Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование транспорта Na+ и К+ через мембрану эритроцитов человека методом монометрии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование транспорта Na+ и К+ через мембрану эритроцитов человека методом монометрии"

РГ6 ОД Hl'1! КлЯ ЛИЛДЬ 1,11 МЕДИЦИНСКИ/ .НАУК

i ;д?ч|Чо'йсопгЖн:/XHJi^CK^Wcfn'ïv'r"

.Л I Л? I 1 í. f ' Г.-1 Е H 1 .Vio! ÍOÉ M Í; Д111.11-1 H Ы

Iii) Прс<ВНЛ I >Y KOI Ilten

БОРИСОВ Юрий Лма гольевич

ИССЛЕДОВАНИЕ TP AI [СПОРТА Na* и К* ЧЕРЕЗ

МЕМБРАНУ ЭР И ! РОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ МОНОМЕ Í РИ',1.

СО О'.) 0-1 - Eli'.: >мм1п

А з т о р е ф е р а т

Лиг-огтаци',! г.? соисьочио умоиои С1«|1'?МИ I'.' П1/',!'Л""-Ч медицинских наук

Озим-Петербург 1995

Работа выполнена на кафедре биохимии Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им.акад. И.П.Павлова МЗ РФ (ректор - академик МАН ВШ, профессор Н.А.Яицкий).

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор И.Г.Щербак

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, А.Д.Денисенко

доктор биологических наук, Л.В.Щагина

Ведущая организация: Физиологический институт им.А.А.Ухтомского Санкт-Петербургского Государственного университета

Защита диссертации состоится "_"_ 1995 г.

в_часов на заседании Диссертационного совета (К 001.23.01)

при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул.Акад.Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул.Акад.Павлова, 12.

Автореферат разослан "_"_1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

О.Г.Куликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ v

_________АКТУАЛЬНОСТЬ" ПРОБЛЕМЫ В самое последнее время значительно возросло

количество научных работ, прямо или косвенно связанных с оценкой функционального состояния биологических мембран Строгая согласованность работы всех мембранных механизмов - рецепторных, канальных, ферментативных - дает возможность клетке поддерживать свой гомеостаз, сохранять свою целостность и одновременно обеспечивает эффективный и адекватный ответ на возникающие дискомфортные состояния, вызванные изменением работы других систем клетки и организма [А.М.Кобаль и др., 1990].

Многолетними исследованиями было показано, что функциональная активность вне- и внутриклеточных ферментов, биоэнергетика клеток напрямую коррелируют с интенсивностью работы мембранных систем активного транспорта Особое внимание исследователей и в теоретическом, и в прикладном аспектах привлекает работа ионтранспортирующих систем, интегрированных в клеточные мембраны Первенство здесь принадлежит Na'.K'-АТФазе, изучение функционирования которой представляет самостоятельный интерес. Накоплено большое количество данных о функционировании этого фермента при различной патологии (Swarts et al, 1981, Tosteson, 1981; De Luise, Flier, 1982. Canessa, 1984; Постнов, Орлов, 1987, Trevisan et al , 1988; Масюк А И и др, 1989 и т д ) Оценить работу Na'.K'-АТФазы можно, определяя как гидролиз АТФ (определение собственно активности фермента), так и интенсивность транспорта натрия и калия (определение насосной функции).

Исходя из представления о компартментализации пространства внутри самой мембраны, следует предположить, что не вся энергия, высвобождающаяся при гидролизе АТФ этим ферментом, используется для трансмембранного переноса ионов Na* и К.* Поэтому мы попытались оценить его работу вторым из вышеперечисленных способов - по реальной насосной функции, не нарушая целостности клетки и приблизив условия эксперимента к существующим in vivo, использовав в качестве основного мет од ионометрии.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Главной целью была оценка ионтранспортирующей функции Ма'.К'-АТФазы эритроцитов человека при различных физико-химических и биологических параметрах среды инкубации. Для ее достижения были поставлены следующие основные задачи:

- изучение возможности применения метода ионометрии для оценки транспорта ионов Na* и К* через мембраны эритроцитов человека,

- поиск параметров среды, химических эффекторов, обеспечивающих оптимальные условия для работы Na'.K'-АТФаэы in vitro;

- выяснение вклада каждого из осн^зных транспортных процессов, влияющих на распределение ионов Na' и К* между внутри- и внеклеточным пространствами.

НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Впервые для исследований транспортных процессов, в том числе для харетеристики работы системы активного транспорта, успешно применен новый подход с -"»льэованием метода

иомометрии. Это позволило вести непрерывную кинетическую регистрацию внеклеточных концентраций ионов и К*, обеспечило сохранение целостности клеток и нативных свойств клеточных мембран в ходе эксперимента, дало возможность максимально приблизить физико-химические и биологические параметры суспензии клеток к условиям, существующим ¡п у\уо. Оценка функционирования Ыа'.К'-АТФаэы проводилась не по количеству гидролизуемых молекул АТФ (приросту неорганического фосфата в среде), а по реальной ионтранспортирующей способности. В работе описаны следующие процессы:

- связывание полиенового антибиотика нистатина с мембранами эритроцитов человека;

- формирование нистатиновых каналов;

- диффузия ионов №* и К* по каналам, сформированным антибиотиком нистатином;

- инактивация сформировавшихся нистатиновых каналов,

- активный транспорт ионов, обеспечиваемый Ыа\К*-АТФазой. Непосредственное прикладное значение имеет разработка условий эксперимента, при которых имеется возможность проводить сравнительную оценку ионтранспортирующей способности Ыа*,К*-АТФазы в норме, при патологии и при действии на клетки различных химических агентов и эффекторов, лекарственных препаратов и т.л

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Предложен новый подход к кинетическим исследованиям процессов транспорта ионов и К* через мембрану эритроцитов человека с использованием метода ионометрии.

2. Кинетическое ионометрическое определение концентрации Ыа' и К' успешно применено для изучения ионного транспорта через клеточную мембрану, выявлены его преимущества перед традиционными методами исследования ионтранспортирующих систем

3. Оптимизированы условия среды, пригодные для оценки работы систем активного транспорта ионов в эксперименте на цельных клетках.

4. Выявлены основные транспортные процессы, влияющие на формирование трансмембранного баланса концентраций Ыа* и К* живых эритроцитов человека при модификации эритроцитарных мембран полиеновым антибиотиком нистатином, определен вклад каждого из них в общую кинетическую картину эксперимента.

5. Насосная функция №*.К*-АТФаэы в эритроцитах человека, "спровоцированных" нистатином, может быть выявлена только в присутствии плазмы крови (в наших экспериментах - гомологичной).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При проведении опытов с применением солевых растворов были использованы эритроциты, полученные из свежей крови здоровых доноров, консервированной с помощью раствора Тлюгицир". эритроциты отделяли от плазмы центрифугированием на холоду при 4°С в течение 10 мин, а затем отмывали трехкратным ресуспендированием в

\

солевом растворе с последующим центрифугированием в тех же условиях. - --- -экспериментах с добавлением плазмы донорскую цельную кровь гепаринизировали.

Приготовление рабочей пробы осуществляли смешиванием эритроцитарной , массы, полученной в результате последнего центрифугирования, с солевым раствором в объемном соотношении от 5:1 до 2:3. Использовали два варианта солевого раствора, один из них - раствор типа Тироде содержал 4 mM KCl, 141 тМ NaCI, 2 тМ CaCI, 3 тМ MgCI, 10 тМ глюкозы Другой - незначительно модифицированный раствор Моргана -отличался от первого несколько иными концентрациями KCl и NaCI (соответственно 5 и 104 тМ), а также наличием 25 mM NaHCOj, 5тМ Na2HPO, , 3.5 тМ NaH2PO« , 27 тМ сахарозы.

В качестве специфического ингибитора Na'.K'-АТФаэы применяли уабаин (Serva). Каналообразующим агентом служил полиеновый антибиотик нистатин, который растворяли в свежеперегнанном диметилформамиде. Для регистрации концентраций Na* и К* в среде после полного лизиса эритроцитов в конце опыта вновили сапонин в конечной концентрации 4.4 мг/мл. С этой же целью в части экспериментов производили замораживание ячеек с последующим их оттаиванием.

Определение внутриклеточного объема эритроцитов производили на основе измерения числа клеток с помощью эритрогемометра. В частности, в 1 мл рабочей пробы из смеси 4.5 мл эритроцитарной массы и 0.9 мл солевого раствора) содержалось обычно 8.1+ 0 1 млн клеток. По известному объему одного эритроцита рассчитывали суммарный внутриклеточный объем.

Ионометрическое определение внеклеточных концентраций Na* и К* осуществляли с помощью Na*-селективных стеклянных электродов ЭСЛ-51-07 (ЗИП, г. Гомель) и пленочных калиевых электродов, изготовленных в НИИ химии СПбГУ. Для калибровки электродов были использованы две различные системы калибровочных растворов для работы в растворе Тироде (с глюкозой) и в растворе Моргана. Эксперименты производились в области полноты линейной функции ИСЭ (5*10"4 -1.2*10'' М для К* и 5*10"® - 5'Ю'1 М для Na'). Пригодность ионселективных электродов была проверена методом стандартных добавок.

Экспериментальная установка для непрерывной регистрации динамики внеклеточных концентраций ионов Na* и К* е основе своей имела блок из 6 фторопластовых ячеек емкостью 10 мл каждая, окруженных общей рубашкой с термостатированной жидкостью (37°С). В каждую из ячеек помещали 2 ионселективных электрода (для К* и для Na* ), а также один из концов электролитического мостика, заполненного 1 mM ЫН,М03, Другой конец мостика фиксировали в сосуде с 1mM NH4N03, который, в свою очередь, соединялся мостиком, заполненным насыщенным раствором KCl, с другой - емкостью, содержащей тот же насыщенный раствор KCl с опущенным в него электродом сравнения. Этот электрод подключали к мономеру И-130 (ЗИП, г.Гомель), к которому через коммутатор автоматически с интервалом 0.5 мин подключались поочередно все 6 пар ионоселективных электродов. Показания мономера отражались на цифровом табло и фиксировались в виде графика на ленте самописца КСП-4 (ЗИП,

б

г.Москва), подключенного к мономеру Колебательные движения блока кювет обеспечивали постоянное перемешивание суспензии эритроцитов в ходе эксперимента.

Спектрофотометрическое определение нистатина в рабочей пробе производили по методу Эштона и Тутила, модифицированному нами с целью удаления белковых компонентов из рабочей пробы, мешающих спектрофотометрическому определению Осаждение белков осуществляли 96% этанолом

Радиохимические эксперименты проводили с использованием S6Rb*. Для измерения пассивной диффузии ионов свежую донорскую кровь предварительно нагружали меченым RbCI в течение двух часов в термостате при 37°С с постоянным встряхиванием Затем эритроциты отмывали от плазмы и ресуспендировали в растворе Моргана. Суспензию вновь помещали в термостат и через фиксированные промежутки времени отбирали пробы и немедленно центрифугировали Надосадочную жидкость и полученный осадок клеток помещали - также в пластиковых пробирках - в полупроводниковый детектор радиометра

В экспериментах по изучению поглощения 86Rb* эритроцитами предварительно отмытые от плазмы клетки ресуспендировали в солевом растворе или аутологичной плазме. В подготовленную пробу добавляли меченый RbCI и помещали ее в термостат при 37°С. Через определенные промежутки времени отбирали пробы в пластиковые пробирки и измеряли радиоактивность пробы. После быстрого охлаждения немедленно центрифугировали, затем измеряли радиоактивность надосадочной жидкости.

Математические методы. Все математические расчеты, построение графиков и статистическую обработку экспериментальных результатов осуществляли с помощью персонального компьютера IBM с соответствующим программным обеспечением.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. ИЗУЧЕНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ Na* И К* 8 ОТСУТСТВИЕ НИСТАТИНА. КОНТРОЛЬНЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ. В начальной серии экспериментов было проведено исследование изменения внеклеточной концентрации ионов Na* под действием ингибитора Na'.K'-Hacoca -уабаина. Из эритроцитов, ресуспендированных в растворе Тироде, готовили две параллельных пробы. В одну из них (опытную) добавляли водный раствор уабаина, а в другую (контрольную) дистиллированную воду. Затем проводили определение динамики внеклеточной концентрации Na*. Типичные результаты приведены на рис 1,

а (тМ) 150

100

50 -I

О ! О

20

АО 60

Время(мин)

i -80

Рис.1. Динамика внеклеточной концентрации N8* при инкубации эритроцитов человека в растворе Тироде в присутствии 0.41 мг/мп уабаина (И) и без него (ф) По оси абсцисс - время (мин) с момента добавления уабаина или дистиллированной воды) к суспензии эритроцитов , по оси ординат - внеклеточная концентрация Ыа' в момент времени I.

Можно видеть, что на протяжении 90 мин эксперимента происходит постепенное снижение концентрации Na* вне клеток Эта динамика сохранялась и при увеличении продолжительности эксперимента до 180 мин. Она не зависела от наличия или отсутствия уабаина в среде.

Сходные результаты были получены и при измерении динамики концентрации К* , с той лишь разницей, что его концентрация во внеклеточной среде, естественно, не убывала, а нарастала со временем. Кроме того, темп изменений для К* был гораздо более значительным, чем для Na*. Это обусловлено тем, что убыль ионов Na' измерялась относительно высокого исходного уровня (примерно 140 тМ), тогда как для ионов К* - относительно исходной внеклеточной концентрации (примерно 5 тМ), в десятки раз меньшей, чем для ионов Na*

Очевидно, выявленная динамика внеклеточных концентраций ионов могла быть следствием постепенного лизиса эритроцитов в ходе достаточно продолжительной инкубации. В пользу такого объяснения свидетельствуют прежде всего общепринятые представления о чрезвычайно малой проницаемости мембран эритроцитов для одновалентных катионов, каковая может рассматриваться в качестве критерия целостности самой мембраны. В определенной мере об этом же свидетельствует и отсутствие эффекта уабаина, наблюдавшееся в описанных экспериментах

В целях независимой проверки были поставлены радиохимические эксперименты по исследованию утечки MRb* во внеклеточную среду из эритроцитов, предварительно нагруженных этим аналогом ионов К*. Полученные результаты показали, что радиоактивность надосадочной жидкости практически не изменялась на протяжении 110 мин инкубации нафуженных меткой эритроцитов в солевой среде, независимо от присутствия уабаина.

110 мин инкубации нагруженных меткой эритроцитов в солевой среде, независимо от присутствия уабаина.

- Отсутствие эффекта уабаина косвенно подтверждено и результатами аналогичных экспериментов с инкубацией нагруженных меткой эритроцитов при 20°С. При таком температурном угнетении К\№'-насоса также не наблюдалось выхода 8бЯЬ' во внеклеточную среду.

Таким образом, изложенные данные показывают, что в избранных нами экспериментальных условиях проницаемость мембраны эритроцитов для одновалентных катионов была незначительной, а регистрировавшиеся небольшие изменения концентраций этих катионов во внеклеточной среде обуславливались в основном постепенным лизисом клеток. Во всех дальнейших экспериментах учитывалась поправка на этот спонтанный лизис.

Однако, наиболее неожиданным результатом явилось отсутствие эффекта уабаина - этого широко применяемого ингибитора №4,К*-насоса, Наиболее приемлемое объяснение этому факту заключается, по всей вероятности, в следующем. Концентрации ионов К' и №* в использованных нами солевых средах соответствовали их содержанию в плазме крови в физиологических условиях. Судя по нашим результатам, в этих условиях вполне достаточно ничтожной доли ионтранспортирующей способности К",Ыа*-АТФаэы для поддержания имеющегося равновесия, нарушаемого лишь незначительной по интенсивности пассивной диффузией N8* и К* через мембрану эритроцитов.

Исходя из этого, в последующих экспериментах мы попытались "спровоцировать* работу Ыа'.К'-насоса путем значительного повышения проницаемости мембран эритроцитов для одновалентных катионов. С этой целью был использован полиеновый антибиотик нистатин, способный, как известно, формировать в мембранах каналы, проходимые для ионов №* и К'.

2 ВЛИЯНИЕ НИСТАТИНА НА ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ КОНЦЕНТРАЦИИ И К' В СУСПЕНЗИЯХ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА.

Прежде всего мы определили оптимальную концентрацию антибиотика в суспензии эритроцитов, при которой мембрана клетки становилась проницаемой для ионов Ыа' и К* настолько, чтобы это вызывало изменение трансмембранного градиента концентраций этих ионов в ходе эксперимента и в то же время не вызывало полной деструкции мембраны с последующим быстрым лизисом клеток. Результаты соответствующих экспериментов представлены на рис.2 на примере внеклеточных концентраций ионов К*.

Как следует из представленных данных, оптимальные концентрации нистатина находились в диапазоне 0.1 - 0.26 мг в расчете на 1 мл внеклеточной жидкости. Кинетические зависимости, соответствующие названным концентрациям антибиотика, отражают в своей начальной части достаточно быстрое увеличение внеклеточной концентрации К*. Через 30 - 40 минут после начала действия нистатина

¡личина Ct-да достигает постоянного уровня, сохраняющегося сперимента.

О 20 40 60 80 100

Время (мин) 4

Рис.2. Влияние различных концентраций нистатина на внеклеточную концентрацию К' в суспензии эритроцитов человека в растворе Тироде. По оси абсцисс - время (мин) с момента добавления нистатина к суспензии эритроцитов По оси ординат - (С(-лС(к) -внеклеточная концентрация К* в опытной пробе (с нистатином) в момент времени t за вычетом изменения концентраций, произошедшего вследствие лизиса клеток в контрольной пробе (без нистатина) ("поправка на лизис"), к этому же моменту времени Концентрация нистатина (мг/мл) ф-0 005; ßj- 0 05; ф- 0.11; р - 0.26; Э -0 53, ^ -0 79

Результаты экспериментов по исследованию динамики внеклеточных концентраций К* при действии нистатина на эритроциты, ресуспендированные в разных солевых средах, представлены на рис.3.

Видно, что в растворе Моргана изменения внеклеточных концентраций К* выражены намного слабее, чем в растворе Тироде. Стационарное состояние в растворе Моргана, в отличие от опытов с растворе Тироде, не достигалось за период эксперимента и вся кривая лежит намного ниже, чем при использовании "менее физиологичного" раствора Тироде. Очевидно, что при отмывании клеток от плазмы раствором Тироде эритроцитарная мембрана становилась существенно менее устойчивой к нистатину, чем при аналогичной процедуре с использованием раствора Моргана. В результате наблюдалось более быстрое увеличение внеклеточной концентрации К* и уменьшение внеклеточной концентрации №*. При разрушении клеток сапонином в конце эксперимента в растворе Тироде скачок концентрации был меньшим, чем в растворе Моргана при одинаковом количестве добавленного нистатина.

а-аа (тщ

Время (мин)

Рис 3. Динамика внеклеточной концентрации К* при действии 0.26 мг/мл нистатина на суспензию эритроцитов человека (объемное соотношение 5:1) в солевом растворе Тироде (В) или Моргана (♦) По оси абсцисс и ординат обозначения те же, что и на рис.2.

3. АНАЛИЗ ВОЗМОЖНЫХ МЕХАНИЗМОВ ЭФФЕКТА НИСТАТИНА.

Представленные выше кинетические зависимости являются, очевидно, интегральными. На их характер могут существенно влиять следующие процессы:

1) связывание антибиотика с мембраной ("посадка" нистатина);

2) формирование нистатиновых каналов,

3) диффузия ионов Ыа* и К* по каналам в соответствии с градиентами их концентраций,

4) инактивация сформировавшихся каналов, происходящая в холестерин-содержащих мембранах;

5) активный транспорт ионов, осуществляемый №*,К"-АТФазой в направлении, противоположном возникающим диффузионным потокам.

Мы попытались оценить возможный вклад каждого из этих процессов в итоговую динамику внеклеточных концентраций определяемых ионов.

При изучении скорости связывания нистатина с мембранами эритроцитов мы определяли кинетику сопряженного с ним процесса - уменьшения концентрации каналоформера во внеклеточной среде при ресуспендировании клеток в растворе Моргана Результаты показали, что в течение 4-х минут , прошедших с момента внесения нистатина в суспензию клеток, в количестве 0,11 мг на 1мл внеклеточной жидкости с мембранами успевало связаться 89% антибиотика, а к 9-й минуте • более 96% от его общего количества в пробе. Следовательно, процесс "посадки" протекает очень быстро и не лимитирует суммарный процесс изменения внеклеточных концентраций ионов К' и Ыа* Расчетная величина константы распределения нистатина между водной фазой и фазой мембраны К =11,05*10" М

Таким образом, ассоциация нистатина с холестерин-содержащими мембранами эритроцитов оказалась очень быстрой, а взаимодействие довольно сильным. Следовательно, процесс формирования каналов, проницаемых для ионов Ыа* и К' вряд ли мог оказать существенное влияние на характер динамики внеклеточной концентрации этих ионов даже в ранние сроки после добавления нистатина.

При оценке диффузионных трансмембранных характеристик мы воспользовались простейшей моделью. Мембрана в рамках этой модели является обобщенной, т е суммируется из мембран всех клеток, находящихся в суспензии. Эта "общая" мембрана разделяет обобщенные же внутри- и внеклеточные пространства. Указанные пространства имеют, соответственно, объемы V, и V»,, а начальные концентрации иона (К* ) в них С, и С.. Предполагается также, что ионы диффундируют исключительно по сформированным каналам (т.е. вклад их пассивного движения непосредственно через мембрану пренебрежимо мал).

Мембрана рассматривается как некоторая среда заданной толщины, сопротивление которой проникновению ионов определяется коэффициентом диффузии, полагаемым постоянным е данный момент времени. Коэффициент диффузии (О) как функция времени был рассчитан нами по известной скорости изменения концентрации ионов во внеклеточном пространстве, текущему значению концентрации, толщине мембраны, общей площади проводящей поверхности мембран, величинам суммарного внеклеточного и внутриклеточного объемов, а также начальным значениям внешней и внутренней концентраций Результаты расчетов коэффициентов диффузии для концентрации нистатина 5 мг/мл представлены в табл.2.

Таблица 2. Зависимость величин коэффициента диффузии (О) К* от времени при модификации мембран эритроцитов человека нистатином. Исходная концентрация нистатина во внеклеточной среде 0.26 мг/мл. Отсчет времени (I) - от момента внесения нистатина в суспензию эритроцитов.

( , тт О (*10") 1 , т ¡п 0 (х 1 О10) ( , т¡п й (х 1010) ( , тт 0 (х10'°)

3 0.570 26.5 0.177 50 0.1 25 73 0.080

6 0.337 29.5 0.166 52.5 0.120 76 0.074

9 0.280 32.5 0.159 55.5 0.114 79 0.067

12 0.244 35.5 0.152 58.5 0.109 81.5 0.061

15 0.221 38 0.147 61.5 0.103 84.5 0.055

18 0.205 41 0.1 41 67 0.095 87.5 0.049

21 0.192 47 0.133 70 0.086 90.5 0.042

Видно, что во времени значения коэффициентов диффузии монотонно убывают. Здесь проявляется совместный эффект инактивации нистатиновых каналов и работы №\К*-АТФазы.

Мы оценили указанный суммарный эффект в рамках рассмотренной выше модепи. Если образовавшиеся с участием нистатина каналы не будут "схлопываться", и Ыа*,К*-АТФаза не станет противодействовать уменьшению

градиентов концентраций ионов N8* и К* между вне- и внутриклеточными средами, то процесс диффузии во времени должен протекать со скоростью, которая определяла перенос ионов через мембрану в некоторый начальный период. При этом коэффициент диффузии должен оставаться постоянным на протяжении всего эксперимента.

Был произведен расчет внеклеточной концентрации К* при сохранении постоянства коэффициента диффузии, соответствующего величине коэффициента диффузии в начальный момент времени после добавления нистатина в суспензию эритроцитов. Результаты представлены на рис.4 а сопоставлении с реально полученными экспериментальными кривыми для разных концентраций нистатина, и,

абсцисс и ординат обозначения те же: что и на рис. 2.

Как видно из рисунков, форма кривых "чистой" диффузии ионов сильно отличалась от формы экспериментальных кривых. "Отставание" экспериментальных кривых указывало на наличие компенсаторных процессов, направленных против диффузионных потоков ионов. При низкой каналоформирующей активности компенсирующая роль инактивации каналов и активного транспорта через мембрану невелика, и для клетки в этих условиях не наступало такого "стационарного состояния", которое послужило бы достаточным фактором для активации №*,К*-АТФазы, да и сам процесс "залечивания" мембраны не активирован. С другой стороны, если процесс "схлопывания" полиенового канала требует затрат энергии, то энергетический ресурс для "схлопывания" будет затребован из наиболее близкого компартмента. Можно полагать, что гидролизу подвергнутся те молекулы АТФ, которые находятся непосредственно в мембране, и, возможно, АТФ, который распределен в примембранных компартментах, но

не АТФ, находящийся в более глубоких областях цитозоля. При таких ограниченных энергетических ресурсах возможна конкуренция за получение энергии между процессом — __ "залечивания"- и активным ~ транспортом ионов Ыа" и К'. В данном случае предпочтительным для клетки оставалось сохранение собственной целостности, то есть энергия, высвобождающаяся при гидролизе АТФ, затрачивалась именно на "схлопывание".

В кинетике противодействия облегченной диффузии ионов по каналам имелись существенные отличия при ресуспендировании эритроцитов в разных солевых растворах (Тироде или Моргана) Как было отмечено выше, в растворе Моргана стационарное состояние, достигалось позднее, чем в растворе Тироде. В растворе Моргана в течение длительного времени мы фиксировали медленное нарастание внеклеточной концентрации К* (уменьшение внеклеточной концентрации N8*). Более жесткие условия существования, в которых оказывались эритроциты при ресуспендировании их в растворе Тироде, являлись активирующим фактором для процесса "охлопывания". В более "физиологичной" среде (раствор Моргана) каналы инактивировались медленнее.

В дальнейшем мы перешли к изучению вклада процесса инактивации каналов и активного транспорта ионов и К* в общую кинетическую картину эксперимента, используя для этого угнетение №а*,К*-АТФазы уабаином.

Нистатин в этих опытах добавляли после после предварительной инкубации суспензии клеток с уабаином (опыт) либо без таковой (контроль). Результаты этих экспериментов для К' представлены на рис.5

: а-со (

90 [ 80 * | 70

I 60-

| 50 -40 -

зо-20" I 10 -

! о1 ! о

Рис.5. Влияние нистатина (0.26 мг/мл) на динамику внеклеточных концентраций К* в суспензии эритроцитов в растворе Тироде (АУ) или Моргана (+0) после предварительной инкубации с 0.41 мг/мл уабаина или без уабаина (АД Обозначения по осям абсцисс и ординат те же, что и на рис.2. '

Видно, что существенные различия между кривыми, полученными при использовании уабаина или без него, отсутствовали, причем в обеих солевых средах.

тМ)

30

60

90

Время (мин)

Как и в предыдущей серии экспериментов, здесь явно заметен стабилизирующие эффект раствора Моргана как "более физиологичной" внеклеточной среды. Независим« от наличия уабаина в пробе, под действием нистатина внеклеточные концентрацт ионов изменялись в среде Моргана медленнее, а стационарное состояние достигалоа значительно позднее, чем в растворе Тироде. Из этого можно заключить, что в раствор« Моргана эритроциты имеют большую резистентность к воздействию нистатина. Этс подтвердили расчеты коэффициентов диффузии, которые для опытов в раствор« Моргана заметно меньше, чем для экспериментов с раствором Тироде.

При ресуспендировании эритроцитов в растворе Моргана несколькс возрастали различия между кинетическими кривыми для проб с уабаином и без него, не и при этом они составляли не более 5% (от абсолютной величины концентрации).

Отсутствие выраженного эффекта уабаина побудило нас проверить влияние более высоких соотношений "ингибитор/эритроциты" и увеличения длительности прединкубации клеток с уабаином.

В первой серии таких экспериментов суспензию эритроцитов в растворе Тироде предварительно инкубировали с разными концентрациями уабаина во внеклеточной жидкости (0.41 и 0.81 мг/мл). Кроме того в части опытов увеличивали продолжительность такой прединкубации с 10 до 30 мин. Однако, во всех этих условиях результат оставался прежним: лрединкубация с уабаином не приводила к существенным отличиям динамики внеклеточной концентрации К* под действием нистатина в сравнении с контрольными опытами без уабаина.

В другой серии опытов была уменьшена доля клеток в исследуемой суспензии при сохранении достаточно высокой концентрации уабаина во внеклеточной жидкости. В этих опытах отношение объема эритроцитов к объему солевого раствора составляло 2:3 вместо обычно использовавшегося в наших экспериментах соотношения 5:1. Однако, и в этом случае не наблюдалось существенного эффекта уабаина, хотя количество его молекул в расчете на одну клетку достигало 55 млн.

Далее был испытан эффект температурного угнетения Na'.K'-АТФазы. Как известно, полное угнетение этого фермента отмечается уже при 20°С, Вместе с тем, при температурах ниже 15°С наступает значительная структурная перестройка

эритроцитарной мембраны. Поэтому мы избрали температуру 16.5°С, при которой проводили эксперименты, в остальных отношениях аналогичные описанным выше. Как показали результаты самопроизвольный лизис при более низкой температуре шел медленнее. Уменьшалась и скорость изменения внеклеточных концентраций (эксперименты были поставлены одновременно, на эритроцитах одного и того же донора). Эти реузльтаты вполне согласуются с известным положением, что при изменении температуры на 10°С скорость физико-химических процессов (в зависимости от состава среды) изменяется в 1.4 - 4 раза. Наличие плато на кинетических кривых при 16.5°С вполне соответствовало литературным данным о прекращении инактивации каналов лишь при температурах ниже 10° С [ Lev A.A., 1992]. Однако, и при 37°С, и при 16.5°С формы кривых оставались одинаковыми. Самое главное заключалось в том, что и в этих экспериментах угнетение Ма\К*-АТФазы (в данном случае - температурное) не влияло

существенно на динамику внеклеточного К' в суспензиях эритроцитов, подвергнуты* _ _______воздействию нистатина-------------------

4 ИЗУЧЕНИЕ ФУРОСЕМИД-ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ТРАНСПОРТА Изложенные выше эксперименты показали, что в присутствии нистатина равновесие между концентрациями Ыа* и К' внутри и вне эритроцитов смещается и в определенных условиях устанавливается на новом уровне Поскольку это г уровень не смещался под действием уабаина. допустимо предположение, что свои вклад в поддержание равновесия в этих условиях вносит фуросемид-чувствитепьныи трлнгпопт Для проверки такой возможности была проведена серия экспериментов мнапогцчны* описанным выше, но с применением фуросемида в конечной концентрации 0 53 мг/мл во внеклеточной жидкости (раствор Тироде) Нистатин в этих экспериментах использовали в концентрации 0 53 мг на 1мл внеклеточной жидкости Оказалось, что прединкубация суспензии эритроцитов с 0 41 мг/мл уабаина, или с 0 53 мг/мл фуросемида, либо с такими же концентрациями обоих ингибиторов вместе существенно не отражалась на динамике внеклеточной концентрации после добавления нистатина

5 РАДИОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСПОРТА ИОНОВ Продолжая изучение функционирования Ыа'.К'-трэнспортирующи ■ систем клетки при различных внешних условиях, мы поставили эксперименты по количественному определению ионов ""РЬ'. поступивших в эритроциты за определенное время инкубации отмытых эритроцитов в растворе Моргана или в аутологичной плазме Результаты эти» опытов (Табл 3) показали, что в условиях близких к остальным нашим экспериментам эритроциты действительно заметно обмениваются с внеклеточной средой ионами аналогами ионов К' Через 90 минут от начала эксперимента удельная радиоактивность клеток, ресуспендированных в растворе Моргана составляет примерно 1/3 от удельной активности пробы и лишь 1/5 часть от удельной активности супернатанта Гораздо

Таблица 3 Вход 86ЯЬ" в клетки, ресуспендированные в растворе Моргана или в аутологичной плазме. Сравнение удельных активностей (А) пробы, супернатанта и клеток

Условия и время инкубации Удельная активность пробы (имп/с) Удельная активность супернатанта (имп/с) Удельная активность клеток (имп/с) Соотношения между удельными активностями

В растворе Моргана, 90 мин 5130 6870 1596 А клетокг „,, А пробы Акпеток_,0 2) Асупернат

В плазме. 120 мин 5000 — 4370 А клетокЗПч> А пробы

более интенсивно происходил обмен при инкубации эритроцитов в аутологичной плазме, за 120 мин инкубации содержание ионов S6Rb' в клетках достигало почти 90% от их концентрации в среднем для всей пробы.

6. ВЛИЯНИЕ АУТОЛОГИЧНОЙ ПЛАЗМЫ НА ИОННЫЙ ТРАНСПОРТ В ЭРИТРОЦИТАХ В ПРИСУТСТВИИ НИСТАТИНА.

Наиболее важным итогом представленных выше экспериментов является отсутствие влияния' уабаина и фуросемида на вызываемые нистатином изменения ионного транспорта в эритроцитах человека, суспендированных в солевых растворах. Вероятной причиной этого феномена может быть наличие каких-то факторов плазмы крови, необходимых для максимальной реализации ион-транспортной функции Na'.K'-АТФазы

Для решения этого вопроса проведена специальная серия экспериментов, аналогичных описанным выше В них испопьзованы также эритроциты чеповека, трижды отмытые на холоду от плазмы раствором Моргана. Однако, эритроциты ресуспендировали не в солевых растворах, а в аутологичной плазме (гепаринизированной).

В этой серии экспериментов впервые удалось выявить эффект Na'.K'-Hacoca в преодолении сдвигов вызываемых нистатином, причем этот эффект был уабаин-чувствительным. Выраженность этого эффекта значительно варьировала в опытах с кровью разных доноров. Можно выдепить два крайних типа соответствующих кинетических кривых (рис. 6а).

Здесь кинетические кривые в целом похожи на зарегистрированные в солевых средах. Однако, для достижения сходного по интенсивности эффекта нистатина требовались значительно более высокие концентрации этого каналообразователя. В данном случае 0 53 мг/мл Это с очевидностью свидетельствует, что существенная часть нистатина связывается с липопротеинами плазмы крови и не может эффективно взаимодействовать с мембраной эритроцитов.

Главной же особенностью результатов, полученных в опытах с инкубацией эритроцитов в гомологичной плазме крови явилась значительная разница в ходе кривых в присутствии уабаина и без него. Эта разница характеризует эффективность противодействия Na*,K*-Hacoca нарушению градиента концентраций ионов (в данном примере ионов К'), вызванному нистатином.

Другой тип кинетических кривых представлен на рис.66. Здесь отчетливо видно, что в присутствии 0.41 мг/мл уабаина нистатин вызывает быстрый выход ионов К* из эритроцитов, уже через 20 мин почти достигающий той внеклеточной концентрации К*, которая наблюдается при попном лизисе эритроцитов. В отсутствие уабаина (нижняя кривая на рис.66) начальный "скачок" внеклеточной концентрации К* уже через 10 мин преодолевается и сменяется преобладанием процесса активного транспорта К* внутрь клеток до тех пор пока равновесие между внутри- и внеклеточными концентрациями К* не установится на новом уровне. И хотя этот новый уровень внеклеточной концентрации К*

не достигает исходного (наблюдавшегося до введения нистатина в среду), он значительно ниже того, который регистрируется при инкубации эритроцитов с уабаином.

I а-аса !

I (™М> | ! '

50 100

Время (мин)

Ч|1И1И11И«М

50 100

Время (мин)

150

Рис.6. Динамика внеклеточных концентраций ионов К* при ресуспендировании эритроцитов человека в аутологичной плазме крови в присутствии 0.53 мг/мл нистатина и

0.41мг/мл уабаина (В) или без него (ф) По оси абсцисс: время (мин) с момента добавления нистатина, По оси ординат: внеклеточные концентрации ионов К' (мМ).

Этот новый уровень характеризует уравнивание интенсивности выхода К* из эритроцитов через нистатиновые канала и обратного ему процесса активного транспорта ионов К* уабаин-чувствительным насосом против градиента концентрации.

Таким образом, полученные результаты однозначно свидетельствуют, что эффективная реализация насосной функции №*,К*-АТФазы эритроцитов человека зависит от наличия каких-то факторов, удаляемых при отмывании клеток солевыми растворами. Очевидно, эти факторы являются компонентами плазмы крови. В их отсутствие Ыа'.К'-АТФаза не может эффективно противодействовать нарушению градиентов Ыа' и К' в эритроцитах, вызываемому нистатином, что и регистрировалось неизменно в экспериментах с суспензией отмытых эритроцитов в солевых средах. В присутствии же гомологичной плазмы насосная функция ^'.К'-АТФазы может быть зарегистрирована отчетливо и количественно оценена. Судя по полученным нами

результатам, существующие представления об очень низкой активности Ыа\К*-АТФазы в эритроцитах обусловлены тем, что в многочис-ленных исследованиях активность этого фермента регистрировали в отмытых эритроци- тах, т.е. в отсутствие плазменных факторов, в которых нуждается №*,К'-АТФаза эритроцитов человека.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый подход к исследованию процессов переноса ионов через мембрану эритроцитов человека с использованием метода ионометрии.

2. Выявлена адекватность, а также преимущества данного метода перед традиционными для изучения работы ионтранспортирующих систем клетки - такие как возможность непрерывной регистрации кинетики концентраций для нескольких видов ионов одновременно; приближение условий эксперимента к существующим ¡п у^о; дешевизна и относительная простота, делающие его доступным к использованию в обычной биохимической лаборатории.

3. Показана пригодность попиенового антибиотика нистатина в качестве фактора (каналообраэователя), обеспечивающего поток одновалентных катионов по градиенту концентрации, позволяющего создать усповия для исследования эффективности систем активного транспорта ионов N8* и К*; количественно описан процесс связывания нистатина с мембранами эритроцитов человека.

4. Установлен суммарный, результирующий характер изменений внеклеточных концентраций ионов Ыа" и К* в суспензии эритроцитов, провоцируемых нистатином, и проанализирован вклад различных процессов, происходящих под действием этого каналообраэователя.

5. Выявлены и охарактеризованы лимитирующие и нелимитирующие процессы, приводящие к формированию интегрального эффекта нистатина и уабаина, регистрируемого по динамике внеклеточных концентраций Ыа* и К*; рассчитаны коэффициенты диффузии и ионная проницаемость модифицируемой нистатином мембраны эритроцитов человека; обнаружено отсутствие заметного влияния уабаина на вызываемые нистатином ионные потоки через мембрану отмытых эритроцитов, взвешенных в солевой среде.

6. Установлено, что ионтранспортирующая функция №*,К*-АТФаэы, чувствительная к уабаину, может быть выявлена и количественно оценена только при ресуспендировании эритроцитов в аутологичной плазме; при этом обнаружены значительные индивидуальные вариации в способности Ыа*,К*-АТФаэы компенсировать изменения трансмембранного градиента концентраций N8* и К* , спровоцированные нистатином.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Щербак А.И., Борисов Ю.А., Галебская Л.В. Методические подходы к исследованию состояния биомембран при артериальной гипертенэии.- В сб.: Процессы биоэнергетики и структурно-функциональные свойства биологических мембран в норме и в условиях патологии//Саратов, 1987, С. 93-99.

2. Борисов ЮА, Соболева О.Ю., Суглобова Е.Д. Использование метода ионометрии для изучения функционирования Ма'.К'-АТФазы - В сб.:НТТМ - практическому здравоохранению//Л.: 1990, С. 28-29.

1У

-------------- З. Борисов Ю А., Соболева О.Ю., Сутлобсвэ Е Д Щербак А И. Ионометрическое

изучение пото' рп Мз* и К' через мембрану ?ритрг>цитов человека, модифицированную нистатином /.' Цитология. 1991. Т 33, 11 1 С ? 1-31

4 Борисов Ю А . Соболем О Ю . Сулобгча Е Д , Федорович Е Е Транспорт ионов 11а* и К" через мрг/брэну эритроцитов челопега при Формировании в ней нистатиновых каналов некоторые особенности и анчпич процессов " Цитология 1994 Т 36, N 5, С 477--Ш