Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменчивость и особенности инфекционной биологии Heterobasidion Annosum (Fr.) Bref.

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Изменчивость и особенности инфекционной биологии Heterobasidion Annosum (Fr.) Bref."

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУ1БЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ

ИНСТИТУТ БОТАНИКИ ям. Н.Г.ХОЛОДНОГО АН УКРАИНЫ

На правах рукописи

ИСКРИЦКИЙ

ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ОСОБЕННОСТИ ИНФЕКЦИОННОЙ БИОЛОГИИ НЕТЕЕОВтМОН Аянозим (РН.) ВИЕР.

03.00.24 . Микология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой отепенн кандидата биологических ваук

Киев - 1992

Работа »нцаднеяа в лаборатории физиологии н биотехнология раотеии* Украинского ордена "Знак Почета" научно-исследовательского ппашт «овага лозяйсгва it агрдееоаивляорацк« им.Г.Н,Высоцкого

Научен! руководитель - кандидат сельскохозяйственных наук,о.н,о, Е.И.Ладейиикова

ОФяпяиыша оппоненты - доктор биологически! наук, профессор

И,А,Дудка

кандидат биологических яаук, профессор А.Р.Цилюрик

ВедУиа* организация - Московский государственный университет им. м. В, Ломоносова

Эаяита дисоертапии состоится ^ffi*,.. /A'fa^-f....... 1992 г.

а | часои на заседании сшпиализяромии'ого совета Д 016.52.01

пр* Ияотятута ботаники ни, Й.Г,Холодного АН Украины (232601,г,Кие», ГОЦ-1, ул.Репина, 2)

О дисмрпшю« ими» ознакомиться я библиотеке ««отитута ботаника ям» Н,Г.Холодного (252025, г,Киев, ул.Житоиирская, 2В)

Автореферат -хазоолан'"

Учен«» секретарь спеииализировакного совета кандидат биологических наук

лт

И.Л.Навроцкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Корневая губка - Heterobasidion annosum (Рг.) Bref. - является возбудителей корневых и комлевых гнилей хвойных пород в умеренных климатических регионах планеты, распространенным практически вэ всех странах с интенсивным лесопользованием, в том числе и на Украине.

По данным Украинского лесоустроительного предприятия (Лесной фонд..., Киев, 1933) обшая площадь хвойных насаждений на Украине составляет 2,9 млн, га, из которых 76.9Î приходится на долю сосняков. Молодняки сосны - навш лесное будущее - к настоящему времени представлены в основном искусственными насаждениями. Поскольку наибольший ущерб Н.аппоашп причиняет монокультурам сосны, вою занимаемую ; ими площадь следует считать потенциально предрасположенной к заболеванию, йкгический ущерб от H. aanosrn.. в значительной мере будет определяться эффективностью направленных против нее защитных мероприятий, научное обоснование которых невозможно без ответа на дискуссионный вопрос о месте и роли патогена во взаимоотношении с раотением-хозяи- . ном.

Выполненная работа является составной частью комплексных исследований по проблеме корневой губки в хвойных насаждениях, проводимых лабораторией физиологии и биотехнологии растений Украинского НИИ лесного хозяйства и агролесомелиорации.

Пели исследования состояли в определении роли патогена в возникновении и развитии очагов усыхания сосны обыкновенной в насаждениях, предрасположенных к заболеванию корневой губкой. Задачи исследования сформулированы таким образом:

1. Оценить степень внутривидовой однородности H,annosum по макро- и микроскопическим признакам в телеоморфной и анаиорфной стадиях.

2. Определить степень и факторы изменчивости H. annosum

по основным физиолого-биохимичеоким показателям (рост, де-реворазрушающая активность, синтез фитотоксина фоманноксин).

3. Выявить закономерности пространственной организации локальных популяций H. annosum в очагах болезни.

4. Установить закономерности распространения H. annosum в насаждениях сосны обыкновенной.

Научная новизна» Впервые проведено изучение пространственное структуры локальных популяций H.annosun в монокультурах сосны обыкнокнной. Установлено, что очаг болезни представляет собой локальную популяцию патогена, структурными субьединицами . которых являются соматически несовместимые клоны. Независимо от площади очага в нем выявляется of 5 до 10 клонов. Для средневозрастных насаждений максимайШе клоновое разнообразие не превышает 556 клонов/га С по рэсчетЗиГ на площадь очага-прэгалины) и в средней составляет 66-83 клона/га (по расчетам на плошадь пораженного насаждения). Клоны характеризуются равномерным, независимо от возраста насаждения, ростом, на уровне 20-40 си/год. Максимальные расчетные размеры клона для 120-летнего насаждения не превышают 35 ц.

Изучение изменчивости H.annosum, проведенное на изолятах из сосновых насаждений, позволило установить высокую степень внутривидовой одйородяости патогена на территории Украины - от Крыма' до Западного Полесья, о чем свидетельствуют отсутствие , среди изолятов морфологически обособленных рас, сходство по параметрам ковидиального спороношен'ия и уровню синтеза фитотокси-на фоманноксина.

Установлена зависимость уровня дереворазрутающей активности (ДРА) патогена от физиолого-биохимических особенностей расте-ния-хсзяина, обусловленных экологическими условиями места произрастания. .

Впервые установлена способность сосновых изолятов H.annoeua продуцировать фитоюксин фоианноксин. Разработана оригинальная методика количественного определения фоманнокоина, изучена изменчивость H.annosum по уровню синтеза этого метаболита.

Теоретической новизной обладают сведения о связи пигментации чистых «ультур о гетерокариотичеоким статусом мицелия. Установлено, что около 1/3 конидий, продуцируемых H.annosua гетеро-кариогачны, что указывает на потенциальную способность отдель-вых таких конидий вызывать заболевание растения-хозяина.

Разработана классификация мешицелвальных взаимодействий кулыур различного геветеского статуса in vitro » позволяющая выявлять индивидуумы локальных популяций (клоны), определять генетический статус моноспоровых изолятов и тип скрещивания гомокарконов.

Практическая ценность работы. Представления об инфекционной биологии н.апиовит , полученные в ходе полевых и лабораторных исследований учтены при разработке "Рекомендаций по профилактике массового поражения культур сосны корневой губкой" (Харьков, 1988). <

В практическом отношении важный являются новые данные о пространственной организации мицелиальной инфекции в очагах болезни. Возможность количественно оценить клоновое разнообразие патогена в пораженных насаждениях позволяет оудить об эффективности инфекционной нагрузки на насаждение, что характеризует степень устойчивости насаждения к болезни.

Данные о росте очагов-прогалин за счет вовлечения в патогенез новых клонов Н.авповша свидетельствует об исключительной значении индивидуальной устойчивости деревьев, расположенных по периферии очагов.

Впервые приводимые данные о размерах и скорости роста клонов является основой для моделирования процесса распространения инфекции Н.аппоаиа в сосновых насаждениях.

Наличие простых методик наработки, очистки в количественного определения фоманноксина позволяет рекомендовать.к использование способность н.аппоаиш синтезировать этот метаболит в качестве диагностического видового признака, а чистые препараты токсина - в исследованиях по устойчивости растений-хозяев к патогену.

Принципы и результата исследований по структуре локальных популяций могут послужить развитию популяционного направления Я биологии н.апповиш и других дереворазруиающих базидиомице-тов, а также будут полезны при составлении лекционных, курсов по микологии.

Апробация работы, Основные положепня и результаты диссертационной работа били представлены и доложены па научных конференциях: всеооюзных (Ыосква,-1987а, 19Э76, 1991; Петрозаводск, 1989), региональных (Минск, 1984; Каунао-Гирионио, 1986; Ивано-Франковск, 1990), молодых ученых и аспирантов (Каунас-Гирионис, 1965; Пушкино, 1989, 1990); на У съезде генетиков и селекционеров Украины (Киев, 1986) и 7 съезде Всесоюзного общества генетиков я селекционеров ( Москва, 1987),

Объем и структура работы. Введение, 5 глав и выводы изложены на 119 страницах иашинописи. Работа иллюстрирована 104 рисунками (д том числе 85 фотографий), таблицами и 10 приложениями. Список использованной литературы состоит из 261 наименования работ, в том числе 145 иностранных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Невысокая изменчивость Н.апповшя по ряду признаков свидетельствует об однородности патогена в пределах сосновой интерсгерильной группы на Украине и Белоруссии.

2. Очаги усыхания оосвы обыкновенной представляют собой локальные популяции н.аппоеиш , структурными субьединицами которых являются соматически несовместимые клоны.

•• 3» Скорость роста клопов H.annosum в насаждениях сосны обыкновенной лимитирована и не превышает 40 см/год; размеры клона пропорциональны его возраст.

4. Уровень клонового разнообразия патогена в пораженном насаждении определяется количеством восприимчивых tк заболеванию деревьев.

ССЙЕШАНИЕ РАБОТЫ.

I. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР.

Общие сведения о проблеме усыхания хвойных насаждений от корневой губки'( Heterobasldion armoeum (Pr. ) Bref, дают представление о глобальном характере проблемы, большом вкладе отечественных исследователей в ее решение.

Констатируется факт наличия как бесспорных так и противоречивых сведений об инфекционной биологии H.armoeum . Единого мнения о степени внутривидовой изменчивости н.аппоеиш также не выработано» одними она оценивается как незначительная (Roll-Haneea,1940( Olbba, 1Ô72) Dlmitri, 1982$ Raabe,1982 )> другими как очень высокая С Kaufaan,1970t Worrall, 1979; Не-груцкий и др., 1962, 1985; Авраменко, 1989; Тиунова, 1990).

Особое внимание уделено генетическим аспектам изменчивости Н.аппоеиш . Изложены представления о механизмах половой репродукции и регуляции мекмицелиальвых взаимодействий базидио-мицетов.

Перспективы Популяционного подхода к изучению н.ышоаит анализируются в контексте современных достижений в области ге-

нзтики грибов, в : ранках концепции внутривидового антагонизма дереворазрушающих гименоиицетов. Развитие исследований в этой направлении позволило открыть б интерстерильных групп H.annosum в Европе и Северной Америке ( Korhonen, 1978; Korhonen et al., 1989; chaeo et а,198э) « впервые получить данные о структуре локальных популяций Н.апповит в еловых ( Stenlid, 1985. 1907 ) и сосновых ( chase t/iirich, 19вз ) насаждениях.

2. МАТЕРИАЛЫ И ЬЕТОДй.

Материал для иссяедонаний'Яврбран, в основном, в чистых разновозрастных культурах сосны обыкновенной 1-1а бонитетов, созданных на яелееных землях в условиях свежей су бори (В2).

Список изолятов й.апповиш , непосредственно иопользозан-иых в работе, включает 203 гетерокарйона и 642 ионоспоровнх изолята базидиоспорового и конидиального происхождения» выделенных из сосновых насаждений Украины (Харьковская, Житоиирская, Ивано-^ранковская и Крымская области) и Беларуси (Минская, Брестская области).

Выделение отдельных базидиоспор и конидий проводили стеклянными изоляционными пипетками под микроскопом по ( Korhonen, Hintilctea , 1980).

Параметры конидиального спороношеиия определяли с помощью окуляр-иикроиетра U0B-I, Измеряли длину (а), ширину (в) конидий, ширину головки конидиеносца (Шкон ). Для конидий вычисляли индекс формы (GL» а/Ь ) и объем (0К), по "формуле

■■'V-TÍt-х Сал^}

Генетический отатуо мицелия определяли по наличию пряжек на гифах ( Korhonen ,1978), а также по характеру пигментации отараюцих (1,5-2 мео,) культур в результата« можмицелиальных взаимодействий на 2% оусло-агаре о тестерами известного геветн-ческого отатуса по разработанной нами.нетодике. Маркером гетеро-кариотмческого статуса мицелия, как показали ваши наблюдения, является его пигментация варьирующей интенсивности - от бледно-коричневого до темнокаштанового оттенков.

Скорость роста изолята определяли по диаметру колонии, измеренному на определенные сутки роста в чашках Петри на 1% сус-агаре при t «= I9-2I°C, Биомассу мицелия, выращенного в жидкой

культуре на среде Чапека с дрожжевым автолиза том определяли после сушки при 65°С до абсолютно сухого состояния.

Содержание аминного азота определяли в культуральных фильтратах IO-суточных культур, выращенных на жидкой среде Чапека с солодовым экстрактом, медным способом по (Белозерский, Проскуряков, 1951).

Дереворазрутаюшую активность (ДРА) изолятов определяли по потере веса образцов древесины за 100 суток опыта. Стерильные образцы сосновой древесины, размером 20 х 20 х 5 мм по 5 штук в 5-кратноВ повторноети помещали на поверхности Посуточных культур, развившихся на 2$ сусло-агаре в 0,5 л колбах Эрленмей-ра. .

Изменчивость н.мшотяа во уровне ДРА анализировалась в зависимости от происхождения изолятов и особенностей растения-хозяина. Опытные деревья характеризовались по высоте, диаметру ствола на уровне груди, смолистости древесины, луба и содержанию б нем водорастворимых фенолов, содержанию поздней древесины в стволах и опытных образцах. Категорию санитарного состояния деревьев определяли после раокошеи корневых систем на основании глазомерных, оценок степени их поражения и по методике (Усцкий, 1988), количественно описывающей степень поражения корней через соотношение сумм площадей сечения здоровых и пораженных корней.

Закономерности распространения инфекции в пораженных насаждениях определены по результатам изучения пространственной организации локальных популяций н.аапоаиа в очагах болезни на б стационарных пробинх площадях, заложенных в монокультурах соо-ны разного аозраота.

Индивидуумы локальных популяций идентифицировали двумя способами: I. по распределению аллелей фактора половой совместимости среди плодовых тел, устанавливаемому путем скрещивания моно-базидяоепоровых (ШО изолятов аналогичной Korhonen ,1978;

Holt et al. »1983) и'2. по тестам на соматическую совместимость гетерокариовов in vitro üo методике ( stenlid ,1985) в нашей модификации,

Аллельяув конотитуцив клонов по фактору половой совместимости устанавливали путем окревивания моиоконидиалышх (МК-) г-о-нокариовов^ »ыделеивых иэ гетерокариотических культур-тестеров клонов. Выявление МК-гомокарионов среди МК-изолятов проводили

ва основании характера пигментации (Мк-гэмокарионы всегда без пигмента, МК- гетерокарионы в большинстве случаев пигментированы), результатов скрещивания между собой, с родительским и неродственным гетерокарионами. Процедура определения генетического статуса МК-изолятов является оригинальной методической разработкой. В эти* экспериментах использовано 576 МК-изолятов от 50 гетерокарионов. На соматическую совместимость протестировано 175 гетерокарионов.

Качественное и количественное определение фоманноксина, фи-тотоксина н.аппоеиш , проводили по методикам ( НваПп 0t а1. 1983) ,частично модифицированных нами, Изоляты культивировали на жидкой среде Чапека о 10^-дрожневым автолизатои, Фильтраты 10-, 20- и 30-суточных культур экстрагировали чиошм хлороформом (СЯС13). Количественно растворенный экстракт фракционировали методом тонкослойной хроматография яа пластинках "зи«Го1" . Отдельные фракции экстракта элюировали метанолом (МеОН) и спектро-фотометрировали в ультрафиолетовом диапазоне 200-350 нм. фракция с нг» 0,5 в СНС1„ и У Ъ-Спехтрои в ИеСИ о Нй йи-* ла идентифицирована как фшанноксин методом масс-спектрометрии.

Количественное определение фоманноксина проводили методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе "Ыилихром" по калибровочной кривой. По уровню синтеза фоианноксина охарактеризовано 57 гетека-рионов. Результаты экспериментов обработаны методами вариационной статистики по (Лакин, 1900; Зайцев, 1984). Дискриминантный, кластерный анализы результатов иикроморфомёгрии о вычислением о расстояний Махалаиобиса, Т2 - критерия Хоттелйнга, Р -критерия ЗСишера, Л- критериев гомогенности поцуляций Ыэлса С Ио1а , 1987) проведены на мини - ЭВМ СМ-1600 под руководстве»! я любезном содействии к.с.-х.н., М.Ю.Попкова.

3. ИЗМЕНЧИВОСТЬ Н. АНВОЗим

ТелеоЦорфа и анаморфа. Высокая вариабельность формы и размеров плодовых тел обусловлена экологическими микроусловиями мест их формирования. Норма вида проявляется в уоловиях достаточного увлажнения, независимо от географического происхождения плодового тела, К наиболее распространенному из необычных иор-фотипов относятся плодовые тела, встречающиеся только на корневых шейках сухостойных деревьев сосны, покрытые сверху белой

(сероватой) тканью, иногда с редкий "островками" коричневой Корки и обширными участками зачаточно?! (не.спорулирупцей) гкме-ниальной ткани. По консистенций они напоминает вспененный пенопласт, не "боятся" открытого солнечного света; специфична склонность к одновременному попарному развитию плодовых тел симметрично оси ствола хозяина.

Культуральные признаки в стадии анаморфы варьируют в за-, висииости от генетического, статуса, длительности нахождения изо-лята . in vitro (возраста) и состава питательной среды. Морфологическое разнообразие культур, нередко наблюдаемое в 1-2 пас-сажал, впоследствие сглаживается. Весь спектр культурального разнообразия гетерокарионов можно наблюдать среди изолятов из ограниченного по площади участка насаждения (хронический очаг, выдел. Кулыуральные особенности более 200 гетерокарионов свидетельствуют об отсутствии среди них морфологически обособленных рас патогена. Морфологические отклонения от нормы вследствие деградации гетерокариотических культур часто обратимы. Моноко-нидиальное потомство гетерокарионов расщепляется на 2 морфоти-~~ па: I. родительский (гетерокариотический) с пигментированным, красновато-коричневым мицелием и 2. непигментированный (гомока-риотический 6 большинстве случаев, внешне сходный о монобазиди-оспорэвыми изолятами. Специфическая особенность гомокарионов -высокая вероятность необратимой деградации культур я меньшая жизнеспособность по сравнению о гетерокариовами. Максимальный срок сохранений жизнеспособности гетерокарионов - 4,5 года (25f сусло-агар, t -4°С), для гомокарионов , как правило, -9-12 месяцев.

Микроморфрметрия кояидиального спороношения гетерокариотических изолятов проведена с целью определения степени внутривидовой однородности н.сшповиа я возможности дифференциаций изолятов на основании микроскопических признаков. Измерено около 1900 конидий я 900 конидкевосцев 23 изолятов. *

Все изоляты были представлены гомогенными по J~ -критерию Мзлса выборкамя измерений ( о£ > 0,05). Среди корреляционных ' зависимостей между параметрами конидиального спороношения выделяются: I. почти функциональная связь между длиной и шириной конидий С г »0,8В) и обратная зависимость объема конидий от величины головки конидиенс.сца ( * « -0,55» »0,70 при£^ « 2,67 >2). '

Сравнительный анализ результатов измерений» проведенный о помощью методов многомерной статистики, позволил установить высокое сходство таких географически удаленных популяций Н.аппоаит как Харьковская', Белорусская и Крымская ( э2 - расстояние Маха-ланобиса не превышает 0,51), В сторону достоверно меньших значений от них отличаются изоляты Иитомирской популяции ( о^-.рассто-яние между ними 8,43), Данные свидетельствуют о возможности дискриминации сосновой и еловой форм н.аадовиа на основании микроскопических признаков (таблица I).

' " Таблица I

Многомерное статистическое сравнение популяций н.аапоаит по 5-ти параметрам конидиального спороношения гетерокариолов (а,- в, 0. ? Ок - для конидий; Ш - для конидиеносца).

Популяция : ж : ■Б ; к 1 .и

л 0,77^ 0,13 0,51 2,83

27,86* 2,68 15,64 34,29я

Я 0,04 2,20 8,43

10,18 47,77й 87,23*

Б 0,51 4,05

6,07 29,62*

К 2,69

26,45я

Примечания: 1-) Верхний показатель - величина в 2 -рассгоя-

ния Махаланобиса; нижний - Б - критерий

Фишера; •

2)- - различия достоверны (Р=0,01)

Изменчивость зл тзЛго в зависимости от возраста изолятов.

Двойственный тип питания !1.аппозиа(паразитический и спро-трофный) позволяет предположить возможность дифференциации иэо-лятоз разной степени паразитизме (патогенности) по физиолого-бйохимическш показателям. В качестве модели варьирующей степени паразитизма пами использовапы изоляты разных сроков культивирования 1п уДЛга. Известно, что при длительной культивировании на искусственных средах фитопатэгены эволюционируют к сапро-

трофному типу питания. Исходя из этого положения, ваий изучена изменчивость изолятов двух возрастных категорий: "молодые" (менее б месяцев in vitro ) и "старые" (I год и более in vitro). Исследования, проведенные па 30 изолятах (14 молодых и 16 старых), показали (таблица 2), что линейная скорость роста на 2$ сусло-агаре несколько выше у старых изолятов; отставание в линейном росте молодые изоляты компенсируют более высоким уровнем накопления биомассы мицелия. По мере старения несколько возрастает -устойчивость изолятов к фунгициду беномил. Возраст изолятов не сказывается на уровне дереворазрушающей активности. Самые значительные различия отмечены по содержанию аминного азота в .культуральных фильтратах,. По-видимому, этот, показатель Т8С-ггее всего связан со степенью патогенпостп H.aanosum .

Таблица 2

Сравнение язолягов н.апяоашп двух возрастнь'х категорий по физиолого-биохимическш'показателям.

"показатель Сед, измерения ) :^окц1у|йшроваНИя ^ ^

Рост па сусло-агаре:

- без добавок (мм/сут) 8,7 9,3

- с витамином Bj- в конц.

0,3 иг/л (£ от контроля) 96,5 81,2

- с фунгицидом беномил в

конц. 25 мг/л (# от контроля) 8,1 б,б

Биомасса мицелия

в жидкой культуре (иг/30 суток) 618,2 402,8 Дереворазрушаюцая активность

(весовый £) 15,5 15,3 Содержание аминного азота

в культуральных фильтратах •>

(мг/10 Мл срзды) 0,125* 0,164й

й - различия достоверны, Р к 0,01

Дьвеворазрупающая активность (ДРА) гетерокарионов варьирует в диапазоне 7,2 * 23,8$ при среднем значении 15,и не зависит от происхождения и возраста изолята.

Таблица 4.

Распределение моноспороЕЫх гомокарионов по типам скрещивания и аллельная конституция(по фактору несовместимости) плодовых тел н.аппоаиш

Плодовое тело

Тип скрещивания гомокарионов

Всего гомо-: Аллели картонов ; фактора

;несовместимос-

: тип I ? ■ тип 2 |ти

Й1 1,5,6,8,9,10 2,3,4,7 8 А1А2

Я2 1,2,5,7 3,4,6 7 -

Ю 1.4,5,6,10 2,3,7,8 ю А1 ь

№ ■ 1.3,4,7 2 ¡,5,6,8 8 hb

Й5 1,2,3,5,8 М*?,9 ' 9 4h

86 1,5,6,8,9,10 2,3,4,7 10 . AI% ,

!¥Г 1.3 б A9AI0

№ 1.2.5,7 3,4,6,8 8 A9AI0

Идептификация индивидуумов популяций с помощью тестов на. соматическую совместимость гетерокарионов.

Мекмицелиалькае взаимодействия гзтерокарионов K»annoatsja регулируются механизмбм соматической (вегетативной) совшстгмоо-ти ( stenlid ,1985),

Надеяность критерия соматической совместимости ждя идентификации индивидуумов популяций оценена по результата« спаривания гетерокарионов патогена разного происхождения - от географически удаленных до выделенных из одного субстрата. Установлено, что соматическая несовместимость гетерокарионов in vitro , независимо от их происхождения, спровождается развитием реакционной зоны по границе взаимодействия в виде просвета между колониями. Совместимые гететокарионц при взаимодействии сливаются, формируя объединенный мицзлйальяый газон.

Клоновое разнообразие '.. ri« annonua - количество соматически несовместимых клонов на участке насаждения - было оценено по совместимости 16 гетерокарионов из 13 очагов усаханпя в ЗО-лет-нем насаждении (участок 1Л. Еитриирокоя обл., Левковское я«во,

пдоща дь сбора - 1,5 га) и в группе изолятов из 50 гетерокарионов, изолированных дз плодовых тел и древесных субстратов в 70-летнем насаждении (участок СК, Харьковская обл., Скрипаевское л-во) площадь сбора - 850 м2). На участке И выявлены 14, на учзстке СК - 18 клонов патогена, Зрагмент участка с компактным размещением клонов показан на рисунке I.

Рис. I. Клоновая структура локальной популяции н.аппоеиш на опытном участке в насаждении сосны обыкновенной УП класса возраста (Харьковская обл., Скрипаевский л-з, кв. 105).

Обозначения: о, ® - живое и сухостойное деревья, & пень. Римскими ци'^рами обозначены клони/ арабскими изоляты -СК -'серии.

Взаимное расположение и размеры клонов отражают динамику v развития этой локальной популяции: первоначально в насаждение

клон I, через определенное время деревья, расположенные {^периферии возникшего очаГз усыхания колонизированы остальными 9 кронами. Линейные размеры клона» определенные через мак-. симальное\расстояние между крайними точками выделения совместимых изолятс'в на участке СК- , не превысили 21 ц. Максимальное расстояние lf.eW деревьями, пораженными клоном УП, составило 70 м. Несоответствие между размерами клона УП и уровнем вегетативного роста большинства клонов объясняется механичгскш пере-' носом мицелия клон2 Л1 вдоль противопожарной минерализованной полосы при ежегодном 'рыхления-. " .

Для поникания механизма развития очага болезни и процесса становления структуры локальной популяции принципиально, важным является вопрос о ' с те пзки "сходства клонов по алла лям фактора несовместимости. В отсутствий гомокарионов базидиосйорового "происхождения аллели несовместимости можно выявить путем, скрещивания мококонидиальпых (ШС-)гомокариб8йв ( Korhonen , 1978)„ Для определения аллельной консти^'чяи клопа необходимо:. . I. установить генетический статус монокоеЗДй^ь1151* потом-

ков гетерокариона, преде тавляющзго клон; 2. ерздй них

тесте'рные ШС-гомокаряонн и скрестить их, апалогичноГУс^Д^Р40"' нам монобазидиоейоровым.

Генетический статус МК-изолятов определяли на основании морфологических признаков чистых культур и результатов иекмице-лиалышх взаимодействий с родительским, неродственным гзтерока-рионами и с МК-изолятами внутри ятамма. Гетерокариотччнботь пигментированных МЯ-изолятов подтверждена их способность.?» ».образованию плодовых тел in vitro ., наличием у большинства яз них пряжек на гифах, В таблице 5 приведены результаты анализа МК-по-томства 3-х серий изолятов, различающихся сроками наделения и пребывания in vitro . <

Процедура определения генетического статуса МК-изолятов базируется на признаках, приведенных в таблице 6,

Таблица 5.

Распределение моноконидиального потомства гетерокариовов Н.ытовиа по морфологическим типам.

Серия : всего : Морфологический тип монококидиаль- '.Дс&я пиг-

изоля-; гетеро- . ного изолята (шт.)_:&ентирован~

тов : карир- " .'пигментирован- -без пиг- : псргп 'них МК-изо-

: нов :ный (гетерокар.).мента : и1,С10

1Л

СК . Другие

13

30 7

^гетерокар.

45 106 12

86 275 52

131 /

381-'

У6Ч

' ;лятов, %

34.4 27,8 18.8

Итого: 50

163

413

576

28,3

Характеристика моноконидиальных изолятов Н.аппоаит разного генетаческого' статуса.

Ыояок ол ь ны% изолят

Таблица 6.

п^Гокарион

гетерокарнон

кет

здоиомение всегда отсутствует

3.

есть почти всегда, встречаемость варьирует

в жидкой культуре через 3-6 иес., на 2% сусло-агаре очень ред-

.■'•'■-.■ ко

ЫешИцелиальные взаимодействия на сусло-агаре

а) с родитель- гетерокариотизация, полная идентичность ским гетерока- с пигментацией зо- колоний

риоксм кы взаимодействия

б) о неродст- соматическая совмес- реакция соматической венным гетеро- тимость, гетерокари- несовместимости (.про-карионом отизация чаще не про- свет между колониями;

исходит .

в) с гоиокари- I. подовая несовие- поведение ашлогкчно оном стимость при идеи- родительскому гетеро-

тичности аллелей кариону типа скрещивания или

2. половая совместимость - при разных.

Цзльвур конотиттшп ояределяли путем скрещивания

~~^гомокарионов. Учет результатов проведен на основа-|тагмеитация взаимодействующих культур. АЛЛели не-^пределенн у 8 гетерокарионов, представляющих кло-ца и у II гетерокарионов с второго участия, "Г, соседние о ним хлона П,Ш,Х,Х1 - ХУ и°уда-" I» 90 м (клон УП).

Гторн'ни r^SL не ВЫЯВЛеНН В пер2Ш случае и Ко втором: поЩ^ 0хояной аллзлй (А12> У Высокая степень клЖ®°Г0 разнообРалия' подтверя-РГзом аллельной кояститудаЯ^В1®етеЛ1Ствует з незави-*схождении клонов, ' .

5. ОСОБЕННОСТИ Ш®ШОННОЗ ЕИОЛОГ^

.Закономерности пространственного расп^зделения ив$екции в

больном насаядении изучала, осйовнваясь на ШЗИШ1И?ая анализ?

структура локальных популяций» изложенных вншст

В пораженных H.annosum насаждениях сосны 1111015 Еа

4-х участках былисобравн данные о клонах патогена. HaSj** Из яих сбор плодовых гея ограничивался площадью очага-прэгалитГ^ оча~ ги 1Л1-3) { площадь сбора на участка ЛЙ включала как здоровыеГ так ирораяенные участки леса.

По тестам на соматическую совместимость среда 75 гетерокарионов выявлено 32 клона патогена.Распределение клонов по участ -кам отражено в таблице 8, .

Кленовое разнообразие н.ытовив в возрасте 12 лет f участок 4) варьировало в диапазоне'56*83 ®г./га. По-вйдииоыу верхним пределом этого показателя являются данные по очагу Я1 ( 32-летнее насаждение) - 55.6 ат./га.

Ровно Половина клонов колонизируют 2 и больяе корневых систем, что позволяет достаточно полво охарактеризовать размеры клонов. Преимущественно вытянутаяу вб$етенэвИдная форма клонов об легчает определение их линейных.размеров, что позволило уотаво -вить диапазон варьирования.признака - от 1,2 до 19,0м.

Один ион колонизирует от 1-2 до 6-7 корневых систем растения-хозяина. '

Рост клонов оценигала за.период'"возраст насаждения минус 20 лот", т.к. достоверно известно, что в 1971-72 г.г. на этих участках оформившихся очагов-прогалин не было', отмечалось лишь единичное усы::ание деревьев. Точкой отсчета начала роста клона

!

\

Таблица 7.

Некоторые количественные характеристики локальных популяций н.аппо.аш» на опытных участках (очаги 3№ 1-4) в (монокультурах сосны обыкновенной-(Хито&шрский ЛХ9, Вогунское лесничество^%ь?вартал 85) .

Очаг *1

пт. шт)/выде-шт.)

2,

Плошадь ( г , мг)

найдено плодовых - тел ( н лево гетерокарионов к

■ Количество клонов на участке (и Плотность размещения:

I) плодовых тел (б/н цт; мс/гг.) ¿) клонов (э/ л к; м2/шт.)

На I га насаждения:

1) плодовых тел

2) клонов

Отношение: количество гетерокарионов/ко-личесуэо клонов 1,7

108

.13 10

8,3

18

1204 556

Очаг яг

232

16 13

7

14,5 33

690 302

1,9

Очаг ЯЗ

240

-12 13

5

18,5 48

542 206

2.6^

Очаг * 4

аекция 5: секция 7: в целом

15 7

56.5

1060 .25'

24 7

1908

40 39

14

47,7 136

о »

- 2f -

считали его геометрический центр. При таком подходе, расчетная скорсть роста клонов составила 5-39 см/год, при среднем значении 18 см/год.

Поскольку Фактический возраст клонов не известен, ценным показателем является величина отношения линейных размеров клона к количеству колонизированных им деревьев. Средние tío участкам значения этого показателя составили: 1,1 ( очаг Л1), 2.2 (очаг . яг ); 2,6 ( очаг Jf3); 2,0 < очаг JM, секц.5); 2,2 ( очаг Я4, секц.7). Незначительные колебания показателя на одновозрастных. участках ( 42-летних ) насаждений1 С Я2-м) свидетельствуют о равномерности роста клонов я позволяет считать линейные размеры клона пропорциональными его возрасту." .

Из вышеизложенного следует, что уровень клопового разнообразия патогена в насаждениях одного возраста при одяваковой величине инфекционной нагрузки завися* от количества восприимчи -вых к заболевавио деревьев.

Не претендуя на окончательность вынесенных зашяеняй, отметим, что реализованный подход гг изученав вазнейаах* otopoa инфекционной природы патогена перспективен и требует дальнейшего раа-вития.

1итотоксия фомаявркоин Методами УЯ-.Ш- и масо-епекгромет-рии в .кулыуральных фильтратах сосновых язоляточ ндейтифяцярован фомайноксян - саняЛ токсичный из Известных {атотокскческих метаболитов н.апяоеиэ , рапео обкаругзпныЗ у еловых изогягов (Hirota-ni ,1977; Heelln et al. ¿1983),

Величина Rf в чистом хлороформе на пластинах ТСХ равна 0.42, имеет 2 пика максимума помовевия в УФ-диапазоне 220-350. ни.

На 30-е сутки роста тжидксй культуре иа среде Чапека о 10$-дрожжевм! автолизами содержание фомаяноксина достигает 56,7^ от отвеса хлороформе иного экстракта кулыуральвой яидкости.

Установлено, что урэве^бввтеза ^маниоксина кв зависит от возраста изолята я.апповш» и источника его выде левея, БРгруп-пе из 44 изолятов 3-х категорий возраста in Yltro ( 1;2 и более б лет) при межгрупповом сравнепия достоверных различий по ур-вно синтеза фоманнокоипа нё выявлений; то же наблсдал я при сравнении этих изолятэв по исгбчяикам вьдедейия (плодолне тела, древесина, кора сосан). В интервале варьирования сосновых «эолитов Харьковской области ( 70 4 665 мкг/IOO мл среды ) находятся

значения продуктивности изолятов КрМ I (сосна, Крым) и И© 2 (ель, Ивано-Фсанксвская обл.)

вывода

1. Морфолого-кульгуральные признаки H.annosum в стадии анаморфы варьирует в зависимости от генетического статуса изодя-та и длительности культивирования lo vitro ; Бесь спектр морфологического* разнообразия можно наблюдать среди изолятов из ограниченного по площади участка соснового насаждения (очаг, выдел); культуральные особенности гетерокарионов разноч^происхож-дения свидетельствуют об отсутствии морфологически обособленных рас патогена .

2. Пигментация мипрлия, независимо от ее интенсивности и площади пигментированного участка, является морфологическим маркером гетерокаряотического статуса; на основании этой закономерности ус тановлево, что около 1/3 моноконидиальних изолятов, полученных из гетерокарионов, имеют гетерэкариэтический статус.

3„ Результаты иикроморфометрии конидиального спорношения свидетельствуют о высоком сходотве сосновых изолятов из таких удаленных друг от друга популяций как Харьковская, Белорусская и Крымская; на основании микроскопических признаков возможна дискриминация сосновой и еловой разновидностей патогена.

Сравнительное изучение физиолого-биохимических особенностей швгшовш» необходимо проводить на нзолятах одного возраста in vitro j молодые лзолягы С .до 6 мес, in vitro ) по срав-нению(сс[старыми ( I год inviiroR Золее) характеризуются достоверно меньшим содержанием аминного азота в культуральных фильтратах, в бреднем меьией окороотью роста на агаровых пластинках и большей биомаооой мицелия, накаленного в жидкой культуре; де-реворазрувающая активность от возраста вззлята не зависит.

5, Сосновыэ изэлята патогена продуцируют фитотоксический метаболит фомавнокеян, уровень его синтеза не зависит от субстрата выделения и возраста изолята; вариабельность по продуктивности токсина ва индивидуальном.» популяционном уровнях сопоставимы.

6. Тест кз соматическую совместимость гетерокарионов is vitro является удобным и производительный методом идентификации индивидуумов локальных'популяций Я,wmoeua. . насаждениях

•7. Очаги усыхания сосны в пораженных н.атовйй^ТфЬпггавля-

ют собой локальные популяции. патогена структурными единицами которых являются соматически несовместимые {мицелиальные клоны; вероятность повторного выделения клона из субстратов, , удаленных друг от друга более, чем на 20 м, стремится к йулю.

0. Клони H.armoBun а сосновых йасаждениях характеризуются равномерным, независимо от возраста насаадения, лимитированным ростом, уровень которого не Превышает 40 см/год.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Мокрицкий В.А. Де-реворазрупаюшая активность й некоторые физиологические показатели гриба Foaitopsie агшова (Pr. )Karst. в чистой кулыуре.// Матер, per. .яауч,-произв. конф. Белоруссии и Прибалтийских республик "Современные проблемы лесозащиты и пути их решения". 13-15 сент. 1984 г. - Минск,1985.

.2. Мокрицкий В.А. Акторы,; влияющие на дереворазрушающую . .активность гриба корневая Губка (Poaitopsis апйоаа (рг.) Karat// Тез докл. науч.- техн. "Молодые ученые - лесному хозяйству" 27-28 авг. 1985 г. - Каунао - Гириэнис, 1985. - С.53.

3. Мокрицкий В.А. Изучение генетического разнообразия и. структуры популяций Fomito'psia annoea (корневая губка) методом скрещивания гомокарионов.'//Тез. докл. У съезда генетиков и селекционеров Украина, - Киев, ISG^ - Ч.4.- С.05.

4. Мокрицкий З.А. Изменчивость корпевоа губки" in vitro

и возможнооть прогноза 'болезни на ее основе. // Тез. докл. науч.-практ; совеш. Прибалтийских респ. и :Белоруссии "Пути ускорения научно-технического прогресса / Секция I: Интегрированная защита леса от вредителей и болезней". 26-27 июня 1986г..- Каунас - Ги-рионис, 1986. - 217-219; '

5. Грицайчук В.В., Мокрицкий В.А. Изучение внутривидовой однородности PomitopslEr annooa (Fr.) Karst, // Тез. ДОКЛ. У съезда Бсесоюзн, ,;об-ва генетиков и селекционеров. - Ч,,1987. -С. 117, ■■.;■"'••■■ . ■

6. Мокрицкий В.А., Аданвн В.М,,Выделение и идентификация Фоманяоксина, Фитотоксина гриба корневая гуйка. // Тез, докл. Всесоюэн. науч,-практ. конф, "Достиже кия науки и передового опыта зашиты леса от вредителей и болезней"* 24-26 нояб, 1987г., Пушкино. - М., 1987. - C.I20-I2I, '

7. Усцкий И.М., Ладейкюссва Е.Й., Мокрицкий В.А. Особенности развития очагов корневой губки. // Тез. докл. Всесоюзн. науч.-

техн, конф. "Охрана лесных экосистем и рациональное использование лесных ресурсов / Секция li 8ащита леса и охрана живой природы", 20-22, охт. IS87r. - «., 1987. - С.63-64.

6. Усщсий й^М„ Мокрицкий В,А, Повреждение в регенерация корней сосен в очагах корневой хубки, // Тез. докл. 1 Всеооюзн. конф. "Проблемы'Физиологии и биохимии древесных растений" 7-8 февр. 1989г. - Петрозаводск, 1989. - С.251-253.

9. Цокрицкий В.А. Определение типа скрещивания монокониди-альных гомэкарионов tftterobaaldton апповда (Fr.)Bref. по пигоентаодв про^двых гетеровдриЬнов, // Матер XI нау,- техн. конф. иалэдих ученых и аспирантов БНИИШ1, 25-.27 окт, 1988г., Пушкино, -. «,,1969. С.25-27.

10. Ыохрицкий В.А. Клоны корневой губки ( Heterobasidion annoeuB ) в очагах усыхавия сосны обыкновенной. // ТЬэ.докд. Всесоюзн. науч.-практ. конф. молодых ученых, аспирантов и специ-... алистов отдела "Совершенствование ваучвого обеспечения лесохо-зяйственног» производства", 15-17 охт. 1990т,, Пушкино. - М., 1990,- С. 135.

П.Уоцький I.U., Слободян Я.Ц,, ЦогрицькийВ.О, Зактори, що впливаюп на розвиток вогнищ коренево1 губки.// Тез, доп. Респ. наук.«техн. конф. "Система ведения л1сового государства в г1рських умовах Карпат", 23-25 травня 1990р. - 1вано-Зран -к1вськ, Î990. - 0,302-303 (укр. яз.),

12. Мокрицкий В.А. Популяционный подход к изучению инфекционной биологии Beterobaeiûion дашовиа (Рт.) Bref, (корневая губка).// ТЬз. докл. 2-ой Всеоовзн, науч.-техн. конф,

" Охрана лесных экосистем и рациональное использование лесных ресурсов". - 4.1. - U..I99I., - СД57-156,

13. Усцкий I.U.,.Попков Ы.С., Ыокрицький В.О, Д1агностика стану в воишиах кореневоГ губки,// Л1с1вн*цтво I агрол1сомел1-орац!я. - Ки. Урожай, 1991, - вип.вг. - 6с, (укр.яз., в печати).