Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменчивость изотопного отношения углерода и азота в онтогенезе и при различных функциональных состояниях у представителей высших и низших позвоночных

ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Изменчивость изотопного отношения углерода и азота в онтогенезе и при различных функциональных состояниях у представителей высших и низших позвоночных"

На правах рукописи

Бедник Дарья Юрьевна

ИЗМЕНЧИВОСТЬ ИЗОТОПНОГО ОТНОШЕНИЯ УГЛЕРОДА И АЗОТА В ОНТОГЕНЕЗЕ И ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СОСТОЯНИЯХ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ВЫСШИХ И НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ

03.00.30-03 - биология развития, эмбриология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

003463536

Работа выполнена на кафедре эмбриологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

доктор биологических наук Доронин Юрий Константинович

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва

доктор биологических наук Бурлаков Александр Борисович Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва

доктор биологических наук Антохин Александр Иванович ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава, Москва

Ведущая организация: Федеральный медицинский биофизический

центр им. А.И. Бурназяна при ФМБА России

Защита состоится 17 марта 2009 года в 15 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан « » 2009 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь

Диссертационного Совета, E.H. Калистратова

кандидат биологических наук '

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В 1939 г. А. Нир и Э. Гульбрансен (Nier, Gulbran-sen, 1939) разделили в соответствии с изотопным составом углерода компоненты земной поверхности на четыре группы. В одну из этих групп, включены главным образом растительные формы, отличающиеся от магматических и метаморфических пород и карбонатов выраженной асимметрией в соотношении стабильных изотопов углерода 12С и 13С в сторону первого. Именно это явление - обогащенность растительных и животных форм легким изотопом углерода - получило название биологического фракционирования изотопов.

С того времени достигнуты существенные успехи в понимании механизмов изотопии — в целом, и биологической изотопии, в частности (Гали-мов, 1981, 2006; Бучаченко, 2007); накоплен значительный фактический материал об изотопии, как различных живых форм, так и основных их биохимических компонентов; убедительно показана связь изотопии растительных форм со способами фиксации СОг и азота и зависимость изотопного состава гетеротрофов от типов питания (Park, Epstein, I960, 1961; Ehleringer et al.; Peterson, Fry, 1987; Griffiths, 1991; Gannes et al, 1997). Изотопные отношения стабильных форм углерода и азота и их изменения стали широко использоваться в качестве «индикатора» движения вещества и энергии, и в качестве «интегратора», для оценки направления и интенсивности экологических процессов...» (Тиунов, 2007, с.475); в частности, определение изотопного отношения стало наиболее популярным методом выявления путей миграции и трофических связей животных организмов.

С накоплением сведений об изотопии автотрофов и гетеротрофов несколько «размылось» четкое и ясное представление о физико-химических механизмах изотопного фракционирования. Стало очевидным, что столь динамическая система как организм, обладающая мощными системами гомео-стаза, привносит свои, специфические коррективы в процессы фракционирования. Существенный успех для объяснения фракционирования и, главное,

многообещающие перспективы направленных влияний на организменные события, привнесло открытие специфических ядерно-спиновых изотопных эффектов (Бучаченко и др., 1976).

Ядерно-спиновый изотопный эффект обеспечен появлением магнитного момента у молекул, включающих в свой состав стабильные изотопы с нецелочисленным ядерным спином. Молекулы такого рода обречены взаимодействовать с парамагнитными структурами, в число которых входят радикалы. Свободнорадикальные формы достаточно обычны для живой материи. Особую роль имеют свободнорадикальные формы кислорода, порождающие многообразные радикальные формы, что губительно сказывается на структуре и функциях макромолекул в живой системе. Предполагается, что в силу изотопного эффекта (т.е. в силу специфики химических взаимодействий структур, несущих в своем составе стабильные изотопы) молекула, несущая в своем составе стабильный изотоп оказывается «защищенной» от губительного влияния реактивных радикальных форм (Shchepinov, 2007).

Существует еще один аспект проблемы биологического фракционирования изотопов. В результате промышленной деятельности в атмосферу выбрасывается огромное количество углекислого газа, на 2-8%о обогащенного изотопом 12С (Friedman, Irsa, 1967; Галимов, 1987). Влияния такого рода обогащения атмосферы, особенно в мегаполисах и промышленных районах, на состояние и репродуктивные способности растений, потребляющих их гете-ротрофов, в том числе и на человека - остается неизвестными.

Смещение изотопного отношения в тканях растений в сторону легкого изотопа отмечено с 40-х годов прошлого столетия. Начиная с конца 80-х годов, эта тенденция кардинально поменялась: вплоть до настоящего времени годовые кольца деревьев неуклонно и достаточно быстро обогащаются тяжелым изотопом углерода (Воронин и др., 2003). A.A. Ивлев (2005) связывает смену изотопного облегчения с непрерывным возрастанием концентрации и изотопным утяжелением С02 в атмосфере, с возрастанием среднегодовой температуры и, как следствие, с усилением фотодыхания. События такого

рода представляется угрожающими, поскольку развиваются по принципу положительной обратной связи: «планетарные лёгкие» изменяют свой функциональный статус, превращаясь в потребителя кислорода и поставщика углекислого газа, что, в свою очередь, усугубляет планетарный парниковый эффект.

Механизмы сегрегации изотопов на организменном уровне (особенно у гетеротрофов) остаются до конца не известными, хотя по этому поводу нет недостатка в предположениях и гипотезах. Более того, сведения об изотопии органов и тканей гетеротрофных организмов, о динамике изотопных отношений на разных этапах жизненного цикла, о роли изотопного отношения для нормального функционирования организмов - представлены фрагментарно и очевидно недостаточно.

В этой связи, целью исследования стало определение изотопного отношения в тканях на различных этапах онтогенеза и при разных состояниях у самок и самцов трех видов систематически существенно различающихся организмов: рыб, амфибий и млекопитающих. Для достижения этой цели разрешались следующие экспериментальные задачи: 1) получение материала, подготовка препаратов для масс-спектрометрии и собственно масс-спектрометрическое определение изотопного отношения углерода и азота и 2) анализ и сопоставление полученных данных.

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате исследования получен ряд новых, ранее неизвестных фактов, свидетельствующих о различиях изотопного отношения углерода и азота в разные периоды онтогенеза. Так, показано, что ткани ювенильных самцов остромордых лягушек существенно обеднены тяжелым изотопом азота, что, вероятно, связано с различиями размеров и рационов совозрастных особей разного пола. С наступлением половозрелости, выравниванием размеров и унификацией рациона происходит не только выравнивание изотопного отношения азота у особей разного пола, но и обогащение тканей самцов тяжелым изотопом. Ткани одномесячных мышей существенно богаче тяжелым изотопом углеро-

да в сравнении с соответствующими тканями 22-месячных мышей, что предопределяется обеднением тяжелым изотопом белковой фракции этих тканей. Тенденция обеднения тяжелым изотопом углерода отмечена также для фракций липидов и нуклеиновых кислот. На большем протяжении плодного периода изотопное отношение углерода тканей эмбрионов мыши идентично изотопному отношению соответствующих тканей материнских организмов, но непосредственно перед рождением смещается в сторону тяжелого изотопа. На основании полученных данных можно также предполагать своего рода половой диморфизм изотопного отношения. Помимо обогащения тяжелым изотопом азота тканей самцов лягушек в период полового созревания (в сравнении с тканями совозрастных самок) (см. выше), отмечена выраженная тенденция к обогащению тяжелым изотопом углерода тканей самцов рыб и плодов мужского пола мышей непосредственно перед их рождением. В то же время, существенные изменения состояния организма, вопреки ожиданиям, могут не сопровождаться какими-либо изменениями изотопного отношения тканей. Так, сезонная гибернация не сказывается на изотопном отношении углерода и азота: значения 513С и 5|5Ы соответствующих тканей у активно питающихся лягушек в период перед зимней спячкой и сразу после выхода из спячки сохраняются неизменными. Ткани каждого из исследованных видов классифицированы в группы в соответствии с изотопным отношением и определены видовые пределы вариации этого показателя. Последнее может оказаться существенным для оценок трофических отношений видов в экологических исследованиях. Результаты работы используются в курсах лекций по биологии развития.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на научном семинаре кафедры эмбриологии биологического ф-та МГУ имени М.В. Ломоносова, Симпозиуме с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, 2007г.), XVIII Симпозиуме по геохимии изотопов имени академика А.П. Виноградова (Москва, 2007г.), XVI Международной конференции

и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2008г.), Всероссийской конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина» Одиннадцатая медико-биологическая конференция «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2008г.)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них статей - 1, тезисов конференций - 4.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на ✓Я* страницах и состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Объекты и методы исследования», «Результаты исследования и их обсуждение», «Выводы», «Список цитированной литературы». Работа включает таблиц и иллюстраций. Список цитированной литературы содержит /^"наименований, из которых на русском, на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Вьюны _/о.ш7йг Ь. были отловлены в де-

кабре-январе 2006-2007г. в Мещерском районе Рязанской области. В лабораторных условиях, на протяжении зимы и весны самцов и самок вьюнов содержали отдельно в 20-ти литровых аквариумах при температуре +5°С. Для масс-спектрометрического анализа использовали ткани и органы рыб (гепа-топанкреас, головной мозг, фрагмент дорсальной мускулатуры средней части тела, хрусталик, фрагмент кожи с дорсолатерапьной поверхности в середине тела, гонады), отловленных в декабре 2006г. (первая серия) и 2007г. (вторая серия) и содержавшихся в лаборатории до апреля 2007 и 2008гг.

В первой серии определяли изотопное отношение углерода тканей отдельных рыб: трех самок (со средним весом в 18,9±5,09 г) и четырех самцов (со средним весом 23,1±3,33 г). Во второй серии определяли изотопное отношение углерода и азота и процентное содержание этих элементов. В этой серии образцы тканей формировались объединением равных весовых долей однотипных тканей, выделенных от пяти рыб каждого пола. Использовав-

шиеся самцы и самки были приблизительно одного веса: самки - 18,0±0,66 г; самцы - 18,4±0,63 г.

Помимо тканей и органов взрослых рыб исследовали изотопное отношение углерода у зародышей вьюнов. После проведения стандартной процедуры осеменения in vitro развивающуюся икру содержали в чашках Петри в прокипяченной и отстоянной водопроводной воде при комнатной температуре. Периодически отбирали от 25 до 50 нормально развивающихся зародышей, которые немедленно помещали в термостат для высушивания. Таким образом были подготовлены образцы зародышей на различных стадиях развития, полученные от 5 самок.

Остромордых лягушек Rana arvalis Nilsson отлавливали в одном, достаточно ограниченном ареале (Истринский район Московской области) с известным местом икрометания. Для измерений использовали ткани амфибий (печень, желудочек сердца, головной мозг, гонады, фрагмент четырехглавой мышцы бедра, диафиз бедренной кости, хрусталик, фрагмент кожи со спины) разного пола, разного возраста (16-месячных, длиной 4,2±0,17 см (самки) и 3,3±0,09 см (самцы); 28-месячных, длиной 6,0±0,23 см (самки) и 5,9±0,14 см (самцы); 36-месячных, длиной ~ 5,5 см). 36-месячные лягушки были выловлены в месте икрометания, т.е. в момент, когда они только вышли из зимовки и еще не питались. В отличие от этой группы, 16- и 28-месячные лягушки были выловлены в августе и активно питались.

Образцы для масс-спектрометрического измерения формировались объединением равных весовых долей тканей одного типа, выделенных от особей каждого пола. В образцах, полученных от лягушек тканей, определяли изотопное отношение углерода, азота и процентное содержание этих элементов.

Лабораторных мышей (линия C57BL/6) с момента полного перехода на самостоятельное питание содержали в виварии в стандартных условиях. На протяжении всего срока существования животных кормили ab libitum

кормом для разведения крыс, мышей и хомяков (рецепт ПК-120, ГОСТ Р50.258-92; ООО «Лабораторкорм», Москва).

Ткани и органы (печень, почки, желудочек сердца, головной мозг, яичник, фрагмент четырехглавой мышцы бедра, выделенное из соединительнотканной капсулы пятое ребро, хрусталик, сухожилие хвоста) для масс-спектрометрического определения изотопного отношения углерода были получены от десяти взрослых самок мышей (пяти одномесячных и пяти 22-месячных). Для масс-спектрометрического измерения приготавливали образцы тканей каждого животного. Часть тканей и органов 1- и 22-месячных мышей (печеночная ткань, почка, головной мозг, мышечная ткань, желудочек сердца) замораживали и хранили при температуре -40°С для последующего выделения основных биохимических фракций.

Изотопные отношения также определяли в тканях эмбрионов мышей. В первой серии измерений определяли изотопное отношение углерода печени, почки, сердца и мышечной ткани каждого из четырех эмбрионов 20-ой стадии развития. Во второй серии измерений, проведенных на эмбрионах той же стадии, помимо 513С определяли процентное содержание углерода, азота и изотопное отношение азота. В этой серии измерений в одном образце объединяли однотипные ткани от восьми эмбрионов.

У плодов на стадии 22 - 23 (18-19 день беременности, 1-2 дня до рождения) увеличивается число органов с массой, достаточной для масс-спектрометрического анализа и становится возможным определение пола плодов. В первой серии измерений тканей от трех единоутробных плодов 23 стадии развития определяли только изотопное отношение углерода. Во второй серии также определяли 813С в образцах, объединяющих ткани четырех плодов женского и четырех плодов мужского пола на 22-ой стадии развития. В третьей серии измерений, помимо 513С, определяли процентное содержание углерода, азота и изотопное отношение азота в образцах, объединяющих однотипные ткани четырех плодов женского пола и пяти плодов мужского пола на 22-ой стадии развития.

Приготовление образцов для масс-спектрометрического анализа. Извлеченные из организма ткани и органы тщательно очищали от прилегающих тканей и отмывали от крови (до полного прекращения отделения крови в надсеченных паренхиматозных органах) в нескольких сменах физиологического раствора (для теплокровных или холоднокровных, в соответствии с видом). Мягкие ткани измельчали до гомогенной массы. Нити сухожилий хвоста разрезали на мелкие части; фрагменты костей дробили. Полученные образцы высушивали в термостате при температуре +65°С в течение 2-3 суток. Высушенные образцы перетирали в фарфоровой ступке до мелкодисперсного порошка. Из сохранявшихся при низкой температуре тканей 1- и 22-месячных мышей выделяли три основные биохимические фракции: белки, жиры и нуклеиновые кислоты, модифицировав для этой цели известный метод Мармура (Северин, Соловьева, 1989).

Полученные образцы тканей и высушенные фракции тканей (от отдельных особей, либо после смешения в равных весовых долях) развешивали по 0,3 - 0,5 мг в оловянных капсулах для масс-спектрометрического анализа (Thermo, Finnigan, Италия), которые немедленно запечатывали и держали до момента анализа в эксикаторе с силикагелем.

Масс-спектрометрические измерения. Собственно измерения производили на двух устройствах: масс-спектрометре «Finnigan DELTA plus» (Институт геохимии и аналитической химии РАН), на котором определяли только изотопное отношение углерода, и «Thermo Finnigan DELTA V p,us» (Институт проблем эволюции экологии РАН), который позволяет одновременное определение изотопного отношения углерода, азота, так же как процентного содержания этих элементов в образцах.

Изотопные отношения (13С/12С, 15N/14N) выражаются величиной <5, представляющей собой отклонение изотопного состава (обычно в промилле, %о) образца (R06p) от изотопного состава некоторого вещества, принятого в качестве стандарта (Rcm):

^Wic.

R&r

В качестве стандарта для определения 6,3С повсеместно принят углерод образца кальцита окаменелости Belemnitella americana формации P-D (Южная Каролина, США) мелового периода - PDB (Pee-Dee Belennite), в котором Rcm равен 11,237-10"3. Стандартом при изотопном анализе азота служит азот воздуха, для которого Rcm = 3,676-10"3. Возрастание величины 3 свидетельствует о повышении доли малораспространенного изотопа, а снижение, -соответственно, о повышении доли распространенного изотопа элемента в образце.

Статистическая обработка полученных данных. Для оценки полученного в результате измерений числового материала использовали методы статистического анализа: для определения однородности или гетерогенности выборок - однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA); для сравнения отдельных выборок данных - непараметрические критерии Ван дер Вардена, Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни; для выяснения различий между однотипными компонентами выборок - LSD (Least Squire Deviation) - тест, эквивалентный t-критерию для независимых переменных. Корреляционные связи переменных оценивали с помощью непараметрического метода Спирмена, а функциональные связи переменных - методом регрессионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изотопное отношение тканей рыб.

Распределение значений 513С (первая серия измерений) в соответствии с типом тканей самок и самцов иллюстрирует рис. 1, А. Однофакторный дисперсионный анализ (группирующий фактор - тип ткани) свидетельствует о значимой (р=0,004) гетерогенности выборки значений 513С. В соответствии с результатом LSD-теста, минимальное и максимальное значения 513С (для мозга и кожи, соответственно) достоверно различаются между собой и большинства иных тканей. Форма распределений средних значений 513С по типам

тканей у самок и самцов (см. рис. 1) одинакова (ANOVA, F = 2,586 < 3,500 = Fcm, Р ~ 0,103).

Выборки данных, полученных при исследовании тканей самок и самцов, достоверно отличаются одна от другой (критерий Колмогорова-Смирнова, р < 0,001; критерий Манна-Уитни, р = 0,0037; ANO VA, группировка значений в соответствии с полом рыб, F=9.415>4,073=Fcm, р = 0,004). Иными словами, ткани самцов обогащены тяжелым изотопом углерода в сравнении с тканями самок.

головной мозг -27

мышечная -пан

гепатопанкреас

головной мозг -27

мышечная ткань

гепатопанкреас

Рис. 1. Распределение значений 813С (А, Б) и 5|5И (В) органов самок (сплошная линия) и самцов (пунктир) взрослых вьюнов. А - первая серия измерений; Б, В - вторая серия измерений. По осям отложены значения изотопного отношения в

головной мозг 15т

мышечная ткань

гепатопанкреас

Распределения значений 5 С, полученные во второй серии измерений (рис. 1, Б), не отличаются от таковых, полученных в первой серии, для тканей как самок, так и самцов (критерий Колмогорова-Смирнова, р>0,100; критерий Манна-Уитни, р>0,05). Выборки гетерогенны (ANOVA, группировка данных по типу ткани, /г= 15,801 >4,387=/7ст, /7=0,002); в соответствии с результатом Ь8Б-теста, эта гетерогенность обеспечена различиями минимальных и максимальных значений 813С (ткани головного мозга и кожи) между собой и от других тканей.

В то же время, выборки значений 513С тканей самок и самцов не различаются (критерий Колмогорова-Смирнова, р>0,100; критерий Манна-Уитни, р=0,423; ANOVA, группировка данных по принадлежности к полу рыб, F=0,192<4,965=Fcm, />=0,670).

Таким образом, следует полагать безусловным отличие некоторых тканей по величине 513С как у самок, так и самцов, в то время как различия изотопного отношения углерода в тканях рыб разного пола - лишь как тенденцию.

Выборки значений 515N для тканей самок и самцов статистически не различаются (критерий Колмогорова-Смирнова, р>0,10; критерий Манна-Уитни, р = 0,200; ANOVA, при группировке данных в соответствии с полом рыб, F = 1,315 < 4,965 = Fcm , р - 0,278 ). Дисперсионный анализ вариаций значений 5ISN в образцах тканей самцов и самок (группировка по типу ткани) также указывает на идентичность значений 5I5N разных тканей рыб обоего пола(F = 1,686 <4,387 = Fcm, р = 0,271; см. рис. 1, В).

Измерения изотопного отношения углерода зародышей вьюна на протяжении эмбрионального периода (рис. 2) описывается линией, параллельной оси абсцисс (513С = -31,22±0,134). 513С зародышей не изменяется на протяже-

Рис. 2. Изменение изотопного отношения углерода по мере эмбрионального развития вьюна. Различные обозначения на графике соответствуют сериям измерений. Линией показан тренд, аппроксимирующий разброс точек (см. текст). Ось абсцисс - время с момента осеменения икры, мин; ось ординат -значения 813С в %о.

нии развития. На протяжении всего периода развития в оболочках умножение численности клеток и морфогенетические события обеспечиваются ме-таболизируемым материалом желточной клети и желточного мешка. Вероятно, уровень обмена с внешней средой углеродсодержащими молекулами на

11

-26 2000 4000 6000 8000 10000

-27 ■

-28 •

-29

-30

-3)

-32 • ■ • ■

-33 о ♦ « •

-34

протяжении эмбриогенеза столь невелик, что маскируется вариациями изотопии зародышей, полученных от разных производителей. Изотопное отношение тканей амфибий.

Результаты измерений изотопного отношения углерода и азота в тканях 16-, 28- и 36-месячных лягушек представлены на рис. 3 и 4. Выборки значений 613С для самцов и самок лягушек каждой из возрастных групп (рис. 3, А, Б) не различаются. Статистические сравнения демонстрируют явную тенденцию к возрастанию значений 513С в тканях как самцов (критерий Колмогорова-Смирнова, р < 0,100; критерий Манна-Уитни, р = 0,036), так и самок (критерий Колмогорова-Смирнова, р < 0,100; критерий Манна-Уитни, р = 0,072) 28- и 36- месячных лягушек в сравнении с тканями 16-месячных лягушек.

•а

•23 •2« •25

•27

э.е

3.6

м

3,2 3.0 2.6 2.6 2.4 2,2 2.С 1.8

Рис. 3. Медиана, квартили и диапазон варьирования значений 513С (А, Б) и 515Ы (В, Г) в тканях самок (А, В) и самцов (Б, Г) 16-, 28- и 36-месячных лягушек.

Выраженное асимметричное распределение значений 513С в соответствии с типом ткани, предопределенное, главным образом, статистически существенными различиями образцов костной ткани, кожи, хрусталика, мы-

бок »УЛЫвг Рк*

ВохДМГМагРЬ*

16-ы 28-м 36«

Вс*»«**к»г Рк*

1»« 28-и 30«

1&* 26«

шечной ткани между собой и от других тканей, между тем, сохраняет подобие у разных возрастных групп (рис. 4, А, В, Д).

головной мозг

д

Рис. 4. Диаграммы, иллюстрирующие распределения изотопного отношения углерода (А, В, Д) и азота (Б, Г, Е) в образцах тканей у самок (сплошная линия) и самцов (пунктир) 16- (А, Б), 28- (В, Г) и 36-месячных (Д, Е) лягушек. По осям отложены значения изотопного отношения в %о.

Выборки значений S15N для тканей самок и самцов каждой из возрастных групп с высокой степенью достоверности различаются между собой (рис. 3, В, Г). При этом, у 16-месячных лягушек все без исключения ткани самцов (в сравнении с тканями самок) обеднены тяжелым изотопом азота, в то время как у 28- и 36-месячных лягушек - напротив, обогащены тяжелым изотопом азота. Распределения 513N в соответствии с типом ткани подобны (ANOVA, значимость различий, /»0,05) (рис. 4, Б, Г, Е), как в разных возрастных группах, так и для самок и самцов. Это подобие предопределено сходством значений 51SN для всех исследованных тканей в пределах каждой возрастной группы и половой принадлежности лягушек.

Как показали многолетние наблюдения, сроки икрометания остромордых лягушек в популяции, из которой были изъяты подопытные особи, сравнительно постоянны и приходятся на последнюю треть апреля. Если полагать (вслед за П.В. Терентьевым, 1950), что половозрелость, достигается у остромордых лягушек на третьем году жизни, то 16-месячных лягушек следует считать ювенильными формами, 28-месячных - поздними ювенильными формами, превращающимися в половозрелые особи, а весенних 36-месячных - половозрелыми формами. В соответствии с этим, значимые изменения величин, отражающие увеличение доли «тяжелых» изотопов углерода и азота в тканях самцов, следует полагать сопряженными с переходом от ювенильной к половозрелой форме. У самок такой переход выражен существенно меньше, поскольку можно констатировать лишь слабую тенденцию изменения значений 513С и 515N.

Лягушки (и R. arvalis в том числе) являются хищниками, лишенными пищевой специализации. Рацион лягушек включает фактически все без исключения группы насекомых (на разных фазах их жизненного цикла), моллюсков, червей. Лягушки поедают все то, что населяет их местообитание и что может быть ими проглочено. Соответственно, крупные особи поедают более крупную добычу, чем мелкие (Терентьев, 1950). Для лягушек второго года жизни (16-месячных) характерно выраженное различие в размерах осо-

бей разного пола: самцы на треть короче и почти вдвое легче самок того же возраста. Соответственно, рацион мелких самцов 16-месячных лягушек должен включать более мелкую «добычу», чем рацион крупных самок этого же возраста, что, возможно, и проявляется в различии изотопных отношений их тканей. Однако, выравнивание размеров самцов и самок на третьем году жизни (что позволяет предполагать унификацию их рациона) отнюдь не приводит к выравниванию значений изотопного отношения: ткани самцов оказываются существенно более богатыми тяжелым изотопом азота в сравнении с тканями самок. Это явление, вероятно, свидетельствует о существовании периода кардинальных изменений метаболизма самцов в сравнении с таковым у самок. Описанная динамика изменений изотопного отношения азота у самцов остромордых лягушек является не только демонстрацией различий изотопных отношений у особей разного пола, но и отражает онтогенетический тренд этого показателя.

Изотопное отношение углерода тканей мышей.

Значения 513С тканей у 1- и 22-месячных самок мышей представлены в таблице 1. Изотопное соотношение в образцах пищи (513С = -25,2±0,61; результат шести определений), на которой содержали животных, значимо (р < 0,05) отличается от характерных изотопных отношений тканей и органов мышей из обеих возрастных групп.

Распределения средних значений 513С у 1- и 22-месячных мышей значимо различаются (критерий Колмогорова-Смирнова, р < 0,005; критерий Манна-Уитни, р = 0,002). Средние значения 513С соответствующих тканей 1-и 22-месячных мышей также различаются.

Распределения значений 613С в соответствии с типом ткани асимметричны как для 1-, так и для 22-месячных мышей (АЖ)УА, р < 0,00001; см. рис. 5, А). Асимметрия предопределена значениями 813С костной ткани, сухожилия хвоста и хрусталика, различающихся между собой и от остальных тканей.

Таким образом, с достаточной уверенностью можно утверждать, что изотопное отношение углерода во всех тканях 22-месячных животных смещено (причем в различной степени) в сторону легкого изотопа углерода.

Таблица 1.

Средние значения изотопных отношений в тканях и органах 1- и 22-месячных мышей линии С57ВЬ/6

Ткани Одномесячные мыши (п=5) 22-месячные мыши (п=4)

Среднее и ошибка среднего Медиана Среднее и ошибка среднего Медиан

Яичник -21,54±0,28 -21,5 -22,96±0,34 -23,0

Кишечный эпителий -21,53±0,44 -21,3 -22,38±0,28 -22,6

Печень -21,42±0,07 -21,4 -22,00±0,16 -21,98

Почка -21,32±0,28 -21,3 -22,21 ±0,26 -22,31

Мышечная ткань -21,23±0,18 -21,3 -22,62±0,23 -22,77

Сердце -21,16±0,28 -21,5 -22,32±0,22 -22,13

Головной мозг -20,82±0,28 -20,5 -22,64±0,18 -22,50

Хрусталик -20,10±0,50 -20,4 -22,64±0,11 -22,55

Сухожилие хвоста -18,33±0,55 -18,1 -20,24±0,30 -20,30

Костная ткань -18,31±0,48 -18,3 -21,51±0,21 -21,52

Результаты измерений изотопного отношения углерода основных фракций, выделенных из тканей 1- и 22-месячных мышей иллюстрируются на рис. 5 Б, В. Значения 513С для образцов белковых фракций каждой из исследованных тканей 1-й 22-месячных мышей достоверно различаются (критерий Колмогорова-Смирнова, р < 0,025; критерий Манна-Уитни, р = 0,009). Различия между значениями ö13C белковых фракций разных тканей недостоверны (дисперсионный анализ при группировке по типу ткани, F = 0,146 < 5,193 = Fcm, р = 0,957). Различия между значениями 513С цельных тканей и белковых фракций, выделенных из этих тканей, также недостоверны (критерий Колмогорова-Смирнова, р > 0,100; критерий Манна-Уитни, р = 0,998). Значения 513С для образцов фракций липидов и нуклеиновых кислот, выделенных из тканей 1-й 22-месячных мышей, не различаются.

Таким образом, можно полагать, что изотопное отношение тканей определяется главным образом изотопным отношением белковой фракции этих тканей, которое с возрастом животных смещается в сторону легкого изотопа.

1остн«)1 ткань.

.кишачный эпителий

сух ожили* хмсп.

мышачная ткань

Рис. 5. А - диаграмма, иллюстрирующая соотношение между значениями 8|3С разных тканей 1- и 22-месячных мышей (сплошная линия и пунктир, соответственно). Б, В -диаграммы, характеризующие распределение значений 5 3С белковых фракций (толстая сплошная линия), фракций нуклеиновых кислот (пунктир) и липидной фракции (тонкая сплошная линия), выделенных из различных органов 1- (Б) и 22-месячных (В) мышей.

Б печень

Результаты определения изотопного отношения углерода тканей эмбрионов мышей в пренатальный период развития представлены в таблице 2. Ткани эмбрионов 20-ой и 21-ой стадий развития не отличаются по значениям изотопного отношения углерода и азота от соответствующих тканей материнского организма. Значения 813С и 515Ы разных тканей также фактически одинаковы. Ткани плодов 22-ой стадии развития также не отличаются по изотопному отношению углерода и азота от соответствующих тканей материнского организма, хотя появляется слабая тенденция изотопного утяжеления (по углероду) тканей эмбрионов мужского пола в сравнении с тканями эмбрионов женского пола. На 23-стадии развития значения 813С в высшей степени достоверно отличаются от значений для соответствующих тканей матери. Тенденция обогащения тканей самцов тяжелым изотопом углерода становится более выраженной.

Поскольку отношения между эмбрионами и вынашивающей их матерью являются, прежде всего, трофическими, мы рассчитали величины «тро-

Таблица 2.

Средние значения 513С тканей плодов мыши на разных стадиях развития в сравнении с 5|3С соответствующих тканей материнских организмов_

Значения 5й С

Серия исследования, стадия развития, пол плодов Печень Почка Сердце Головной мозг Мышеч ная ткань

Серия 1, стадия 20 -22,13 -22,15 -23,82 -22,75 -

Ткани материнского организма -22,05 -22,58 -22,15 -23,82 -

Серия2, стадия 20 -23,71 -23,48 -23,67 -23,70 -

Ткани материнского организма -24,04 -23,97 -24,06 -23,47 -

самки -23,75 -23,68 -23,96 -23,92 -23,67

Серия 3, ста- самцы -23,75 -23,64 -23,87 -24,02 -23,46

дия 21 Ткани материнского организма -24,13 -23,91 -23,71 -23,32 -23,11

самки -21,13 -22,06 -21,98 -22,54 -21,65

Серия 4, самцы -20,78 -21,87 -21,58 -22,04 -20,45

стадия 22 Ткани материнского организма -21,86 -22,33 -22,09 -24,02 -22,16

самки -19,75 -19,72 -19,74 -19,63 -19,55

Серия5, самцы -18,50 -19,30 -19,50 -19,04 -19,50

стадия 23 Ткани материнского организма -21,96 -22,64 -22,17 -23,64 -22,21

Таблица 3.

Значения «трофического сдвига» тканей эмбрионов на разных стадиях развития

Д

Стадии развития, серия исследований серия 1, 20 ст. серия 2, 20 ст. серия 3, 21 ст. серия 4, 22 ст. серия 5 23 ст.

Печень -0,08 0,33 0,38 0,905 2,63

Почка 0,35 0,49 0,25 0,365 3,06

Сердце -0,21 0,39 -0,455 0,31 2,51

Головной мозг 1,07 -0,23 -0,205 1,73 4,21

Мышечная ткань - - -0,65 1,11 2,68

Среднее значение 0,2825 0,245 -0,136 0,884 3,018

фического сдвига» (А = {.биС)^нттй „,„„„„ ~{3"С)мтртст _„), широко используемые в экологических исследованиях (табл. 3).

В соответствии со статистическими сравнениями распределения Д для тканей эмбрионов 23-ей стадии развития значимо отличаются от таковых у более ранних эмбрионов (см. рис. 6). Таким образом, в период перед рождением происходит быстрое изменение изотопного отношения углерода тканей плодов, состоящее в их обогащении тяжелым изотопом по сравнению с соответствующими материнскими тканями.

1. Органы и ткани каждого из исследованных видов по изотопному отношению углерода распределяются в две группы. Одна объединяет внутренние органы (печень, почки, мозг, гонаду, мышцы, сердце, кишечный эпителий), которые, как правило, не отличаются по величине изотопного отношения. Вторая группа включает кожу, костную ткань, сухожилия и хрусталик, существенно обогащенные (в сравнении с тканями первой группы) тяжелым изотопом углерода.

2. Изотопное отношение азота одинаково для каждой из тканей и изменяется в равной мере для всех тканей при изменении состояния и стадии жизненного цикла у каждого из исследованных организмов.

3. Изотопные отношения углерода и азота тканей различны на разных этапах жизненного цикла организмов. Так:

а) ткани ювенильных самцов остромордых лягушек существенно обеднены тяжелым изотопом азота (в сравнении с тканями половозрелых самок), что,

О

Рис. 6. Медианы, квартили и диапазоны варьирования значений «трофического сдвига» (А) у эмбрионов мыши на различных стадиях развития (1,2 — 20, 3 — 21, 4 — 22, 5-23 стадии).

I I 25Н-75Н ЦТ Мш-Мах

-1

Выводы

вероятно, связано с различиями размеров и, соответственно различиями рационов совозрастных особей разного пола. С наступлением половозрелости, выравниванием размеров и унификацией рациона ткани самцов не только выравниваются, но обогащаются тяжелым изотопом в сравнении с тканями совозрастных самок;

б) ткани 1-месячных мышей существенно богаче тяжелым изотопом углерода в сравнении с соответствующими тканями 22-месячных мышей;

в) изотопное отношение углерода в тканях плодов мышей идентично изотопному отношению соответствующих тканей в материнских организмах, но непосредственно перед рождением смещается в сторону тяжелого изотопа.

4. В то же время изотопное отношение углерода зародышей рыб не отличается от такового ооцитов и не изменяется на протяжении развития в оболочках.

5. Возрастное обеднение тяжелым изотопом углерода тканей мышей сопровождается обеднением тяжелым изотопом белковой фракции этих тканей. Тенденция обеднения тяжелым изотопом углерода отмечена для фракций липидов и нуклеиновых кислот.

6. Значения изотопного отношения углерода и азота, вероятно, связаны с полом организма. Так:

а) ткани самцов остромордых лягушек в поздний ювенильный период и при наступлении половозрелости обогащаются тяжелым изотопом азота (в сравнении с тканями совозрастных самок) (см. п.З, а);

б) как тенденция отмечено обогащение тяжелым изотопом углерода тканей самцов рыб и плодов мышей мужского пола.

7. Сезонная гибернация не изменяет изотопное отношение углерода и азота: значения 513С и 5|5И соответствующих тканей идентичны у активно питающихся лягушек перед уходом в зимнюю спячку и у лягушек сразу после выхода из спячки.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Д.Ю. Бедник. A.A. Иванов, П.Д. Голиченкова, Ю.К. Доронин. Распределение стабильных изотопов углерода в тканях взрослых мышей. // Сборник материалов Симпозиума с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза». Москва. 2007, с.35

2. Д.Ю. Бедник. A.A. Иванов, B.C. Севастьянов, П.Д. Голиченкова, Ю.К. Доронин. Фракционирование изотопов углерода в тканях и органах разновозрастных мышей. // Тезисы докладов XVIII Симпозиума по геохимии изотопов имени академика А.П. Виноградова. Москва. 2007, с.44-45.

3. Д.Ю. Бедник. A.A. Иванов, B.C. Севастьянов, П.Д. Голиченкова, Ю.К. Доронин. Возрастные изменения соотношения стабильных изотопов углерода в тканях и органах мышей. Бюл. Моск. Об-ва Испытателей Природы, 2008г., Том 113, Выпуск 5, с. 76-79

4. Д.Ю. Бедник. A.A. Иванов, Ю.К. Доронин. Изотопное обогащение стабильным изотопом у гетеротрофов: отражение метаболических различий или сущностных свойств живого? // XVI Международная конференция и дискуссионный научный клуб «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Украина, Крым, Ялта-Гурзуф. 2008, с. 265-266.

5. Д.Ю. Бедник. П.Д. Голиченкова. Фракционирование стабильных изотопов углерода в тканях и органах взрослых вьюнов Misgurnus fossilis L. // Всероссийская конференция «Фундаментальная наука и клиническая медицина» Одиннадцатая медико-биологическая конференция «Человек и его здоровье». Санкт-Петербург. 2008, с. 29-30

Благодарности. Автор выражает благодарность своему научному руководителю д.б.н. Ю.К. Доронину, Л.П. Штаф, д.б.н. М.Л. Семеновой и всему коллективу кафедры эмбриологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, д.б.н. A.A. Иванову, д.б.н. B.C. Севастьянову, д.б.н. A.B. Тиу-

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, Ленинский пр-т, Д.37А Тираж 100 экз. 2009 год.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бедник, Дарья Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Основные понятия и физико-химические представления о механизмах изотопного фракционирования.

Изотопный состав и изотопное отношение.

Изотопные эффекты и фракционирование изотопов.

Магнитный изотопный эффект.

Фракционирование изотопов у автотрофов.

Фракционирование изотопов у гетеротрофов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Изотопное отношение углерода развивающихся зародышей вьюна.

Сопоставление данных об изотопном содержании углерода в первой и второй сериях измерений тканей вьюнов.

Летние лягушки второго года жизни (16-месячные).

Корреляции изотопного отношения с содержанием углерода и азота в составе тканей.

Летние лягушки третьего года жизни (28-месячные лягушки).

Корреляции изотопного отношения с содержанием углерода и азота в составе тканей

Весенние лягушки четвертого года жизни (36-месячные лягушки).

Корреляции изотопного отношения с содержанием углерода и азота в составе тканей.

Сопоставление данных, полученных при исследовании разновозрастных лягушек.

Изотопное отношение углерода в тканях взрослых мышей.

Изотопное отношение углерода основных фракций тканей взрослых мышей.

Сопоставление данных об изотопном отношении углерода в основных фракциях тканей мышей.

Изотопные отношения углерода и азота в тканях мышей в пренатальный период развития.

Сопоставление данных для тканей эмбрионов мышей разных стадий развития.

Связь изотопного отношения углерода с относительным содержанием азота и углерода в составе ткани.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменчивость изотопного отношения углерода и азота в онтогенезе и при различных функциональных состояниях у представителей высших и низших позвоночных"

Легкий стабильный изотоп углерода в природе представлен в существенно большем количестве, чем тяжелый стабильный изотоп этого элемента. На долю 12С приходится (во вселенском масштабе) 98,9% углерода, на долю |3С - всего 1,10%, что, как хорошо известно, нарушает целочисленность атомного веса углерода (Эмсли, 1993). Еще более контрастно соотношение легкого (l4N) и тяжелого (l3N) стабильных изотопов азота - 99,63% против 0,37%, соответственно.

В 1939 г. А. Нир и Э. Гульбрансен (Nier, Gulbransen, 1939) разделили в соответствии с изотопным составом углерода компоненты земной поверхности на четыре группы. В одну из этих групп включены главным образом растительные формы, отличающиеся от остальных (магматических и метаморфических пород, карбонатов) выраженной асимметрией в соотношении стаj2 joбильных изотопов углерода Си С в сторону первого. Именно это явление- обогащенность растительных и животных форм легким изотопом углерода- получило название биологического фракционирования изотопов, Существенно уточненные со времени Нира и Гульбрансена представления об изотопных отношениях углерода в локальных (т.е. разной природы и различного географического происхождения) образцах дает схема, представленная на рис. 1. В 1953 г. Г. Крейг (Craig, 1953) убедительно подтвердил факт биологической изотопии.

Рис. 1. Вариации изотопного состава углерода в веществе земной поверхности. Из Галимова, 1981.

Соотношение легкого и тяжелого изотопов азота, так же как изотопное отношение углерода, варьирует в достаточно широких пределах в веществах различной природы (рис. 2). Эти вариации предопределены происхождением и превращением веществ, в результате которых и происходит фракционирование изотопов азота.

Атмосферашзкм пая поверх ность ркппсяыясп шпгчшме крошимы нрнролнмо гаил | нофи.■флканнческиеотлмкемня осатчиый |ио-пч п ишнпчяпнч.к: слпк сшп л н'кскнс элий^сния органический а ми10 10 ? 10 )£>Рис, 2. Вариации изотопного отношения азота (5151М, горизонтальная ось) в веществе земной поверхностиФундаментальная значимость явления биологического фракционирования наилучшим образом сформулирована А.И. Опариным в предисловии к книге Э.М. Галимова. Он пишет следующее. «Для меня, как биолога, работающего над проблемой происхождения жизни, особый интерес представляет утверждение автора, что высшими критериями для распознания биогенных и абиогенных соединений может служить характер внутримолекулярного распределения изотопов, которое может возникнуть не просто в результате отдельной реакции (даже ферментативной), а в целом их цикле, осуществляемом в фазово-обособленной открытой системе. Возникновение такого рода многомолекулярных систем в результате неспецифической самосборки органических макромолекул характеризует собой самую начальную стадию перехода от химической эволюции к ее биологическому этапу.

Таким образом (так э/се как в отношении оптической симметрии), пути возникновения закономерного внутрилюлекулярного распределения изотопов в органических соединениях нужно искать не на молекулярном уровне, а на уровне фазовообособленных многомолекулярных открытых систем, взаимодействующих с окружающей средой и эволюционирующих на основании примитивного отбора» (Галимов, 1981, с.5).

Со времени написания этих слов достигнуты существенные успехи в понимании механизмов изотопии - в целом, и в биологической изотопии, в частности (Галимов, 1981, 2006; Бучаченко, 2007); накоплен значительный фактический материал об изотопии, как различных живых форм, так и основных их биохимических компонентов; убедительно показана связь изотопии растительных форм со способами фиксации СОг и азота, а также зависимость изотопного состава гетеротрофов от типов питания (Park, Epstein, 1960, 1961; Ehleringer et al., 1986; Peterson, Fiy, 1987; Griffiths, 1991; Gannes et al, 1997). Изотопное отношение стабильных форм углерода и азота приобретает все большую популярность как метод определения путей миграции и трофических связей животных организмов.

С накоплением сведений об изотопии автотрофов и гетеротрофов несколько «размылось» четкое и ясное представление о физико-химических механизмах изотопного фракционирования. Стало очевидным, что столь динамическая система как организм, обладающая мощными системами гомео-стаза, привносит свои специфические коррективы в процессы фракционирования. Существенный успех для объяснения фракционирования и, главное, многообещающие перспективы направленных влияний на организменные события, привнесло открытие специфических ядерно-спиновых изотопных эффектов (Бучаченко и др., 1976).

Ядерно-спиновый изотопный эффект обеспечен появлением магнитного момента у молекул, включающих в свой состав стабильные изотопы с нецелочисленным ядерным спином (13С и 15N). Молекулы такого рода обречены взаимодействовать с парамагнитными структурами, в число которых входят радикалы. Свободнорадикальные формы достаточно обычны для живой материи. Особую роль имеют свободнорадикальные формы кислорода, порождающие многообразные радикальные формы и губительно сказывающиеся таким образом на структуре и, соответственно, функциях макромолекул в живой системе. Предполагается, что в силу изотопного эффекта (т.е. в силу специфики химических взаимодействий структур, несущих в своем составе стабильные изотопы) и, вероятно, прежде всего, в силу ядерно-спинового изотопного эффекта, молекула, несущая в своем составе стабильный изотоп оказывается «защищенной» от губительного влияния реактивных радикальных форм (Shchepinov, 2007). Соответственно, обогащение организма тяжелыми стабильными изотопами, достигаемая в результате употребления в пищу продуктов, полученных из С4 растений, способно «смягчить», элиминировать многочисленные патологические процессы и даже увеличить продолжительность существования организма (Shchepinov, in press).

Существует еще один аспект проблемы биологического фракционирования изотопов. В результате промышленной деятельности в атмосферу выбрасывается огромное количество углекислого газа, образующегося при сжигании обогащенного легким изотопом углерода топлива - нефти, газа, угля. Соответственно, углекислый газ также обогащен легким изотопом углерода.

В результате, в мегаполисах и промышленных районах углекислый газ на 212 •8%о обогащен изотопом С (Friedman, Irsa, 1967; Галимов, 1987). Такого рода обогащение атмосферы, очевидно, приводит к смещению изотопного отношения в тканях растений в сторону легкого изотопа. Именно такая тенденция — облегчение материала ростовых колец древесных растений, - отмечена с 40-х до конца 80-х годов прошлого столетия. Начиная с последнего срока, тенденция кардинально поменялась: вплоть до настоящего времени годовые кольца деревьев неуклонно и достаточно быстро обогащаются тяжелым изотопом углерода (Воронин и др., 2003). A.A. Ивлев (2005) связывает смену изотопного облегчения на изотопное утяжеление с непрерывным возрастанием концентрации СОг в атмосфере, увеличению среднегодовой температурыи, как следствие, к усилению фотодыхания. События такого рода представляются угрожающими, поскольку развиваются по принципу положительной обратной связи: «планетарные лёгкие» изменяют свой функциональный статус, превращаясь в потребителя кислорода и поставщика углекислого газа, что, в свою очередь, усугубляет планетарный парниковый эффект. Остается неизвестным, влияют ли и как изменения изотопного отношения углерода на состояние и репродуктивные способности растений, на потребляющих их ге-теротрофов и, опосредовано, на человека.

Следует отметить, что, вопреки перспективности и, соответственно, значимости явления биологического фракционирования, механизмы сегрегации изотопов на организменном уровне (особенно у гетеротрофов) остаются неизвестными, хотя по этому поводу нет недостатка в предположениях и гипотезах. Более того, сведения об изотопии органов и тканей гетеротрофных организмов, о динамике изотопных отношений на разных этапах жизненного цикла, о роли (если таковая имеется) изотопного отношения для нормального функционирования организмов, - представлены фрагментарно и очевидно недостаточно.

В этой связи, целью данного исследования стало систематическое определение изотопного отношения в различных тканях на различных этапах онтогенеза и при различных состояниях гетеротрофных организмов. В качестве объектов исследования мы выбрали три существенно различающихся по организации вида позвоночных: костистую рыбу Misgurnus fossilis L., бесхвостую амфибию Rana arvalis Nilsson и домовую мышь Mus musculus L.

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Бедник, Дарья Юрьевна

выводы.

1. Органы и ткани каждого из исследованных видов по изотопному отношению углерода распределяются в две группы. Одна объединяет внутренние органы (печень, почки, мозг, гонаду, мышцы, сердце, кишечный эпителий), которые, как правило, не отличаются по величине изотопного отношения. Вторая группа включает кожу, костную ткань, сухожилия и хрусталик, существенно обогащенные (в сравнении с тканями первой группы) тяжелым изотопом углерода.

2. Изотопное отношение азота одинаково для каждой из тканей и изменяется в равной мере дня всех тканей при изменении состояния и стадии жизненного цикла у каждого из исследованных организмов.

3. Изотопные отношения углерода и азота тканей различны на разных этапах жизненного цикла организмов. Так: а) ткани ювенильных самцов остромордых лягушек существенно обеднены тяжелым изотопом азота (в сравнении с тканями половозрелых самок), что, вероятно, связано с различиями размеров и, соответственно различиями рационов совозрастных особей разного пола. С наступлением половозрелости, выравниванием размеров и унификацией рациона ткани самцов не только выравниваются, но обогащаются тяжелым изотопом в сравнении с тканями совозрастных самок; б) ткани 1-месячных мышей существенно богаче тяжелым изотопом углерода в сравнении с соответствующими тканями 22-месячных мышей; в) изотопное отношение углерода в тканях плодов мышей идентично изотопному отношению соответствующих тканей в материнских организмах, но непосредственно перед рождением смещается в сторону тяжелого изотопа.

4. В то же время изотопное отношение углерода зародышей рыб не отличается от такового ооцитов и не изменяется на протяжении развития в оболочках.

5. Возрастное обеднение тяжелым изотопом углерода тканей мышей сопровождается обеднением тяжелым изотопом белковой фракции этих тканей. Тенденция обеднения тяжелым изотопом углерода отмечена для фракций липидов и нуклеиновых кислот.

6. Значения изотопного отношения углерода и азота, вероятно, связаны с полом организма. Так: а) ткани самцов остромордых лягушек в поздний ювенильный период и при наступлении половозрелости обогащаются тяжелым изотопом азота (в сравнении с тканями совозрастных самок) (см. п.З, а); б) как тенденция отмечено обогащение тяжелым изотопом углерода тканей самцов рыб и плодов мышей мужского пола.

7. Сезонная гибернация не изменяет изотопное отношение углерода и азота: значения 813С и 815Ы соответствующих тканей идентичны у активно питающихся лягушек перед уходом в зимнюю спячку и у лягушек сразу после выхода из спячки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Сопоставление значений изотопного отношения углерода и азота у исследованных видов.

Изотопный состав тканей у особей разного пола.

Из результатов первой серии измерений изотопного отношения углерода тканей рыб однозначно следует, что все без исключения ткани самцов обогащены тяжелым изотопом в сравнении с тканями самок. Однако, вторая серия аналогичных измерений, произведенная годом позже, не подтвердила

13 этот результат: статистически значимых различий значений 5 С тканей самцов и самок не обнаружено. Кажется маловероятным, что это несовпадение предопределено оплошностями при подготовке препаратов для измерений или собственно измерениями. Более вероятно то, что различия такого рода между самцами и самками предопределено какими-либо неизвестными нам эколого-физиологическими факторами существования рыб в период до отлова.

Более определенный результат получен в исследовании остромордых лягушек. Как указывалось выше, существенное обеднение тканей самцов 16-месячных лягушек тяжелым изотопом азота (в сравнении с совозрастными самками) мы склонны считать результатом выраженных различий размеров самцов и самок в этот период ювенильного существования, ведущих к различиям рационов особей разного пола. В этом случае, выравнивание размеров самцов и самок к моменту наступления половозрелости должно было бы привести к унификации рационов и к выравниванию значений б15М. Однако, в реальности, в поздний ювенильный период происходит не только выравнивание изотопного отношения азота у особей разного пола, но и значимое обогащение тканей самцов (в сравнении с таковыми самок) тяжелым изотопом азота. Это явление, вероятно, свидетельствует о существовании периода кардинальных изменений метаболизма самцов в сравнении с таковым у самок.

Изменения изотопного статуса на протяжении жизненного цикла организмов.

Описанная выше динамика изменений изотопного отношения азота у самцов остромордых лягушек является не только демонстрацией различий изотопных отношений у особей разного пола, но и отражает онтогенетический тренд этого показателя. Иными словами, мы склонны считать, что метаболические изменения, происходящие при переходе от ювенильного к половозрелому состоянию самцов остромордых лягушек, сопровождаются стремительным ростом изотопного отношения азота во всех тканях.

Измерения, произведенные на развивающихся зародышах рыб, не выявили сколько-нибудь значимых изменений изотопного отношения углерода. Кажется вероятным, что эмбриональное развитие млекопитающих (мышей) на большей части своей протяженности также не сопровождается существенными изменениями изотопных отношений. Эмбрионы мыши, вплоть до последних сроков беременности сохраняют «изотопное факсимиле», характерное для материнского организма.

Однако, непосредственно перед рождением, изотопное отношение углерода претерпевает резкое изменение: плод «тяжелеет» (в соответствии с изотопным составом углерода) в сравнении с таким же показателем в тканях матери. Это событие не находит однозначного соответствия с совокупностью морфологических изменений, определяемой как стадия развития. Кажется вероятным, что такое скачкообразное изменение изотопии предопределяется инициацией собственных обменных процессов плода, предшествующих рождению.

У млекопитающих явления такого рода ранее не описывались, хотя от

13 15 мечены различия значений 5 С и 5 N между ювенильными и половозрелыми рыбами (Vander Zanden, Hulshot, 1998; Genner et al., 2003), и новорожденными гремучими змеями и их матерями (Pilgrim, 2007) (подробнее см. в разделе «Обзор литературы»).

Наиболее ярким, ранее не отмеченным явлением является возрастное обеднение тяжелым изотопом углерода тканей мышей. Проще всего это явление могло бы быть объяснено изменением соотношений основных химических фракций тканей, в частности, белков и липидов. Поскольку последние сильно обеднены по тяжелому изотопу углерода (DeNiro, Epstein, 1981; Webb et al., 1998; Ruess et al., 2005) увеличение их доли в составе ткани могло бы привести к уменьшению изотопного отношения.

Однако, как было показано выше, возрастное обогащение тканей легким изотопом углерода сопровождается обогащением легким изотопом углерода белковой фракции. Явную тенденцию к такого рода обогащению имеют также фракции липидов и нуклеиновых кислот.

Различия изотопного отношения тканей.

В соответствии с изотопным отношением углерода ткани каждого из исследованных видов можно разделить на две группы. Первую группу составляют печень, почки, сердечная и соматическая мышцы и кишечный эпи

13 телий. Значения 8 С для тканей этих органов, как правило, одинаковы. Отдельное положение принадлежит головному мозгу и гонадам, обычно несколько обогащенным легким изотопом углерода. Вторая группа объединяет структуры, которые возможно назвать «периферическими» по отношению к магистральному кровотоку. Это кожа, костная ткань, сухожилие хвоста и хрусталик. Значения 813С этих тканей на 1 - 1,5%о выше значений для тканей первой группы. Различиями изотопного отношения углерода структур первой и второй группы, а в некоторых случаях - значениями для головного мозга и гонады, - определяется асимметрия распределения значений 813С в разных тканях, неоднократно продемонстрированная выше на многоосных диаграммах.

Этот результат вполне соответствует данным, полученным в предшествующих исследованиях (DeNiro, Epstein, 1978; Tieszen et al., 1983; подробнее см. раздел «Обзор литературы»).

Механизмы, предопределяющие гетерогенность тканей по признаку изотопного отношения углерода, неизвестны. Проводя аналогию с явлением трофического обогащения в пищевой цепи в экологических системах, можно предположить, что в организме, на уровне органов и тканей также осуществляется своего рода «трофическое обогащение». Факторы, предопределяющие трофику тканей и, соответственно, трофическое обогащение тем или иным стабильным изотопом, очевидно многообразны. Здесь и анатомические особенности структуры органов и их отношения между собой, особенности рецепторного и эффекторного аппарата клеток, обеспечивающие преимущественное поглощение, либо выделение содержащих биогенные элементы веществ, особенности внутриклеточных ферментативных превращений и многое другое. В совокупности - все особенности, которые обобщаются понятиями «тканевая специализация» и «тканевой метаболизм».

Представленный выше материал позволяет полагать, что для тканей со сравнительно низким уровнем дыхания и метаболизма (кость, кожа, сухожилия, хрусталик) характерно «трофическое обогащение» тяжелым изотопом углерода. Однако этой посылке противоречат факты, свидетельствующие о возрастном смещении изотопного отношения в сторону легкого изотопа углерода у мышей, так же как тенденция обогащения тяжелыми изотопами тканей самцов в сравнении с тканями совозрастных самок, поскольку, как хорошо известно, у млекопитающих уровень метаболизма снижается с возрастом, а интенсивность метаболизма у самцов выше, чем у самок.

На фоне разнообразия значений 513С в тканях исследованных организмов, представляется удивительным идентичность значений разных тканей, изменяющихся в равной мере при изменении состояния и стадии жизненного цикла у каждого из исследованных организмов. Объяснить сколько-нибудь убедительно этот факт не представляется возможным.

На рис. 51 и в таблице 53 представлены распределения и их параметры всей совокупности измерений изотопных отношений тканей трех исследованных видов. Статистическая оценка свидетельствует о нормальности этих распределений. Их особенность состоит в том, что они характеризуют не столько статистическую вариабельность значений изотопных отношений, сколько их разнообразие в пределах организма определенного вида. Соответственно, широта изменчивости значений 513С составляет у вьюнов 7,26%о (т.е. 23% от среднего значения), у лягушек - 5,69%о (21% от среднего значения), у мышей - 8,08%о (37,27% от среднего значения) (табл. 53). Широта изменчивости значений б,3Ы равна: у вьюнов - 2,31%о (т.е. 24,5% от средней величины); у лягушек - 3,95%о (140,6% от средней величины); у мышей -3,62% (46,3% от средней величины). Эти показатели могут оказаться полезными при определении трофических связей в экологических исследованиях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бедник, Дарья Юрьевна, Москва

1. Бучаченко A.JI. 2007. Новая изотопия в химии и биохимии. М.: Наука, 189 сс.

2. Бучаченко А.Л., Галимов Э.М., Никифоров Г.А. 1976. Докл. АН СССР, 228: 379-382.

3. Варшавский Я.М. 1988. О распределении тяжелого изотопа углерода (13С) в биологических системах. Биофизика, 23 (2): 351-355.

4. Галимов Э.М. 1981. Природа биологического фракционирования изотопов. М., Наука, 248 сс.

5. Галимов Э.М. 2006. Феномен жизни. Между равновесием и нелинейностью. Происхождение и принципы эволюции. М.: Едиторная УРСС, 256 сс.

6. Ивлев A.A. 1985. Теоретический анализ связей состояния клетки и путей фракционирования изотопов углерода в процессах метаболизма. Биофизика, 30 (1): 88-92.

7. Ивлев A.A. 1991. Распределение изотопов углерода (13С/12С) в клетке и временная организация клеточных процессов. Биофизика, 36 (6): 10691077.

8. Ивлев A.A. 1992. Связь изотопного состава углерода волос человека с его функциональным состоянием. Биофизика, 37 (6): 1086-1089.13 12

9. Ивлев A.A. 2002. Изотопноуглеродный ( С/ С) эффект фотодыхания у фотосинтезирующих организмов. Доказательство существования. Вероятный механизм. Биофизика, 49: 56-70.

10. Ивлев A.A. 2004. Внутримолекулярные изотопные распределения метаболитов в гликолитической цепи. Усп. Совр. Биологии, 49 (3): 436452.

11. Ивлев A.A., Князев Д.А., Калошин А.Г. 1982. Соотношения внутримолекулярного распределения изотопов углерода при декарбоксилирова-нии пирувата. Биофизика, 27 (5): 762-767.

12. Ивлев A.A., Князев Ю.А., Логачев М.Ф. 1996. Короткопериодические колебания изотопного состава углерода ССЬ выдыхаемого воздуха в различных функциональных состояниях человека. Биофизика, 41 (2): 502-507.

13. Ивлев A.A., Королева М.Я., Калошин А.Г. 1975. Механизм возникновения изотопных эффектов углерода в процессах метаболизма. Мол. Биол., 217: 224-227.

14. Ивлев A.A., Пантелеев Н.Ю., Князев Ю.А., Логачев М.Ф., Миллер Ю.М. 1994. Суточные изменения изотопного состава углерода ССЬ выдыхаемого воздуха у человека при некоторых нарушениях метаболизма. Биофизика, 39 (2): 393-399.

15. Казначеев В.П., Доильницын Е.Ф., Габуда С.П., Ржавин А.Ф., Маликов Н.Г. 1987. Фракционирование изотопов углерода в тканях человека при атеросклерозе // Бюлл. эксп. биол. мед., 104, №9. С. 295-296.

16. Костомарова A.A. 1975. Вьюн Misgumus fossilis L. В книге «Объекты биологии развития» М., Наука, с. 308-323.

17. Северин С.Е., Соловьева Г.А. (ред.) 1989. Практикум по биохимии. М., Изд-во Московского Университета, с. 166-167.

18. Терентьев П.В. 1950. Лягушка. Из-во «Советская Наука», М., 345 сс.

19. Тиунов A.B. 2007. Стабильные изотопы углерода и азота в почвенно-экологических исследованиях. Изв. РАН, Сер. Биол. №4, 475-489.

20. Эмсли Дж. 1993. Элементы. М.: Мир, 256 сс.

21. Abend A.G., Smith T.D. 1997. Differences in stable isotopic ratios of carbon and nitrogen between long-finned pilot whales (Globicephala melax) and their primary prey in western north Atlantic. J. Marine Sei., 54: 500-503.

22. Abend, A. G. and T. D. Smith. 1995. Differences in ratios of stable isotopes of nitrogen in long-finned pilot whales (Globicephala melas) in thewestern and eastern North Atlantic. ICES Journal of Marine Science 52:837-841.

23. Adams T.S., Sterner R.W. 2000. The effect of dietary nitrogen content on trophic level 15N enrichment. Limnol. Oceanogr., 45: 601-607.

24. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. 2008. Molecular biology of the cell. Garland Science, NY, 1268 pp.

25. Ambrose, S.H. 1991. Effects of diet, climate and physiology on nitrogen isotope abundances in terrestrial food webs. J. Archaeol. Sci. 18: 293-317.

26. Ambrose, S.H., and DeNiro, M.J. 1986. The isotopic ecology of East African mammals. Oecologia, 69: 395-406.

27. Badeck F.W., Tcherkez G., Nogue's S., Piel C., Ghashghaie J. 2005. Postphoto synthetic fractionation of stable carbon isotopes between plant organs—a widespread phenomenon. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19: 1381-1391.

28. Bell L.S., Cox G., Sealy J. 2001. Determining isotopic life history trajectories using bone density fractionation and stable isotope measurements: a new approach. Amer. J. Phys. Antropol., 116: 66-79.

29. Bender M. M. 1968. Mass spectrometric studies of carbon 13 variations in corn and other grasses. Amer. J. Sci., Radiocarbon Suppl. 10: 468-472

30. Bender M.M., Rouhani I., Vines H.M., Black C.C. 1973. 13C/12C ratio changes in Crassulacean acid metabolism plants. Plant Physiol., 52: 427-30.

31. Best P.B., Schell D.M. 1996. Stable isotopes in southern right whale (Eubalaena austrais) baleen as indicators of seasonal movements, feeding and growth. Marine Biol., 124: 483-94.

32. Borland A.M., Griffiths H., Broadmeadow M.S.J., Fordham M.C., Maxwell C. 1993. Short-term changes in carbon-isotope discrimination in C3 CAM intermediate Clusia minor L. growing in Trinidad. Oecologia, 95:271-6.

33. Burns J.M., Trumble S.J., Castellini M.A., Testa J.W. 1998. The diet of Weddell seals in McMurdo Soundm Atlantica as determined from scat collections and stable isotope analysis. Polar Biol., 19: 272-82.

34. Caraveo-Patino J., Soto L.A. 2005. Stable carbon isotope ratio for the gray whale (Eschrichtius robustus) in the breeding grounds of Baja California Sur, Mexico. Hydrobiologia, 539: 99-107.

35. Cherel Y., Hobson K.A. 2005. Stable isotopes, beaks and predators: a new tool to study the trophic ecology of cephalopods, including giant and colossal squids. Proc. R. Soc. B, 272: 1601-1607.

36. Cherel, Y., Hobson, K.A., Hassani, S. 2005. Isotopic discrimination between food and blood and feathers of captive penguins: implications for dietary studies in the wild. Physiol. Biochem. Zool., 78: 106-115.

37. Craig H. 1953. The geochemistry o the stable carbon isotopes. Geochim. et cosmochim. acta, 3, № 2/3, p.53-92.

38. Cruz V.C., Ducatti C., Pezzato A.C., Pinheiro D.F., Sartori J.R., Goncalves J.C., Carrijo A.S. 2005. Influence of diet on assimilation and turnover of 13C in the tissues of broiler chickens. British Poultry Sci., 46: 382-389.

39. Degens E.T. 1969. Biogeochemistry of stable carbon isotopes. In: Organic Geochemistry (Eds. G.Eglinton, M.T.J. Murphy), 12: 304-329.

40. Denadai J.C., Ducatti C., Pezzato A.C., Carrijo A.S., Caldera F.R., Oliveira R.P. 2006. Studies on carbon-13 turnover in eggs and blood of commercial layers. Brazilian J. Poultry Sci., 8: 251-256.

41. DeNiro M.J., Epstein S. 1978. Influence of diet on the distribution of carbon isotopes in animals. Geochim. Cosmochim. Acta, 42: 495-506.

42. DeNiro M.J., Epstein S. 1981. Influence of diet on the distribution of nitrogen isotopes in animals. Geochim. Cosmochim. Acta, 45: 341-51.

43. Dodd A.N., Borland A.M., Haslam R.P., Griffiths H., Maxwell K. 2002. Crassulacean acid metabolism: plastic, fantastic. J. exp. Botany, 53: 569-580

44. Eggers T., Jones T.H. 2000. You are what you eat . or are you? Trends Ecol. Evol., 15: 265-266.

45. Ehleringer J.R., Rundel P.W., Nagy K.A. 1986. Stable isotopes in physiological ecology and food web research. Trends Ecol. Evol., 1: 42-45.

46. Fantle M.S., Dittel A.I., Schwalm S.M., Epifanio C.E., Fogel M.L. 1999. A food web analysis of the juvenile blue crab, Callinectes sapidus, usimg stable isotopes in whole animals and individual amino acids. Oecologia, 120: 416-426.

47. Felicetti L.A., Robbins C.T., Shipley L.A. 2003a. Dietary protein content alters energy axpenditure and composition of the mass gain in grizzly bears (Ursus arctor horribilis). Physiol. Biochem. Zool., 76: 256-261.

48. Fenolio D.B., Graening G.O., Colier B.A., Stout J.F. 2006. Coprophagy in cave-adapted salamander; the implication of bat guano examined through nutritional and stable isotope analyses. Proc. R. Soc. Lond. B, 273: 439-443.

49. Folinsbee R.E., Fritz P., Krouse H.R., Robblee A.R. 1970. Carbon-13 and oxygen-18 in dinosaur, crocodile and bird eggshells indicate environmental conditions. Science, 168: 1353-1356.

50. Forero M.G., Hobson K.A. 2003. Stable isotopes of nitrogen and carbon to study seabird ecology: application in the Miditerranean seabird community. Sci. Mar., 67 (Suppl. 2): 23-32.

51. Friedman L, Irsa A.P. 1967. Variations in the isotopic composition of carbon in urban atmospheric carbon dioxide. Science, 154: 263-264.

52. Galimov E. M. 1966. Carbon isotopes of soil C02. Geochem. International 3(5): 889-897; translated from: Geokhimiya, 9: 1110-1118.

53. Gannes L.Z., O'Brien D.M., Martinez Del Rio C. 1997. Stable isotopes in animal ecology: assumptions, caveats, and a call for more laboratory experiments. Ecology, 78: 1271-1276.

54. Genner M.J., Hawkins S.J., Turner G.F. 2003. Isotopic change throughout the life history of a Lake Malawi cichlid fish. J. Fish Biol., 62: 907-917.

55. Gratton C., Forbes A.E. 2006. Changes in 513C stable isotopes in multiple tissues of insect predators fed isotopically distinct prey. Oecologia, 147: 615-624.

56. Griffiths H. 1991. Application of stable isotope technology in physiological ecology. Func. Ecol., 5: 254-269.

57. Griffiths H. 1992. Carbon isotope discrimination and the integration of carbon assimilation pathways in terrestrial CAM plants. Plant, Cell and Environment, 15: 1051-62.

58. Guelineckx J., Moes J., De Brabandere L., Dehairs F., Ollevier F. 2006. Migration dynamics of clupeoids in the Schelde estuary: A stable isotope approach. Estuarine, Costal and Shelf Sci., 66: 612-623.

59. Haines E.B. 1976. Relation between the stable carbon composition of fiddler crabs, plants and soil in a salt marsh. Limnol. Oceanogr., 21: 880-883.

60. Hall, H. M., F. E. Clements. 1923. The North American species of Artemisia, Chiysothamnus, and Atriplex. in: The phylogenetic method in taxonomy. Carnegie Institute Wash., Washington, D.C. pp. 342-344.

61. Harding E.K., Stevens E. 2001. Using stable isotopes to assess seasonal patterns of avian predation across a terrestrial-marine landscape. Oecologia, 129: 436-444.

62. Hatch M. D., Slack C. R. 1970. Photosynthetic C02-fixation pathways. Annu. Rev. Plant Physiol., 21: 141-162.

63. Hentschel B.T. 1998. Intraspecific variations in 513C indicate ontogenic diet changes in deposit-feeding polychaetes. Ecology, 79: 1357-1370.

64. Hilderbrand G.V., Farley S.D., Robbins C.T., Hanley T.A., Titus K., Servheen C. 1996. Use stable isotopes to determine diets of living and extinct bears. Can. J. Zool., 74: 2080-2088.

65. Hobson K.A., Alesauskas R.T., Clark R.G. 1993. Stable-nitrogen isotope enrichment in avian tissue due to fasting and nutritional stress: implication for isotopic analyses of diet. The Condor, 95: 388-394.

66. Hobson K.A., Clark R.G. 1992. Assessing avian diets using stable isotopes II: Factors influencing diet-tissue fractionation. The Condor, 94: 189-197.

67. Hobson K.A., McLellan B.N., Woods J.G. 2000. Using stable carbon (513C) and nitrogen (515N) isotopes to infer trophic relationships among black and grizzly bears in the upper Columbia River basin, British Columbia. Canadian J. Zool., 78: 1332-1339.

68. Hobson K.A., Schell D.M. 1998. Stable carbon and nitrogen isotope patterns in baleen from eastern Arctic bowhead whales {Balaena mysticetus). Can J. Fisher. Aquatic Sci., 55: 2601-2607.

69. Igamberdiev A.U., Ivlev A.A., Bykova N.V., Threlkeld Ch., Lea P.J., Gardestrom P. 2001. Decarboxylation of glycine contributes to carbon fractionation in photosynthetic organisms. Photosynthesis Res., 67: 177-184.

70. Ikeda H,, Kubota K., Kagaya T., Abe T. 2006. Niche differentiation of burying beetles (Coleoptera: Silphidae: Nicrophorinae) in carcass use in relation to body size: Estimation from stable isotope analysis. Appl. Entomol. Zool., 41: 561-564.

71. Keeling C. D. 1961. The concentration and isotopic abundances of carbon dioxide in rural and marine air. Geochim. Cosmochim. Acta, 24: 277-298.

72. Kelly J.F. 2000. Stable isotopes of carbon and nitrogen in the study of avian and mammalian trophic ecology. Can. J. Zool., 78: 1-27.

73. Kiriakoulakis K., Fisher E., Wolff G.A., Freiwald A., Grehan A., Roberts J.M. 2005. Lipids and nitrogen isotopes of two deep-water corals from the North-East Atlantic: initial results and implications for their nutrition. In:

74. Cold-water Corals and Ecosystems. (A. Freiwald, J.M. Roberts, eds.). Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, pp.715-729.

75. Kortschak,H. P., Hartt C. E., Burr G. 0. 1965. Carbon dioxide fixation in sugarcane leaves. Plant Physiol., 40: 209-213.

76. Lee S.H., Schell D.M., McDonald T.L., Richardson W.J. 2005. Regional and seasonal feeding by bowhead whales Balaena myslicetus as indicated by stable isotope ratios. Marine Ecol. Progress Ser., 285: 271-287.

77. Lesage V. 2002. Diet-tissue fractionation of stable carbon and nitrogen isotopes in phocid seals. Marine Mammal. Sci., 18: 182-193.

78. Luttge U. 2002. C02 concentrating: consequences in crassulacean acid metabolism. J. Exp. Botany, 53: 2131-42.

79. Lyon T.D., Baxter M.S. 1978. Stable carbon isotopes in human tissues. Nature, 273: 750-752.

80. Macko S.A., Engel M.H., Andrusevich V., Lubec C., O'Connell T.C., Hedges R.E.M. 1999. Documenting the diet of ancent human populations through stable isotope analysis of hair. Philisoph. Transact. Royal Soc. Lond. B, 354: 65-76.

81. Maros A., Louweaux A., Lelarge C., Gerondot M. 2006. Evidence of exploitation of marine resource by the terrestrial insect Scapteriscus didactylus through stable isotope analyzes of its cuticle. BMC Ecology, 6: 6.

82. McCue M.D. 2008. Endogenous and environmental factors influence the• •• 13 15*** .dietary fractionation of C and N in hissing cockroaches. Physiol. Bio-chem. Zool., 81: 14-24 (Electronically published 11/16/2007).

83. McCue M.D. 2008. Stable isotopes track spatio-temporal patterns of nutrient allocation in postpradial pit-vipers. Res. Rew. Bio Science, 1: 17-26.

84. McCutchan J.H. Lewis W.M., Kendall C., McGrath C.C. 2003. Variation in trophic shift for stable isotope ratios of carbon, nitrogen, and sulfur. Oikos, 102: 378-90.

85. Metref S., Rousseau D.D., Bentalev L., Labonne M. 2003. Study of the diet effect on S13C of shell carbonate of the land snail Helix aspersa in the ex-perimentsl conditions. Earth and Plan. Science Letters, 211: 381-393.

86. Michener, R.H., and Schell, D.M. 1994. Stable isotope ratios as tracers in marine aquatic food webs. In Stable isotopes in ecology and environmental science. Edited by K. Lajtha and R.H. Michener. Blackwell Scientific, London. pp. 138-157.

87. Minagawa M., Wada E. 1984. Stepwise enrichment of 15N along food chain: further evidence and relation between 515N and animal age. Geochim. Cos-mochim. Acta, 48: 1135-1140.

88. Minson D.J., Ludlow M.M, Troughton J.H. 1975. Differences in natural carbon isotope ratio of milk and hair from cattle grazing tropical and temperature pastures. Nature, 256: 602.

89. Mitani Y., Bando T., Takai N., Sakamoto W. 2006. Patterns of stable carbon and nitrogen isotopes in the baleen of common Minke whale Balenoptera acutorostrata from the western North Pacific. Fisher. Sci., 72: 69-76.

90. Moore A.K., Suthers L.M. 2005. Can the nitrogen and carbon stable isotopes of the pygmy mussel, Xenostrobus secures, indicate catchment disturbance for estuaries in Northen New South Wales, Australia? Estuaries, 28(5): 714725.

91. Moss D. M. 1962. The limiting carbon dioxide concentration for photosynthesis. Nature, 193: 587.

92. Nardoto G.B., de Godoy P.B., de Barros Ferraz E.S., Balbaud Ometto J.P.H., Martinelli L.A. 2006. Stable carbon and nitrogen isotopic fractionation between diet and swine tissue. Sci. Agric. (Braz.), 63: 579-582.

93. Nelson E.A., Sage R.F. 2008. Functional constrains of CAM leaf anatomy: tight cell packing is associated with increased CAM function across a gradient of CAM expression. J. Exp. Botany, 59(7): 1647- 1661.

94. Nier A.O., Gulbransen E.A. 1939. Variations in the relative abundance of the carbon isotopes. J. Amer. Chem. Soc., 61: 697-698.

95. Norris D.R., Arcese P., Preikshot D., Bertram D.F., Kyser T.K. 2007. Diet reconstruction and historic population dynamics in a threatened seabird. J. Appl. Ecology, 44: 875-884.

96. O'Brien D.M., Bogg C.L., Fogel M.L. 2003. Pollenfeeding in the butterfly Heliconius charitonia: isotopic evidence for essential amino acid transfer from pollen to eggs. Proc. R. Soc. Lond. B, 270: 2631-2636.

97. Oelbermann K., Scheu S. 2002. Stable isotope enrichment (515N and 813C) in generalist predator (Pardosa lugubris, Araneae: Lycosidae): effect of prey quality. Oecologia, 130: 337-344.

98. Ostrom P.H., Colunga-Garcia M., Gage S.H. 1997. Establishing pathways of energy flow for insect predator using stable isotope ratios: field and laboratory evidence. Oecologia, 109: 108-113.

99. Ostrom P.H., Lien J., Macko S.A. 1993. Evaluation of the diet of Sowerby's beaked whale, Mesoplodon bidens, based on isotopic comparisons among northwestern Atlantic cetaceans. Canad. J. Zool., 71: 858-861.

100. Park R., Epstein S. 1960. Carbon isotope fractionation during photosynthesis. Geochim. Cosmochim. Acta, 27: 110-126.

101. Park R., Epstein S. 1961. Metabolic fractionation of 12C and 13C in plants. Plant Physiol., 36: 133-138.

102. Parker P. L. 1964. The biogeochemistry of the stable isotopes of carbon in a marine bay. Geochim. Cosmochim. Acta, 28: 1155-1164.

103. Pearson S.F., Levey D.J., Greenberg C.H., Martinez del Rio, C. 2003. Effects of elemental composition on the incorporation of dietary nitrogen and carbon isotopic signatures in an omnivorous songbird. Oecologia, 135: 516523.

104. Peterson B.J., Fiy B. 1987. Stable isotopes in ecosystem studies. Annual Rev. Ecol. Syst., 18: 293-320.

105. Petzke K.J., Boeing H., Klaus S., Metges C.C. 2005b. Carbon and nitrogen stable isotopic composition can be used as biomarkers for animal-derived dietary protein intake in humans. J. Nutr., 135: 1515-1520.

106. Petzke K.J., Boeing H., Metges C.C. 2005a. Choice of dietary protein of vegetarians and omnivores is reflected in their hair protein 13C and 15N abundance. Rapid Commun. Mass Spectrom., 19: 1392-1400.

107. Popa-Lisseanu A.G., Delgado-Huertas A., Forero M.G., Rodriguez A., Arlettaz R., Ibanez C. 2007. Bat's conquest of a formidable foraging niche: the myriads of nocturnally migrating songbirds. PLoS ONE, 2(2): 205.

108. Post D.M. 2002. Using stable isotopes to estimate trophic position: models, methods and assumptions. Ecology, 83: 703-718.

109. Power M., Guiguer K.R., Barton D.R. 2003. Effects of temperature on iso-topic enrichment in Daphnia magna: implications for aquatic food-web studies. Rapid Commun. Mass Spectrom., 17: 1619-1625.

110. Power M., Igoe F., Neylon S. 2007. Dietary analysis of sympatric arctic char and brown trout in Lough Mackross, South-Western Ireland. Biol. Environ.: Proc. Royal Irish Acad., 107B: 31-41.

111. Raikow D.F., Hamilton S.K. 2001. Bivalve diets in a Midwestern U.S. stream: a stabil isotope enrichment study. Limnol. Oceanogr., 46: 514-522.

112. Richards M.P., Pettett P.B., Stiner M.C., Trinkaus E. 2001. Stable isotope evidence for increasing dietary breadth in European mid-Upper Paleolithic. Proc. Natl. Acad. Sci., 98: 6528-6532.

113. Robbins C.T., Felicetti L.A., Sponheimer M. 2005. The effect of dietary protein quality on nitrogen isotope discrimination in mammals and birds. Oecologia, 144: 534-540.

114. Robinson S.A., Osmond C.B., Geles L. 1993. Interpretation of gradient in S13C value in thick photosynthetic tissue of plants with Crassulacean acid metabolism. Planta, 190: 271-276.

115. Romanek C.S., Gaines K.F., Bryan A.L., Brisbin L.L. 2000. Foraging ecology of the endangered wood stork recorded in stable isotope signature of feathers. Oecologia, 125: 584-594.

116. Roth J.D., Hobson K.A. 2000. Stable carbon and nitrogen isotopic fractionation between diet and tissue of captive red fox: implication for dietary reconstruction. Can. J. Zool., 78: 848-52.

117. Ruess L., Tiunov A.V., Haubert D. et al. 2005. Carbon stable isotope fractionation and trophic transfer of fatty acids in fungal based soil food chains. Soil Biol. Biochem., 37: 945-953.

118. Sackett W.M., Eckelmann W.R., Bender M.L., Be' A.W.H. 1965. Temperature dependence of carbon isotope composition in marine plankton and sediment. Science, 148: 235-237.

119. Sager C.L., Goggin F.L. 2007. Isotopic enrichment in a phloem-feeding insect: influences of nutrient and water availability. Oecologia, 151: 464-472.

120. Schell, D.M., Saupe, S.M., and Haubenstock, N. 1989. Bowhead whale (Balaena mysticetus) growth and feeding as estimated by 813C techniques. Mar. Biol. (Berl.), 103: 433^143.

121. Schoeninger, M.J., and DeNiro, M.J. 1984. Nitrogen and carbon isotopic composition of bone collagen from marine and terrestrial animals. Geochim. Cosmochim. Acta, 48: 625-639.

122. Scott L.D. 2002. The influence of diet on the 513C of shell carbon in the pulmonate snail Helix aspersa. Earth and Plan. Science Letters, 195: 249259.

123. Sealy J.C., van der Merwe N.J., Lee-Thorp J.A., Lanham J.L. 1987. Nitrogen isotopic ecology in southern Africa: implication for environmental and dietary tracing. Geochimi. Cosmochim. Acta, 51: 2707-2717.

124. Shchepinov M.S. 2007. Reactive oxygen species, isotope effect, essential nutrients, and enhanced longevity. Rejuvenation Res., 10: 47-59.

125. Shchepinov M.S., in press. Do "heavy" eaters live longer?

126. Shearer, G., Kohl, D.H., and Virginia, R.A. 1983. Estimates of N2-fixation from variation in the natural abundance of 15N in Sonoran Desert plants. Oecologia, 56: 365-373.

127. Shoeninger M.J., DeNiro M.J. 1984.Nitrogen and carbon isotopic composition of bone collagen from marine and terrestrial animals. Geochimi. Cos-mochim. Acta, 48: 625-639.

128. Shoeninger M.J., DeNiro M.J., Tauber H. 1983. Stable nitrogen isotope ratios of bone collagen reflect marine and terrestrial components of prehistoric human diet. Science, 220: 1381-1383.

129. Slatkin D.N., Friedman L., Irsa A.P., Micca P.L. 1985. The stability of DNA in human cerebella neurons. Science, 228: 1002-1004.

130. Smith B. N., Epstein S. 1971. Two categories of 13C/12C ratios for higher plants. Plant Physiol., 47: 380-384.

131. Smith B.N., Epstein S. 1970. Biogeochemistry of the stable isotopes of hydrogen and carbon in salt marsh biota. Plant Physiol., 46: 738-742.

132. Steele, K.W., and Daniel, R.M. 1978. Fractionation of nitrogen isotopes by animals: a further complication to the use of variations in the natural abundance of 15N for tracer studies. J. Agric. Sci. 90: 7-9.

133. Stowasser G„ Pierce G.J., Moffat C.F., Collins M.A., Forsythe J.W. 2006. Experimental study on the effect of diet on fatty acid and stable isotope profiles of squid Lolliguncuka brevis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 333: 97-114.

134. Sutoh M., Koyama T., Yonegama T. 1987. Variations of natural nitrogen-15 abundances in the tissues and digesta of domestic animals. Radioisotopes, 36: 74-77.

135. Sutoh, M., Koyama, T., and Yonyeyama, T. 1987. Variations of natural 13N abundances in the tissues and digesta of domestic animals. Radioisotopes, 36: 74-77.

136. Sydeman W.J., Hobson K.A., Pyle P., McLaren E.B. 1997. Trophic relationships among seabirds in central California: combined stable isotope and conventional dietary approach. The Condor, 99: 327-336.

137. Teeri J.A., Torsor S.J., Turner M. 1981. Leaf thickness and carbon isotope composition in crassulaceae. Oecologia, 50:367-9.

138. Thompson D.R., Lilliendahl K., Solmundsson J., Furness R.W., Waldron S., Phillips R.A. 1999. Trophic relationships among six species of Icelandic seabirds as determined through stable isotopic analysis. The Condor, 101: 898-903.

139. Tieszen L.L., Boutton T.W., Tesdahl K.G., Slade N.A. 1983. Fractionation13and turnover in animal tissue: Implication for 8 C analysis of diet. Oecologia, 57: 32-37.

140. Tregunna E. B., Smith B. N., Berry J. A., Downton W. J. S. 1970. Some methods for studying the photosynthetic taxonomy of the angiosperms. Can. J. Bot. 48: 1209-1214.

141. Trueman C.N., McGill R.A., Guyard P.H. 2005. The effect of growth rate on tissue-diet isotopic spacing in rapidly growing animals. An experimental study with Atlantic salmon (Salmo salar). Rapid Commun. Mass Spectrom., 19: 3239-3247.

142. Vanderklift M.A., Ponsard S. 2003. Sourses of variation in consumer-diet 815N enrichment: a meta-analysis. Oecologia, 136: 169-182.

143. Virginia, R.A., Delwiche, C.C. 1982. Natural 15N abundance of presumed N2-fixing and non-N2-fixing plants from selected ecosystems. Oecologia, 54:317-325.

144. Voigt C.C., Matt F. 2004. Nitrogen stress caused unpredictable enrichment of I5N in two nectar-feeding bat species. J. Exp. Biol., 207: 1741-1748.

145. Voigt C.C., Speakman J.R. 2007. Nectar-feeding bats fuel their high metabolism directly with exogenous carbohydrates. Funct. Ecol., 21: 913-921.

146. Voigt Ch.C., Matt F., Michener R., Kunz T.H. 2003. Low turnover rates of carbon isotopes in tissue of two nectar-feeding bat species. J. Exp. Biol., 206: 1419-1427.

147. Walker P.L., DeNiro M.J. 1986. Stable nitrogen and carbon isotope ratio in bone collagen as indices of prehistoric dietary dependence on marine and terrestrial resources in southern California. Amer. J. Phys. Antropol., 71:5161.

148. Webb S.C., Hedges R.E.M., Simpson S.J. 1998. Diet quality influences the 813C and 515N of locusts and their biochemical components. J Exp. Biol., 201:2903-11.

149. Welch D.W., Parsons R.R. 2006. 8I3C SI5N values as indicators of trophic position and competitive overlap for Pacific salmon (Oncorhynchus spp.). Fish. Oceanogr., 2(1): 11-23.

150. Wickman F. E. 1952. Variations in the relative abundance of the carbon isotopes in plants. Geochim. Cosmochim. Acta, 2: 243-254.

151. Yoneyama T., Handley L.L., Scrimgeour C.M., Fisher D.B., Raven J.A. 1997. Variations of the natural abundances of nitrogen and carbon isotopes in Triticum aestivum, with special reference to phloem and xylem exudates. New Phytol., 137: 205-213.