Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование устойчивости дегидратированных эритрогцитов к действию осмотического и механического стресса
ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование устойчивости дегидратированных эритрогцитов к действию осмотического и механического стресса"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОІЕДЩКНИ

¡'5 од

На правах рукопису

о

ПАНТАЛЕР Олена Револьдіїзна

ДОСЛІДЖЕНІ!Я СТІЙКОСТІ ДЕИДРАТОВАНИХ ЕРИТРОЦИТІВ ДО ДІЇ ССЇОТЙЧШГО ТА МЕХАНІЧНОГО СТРЕСУ

03.00.22 - кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на 'здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Харків - 1996

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріоме-дицігаи Національної Академії наук України -

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор В.А.БОНДАРЕНКО

Офіційні опоненти: '

доктор біологічних наук є.0.ГОРДІЄНКО

доктор біологічних наук Є.Е.ПЕРСЬКИЙ

Провідна установа: Харківський Державний університет

ім.О.М.Горького (Кафедра молекулярної і прикладної біофізики)

Захист відбудеться "%/)" р_ 0 /3 ?0годині

на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 50.21.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України (310015, м.Харків, вул.Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інститута проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України

Автореферат розіслано

"/Ь_" сл’і-Ш ідд£ р.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради, доктор медичних наук, професор

А.М.ГОЛЬЦЕВ

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Хоча існує значний об’єм експериментальних даних, які стосуються вивчення механізмів холодового пошкодження біооб’єктів, зараз багато аспектів проблеми кріо-пошкоджень залишаються недостатньо ясними. Це стосується, насамперед, механізмів зв’язку стійкості клітини до дії фізи-ко-хімічних факторів кріоконсервування (всув температури, осмо-лярності, рН) зі змінами її макроскопічних характеристик (об'єм, форма, деформуємість) в умовах дегідратації. Відомо, що початкові значення цих характеристик, котрі контролюються початковіші-! умовами, в яких знаходиться клітина, мають суттєвий вплив на її поведінку при наступних змінах параметрів середовища.

Так, початкова часткова дегідратація, що проводиться при

0 °С, суттєво підвищує стійкість клітин до гіперосмотичного стресу у висококонцентрованих розчинах солей (Поздняков, 1989). Останнє дозволяє говорити про наявність у клітині певних струк^ турних резервів, які здатні забезпечити її високу стійкість до дії пресового фактору при оптимальній траєкторії клітинної системи у просторі значень параметрів середовища, що змінюються.

Існуючи дані вказують, що у механізми підвищену структурної стійкості в умовах часткової дегідратації залучені процеси, що охоплюють як цитоскелет, так і плазматичну мембрану.

Під час значного зсуву осмолярності та температури середовища в мембранах клітин народжуються дефекти, подальший розвиток яких здатний призвести до формування гемолітичної пори.. До ряду засобів, що здатні вплинути на процес зародження, розмір та час життя трансмембранної пори, можна віднести фармакологіч-

ні препарати (Lieber, 1984), двухваиентні йони (Bashford, 1988) та ін. Інформація про характер їх дії дозволила б зробити певні висновки і' відносно механізму формування пори. Така інформація також необхідна для обгрунтування засобів спрямованої регуляції стану клітин при використанні комплексних впливів, у ' яких застосовується дегідратація поряд з іншими факторами, щр здатні забезпечити більш високу стійкість клітин в умовах, далеких від фізіологічної норми. '

Мета дослідження. Вивчення взаємозв’язку між початковими осмотичними умовами, у яких знаходилися еритроцити, та їх реакцією на наступну дегідратацію і регідратацію, а також на дію факторів, здатних модифікувати макроскопічну структуру клітин (дія деформуючого фактора) та їх плазматичну мембрану (обробка амфіфільними сполуками). .

Задачі дослідження. Для досягнення мети були поставленні такі задачі: ‘

- вивчити вплив початкового ступеню дегідратації у розчи-

нах NaCl та сахарози на стійкість еритроцитів до гіпертонічного та постгіпертонічного стресу; •

- вивчити динамічну деформуємість еритроцитів в залежності від ступеня їх дегідратації у гіпертонічному середовищі, температури, а також після обробки глюкозою;

- еивчити вплив хлорпромазину на стійкість дегідратованих еритроцитів до гіпертонічного стресу при переносі в 4.0 М NaCl у температурному інтервалі 0-40 °С;

- вивчити вплив початкового ступеня дегідратації еритроцитів на структурну стабільність плазматичної мембрани при дії амфіфільних сполук (на прикладі хлорпромазина).

• Наукова новизна. У роботі показано, що при дегідратації еритроцитів час деформування клітин при втягуванні у мікропи-петку та характерні терміни як гіпертонічного кренірування так

і наступної релаксації форми клітин при додаванні сироваткового альбуміну експоненціально зростають з підвищенням концентрації КаОІ у середсЕищі. Виявлено, що динамічну жорсткість еритроцитів може бути знижено у результаті початкового нзсичешм клітин глюкозою.

Досліджено еплив температури на динаміку розвитку гіпе-росмотичного лізису еритроцитів при перенесенні клітин у 4.0 М МаСІ е залежності від ступеня їх початкової дегідратації. Виявлено особливості на арреніусовських залежностях швидкості та тривалості лаг-фази лізису (8-10 °С та 17-20 °С) та оцінена енергія активації процесу у температурному інтервалі 10-40 °С (40 кДж/моль для клітин, перенесених у 4.0 М НаСІ з фізіологічного розчину).

Виявлено ефект блокування гіперосмотичного лізису еритроцитів хлорпромазином у концентрації б.бхІО-5 М. Цей ефект залежить від температури та умов початкової дегідратації клітин і реалізується безпосередньо в момент зміни осмотичних умов при перенесенні клітин в 4.0 М МаСІ.

Теоретичне значення. Проведені дослідження дозволили доповнити уявлення про клітину в умовах дегідратації роллю такого фактора як цитоматрикс, основним компонентом якого є щільно упаковані (у обезводненій клітині) глобули гемоглобіну, що здатні проникати у білкову решітку, яка утворює мембранний скелет.

Обгрунтовано роль розклинюючого тиску тонких плівок роз-

чинника, який оточує білкові глобули, як фактора, що визначає неідеальність осмотичного стискування еритроцитів.

Розширено уявлення про роль катіонних амфіпатичних сполук як фактора, здатного модифікувати осмотичну та температурну чутливість клітин. Одержані експериментальні дані про особливості впливу катіонних амфіпатів на стійкість еритроцитів до гіперосмотичного стресу, які дозволяють розглядати як критичний етап гіперосмотичного пошкодження клітин фазу утворення трансмембранної пори.

Практичне значення роботи полягав у розробці нових методів направленої корекції осмотичної чутливості еритроцитів за допомогою катіонних амфіпатичних сполук, що прояєляють максимальну ефективність як фактор, який захищає клітини від лізису при зміні осмотичних умов середовища. ■

Положення, що виносяться на захист.

1. Характер температурної залежності рівня лізису та кінетичні« параметрів гіперосмотчного шоку частково дегідратованих еритроцитів вказує на існування комплексного механізму осмотичної чутливості клітин, що включав зміни асоціації компонентів мембрани один з одним, а також з білками цитоскелета.

2. Осмотична стійкість еритроцитів контролюється, принаймні, двома механізмами. Загальний механізм пов’язаний з генералізо-ваними змінами цитоскелета та плазматичної мембрани у початкових умовах і контролює стійкість клітин до наступних змін умов оточення. Локальний механізм пов'язаний з зародженням та еволюцією трансмембранної пори при дії осмотичного стресу і реалізується безпосередньо у момент зміни осмотичних умов середовища.

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на Всесоюзній конференції "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов" (Мінськ, 1988), II Міжнародній конференції "Успехи современной криобиологии" (Харків,1992), VI Українському біохімічному з’їздГ.(Київ,1992), І з'їзді Українського біофізичного товариства (Київ,1994), 31-му та 32-му з'їздах това-

риства кріобіологів (Японія, 1994: СІЛА, 1995), І з'їзді Українського товариства кріобіології і кріомедицини (Харків,1995).

Публікації матеріалів досліджень. За метеріалами дисертації у відкритій печаті опубліковано 16 робіт.

06'бм та структура роботи. Дисертація викладена на 137 стор. машинописного тексту, складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів, глави власних досліджень та їх обговорювання, містить 43 малюнка та 3 таблиці. Список використованої літератури включає 190 робіт. '

МАТЕРІАЛИ ТА НЕГОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ.

Об’єктом дослідження були еритроцити донорської крові, тричі відмиті фізіологічним розчином (0.15 М МаСІ, 0.01 М фосфатний буфер, рН-7.4).

Дегідратацію еритроцитів здійснювали , змішуючи у співвідношені 1:10 аліквот відмитих упакованих еритроцитів з розчинами ЫаС1 або сахарози з різнім осмотичним тиском (1300-2000 мос-моль/кг). .

У експерт,іентах, які присвячені дослідженню постгіперто-нічного лізису еритроцитів, клітини інкубували потрібний час (1-30 хв.) у розчинах з різним вмістом сахарози при 37 °С і потім переносили у ізотонічні розчини НаСІ (0.15 М), холін-хлори-

ду (0.15 М) або сахарози (0.2? М).

Гіпертонічний шок еритроцитів здійснювали шляхом переносу рівних аліквот контрольних або початково модифікованих клітин у розчини 4.0 М МаСІ.'

Для дослідження структурної стабільності плазматичної мембрани дегідратованих еритроцитів при дії амфіфільних сполук клітини помішали у відповідні розчини МаСІ, які містили катіонний амфіпат хлорпромазин (ЗхЮ-4 та 4х10-4 М, відповідна).

Для вимірювання рівня гемолізу еритроцити висаджували центрифугуванням на протязі 5 хвилин при 1500 є. Кількість вийшовшого у розчин гемоглобіну визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 543 нм.

Рівень гемолізу як функцію часу визначали шляхом реєстрації змін у часі оптичної густини суспензії еритроцитів на дое-жині хвилі 720 нм при розходженні світлового пучка ±1.5° на установці, розробленій та атестованій е ІПКіК НАН України. При цьому кінетичні параметри лізису еритроцитів визначали таким чином: а) максимальна швидкість лізису (Ущах) - по максимальному нахилу дотичної до кривої, яка описує зміни у часі оптичної густини суспензії у процесі лізису клітин;

б) лаг-період розвитку лізису (ідаг) - по відстані на шкалі часу від моменту поміщення клітин у середовище, де відбувається лізис, до крапки перегину кінетичної кривої.

Динаміку зміни форми еритроцитів досліджували розробленим у роботах (Дегтярев,1988) спектрофотометричним способом реєстрації індексу "дискоїдності". Спосіб оснований на вираженій кореляції між ступенем сферичності клітин, яка звичайно виражається у вигляді морфологічного індексу (Гапака,1981), та індек-

сом "дискоїдності" K, що виражається відношенням розмаху флуктуацій оптичної густини (шириною "шумової" доріжки) до середньої по часу оптичної густини суспензії на довжині хвилі 720 нм. Показник К дає усереднену по популяції кількісну міру сферичності клітин у кожний момент часу. У паралельних експериментах конролювали особливості трансформації форми клітин при різних стресових впливах методами оптичної мікроскопії.

Початкова швидкість і характеристичний час встановлення нового рівня оптичної густини при дії на клітини,яка змінює їх форму, трактувалися як кінетичні параметри трансформації форми еритроцитів v0 і t , відповідно. .

Об'єм еритроцитів та динаміка його зміни реєструвалися методом спектроскопії.імпульсів опору (CIO), який розвинуто у роботах (Akeson, Mel, 1982).

Осмотичний тиск середоЕшд виміряли осмометром 0МКА-1Ц-01.

Ступінь осмотичного стискування еритроцитів у розчинах, що містили гіпертонічні концентрації хлориду натрію, визначали мікрогематокрітним методом.

Для вивчення деформуємості окремих еритроцитів було використано метод, аналогічний [Лерхе, 1986] з деякою модифікацією. Еритроцити втягували у скляну мікропіпетку конічної форми (діаметр вхідного отвору 3 мкм) під дією перепаду гідростатичного тиску 1-2 см водн.ст. У нашій модифікації методу реєструвалася не амплітуда, а тривалість імпульсу струма при прохожденні клітини через вхідний отвір капіляра, яка служила мірою динамічної деформуємості клітин.

Апроксимацію експериментальних кривих формулами, що містять лінійні параметри; проводили методом найменьших квадратів,

які містили нелінійні параметри - з використанням алгоритму нелінійної оптимізації з пакету PC-Matlab.

Статистичну обробку даних проводили по методу Стьюден-та-Фішера.

У роботі використовувалися хлорпромазин (ХПМ) та сироватковий альбумін людини (САЛ) фірми "Serva", реактиви вітчизняного виробництва кваліфікації "хч" та "чда".

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ.

Проведені дослідження показали, що осмотичне стискування еритроцитів у гіпертонічних розчинах приводить до дуже суттєвої зміни їх динамічної поведінки. При збільшенні концентрації NaCl у середовищі від 0.15 до 0.7 М час деформації клітин до повного втягування в мікропіпетку діаметром 3 мкм зростає більш чим на З порядки. При концентраціях NaCl у середовищі вище 0.4 М спостерігається сильніше, ніж у області 0.15-0.3 М, приблизно експоненціальне наростання часу деформування клітин із збільшенням концентрації солі (мал. 1А).

Попередня модифікація еритроцитів глюкозою при інкубації на протязі 2-х годин у фізіологічному розчині, якій містить 0.2 М глюкози, приводить до зміщення у бік більшої гіпертонії області концентрацій NaCl, яка відповідає експоненціальному зростанню часу деформації клітин. Зріст часу деформації еритроцитів при втягуванні в мікропіпетку був мірою зростання динамічної жорсткості еритроцитів шодо зсуву.

Динамічну згинну дефогмацію дегідратованих еритроцитів досліджували шляхом реєстрації зміни від часу оптичної густини клітинної суспензії та індексу "дискоїдності" клітин у

відповідь на дію, ідо викликає зміну форми (на прикладі додавання САЛ). Оцінені кінетичні параметри процесів гіпертонічного кренірування ( Ті) та зворотньої релаксації форми до дискоциту під впливом САЛ (ІЛ'о і ї2) • Як видно з мал.1 Б, при збільшенні концентрації NaCl у середовищі спостерігається експоненціальне зростання характеристичних термінів' обох процесій. Ступінь уповільнення процесів змінення форми еритроцитів можна вважати мірою збільшення в умовах дегідратації динамічної жорсткості клітин щодо згину.

Як відомо, еритроцити стискуються у гіпертонічних середовищах у меньшому ступеню, нім це може бути завбачено, виходячи з уявлення про ці клітини як про ідеальний осмометр, які враховують значний виключений об'єм, що зайнятті гемоглобіном (Solomon,1968,1986). При цьому зі збільшенням осмотичного тиску зовнішнього середовища з'являється та зростає різниця між осмотичним тиском електролітів, які сконцентрувалися у середині клітини, та осмолярністю зовнішнього середовшд.

У останньому десятиріччі розвинені уяви про розклинюючий тиск у тонких плівках розчинника між крупними макромолекулами або підвійними ліпідними шарами, які з'являються при їх зближуванні на малі відстані. Засновуючись на цих уявах, ми припустили, що вказана вище різниця обумовлена наявністю сил відштовхування гідратаційної природи поміж глобулами гемоглобіну та виникненням у наслідок цього об'ємної пружності білкової "решітки", яка заважає стисканню клітини. Вона може бути висловлена у вигляді "тиску решітки" формулою:

Мал.1. Вплив концентрації ЬІаСІ у середовищі на динамічну дефор-муємість еритроцитів.

А - час проходження еритроцитів скрізь вхідний отвір мікропі-петки, нормований на відповідний час для еритроцитів у фізіологічному розчині при 24 °С: температура 24 °С(1) та 5 °С(2). Б -кінетичні параметри процесу змінення форми еритроцитів (1), 1/*о (2), т2 (3). '

Мал.2. Розрахункова залежність "тиску решітки" від відстані між глобулами гемоглобіну. Пунктирна лінія

- результат апроксимації формулою (1). На вставці: час проходження еритроцитів скрізь вхідний отвір

МІКрОПІПЄТКИ.

Р^<М0СА\0ЛІ>/Кґ ТОО

600

Я00 ЗГаи*! /

• мосмолуіз-

7 10 13 <6 із уА

де у - середня відстань між глобулами гемоглобіну; Rc -радіус сфери, яка моделює глобулу; До - силовий множник; 5 - характерна довжина спадання сил відштовхування.

З експериментальної залежності об'єму еритроцитів від осмотичного тиску середовища були відраховані середні міжглобу-лярні відстані та відповідаюча їм нескомпенсована осмотично різниця осмотичних тисків поза- та внутрішньоклітинних електролітів (з урахуванням осмотичного внеску гемоглобіну). Як результат апроксимації поданої таким чином експериментальної залежності за допомогою формули (1) (пунктирна крива на мал.2) була одержана величина характерної довжини спадання сил

О

відштовхування 3.17 А. Близькі величини одержані у працях (Rand, Parsegian, 1986-92) при вимірюванні методом осмотичного стресу сил відштовхування при сближенні на відстані, менші 20-30 А, подвійних ліпідних шарів, а також таких макромолекул, як ДНК і деякі полісахариди. У рамках нашої моделі передбачена область осмотичних тисків середовища, де повинні проявитися ефекти структурування гемоглобінового цитоматриксз. Це завбачення узгоджується з результатами наших досліджень деформує-мссті дегідратованих еритроцитів (вставка мал.2).

Досліджено вплив початкового ступеня дегідратації еритроцитів на динаміку пошкодження клітин при гіперосмотично-му, постгіпертонічному та ХПМ-індукованому лізисі.

Вивчення динаміки змінення об’єму та форми еритроцитів, дегідратованих у гіпертонічних сахарозних середовищах і потім регідратованих у ізотонічних умовах показало, що пошкодження клітин при регідратації залежить як від часу інкубації у гіпертонічному середовищі, йсго тонічності та температури, так і від

складу регідрагуючого середовища (НаСІ, холін-хлорид або сахароза). Короткочасна (1 хв.) інкубація еритроцитів у гіпертонічних розчинах сахарози з концентрацією від 0.5 до 1.2 М не спричиняє суттєвої зміни форми та набухання клітин після регідратації. При збільшенні тривалості інкубації еритроцитів у дегідратованому стані до 15 хв. з’являється критичний рівень дегідратації у області 0.8-0.9 М сахарози, при перевищенні якого еритроцити сенсибілізуються до наступної регідратації в 0.15 М МаСІ. Це виражається у набуханні та лізисі клітин. При подальшому збільшенні тривалості інкубації (ЗО хв.) у дегідратую-чому середовищі ця критична межа зсувається у бік нижчих концентрацій сахарози (0.7 М) (мал.З). При цьому методом СЮ реєструються дві субпопуляції еритроцитів - клітини, які відновили овій об’єм до нормального ізотонічного, та клітини, які набухли та зазнають лізису. Об’єм еритроцитів набухшої популяції та кількість у ній клітин залежать від часу і ступеня дегідратації та від часу, що пройшов з моменту вміщення клітин у регід-ратуюче середовище. '

Існування критичної межі дегідратації, при переході через яку клітини сенсибілізуються до наступної зміни умов середовища, виявляється також при дослідженні динаміки гіпертонічного та ХПМ-індукованого лізису дегідратованих еритроцитів.

Як видно з мал.4, збільшення концентрації ИаСІ у середовищі передінкубації схожим чином впливає на кінетичні параметри лізису, що викликаний факторами різноманітної природи. Це виявляється V зростанні тривалості лаг-фази з наступним зниженням після досягнення концентрації ■ МаСІ понад 0.5 М і у зменшенні швидкості лізису з наступнім збільшенням при концентрації МаСІ

Мал.З. Залежність середнього відносного об’єму еритроцитів через 12 ХЕ. після ре-гідратації у фізіологічному розчині від концентрації сахарози у дегідратуючому се-Рєдоеищі. Час інкубації у сахарозному середовищі

15 хв. (1) і ЗО хе. (2).

0,4 о,

ці м

Сим,П

дг

С&а, М

Мал.4. Вплив концентрації ИаТІ у середовищі передінкубації на кінетичні параметри гіперосмотичного лізису у 4 М МаСІ (А,Б) та ХПМ-індукованого гемолізу еритроцитів.(В,Г) : А,В - лаг-період

розвитку лізису; Б,Г - максимальна швидкість лізису.

0.8-1.О М. При цьому ефект, що спостерігається, затримки гіпе-росмотичного гемолізу та зменшення його швидкості більш виявляється у випадку, коли вихідна дегідратація здійснюється при 0°С.

Важливо, що ліворуч від критичної межи дегідратації, розташованої на шкалі осмолярності у області 1100 мосмоль/кг, клітини, навпаки, нзбувають збільшену стійкість до дії стресових факторів.

Вивчено температурну залежність кінетичних параметрів гіперосмотичного лізису еритроцитів з метою оцінити енергію активації цього процесу та виявити особливості, що маються, щодо комбінованого вплиеу на нього температури і ступеня вихідної дегідратації клітин.

• Арреніусові залежності швидкості і лаг-періоду розвинення лізису еритроцитів у 4 М МаСІ мають особливість в області 17-20 °С, яка проявляється для першого параметра у вигляді розриву (мал. 5 А), а для другого - у вигляді зламу (мал.5 Б). Для клітин, що знаходилися спочатку у 0.15 М МаСІ, явно виявляється злам на арреніусовій залежності швидкості лізису поблизу 10 °С, тоді як у випадку початково дегідратованих клітин він відсут-ний. Ця особливість у області 10 °С відмічається також на арреніусовій залежності лаг-періоду розвинення лізису для контрольних еритроцитів (лаг-період зникає нижче 10 °С) та дегідратоЕа-них у 0.3 М МаСІ (зменшується при подальшому зниженні температури.) . ,

Виявлені особливості арреніусових залежностей кінетичних параметрів гіпертонічного лізису співпадають з відомими раніше особливостями температурних залежностей різних структурних і функціональних характеристик еритроцитів, які поєднують з тер-

мотропними структурними переходами еритроцитарних мембран. Вважається, що перший з них (17-20 °С) призводить до зміни лі-під-білкових взаємодій у площині мембрани (Wallach,1979), ay другий (8-10 °С) залучена зміна асоціації цитоскелет-мембрана за допомогою білка 4.1 (Minetti,1986).

Оцінена з температурної залежності швидкості лізису енергія активації гіпертонічного гемолізу еритроцитів, які перенесені у 4.0 М NaCl з фізіологічного розчину, склала 40 кДж/моль. Одержана величина близька до енергії активації латеральної дифузії у ліпідному матриксі еритроцитів 43-48 кДж/моль (Kapitsa,1982). Енергія активації латеральної рухливості інтегральних білків, що занурені у ліпідний матрикс, яка контролюється у нормі цитоскелетом, перевищує 100 кДж/моль (Peters, 1986). Це дозволяє виказати припущення, що швидкість-лімітуючою стадією у розвитку гіпертонічного гемолізу може бути формування ліпідної пори (яка, вирогідно, стабілізується білками) в області мембрани, що позбавлена підтримки цитоскелета.

Далі, ми припустили, що учинити вплив на формування, час життя та замикання народженої при стресі трансмембранної пори можуть амфіпатичні сполуки, які здатні швидко перерасподілятися у клітинну мембрану і змінювати рухомість її компонентів. Досліджено вплив катіонного амфіпату хлорпромазина на рівень гемолізу еритроцитів при перенесенні до 4.0 М NaCl у залежності від вихідних та кінцевих параметрів середовища при такій стресовій дії. Вихідними параметрами, що варіювалися, були склад (NaCl або сахароза), осмолярність (300-2000 мосмоль/к.г) і температура (0-40 °С) середовища передінкубації, кіні^еими - температура (0-40 °С) та концентрація ХПМ у стресувчому гіпертонічному се-

Мал. 5. Арреніусові залежності кінетичних параметрів гіперосмо-тичного лізису еритроцитів при переносі клітин у 4 М МаСІ після попередньої інкубації у середовищах 8 різни,! ЕМІСТОМ солі при 0 °С. А - максимальна швидкість лізису; Б - лаг-період розвитку лізису.

0,2. 0,6 і,0 0,2. О,Є і,О С^СІ,ІЇ

Мал. 6. Вплив ХПМ та концентрації ИаСІ у вихідному середовищі на рієень гемолізу еритроцитів при переносі у 4 М ИзСІ при різних комбінаціях температурних умов передінкубації та лізису: 0 - 0-°С (1), 0 - 35 °С (2), 35 - 35 °С (3). А - контроль;

Б - ХПМ, 6.6*1СҐ5 М.

редовищі. Крім того, застосовували два температурних режима попередньої дегідратації та наслідуючого гіпертонічного стресу:

1) дегідратація клітин при 0 °С та перенесення у 4 М МаСІ при рівних температурах, 2) ізотермічне перенесення у 4 М МаСІ при різних температурах.

Виявлено значний антигемолітігчний ефект ХПМ при його додаванні у концентраціях 5-7*10-5 М у лізуюче гіперосмотичне середовище до поміщення в нього клітин. Ефект ХПМ не залежить Бід складу середовища передінкубації і від присутності цієї сполуки на ранітих етапах експерименту - при інкубації у фізіологічному розчині чи в дегідратуючих середовищах. Останнє Еказує на те, що захисна дія ХПМ не є результатом попередньої модификації мембран еритроцитів, не зв’язано прямо з йшшвом амфіпату на регуляторні системи клітини, а реалізується безпосередньо у момент різкої зміни умов оточення.

У випадку помірної дегідратації (до 0.5 М МаСІ) ефект блокування гемолізу спостерігається, починаючи з 15 °С, зростає при подальшому звищенні температури лізуючего середовища і не залежить від температурного режиму початкової дегіратації (мал. 6 Б, криві 2,3). У випадку міцної дегідратації, відповідаючої переходу через критичну межу, яка згадувалася вище, значний захисний ефект ХПМ спостерігається тільки для клітин, дегідрато-ваних при 0 °С. При цьому підвищення температури стресуючого

середовища від 15 до 35 °С призводить до майже повного подавления гемолізу (мал. 6 Б, крива 3).

Аналіз одержаних результатів приводить до висновку, що особливості, які спостерігаються, щодо умов попередньої дегідратації, температури та .ХПМ на динаміку і ріЕень пошкодження

еритроцитів при гіперосмотичному стресі пов’язані з процесом формування трансмембранної пори. Цей процес слід вважати критичним етапом пошкодження клітин при температурному та осмотичному впливі. З’явлення стійкого стану при певній комбінації початкових параметрів середовища (мал. 4 та 6 А), очевидно, відображує різке зниження вирогідності зародження пори, що може бути обумовлено реорганізацією периферічних білків, які контро-лювть безперервність ліпідного бішару. У той ке час, ефект ХПМ на кінцевому етапі осмотичного Ешшву може бути обумовлений прямою дією амфіпату на пору, що формується, тобто є локальним ефектом. Пора, що фомується, є динамічним створенням і може замикатися при оптимальній комбінації параметрів початкового та кінцевого середовища.

ВИСНОВКИ

1. Досліджено вплив ступеня дегідратації клітин на динамічну зсувну та згинну деформуємість еритроцитів. Одержана експоненціальна залежність від концентрації МаСІ у середовищі часу деформації еритроцитів при входженні у мікропіпетку (у області концентрацій МаСІ 0.3-0.7 М) та характерного часу трансформації-ехіноцит-дискоцит (у області концентрацій ЫаС1 0.15-0.42 М). Насичення еритроцитів глюкозою приводить до зміщення у бік більшої гіпертонії області концентрацій МаСІ, яка відповідає експоненціальному наростанню часу деформації клітин.

2. Проведено моделювання цитоматриксу дєгідратованих еритроцитів щільною шаровою упаковкою гемоглобінових глобул, які оточені розклинюючою плівкою розчинника. У результаті апроксимації згідно моделі експериментальної залежності об’єму клітин від осмотичного тиску середовища одержана величина характерної

довжини спадання сил відштовхування 3.17 А. Останнє може свідчити про переважний вклад структурної складової розклинюючого тиску у межглобулярні взаємодії гемоглобіна як фактора, який визначає неідеальність осмотичного стискування еритроцитів.

3. Дослідження динаміки зміни об'єму та форми еритроцитіе при регідратації з гіпертонічних сачарозних розчинів показало, що існує критична межа ступеня дегідратації у сахарогному сере-довщі, до котрої втискування клітини є оборотнім. Вона залежить від часу інкубації у дегідратугачому середовищі та температури. Так, значне набухання та лізис клітин при регідратації спостерігаються після інкубації у розчинах, які містять більш 0.9 М сахарози на протязі 15 хвилин та більш 0.7 М - на протязі ЗО хвилин, при 37 °С.

4. Досліджено вплив початкового ступеню дегідратації на динаміку розвитку гіперосмотичного лізису та викликаного хлорпро-мазином гемолізу еритроцитів. Для обох типів лізису спостерігається зростання тривалості лаг-фази при збільшенні концентрації ИаСІ у початковому середовищі до 0.4-0.5 М з наступиш значним зниженням, а також зменшення швидкості лізису з невеликим підвищенням при досягненні концентрації МаСІ 1.0 М. Зниження температури початкової дегідратації до 0 °С посилює ефект затримки початку гемолізу та уповільнення лізису клітин при наступному переносі у 4.0 М МаСІ і збільшує кількість виживших клітин.

5. Виявлено особливості на арреніусовських залежностях кінетичних праметрів гіпертонічного гемолізу еритроцитів у 4.0 М МаСІ в області 8-10 °С та 17-20 °С, які співпадають з відомими особ-

лиеостями температурних залежностей різни;-; структурних та функціональних характеристик еритрощттів, що зумовлені термот-ропними структурними перехода,® у еритроцитарних мембранах.

5. Виявлено ефект блокування хлорпромазином (6.6х10-5М)гемолізу еритроцитів при гіперосмотичному шоці в 4.0 М NaCl, який залежить від ступеня початкової дегідратації клітин та температури, при котрій вона здійснюється, а також від температури, при якій клітина зазнає стрес. При оптимальній комбінації початкових (0 °С) і кінцевих (25-40 °С) температурних умов середовища досягається протектування клітин у всьому інтервалі початкових концентрацій МаСІ. При цьому дія хлорпромазина реалізується безпосередньо у момент різкої зміни осмотичних умов середовища. СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ.

1. Панталер Е.Р., Дегтярев A.B., Жутченко И.Л. Динамическая де-

формация одиночных эритроцитов в гипертонических средах// Теоретические и практические аспекты современной криобиологии/ Сб.науч.тр..-К.: Наук.думка, 1989.-С.6-9. .

2. Панталер E.Р..Дегтярев A.B., Бондаренко В.А. Взаимодействие

между глобулами гемоглобина гак фактор, контролирующий объем и

динамическую жесткость дегидратированных эрироцитов// Еиохими-

•і. .

ческие аспекты криоповреждения и криозащиты клеточных сис-тем/Сб.науч.тр.-Харьков, 1989.-С.19-25.

3. Поздняков В.В., Панталер Е.Р., Бондаренко В.А. Осморезистентность как принцип устойчивости к замораживанию//Физико-химические свойства и биологическое действие ..криопротекторов/Сб. науч.тр.-Харьков, 1990.-С.124-130.

4. Панталер Е.Р., -Руденко С.В. Влияние глюкозы на динамическую деформируемость одиночных эритроцитов в гипертонических,средах

//Холодовый анабиоз/Сб.науч.тр.-К.:Наук.думка, 1991.-С.42-46.

5. Дегтярев A.B., Пантапер Е.Р. Кинетика кренирования и ге-

молиза эритроцитов под действием ионофоров в изо- и гипертонических средах//Физико-химические процессы в криобиологических системах/Сб.науч.тр.-Харьков, 1991.-С.19-31. _

6. Дунаевская О.Н.. Панталер E.Р., Шпакова Н.М., Бондаренко В.А. Некоторые возможности повышения устойчивости эритроцитов к холодовому и гиперосмотическому воздействиям при использовании катионных амфипатов//Проблемы криобиологии.- 1995.- N 1.0.31-27.

7. ШпаковаН.М., Панталер Е.Р., Бондаренко'В.А. Антигемолити-ческий ' эффект хлорпромазина при гиперосмотическом и холодовом шоке эритроцитов//Биохимия.-1995.-60, N 10.-С.1624-1631.

8. Дегтярев A.B., Бондаренко В.А.. Семенченко А.Ю., Панталер Е.Р. Конформационная метастабильность цитоскелета эритроцитов и критические явления при холодовом шоке//Тез. Всесоюзн.конф. "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов".- Минск, 1988.-С.46.

9. Руденко С.В., Панталер Е.Р. Проблема регидратации при криоконсервировании клетки//Тез.докл. II Междунар.конф. "Успехи современной криобиологии".-Харьков, 1992.-С.156-157.

10. Панталер Е.Р., Дегтярев A.B. Механо-химические следствия дегидратации цитоматрикса эритроцитов в гипертонической среде//

Там же, С.137. ^

11. Шпакова Н.М., Панталер O.P. Інгібітори кальмодуліну та холо-V. довий шок еріїтроцитів//Тез.доп. VI Укр.біохім.з'їзду.-Київ, ' 1992.-Ч.1.-С.107.

12. Дунаєвська О.М., Панталер O.P., Шпакова Н.М. Можливості уп-

равління стійкістю еритроцитів до гіперосмотичного стресу: роль початкового стану клітин та катіонних амфіпатів//Тез.доп. І в’їзду Укр.біофіз.тое.-Київ, 1994.-С.93.

13. Панталер О.Р., ВоїноваМ.В., Шпачова Н.М. Вплив початкового ступеню дегідратації цитоматриксу та температури на кінетичні параметри гіперосмотичного лізису еритроцитів// Там же.-G.184-185.

14. Bondarenko V., Bondarenko T.,Shpakova М., Pesina N., Kudo-kotseva E., Pantaler E. Alternative principle of cryobiology: elaboration of cellular mechanisms of cold and osmotic stability//31-st Annual Meeting of Society for Cryobiology.-Kyoto, Japan, 1994.-P.27.

15. Bondarenko '/., Pantaler E., Shpakova N. et al. The formation and development of a transmembrane pore as a decisive event in the thermal and osmotic effect//32-nd Annual Meeting of' society for Cryobiology.-Madison, USA, 1995.-P2-54.

16. Панталер E.P., Шпакова Н.М., Бондаренко В.А. Температурная и фармакологическая коррекция эволюции трансмембранной поры в условиях гиперосмотического шока//Теэ доп. І в’їзду Укр.тов. кріобіології і кріомедицини.-Харків, 1995.-С. 191-193.

- Панталер Е.Р. "Исследование устойчивости дегидратированных эритроцитов к действию осмотического и механического стресса". Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22. - криобиология.

Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной Академии Наук Украины, Харьков, 1996.

Работа посвящена изучению взаимосвязи между исходным уров-

нем дегидратации эритроцитов и их реакции на последующий осмотический стресс, деформирующее воздействие и обработку амфи-фильными соединениями. Показано, что динамическая жесткость эритроцитов возрастает экспоненциально с увеличением осмотического давления внеклеточной среды и может быть снижена в результате предварительного насыщения клеток глюкозой. Обнаружены особенности аррениусовских зависимостей кинетических параметров гиперосмотического гемолиза в области 8-10 °С и 17-20 °С и оценена энергия активации этого процесса (40 кДж/моль). Обнаружен антигемолитический эффект хлорпромазина при гиперасмотическом шоке. Показано, что этот эффект зависит от температуры и условий исходной дегидратации клеток и реализуется непосредственно в момент резкого изменения осмотических условий среды.

Pantaler E.R. Study Of The Resistance Of Dehydrated Red Blood Cells To The Effect Of Osmotic And Mechanical Stress. Manuscript. Thesis for obtaining scientific degree of Candidate of Biological Sciences on the 03.00.22. speciality - cryobiol-gy. Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of the Ukraine, Kharkov, Ukraine, 1995. .

This work is devoted to the investigation of relationship between initial level of red blood cells dehydration and their response to following osmotic stress, deforming effect and treatment by amphiphilic compounds. It has been demonstrated that dynamic rigidity of red blood cells increases exponentially by the increase of osmotic pressure of extracellular medium and may be decreased as the result of

preliminary cell saturation by glucose. The peculiarities of Arrhenius dependences of kinetic parameters of hyperosmotic hemolysis in the region of 8-10 °С and 17-20 °С were revealed and this process activation energy (40 kJ/mol) was estimated. Antihemolytic effect of chlorpromazine at hyperosmotic shock was determined. It was shown that this effect depended on temperature and conditions of initial , cell dehydration and realized directly in the moment of sharp change in environmental osmotic

Ключові слова: еритроцит, деформуемість, гемоліз, осмотичний стрес, катіонні амфіпати. ,

Відповідальний за випуск акад. Н/.Н України В.!. ГРИЦЕНКО

Підписано до друку 25.ІІЛ5 р. Об'р.м йіз.п.л. 1,5, умов.л.І,5 Замовлення 47, тира’їг 100 прим. .

Ротапринт ФТІНТ НАН України, Харктв-164, пр. Леніна, 47