Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Изменчивость линий регенерантов ячменя по признакам устойчивости к болезням, морфологии и продуктивности

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Изменчивость линий регенерантов ячменя по признакам устойчивости к болезням, морфологии и продуктивности"

госсипшя лклдаш скльскохозяйсгвеншх наук

всероссийский научно - исследовательский институт защиты растений

На правах рукописи

? У

шевченко Денис Николаевич

изменчивость линий регенерлнтов ячменя но пв13накам устойчивости к болезням,

ыогеологии и продуютшюсти

Специальность: 06.01.11 - защита растений от вредителей

и болезней

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Стшт-Петербург

1994

Работа выполнена п лаборатории иммунитета растений к болезням Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Н. 11.Гусева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Б.В.Ригин и кандидат биологических наук С.Л.Тютереп

Ведущее учрекдение - Северо - Западный научно -исследовательский институт сельского хозяйства "Белогорка"

1 - Защита диссертации состоится " 199-1 г.

в " ' " часов на заседании Специализированного совета Д. 020. 01. 01. во Всероссийском научно - исследовательском институте защиты растений по адресу: 189620, Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЗР.

Л -У

Автореферат разослан " " 1994 г.

/

Ученый секретарь Специализировшгного совета, / кандидат биологических наук ¡// /"Г.А.Наседкина

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ. К числу наиболее распространенных болезней ячменя откосят обыкновенную корневую гниль, сетчатую и темно - бурую листовые пятнистости, мучнистую росу и карликовую ржавчину. Обыкновенная корневая гниль и темно-бурая листовая пятнистость - это болезни, вызываемые грибом Bipolaris soroKiniana. Несмотря на применяемые химические и агротехнические методы борьбы, ежегодные потери урожая от этих болезней могут составлять 10 - 70х. Возбудитель сетчатой пятнистости ячменя

- гриб Drechslera teres, широко распространенный патоген, снижающий качество и количество урожая во всех районах возделывания ячменя. В нашей стране потери урожая в разные годы составляли 8

- 20 у. (АФанасекко. 1977). мучнистая роса (возбудитель ErysiPhe. gramnis) - вредоносна и повсеместно распространена в зонах возделывания ячменя. Ежегодные потери урожая могут составлять до 30 х. Карликовая ржавчина (Puccima. hordei) также является вредоносным патогеном, к которому восприимчиво подавляющее большинство образцов ячменя (Лукьянова и др., 1990).

Селекиня на иммунитет ведется, в основном, с использованием доноров, однако беккросы занимают длительное время. Кроме того, к некоторым болезням может не быть эффективных доноров устойчивости. Так, з отношении болезней, вызываемых Bipolaris soroKiniana отсутствуют надежные доноры устойчивости, существует относительно небольшое количество работ по генетике устойчивости к этим болезням, а целенаправленная селекция ка устойчивость до сих пор не приносит существенных результатов, что связано, вероятно с полигенным наследованием устойчивости.

Таким образом, работа по созданию исходного материала для селекции ячменя с еироким спектром изменчивости по устойчивости ,к болезням является необходимой. Наряду с традиционными методами создания генетического разнообразия, с начала 80-х годов применяют биотехнолопг-геские методы, основанные ка использования явления сомаклональной изменчивости, когда генетическое разнообразие создается при культивировании соматических клеток in vitro. Использование культуры тканей в селекционных программах требует разработки способов регенерации растений. Ячнекь считается трудной культурой для биотехнологических работ из-за низкой регене-раиионной отзывчивости. Таким образом, АКТУАЛЬНА работа по созданию методов регенерации растений в культуре m vitro ячменя.

- £ -

позволяющих получать регенергнты в количествах достаточных для изучения явления сомаклональной изменчивости и выделения устойчивых к болезням сонаклональньЕ мутантов.

Цель настоящего исследования - разработка метода эффективного каллусогенеза и регенерации в культуре каллусов .различных сортов ячменя и изучение полученных лхкий регенерантов по признакам устойчивости к болезням, а также со морфологическим и хозяйственным признакам. Для достижения этой~пели было необходимо решить следующие задачи:

- оценить регенераиионную способность сортов;

- оценить регенераиионную способность различных типов зкс-плантов (незрелые зародыши, незрелые соцветия, пыльники);

- оптимизировать метод по.-.учения регенерантов ячменя с высокой эффективностью независимо ст генотипа;

- получить линии растений - регенерантов (Ro) в культуре незрелых зародышей различных сортов ячменя;

- провести оценку исходных сортов . и линий регенерантов поколений R1 и R2 по признакам устойчивости к болезням, хозяйственным и морфологическим признакам.

- сравнить эффективность двух методов получения линии, устойчивых к темно-бурой листовой пятнистости: поиск устойчивых генотипов в коллекции вир и поиск устойчивых линий среди потомства регенерантов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Бгервые получили высокоэффективный каллусогенез и регенерацию независимо от влияния генотипа в культуре незрелых зародышей 13 сортов ячменя. Разработанная методика позволяет получать растения - регенеранты в количествах-достаточных для практического использования. Влияние генотипа на регенераиионную способность было значительно снижено за счет оптимизации методики по двум параметрам: подбору оптимальной стадии развития незрелых зародкзей и подбору состава питательной среды. Впервые в составе среды для получения каллусов из соматических тканей была использована мальтоза в качестве основного источника углеводов, также впервые использовали культуральную жидкость гриба Bipolaris soroi'.iniana в качестве компонента среды. стимулируюшего образование эмбриогенных каллусов. Линии растений - регенерантов изучались в поколениях Rl, R2 и R3 по комплексу признаков морфологии, продуктивности и устойчивости к болезням: темно-бурой листовой пятнистости (возбудитель BlPOlaris soroKiniana), сетчатой пятнистости (Drechslera teres).

мучнистой росе (ErysiPhe graminis) и карликовой ржавчине (Puccinia hordei). Выделены линии регенерантов. отличающиеся от исходных сортов по некоторым признакам морфологии и устойчивости к болезням. Измененные линии сохраняли отличия в поколениях R2 и R3.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Разработана методика получения эмбриогенных каллусов в культуре незрелых зародышей ячменя., которая позволяет получать растения - регенеранты независимо от влияния генотипа, в количествах, достаточных для практического использования явления сомаклональной изменчивости в селекционных программах. Получены линии регенерантов пяти коммерческих сортов ячменя с устойчивостью проростков к темно-бурой листовой пятнистости на уровне имеющихся в коллекции ВИР устойчивых образны. Кроме того, из восприимчивых сортов получены линии регенерантов устойчивые в проростках к сетчатой пятнистости, мучнистой росе и карликовой рхаЕчине. Линии регенерантов охарактеризованы по признакам морфологии и продуктивности.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы были представлены на конференции аспирантов и молодых ученых ВИР им. К. И. Вавилова 11992 г.). II международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алма-Ата. 1993 г.), IV Международной конференции "Изогенкые линии и генетические коллекции" (Новосибирск, 1?93 г. ) и II Международной конференции "Биотехнология Санкт-Петербург 94" (С-Петербург. 1994 г. )

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам работы опубликовано 3 работы, 3 работы находится в печати.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, рекомендаций, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 7 рисунками и 21 таблицей. Библиография Еключает 158 источников, 26 из них на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Глава 1. Обзор литературы. Приведены имеющиеся в литературе сведения о каллусогенезе и регенерации в культуре in vitro злаков, о перспективах использования культуры тканей и явления со-маклональксй изменчивости для создания ценных в селекционном отношении генотипов ячменя и пшеницы.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В исследования были включены 13 сортов ярового ячменя (Hordeum vulgare Инг сорта пшеницы (Triticum aestivum L. ),

районированные и перспективные для районирования, с различной ре-генераиионной отзывчивостью в культуре незрелых зародышей.

Отбор зародышей производили в конце молочной стадии - начале стадии спелости зерновки. При отборе зародъаей, находящихся на оптимальной стадии развития ориентировались на морфологический маркер: прозрачный - полупрозрачный щиток н серо - белая, непрозрачная осевая часть. Еыделение зародышей, культивирование каллусов и получение регенерантов проводили по методике Тырышкин и др. (1991). '

Для культивирования незрелых зародышей к каллусов у ячменя на этапе подбора состава питательной среды использовали среды КБ ( модифицированная). М2, 1Т, икт ( модифицированная ) (таб. 1). Среда КИТ представляет собой среду МЯ, в которой макросоли

Таблица 1

Состав питательных сред для индукции каллусообразования

Компоненты HS NMT мг LT

макроэлементы: MS «« N6 • N5 N6

микроэлементы: MS MS MS MS

витамины: MS MS MS MS

asparagme 250 mg/l 250 rng/1 250 mg/l 250 mg/l

glutamine г 50 mg/l 250 mg/'l 250 mg/l 250 mg/l

шю- inositol 250 mg/l 250 me/i 250 mg/l 250 mg/l

дрожжевой экстракт 300 mg/l 300 ms/i 300 me/1 300 mg/l

нитрат серебра AgNo3 10 mg/l 10 me/l 10 mg/l 10 mg/l

сахароза 30 6/1 30 g/l — —

мальтоза — — 25 g/l 25 e/1

культуральная жидкость

В. soroKiniana х ю — — — 5 ml/1

г. 4. 5-Т £. 5 mg/l 2. 5 mg/l 2. 5 mg/l 2. 5 mg/l

агар j 8 6/1 8 g/l 6 Vl 8 g/l

PH = 5. в - б. 0 -

Примечания: » среда Нб (Chu et al.1975);

<* среда КЗ Ciurashige and SKoce, 196£) заменены на набор макросслей среды N6 (Chy et al.1975). Среда И2 - это модифицированная среда НКТ, в которой сахароза заменена на мальтозу. Среда LT - это модифицированная среда М2, к которой добавлена культ/ральная жидкость (КЖ) гриба Bipolaris soroKmlana.

КЖ получали путем культивирования высокотоксичного штамма "Т" Bipolaris soroKmiana на жидкой среде Прингла (по 150 мл среды в 0. 5 л колбах) в течение 28 суток. Полученную КЖ центрифугировали при 16000 оборотах/мин. лиоФильно высушивали, разводили дистили-ровакной водой до 10 кратной концентрации от исходной КЖ и добавляли в среду LT перед автоклавированием (0. 8 атм. -20мин) - 5 мл/л. Для индукции калусообразования использовали 2'. 4. 5-трихлор-Феноксиуксусную кислоту (2. 4.5-Т) - 3 мг/л, растворенную в 36 ч. этаноле, которую добавляли в колбы со средой после ее автокла-вирования. Также после автоклавирования в среду добавляли водный раствор азотнокислого серебра (10 мг/л).

Учет количества эмбриогенных и регенерирующих каллусов проводили через 4 недели после эксплантации зародышей на среду. Визуально оценивали два типа каллусов: 1) неэмбР.иогенного. типа -неструктурированный, мягкий, водянистый; 2) эмбриогекный - структурированный, плотный, чаые желтый, иногда белый. Рассчитывали процент эмбриогенных каллусов от обшего чи ела калл усов.

Опыты по получению каллусов и регенерантов в культуре пыльников ячменя проводили по методике Kuhlmann and Foroughi-Vehr (1991).

Б культуре незрелых соцветий оценивали эффективность каллусо-генеза и регенерации в зависимости от размера соцветий. Для выделения использовали соцветия длиной: - менее 1 мм; - 1 - 3 мм: - 3 - 5 мм; -5-7 нм; - 7 - 10 мм; - 10 - 15 мм; - 15 - 20 мм; более 20 мм. Соцветия длиной более 3 мм разрезали на кусочки по 1 -2 мм. Для индукции каллусогенеза использовали среду LT с 2 и Змг /л 2. 4.5-Т. Учет каллусогенеза и эмбриогенеза проводили через 4 и 8 недель. Рассчитывали процент каллусов от обшего количества экс-плантоз по каждому сорту и по каждому интервалу длин соцветай. Полученные в теплиае семена регенерантов поколений R1 и R2 высевали з поле ка рядковых делянках 1 м по схеме Ю х 10 см и обсевали сортом - стандартом. Убирку проводили снопами, по линиям.

Лабораторную оценку устойчивости проростков исходных сортов и линий регенерантов к сетчатой пятнистости проводили методом листовых отрезков ка бензимидазоле(АФанасенко, 1988). Для инокуляции использовали клоны, выделенные из Ленинградской и Саратовской популяции d. teres.

Лабораторную оценку устойчивости проростков к темно-бурой листозой пятнистости проводили по модифицированной методике Ты-рышкин и Михайлова (1991). Отрезки листьев проростков инокулнро-

- б -

еэли споровой суспензией штамма "Т". выделенного как наиболее агрессивного среди 20 моноспоровых изолятов из различных популяций.

Лабораторную оценку проростковой устойчивости к карликовой ржавчине проводили по методике Л. А. Михайловой и Тырышкина Л. Г. (1988). Листовые отрезки инокулировзли суспензией спор из штанмов ленинградской популяции.

Лабораторную оценку проростковой устойчивости к Erysiphe graminls проводили методом -листовых отрезков на бензимидазоле. Возбудителя выделили из полевого материала 1993 г. собранного на посевах ячменя Пушкинской станции ВИР. В течение всего периода оценки возбудителя мучнистой росы культивировали в теплице на растениях восприимчивых сортов. Листовые отрезки опрыскивали суспензией из конидий тепличной популяции в концентрации 40000 конидий/мп.

Опенка проростковой устойчивости образцов из мировой коллекции ВИР прсзодилась по тем же методикам, что и оценка линий реге-нерантов.

Семьи регенерантов поколения R1 и линии R2 и исходные сорта оценивали по морфологическим признакам и признакам продуктивности: - длина соломины главного стебля ; - длина Флагового листа; -длина колоса без остей; - количество зерновок в колосе; - количество продуктивных стеблей; - средняя масса 1000 зерен с растения.

Глава 3. Повышение эффективности регенерации в культуре каллусов, инициированных из различных типов эксплантов ячменя

Лимитарушим Фактором использования культуры in vitro в селекционные программах является низкая регенераиионная способность большинства генотипов ячменя. Поэтому целью данной части работы было создать высокоэффективную методику получения эмбриогенных каллусоз з культуре незрелых зародышей ячменя различных сортов, независимо от влияния генотипа.

На перзо.ч этапе работы был подобран маркер.оптимальной стадии развития незрелых зародышей. В качестве признака зародышей, способных к инициации каллусов с высокой регенерационной способность» . у ячменя возможно использовать морфологический маркер "прозрачность щитка". Было показано, что .зародыши изучаемых генотипов с таким морфологическим маркером образуют регенерирующий каллус с высокой частотой. Однако, при использовании среды Мура-шиге - 0:7га (Murashige and SKoos,1962) для культивирования различных сортов ячменя наблюдали значительную разницу между ними в

змбриогенной (а значит и регенерационной) отзывчивости. Следующей нашей задачей было подобрать такой оптимальный состав питательной среды, на которой различия между генотипами по гффективности эмбриогенеза были бы сглажены, что дало бы возможность получать растения - регенеранты независимо от влияния генотипа.

Незрелые зародыши сортов ячменя и пшеницы образовывали эмбри-огенные каллусы на средак HS, NMT, М2 и LT с различной частотой (таб. 2)

На среде NHT частота образования эмбриогенного каллуса варьировала в зависимости от генотипа растения от 2. 03 '/. у сорта Зазерский 85 до 66. 7>. у сорта Golden Promise. Низкая частота образования эмбриогенкого каллуса • отмечена на этой среде у сортов Sajorne (б. az) и Diäsa (7. 9/.). На среде HS частота эмбриогенеза -варьировала также :начительно - от 1. 57z у сорта Зазерский S5 до 66. 1 z у Golden Promise. У сортов Salome и Dissa эффективность эмбриогенеза на зтой среде была значительно выше - 30.0 и 22.83/ соответственно, а у сортов Roland и KIM. наоборот, процент эмбри-оггнных каллусов был выше на среде MS, чем на NMT.

На среде К2 крайние значения изучаемого признака были значительно выше и составляли 22.2'/■ У сорта KIM и 99. ¿У- У сорта Golden ?r;mise; для всех остальных сортов частота образования эмбриоген-ного каллуса пренъ^ала 40'/.

На среде LT са^ая низкая частота образования эмбриогенных каллусов составляла 45.4/. у линии 21849, а у Golden Promise достигала 100'/. Образование эмбриогенных каллусов с частотой свызе 60'/. отмечено на среде LT у сортов Mamie, Salome, Hassan. S-170; более 70'/ у сортов Roland и Dissa.

Представленные данные свидетельствуют, что использование сред Y.C и LT содержащих мальтозу значительно повысило эффективность образования змбриогенного1каллуса у большинства изученных генотипов. Максимальные значения для сорта Golden Promise -100'«'. и 98,2'/. получены на средах LT и М2 соответственно. Исключение составляет линия К21849. для которой получена одинаковая частота индукции знбриогенного каллуса на всех 3-х средах и сорт Одесский 115, у которого нет значимых различий по этому показателю на средах NMT и М2. При сравнении среды LT и М2 также выявлены значимые отличия в увеличении частоты образования эмбриогенного каллуса на среде LT в 7 из 12 случаев. Только в 5 случаях у сортов Salome. PirKKa, К21849. Зазерский 35 и S-170-74 увеличение значений изучаемого

Таблица 2

Эмбриогенез в култьтуре незрелых зародышей ячменя и пшеницы

среда MS среда NMT среда И2 среда LT

СОРТ

всего эмбриогенных всего эмбриогенных всего эмбриогенных всего эмбриогенных

каллу- каллусов, У- каллу- каллусов, z каллу- каллусов, '/■ каллу- каллусов, Z

сов (♦-1 ошибка сов (♦-) ошибка сов ( + -) ошибка сов ошибка

Golden Promise 137 86. 1 г. 95 288 68. 8 £ 2. 73 514 98. 3 А 0. 58 251 100. 0± 0. 10

Line 21849 -- -- 4 -- 25 40. 0 JL 9. 99 43 46. 5 £ 7. 61 33 45. 5 А в. 67

Hajari -- fr -- 139 31, 7 + 3. 95 67 50. 2 + 0. 03 59 «3. 1 + 4. 8»

Одесский 115 21 28. 6 4 9. 86 57 31. б £ 6. 16 48 41. 7 J: 7.12 75 66. Т £ 5. 44

S-170-74 11 36. 4 £ 14. 5 23 30. 4 £ 9. 59 26 69. 2 £ 9. 05 V 37 81. 1 А 6. 44

PirKKa 11 17. 1 L 5. 88 99 22. 2 £ 4. IS 43 58. 1 7. 52 86 66. 3 £ 5. 10

Roland 70 7. 1 £ 3. 08 116 18. 1 + 3. 58 123 59. 4 + 4. 43 147 73. 5 £ 3. 64

Mamie 100 29. 0 ± 4. 54 41 14. 6 £ 5. 52 105 43. 8 i 4. 84 209 81. 8 ± 2. 67

Dlssa 276 22. 8 ■£ 2. 53 215 7. 9 ± 1. 84 392 68. 9 ± 2. 34 421 75. 5 + 2. 10

Sn1ome '10 30. 0 t 7. 25 ДО'1 б. 9 * 1. 77 158 81. 0 t 3. 12 275 86. б * 2. Об

Зазерский 05 127 1. б £ 1. 1 395 2. 0 £ 0. 71 201 53. 7 1 3. 52 £68 58. 9 ± 3. 00

KIM 39 10. 3 £ 9. 81 42 2. 4 2. 35 9 22. 2 ±13. 86 60 60. 0 + 6. 32

Московский 2 — — - -- - - 22 45. 5 НО. 62 25 64. 0 1 9. 60

Orofen , 71 67. б £ 5. 55 83 75. 9 £ 4. 69 36 95. i ± 4. 37 57 92. 9 £ 3. 38

Zaragoza 87 77. 1 А 4. 5 27 70. 4 * 8, 79 18 94. 4 ill. 41 зг 93. г ± 8. 23

признака на среде LT по сравнен!«) со средой И2 были недостоверны.

В опытах по получению каллусов в культуре незрелых соцветий наблюдали зависимость э?;ективности образования каллусов от генотипа и длины экспланта. Для всех сортов ячменя наиболыпая эффективность каллусообразовгкия наблюдалась при длине зкспланта 1 - 3 им: от 4. 7 х у сорта Roland до 15. б z у сорта Golden Premise. При увеличении длины .соцветий до 5 мм эффективность каллусогенеза существенно снижалась, а при длине свыше 5 мм не наблюдали образования каллусов.. Соцветия длиной менее 0.5 мм также плохо образовывали каллусы: часто наблюдали некротизацию тканей, либо каллусообразование происходило, но каллусы были мелкими, незмбри-огенными. От 70 до ЪЧУ. каллусов, в зависимости от сорта, регенерировали растения после пересадки на среду для регенерации. Обаая эффективность метода по.-.учения регенерантов в культуре незрелых-соцветия была ниже, чем эффективность культуры незрелых зародышей. Оба сорта пшеницы образовывали эмбриогенные каллусы с высокой эффективностью независимо от длины соцветий.

Пыльники ячменя сортс-з Dlssa. Зазерсккй 35, Golden Promise культивировали на жидкой питательной среде с Фиколом. Через 1 неделю после эксплантации пыльников, в жидкой среде наблюдали большое количество микросг.;?. а при учете через 3 недели наблюдали образование каллусов и эмбриоподобных структур. V сорта Dlssa а трех повторностях наблюдали образование каллусов и эмбриоидоз с эффективностью б. 7, 50 л 200у. от числа эксплантировакных пыльников, соответственно. Частота каллусообразования у обоих сортов пшеницы была значительно выше, чем у сортов ячменя - от 147 до 179. ЗУ- и существенно не различалась по повторностям. После учета, каллусы и эмбриоиды ячменя и пшеницы помешали на агаризованную среду для регенерации. Частота регенерации у ячменя была невелика -17-21/, а у паекииы оксло 50Х каллусов давали регенеранты. У остальных каллусов наблюдали образование корней. До 50Z полученных растений - регенерантов г ячменя были альбиносами. V пшенипы, 21 регенерант был пересажен в почву, однако полученные растения были не Фертильными карликами и не дали семенного потомства.

Среди трех типов зкег.лантов ячменя (незрелые зародили, незрелые соцветия vi пыльники> только незрелые зародили обеспечивали эффективное получение большого количества змбриогенных каллусов и регенерантов различных сортов. В культуре незрелых зародышей было получено наибольшее количество семян регенерантов различных сортов ячменя в количествах, достаточных для изучения изменчивости

среди линий регенерантов по признакам устойчивости к болезням, морфологии и гродуктивности.

Глава ч. Опенка линий регенерантов на устойчивость к болезням.

Линии регенерантов пяти сортов (Golden Promise, Dissa, Mamie, Roland, Одесский 115) были оценены на устойчивость к темно-бурой листовой пятнистости (возбудитель Bipolaris soroKimana Sïioera. ), сетчатой пятнистости ( Drechslera teres I to. ), мучнистой росе (ErysiPhe graianis f. hordei) и карликовой ржавчине (Puccinia hordei Otth. ). Опенку проводили в поколениях R2 и R3.

Среди лин;сй регенерантов всех сортов было выделено различное количество устойчиеых и расшепляюшихся Форм (Таб. 3). Частота появления устойчивых в проростках к В. soroKiniana и D. teres линий варьировала от 1. г и до 3. 9'/-. Частота появления расшепляюшихся линий была Bazs частоты устойчиеых у всех изучаемых сортов. У сортов Golden Promise и Dissa частота появления линий, устойчивых к В. soroKiniana и D. teres была , по-крайнс-й мера в два раза выше, чем частота появления линий, устойчивых к е. gramiriis и f. hordei. Это может быть связано с различным типом генетического контроля устойчивости к этим патогенам: частота мутаций по устойчивости к ' 3. soroKiniana и D. teres выше из - за полигенного контроля этого признака, в то время как олигогенкый контроль устойчивости к е. graminis и .".hordei предполагает и сравнительно низкую частоту мутаций.

Сорт Одесский 115 в наших опытах был устойчив к мучнистой росе. Большинство линий - 119 (97. б*) были устойчивы на уровне исходного сорта (Таб. 3). Две линии были расшеплякжимися, а 1 линия имела восприимчивый тип реакции. При проверке распепляюсихся линий в поколении R3 обнаружили, что 1 из них была нерасшепляшейся восприимчивой , а вторая линия была расшепляюшейся. одна восприимчивая линия 52, в поколении R3 сохранила восприимчивость. Частота появления восприимчивой и расшепляюшихся линий у устойчивого сорта (0.8 и ft. соответственно) сопоставима с частотой появления устойчивые к расшепляюшихся линий у восприимчивых сортов Golden Primise (О. 8Z и 1.9*) и Dissa (0.7'/. и 2. 9*).

Для выяснгну.я вопроса о сушестовании высокоустоичивых к В. soroKiniana генотипов нами была проведена оценка образцов из Кировой коллекции ячменей ВИР, известных как устойчивые. Оценку вели на листовых отрезках проростков и взрослых растений.' для

- и -

Таблица 3

Частота появления измененных линий г.о устойчивости проростков регеиерантов поколения ка к болезням

СОРТ Возбудители б олезней

1

В. soroKin. ! D, teres Е. ьГ aminis ?. horde:

кол-во у- ! кол-во У. К0Л-2 0 У. кол-so

ЛИНИЙ, линий. ЛИНИ'/ • линий,

Со!den Frcr.ise

всего линий. .4 1074 100. 0 1103 100. 0 376 100. 0 390 100. 0

-н/р линии 18 1. 7 13 1.2 3 ... о, а 2 0. 5

- р. линии 34 3. 2 31 2. S 7 1. 9 д г. з

Di ssa

гсего линий,H 140 100. 0 140 100. 0 139 100. 0 131 100. 0

-н/р линии 2 1. 4 3 г. 1 1 0. 7 1 0. s

- Р. линии 9 Ö. 4 5 3. б LL 2. 9 2 1. 5

Roland

всего линии. M 133 100. 0 133 100. 0 -- -- -- --

-н/р линии 2 1. 5 4 3. 0

- р. линии 7 5. 3 7 5. 3

• Kamie, R3

всего линий,я 203 100. 0 208 100. 0 -- -- --

-н/р линии 3 3. 9 3 1.4

- Р. линии 14 6. 7 10 4. 8

Одесский 115

всего линий.и 123 100. 0 123 100. 0 122 100. 0 -- --

-н/р линии 2 1. 6 2 1. 6 119 97. 6 -- --

- Р. линии 4 2. 8 7 5. 7 с 1. 6 -- --

-Н/р ВОСПРИИК. -- ; 0. 3 - 1 --

Примечание: р/линии - расщепляющиеся линии, содержащие как устой-чпЕые, так и восприимчивые растения; ■ н/р линии - нерасэепляюшиеся линии, содержание только устойчивые растения; гекерантов. Всего в проростках было оценено 75 образцов, в том числе выделенные по устойчивости в условиях Ленинградской, свердловской областей и Дальнего Востока. 'Из них. четыре образца пока-

з=ли тип реакции на уровне 3 балла: Тогузак, Черниговский 90 Могех, Preria. Не было обнаружено более устойчивых образцов, чем выделенные нами среди линий регенерантов.

Глава 5. Изменчивость линий регенерантов по признакам морфологии и продуктивности

Линии регенерантов сорта Golden Promise изучали по признакам морфологии и продуктивности в поколениях R1 и R2 (таб.4).

Среди семей поколения R1 наблюдали высокий процент отличающихся от контроля по всем изучаемым признакам: от 20.5Z (длина колоса) до 5S. Оi (продуктивная кустистость). В поколении R2 изучали изменчивость по линиям, которые были образованы отдельными растениями, составлявшим в прошлой поколении семьи. Изменчивость среди линий R2 была значительно ниже: от 1.5и ( длина пластинки фагового листа) до 17. 3/. ( масса 1000 зерен).

V ряда линия наблюдали сохранение отличий, наблюдавшихся по нескольким признакам в поколении R! и в следующем поколении. Так, по признаку продуктивная кустистость, девять линий из 65. отлича-гсихся от контроля в RI, сохранили это отличие в поколении R2, по длине стебля, из 57 линий, отличающихся от контроля в R1, три линии также имели отличия и в R2, аналогично по другим признакам. .Чалое количество линий, отличиюшкхся от контроля в обоих поколениях. по - видимому свидетельствует о том, что отличия большинства семей R1 и линий R2 имели Физиологический характер и были вызваны влинием условий окружающей среды. Линии, отличавшиеся в обоих поколениях, по-видимому, имеют генетическую природу этих отличий.

Среди растений. образующих семьи поколения R1 наблюдали значительную вариабельность, поэтому в следующем поколении семьи зысеяли по растениям, каждое из которых образовало линию R2. Каждая линия поколения R2 является потомством одной зерновки регене-ранта Ro. Наблюдали достоверные отличия линий поколения R2 друг 1 от друга и от исходного сорта, что свидетельствует о гетерогенности семей поколения R1 по изучаемым признакам. В поколении R2 наблюдали линии, отличающиеся от контроля и друг от друга как по одному признаку, так и по нескольким.

Линии - потомки регенерантов. происходящих из одного каллуса также имели значимые отличия друг от друга по всем изучаемым признакам, что может быть следствием генетической неоднородности клеток каллусной ткани из которой были получены растения - реге-неранты, т.е. регенерация растений из различных участков ткани

Таблица 4

Отличия линий регенерантов от исходного сорта Golden Promise по признакам морфологии и продуктивности

признак, поколение кол-во семей, линий меньше контроля больше к;ктроля всего отличаются от контроля

N V. N N 7.

продуктивна к2 » к1 и яг 1Я кустис 112 138 80 тость 40 и 4 35. 7 7. 9 5. 0 25 1 5 гг. з 0. 7 6. 3 65 12 9 58. 0 8. 7 11. 3

длина стеб; |?г л и р2 1Я 112 142 37 24 5 1 21. 43 3. 52 2. 7 33 8 2 29. 46 5. 63 5. 4 57 13 3 50. 90 9. 16 8. 11

масса 100С !?1 линии 1?2 Я1 и кг зерен 110 133 65 1 1 нет 0. 9 0. 75 1. 5 53 22 18 48. 2 16. 5 27. 7 54 23 18 49. 1 17. 3 27. 7

длина ко] й'1 иг 51 и кг юса 117 133 51 1 13 нет 0. 85 0. 8 23 нет нет 19. 7 24 13 нет 20. 5 9. 8

длина Фл 1?1 И£1 К1 и И2 аг. листа 106 133 54 нет нет нет ■ - £2 20. 8 1. 5 10. 0 22 2 2 20. 8 1. 5 10. 0

кол. зерно К1 вг ?! и й2 вок в ко 117 132 61 юсе 2 14 1 1. 71 10. 6 1. 6 37 31. 6 3. 1 1.6 39 18 2 33. 3 13. 7 3. 2

Примечание: « - кол-во линий, сохранивших отличия в и Я2;

каллуса приводила к образованию отличающихся друг от друга по ряду признаков семей, а в последствии и линий регенерантов. Среди причин неоднородности тканей, составляющих каллус может быть мутационная изменчивость клеток под дейстзием условий культивирования in vitro.

В наших опытах наблюдалась относительно высокая частота появления линий регенерантов, отличающихся от исходных Форм как по признакам устойчивости к болезням (Таб.3), так и по признакам морфологии и продуктивности (Таб. 4). Причем в нескольких случаях измененные по признакам устойчивости к болезням линии передавали эта признаки и в поколение R3, что, вероятно, может свидетельствовать о мутационном характере этих изменений, среди вероятных Факторов, которые могли привести к поЕЬсению изменчивости среди линий регенерантов, может быть прохождение генотипами стадии неорганизованного роста в культуре каллусов. Сохранение отличий, наблюдавшихся в поколении S2 и в следующем поколении R3 может свидетельствовать о нутационном характере наблюдаемой изменчивости, и следовательно, о проявлении в данном случае явления сомак-локальной изменчивости.

Ряд линий, выделившихся по устойчивости к болезням, были изучены также по признакам морфологии и продуктивности (Таб.5). Ликин, отличагалиеся от исходного сорта можно сгруппировать следующим образом: 1) линии, отличающиеся как по устойчивости к болезням, так и по морфологическим признакам: 43Ы. 43Ь2. 41-1, 41-2, 41-8, 41-9, 7бЪ7; 2) ликки, отличавшиеся по устойчивости к болезням, и не имеюшие отличий по морфологическим признакам: 3За2, 79Ы, 77Ы; 3) линии, устойчивые более, чем к одному патогену - это линии 79Ы и ззаг устойчивые к В. soroKiniana и D. teres; линия 4-5. устойчивая к В. soroKiniana и расшепляюшаяся по устойчивости к Е. graminis и P. hordei; линия 65а&, устойчивая к Б. soroKiniana и расшепляюшаяся по устойчивости к Е. graminis;

Линия 43М устойчива к P. hordei и зосприимчива к остальным патогенам, кроме того эта линия отличалась от контроля по морфологическим признакам, в то время как полученная из другой зерновки этого же регенеранта линия,43Ь2 отличалась от контроля по тем же признакам морфологии, но была устойчива к Е. graminis и восприимчива к P. hordei.

Таким образом, среди линий отличающихся от исходного сорта по устойчивости к болезням можно наблюдать как линии аналогичные сорту по другим признакам, так и значительно измененные линии, -

Таблица 5

Линии регенорлцтоп порта ЯоЫеп Рголияе, выделившиеся по устойчивости к болезням

ЛИЛИЯ о э устойчивость к возбудителям признаки морфологии и продуктивности

В. зого- Р. 1егей К. Я1\1- Р. Ьоп1е1 ПРОДУКТОВ!!. длина масса 1000 длина длина кол. зерно-

Кхшапа тпиа кустистость стебля зерен колоса Ф. лист вок в кол.

79Ь1 К Я г Э к К К К К К

л..<иа К к :; к К К 14 К 1'.

43Ы 3 5 Б К к Ж Ж к Ж <К

43Ь2 3 3 1? Б к Ж Ж к Ж <К

41-1 3 I? 3 г к ж К к к К

41-г к 3 3 к 'К К <11 к к

41-6 Б 15 5 3 к к к к к к

41-9 Э й 3 г к к ж к к к

76Ь7 3 1? г г к к к к к к

77Ы Э Я 3 3 к к к к к к

ббаз I? Э 5 - - - - - -

4-5 й г КБ иг — - - - - -

Примечание: 3 - восприимчивость; К - устойчивость. КЗ - линии е рлсшенлением но устойчивости. к - линии не отличались от контроля по признакам морфологии и продуктивности; >К - среднее значение по данному признаку у линии достоверно больше среднего значения

п контроле;

<К - среднее значение признака у линии достоверно меньше среднего значения в контроле

имеющие отличия по признакам морфологии и продуктивности. Вероятно, изучение линий регенерантов районированных сортов позволяет обнаружить генотипы с рядом ценных признаков, отсутствующих у исходного сорта, а метод получения регенерантов в культуре in vitro с последующей оценкой и выделением денных генотипов может использоваться для создания устойчивых к болезням аналогов районированных сортов ячменя. Срок всей работы, от получения регенерантов до оценки коллекции регенерантов и.-выделения ценных генотипов занимает около четырех лет, что значительно меньше срока создания аналогов с использованием доноров признаков и многократных бекк-росов.

Изучение характера расщепления в поколениях Rl, R2 и R3 по признакам морфологии, продуктивности^ и устойчивости к болезням привели нас к заключению , что для обнаружения Форм, отличающихся от исходного сорта, необходимо изучение регенерантов поколений R2 и R3, по линиям, происходящим из каждой зерновки регенеранта Ro.

Выводы

1. Разработана технология получения исходного материала для селекции ячменя с широким спектром изменчивости по устойчивости к болезням и по ряду хозяйственно - ценных признаков. Использование разработанной технологии позволяет значительно ускорить получение устойчивых к патогенам аналогов районированных сортов.

2. Разработана методика высокоэффективного каллусогенеза и регенерации в культуре незрелых зародышей ячменя и пшеницы. Методика основана на использовании незрелых зародышей находящихся на оптимальной стадии развития и питательной среды LT, в' состав которой входит мальтоза и культуральная жидкость гриба Bipolaris soroKimana. •

3. В культуре незрелых зародышей, незрелых соцветий и пыльников ячменя и пшеница получены растения - регенеранта. Наибольшая

4 эффективность регенерации и получения семенного потомства регенерантов наблюдалась в культуре незрелых зародыаей: свыше 50 '/. каллусов были змбриогеннкми для наименее отзывчивых генотипов, для 7 сортов ячменя из 13 эффективность эмбриогенеза была Еыше 80Z.

4. Получены линии регенерантов, превосходящие исходные сорта по устойчивости к болезням:

- линии устойчивые в проростках к темно-бурой листовой пятнистости (18 линий сорта Golden Promise, 2 линии сорта Dissa, 2 линии сорта Mamie, 2 линии сорта Roland, 2 линии сорта Одесский 115);

- линии устойчивые в проростках к сетчатой пятнистости (13 линий сорта Golden Promise. 3 линии сорта Díssa. 4 линии сорта Roland. 3 линии сорта Mamie. 2 линии сорта Одесский 115);

- линии устойчивые в проростках к мучнистой росе ( 3 линии сорта Golden Promise. 1 линия сорта Dissa);

- линии устойчивые в проростках к карликовой ржавчине (2 линии исходного сорта Golden Promise. 1 линия сорта Dissa);

5. Получены линии регенерантов, превышающие исходный сорт ячменя (Golden Promise) по длине стебля, массе 1000 зерен и продуктивной кустистости.

6. При изучении 75 генотипов Мировой коллекции ячменей ВИР, в том числе известных как устойчивые, только четыре образна ( То-гузак. Черниговский 90. Могех, Ргепа) показали тип реакции на уровне 3 баллов (средняя устойчивость). остальные образцы были еысоковосприимчиеы к штамму "Т" Bipolans soroKiníana. Эти четыре образна не были более устойчивы чем выделенные нами устойчивые линии регенерантов.

7. Среди линий регенерантов поколения R2. образованных из одного каллуса существуют достоверные отличия как по признакам морфологии и продуктивности, так и по признакам устойчивости к болезням.

8. Среди линий регенерантов поколения R2, происходяших из разных зерновок одного колоса регенеранта Ro выявлены достоверные отличия по признакам морфологии, продуктивности и устойчивости к болезням.

9. В качестве линии регенерантов. как генетически однородного материала, следует принять потомство одной зерновки регенеранта Ко после двух самоопылений. Для обнаружения Форм, отличающихся от исходного сорта, необходимо изучение регенерантов поколений R2 по линиям, происходящим из каждой зернении регенеранта Ro с последу- ■ шей проверкой передачи признака в поколение R3.

Предложения по практическому использованию

1) Для получения растений - регенерантов ячменя с высокой эффективностью, независимо от елияния генотипа следует использовать разработанный нами метод получения змбриогенного каллуса в культуре незрелых зародышей. Метод гключает два подхода: во-первых. использование экспланта. находящегося на оптимальной стадии развития, для чего следует ориентироваться на морфологический маркер "полупрозрачность шитка зародьса". И во вторых следует использовать предложенные нами составы питательных сред с использо-

ванием мальтозы (среда Н2) и с добавлением культуральной жидкости гриба Blpolaris soroKmiana в качестве добавки, повышающей эффективность эмбриогенеза.

2) Рекомендуем метод изучения семенного потомства регенеран-тов ячменя и веделения Форм с необходимыми признаками, как метод получения устойчивых к болезням аналогов коммерческих сортов.

3) Для выявления ценных в практическом отношении генотипов следует изучать потомство к-адой зерновки регенеранта Ко после деух самоопылений, т. е. линию поколения RS.

4) Для установления наследуемости полученных изменений следует проверить передачу признака, по которому идет изучение регене-рантов в поколениях R2 и R3.

5) Рекомендуем использовать полученные в работе устойчивые линии регенерантов как исходный материал для селекции и для широких экологических испытаний.

Список опубликованных работ по теке диссертации:

ПТырышкин Л. Г. , Шевченко Д. И. . АФанасенко О. С. Поиск и создание доноров устойчивости пшеницы и ячменя к корневым гнилям и листовым пятнистостям// Мат. II Всесоюзного Сов. " Изогенные линии и генетические коллекции", - Новосибирск. - 1993.- С. 30-33.

2). Тыршкин Л. Г. , Шевченко Д. Н. , АФанасенко O.e. Каллусо-генез и регенерация в культуре незрелых соцветий ппеницы. //II Международной конференции "Биология культивируемых клеток", Алма-Ата. - 1593. - С. 79.

3) TyrysfcKin L. G. , ShevchenKo D. N. . AfanasenKo O.S. Somaclonal variation in barley (Hordeum vulgare L.I for diseases resistance. //II International conference "Biotechnology St.-Petersburg'94". p. 106.

4) Тырышкин Л. Г. , АФанасенко О. С. , Левченко Д. Н. , Хунольд Р. Высокая эффективность калл'/согекеза и рггенерапии в культуре незрелых зародышей ячменя// Труды ВИЗР. В печати. i

5) Тырышкин л. Г. , АФанасенко о. с. , 1езченко д. н. Влияние азида натрия на каллусогенез и регенерацию в культуре незрелых зародышей ячменя// Труды ВИЗР. 3 печати.

6) Шевченко Д. Н. . Тырьекин Л. Г. Оптимизация метода получения растений - регенерантов в культуре незрелых зародышей ячменя (Hordeum vulgare L.)// Сб. трудоз молодых ученых ВИР. В печати.

ШТП "Курс". Зак.245ст. 1994 г.