наталия Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Генетически модифицированные культуры: распространение и

Ф использование в сельскохозяйственном производстве.

1.2. Генетически модифицированный картофель устойчивый к колорадскому жуку.

1.3. Фенетическая структура популяций колорадского жука.

1.3.1. Систематическое положение и морфологические признаки.

1.3.2. Фены и фенетика.

1.4. Использование методов молекулярной биологии для анализа генетического полиморфизма популяций насекомых.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Агроклиматические условия в районах исследований.

2.2. Материалы исследований.

2.3. Объекты и методы исследований.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Новый комплексный подход к описанию рисунка переднеспинки имаго колорадского жука.

3.2. Влияние Bt-картофеля и химических инсектицидов на структуру различных популяций колорадского жука.

3.3. Прогноз формирования резистентности колорадского жука к Bt-картофелю по фенам рисунка переднеспинки имаго.

3.4. Влияние Bt-картофеля на выживаемость личинок колорадского жука, отродившихся из яиц различной окраски.

3.5. Молекулярно-генетический полиморфизм популяций колорадского жука по признакам пола и окраски яиц.

3.6. Изменчивость генетической структуры популяции КЖ в зависимости от их географической удаленности.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Изменчивость структуры популяций колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say под влиянием трансгенного картофеля и инсектицидов"

Картофель (Solatium tuberosum L) - одна из наиболее важных продовольственных культур в России, где ее называют «вторым хлебом». Однако, только из-за вредителей, среди которых наиболее опасным является колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata Say) ежегодно теряется до 30 % урожая даже при использовании химических средств защиты растений [1]. Ситуация осложняется тем, что колорадский жук (КЖ) приобрел резистентность ко многим химическим инсектицидам, что увеличивает их расход на полях и приводит к загрязнению окружающей среды и продуктов урожая. Это диктует необходимость поиска новых средств защиты картофеля от этого вредителя и управления развитием резистентности.

Трансгенный (Bt) картофель, с геном СгуЗА, устойчивый к КЖ, в определенной степени, может решить эту проблему. В то же время, остается вероятность возникновения резистентности КЖ и к самому Bt-картофелю. Решение проблемы резистентности напрямую связано со знанием механизмов этого процесса не только на организменном уровне, но и на популяционном.

Изучение генетических механизмов резистентности к инсектицидам и Bt-токсинам проводилось до настоящего времени, главным образом, на имаго и личинках насекомых. В то же время, до сих пор остаются неизвестными вопросы генотипической изменчивости структуры популяций под влиянием стрессового фактора (инсектицид). Как реагирует на стресс популяция вредителя в целом, как единая структура? Какие изменения происходят в структуре различных популяций на уровне внутрипопуляционных групп? Существуют ли общие закономерности генотипической изменчивости популяций вредителей под влиянием разных классов химических соединений и Bt-токсинов?. Эти и другие, связанные с ними вопросы требуют своего решения.

В этой связи, задача сравнительного анализа структуры популяций колорадского жука с различной устойчивостью к инсектицидам и её изменчивости в условиях взаимодействия с трансгенным картофелем (растенйе-инсектицид) и химическими инсектицидами составляла важное направление исследований в рамках указанной проблемы.

Оценку изменчивости структуры популяций проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Данные методы научного исследования широко применимы в настоящее время в мировой практике. В этом отношении популяционный подход к оценке адаптивности колорадского жука к инсектицидам и трансгенному картофелю является оригинальным и будет способствовать более глубокому пониманию механизмов формирования резистентности вредителей к пестицидам.

Кроме того, продолжаются попытки прогноза резистентности вредителей на основе простых фенетических маркеров популяций колорадского жука. Традиционно для этих целей используют рисунок переднеспинки или надкрыльев имаго особей или окраску яиц, из которых выделяют пять визуально отличимых оттенков. Частоты распределения этих простых элементарных признаков (фенов) используются для описания фенетической структуры популяции и ее изменчивости под воздействием пестицидов или других внешних факторов среды.

Многими исследователями подтверждена взаимосвязь адаптационного полиморфизма КЖ с рисунком центральной части переднеспинки имаго. Такая взаимосвязь дает возможность индикации в популяциях этого вредителя адаптивных форм по внешним признакам взрослых особей. Отмечается также адаптивный характер изменчивости некоторых фенов в связи с действием инсектицидов и фитонцидов [39; 24; 22].

В этой связи приобретает особую актуальность изучение фенетической структуры популяций КЖ и выявление фенов-маркеров адаптивности к биотическим и абиотическим стрессам. Кроме того, некоторые авторы указывают на возможность использования в фенетическом анализе популяций колорадского жука признака «окраски яиц»; среди которых можно выделить пять визуально различных оттенков [39]. В тоже время, до конца не ясно, имеет ли этот признак адаптивный характер и насколько велика генетическая компонента в детерминации «окраска яиц». Таким образом, оценка адаптивности некоторых фенов колорадского жука к инсектицидам и Bt-картофелю и является предметом настоящих исследований.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы - выявление закономерностей изменчивости структуры популяций колорадского жука в условиях взаимодействия с Bt-картофелем и химическими инсектицидами и разработка прогноза развития резистентности к Bt-токсину по фенетическим маркерам.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- разработать новый подход к описанию рисунка преднеспинки имаго колорадского жука;

- изучить влияние трансгенного картофеля и химических инсектицидов на фенетическую структуру популяций колорадского жука;

- оценить изменчивость структуры географических популяций колорадского жука по признаку «окраска яиц»; оценить чувствительность различных географических популяций колорадского жука к трансгенному картофелю; исследовать молекулярно-генетический полиморфизм популяций колорадского жука по признакам пола, окраски яиц и в зависимости от их географической удаленности; идентифицировать фены-маркеры определяющие чувствительность колорадского жука к трансгенному картофелю. Научная новизна.

- определены новые феноформы и разработан комплексный подход к описанию рисунка центральной части переднеспинки имаго КЖ, который может быть использован при анализе изменчивости структуры популяций;

- впервые проведена сравнительная оценка исходной чувствительности пяти популяций КЖ Краснодарского края к трансгенному картофелю;

- разработана оригинальная методика выделения ДНК из КЖ, пригодная для реакции амплификации;

- оценен генетический полиморфизм ряда популяций КЖ по ДНК- маркерам и определена генетическая обусловленность признака «окраска яиц»;

- выявлены закономерности изменчивости структуры популяций КЖ под влиянием инсектицидов и трансгенного картофеля и феноформы специфической и неспецифической устойчивости;

- разработана математическая модель прогноза изменения чувствительности популяций колорадского жука к трансгенному картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго.

Практическая значимость. Разработанный новый комплексный подход к описанию рисунка центральной части переднеспинки имаго КЖ, можно использовать в генетико-популяционных исследованиях КЖ; выявлены закономерности изменчивости популяций КЖ под влиянием трансгенного картофеля и химических инсектицидов; предложен новый метод мониторинга и прогноза резистентности популяций КЖ к трансгенному картофелю по фенетическим маркерам.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 3-ей и 5-ой региональных научно-практических конференциях молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (15-16 ноября 2001г. и 18-19 декабря 2003 г. Краснодар, КГАУ); на научно-практической конференции посвященной, 100-летию со дня рождения Е.М. Степанова (8-9 октября 2002, Краснодар, ВНИИБЗР); на международных конференциях «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (г. Москва, 6-12 июня 2004 г) и «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (г.Краснодар, 29 сентября - 1 октября 2004 г. ВНИИБЗР); на 11-ом Московском международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» ( г.Москва, 10-14 ноября 2003 г).

Основные положения, выносимые на защиту:

-система оценки структуры популяций КЖ, основанная на описании феноформ рисунка переднеспинки имаго по С.Р. Фасулати, является недостаточной для описания популяций юга России.

-структура популяций КЖ подвержена значительным изменениям под действием инсектицидов, причем характер этой изменчивости определяется как географическим положением популяции (ее генетическими особенностями), так и природой пестицида.

-фенооблик структуры популяций КЖ определяется, главным образом, соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих различную неспецифическую устойчивость к стрессовым факторам среды, -мониторинг резистентности КЖ к трансгенному картофелю можно проводить по феноформам рисунка переднеспинки имаго, используя в качестве индикатора Bt -чувствительности феноформы группы V и проводить прогноз по разработанной формуле.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 работ.

Благодарность. Автор приносит глубокую благодарность руководителю диссертационной работы к.с-х.н. В.И. Килю, доктору с.-х. наук В.И. Терехову, доктору с.-х. наук В.Е. Болахоненкову, к.б.н. В.Я. Исмаилову за помощь, оказанную в выполнении исследований и оформлении работы.

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Головатенко, Наталия Алексеевна

выводы

1. Определены новые феноформы и разработан комплексный подход к описанию рисунка центральной части переднеспинки имаго колорадского жука, который может быть использован при анализе изменчивости структуры популяций;

2. Структура популяций подвержена значительным изменениям под действием Bt-картофеля и инсектицидов (лептоцид, дурсбан), причем характер этой изменчивости определяется как географическим положением популяции (ее генетическими особенностями), так и природой пестицида.

3. Фенооблик структуры популяций колорадского жука определяется, главным образом, соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих различную неспецифическую устойчивость к стрессовым факторам среды (Bt-картофель, лептоцид, дурсбан и др.). Редко встречаемые фенетические группы насекомых имеют, как правило, высокую устойчивость к определенным инсектицидам и, вероятно, выполняют в популяции роль своего рода резерва генов резистентности, отвечающих за специфическую устойчивость к воздействию инсектицидов.

4. Мониторинг резистентности популяций колорадского жука к трансгенному картофелю можно проводить по феноформам рисунка переднеспинки имаго, используя в качестве индикатора Bt - чувствительности феноформы группы V и прогноз развития резистентности по разработанной формуле:

Г 5, если Х< 6,5; Y= 1 5 + 1,4 (Х-6,5), если X > 6,5, где

Y - продолжительность жизни личинок КЖ 1Увозраста (сутки); X - частота встречаемости фенов группы V(%).

5. Признак «окраска яиц» детерминирован главным образом генотипиче-скими факторами, вероятно сцеплен с полом, и может быть использован в анализе популяционных процессов КЖ наряду с рисунком переднеспинки имаго. б.Генетические различия в популяциях КЖ определяются в основном их географической изоляцией.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для целей мониторинга популяций колорадского жука по морфологическим признакам использовать предложенный нами комплексный подход для описания центральной части переднеспинки имаго КЖ.

При проведении мониторинга популяций колорадского жука применять математическую модель, разработанную нами, которая дает возможность проводить прогноз развития резистентности вредителя к трансгенному картофелю.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Головатенко, Наталия Алексеевна, Краснодар

1. Азизбекян P.P. Биологический препарат для борьбы с колорадским жуком «Колорадо»// Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.-М.: Наука.-2000.-Т1.-С.48-50.

2. Булат С.А., Кабоев O.K., Мироненко Н.В. и др. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для изучения геномов // Генетика. 1992.Т. 28, №5.- 19-28 с.

3. Бурьянов Я.И. Успехи и перспективы генно-инженерной биотехнологии растений// Физиология растений.-1999.-Т.46, №6.-С.930-944.

4. Глез В.М., Черкашин В.И. Колорадский жук. Систематическое положение и морфологические признаки // Защита и карантин растений. 2002.№5.С.67(3)-68(4).

5. Гостимский С.А., З.Г. Кокаева и др. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений. Генетика, 1999, том 35, №1 l.c.l538-1549.

6. Гриценко В.В., Глотов Н.В., Орлинский Д.Б. Эколого-генетический анализ изменчивости центральных элементов рисунка переднеспинки у колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata) // Зоологический журнал.- 1998.-Т.77.- №3, С. 278-284.

7. Дорохов Д.Б., A.M. Сеитова и др. ДНК-идентификация: проблемы и перспективы. Селекция и семеноводство, №4 1999г.44-46с.

8. Дорохов Д.Б., Э. Клоке. Быстрая и экономичная технология RAPD-анализа растительных геномов. Генетика, 1997, том 33, №4.с.443-450.

9. Захаров Е.В., Г.Н. Челомина. Выделение ДНК из музейных экспонатов бабочек (Lepidoptera, Papilionidae) и ПЦР-анализ со случайными иуниверсальными ген-специфичными праймерами // Генетика,- 2000.- Т. 36, №9. 1221-1229 с.

10. Калабеков A.JL, Каргаева Ф.Т. Фенетическое разнообразие двух совокупностей популяции колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say) // Экология и охрана беспозвоночных животных Кавказа. Сб. науч. тр. -Орджоникидзе: РИО СОГУ, 1989. - С. 39-44.

11. Коваленков В. Г., Тюрина Н. М., Соколов М. С. Проблемы резистентности фитофагов к пиретроидным инсектицидам и пути её решения (на примере Северо-Кавказского региона). //Агрохимия. 1998. - N10. - С. 24-32.

12. Конов А. Л., Стародубцева А. М., Шульга О. А., Скрябин К. Г. Генетическая инженерия картофеля: от лаборатории до поля. // Там же. — С. 110-119.

13. Король Т.С., Новосельская Т.Г. Мониторинг популяции колорадского жука по рисунку переднеспинки имаго // Биологизация защиты растений:состояние и перспективы. Материалы докл. междунар. конф. 18-22 сентября 2000 г., г. Краснодар,-2001.-Ч. 2.-С. 19-21.

14. Кочиева Е.З. Использование методов на основе полимеразной цепной реакции для анализа и маркирования растительного генома (обзор).Сельскохозяйственная биология, 1999, №3, 3-14с.

15. Кохманюк Ф.С. Изменчивость фенетической структуры популяций колорадского жука в пределах ареала. В кн.: Фенетика популяции. М.: Наука. -1982.-С. 233-243.

16. Кохманюк Ф.С. Внутривидовая дифференцировка у колорадского жука. В кн.: XIV Междунар. генет. конф.: Тез. докл. М.: Наука. - 1978. - С. 648-649.

17. Медицинские биотехнологии (специальный выпуск)// Информационный дайджест.-Центр «Биоинженерия» РАН.-2000.-№4.-32с.

18. Овчинникова Н.А., Маркелов Г.А. Внутривидовая изменчивость колорадского жука в Липецкой области // Науч. докл. Высшей школы, биол. науки. 1982.-С. 63-67.

19. Павлюшин В. А. Проблемы биологической защиты растений от колорадского жука. //Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку. М.: Наука. - 2000. -Т.1.-С. 45-48.

20. Романов Г.А. Генетическая инженерия растений и пути решения проблемы биобезопасности// Физиология растений.-2000.-Т.47, №3.-С.343-353.

21. Сидоренко А.П., О.П. Березовская и др. Оценка генетического полиморфизма в популяциях колорадского жука Leptinotarsa decemlineata (Say) по RAPD-маркерам// Генетика.-2000,-Т. 36, №5. 651-656 с.

22. Сидоренко А.П., Березовская О.П. Индивидуальный полиморфизм по RAPD-маркерам в весенней генерации колорадского жука Leptinotarsa decemlineata (Say) // Генетика.- 2001.- Т.37, №10.-С.1348-1352.

23. Соколов A.M. Изменчивость морфологических признаков колорадского жука . В кн.: Вопросы экологии и охраны животного мира Нечерноземной зоны РСФСР. Иваново. - 1978. - С. 110-117.

24. Сорокина Е. Ю., Аксюк И. Н., Кирпатовская Н. А. и др. Токсикологические исследования генетически модифицированного картофеля, устойчивого к колорадскому жуку. // Там же. С. 160.

25. Сухорученко Г.И. Резистентность вредных объектов к пестицидам в конце XX столетия // Защита и карантин растений. №6. - 2001. -с. 23-28.

26. Тимофеев-Ресовский Н.В., Яблоков А.В. Фены, фенетика и эволюционная биология // Природа. 1973. - №5. - С. 40-51.

27. Ушатинская Р.С., Иирковский Г.Г. Экология и физиология колорадского жука.- М.: Наука.- 1976. — 134 с.

28. Фасулати С.Р. Анализ структуры популяций колорадского жука и его значение для разработки зональных систем защиты картофеля // Бюлл. ВИЗР. -1986.-№63.- С. 38-43.

29. Фасулати С. Р. Феногеографическое разделение основных групп популяции колорадского жука в Европейской части СССР // Бюлл. ВИЗР. 1987. - №67. - С. 46-49.

30. Хавкин Э.Е. Молекулярнык маркеры в растениеводстве. // Сельскохозяйственная биология. —1997. -№5. -с.3-21.

31. Чудинов О.С., В.Н. Поздняков и др. Оптимизация RAPD-технологии для изучения генетического полиморфизма ДНК генома различных пород пчел // Сельскохозяйственная биология, серия « Биология животных».-1999.- №6.- 4756. с.

32. Шатилова О. Н., Удод J1. Г. Особенности становления потребительского рынка картофеля в России. // Агро XXI. Приложение. Эффективные технологии производства картофеля. 1999 г. - С.2.

33. Шевелуха B.C. Эволюция агроэкотехнологий и перспективная стратегия адаптивной селекции растений. Главные задачи отечественной селекции и биотехнологии на ближайшую перспективу//Агро ХХ1.-2001.-№1.-С.14-16.

34. Ширинян Ж.А., Исмаилов В .Я. Влияние трансгенных сортов картофеля на выживаемость, вредоносность и репродуктивные функции колорадского жука // Матер, докл. междунар. конф. 4.2.- 18-22 сент. 2000 г. Краснодар.

35. Яблоков А.В., Ларина Н.И. Введение в фенетику популяций. Новый подход к изучению природных популяций: Учеб. пособие для студ. вузов. -М.: Высш. шк.-1985.-159с.

36. Яшина И. М. Генетические и методические аспекты традиционной селекции картофеля на устойчивость к колорадскому жуку. // Там же. с. 102-104.

37. Alstad, D.N., Andow, D.A., Managing the evolution of insect resistance to transgenic plants.// Science.-1995.-v.268.-p. 1894

38. Alyokhin A. V., Ferro D. N. Relative fitness of Colorado potato beetle {Coleoptera: Chrysomelidae) resistant susceptible to the Bacillus thuringiensis СгуЗА toxin. // J. Econ. Entomol.- 1999. V. 92. - p. 510-515.

39. Andow D. A., Hutchison W. D. Bt corn resistance management/An: M. Mellon and J. Rissler (eds.)., Now or Never: Serious New Plants to Save a Naturel Pest Control. Union of Concerned Scientists: Cambridge, M.A. 1998. - p. 16-66.

40. Aronstein К. Direct Comparison of PCR-Based Monitoring for Cyclodiene Resistance in Drosophila with Insecticide Bioassay // Pesticide Biochemistry and Physiology.-1994. V. 48. P. 229-233.

41. Ballinger-Crabtree M.E., Black W.C., Miller B.R. Use of genetic polymorphisms detected by RAPD-PCR for differentiation and identification of Aedes aegypti subspecies and populations // Am.J. Tropical Med. Hyg.-1992.-V.47(6).-P.893-901.

42. Barton K., Binns A., Matzke A., Chilton M.-D. Regeneration of intact tobacco plants containing full length copies of genetically engineered T-DNA to R1 progeny// Cell.-1983 .-V.32.-P. 1033-1043.

43. Berlocher S.H. Insect molecular systematica // Ann. Rev. Entomol. 1984.- V.29.-P. 403-433.

44. Bt plant-pesticides risk and benefit assessment: insect resistance management// SAP Report No. 2000-07a, March 12,-2001. (http:/www.epa.gov/fedrgstr/).

45. Bulla L. A., Bechtel Jr., Kramer K. J. et al. Ultrastructure, Physiology and Biochemistry of Bacillus thuringiensis. // Crit. Rev. Microbiol. — 1980. V. 8. - p. 147-204.

46. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting: A strategy for genome analysis // Plant. Mol. Biol. Rep. 1991. V. 9. P. 292-305.

47. Cao J, Zhao JZ, Tang D, Shelton M, Earle D. Broccoli plants with pyramided cry 1 Ac and cry 1С Bt genes control diamondback moths resistant to Cryl A and Cry 1С proteins // Theor Appl Genet. 2002. - V. 105,- № 2-3. - p. 258-264.

48. J.L.Cenis, F.Beitia. Aplicacion de la tecnica RAPD-PCR (and polimorfico amplificado al azar) a la identificacion de insectos.// Invest. Arg.: Prod. Prot. veg.-1994. Vol. 9, №2,- P.289-297.

49. Cenis J.L., Perez P., Fereres A. Identification of various aphid (Homoptera: Aleyrodidae) species and clones by Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD-PCR) // Ann. Entomol. Soc. Am.-1993.-V.86.-P.545-550.

50. Cenis J.L. Identification of four major Meloidogyne spp. by random amplified polymorphic DNA (RAPD-PCR) // Phitopathology.-1993.-V.83.-P.76-78.

51. CFIA (Canadian Food Inspection Agency). Summary of Consultation on Pest resistance management strategies for Bt potatoes.- January 20.- 2000 ( http://www.inspection.gc.ca).

52. Chaufaux J, Muller-Cohn J, Buisson C. e.a Inheritance of resistance to the Bacillus thuringiensis Cry 1С Toxin in Spodoptera Littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). II J. Econ. Entomol. 1997. - V. 90. - №4 - p. 873-878.

53. Drew R.A.J., Hardy D.E. Dacus ( Bactrocera ) opiliae, new sibling species of the dorsal is complex of fruits flies from Northern Australia ( Diptera: Tephritidae )//.J. Aust. Entomol. Soc. 1981.- V. 20.- P. 131-137.

54. English L., Slatin S. L. Mode of action of delta-endotoxins from Bacillus thuringiensis: a comparison with other bacterial toxins. // Insect. Biochem. Mol. -1992.-v.22.-p. 1-7.

55. EPA. Plant Pesticide Bacillus thuringiensis Cry ЗА Delta-Endotoxin and the genetic material necessary for its production; Tolerance Exemption. — 1995 — Federal Register 60: 47871-47874.

56. EPA Registration Eligibility Decision (RED) Bacillus thuringiensis. EPA 738-R-98-004. March 1998.

57. EPA (US Environmental Protection Agency). Pesticide Fact Sheet: Bacillus thuringiensis Cry III(A) delta endotoxin and the genetic material necessary for its production in potato.- April. 2000.

58. Essential Biosafaty. Agriculture and Biotechnology Strategies (AGBios)Inc.(http://biobel.basnet.by/biosafaty/agbios/static/SHORT24. html).

59. Feitelson J.S, Payne J., Kim L. // Bio/Technology 1992. - V. 10. - P. 271-275.

60. Ferre J., Van Rie. Biochemistry and genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis. II Annu. Rev. Entomol. -2002. -v. 47. -p. 501-533.

61. Ferre J., Real M. D., van Rie J. e.a. Resistance to the Bacillus thuringiensis bioinsecticide in field population of Plutella xylostella is due to a change in a midgut membrane receptor. // Proc. Natl. Acad. Sci., USA. -1991. -v. 88. -p. 5119-5123.

62. Ffrench-Coustant R. H., Roush R. T. In. Pesticide Resistance in Arthropods; Roush R. Т., Tabashnik B.E. (eds); Chapman and Hall, N. Y., 1990. - p. 4-38.

63. Fischhoff D. A., Bowdish K. S., F. J. Perlak et al. Insect tolerant transgenic tomato plants. // Bio/Technology. 1987. - V. 5. - p. 807-813.

64. Fleming L. Mann J.B., Bean J.et al. 1994. Parkinson's disease and brain levels of organochlorine pesticides. Ann.Neurol.36:100-103.

65. Fuchs R. L., Ream J. E., Hammond B. G. et al. Safety assessment of the neomycin phosphotransferase II (NPT II) protein. // Bio/Technology. 1993. - V. 11. - p. 15431547.

66. Gahan L. J.,Gould F., Heckel D. G. Indentification of gene associated with Bt resistance in Heliothis virescens. II Science. 2001. V. 293. - p. 857-860.

67. Geographical origin of an introduced insect pest, Listronotus Bonariensis (Kuschel), determined by RAPD analysis / Williams C.L., Goldson S.L., Baird D.B., Bullock D.W. // Heredity.-1994.-V.72.-P.412-419.

68. Genetically Modified Pest-protected plants: Science and regulation //US National Research Council 2000.- National Academy Press: Washington, DC, USA.

69. Georghiou G.P., Lagunes -Tejeda A. The occurrence of resistance to pesticides in arthropods // Food and Agriculture organization of the United Nations; Rome, 1991.

70. Georghiou G. P. Principles of insecticide resistance management. // Phytoprotection. -1994 v. 75 (suppl.) -p. 51 -59.

71. Gonzalez-Cabrera J, Herrero S, Ferre J. High genetic variability for resistance to Bacillus thuringiensis toxins in a single population of diamondback moth // Appl Environ Microbial. 2001. - V. 67. - p. 5043-5048.

72. Gould F. Sustainability of transgenic insecticidal cultivars: Integrating pest genetics and ecology. // Annu. Rev. Entomol. 1998. - V. 43. - p. 701-726.

73. Gould, F. Simulation models for predicting durability of insect-resistant germ plasm: A deterministic diploid, two-locus model // Environ. Entomol. 1986. - V. 15. - p. 1-10.

74. Gould, F. Simulation models for predicting durability of insect-resistant germ plasm: Hessian fly {Diptera: Cecidomyiidae)-ves\stant winter wheat // Environ. Entomol. 1986,-V. 15. - p. 11-23.

75. Gould, F. Evolutionary biology and genetically engineered crops // Bioscience. -1998.-V. 38. p. 26-33.

76. Griffitts J. S., Whitacre J. L., Stevens D. E., Aroian R. V. Bt toxin resistant from loss of putative carbohydrate-modifying enzyme. // Science. 2001. - V. 293. - p. 860-864.

77. Halliday W. R., Buruham K. P. // J. Econ. Entomol.- 1990. V. 83. - p. 11511159.

78. Haffani YZ, Cloutier C, Belzile FJ. Bacillus thuringiensis cry3Cal protein is toxic to the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) // Biotechnol Prog. -2001. V. 17.-p. 211-216.

79. Haymer D.S., Mclnnis D.O. Resolution of populations of the mediferranean fruit fly at the DNA bevel using random primers for the polimerase chain reaction // Genome.-1994.-V.37, №2.-P.244-248.

80. Heckel, G., The complex genetic basis of resistance to Bacillus thuringiensis toxins in insects//Biocontrol. Sci. Technol.-1994.-V.4.-P. 451

81. Heckel D. G., Gahan L. J., Daly J. C., Trowell S. A genomic approach to understanding Heliothis and Helicoverpa resistance to chemical and biological insecticides. // Phil. Trans. R. Soc. London Ser. В 353. 1998. - p. 1713-1722.

82. Heckel D. G., Gahan L. J., Liu Y. В., Tabashnik В. E. Genetic mapping of resistance to Bacillus thuringiensis toxins in diamondback moth using biphasic linkage analysis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - p. 8373-8377.

83. Herrera-Estrella L., Depicker A., Van Montagu M., Svhell J. Expression of Chimeric Genes Transfered into plant cell ising a Ti-plasmidderived vector// Nature.-1983.-V.303.-P.209-213.

84. Hodson E. Meyer. S. !997.Pesticides. Pp.369-387. In Comprehensive Toxicology, I.G.G.Sipes, C.A.McQeen, A.J.Gandolfi eds., vol.9, Hepatic and Gastrointestinal Toxicology, R.S.McClusky and D.L.Earnest,volume eds. London: Pergamon Press.

85. Hofte H., Whiteley H. R. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. // Microbiol. Rev. 1989. - V. 53. - p. 242-255.

86. Huang F., Buschman L.L., Higgins R.A., McGaughey W. H. Inheritance of resistance to Bacillus thuringiensis toxin (Dipel ES)) in the Europian Corn borer II Science.- 1999.- v.284.- p.965-967

87. Ioannidis P.I., Grafius E.J., Whalon M.E. Patterns of insecticide resistance to azinphosmethyl, carbofuran, and permethrin in the Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) II J.Econ. Entomol. 1991. - V. 84. - P. 1417-1423.

88. IPCS. !999. United Nations / International Labour Program / WHO. International program on chemical safety Environmental health criteria 217: Bacillus thuringiensis.

89. Jach G., Goruhardt В., Mundy J. e.a Enhanced quantitative resistance against fungal diseases by combinatorial expression of different barley antifungal proteins in transgenic tobacco. II Plant J. 1995. - V. 8. - P.97-109.

90. James С. Global review of commercialized transgenic crops: 2000// IS AAA Briefs.-2000.-N21.-ISAAA: Ithaca, NY.

91. Jones D. Paper Presented to the research and development perspectives workshop. // Agricultural Biotech. And Enviromental Quality : Gene Escape and Pest Resistance.- NABC Report 10. -1998 -p. 11-14.

92. Kambhapati S., Black W.C., Rai K.S. A RAPD-PCR based method for the identification and differentiation of mosquito species and populations: techniques and statistical analyses // J. Med. Entomol. (en prensa).-1992.

93. Kirsch K., Schmutterer H. // J.Appl. Entomol. -1998. -v. 105. -p. 249-255.

94. Knowles В. H., Ellar D. J. Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanisms of action of Bacillus thuringiensis (delta) endotoxins with different insect specificity. // Biochem. Biophys. Acta. - 1987. - V. 924. - p. 509-518.

95. Knowles В. H., Dow J.A.T. The crystal 5-endotoxin of Bacillus thuringiensis: models for their mechanism of action on the insect gut. // BioEssays. -1993 -v. 15.-p. 469-475.

96. Koller C. N., Bauer L. S., Hollingworth R. M. Characterisation of the pH-mediated solubility of Bacillus thuringiensis var. sandiego native 8-endotoxin crystals. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1992 v. 184. -p. 692-699.

97. Lee M. K., Rajamohan F., Gould F., Dean D. H. Resistance to Bacillus thuringiensis Cry 1A 5-endotoxin in a laboratory-selected Heliothis virescens straine is related to receptor alteration. // Appl. Environ. Microbiol. -1995. -v. 61. -p. 3836-42.

98. Liu, Y.B., and B.E. Tabashnik, Experimental evidence that refuges delay insect adaptation to Bacillus thuringiensis// Proc. Roy. Soc. Lond. Ser.B.-1997.-V. 264:P. 605

99. Liu, Y-B., B.E. Tabashnik, T.J. Dennehy, AL. Patin, AC.Barflett, Development time and resistance to Bt crops. // Nature.-1999.-V.400.-P. 519

100. Matten S. R. EPA regulation of plant-pesticides and Bt plant-pesticide resistance management// NABC Report 10. -1998.-p. 121-143. (http://www.cals.cornell.edu/extension/nabc).

101. Matten S. R. Lewis P. I. Tomimatsu G. e.a. The US environmental protection agency's role in pesticide resistance management // In.: Molecular genetics and evolution of pesticide resistance; ed. T. Brown.-ACS., Washington. DC. 1996. - P. 243-253.

102. McCaughey W.H., Whalon M.E. Managing Insect resistance to Bacillus thuringiensis toxins// Science.-1992.-V.258.-P.1451-1455.

103. McGaughey W. H., Beeman R. W.// J. Econ. Entomol.- 1988. V. 81. - p. 28-33.

104. Naimov S, Weemen-Hendriks M, Dukiandjiev S, de Maagd RA. Bacillus thuringiensis delta-endotoxin Cryl hybrid proteins with increased activity against the Colorado potato beetle // Appl Environ Microbiol. 2001. - V. 67. - p. 5328-5330.

105. Ooms G., Karp A., Burrel M. M., Twell D., Roberts J. Genetic modification of potato development using Ri T-DNA.// Theor. Appl. Genetic. 1985. - V. 70. - p. 44-446.

106. Oppert В., Kramer K. J., Beeman R. W. e.a. Proteinase-mediated insect resistance to Bacillus thuringiensis toxins. // J. Biol. Chem. — 1997. —v. 272. —p. 2347376.

107. Oppert В., Kramer К. J., Johnson D. E. e.a. Altered protoxin activation by midgut enzymes from a Bacillus thuringiensis resistant strain of Plodia interpunctella. II Biochem. Biophys. Res. Commun. -1994 v. 198. -p. 940-947

108. Perez, C.P. and A.M. Shelton, Resistance of Plutella xylostella (Lepidoptera: Pyralidae), to Bacillus thuringiensis in South America// J. Econ. Entomol. -1997.-V.90.-P.669

109. Perlak F. J., Stone Т. В., Muskopf Y. M. et al. Genetically improved potato: protection from damage by Colorado potato beetles. // Plant Molecular Biology. -1993.-N 22.-p. 313-321.

110. Perlak F. J., Deaton R. W., Armstrong T. A. et al. Insect resistant cotton plants. // Bio/Technology. 1990. - V. 8. - p. 939-943.

111. Prabhaker N., Coudriet D.L., Meyerdirk D.E. Discrimination of three whitefly species ( Homoptera: Aleyrodidae ) by electroforesis of non-specific sterases // J. Appl. Ent. 1987.- V.103.- P. 447-451.

112. Rahardja U., Whalon M. E. Inheritance of resistant to Bacillus thuringiensis subsp. Tenebrionis Cry III A 5-endotoxin in Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). // J. Econ. Entomol.-1995.-v. 88,- p. 21-26.

113. Roush R.T. In.: Proceedings of Biotechnology for Integrated Pest Management, (Persley G. (ed)); CAB International, Wallingford, UK, 1996.

114. Roush, R.T. Managing resistance to transgenic crops. // In Advances in Insect Control: The Role of Transgenic Plants, N. Carozzi, and M.Koziel, eds. London: Taylor and Francis. 1997. - p. 271-294.

115. Roush, R. Т., Managing pests and their resistance to Bacillus thuringiensis: Can crops be better than sprays?. // Biocontrol Science and Technology.-1994.-v.4.-p. 501

116. Roush, R. T. and G. L. Miller, Considerations for design of insecticide resistance management programs. // J. Econ. Entomol.-1986.-v.79.-p. 293

117. SAP (Scientific Advisory Panel). Final report of the FIFRA Scientific Advisory Pantl Subpanel on Bacillus thuringiensis (Bt) plant-pesticides and resistance management, Feb. 9, 10. 1998. - Washington D. C.: US Eviron. Protect. Agency.

118. Sayyed AH, Wright DJ. Cross-resistance and inheritance of resistance to Bacillus thuringiensis toxin Cry 1 Ac in diamondback moth {Plutella xylostella L) from lowland Malaysia//Pest Manag Sci. 2001. - V. 57. - p. 413-421.

119. Scott M, Williams S.M. Comparative reproductive success of communally breeding burying beetles as assessed by PCR with randomiy amplified polymorphic DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1993.- Vol. 90. P. 2242-2245.

120. Shelton A. M., Tang J. D., Roush R. T. e.a. Field tests on managing resistance to Bt-engineered plants // Nat. Biotechnol.- 2000.- V. 18. P.339-342.

121. Siegfried B. D., Marcon P. C., Witkowski J. F. e.a. // // J. Agric. Entomol.-1995.-V. 12.-p. 257-263.

122. Staetz С.А.//J. Econ. Entomol.- 1985. V. 78. - p. 505-510.

123. Steck G.J. Biochemical systematics and population genetic structure of Anastepha flaterculus and related species ( Diptera: Tephritidae) // Ann. Entomol. Soc. Am.- 1991.- V.84.- P. 10-28.

124. Stewart J. Potential for development of resistance to Bt by Colorado potato beetle (СРВ)// Canadian Food Inspection Agency.- 2000.- http: //www.inspection.gc.ca.

125. Stone T.B., Sims S.R. // Geographic susceptibility of Heliothis virescens and Helicoverpa zea (Helioptera: Noctuidae) to Bacillus thuringiensis. J. Econ. Entomol.-1993.-V. 86.-p. 989-994.

126. Sumerford, D.V., D.D. Hardee, L.C. Adams, and W.L. Solomon, Status of Monitoring for Tolerance to CrylAc in Populations ofHelicoverpa zea andHe/iolhis virescens: Three-Year Summary. 1999 Proceeding of the Beltwide Cotton Conferences (1999).

127. Tabashnik В. E., Cushing N. L., Finson N., Johnson M. W. Field development of resistant to Bacillus thuringiensis in diamondback moth (Lepidoptera: Plutellidae). // J. Econ. Entomol.-1990,-v. 83.- p. 1671-1676.

128. Tabashnik, B.E., Evolution of resistance to Bacillus thuringiensis. II Ann. Rev. Entomol-1994.-V.39.-P. 47-79.

129. Tabashnik, В. E, R. T. Roush, E. D. Earle, A. M. Shelton, Resistance to Bt toxins. // Science.-2000.-v.287.-p.42

130. Tabashnik, В. E., N. Finson, C. F. Chilcutt, N. L. Cushing, and M. W. Johnson, Increasing Efficiency of Bioassays: Evaluating Resistance to Bacillus thuringiensis in Diamondback Moth (Lepidoptera: Plutellidae). // J. Econ. Entomol.-1993.-v.86.-p. 635

131. The use of electroforesis for identification of adult whiteflies( Homoptera: Aleyrodidae ) in Israel and Colombia // Wool D., Gerling D., Nolt B.L., Constantino L.M., Delloti A.C.et. al. Appl. Ent. 1989.- V.107.- P. 344-350.

132. Trisyono A., Whalon M. E. Fitness costs of resistance to Bacillus thuringiensis in Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). II J. Econ.

133. Entomol.- 1997. V. 90. - p. 267-271.

134. US National Research Council (2000). Genetically modified pest-protected plants: Science and regulation. National Academy Press: Washington. DC, USA.

135. Use of the RAPD-PCA to detect DNA polimorphisms in aphids. Black W.C., Duteau N.M., Puterka G.J., Nechols J.R., Pettorini J.M.// Bull. Entomol. Res.-1992.-V.82(2).- P.151-159.

136. Vaeck M., Reybnaerts A., Hofte J. et al. Transgenic plants protected from insect attack. // Nature. 1987. - V. 328. - p. 33-37.

137. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCA with arbitrary primers//Nucl. Acids Res. 1991. V. 18. P. 7213-7218.

138. Whalon M. E., Miller O. L.,Hollingworth R. M. e. a. Selection of a Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) strain resistant to Bacillus thuringiensis // J. Econ. Entomol.-1993.- v. 86.-p.226-233.

139. Whalon M. E., Wierenga J. M. Bacillus thuringiensis resistant Colorado potato beetle and transgenic plants:some operational and ecological implications for deployment. // Biocontrol Sci. Technol. 1994. - V. 4. - p. 555-561.

140. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J. et al. DNA polymorphism's amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 6531-6535.л1. W ш