Исследование судьбы экзогенной ДНК, интегрированной в геном соматических клеток млекопитающих

Иванов, Андрей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование судьбы экзогенной ДНК, интегрированной в геном соматических клеток млекопитающих
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование судьбы экзогенной ДНК, интегрированной в геном соматических клеток млекопитающих"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

□0306726Б

ИВАНОВ Андрей Владимирович

ИССЛЕДОВАНИЕ СУДЬБЫ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК, ИНТЕГРИРОВАННОЙ В ГЕНОМ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2006

003067266

Работа выполнена в лаборатории клеточной биологии Отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Филатов Михаил Валентинович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Михельсон Виктор Михайлович

кандидат химических наук Аленин Владимир Владимирович

Ведущее учреждение:

Защита состоится

ГУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН».

е4ьа4Л

2.232.

2007 г. в

часов на заседании

Диссертационного совета Д.212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория _1_.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9

Автореферат разослан « 200/т.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Геном клеток высших эукариот находится под постоянным риском инвазии чужеродной ДНК. In vivo клетки млекопитающих продолжительное время контактируют с различными бактериями, вирусами и фрагментами их ДНК, что предполагает возможность горизонтального переноса генетической информации. В действительности, свидетельства о захвате и сохранении бактериальной ДНК в геноме млекопитающих достаточно ограничены (Scrable, Stambrook 1999; Doerfler et al., 2001). Практическое отсутствие остатков фрагментов бактериальной ДНК в геноме млекопитающих дает основание для предположения о наличии в их клетках высокоэффективной системы по защите собственного генома от приобретения нежелательной чужеродной ДНК. Экспериментально доказать наличие таких систем достаточно сложно, и исследования в этой области находятся на начальной стадии (Awadala, 2003). Несмотря на то, что подобные защитные системы были описаны для бактерий, простейших (Selker, 2003; Yao et al., 2003) и растений (Matzke et al., 2000), об их существовании у млекопитающих свидетельствуют лишь немногочисленные отрывочные данные (Hemmi et al., 2000; Pravtcheva, Wise, 2Q03; Pipes et al., 2005).

Знание подобных аспектов стабильности генома особенно важно в случаях направленного введения в клетки высших эукариот желательных фрагментов ДНК, таких как геномные исследования, генная терапия, получение трансгенных животных и т.д. (Smith, 2004).

В сфере медицинских исследований большое значение имеет вопрос об особенностях интеграции в геном соматических клеток человека вирусов, в том числе и онкогенных. Кроме достаточно хорошо изученного момента интеграции вирусной ДНК в клеточный геном, остаётся плохо понятной дальнейшая судьба чужеродной ДНК и ее взаимоотношения с системами поддержания стабильности генома (Doerfier et al., 1997).

На начальной стадии исследования было предложено две основных гипотезы, объясняющие это явление:

1) клетка млекопитающих может "узнавать" и удалять места интеграции чужеродной ДНК за счет взаимодействия с гомологичной хромосомой или хроматидой;

2) основное влияние на стабильность интегрированного в геном трансгена оказывают нуклеотидные последовательности флангов, окружающих сайт внедрения чужеродной ДНК в хромосому.

Цель исследования:

Целью данного исследования является демонстрация явления нестабильности интеграции чужеродной ДНК в геном соматических клеток млекопитающих на модели культур клеток,, количественная характеристика этого явления для линии клеток китайского хомячка А23, поиск, и изучение факторов, влияющих на удаление чужеродной ДНК из генома клеток млекопитающих.

Задачи исследования:

1) на модели культуры соматических клеток китайского хомячка А23 продемонстрировать и количественно охарактеризовать феномен нестабильности интегрированной в геном плазмидной ДНК;

2) с помощью метода ПЦР доказать действительную потерю интегрированных последовательностей ДНК из генома клонов клеток, характеризующихся подобной нестабильностью;

3) продемонстрировать функциональность модифицированного бактериального белка RecA в клетках исследуемых линий;

4) рассмотреть влияние возможного усиления гомологичной рекомбинации на стабильность интегрированной чужеродной ДНК на примере введения в соматические клетки млекопитающих бактериального белка RecA;

5) разработать подход для анализа областей генома, окружающих место интеграции плазмиды, попытаться определить роль влияния фланговой геномной ДНК на стабильность интегрированной чужеродной ДНК.

Научная новизна.

На модели культур клеток продемонстрирован и впервые количественно описан феномен потери интегрированной чужеродной ДНК. Выявлено, что основным фактором, влияющим на такую нестабильность, могут являться фланги хромосомной ДНК, окружающие место интеграции плазмиды.

Показано, что бактериальный белок RecA, модифицированный сигналом ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV40, а также гиперрекомбиногенный белок RecA-X53, экспрессированные в клетках млекопитающих, функционально активны и приводят к некоторому уменьшению повреждений ДНК после облучения. Данная картина визуализирована методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (Comet assay). Установлено, что усиление процессов гомологичной рекомбинации с помощью экспрессия этих белков практически не влияет на нестабильность трансгенов.

Разработан оригинальный подход конструирования «вторичной» плазмиды, содержащей участки генома клетки китайского хомячка вокруг места интеграции первоначальной плазмиды.

Теоретическое и практическое значение результатов работы.

Полученные данные о нестабильности интеграции плазмидной ДНК в геном культивируемых клеток млекопитающих говорят о существовании в клетках высших эукариот пока до конца неизвестных механизмов защиты генома от инвазии чужеродной ДНК. Хотя предположения о существовании подобных систем у эукариот существуют достаточно давно, а их работе у растений посвящен целый выпуск журнала "Nature" (Dangl, Jones, 2001; Waterhouse et al., 2001), об их действиях по защите генома млекопитающих свидетельствуют только единичные отрывочные данные (Doerfler et al., 2001). Данное исследование говорит о

необходимости дополнительного изучения систем поддержания стабильности генома и репарации у млекопитающих. Это приобретает особую актуальность в случаях удаления из генома интегрированной ДНК провирусов, а также в случаях генной терапии различных заболеваний. Хотя данное исследование проведено на культурах клеток, явление нестабильности введенной ДНК проявляется и на трансгенных животных (Scrable, Stambrook, 1999; Pravtcheva, Wise, 2003), что также необходимо учитывать при проведении соответствующих экспериментов. Кроме того, настоящая работа нарушает "классическую" концепцию, согласно которой трансген после интеграции в геном рассматривается как часть хозяйской хромосомной ДНК, неотличимая от собственных генов организма. Разработана стратегия оценки степени нестабильности в динамике во время культивирования клеток млекопитающих in vitro.

Положения, выносимые на защиту.

1) На модели культуры клеток А23 и плазмиды р16 наблюдается явление направленного удаления чужеродной ДНК, предварительно интегрированной в геном.

2) Попытки усилить ГР в клетках исследуемых линий с помощью экспрессии бактериального белка RecA не приводят к существенным изменениям нестабильности интегрированных чужеродных генов.

3) С помощью оригинального подхода по определению влияния нуклеотидной последовательности флангов геномной ДНК, окружающих места интеграции плазмиды, на стабильность существования чужеродной плазмидной ДНК в геноме соматических клеток млекопитающих демонстрируется возможность зависимости судьбы чужеродной ДНК от места ее интеграции в геном.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 30th Nordic-Baltic Postgraduate Course in Plant Breeding (Ош, Норвегия, 2004), на III съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004), 45th Annual meeting of American Cociety for Cell Biology (Сан-Франциско, США, 2005), а также на научных семинарах Отделения молекулярной и радиационной биофизики ПИЯФ, совместных семинарах Лабораторий клеточной биологии, биофизики макромолекул и молекулярной генетики ОМРБ ПИЯФ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 3 тезиса.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 145 страницах текста, содержит 4 таблицы и 27 иллюстраций. Список литературы включает 227 работ, в том числе 209 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культуры клеток. Линии клеток китайского хомячка А23 ТК", фибробластов человека, больного синдромом Вернера, трансформированных вирусом SV40, AG11395 и клеток эмбриональной тератокарциномы мыши F9 культивировали в среде Игла (ВМЕ) (Биолот, Санкт-Петербург) с добавлением 10% сыворотки крови

крупного рогатого скота (КРС) и 10 нг/мл ампициллина при 37°С во флаконах Карреля (Orange Scientific, США). Для получения отдельных клонов клетки высевались в чашки Петри или 24-луночные планшеты (Costar, США) и помещались в С02 инкубатор (Flow Laboratories, США) в атмосферу 5 % С02. Для длительного хранения клеток использовались стандартные методы криоконсервации.

Плазмиды, использованные в работе. Плазмида р16 получена как комбинация плазмид pMCITK и pRV9.2 (д-р P. Hasty, проф. M. Capecchi, University of Utah, США). Плазмида несет полный ген ТК человеческого вируса простого герпеса, энхансер вируса полиомы, ген HPRT со вставкой гена устойчивости к аминогликозидфосфорибозилтрансферазы (G418) NEO, и вектор для репликации в Е. coli pTZ с устойчивостью к ампициллину (Thomas, Capecchi, 1987). Плазмида pATR4 (проф. К. Kohno, Institute of Molecular and Cellular Biology, Osaka, Япония), несет ген recA E. coli и ген гигромицин В-фосфотрансферазы, придающий устойчивость к гигромицину В. Плазмида pcDNA3.1-Hygr также имеет ген устойчивости к гигромицину В (д-р M.Grey, США). Плазмида р42_3-3 получена автором.

Электропорация; получение и селекция ТК* клеток линии А23. Трансфекцию плазмид в клетки проводили методом электропорации. ЗхЮ6 выращенных в стандартных условиях клеток суспендировали в 0.3 мл среды Игла, смешивали с 20-100 мкг плазмидной ДНК и электропорировали при U=1.08 kB, С=0.1 мкФ, средняя продолжительность импульса 1 мсек. После электропорации отбирали отдельные клоны устойчивых к G-418 и одновременно чувствительных к ганцикловиру клеток. Далее клетки каждого клона наращивали и рассевали на 4 флакона. Через 24 часа в один из флаконов добавляли 5 мкг/мл ганцикловира, во второй среду HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин), в третий повторно G-418, четвертый служил контролем. Через 15-20 дней каждый эксперимент повторялся для клеток, выросших в нормальных условиях или после селекции клеток на среде HAT. Частота потери селективных признаков измерялась путем подсчета количества колоний, выросших на ганцикловире в пересчете на число высеянных клеток.

Для получения вторичных трансфектов выделенную из E.coli плазмиду р42_3-3 электропорировали в клетки линии А23 аналогично плазмиде р16, но брали 100150 мкг пДНК для каждой трансфекции. Выход устойчивых к G-418 колоний оказывался существенно ниже, чем в опытах с р16, и составлял ~ lx 105 клеток.

Анализ наличия трансгенной ДНК в клетках. ДНК из культивируемых клеток млекопитающих выделяли, лизируя клетки саркозилом и расщепляя белки протеиназой К в присутствии ЭДТА (Херринггон, Макги, 1999). При проведении опытов по вторичной трансфекции суммарной геномной ДНК клона 42 линии клеток А23 очищенную ДНК дробили воздействием ультразвука частотой 40 х 103 Гц в течение 10 сек. на приборе производства ОМРБ ПИЯФ РАН. амплификация трансгенов до 20 копий уже после интеграции в геном (Muräne, Yezzi, 1988; Doerfier, 1997). Подобная амлификация после интеграции отмечена и

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась по стандартной методике (Mullís, Fallona, 1987) по схеме: 1 цикл - 92°С в течение 200 сек., 20 циклов - 92°С - 60 сек., 58°С - 90 сек., 73°С - 120 сек., последний цикл 73°С - 200 сек. на термоциклере производства ОМРБ. На каждую реакцию брали 100 нг обработанной ДНК, 0.2 мкМ нуклеотид трифосфатов, 2.8 мМ MgCl2, 50 мкг/мл BSA, 1 мкМ каждого из праймеров, 1 единицу Taq полимеразы.

Были использованы следующие праймеры (Хеликс Лимитед, СПб): NEO/S1693 5'-TTGTCAAGACCGACCTGTC-3', NEO/AS2307 5'-GCTGCG AATCGGGAGCG-3 ', HSVTK/S368 5' -G A AGCGCGTATGGCTTCG-3 ', HSVTK/AS561 5'-GCACCCGCCAGTAAGTCА-3 '. Определение нуклеотидной последовательности части плазмиды р42_3-3, содержащей участки флангов места первоначальной интеграции, осуществляли по Сенджеру с использованием реактивов и оборудования фирмы «Хеликс Лимитед» (СПб). Был использован праймер P4233R 5 ' - AC AAGCGCCC AG AT А AC AATG-3 '. Анализ полученной нуклеотидной последовательности проводили с помощью программы BLASTN, входящей в пакет Vector NTI.

Получение и анализ клонов клеток, экспрессирующих белок RecA. ДНК плазмиды pATR4 вводилась в клетки линии F9 методом электропорации, как описано выше. Для каждого опыта брали 5><10б клеток и 50-80 мкг пДНК.

Вестерн-блот. Для выявления белка RecA, находящегося на мембране, проводилось обработка антителами двухэтапным непрямым методом. В качестве первых антител были использованы поликлональные кроличьи антитела на белок RecA (д-р А.В.Суслов, ПИЯФ РАН), в разведении 20 мкг/мл. Реакция связывания проводилась при комнатной температуре в растворе TBS в течение часа, после чего следовали 3 отмывки в TBS по 5 мин. (все при покачивании). В качестве вторых антител использовались козьи антикроличьи антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена. Реакция проходила при комнатной температуре в растворе TTBS и 0,1% молока в течение 1 часа, после чего следовала аналогичная отмывка. После отмывки производилось окрашивание 3,3'-диаминобензидином (ДАБ) или люминолом. Для этого был использован набор реактивов Super signal West Pico Trial Kit (Pierce).

Для визуализации разрывов ДНК в клетках после облучения жестким рентгеновским излучением был применен метод Comet assay в вариации Коллинса с коллегами (Horvathova et al., 2004). Клетки смешивались с раствором 1% агарозы в ФБ, наносились на предметные стекла двумя аликвотами по 80 мкл, обрабатывались лизирующим раствором (2.5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 10 mM Tris/HCl, pH 10, 1% Triton X-100) в течение 1 часа для удаления мембран и разгонялись в электрическом поле 0,8В/см. Перед наблюдением в флуоресцентный микроскоп готовые препараты окрашивались ДНК-связывающими красителями: Hoechst, DAPI или бромистым этидием. В каждой пробе оценивалось 100 комет, которые разделялись на 5 классов в зависимости от выраженности и размеров хвоста.

В работе использованы методы статистической обработки материалов, осуществлявшиеся с использованием стандартного пакета программ EXCEL'XP. При расчете погрешностей для построения графиков потери селективных маркеров статистическую обработку результатов гибели клеток проводили с помощью метода наименьших квадратов, используя коэффициент Стьюдента для заданной надежности а=0.95. Расчет доверительных интервалов при построении диаграмм распределения клеток различных типов проводился по критерию х2-

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Одной из моделей для изучения нестабильности стали культуры клеток. В серии работ Глебов с соавторами (Глебов и др., 1985; Глебов, Абрамян, 1985) описали явление нестабильности искусственно введенной в геном клеток линии СНО тимидин киназы вируса простого герпеса и обнаружили мозаичность ТК+ фенотипа.

В данной работе нам удалось развить эти подходы и продемонстрировать эффективную потерю предварительно включенной в геном чужеродной ДНК при культивировании клеток млекопитающих. Предложенная экспериментальная система позволяет легко следить за изучаемым процессом, используя экспрессию двух селективных маркеров (Рис. 1). Устойчивость к G418 служит для отбора трансфектантов, несущих встроившуюся в геном экзогенную ДНК, а устойчивость к ганцикловиру используется для селекции клонов, потерявших чужеродную ДНК.

Анализировались только клоны, изначально устойчивые к G418 и чувствительные к ганцикловиру. Те из этих клонов, клетки которых в более поздние сроки становились устойчивыми к ганцикловиру и одновременно чувствительными к G418 и среде HAT, рассматривались как ревертанты.

Для трансформации клеток линии А23 была получена плазмидная конструкция р16, включающая ген NEO, обуславливающий устойчивость к G418, и ген тимидинкиназы вируса простого герпеса - ТК ВПГ. Сильные эукариотические промоторы - ß-актина цыпленка для гена NEO и вируса простого герпеса для гена ТК, а также энхансер вируса полиомы и сигнал инициации трансляции Козак обеспечивают эффективную экспрессию этих генетических маркеров в клетках млекопитающих (Kido et al., 1992).

Интеграция гена NEO в геном ведет к появлению клонов клеток, способных расти в присутствии G418. Интеграция же гена ТК ВПГ сообщает клеткам, дефектным по эндогенному гену тимидинкиназы, способность расти на среде HAT, но делает клетки чувствительными к такому аналогу природных нуклеозидов, как ганцикловир. Такая ситуация реализуется только в случае встройки вводимой плазмидной ДНК в геном клеток - реципиентов. Данная конструкция, как и все подобного рода конструкции, не имеющие специальных вирусных ori репликации ДНК, не может сохраняться и работать в клетках

Ген Атр -устойчивость * ампициллину

Ген NEO-устойчивость «G418

Элестролорация

5Х©

Ген ТК 6ПГ - чувствительность к ганцикловиру

Если клетки сразу живут в среде с ганциклоеиром, клон отбрасывается из эксперимента как изначальна не включивший ген ТКВПГ

Если клетки сразу погибают в среде с ганциклоеиром, клон подвергается дальнейшему анализу на стабильность приобретенных признаков

Появление колоний, устойчивых к ганцикловиру и чувствительных к среде HAT свидетельствует о нестабильности интегрированной в геном ДНК плазмиды р16

Повторение эксперимента через 10 суток для оценки динамики нестабильности

Рис. 1. Схема основных экспериментов по демонстрации явления нестабильности ужеродной ДНК, интегрированной в геном соматических клеток млекопитающих.

текопитающих в эписомном состоянии сколь либо долгое время. Она должна ибо интегрироваться в клеточный геном, либо будет утрачена. Не нтегрированные генные конструкции такого рода обычно утрачиваются клетками ке после нескольких делений (Тимченко и др., 1990). Таким образом, полученная онструкция позволяет вести отбор клеток, в геном которых она интегрировалась -о устойчивости к G418 и наоборот - вести среди этих интегрантов отбор клеток, отерявших ее, по устойчивости к ганцикловиру.

Селекция на среде HAT помогает удалять ревертантов по гену ТК в случаях, огда доля таких ревертантов приближается к 100%, но не достигает этого начения. После зачистки на среде HAT выживают только клетки, сохранившие К+ фенотип, они образуют колонии, число которых легко подсчитать.

Было получено и проанализирвано 64 независимых клона клеток линии А23. становлено несколько вариантов поведения чужеродной плазмидной ДНК при торичной селекции на ганцикловире, G418 и среде HAT. Как видно из Рис. 2, 1етки теряли селективные признаки с разной скоростью в течение первых недель момента трансфекции. В результате анализа динамики потери селективных ризнаков все исследуемые клоны разбиваются на два класса - стабильные (23 юна) и нестабильные (41 клон). Класс нестабильных клонов, в свою очередь, елится на три группы, обозначенные как полная потеря (f), частичная потеря 1 (р) и частичная потеря 2 (р-2).

В группу f попадают клоны, достигающие на 70-80 сутки эксперимента 100% реверсий. После очистки на среде HAT у клонов этой группы не вырастает ни одной ТК+ колонии (21 клон).

Группу р-1 составляют клоны, у которых процент реверсий на 70-80 сутки после трансфекции попадает в интервал 60-99,9%, но не достигает 100%. После селекции на среде HAT остаются ТК+ клетки, среди которых вновь появляются ревертанты ТК~ после замены среды HAT на обычные условия культивирования (14 клонов).

В группе р-2 динамика потери селективных признаков растет несколько меньшими темпами, чем в группе р-1, достигая на 70-80 сутки эксперимента значений 45-55%. После очистки на среде HAT клоны этой группы ведут себя полностью аналогично клонам группы р-1 (6 колонов).

Рис. 2. График потери ТК ВПГ фенотипа для клеток А23, трансфецированных плазмидой р16. Стрелкой отмечен момент добавления к выжившим Hä ганцикловире колониям клеток среды HAT, вызывающей гибель ТК" клеток (на 70-е сутки наблюдения).

В результате проведенного анализа возникла гипотеза, что имеет место избирательная потеря экзогенной плазмидной ДНК, первоначально интегрированной в геном млекопитающих. Для того, чтобы придти к такому серьезному заключению, была проверена экспрессия вирусной тимидин киназы по регистрации включения в ДНК аналога тимидина - бромдизоксиуридина моноклональными антителами и проточной цитометрией. Результаты экспериментов подтверждают адекватность выбранного подхода и правомочность предложенной гипотезы.

Для проверки универсальности явления нестабильности сходные эксперименты были проведены на других моделях. Клетки тератокарциномы мыши F9 были трансфицированы плазмидой pATR4, несущей ген резистентности к гигромицину в качестве селективного маркера. Аналогичные опыты были проведены с клетками человека линий AG 11395 и плазмидой pcDNA3.1-Higr(WRN), также несущей ген резистентности к гигромицину в качестве селективного маркера. Полученные на селективной среде клоны на 12-14 день селекции несли селективный маркер в 100% своих клеток. Однако после 6-месячного культивирования в отсутствии селективного давления установлено, что в ряде клонов практически все клетки утратили селективный маркер. Так как эти модельные системы из-за отсутствия возможности селекции по ТК+ признаку не так удобны для количественного исследования нестабильности, как система А23-р16, для них рассчитывалось отношение стабильных и нестабильных клонов к общему числу полученных клонов (Рис. 3).

Поиски и исследование факторов, влияющих на нестабильность. Среди рассматриваемых факторов были как внешние (ионизирующая радиация), так и внутриклеточные (работа систем гомологичной рекомбинации и влияние нуклеотидных последовательностей, окружающих место интеграции трансфекта). Установлено, что облучение у-радиацией не является фактором, влияющим на стабильность чужеродных ДНК в геноме клеток млекопитающих.

• Как известно, белок RecA бактерий и его эукариотические гомологи являются основными элементами системы гомологичной рекомбинации. Введение в клетки эукариот бактериального гена гесА, связанного с системой нуклеотидных последовательностей, обеспечивающих его оверэкспрессию, приводит к усилению процессов ГР как минимум на порядок (Shcherbakova et al., 2000).

Именно эта стратегия - оверэкспрессия бактериального белка RecA была выбрана в качестве основы для проверки гипотезы о влиянии механизмов ГР на стабильность интегрированной чужеродной ДНК. Для осуществления этой идеи была получена линия клеток А23, экспрессирующих ген гесА Е. coli Для контроля воспроизводимости такого подхода на других клеточных линиях также были получены линии клеток китайского хомячка V79 и тератокарциномы мыши F9, экспрессирующие бактериальный белок RecA Е. coli и химерный белок RecA-X53 P. aeruginosa, обладающий гиперрекомбиногенными свойствами. Для трансфекции была выбрана плазмида pATR4, кодирующая ген гесА Е. coli, связанный с сигналом ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV40. Для эффективной экспрессии в клетках млекопитающих промотор гена гесА в плазмиде pATR4 заменён промотором р-актина цыплёнка и сигналом инициации трансляции Козак.

Трансфекция плазмиды pATR4 в клетки А23, V79 и F9 проводилась методом электропорации в условиях, аналогичных опытам по нестабильности плазмиды р16. Клоны, в которых плазмида была стабильно интегрирована в геном, были отобраны по устойчивости к гигромицину В, которая обеспечивалась селективным

100 so so

70 £0 SO 40 00 20 10 0

A23-B56

F9 - p 16

F3- pATR4 Ag - WRMeti)

ПЧННН FinCTrt« M HU IM K l..

□ стабильные в нестабильные

Рис. 3. Соотношение стабильных и нестабильных клонов для некоторых наиболее исследованных линий клеток и плазмшшых конструкций.

маркером плазм иды - геном hph, кодирующим гигромицин В-фос-фотрансферазу.

Для выявления клонов клеток, экс премирующих белок T-RecA, лизаты клеток из различных клонов, устойчивых к гигромицину,

анализировали методом Вестерн-блоттинга с помощью поликло-нальных кроличьих антител к белку RecA. Данные опыты проводили по достаточно оригинальной методике, имеющей в основе стандартный набор методов (Sambrook et al., 1989), дополненных и улучшенных с учетом последних работ (Goers, 1993; Gersten, 1996; Wilkinson, 2000ХРис. 4). Как и предполагалось, экспрессия бека RecA в культивируемых клетках млекопитающих оказалась

достаточно нестабильной. За время исследований только одна клеточная "л и ни я, полученная из клона А23-847, смогла сохранить экспрессию бека RecA в течение полутора лет.

Данные о наличии гена гесА, полученные методом ПЦР, полностью совпали с результатами Вестерн-блота: амплификация происходила только в клонах, экспрессирующих RecA.

Продемонстрированный высокий уровень экспрессии белка T-RecA в культивируемых клетках млекопитающих еще не говорит о его полноценном функционировании в сложно устроенной эукариотической клетке. Даже в случае корректной работы в ядре эукариотической клетки бактериальному белку RecA, практически в одиночку способному поддерживать функционирование системы ГР, придется столкнуться с сильной конкуренцией со стороны многочисленных ДНК-связывающих белковых систем. Способность чужеродного белка выполнять р е ко М б и нати в ны е функции в эукариотической клетке может привести как к всплеску активности системы ГР из-за смешения равновесия от приоритетного НВК к ГР, так и к полному запрету ГР за счет нарушения работы Rad51-зависимого комплекса белков.

Для проверки работоспособности белкз T-RecA в исследуемой системе и определения степени его влияния на работу клеточных репаративных систем были проведены опыты двух типов: облучение культивируемых клеток с построением графика выживаемости и облучение с последующей визуализацией повреждений ДНК методом Comet assay. Более информативным методом оказался Comet assay,

12 3 4

I 2 3 4 S 6 ?

поскольку репарация через ГР в клетках млекопитающих часто приводит к остановкам клеточного цикла и апоптозу (Hendrickson, 1997; Lin et al., 1999), В результате такие клетки гибнут как раз в результате перевода систем репарации на путь ГР.

Рис. Вестерн-блат лизатав различных клонов клеток А23 и F9, трансфецированных плазмидами pATR4 и рХ53, а - определение содержания белков а лизатах, окраска серебром; б -вестерн-б л от с первичными анти-RecA кроличьими антителами и вторичными козьими антн-кроличьим антителами, окраска люминолом. Дорожки: I -очищенный белок RecAEc, 2 - чистая линия А23; 3-4 - клоны A23-pATR4, устойчивые к гигромицину; 5 — клон А23- рХ53; 6-7 - клоны F9-pATR4, устойчивые к гигромицину.

т. .

■ ?"5П

Было поставлено два опыта с облучением клеток дозами жесткого рентгеновского облучения 600 Рад и 1200 Рад. В каждом случае сравнивались клетки чистой линии А23 и клетки клона A23-R47, экспрессиру тощие белок Т-RecA. Наиболее информативным оказался опыт с облучением клеток дозой 1200 Рад. В этом случае среди клеток клона A23-S47 после облучения зарегистрировано преобладание комет более низких классов, чем среди клеток чистой линии А23, что говорит о более эффективной репарации ДР ДНК и, следовательно, об успешной работе белка RecA (Рис. 5).

Как видно из Рис. 5 и 6, не подвергшиеся облучению контрольные клетки линии А23 так же, как и клетки клона А23-847, практически не демонстрируют значительных повреждений ДНК. На диаграмме хорошо видно, что среди проанализированных 100 комет преобладают кометы класса 1 (их 73 у чистой линии А23 и 75 у клона А23-847), что соответствует отсутствию выявляемых повреждений ДНК. Наличие незначительного количества комет класса 2 (18 у А23 и 16 у А23-847), а также единичные случаи появления комет классов 3 и 4 можно объяснить повреждениями ДНК во время обработки клеток и приготовления препаратов. Это также может быть результатом проявления спонтанной нестабильности генома культивируемых клеток млекопитающих (Filatov et al., 1998).

Иная картина наблюдается после облучения клеток А23 и А23-847 жестким рентгеновским излучением (Рис. 5 и 6). На диаграмме преобладают кометы класса 5, что соответствует практически полностью разорванной клеточной ДНК.

Значительно количество комет классов 3 и 4 (сильно поврежденная ДНК). При этом заметно различие между клетками А23 и А23-847: у чистой линии А23 число комет класса 5 на 15 больше, чем у клона А23-847, а кометы классов 1-4 преобладают, наоборот, у клеток А23-847. Хотя повреждения ДНК у клеток обоих сравниваемых линий значительны, заметна тенденция к увеличению числа и степени разрывов ДНК у клеток чистой линии А23 (преобладает класс 5), в то время как у клеток клона А23-847 регистрируются больше слабых и средних суммарных разрывов, чем у клеток А23, Итак, показано, что степень повреждения ДНК после облучения рентгеновскими лучами у клеток линии А23-847 незначительно меньше, чем у клеток исходной линии А23 без белка Т-КесА.

Рис. 5. Comet assay: распределение клеток А23 и A23-847(RecA) по 5 классам комет до облучения (а) и после облучения жестким рентгеновским излучением дозой 1200 Рад (б).

Нестабильность чужеродной пДНК в клетках, экспрессирующнх ИесА. Убедившись в эффективной работе белка Р.есА по усилению ГР в культивируемых клетках китайского хомячка А23, можно было приступать к проверке гипотезы о влиянии процессов ГР на выбрасывание чужеродной ДНК. Из полученных 11 клонов А23-рАТ114-р16 8 оказались нестабильными. Это проявилось в потере устойчивости к гигромицину на 70-90 сутки после трансфекции. Оставшиеся три клона, среди которых был клон А23-847, характеризуются стабильной устойчивостью к гигромицину и экспрессией ЯесА.

Сравнение данных о нестабильности чужеродной ДНК р16 в ЯесА* и РесА" клонах показывает, что характеристики нестабильности пДНК в клетках, экспрессирующих белок Лес А, практически не отличаются от характеристик, выявленных на «чистых» клетках линии А23. Тем не менее, процентное отношение стабильных и нестабильных ¡слонов, представленное на Рис. 7, имеет небольшой сдвиг в сторону нестабильных клонов у клеток, обладающих повышенной ГР за счет экспрессии белка Пес А. Однако решающего влияния на удаление интегрированной в геном чужеродной ДНК усиление ГР за счет

экспрессии белка RecA, по всей видимости, не оказывает. Среди нестабильных клоков удается выделить все три группы, различающиеся по динамике потери селективных признаков - f, р-1 и р-2.

контроль облучение, 600 Рад облучение, 1200 Рад

■ Р i

А23

контроль

А23 pATR4 Клан 847

+ ВИВЯ^И

Рис. 6. Визуализация повреждений ДНК клеток линий А23 и А23-847 после облучения рентгеновскими лучами с помощью метода Comet assay. Окраска DAPI: а, г - кометы класса 1, преобладают среди клеток, не подвергавшихся облучению; д - комета класса 2; б -к ом era класса 3; в — комета класса 4; е - комета класса 5.

Конструирование плазмиды р42_3-3, содержащей последовательности флангов интеграции, и ее анализ. Для определения влияния на стабильность интеграции пДНК геномных нуклеотидных последовательностей, окружающих места встраивания плазмиды в хромосому, был использован оригинальный подход. В его основе лежит конструирование «вторичной» плазмиды, включающей в себя фрагменты исходной плазмиды р16 и участки геномной ДНК, являющейся флангами места интеграции (Рне. 8). Для детального исследования был выбран клон 42 линии клеток китайского хомячка А23, трансфецированных плазмидой р 16. Этот клон характеризуется плавным ростом числа кл сто к-ре ве рта нто в, потерявших интегрированную в геном пДНК, На 70-е сутки после трансфекции доля таких ревертантов у клопа 42 достигает 54,7%. Для эксперимента с конструированием «вторичной» плазмиды были взяты клетки этого клона, ранее замороженные на 20-е сутки после трансфекции, когда доля ревертантов составляла только 1,8 % от общего числа клеток. В результате культивирования было получено 4,5*Ю6 клеток (3 флакона), и из них была выделена ДНК. Далее была проведена денатурация (кипячение в течение 5 минут) и разрезание на фрагменты с помощью ультразвука. Полученная смесь фрагментов геномной ДНК использовалась в качестве вектора для трансфекции в бактерии Е. coli, штамм К12. Изначально предполагалось, что некоторые фрагменты случайным образом разрезанной ДНК клеток клона 42 будут содержать участки интегрированной ДНК

р16 с тремя исследуемыми генами -NEO, ТК ВПГ и Amp, или, как минимум, только Amp и NEO. При попадании в клетку бактерии разрезанные ультразвуком

линейные фрагменты ДНК замыкаются в кольцо, образуя плазмидообразные конструкции. Так как в исходной плазмиде р16 для репликации в бактериальных клетках содержится вектор pTZ, включающий в себя ген устойчивости к ампициллину Amp, при селекции на ампициллине выживут и вырастут в колонии только те клетки, в которые попали, а затем замкнулись с образованием кольцевых плазмидных

конструкций фрагменты ДНК; содержащие вектор pTZ. Существует значительная вероятность, что с участком pTZ будут тесно сцеплены гены NEO и ТК ВПГ, входящие в состав р16. Такой вариант возможен, если эти гены при дроблении ДНК попали в тот же линейный фрагмент, что и вектор pTZ, и не были повреждены эндонуклеазами при трансфекции. В этом случае в состав получающейся кольцевой плазмиды также входят фланги геномной ДНК, окружающие место интеграции лДНК в хромосому клетки млекопитающего. Плазм и да, названная р42_3-3, оказалась удачной — она содержит все три селективных гена, и при ее трансфекции в клетки линии А23 вырастали устойчивые к G418 колонии.

Потеря из генома клеток линии А23 ДНК «вторичной» плазмиды. После выделения из бактерий полученная вторичная плазмида была использована в качестве вектора для трансфекции исходной линии клеток А23. Условия культивирования клеток, электропорации и последующей обработки были полиостью идентичны экспериментам с «обычной» трансфекцией плазмиды р 16. Основная цель этой части исследования была в определении возможности сохранения характера нестабильности, присущей «прародителю» плазмиды р42_3-3 клону 42, во всех клонах - вторичных трансфектаытах. Среди клонов, полученных в результате трансфекции клеток линии А23, преобладают

|DCT«6wnbHh4 Ш'~п ■ 1,-.: -.—.Л |

Рис. 7. Соотношение стабильных и нестабильных клонов среди клеток линии А23, трансфецированных плазм идам и р 16, pATR4 и совместно pATR4- pió. Слева показано распределение в исходной коллекции клопов А23-р 16, посередине - распределение по стабильности ДНК pATR4 в «чистых» клетках А23, справа - распределение по стабильности ДНК р 16 в клетках клона А23-847 (А23-pATR4, экспрессия белка RecA). '

дестабильные (Рис. 9). Эти данные говорят о сохранении генетического признака [(нестабильность интеграции чужеродной ДНК в геном клеток млекопитающих» в последовательности ДНК фланга места интеграции, включенной во вторичную плазмиду. Такой результат является веским аргументом в пользу гипотезы о том, что в процессе интеграции чужеродной ДНК нарушается локальная организация генетического материала и de novo возникает сайт нестабильности.

Определение пуклеотидиой последовательности флангов места интеграции в геном первоначальной платиды. Одним из наиболее привлекательных подходов при изучении плазмиды р42_3-3 является секвенирование той ее части, которая первоначально являлась частью генома клеток хомячка и оказалась флангами интеграции плазмиды р 16. Ситуация

ген vVUO - устойчивость к C4IH

ген ТК ВПГ - чувствитсль-J ноеть к 1йнцнклоннру

геи Atrift — устойчивость I ам пииплл*

хромосомы

____— О,

клетки линии А 23

пДНК, встроенная в хромосому

Селекция на G4LS, отбор отдельных клоков, янпл« ч стабильности интеграции нДНК ганцнкловцре и среде HAT для каждого клони

Выделение ДНК

í iapaiunвштс отдельною

нестабильного клоиа 42

ицр

Дробление ультразвуком

j Заморозка в í ; Анализ нестабильности с i

; жидком азоте i I построением графика :

электponoрация

Трансформация /:, colí смесыо раздробленной геномной ДНК содержащей фрагменты р!6

''"©-Ьг-1^ \ Выделение

uní \\ фланги | «вторнчиой» 1 плазмиды

«л Neo, ТК

rto полу1

геномной ДНК из места первоначальной интеграции pió.

i------------------"si

Селекция на ампициллине, выживают только бактерпн, включившие фрагмент ДНК, содержащий р 16 с участком флангов места интеграции

Рис. 8. Схема опыта^ополучению плазмиды, содержащей фрагменты флангов

несколько усложнялась отсутствием конкретной информации о том, в какую именно часть плазм иды включены фланговые последовательности.

По анализу рестрикцнонной картины плазмид р42_3-3 и р 16 было сделано предположение, что вставка фланговых геномных последовательностей

произошла сразу за геном ТК ВПГ. Исходя из этого предположения, были сконструированы праймеры для сиквенса. Один из праймеров, P4233R, оказался удачным, и была получена расшифровка «уклеотидной

последовательности, отличающаяся от последовательности исходной

плазмиды р1б, длиной 255 оснований.

Несмотря на обширность полученной информации, точного места локализации сайта интеграции пДНК в геноме определить не у далось. Это связано с тем, что геном китайского хомячка Mesocricetus auratus не секвенирован. Тем не менее, обнаружены обширные (до 30 нуклеотидов) области гомологии полученной последовательности с участками геномов других млекопитающих - мыши, человека, шимпанзе, макаки. Все участки геномов млекопитающих, с которыми у исследуемого фрагмента обнаружена гомология, представляют собой некодирующие области различной природы - копии функциональных генов, тандемные повторы. Подобные данные позволяют говорить о том, что плазмида р 16 интегрировалась в геном клетки-основательницы клона 42 в область гетерохроматина,

ОБСУЖДЕНИЕ

Использование ПЦР техники дало возможность подтвердить, что потеря селективных маркеров происходит именно благодаря физической потере интегрированной экзогенной ДНК, а не из-за подавления ее экспрессии. Сделанные количественные оценки частоты потерь, продемонстрировали значительную вариабильность описанного события в различных независимо полученных клонах клеток. Остается не ясным, однако, связана ли различная стабильность полученных клонов с разными местами интеграции их в геном или просто с количеством копий, первоначально встроившейся экзогенной ДНК.

Возможно, такое явление связано с интеграцией в геном сразу нескольких копий пДНК (Wilkie, Palm iter, 1987; Chan et al., 2001). Возможна также и

AM-016 KÜ гИ.

Л»*« (МШ . ■ ■ u

D стабильные И нестабигьнье

Рис. 9. Соотношение стабильных и нестабильных клонов линии клеток А23, тран сфециров а иных исходной члазмилой р 16 и ее производной р42_3-3.

для вирусной ДНК, причем амплификацией захватываются и фланкирующие участки хромосомы (Sambrook et al., 1980). Вероятный механизм такого явления -внехромосомная рекомбинация (Covarrubias et al., 1986).

В настоящее время наибольшую дискуссию вызывает влияние метилирования на стабильность интеграции искусственного вектора. Описывается наличие двух альтернативных систем: в одном случае инородная ДНК вырезается и выбрасывается из клетки за счет гиперметилирования промоторной области трансгена ДНК-метилазой Dnmtl (Chan et al., 2001), в другом случае снижается экспрессия внесенных генов при сохранении векторной ДНК в геноме (Palmer et al., 1991; Chen et al., 1998). Неоднократно показано, что после трансфекции как в культуры клеток, так и в зиготу трансгенных животных, введенная ДНК оказывается достаточно быстро метилированной de novo. Несмотря на некоторые данные, говорящие о снижении уровня экспрессии генов в интегрированных экзогенных областях генома за счет изменения характера метилирования при сохранении этих областей, наше исследование доказывает полное выбрасывание встроившейся химерной ДНК. При этом данные ПЦР анализа полностью совпадают с фенотипическими проявлениями наличия или потери клетками селективных маркеров. Таким образом, в нашем случае можно говорить именно о полном удалении инородной ДНК из генома клеток высших млекопитающих. Вполне вероятно, что опознавание таких фрагментов ДНК происходит при участии клеточной ДНК-метилазы Dnmtl. Изучая роль этого фермента в процессах мутагенеза, две группы исследователей (Chen et al., 1998; Chan et al., 2001) показали взаимно противоположные результаты - увеличение и уменьшение темпов делеции трансфецированного гена ТК ВПГ на модели Dnmtl эмбриональных стволовых клеток млекопитающих. На наш взгляд, возможны оба варианта, метилирование только обозначает область внедрения чужеродной ДНК в геном, а за ее удаление ответственны другие клеточные механизмы, в первую очередь гомологичная и негомологичная рекомбинация. По-видимому, степень такой стабильности и количество клеточных делений перед началом активного выброса клеткой инородной ДНК зависит от природы клеток, их физиологического состояния и количества копий встроенной пДНК. Такая версия совпадает с данными, полученными на различных культурах клеток и трансгенных мышах (Mark et al., 1992; Hunter, Gurney, 1994; Remus et al., 1999; Yamada et al., 1999).

В самом феномене удаления интегрированной в геном чужеродной ДНК нет ничего удивительного, у бактерий существует целых две системы по распознаванию и удалению такой ДНК, названные системами рестрикции-модификации типов I и II. Высказано предположение о существовании аналогичных систем и в клетках млекопитающих (Scrable, Stambrook, 1999). Полагают также, что при внедрении чужеродной ДНК возникают изменения в

укладке хромосомы и конденсации хроматина, присоединение неспецифичных лигандов вдоль таких измененных участков ДНК, что приводит к активации системы рестрикции-модификации типа I и удалению чужеродной ДНК из генома (Keatch et al., 2004).

По всей видимости, за интеграцию чужеродной ДНК в геном и ее последующую транскрипцию отвечают значительное число глобальных систем, вовлеченных в выполнение фундаментальных клеточных процессов жизнедеятельности. Сюда можно отнести ГР, НВК, внехромосомную рекомбинацию, транспорт ДНК в ядро, системы метилирования и ряд других. Аналогично, сразу несколько систем задействовано в механизмах опознавания и последующего удаления чужеродной ДНК из генома. Несмотря на практическое отсутствие эффекта действия усиления ГР за счет экспрессии бактериального белка RecA на динамику нестабильности интегрированной в геном пДНК, нельзя полностью исключать участие ГР в опознавании и удалении фрагментов такой ДНК из генома, особенно в течение первого клеточного цикла с момента интеграции.

В то же время получены аргументы, что основным фактором, влияющим на судьбу интегрированной в хромосому чужеродной ДНК, является нуклеотидная последовательность, окружающая место интеграции. В пользу этого говорит тесная сцепленность характера нестабильности с фрагментами флангов, окружающих первоначальное место интеграции.

Наиболее вероятным первоначальным проявлением реакции хромосомы на внедрение в нее чужеродной ДНК является изменение укладки генетического материала в районе места интеграции. После этого происходит опознавание и мечение «подозрительного» участка Sin3p или Esalp- зависимыми системами. Удаление может быть осуществлено по типу рестрикции-модификации (Scrable, Stambrook, 1999). Такая картина явления соответствует современным данным о динамике изменений в структуре хроматина в ответ на повреждения ДНК, например двуцепочечных разрывов (Moore, Krebs, 2004).

В результате анализа графиков потери интегрированной ДНК из генома клеток А23 (Рис. 2) можно предположить, что удаление чужеродной ДНК из генома осуществляется по закону зеркальной экспоненты е . Подобная закономерность наблюдается в ряде открытых физических и биологических систем (Климонтович, 1995). При этом константа времени т во всех трех типах потери оказывается равной одному значению - приблизительно 35 суток.

Наибольшее действие на усиление выбрасывания чужеродной ДНК из генома клеток линии А23 оказало использование плазмидной конструкции, содержащей геномные фланги места интеграции первоначальной плазмиды из нестабильного клона.

Настоящее исследование впервые показало на модели культуры клеток китайского хомячка А23 существование нестабильности интегрированной в геном ДНК плазмиды р16, произведена ее количественная оценка. Доказательства этого

Соматическяя клетке м лекопнти тощ и *

Рис. 10. Гипотетическая схема процессов, сопровождающих интергацию чужеродной ДНК в геном еомэтической клетки млекопитающих и ее последующее удаление из генома,

явления получены как на клеточном уровне - по устойчивости к селектирующим средам и чувствительности к ганцикловиру, так и на молекулярном уровне - с помощью амплификации областей чужеродной ДНК методом ПДР. Результаты данного исследования о потерях интегрированной в геном пДНК в целом совпадают с более ранними наблюдениями (Томилин, 1983; Глебов и др., 1985;

Murnane, Young, 1989; Doerfler et al., 1997), значительно расширяя и дополняя их, хотя и несколько различаются в деталях.

ВЫВОДЫ:

1. Интеграция чужеродной плазмидной ДНК в геном соматических клеток млекопитающих линий А23, F9 и Agl 1395 происходит как стабильно, так и нестабильно.

2. В случае нестабильной интеграции можно выделить три типа динамики потери селективных признаков: полная потеря на 90 сутки после трансфекции, и два типа частичной потери, статистически различающиеся темпами потери селективных признаков на 40 - 90 сутки эксперимента.

3. Ген бактериального белка Ree А, обеспечивающего проявление гомологичной рекомбинации у бактерий, дополненный нуклеотидной последовательностью сигнала транспорта в ядро и эукариотическим промотером, активно экспрессируется в клетках млекопитающих различных линий и не является токсичным для таких клеток.

4. По всей видимости, экспрессия бактериального белка Ree А в клетках млекопитающих не оказывает существенного влияния на стабильность существования интегрированной чужеродной ДНК в геноме таких клеток.

5. На основе использования обработанной ультразвуком совокупной геномной ДНК клеток млекопитающих в качестве вектора для трансфекции разработан подход по выделению и анализу последовательностей флангов сайта интеграции плазмидной конструкции.

6. Получены аргументы в пользу того, что влияние на стабильность интегрированной в геном клеток млекопитающих чужеродной плазмидной ДНК могут оказывать фланги сайта интеграции.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Ivanov A.V. Deleting of Foreign DNA from the Genome of Transformed Cells: A Novel Genom-Guarding Function. In: Plant production in 2025 - transgenic or ecological? Norway, As-NLH 2003. P. 53-56.

Иванов A.B., Бахланова И.В., Пантина P.A., Филатов M.B. Изучение нестабильности интеграции плазмидной ДНК в геном соматических клеток млекопитающих. Цитология, 2004. Т. 46, С. 740-747.

Иванов A.B., Филатов М.В. Особенности потери интегрированной плазмидной ДНК из генома соматических клеток млекопитающих. Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития. III ВОГиС. Москва, 6-12 июня 2004 г. Т. 2, С. 285. Ivanov A.V. Instability of Foreign DNA Integrated into the Genome of Transformed Cells. 45th Annual meeting of The American Society for Cell Biology. San Francisco, 2005, P. 347.

Иванов A.B. Изучение факторов, влияющих на гомологичную и негомологичную застройку экзогенной ДНК в геном соматических клеток млекопитающих. VII Санкт-Петербургская Ассамблея молодых ученых и специалистов. С-Петербург, 2002. С. 4647.

Отпечатано в типографии ПИЯФ РАН

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 478, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 14.12.2006 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Иванов, Андрей Владимирович

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Интеграция чужеродной ДНК в геном клеток млекопитающих.

1.2 Вопрос об экстрахромосомном существовании пДНКу млекопитающих.

1.3 Нестабильность интеграции чужеродной ДНК.

1.3.1 Нестабильность интеграции вирусной ДНК.

1.3.2 Нестабильность интеграции плазмидной ДНК.

1.3.3. Влияние копийности на интеграцию ДНК.

1.3.4 Влияние метилирования на интеграцию ДНК.

1.3.5. Проявление генетической нестабильности интегрированных

ДНК на модели трансгенных мышей.

1.4. Наиболее вероятный механизм нестабильности чужеродной ДНК -рекомбинация.

1.4.1. Гомологичная рекомбинация.

1.4.2. Гомологичная рекомбинация и таргетинг генов.

1.4.3. Различные проявления негомологичной рекомбинации.

1.5. Молекулярные механизмы рекомбинационных явлений.

1.5.1. Строение и биохимические свойства белка ЯесА.

1.5.2. Распространение семейства ЛесА-подобных белков.

1.5.3. Гомологи белка КесА у эукариот и их функции.

1.5.4. Другие белки, взаимодействующие с КесА/И.ас151, и необходимые для рекомбинации.

1.5.5. Белки 88В и ЯРА.

1.5.6. Белок 11ас154.

1.5.7. Белки В11СА1 и ВЯСА2.

1.5.8. Другие белки, способствующие рекомбинации.

1.5.9. Оверэкспрессия рекомбинантных белков в клетках млекопитающих.

1.5.10. Белки, осуществляющие негомологичное воссоединение концов ДНК.

1.5.11. Изменения в структуре хроматина, происходящие во время негомологичного воссоединения концов ДНК.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Культуры клеток.

2.2. Плазмиды, использованные в работе.

2.3. Электропорация; получение и селекция TIC клеток линии А23.

2.4. Анализ наличия трансгенной ДНК в клетках.

2.4.1. Выделение ДНК.

2.4.2. Подготовка геномной ДНК для использования в качестве вектора для трансфекции.

2.4.3. Анализ методом ПЦР.

2.4.4. Секвенирование ДНК.

2.5. Анализ экспрессии гена тимидинкиназы вируса герпеса.

2.6. Получение и анализ клонов клеток млекопитающих, экспрессирующих белок RecA.

2.6.1. Вестерн - блот.

2.6.2. Comet assay.

2.7. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Результаты исследования.

3.1. Изучение феномена нестабильности.

3.2. Доказательства действительности потери чужеродной ДНК из генома культивируемых клеток линии А23.

3.3. Проявление нестабильности интеграции чужеродной ДНК различных плазмидных конструкций на разных клеточных линиях

3.4. Поиск и исследование факторов, влияющих на нестабильность.

3.4.1. Облучение у-радиацией.

3.4.2. Влияние усиления гомологичной рекомбинации за счет экспрессии бактериального белка RecA.

3.4.2.1. Получение клеточных линий, экспрессирующих RecA.

3.4.2.2. Проверка наличия гена RecA в трансфецированных клетках и его экспрессии.

3.4.2.3. Проверка работоспособности белка RecA в эукариотических клетках: .облучение и Comet assay.

3.4.2.4. Нестабильность чужеродной пДНК в клетках, экспрессирующих RecA.

3.4.3. Конструирование плазмиды, содержащей последовательности флангов интеграции, и ее анализ.

3.4.3.1. Стратегия получения плазмиды, содержащей фланги места интеграции в геном плазмиды р!6.

3.4.3.2. Выбрасывание из генома клеток линии А

ДНК "вторичной" плазмидыр4233.

3.4.3.3. Определение нуклеотидной последовательности флангов места интеграции в геном первоначальной плазмиды.

Глава 4. Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование судьбы экзогенной ДНК, интегрированной в геном соматических клеток млекопитающих"

Актуальность проблемы:

Геном клеток высших эукариот находится под постоянным риском инвазии чужеродной ДНК. In vivo клетки млекопитающих продолжительное время контактируют с различными бактериями, вирусами и фрагментами их ДНК, что предполагает возможность горизонтального переноса генетической информации. В действительности, свидетельства о захвате и сохранении бактериальной ДНК в геноме млекопитающих достаточно ограничены (Scrable, Stambrook 1999; Doerfler et al., 2001). Практическое отсутствие остатков фрагментов бактериальной ДНК в геноме млекопитающих дают основания для предположения о наличии в их клетках высокоэффективной системы по защите собственного генома от приобретения нежелательной чужеродной ДНК. Экспериментально доказать наличие таких систем достаточно сложно, и исследования в этой области находятся на начальной стадии (Awadala, 2003). Несмотря на то, что подобные защитные системы были описаны для бактерий, простейших (Selker, 2003; Yao et al., 2003) и растений (Matzke et al., 2000), об их существовании у млекопитающих свидетельствуют лишь немногочисленные отрывочные данные (Hemmi et al., 2000; Pravtcheva, Wise, 2003; Pipes et al., 2005).

В сфере медицинских исследований большое значение имеет вопрос об особенностях интеграции в геном соматических клеток человека вирусов, в том числе и онкогенных. Кроме достаточно хорошо изученного момента интеграции вирусной ДНК в клеточный геном, остаётся плохо понятной дальнейшая судьба вирусной ДНК и ее взаимоотношения с системами поддержания стабильности генома (Doerfier et al., 1997).

Хорошо известно, что мутационные или делеционные события в резидентных генах клеток млекопитающих достаточно редки и, как правило, происходят с частотами не выше 1 на 1 ООО ООО клеточных делений, часто приводя к злокачественному перерождению клетки (Kopnin, 2000). Спонтанная же потеря гена в популяции перевиваемых клеток представляет собой практически невероятное событие. В то же время, есть достаточно старые наблюдения, что интегрированные в геном культивируемых клеток млекопитающих экзогенные плазмидные ДНК, несущие селективные гены, могут быть потеряны с частотами, варьирющими от 1 на 100 до 1 на 1000 000 на клеточное деление (Sandri-Goldin et al., 1981; Глебов, Абрамян, 19856). Отмечается, что при культивировании часто наблюдается спонтанная потеря искусственно интегрированных в геном селективных маркеров в процессе роста клеточных популяций. Возникает необходимость поиска объяснения наблюдаемому феномену удаления встроившейся чужеродной ДНК из генома клеток млекопитающих.

На начальной стадии исследования было предложено две основных гипотезы, объясняющие это явление:

1) Клетка млекопитающих может "узнавать" и удалять места интеграции чужеродной ДНК с помощью механизмов гомологичной рекомбинации за счет взаимодействия с гомологичной хромосомой или хроматидой;

2) Основное влияние на стабильность интегрированного в геном трансгена оказывают нуклеотидные последовательности флангов, окружающих сайт внедрения чужеродной ДНК в хромосому.

Цель исследования:

Целью данного исследования является демонстрация явления нестабильности интеграции чужеродной ДНК в геном соматических клеток млекопитающих на модели культур клеток, количественная характеристика этого явления для линии клеток китайского хомячка А23, поиск и изучение факторов, влияющих на удаление чужеродной ДНК из генома клеток млекопитающих.

Задачи исследования:

3) продемонстрировать функциональность модифицированного бактериального белка 11есА в клетках исследуемых линий;

Научная новизна:

На модели культур клеток продемонстрирован и впервые количественно описан феномен потери интегрированной чужеродной ДНК. Выявлено, что основным фактором, влияющим на такую нестабильность, являются фланги хромосомной ДНК, окружающие место интеграции плазмиды.

Показано, что бактериальный белок ЯесА, модифицированный сигналом ядерной локализации большого Т-антигена вируса БУ40, а также гиперрекомбиногенный белок 11есА-Х53, экспрессированные в клетках млекопитающих, функционально активны и приводят к некоторому уменьшению повреждений ДНК после облучения. Данная картина визуализирована методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (Comet assay). Установлено, что усиление процессов гомологичной рекомбинации с помощью экспрессии этих белков практически не влияет на нестабильность трансгенов.

Теоретическое и практическое значение результатов работы:

Это приобретает особую актуальность в случаях удаления из генома интегрированной ДНК провирусов, а также в случаях генной терапии различных заболеваний. Хотя данное исследование проведено на культурах клеток, явление нестабильности введенной ДНК проявляется и на трансгенных животных (Scrable, Stambrook, 1999; Pravtcheva, Wise, 2003), что также необходимо учитывать при проведении соответствующих экспериментов.

Кроме того, настоящая работа нарушает "классическую" концепцию, согласно которой трансген после интеграции в геном рассматривается как часть хозяйской хромосомной ДНК, неотличимой от собственных генов организма.

Разработана стратегия оценки степени нестабильности в динамике во время культивирования клеток млекопитающих in vitro.

Положения, выносимые на защиту:

1) На модели культуры клеток А23 и плазмиды р 16 наблюдается явление направленного удаления чужеродной ДНК, предварительно интегрированной в геном.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Иванов, Андрей Владимирович

Выводы:

1. Интеграция чужеродной плазмидной ДНК в геном соматических клеток млекопитающих линий А23, F9 и Ag 11395 происходит как стабильно,так и нестабильно.

3. Ген бактериального белка RecA, обеспечивающего проявление гомологичной рекомбинации у бактерий, дополненный нуклеотидной последовательностью сигнала транспорта в ядро и эукариотическим промотером, активно экспрессируется в клетках млекопитающих различных линий и не является токсичным для таких клеток.

4. По всей видимости, экспрессия бактериального белка RecA в клетках млекопитающих не оказывает существенного влияния на стабильность существования интегрированной чужеродной ДНК в геноме таких клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванов, Андрей Владимирович, Санкт-Петербург

1. Алексеев А.А. Структурно-функциональный анализ белка RecA у Escherichia coli. О роли С-концевого домена белка в рекомбинантной реакции.: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Гатчина, 1995. 24 с.

2. Гвоздев В.А. Гетерохроматин. Структура, молекулярная эволюция и регуляторные взаимодействия // Проблемы и перспективы молекулярной генетики. М.: Наука, 2003. - Т. 1. - С. 15-27.

3. Гинкул Л.Б. Влияние трансгенеза на неопластический рост и количественные полигенные признаки у мышей.: Автореф. дис. . канд. биол. наук. СПб, 2003. 24 с.

4. Глебов O.K., Абрамян Д.С. Генетическая трансформация соматических клеток. VII. Потеря трансформантного фенотипа сопровождается как стабильными, так и нестабильными изменениями в ДНК // Цитология. -19856. Т. 27, № 7. - С. 797-804.

5. Гривенников И.А., Мануйлова Е.С. Эмбриональные стволовые клетки в изучении функции генов в процессах дифференцировки и развития // Проблемы и перспективы молекулярной генетики. М.: Наука, 2003. - Т. 1. -С. 290-306.

6. Калинин B.JI. Введение в молекулярную вирусологию. СПб.: Из-во СПбГТУ, 2002. - 302 с.

7. Кассандрова О.Н., Лебедев В.В. Обработка результатов измерений. -М.: Наука 1970.-411 с.

8. Климонтович Ю. Статистическая теория открытых систем. М.: Янус 1995.-624 с.

9. Николаев А.И. Автономные трансгены и перспективы генной терапии // Проблемы и перспективы молекулярной генетики. М.: Наука, 2003. - Т. 1. -С. 218-247.

10. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. СПб.: Изд-во СПбГТУ, 2002. - 522 с.

11. Тарантул В.З. Таргетинг генов как современный подход к изучению их функции // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1996. -№2.-С. 2-13.

12. Тимченко H.A., Щербакова О.Г., Крутяков В.М., Филатов М.В. Автономная репликация плазмид, содержащих фрагменты ДНК из альфа полимеразного комплекса печени крысы // Мол. биол. 1990. - Т. 24, № 3. -С. 814-823.

13. Томилин Н.В. Генетическая стабильность клетки. Л.: Наука, 1983.156 с.

14. Томилин Н.В. Репарация двунитевых разрывов ДНК и стабильность хромосом в клетках высших эукариот // Бреслировские чтения. СПб., 2002. - С. 70-83. Редактор В.А. Ланцов, 322 с.

15. Херрингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М.: Мир, 1999. - 558 с.

16. Щербакова О.Г. Изучение гомологичной и негомологичной интеграции экзогенной ДНК в геном соматических клеток млекопитающих.: Автореф. дис. . канд. биол. наук. СПб, 2000. 26 с.

17. Adzuma K. Stable synapsis of homologous DNA molecules mediated by the Escherichia coli RecA protein involves local exchange of DNA strands // Genes, and Develop. 1992. - Vol. 6, № 9. - P. 1679-1694.

18. Aguilera A. Double-strand break repair: are Rad51/RecA-DNA joints barriers to DNA replication? // Trends in Genetics. 2001. - Vol.17, № 6. - P. 318-321.

19. Aigner B., Fleischmann M., Muller M., Brem G. Stable long term germ-line transmission of transgene integration sites in mice // Transgenic Research. 1999. -Vol. 8, № 1. - P. 1-8.

20. Alexeev A., Mazin A., Kowalczykowski S.C. Rad54 protein possesses chromatin-remodeling activity stimulated by the Rad51-ssDNA nucleoprotein filament//Nature Struct. Biol. 2003. - Vol. 10, №3,-P. 182-186.

21. Allen C., Halbrook J., Nickoloff J.A. Interactive competition between homologous recombination and non-homologous and joining // Molecular Cancer Res. 2003. - Vol. 1, № 12. - P. 913-920.

22. Anderson L.K., Offenberg H.H., Verkuijlen W.M.H.C., Heyting C. RecA-like proteins are components of early meiotic nodules in lily // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94, № 13. - P. 6868-6873.

23. Aravind L., Walker D.R., Koonin E.V. Conserved domains in DNA repair proteins and evolution of repair systems // Nucleic Acids Res. 1999. - Vol. 27, №5.-P. 1223-1242.

24. Asefa B., Kauler P., Cournoyer D., Lehnert S., Chow T.Y. Genetic analysis of the yeast NUD1 endo-exonuclease: a role in the repair of DNA double-strand breaks // Curr. Genet. 1998 - Vol. 34, № 5. - P. 360-367.

25. Awadala P. The evolutionary genomics of pathogen recombination 11 Nature Rev. Genetics. 2003. - Vol. 4, № 1. - P. 50-60.

26. Baitin D.M., Zaitsev E.N., Lanzov V.A. Hyper-recombinogenic RecA protein from Pseudomonas aeruginosa with enhanced activity of its primary DNA binding site//J. Mol. Biol. 2003. - Vol. 328, № l.-P. 1-7.

27. Bakhlanova I.V., Ogawa T., Lanzov V.A. Recombinogenic activity of chimeric recA genes (Pseudomonas aeruginosa/Escherichia coli): A search for RecA Protein regions responsible for this activity // Genetics. 2001. - Vol. 159, -P. 7-15.

28. Bergerat A., de Massy B., Gadelle D., Varoutas P., Nicolas A., Forterre P. An atypical topoisomerase II from Archaea with implications for meiotic recombination //Nature. 1998. - Vol. 386, № 6623. - P. 414-417.

29. Bishop J.O., Smith P. Mechanism of chromosomal integration of microinjected DNA // Mol. Biol. Med. 1989. - Vol. 6, № 4. - P. 283-298.

30. Bradley A., Evans M., Kaufman M., Robertson E. Formation of germ line chimeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines // Nature. 1984. - Vol. 309, № 5965.-P. 255-256.

31. Brendel V., Brocchieri L., Sandler S.J., Clark A.J., Karlin S. Evolutionary comparisons of RecA-like proteins across all major kingdoms of living organisms //J. Mol. Evol.- 1997.-Vol. 44, P. 528-541.

32. Brenneman M.A., Wagener B.M., Miller C.A., Allen C., Nickoloff J.A. XRCC3 controls the fidelity of homologous recombination: roles for XRCC3 in late stages of recombination // Molecular Cell. 2002. - Vol. 10, № 2. - P. 387395.

33. Broday L., Lee Y.-W., Costa M. 5-Azacytidine induces transgene silencing by DNA methylation in Chinese hamster cells // Mol. Cell. Biol. 1999. - Vol. 19, №4.-P. 3198-3204.

34. Burma S., Chen B.P., Murphy M., Kurimasa A., Chen D.J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breakes // J. Boil. Chem. 2002. - Vol. 276, № 45. - P. 42462-42467.

35. Burnett B., Rao B.J., Jwang B., Reddy G., Radding C.M. Resolution of the three-stranded recombination intermediate made dy recA protein. An essential role of ATP hydrolysis // J. Mol. Biol. 1994. - Vol. 238, № 4. - P. 540-554.

36. Camenisch G., Gruber M., Donogo G. A polyoma-based episomal vector efficiently expresses exogenous genes in mouse embryonic stem sell // Nucl. Acids Res. 1996. - Vol. 24, № 19. - P. 3707-3713.

37. Cao J., Combs C., Jagendorf A.T. The chloroplast-located homolog of bacterial DNA recombinase // Plant Cell Physiol. 1997. - Vol. 38, № 12. - P. 1319-1325.

38. Capecchi M.R. Generating mice with targeted mutations // Nature Medicine. 2001. - Vol. 7, № 10. - P. 1086-1090.

39. Chan M.F., van Amerongen R., Nijjar T., Cuppen E., Jones P.A., Laird P.W. Reduced rates of gene loss, gene silencing, and gene mutation in Dnmt I-deficient embryonic stem cells // Mol. Cell. Biol. 2001. - Vol. 21, № 22. - P. 7587-7600.

40. Chen C., Okayama H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA // Mol. Cell. Biol. 1987. - Vol. 7, № 8 - P. 2745-2752.

41. Chen R.Z., Petterson U., Beard C., Jackson-Grusby L., Jaenisch R. DNA hypomethylation leads to elevate mutation rates // Nature. 1998. - Vol. 395, № 6697. - P. 89-93.

42. Clark S.J., Harrison J., Frommer M. CpNpG methylation in mammalian cells // Nature Genetics. 1995. - Vol. 10, № l.-P. 20-27.

43. Cooper M.J., Lippa M., Payne J.M. Safety-modified episomal vectors for human gene therapy // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94, № 12. - P. 6450-6455.

44. Covarrubias L., Nishida Y., Mintz B. Early postimplantation embryo lethality due to DNA rearrangements in a transgenic mouse strain // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. - Vol. 83, № 16. - P. 6020-6024.

45. Cox M.M., Battista J.R. Deinococcus radiodurans the consummate survivor // Nat Rev Microbiol. - 2005. - Vol. 3, № 11. - P. 882-892.

46. Culver K.W. Gene Therapy: A handbook for Physicians. N.Y.: May Ann Liebert Inc. Publ., 1994,- 117 p.

47. D'Adda D.I., Fagagna F., Hande M.P., Tong W.M., Lansdorp P.M., Wang Z.Q., Jackson S.P. Function of Poly(ADP-ribose) polymerase in controlling telomere length and chromosomal stability // Nature Genetics. 1999. - Vol. 23, № 1. - P. 76-80.

48. D'Amours D., Desnoyers S., D'Silva I., Poirier G.G. Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions // Biochemical Journal. 1999. -Vol. 342,№2.-P. 249-268.

49. D'Amours D., Jackson S.P. The Mrel 1 complex: at the crossroads of DNA repair and checkpoint signaling // Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 2002. - Vol. 3, № 5.-P. 317-327.

50. Dangl J.L., Jones J.D.G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection // Nature. 2001. - Vol. 411, № 6839. - P. 826-833.

51. Deng C., Capecchi M. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus // Mol. Cell. Biol. 1992. - Vol.12, № 8. - P. 3365-3371.

52. Dernburg A., McDonald K., Moulder G., Barstead R., Dresser M.E., Villeneuve A. Meiotic recombination in C. elegance initiates by a concerved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis // Cell. -1998. Vol. 94, № 3. - P.387-398.

53. Doerfier W., Schubbert R., Heller H., Kammer С., Hilger-Eversheim К., Knoblauch M., Remus R. Integration of foreign DNA and its consequences in mammalian systems // Trends in Biotech. 1997. - Vol. 15, № 8. - P. 297-301.

54. Doerfier W., Hohlweg U., Müller К., Remus R., Heller H., Hertz J. Foreign DNA Integration — Perturbations of the Genome — Oncogenesis // Ann. New York Acad. Sei. 2001. - Vol. 945, - P. 276-288.

55. Dougherty W.G., Parks T.D. Transgenes and gene suppression: telling us something new? // Curr. Opin. Cell Biol. 1995. - Vol. 7, № 3. - P. 399-405.

56. Dresser M.E., Ewing D.J., Conrad M.N., Dominguez A.M., Barstead R., Jiang H., Kodadek T. DMC1 functions in a Saccharomyces cerevisiae meiotic pathway that is largely independent of the RAD51 pathway // Genetics. 1997. -Vol. 147, №2.-P. 533-544.

57. Dressler D., Potter H. Molecular mechanism in genetic recombination // Ann. Rev. Biochem. 1982. - Vol. 51,- P. 727-761.

58. Eisen J.A., Hanawalt P.C. A phylogenomic study of DNA repair genes, proteins, and processes // Mutat Res. 1999. - Vol. 435, № 3. - P. 171-213.

59. Etkin L.D., Pearman В., Roberts M., Bektesh S.L. Replication, integration and expression of exogenous DNA injected into fertilized eggs of Xenopus laevis II Differentiation. 1984. - Vol. 26, № 3. - P. 194-202.

60. Felgner P.L., Gadek T.R., Holm M., Roman R., Chan H.W., Wenz M., Northrop J.P., Ringold G.M., Danielsen M. Lipofection: a highly efficient, lipidmediated DNA-transfection procedure // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1987. Vol. 84, №21.-P. 7413-7417.

61. Fernandes-Capetillo O., Nussenzweig A. Linking histone deacetylation with the repair of DNA breaks // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 2004. Vol. 101, № 6. - P. 1427-1428.

62. Filatov M. V., Pantina R.A., Noskin L.A. Methods for registration of spontaneous DNA instability in mammalian cells // Mutat Res. 1998. Vol. 403, № 1-2.-P. 95-101.

63. Flores-Rozas H., Kolodner R.D. Links between replication, recombination and genome instability in eukaryotes // Trends in Biohem. Sei. 2000. - Vol. 25, №4.-P. 196-200.

64. Frank E.G., Hauser J., Levine A.S., Woodgate R. Targeting of the UmuD, UmuD', and MucA' mutagenesis proteins to DNA by RecA protein // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1993.-Vol. 90, № 17.-P. 8169-8173.

65. Friedman D.I., Court D.L. Bacteriophage lambda: alive and well and still doing its thing // Curr. Opin. Microbiol. 2001. - Vol. 4, № 2. - P. 201-207.

66. Galande S., Kohwi-Shigematsu T. Poly(ADP-ribose) polymerase and Ku autoantigene form a complex and synergistically bind to matrix attachment sequences // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274, № 29. - P. 20521-20528.

67. Garrick D., Fiering S., Martin D.I., Whitelaw E. Repeat-induced gene silencing in mammals //Nat. Genet. 1998. - Vol. 18, № 1. - P. 56-59.

68. Gersten D.M. Gel Electrophoresis: Proteins: Essential Techniques Series. -: John Wiley & Sons Ltd., 1996. 223 p.

69. Godthelp B.C., Wiegant W.W., A.van Duijn-Goedhart, Schärer O.D., P.P. W. van Buul, Kanaar R., Zdzienicka M.Z. Mammalian RAD51C contributes to

70. DNA cross-link resistance, sister chromatid cohesion and genomic stability // Nucleic Acids Research. 2002. - Vol. 30, № 10. - P. 2172-2182.

71. Goers J. Immunochemical Techniques. Laboratory Manual. : Academic Press, 1993.-392 p.

72. Goudelock D.M., Jiang K., Pereira E., Russell B., SanchezY. Regulatory interactions between the checkpoint kinase Chkl and the proteins of the DNA-dependent protein kinase complex // J. Biolog. Chem. 2003. - Vol. 278, № 32. -P. 29940-29947.

73. Haber J.E. A super new twist on the initiation of meiotic recombination // Cell. 1997. - Vol. 89, № 2. - P. 163-166.

74. Hamada T., Sasaki H., Seki R., Sakaki Y. Mechanism of chromosomal integration of transgenes in microinjected mouse eggs: sequence analysis of genome-transgene and transgene- transgene janctions at two loci // Gene. 1993. -Vol. 128,-P. 197-202.

75. Hamel W., Zirkel D., Mehdorn H.M., Westphal M., Israel M.A. (E)-5-(2-bromovinyl)-2'-deoxyuridine potentiates ganciclovir-mediated cytotoxicity on herpes simplex virus-thymidine kinase-expressing cells // Cancer Gene Ther. -2001.-Vol. 8, №5.-P. 388-396.

76. Hasty P., Ramirez-Solis R., Krumlauf R., Dradley A. Introduction of a subtle mutation into the Hox-2.6 locus in embryonic stem cells // Nature. 1991. -Vol. 350, №6315.-P. 243-246.

77. Hayday A., Ruley H.E., Fried M. Structural and biological analysis of integrated polioma virus DNA and its adjacent host sequences cloned from transformed rat cells // J. Virol. 1982. - Vol. 44, №1.-P. 67-77.

78. Hejnar J., Elleder D., Hajkova P., Walter J., Blazkova J., Svoboda J. Demethylation of host-cell DNA at the site of avian retrovirus integration // Bioch. and Biophysical Res. Comm. 2003. - Vol. 311, № 3. - P. 641-648.

79. Hemmi H., Takeuchi O., Kawai T., Kaisho T., Sato S., Sanjo H., Matsumoto M., Hoshino K., Wagner H., Takeda K., Akira S. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA // Nature. 2000. - Vol. 408, № 6813. - P. 740-745.

80. Henderson G., Simon P. Processing of DNA prior to illegitimate recombination in mouse cells // Mol. Cell Biol. 1997. Vol. 17, № 7. - P. 37793785.

81. Hendrickson E. Cell-cycle regulation of mammalian DNA double-strand break repair // Am. J. Hum. Genet. 1997. - Vol. 61, № 4. - P. 795-800.

82. Henikoff S., Matzke M.A. Exploring and explaining epigenetic effects // Trends in Genet. 1997. - Vol. 13, № 8. - P. 293-295.

83. Holliday R. A mechanism for gene conversion in fungi // Genet. Res. -1964. Vol. 5, № 2. - P. 282-304.

84. Holmes-Son M.L., Appa R.S., Chow S.A. Molecular genetics and target site specificity of retroviral integration // Adv. Genet. 2001. - Vol. 43,- P. 33-69.

85. Horvathova E., Dusinska M., Shaposhnikov S., Collins A.R. DNA damage measured in different genomic regions using the comet assay with fluorescent in situ hybridization // Mutagenesis. 2004. - Vol. 19, № 4. - P. 269-276.

86. Hough-Evans B.R., Britten R.J., Davidson E.H. Mosaic incorporation and regulated expression of exogenous gene in the sea urchin embryo // Developmental Biology. 1988. - Vol. 129, - P. 198-208.

87. Hsieh C-L. Dynamics of DNA methylation pattern // Curr. Opin. Genet. Dev. 2000. - Vol. 10, № 2. - P. 224-228.

88. Hsu H-L., Gilley D., Blackburn E.H., Chen D.J. Ku is associated with the telomere in mammals // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96, № 22. - P. 12454-12458.

89. Jazayeri A., McAinsh A.D., Jackson S.P. Saccharomyces cerevisiae Sin3p facilitates DNA double-strand break repair // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2004. -Vol. 101, № 6. - P. 1544-1649.

90. Jeddeloh J.A., Stokes T.L., Richards E.J. Maintenace of genomic methylation requires a SWI2/SNF2-like protein // Nature Genet. 1999. - Vol. 22, № l.-P. 94-97.

91. Kalderon D., Roberts B., Richardson W., Smith A. A short amino acid sequence able to specify nuclear location // Cell. 1984. - Vol. 39, № 3 Pt 2. - P. 499-509.

92. Kanaar R., Hoeijmakers J.H., van Gent D.C. Molecular mechanisms of DNA double-strand break repair // Trends in Cell Biol. 1998. - Vol. 8, № 12. - P. 483489.

93. Kang Y-K., Park J.S., Lee C-S., Yeom Y.I., Chung A-S., Lee K-K. Efficient integration of short intersperspersed element-flanked forein DNA via homologous recombination // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274, № 51. - P. 36558- 36591.

94. Karran P. DNA double strand break repair in mammalian cells // Curr. Opin. Genet. Dev. -2000. Vol. 10, №2.-P. 144-150.

95. Kass S.U., Pruss D., Wolffe A.P. How does DNA methylation repress transcription? // Trends in Genet. 1997. - Vol. 13, № 11. - P. 444-449.

96. Keeney S., Gitropux C., Kleckner N. Meiosis-specific DNA double-strand breaks are catalyzed by Spoil, a member of widely conserved protein family // Cell. 1997. - Vol. 88, № 3. - P. 375-84.

97. Kido M., Yoneda Y., Nakanishi M., Tsuyshi U., Okada Y. Escherichia coli RecA protein modified with a nuclear location signal binds to chromosomes in living mammalian cells // Exp. Cell Res. 1992. - Vol. 198, № 1. - P. 107-114.

98. Kopnin B.P. Targets of oncogenes and tumor suppressors: key for understanding basic mechanisms of carcinogenesis // Biochemistry (Moscow). -2000.-Vol. 65, № l.-P. 2-27.

99. Kowalczykowski S.C. Initiation of genetic recombination and recombination-dependent replication // Trends in Biohem. Sci. 2000. - Vol. 25, №4.-P. 156-165.

100. Krejci L., Chen L., Van Komen S., Sung P., Tomkinson A. Mending the break: two DNA double-strand break repair machines in eukaryotes // Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 2003. - Vol. 74, - P. 159-201.

101. Kurumizaka H., Ikawa S., Nakada M., Eda K., Kagawa W., Takada M., Takeda S., Yokoyama S., Shibata T. Homologous-pairing activity of the human DNA-repair proteins Xrcc3-Rad51C // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98,№ 10.-P. 5538-5543.

102. Maeshima K., Morimatsu K., Shinohara A., Horii T. RAD51 homologues in Xenopus laevis: two distinct genes are highly expressed in ovary and testis // Gene. 1995.-Vol. 160, №2.-P. 195-200.

103. Mahajan K.N., Gangi-Peterson L., Sorscher D.H., Wang J., Gathy K.N., Mahajan N.P., Reeves W.H., Mitchell B.S. Association of terminal deoxynucleotidyl transferase with Ku. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96,№24.-P. 13926-13931.

104. Manivasakam P., Schiestl R.H. Nonhomologous end joining during restriction enzyme-mediated DNA integration in Saccharomyces cerevisiae 11 Molecular and Cellular Biology. 1998. - Vol. 18, № 3. - P. 1736-1745.

105. Mansour S.L., Thomas K.R., Capecchi M.R. Distruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embrio-derived stem sell: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes // Nature. 1988. - Vol. 336, № 6197. - P. 348353.

106. Martin T., Parker S.E., Hedstrom R., Le T., Hoffman S.L., Norman J., Hobart P., Lew D. Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramascular injection // Human Gene Therapy. 1999. - Vol. 10,№5.-P. 759-768.

107. Marvo S.L., King S.R., Jaskunas S.R. Role of short regions of homology in intermolecular illegitimate recombination events // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1983. Vol. 80, № 9. - P. 2452-2456.

108. Matsuyama A., Shiraishi T., Trapasso F., Kuroki T., Alder H., Mori M., Huebner K., Croce C.M. Fragile site orthologs FHIT/FRA3B and Fhit/Fral4A2:

109. Evolutionarily conserved but highly recombinogenic // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -2003.-Vol. 100, №25.-P. 14988-14993.

110. Matzke M.A., Mette M.F., Matzke A.j. Transgene silencing by the host genome defense: implications for the evolution of epigenetic control mechanisms in plants and vertebrates // Plant Mol. Biol. 2000. - Vol. 43, № 2-3. - P. 401415.

111. Mazin A.V., Alexeev A.A., Kowalczykowski S.C. A novel function of Rad54 protein. Stabilization of the Rad51 nucleoprotein filament // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, № 16. - P. 14029-14036.

112. McBurney M.W., Fournier S., Schmidt-Kastner P.K., Craig J. Unstable integration of ttransfected DNAs into embrional carcinoma cells // Somat. Cell Mol. Genet. 1994. - Vol. 20, № 6. - P. 529-540.

113. Minton K., Daly M. A model for repair of radiation-induced DNA doublestrand breaks in the extreme radiophile Deinococcus radioduram II BioEssays. -1995. Vol. 17, № 5. - P. 457-464.

114. Morrison C., Takeda S. Genetic analysis of homologous DNA recombination in vertebrate somatic cells // Inter. J. Biochem. Cell Biol. 2000. -Vol. 32,№8.-P. 817-831.

115. Muller K., Heller H., Doerfler W. Foreign DNA integration: genome-wide perturbations of methylation and transcription in the recipient genomes // J. Biol. Chem.-2001.-Vol. 276, № 17.-P. 14271-14278.

116. Mullis K.B., Fallona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction // Methods Enzymol. 1987. - Vol. 155. - P. 335-350.

117. Murnane J.P. Influence of cellular sequences on instability of plasmid integration sites in human cells // Somatic Cell and Molecular Genetics. 1990. -Vol. 16, №3,- P. 195-209.

118. Murnane J.P., Young B. Nucleotide sequence analysis of novel functions near an unstable integrated plasmid in human cells // Gene. 1989. - Vol. 84, № 1. -P. 201-205.

119. Murnane J.P., Yu L. Acquision of telomere repeat sequences by transfect DNA integrated at the sote of a chromosome break // Mol. Cell Biol. 1993. -Vol. 13, №2.-P. 977-983.

120. Namsaraev E.A., Baitin D.M., Bakhlanova I.V., Alexeyev A.A., Ogawa H. Biochemical basis of of hiper-recombinogenic activity of Pseudomonas aeruginosa RecA protein in Escherichia coli cells // Mol. Microbiol. 1998. -Vol. 27, № 4. - P. 727-738.

121. Neale M., Ramachandran M., Trelles-Sticken E., Scherthan H., Goldman A.S. Wild-type levels of Spoil-induced DSBs are required for normal singlestrand resection during meiosis // Mol. Cell. 2002. - Vol. 9, № 4. - P. 835-846.

122. Ng H-H., Bird A. DNA methylation and chromatin modification // Cur. Opinion Genet and Develop. 1999. - Vol. 9, № 2. - P. 156-163.

123. Nielsen T.O., Cossons N.H., Zannis-Hadjopoulos M., Price G.B. Circular YAC vectors containing short mammalian origin sequences are maintained under selection as HeLa episomes // J. Cell Biochem. 2000. - Vol. 76, № 4. - P. 674685.

124. Oberle I., Rousseau F., Heitz D., Kretz C., Devys D., Hanauer A., Boue J., Bertheas M.F., Mandel J.L. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome // Science. 1991. - Vol. 252, № 5010.-P. 1097-1102.

125. Palmer T.D., Rosman G.L., Osborne W.R.A., Miller D. Genetically modified skin fibroblasts persist long after transplantation but gradually inactivateintroduced genes // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol. 88, № 4. - P. 13301334.

126. Paul R., Dalibart R., Lemoine S., Lestienne P. Expression of E. coli RecA targeted to mitochondria of human cells // Mutat. Res. 2001. - Vol. 486, № 1. -P. 11-19.

127. Paull T.T, Gellert M. Nbsl potentiates ATP-driven DNA unwinding and endonuclease cleavage by the Mrel 1/Rad50 complex // Genes and Development. -1999. Vol. 13, № 10. - P. 1276-1288.

128. Paull T.T., Rogakou E.P., Yamazaki V., Kirchgrssner C.U., Gellert M., Bonner W.M. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage // Curr. Biol. 2000. - Vol. 10, № 15. - P. 886895.

129. Pecina A., Smith K.N., Mezard C., Murakami H., Ohta K., Nicolas A. Targeted stimulation of meiotic recombination // Cell. 2002. - Vol. 111, № 2. -P. 173-184.

130. Pellegrini L., Yu D.S., Lo T., Anand S., Lee M., Blundell T.L., Venkitaraman A.R. Insights into DNA recombination from the structure of a RAD51-BRCA2 complex //Nature. 2002. - Vol. 420, № 6913. - P. 287-293.

131. Peruccho M., Hanahan D., Wigler M. Genetic and physical linkage of exogenous sequences in transformed cells // Cell. 1980. - Vol. 22, № 1 Pt 1. - P. 309-317.

132. Petrini J.H., Bressan D.A., Yao M.S. The Rad52 epistatic group in mammalian double strand break repair // Semin. Immunol. 1997. - Vol. 9, № 3. -P. 181-188.

133. Petukhova G., Stratton S.A., Sung P. Single strand DNA binding and annealing activities in the yeast recombination factor Rad59 // J. Biol. Chem. -1999. Vol. 274, № 48. - P. 33839-33842.

134. Piechaczek C., Fetzer C., Baiker A. A vector based on SV 40 origin of replication and chromosomal S/MARs replicates episomally in CHO cells // Nucl. Acids Res. 1999. - Vol. 27, № 2. - P. 426-428.

135. Pipes B.L., Vasanwala F.H., Tsang T.C., Zhang T., Luo P., Harris D.T. Brief heat shock increases stable integration of lipid-mediated DNA transfection // BioTechniques 2005. - Vol. 38, № 1. - P. 48-52.

136. Pravtcheva D.D., Wise T.L. Transgene instability in mice injected with an in vitro methylated Igf2 gene // Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. of Mutagenesis. -2003. - Vol. 529, № 1-2. - P. 35-50.

137. Reich C.I., McNeil L.K., Brace J.L., Brucker J.K., Olsen G.J. Archaeal RecA homologues: different response to DNA-damaging agents in mesophilic and thermophilic Archaea // Extremophiles. 2001. - Vol. 5, № 4. - P. 265-275.

138. Reiss B.M., Klemm M., Kosak H., Schell J. RecA protein stimulates homologous recombination in plants // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1996. - Vol. 93, № 7.-P. 3094-3098.

139. Reiss B., Kosak H., Klemm M., Schell J. Targeting of a functional Escherichia coli RecA protein to the nucleus of plant cells // Mol. Gen.Genet. -1997. Vol. 253, № 6. - P. 695-702.

140. Remus R., Kämmer C., Heller H., Schmitz B., Schell G., Doerfler W. Insertion of foreign DNA into an established mammalian genome can alter the methylation of cellular DNA sequences // J. Virol. 1999. - Vol. 73, № 2. - P. 1010-1022.

141. Roca A., Cox M. RecA protein: structure, function, and role in recombinational DNA repair // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1997. - Vol. 56,-P. 129-223.

142. Rogakou E.P., Nieves-Niera W., Boon C., Pommier Y., Bonner W.M. Initiation of DNA fragmentation during apoptosis induces phosphorilation of histone H2AX at serine 139 // J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275, № 13. - P. 93909395.

143. Rogakou E.P., Pilch D.R., Orr A.H., Ivanova V.S., Bonner W.M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorilation on serine 139 // J. Boil. Chem. 1998. - Vol. 273, № 10. - P. 5858-5868.

144. Roth, D., J. Wilson. Relative rates of homologous and nonhomologous recombination in transfected DNA // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. - Vol. 82, № 10.-P. 3355-3359.

145. Sambrook J., Botchan M., Hu S.L., Mitchison T., Stringer J. Integration of viral DNA sequences in cells transformed by adenovirus 2 or SV40 // Proc. R LondBBiol Sci. 1980.-Vol. 210, № 1180.-P. 423-435.

146. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - 482 p.

147. Sandler S.J, Satin L.H, Samra H.S, Clark A.J. recA-like genes from three Archaean species with putative protein products similar to Rad51 and Dmcl proteins of the yeast Saccharomyces cerevisiae II Nucleic Acids Res. 1996. -Vol. 24, № 11.-P. 2125-2132.

148. Sandri-Goldin R.M, Goldin A.L, Levine M, Glorioso J.C. High-frequency transfer of cloned Herpes Simplex Virus Type 1 sequences to mammalian cells by protoplast fusion // Mol. Cel. Biol. 1981. - Vol.1, № 8. - P. 743-752.

149. Saxon P.J., Srivatsan E.S., Leipzig V., Sameshima J.H., Stanbridge E.J. Selective transfer of individual human chromosomes to recipient cells // Mol. Cel. Biol. 1985,-Vol. 5, № l.-P. 140-146.

150. Schiestl R.H., Zhu J., Petes T.D. Effects of mutations in genes affecting homologous recombination on restriction enzyme-mediated and illegitimate recombination in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cel. Biol. 1994. - Vol.14, № 7.-P. 4493-4500.

151. Scrable H., Stambrook P.J. A genetic program for deletion of foreign DNA from the mammalian genome // Mutat. Res. 1999. - Vol. 429, № 2. - P. 225-237.

152. Selker E.U. A Self-help guide for a trim genome // Science. 2003. - Vol. 300,№ 5625.-P. 1517-1518.

153. Shcherbakova O.G., Lanzov V.A., Ogawa H., Filatov M.V. Overexpression of bacterial RecA protein stimulates homologous recombination in somatic mammalian cells // Mutat. Res. 2000. - Vol. 459, № 1. - P. 65-71.

154. Shiloh Y. ATM and related protein kinases: safeguarding genome integrity // Nature Review Cancer. 2003. - Vol. 3, № 3. - P. 155-168.

155. Shinohara A., Ogawa H., Matsuda Y., Ushio N., Ikeo K., Ogawa T. Cloning of human, mouse and fission yeast recombination genes homologous to RAD51 and recA // Nature Genet. 1993. - Vol. 4, № 3. - P. 239-243.

156. Shinohara A., Ogawa T. Rad51/RecA protein families and the associated proteins in eukaryotes//Mutat. Res. 1999. - Vol. 435, № l.-P. 13-21.

157. Shinohara M., Sakai K., Shinohara A., Bishop D.K. Crossover interference in Saccharomyces cerevisiae requires a TID1/RDH54- and DMC1-dependent pathway // Genetics. 2003. - Vol. 163, № 4. - P. 1273-1286.

158. Shinohara A., Shinohara M. Roles of RecA homologues Rad5l and Dmcl during meiotic recombination // Cytogenetic and Genome Res. 2004. - Vol. 107, №3-4.-P. 201-207.

159. Smith K.R. Gene therapy: the potential applicability of gene transfer technology to the human germline // int. J. Med. Sci. 2004. - Vol. 1, № 2. - P. 76-91.

160. Smith K.N., Nicolas A. Recombination at work for meiosis // Curr. Opin. Genet. Dev. 1998. - Vol. 8, № 2. - P. 200-211.

161. Smolkova B., Dusinska M., Raslova K., McNeill G., Spustova V., Blazicek P., Horska A., Collins A. Seasonal changes in markers of oxidative damage to lipids and DNA; correlations with seasonal variation in diet //Mut. Res. 2004. -Vol. 551.-P. 135-144.

162. Song B., Sung P. Functional interactions among yeast Rad51 recombinase, Rad52 mediator, and replication protein A in DNA strand exchange // J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275, № 21. - P. 15895-15904.

163. Soustelle C., Vedel M., Kolodner R., Nicolas A. Replication protein A is required for meiotic recombination in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. -2002.-Vol. 161,№2.-P. 535-547.

164. Stark J.M., Hu P., Pierce A.J., Moynahan M.E., Ellis N., Jasin M. ATP hydrolysis by mammalian RAD51 has a key role during homology-directed DNA repair // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277, № 23. - P. 20185-20194.

165. Stringer J.R., Kuhn R.M., Newman J.L., Meade J.C. Unequal homologous recombination between tandemly arranged sequences stably incorporated into cultured rat cells // Mol. Cell Biol. 1985. - Vol. 5, № 10. - P. 2613-2622.

166. Subramani S., Rubnitz J. Recombination events after transient infection and stable integration of DNA into mouse cells // Mol. Cell Biol. 1985. - Vol. 5, - P. 659-666.

167. Sudo K., Ogata M., Sato Y., Iguchi-Ariga S.M., Ariga H. Cloned origin of DNA replication in c-myc gene can function and be transmitted in transgenic mice in an episomal state // Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 25, № 18. - P. 54255432.

168. Sugawara N., Haber J.I. Characterization of double-strand break-induced recombination: homology requirements and single-stranded DNA formation // Moi. Cell Biol. 1992. - Vol. 12, № 2. - P. 563-575.

169. Sung P. Yeast Rad55 and Rad57 proteins form a heterodimer that functions with replication protein A to promote DNA strand exchange by Rad51 recombinase // Genes Dev. 1997. - Vol. 11, № 9. - P. 1111-1121.

170. Sung P., Krejci L., Van Komen S., Sehorn M.G. Rad51 recombinase and recombination mediators // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, № 44. - P. 4272942732.

171. Symington L.S. Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. - Vol. 66, № 4. - P. 630-670.

172. Tashiro S., Kotomura N., Shinohara A., Tanaka K., Ueda K., Kamada N. S phase specific formation of the human Rad51 protein nuclear foci in lymphocytes //Oncogene. 1996,-Vol. 12, № 10. - P. 2165-2170.

173. Tashiro S., Walter J., Shinohara A., Kamada N., Cremer T. Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin // J. Cell Biol. 2000. - Vol. 150, № 2. - P. 283-291.

174. Te Riele H., Maandag E.R., Berns A. Highly efficient gene targeting in embryonic sterm cell through homologous recombination with isogenic DNA constructs // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1992. - Vol. 89, № 11. - P. 5128-5132.

175. Thacker J. A surfeit of RAD51 -like genes? // Trends in Genetics. 1999. -Vol. 15, №5.-P. 166-168.

176. Thomas K., Capecchi M. Site-directed mutageneses by gene targeting in mouse enbryo-derived stem cells//Cell. 1987. - Vol. 51, №3.- P. 503-512.

177. Thyagarajan B., Padua R.A., Campbell C. Mammalian mitochondria possess homologous DNA recombination activity // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271, № 44.-P. 27536-27543.

178. Trujillo K.M., Roh D.H., Chen L, Komen S.V., Tomkinson A., Sung P. Yeast Xrs2 binds DNA and helps target Rad50 and Mrel 1 to DNA ends // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, № 49. - P. 48957-48964.

179. Truong T., Sun G., Doorly M., Wang J.Y., Schwartz M.A. Modulation of DNA damage-induced apoptosis by cell adhesion is independently mediated by p53 and c-Abl // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100, № 18. - P. 1028110286.

180. Tsukamoto M., Yamashita K., Miyazaki T., Shinohara M., Shinohara A. The N-terminal domain of Rad52 promotes Rad51 Independent recombination in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. - 2003. - Vol. 165, № 4. - P. 1703-1715.

181. Vispe S., Cazaux C., Lesca C., Defais M. Overexpression of Rad51 protein stimulates homologous recombination and increases resistance of mammalian cells to ionizing radiation // Nucleic Acids Res. 1998. - Vol. 26, № 12. - P. 28592864.

182. Vispe S., Defais M. Mammalian Rad51 protein: A RecA homologue with pleiotropic functions // Biochimie. 1997. - Vol. 79, № 9-10. - P. 587-592.

183. Waterhouse P.M., Wang M-B., Lough T. Gene silencing as an adaptive defence against viruses //Nature. 2001. - Vol. 411, № 6839. - P. 834-842.

184. West S.C. Molecular views of recombination proteins and their control // Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 2003. - Vol. 4, № 6. - P. 435-445.

185. Willers H., Xia F., Powell S.N. Recombinational DNA Repair in Cancer and Normal Cells: The Challenge of Functional Analysis // J Biomed Biotechnol. -2002.-Vol. 2, №2.-P. 86 -93.

186. Wiese C., Collins D.W., Albala J.S., Thompson L.H., Kronenberg A., and Schild D. Interactions involving the Rad51 paralogs Rad51C and XRCC3 in human cells // Nucleic Acids Res. 2002. - Vol. 30, №4.-P. 1001 - 1008.

187. Wigler M., Pellicer A., Silverstein S., Axel R. Biochemical transfer of single copy eucariotyc genes using total cellular DNA as donor // Cell. 1978. - Vol. 14, № 3. - P. 725-731.

188. Wilkie T.M., Palmiter R.D. Analysis of the integrant in MyK-103 transgenic mice in which males fail to transmit the integrant // Mol. Cell Biol. 1987. - Vol. 7, № 5. - P. 1646-1655.

189. Wilkinson D. The western lights: chemiluminiscent techniques for western blot detection let researchers shed their lead aprons // The Scientist. 2000. - Vol. 14,№5.-P. 29.

190. Yagi T., Ikawa I., Yoshida R. Homologous recombination at c-fyn locus of mouse embryonic stem cells with use of diphtheria toxin A-fragment gene in negative selection // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87, № 24. - P. 9918-9922.

191. Yanez R., Porter A. Gene targeting is enhanced in human cells overexpressing hRAD51 // Gene Ther. 1999. - Vol. 6, № 7. - P. 1282-1290.

192. Yang D., Waldman A.S. Fine-Resolution Analysis of Products of Intrachromosomal Homeologous Recombination in Mammalian Cells // Mol. Cell Biol. 1997.-Vol. 17, №7. -P. 3614-3628.

193. Yano O., Hirano H., Karasaki Y., Higashi K., Nakamura H., Akiya S., Gotoh S. Cloning and sequencing of viral integration site in human fibroblastsimmortalized by simian virus 40 // Cell Struct. Funct. 1991. - Vol. I, № 1. - P. 63-71.

194. Yao M-C., Fuller P., Xi X. Programmed DNA deletion as an RNA-guided system of genome defense // Science. 2003. - Vol. 300, № 5625. - P. 1581-1584.

195. Yoshihara T., Ishida M., Kinomura A., Katsura M., Tsuruga T., Tashiro S., Asahara T., Miyagawa K. XRCC3 deficiency results in a defect in recombination and increased endoreduplication in human cells // EMBO Journal. 2004. - Vol. 23, №3.-P. 670-680.

196. Yu X., Egelman E.N. The LexA repressor binds within the deep helical groove of the activated RecA filament // J. Mol. Biol. 1993. - Vol. 231, № 1. - P. 29-40.

Информация о работе

Иванов, Андрей Владимирович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2006
ВАК 03.00.25

Диссертация

Исследование судьбы экзогенной ДНК, интегрированной в геном соматических клеток млекопитающих - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы