Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование взаимодействия между бактериальными ФМН-редуктазой и люциферазой

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мажуль, Михаил Михайлович, Москва

АЛ « U и - Ч / Я%М - А

/ ■ .J J I J 1 и ь- .

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

МШЛЬ МИХАИЛ МИХАЙЛОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАЖОДЕЙСТВИЯ ЩЗДУ ВАКТЕРИАШШИ ФМНРЕДУКТАЗОЙ И ЛЮЦИФЕРАЗОЙ

(03.00.Cf? шшробиология}

Диссертация на соисказис .ученой стопсни гганздцата бнологичс сних наук

Научный рукоЕодятель д.б.п., проф. ДАНИЛОВ B.C.

МОСКВА - 1999

- 2 -СОДЕРЖАНИЕ

стр.

вваднш.................... 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. БИОЛОГИЯ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ БАКТЕРИЙ

1.1. Общие полжения, таксономия» физиология................8

1.2. Рост и развитие культуры лшинесцентных бактерий..* 12

1.3. Потребность в кислороде и энергетика............... 13

2. ЛЮЮШЕСЦЕТНАЯ СИСТЕМА СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ

2.1. Субстраты лвдиферазной реакции, ее квантовый

выход.............................................. 15

2.2. Применяемые способы измерения активности лвдиферазы......................................... 18

2.3. Строение фермента...........................................21

2.4 Стадии лвдиферазной реакции, ее интермедиаты

и пути их превращения............................... 24

2.5. Гены и генная организация lux оперонов лшинесцентных бактерий............................ 29

2.6. Электроннотранснортные цепи лшинесцентных

бактерий..........................*......................31

2.7. FMN-редуктаза (NAD(Р)Н:?1Ю-оксидоредуктаза)........ 34

2.8. Комнлексообразование меяеду PMN-редуктазой

и лвдиферазой...................................... 38

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3. МАТЕРИАЛЫ.

3.1. Состав среда и условия роста люминесцентных

бактерий.......................................................................41

3.2. Зависимость свечения бактерий от стадий роста..........42

1.3. Состав среда и условия роста не люмине сцируицих бактерий............................................................................42

3.4. Реактивы ....................................................................................42

4. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Измерение активности ферментов

а) Лнщефераза......................................................43

б) FMN-редуктаза...................................44

в) NADH:цитохром с-оксидороедуктаза..............................45

4.2. Электрофорез в ПААГ .........................................45

4.3. Нахождение изоэлектрической точки..................................46

4.4. Определение молекулярной массы ферментов....................46

4.5. ОЕфвделение белка ..................................................................47

4.6. Измерение спектров биолюминесценции.........................47

5. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ

5.1. Получение бактериальной сульфатаммонийной пасты... 47

5.2. Выделение FMN-редуктазы из V./iscfierí ..........................48

5.3. Очистка люциферазы из V.fischeri ....................................54

5.4. Выделение FMN-редуктазы из В.coli ................................56

5.5. Выделение обоих ферментов из рекомбинантного

штамма Ж.coli JM109 (рРЗ) ..................................................56

- 4 -

6.СВОЙСТВА FMN-РЕДУКТАЗ

6.1. Свойства PMN-редуктазы из V.fisciwri ............................59

6.2. Свойства PMN-рвдуктазы из Ж.coli ................................?о

7. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЖЩИФЕРАЗЫ И МШ-ИЭДУКТАЗЫ

7.1. Ферменты из Y.fiacheri ........................................................75

7.2. Ферменты из V.lwrveyt и Р.phosphorеш............................89

7.3. Лщифераза из E.coli JM109(pF3) с генами lux AB________99

7.4. Ферменты из E.coli JM109, E.coli «Ш109(рРЗ)

и V.fischerl..............................................100

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.............105

ВЫВОДЫ........................115

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

116

- 5 -ВВЕДЕНИЕ

Люминесцентные бактерии открыты в 1875 году Щшюгером, а к 1900 году число описанных видов достигло двадцати, и с тех пор интерес к ним не ослабевает. Люминесцентные бактерии являются группой прокариот, функционально объединяемой способностью излучать видимый невооруженным глазом свет. Распространены они повсеместно. Среди них есть почвенные, пресноводные и морские виды. Экологические ниши, занимаемые морскими люминесцентными бактериями, отличаются особенным разнообразием: есть свободноживущие виды, виды, паразитирующие на морских ракообразных, комменсалы, обитающие в пищеварительном тракте морских рыб и беспозвоночных, и, наконец, симбиотические виды, живущие в специальных световых органах глубоководных рыб и кальмаров

Бактериальная биолюминесценция - это окислительный процесс, сопровождаемый потреблением кислорода. Функционирование люминесцентной системы как альтернативного дыханию потока электронов признется большинством исследователей (Nealson, Hastings, 1979, Hasnings et al., 1985, Nealson, 1993). Обычно они рассматривают биолюминесцентную систему как ответвление от дыхательной электроннотранспортной цепи на уровне восстановленного флавина или восстановленных шфидиннуклеотидов, которые могут, благодаря наличию фермента FMN-редуктазы, участвовать в восстановлении флавина, являющегося одним из субстратов бактериальной люциферзы. Однако до последнего времени сведения о PMN-редуктазе из люминесцентных бактерий недостаточны и противоречивы, но еще меньше их, как ни парадоксально, о PMN-редуктазе из нелюминесцентных бактерий. Очень мало изучена и

возможность котлексообразования между люциферазой и PtóN-редуктазой. Поэтому разрешение этих вопросов являются весьма актуальными.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось получение новых данных о возможности и механизме взаимодействия бактериальной люциферазы о РШ-редуктазами как из светящихся бактерий, так и из бактерий, не обладающей таким свойством. Задачи нашей работы были следующими:

1. Разработка метода выделения высокоочищенной FMN-редуктазы (NAD (Р )н: PtóN-оксидоредуктазы) из морской люминесцентной бактерии Vibrio fischerí и Escherichia coli.

2. Характеристика свойств мш-редуктазы из V.fischerí и В.coli, и выяснение характера взаимодействия фермента с сбстратами.

3. Исследование взаимодействия двух ферментов: бактериальной люциферазы и РШ-редуктазы из Vibrio fischerí.

4. Выяснение возможности взаимодействие двух ферментов бактериальной люциферазы и РШ-редуктазы, выделенных из люминесцентных бактерий Vibrio fischerí, Vibrio harveyí и Ptvotobacterim phosphoremr цутем образования активного комплекса между этими ферментамии в различных сочетаниях.

5. исследование взаимодействия между люциферазой, выделенной из Vibrio fischerí 6 и из рекомбинантного штамма Escherichia coli JM109(рРЗ), с клонированными в нем генами 1ш AB Vibrio fischeríг с РШ-редуктазой, шделенной из штамма Escherichia coli JM109.

Научная новизна работы. Получен высокоочищенный препарат РШ-редуктазы. Определены молекулярная масса фермента, его кинетические константы, порядок присоединения субстратов,

взаимодействие с различными акцепторами и ингибиторами, изоэлектрическая точка, оптимум рН, термоустойчивость.

Своими опытами мы впервые показали очень большое (до 100-кратного) стимулирующее действие PMN-редуктазы на реакцию бактериальной люциферазы вследствие образования фермент-ферментного комплекса и определили константу равновесия образовавшегося комплекса. При этом исследования показывают отсутствие изменений как в спектрах эмиссии, так и в константе скорости затухания биолюминесценции.

Практическое значение работы. Практическую значимость имеют сформулированные в работе новые принципы образования фермент-ферментного комплекса между люциферазой и редуктазами, которые, помимо несомненного научного интереса, помогут создать оптимальные бинарные системы для проведения биолюмине сцентного тестирования различных веществ с очень высокой чувствительностью к этим соединениям.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены на Всесоюзной научной школе "Биолюминесценция и хемилюминесцентный анализ" (Краснорярск, 1985), VII съезде ВМО (Алма-Ата, 1985), конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990).

- 8 -ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. БИОЛОГИЯ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ БАКТЕРИЙ 1.1. Общие полжения, таксономия, физиология

Излучать свет свойственно всем живым организмам. По своей природе это свечение является биохемилюмине сценцией. Биолюминесценция, в отличие от биохемилюминесценции, являясь по существу той же хемилюминесценцией, характерна тем, что ее интенсивность на несколько порядков выше и может наблюдаться невооруженным глазом.

Биолюминесценция свойственна небольшому числу организмов, таксономическое положение которых весьма разнообразно: способностью светиться обладают бактерии, грибы, моллюски, кишечнополостные, оболочники, кольчатые черви, динофлагелляты, ракообразные, насекомые, рыбы (Сборн. под ред. Кондратьевой 1984; Harvey, 1952). Главными отличиями биолюминесценции являются наличие у светящихся организмов особой ферментативной системы и высокий квантовый выход реакций, который может превышать 0,1.

Долгое время таксономия люминесцентных бактерий претерпевала постоянные изменения. Ее история изложена в работах (Reichelt, Bauman, 1973, Nealson, Hastings, 1979, Baumann et al., 1980, 1981, Примакова, 1984). Современная систематика этих бактерий, учитывающая данные молекулярно-филогенетических исследований (гомологии ДНК, последовательностей 5S рРНК или I6S рРНК, содержания Г-Ц пар в ДНК, а также иммунологических сравнительных характеристик специфических ферментов (Nearhos, Fuerst, 1987, 1987,Ehlers et al., 1988)), в основном согласуется

с более ранними результатами, полученными посредством нумерической таксономии. В своем обзоре Нильсон и Гастингс высказывают предположение о том, что экология, физиология и эволюция люминесцентных бактерий близко связаны с их ассоциацией с эукариотическими хозяевами (Nealson, Hastings, 1992)

В настоящее время все люминесцентные бактерии отнесены к 4 родам: Vibrio и Phntobacterivm (сем. Vibrionaceae), Alteromonas (4 секция - грам-отрицательные аэробные палочки и кокки) и Xenorhabdus (сем. Enterobacter iacecue) (Baumann, Baumann, 1984; Baumann et al., 1984a,b; Farmer, 1984). Кроме описанного недавно (Jensen et al., 1980) Alteromoms hanedai, являющегося облигатным аэробом, все виды люминесцентных бактерий являются факультативными анаэробами, способными расти в интервале температур от +4°С до +35°С на глюкозе, фруктозе, маннозе, галактозе, глицерине. Представляют собой грамотрицательные подвижные палочки с одним или несколькими полярно расположенными жгутиками.

Подавляющее большинство видов люминесцентных бактерий является морскими обитателями и проявляет специфическую потребность в высокой концентрации ионов натрия в среде для поддержания жизнедеятельности. Все морские виды продуцируют экзохитиназу (Nealson, Hastings, 1979). Распространены они практически повсеместно от тропических до полярных широт, однако встречаются они преимущественно в прибрежных акваториях, лагунах заливах, отдельно живущие клетки не люминесцируют. Однако попадая на подходящий субстрат и образуя колонии, они начинают люминесцировать.

Экологические ниши, занимаемые люминесцентными бактериями, отличаются разнообразием: есть виды, ведущие свободный образ

жизни, вида, паразитирующие на морских ракообразных, кошенсалы, обитающие в пищеварительном тракте морских рыб m беспозвоночных» и» наконец, симбиотические виды, живущие в специальных световых органах глубоководных рыб И кальмаров (Harvey, 1952; Nealson, Has t ings, 1979 ). Единственный наземный вид, т.е. местообитание которого не вода и не водные животные, Xenorhdbdus lumlnescens, ныне Photorhdbûus lumineacem (Boemare et al., 1993), является специфическим симбионтом энтомопатогенных нематод сем. Heterorhabditlûae (Thomas, Poinar, 1979). Основные вида люминесцентных и близких к ним нелюминесцентных бактерий можно свести в следующую таблицу I

Основные вида люминесцентных и близких к ним нелюминесцентных -, бактерий (Nealson, Hastings, 1979)

ВИДЫ Рода Люминесцентные вида Нелюминесцентные вида

Морские Fhotobacterium P. phosphorеш

P.leiognathi

Vibrio V.fiacheri V.angustm

Vtftarveyi V.algtnolitica

V.logei V.pardhamolittca

V.splendida V .angîullarta

V.natriegens

V.ca&ibelli

7. vuinlflea

V.nereida

V.pelagia,

(прдолжение таблицы I)

Виды Рода Люминесцентные виды Нелюмине сцентные вида

Неморские Vibrio Fhotorhabdua Y.choleras albensis P. luminescens Y.choleras el-tor P.nematophilus

Люминесцентные бактерии, относящиеся к различным видам, испускают свет в сине-зеленой области спектра с Ä.ffiax=472-505 нм (Cline, Hastings, 1974; Seliger, MoBlroy, 1965). Кроме того, один из штаммов V.ftscheri у-1 (Ruby, Nealson, 1977) испускает свет с максимумом при 545 нм и плечом при 500 нм. Наиболее яркие штаммы способны излучать свет с интенсивностью 103-104 квант/сек в расчете на клетку (Hastings, Nealson, 1977). Показано, что энергия испускаемая одной клеткой в виде светового излучения составляет величину порядка 5х10-10 мкДж в пересчете на I см2 поверхности клетки за I сек при 510 нм (Harvey, 1952). Таким образом светящаяся бактериальная клетка являетя самым миниатюрным известным источником света.

Установлен®), что изменение различных факторов, таких как температура, pH, солевой состав - не влияют на спектральные характеристики люминесценции, однако могут повлиять на ее интенсивность (iymers, van Sohoevenburg, 1936). Показано, что наблюдаемый изотопный аффект также мало зависит от длины альдегидной цепи и величины pH в пределах 6-9 (Fransisoo et al., 1998).

- 12 -

1.2. Рост и развитие культуры люминесцентных бактерий.

В процессе роста и развития, при периодическом культивировании, культура люминесцентных бактерий проходит ряд стадий, характерных для развития любых бактериальных культур: лаг-период, период экспоненциального роста, период замедленного роста, стационарный период и период отмирания. Общая продолжительность процесса от инокуляции до максимальной величины свечения (10) составляет 8-20 часов, длительность его зависит от вида бактерий и от условий их выращивания, причем динамика интенсивности люминесценции не совпадает с динамикой роста клеток. Пик люминесценции приходится на середину экспоненциальной фазы роста.

Феномен ускоренного нарастания свечения получил название аутоиндукции, а вещество, благодаря которому она происходит -аутоицдуктора (Nealson et al., 1970, Nealson et al., 1977). Предполагается, что это вещество продуцируется клетками и выделяется в среду При накоплении его до определенной концентрации, начинается процесс интенсивного синтеза лщиферазы, собственно и обеспечивающий свечение бактериальных клеток. Аутоиндуктор был выделен и идентифицирован как N- (З-оксогексаноил) -З-амшогидро-2- (ЗН) - фуранон. Определена пороговая концентрация аутоиндуктора в 10~12М. Будучи синтезированным in vitro, это вещество индуцировало биосинтез лщиферазы V. fiscTwrt, но было неактивным в отношении других видов бактерий (Eberhard et al., 1981). Синтез аутоиндуктора блокируется ингибиторами синтеза белка и мРНК. Показано, что аутоиндуктор действует на уровне транскрипции, т.е. наяву индукция синтеза люциферазы (Hastings, Nealson, 1977). В настоящее время у этого объекта обнаружен и другой аутоиндуктор

— N-3-оксогексаноил-ь-гомосерш лактон, который также активирует транскрипцию генов люминесценции (Ulitzur, Dunlap, 1995).

Синтез люциферазы зависит не только от его иадукции, но и от репрессии. Так синтез люминесцентной системы V.Tuarveyi подвержен катаболической репрессии. Глюкоза репрессирует синтез лвдиферазы, а цАМФ снимает эту рецессию (Nealson et al., 1972). Из V.harveyi выделен цАМФ-связывающий белок и показано, что он тедунологически гомологичен белку из E.goU и из некоторых других энтеробактерий.

В связи с этим интересны факты синтеза другого участника люминесцентной системы бактерий - мш-редуктазы, ответственной за синтез восстановленного флавина in vivo. До сих пор не показана ивдуцибельность синтеза РШ-редуктазы. Считается, что все изученные к настоящему времени FMN-редуктазы из различных видов люминесцентных бактерий являются конститутивными ферментами (Gerlo, Charlier, 1975; Watanabe et al., 1975).

1.3. Потребность в кислороде и энергетика

Хотя все морские люминесцентные бактерии - факультативные анаэробы, для роста им необходим кислород, дефицит которого является лимитирующим рост фактором. По влиянию концентрации кислорода на рост и люминесценцию выделяют две группы бактерий: у первой группы, куда относятся У. fi scher i и Р. ¡Яюзрюгеш^ снижение концентрации ведет к замедлению роста, хотя интенсивность свечения может даже возрастать (Nealson et al., 1977). Предполагается, что это связано с высоким сродством люциферазы у этих штаммов к кислороду (Hastings, 1968)

- 14 -

У другой группы, куда входят 7. barveyi и Р. letognathi, снижение концентрации кислорода приводит не только к замедлению роста, но и к ингибированию синтеза лщиферазы. Предполагается, что это отражает различие в среде обитания данных видов (Hastinga et al., 1966).

Потребление кислорода растущей культурой возрастает в фазе замедленного роста на три порядка, причем практически весь этот прирост расходуется на люминесценцию (Karl, Nealson, 1980, Высоцкий, 1980). Считается, что ?. barveyi расходует на люминесценцию до 20% кислорода, потребляемого клеткой, тогда как количественное содержание лщиферазы составляет около 5% всех белков клетки (Hastings, 1965).

Рассматривались энергетические затраты на люминесценцию: у очень ярких штаммов на свечение расходуется до 10% от всей энергии, выделяемой клеткой, для нормальных штаммов - только 0,1% (Karl, Nealson, 1980).

И, наконец, кратко охарактеризуем те виды люминесцентных бактерий, которые мы использовали при проведении экспериментов. Клетки V.fischeri содержат желтый пигмент и имеют форму палочки П мкм) с пучком жгутиков. Характерной особенностью Р.phosphorеж является спосбность расти при 4°С, а при 25°С рост их уже тормозится. V.barveyi - прямые или изогнутые палочки 0,5-0,8 мкм шириной и 1,4-2,6 мкм длиной, не образуют эндоспор или микроцист, в