Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование структуры хроматина млекопитающих при помощи метилазы Dam E. coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование структуры хроматина млекопитающих при помощи метилазы Dam E. coli"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им академиков ММ Шемякина иЮ А Овчинникова

На правах рукописи 0031G5213

Буланенкова Светлана Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ХРОМАТИНА МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПРИ ПОМОЩИ МЕТИЛАЗЫ DAM Е. COLI

03 00 03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 MAP 2008

Москва-2008

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Института биоорганической химии им академиков ММ ШемякинаиЮА Овчинникова РАН

Научный руководитель:

академик РАН, доктор химических наук Е Д Свердлов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук К А Лукьянов кандидат биологических наук М А Эльдаров

Ведущая организация:

Институт биологии гена РАН

Защита состоится 3 «VfW 2008 г в lñ часов на заседании Специализированного Совета Д002 019 01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М ШемякинаиЮА Овчинникова РАН по адресу 117997, Москва, ул Миклухо-Маклая 16/10

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Автореферат разослан

2008 г

Ученый секретарь Специализированного Совета,

доктор фаз -мат наук

В А. Олейников

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одной из важнейших задач молекулярной биологии является исследование организации и функционирования генома высших организмов Недавние успехи в определении полных последовательностей геномов различных организмов не предоставляют исчерпывающей информации о функциональной роли генов и регуляции их экспрессии В наступающую постгеномную эру на первый план выходит изучение регуляторных систем, обеспечивающих фенотипическое разнообразие живых организмов К числу таких регуляторных элементов относятся энхансеры, терминаторы транскрипции, участки связывания ДНК с регуляторными белками, участки начала репликации и др Важнейшей составляющей регуляторной машины генома являются эпигенетические элементы, т е элементы, определяющие стабильно наследуемые изменения в уровне экспрессии генов без изменения последовательности ДНК геномов Ближайшей целью геномики становится выявление закономерностей взаимодействия всех этих элементов между собой, для чего необходимо построение метрических карт расположения функциональных элементов генома Наиболее важной задачей является построение функциональной карты геномов млекопитающих, в первую очередь человека Полногеномная идентификация и картирование десятков и сотен тысяч регуляторных элементов генома трудновыполнимо даже с применением самых современных подходов, таких как метод микрочипов Для упрощения этой задачи картирование регуляторных элементов можно проводить внутри относительно ограниченных, но достаточно протяженных областей генома, в дальнейшем объединяя частичные карты в карты целых хромосом В частности, в лаборатории структуры и функций генов человека ведется поиск и функциональный анализ различных типов регуляторных элементов в области С А РЭНБ- 11РК1А хромосомы 19 человека длиной около 140 т п о

К числу эпигенетических факторов, регулирующих активность генома, относится хроматин, представляющий собой макромолекулярный комплекс из геномной ДНК и ядерных белков Изучение особенностей структуры хроматина в транскрибируемых участках генома привело к концепции «открытого» или деконденсированного (активного) и «закрытого» или конденсированного

(неактивного) хроматина и его участия в регуляции активности генов Несмотря на очевидную важность проблемы организации хроматина и большое число работ, посвященных этой проблеме, исследования ограничивались в основном изучением состояния хроматина конкретных генов и окружающих их участков генома (Dekker, 2003) В то же время, закономерности организации хроматина протяженных участков генома изучены недостаточно, что приводит к заметным пробелам в понимании координированной регуляции экспрессии ансамблей генов и участия в этой регуляции высших структур хроматина На сегодняшний день предпринимаются попытки полногеномного анализа структуры хроматина, которые также сопряжены со значительными трудностями Отсюда очевидна потребность в разработке методов анализа структуры хроматина ограниченных протяженных геномных областей, содержащих не один, а множество генов, которые дают возможность выявить связь между активностью этих генов и структурой хроматина в занимаемых ими участках генома

Анализ структуры хроматина основан на различной доступности геномной ДНК в составе хроматина для крупных белковых молекул Одной из проблем при анализе является выбор подходящего инструмента, позволяющего получать достоверный результат В классических работах для анализа структуры хроматина используют различные нуклеазы, например, микрококковую нуклеазу или ДНК-азу I Однако гидролиз геномной ДНК этими ферментами приводит к гибели клеток, что делает невозможным такой анализ in vivo В большинстве случаев подобный анализ проводится на изолированных ядрах, что неизбежно вызывает ряд артефактов, возникающих в процессе выделения ядер Избежать негативных последствий можно в случае экспрессии в исследуемых клетках гена фермента, не оказывающего влияния на жизнеспособность клетки К числу таких ферментов относится бактериальная ДНК(№-аденин)метилтрансфераза (метилаза Dam), метилирующая аденин в последовательности GATC Метилаза Dam Е coli успешно применялась для анализа структуры хроматина у Saccharomyces cerevisiae и Drosophila melanogaster (Singh & Klar, 1992, Wines et al, 1996, Gottschling, 1992, Boivin & Dura, 1998) Однако в литературе отсутствуют данные об использовании данного метода для анализа структуры хроматина млекопитающих В настоящей работе был разработан подход с

использованием метилазы Dam Е coli, позволяющий построить схему распределения открытых и закрытых участков хроматина в области GAPDHS-UPK1A хромосомы 19 человека

Цели и задачи работы

Цель данной работы заключалась в разработке подходов для анализа структуры хроматина протяженных локусов генома млекопитающих (на примере человека) с использованием метилазы Dam Е coli и построении метрической карты открыть« и закрытых участков хроматина для области GAPDHS-UPK1A хромосомы 19 в линии клеток почки эмбриона человека НЕК293

В ходе работы были решены следующие задачи

1 Создана система экспрессии гена метилазы Dam Е coli в клетках человека. После введения полученной конструкции в клетки показана способность метилазы Dam метилировать геномную ДНК т vivo

2 Разработана методика идентификации Dam-метилированных сайтов в протяженных областях геномной ДНК и с ее помощью получена карта их распределения для области GAPDHS-UPK1A хромосомы 19 человека длиной 140 тпо

3 Показано, что распределение метилированных сайтов коррелирует с распределением участков доступности хроматина для расщепления ДНК-азой I и уровнем ацетилирования гистона НЗ по лизину-9

4 Проведен анализ уровня Dam-метилирования отдельных генов

Научная новизна и практическая значимость работы

Показана возможность анализа структуры хроматина млекопитающих т vivo с использованием метилазы Dam Е coli В ходе данной работы был предложен метод детекции и картирования Dam-метилированных сайтов GATC в протяженных участках генома С использованием разработанного метода было установлено распределение метилированных сайтов GATC в полигенной области GAPDHS-UPK1A хромосомы 19 человека длиной 140 т п о Распределение Dam-метилированных сайтов не было равномерным, наблюдались участки с повышенной и пониженной плотностью dam-сайтов, соответствующие участкам открытого и закрытого

хроматина, соответственно, и отражающие функциональную активность определенных участков локуса. Полученные результаты вносят существенный вклад в изучение структурной организации хроматина на геномном уровне, а разработанные подходы могут стать полезным инструментом функциональной геномики Апробация работы

Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях XV всероссийское совещание «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005), Международная конференция «Генетика в России и мире» (Москва, 2006), XIX Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2007), Международная молодежная научно-методическая конференция «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics dedicated to 120th anniversary of NI Vavilov (Киев, 2007)

Объем работы Диссертационная работа изложена на 105*сграницах, и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов и списка литературы из ¿1$ наименований Диссертация содержит R таблиц и П рисунков Публикация

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспрессия гена dam в клеточной линии IIEK293

ДНК-метилаза Dam Е coli метилирует аденин в составе последовательности GATC Применимость метилазы Dam для анализа степени открытости хроматина in ■vivo была показана ранее для Drosophila melanogaster и Saccharomices cerevisiae (Hoekstra & Malone, 1985, Wmes et al, 1996, Gottschling, 1992, Kladde & Simpson, 1994), однако данных по использованию этого фермента для анализа структуры хроматина млекопитающих не имелось Геном млекопитающих, в том числе человека, удовлетворяет условиям, при которых возможно использование метилазы Dam Во-первых, геномная ДНК человека не содержит метилированного аденина на

детектируемом уровне (Kudriashova et al, 1976); во-вторых, эксперименты по стабильной экспрессии гена dam в клетках линии НЕК293 человека показали отсутствие негативного влияния активной метилазы Dam на жизненно важные функции клетки (Nakai et al, 2000).

Нами была создана конструкция для транзиентной экспрессии гена dam в клетках млекопитающих (pCI-Dam, рис. 1). Полученной конструкцией были трансфицированы клетки линии НЕК293 (далее клетки dam+). Параллельно с трансфекцией pCI-Dam проводили трансфекцию исходной, не содержащей гена dam плазмидой рС1 в качестве отрицательного контроля (далее клетки dam'). Трансфицированные pCI-Dam клетки сохраняли полную жизнеспособность, что подтверждало отсутствие токсичности продукта гена dam для клеток НЕК293 (трансфекции были проведены к.б.н. Стукачевой Е.А., ИБХ РАН).

Рис. 1. Схема плазмиды pCI-Dam для экспрессии гена dam в клетках линии НЕК293. Плазмида содержит промотор ранних генов цитомегаловируса CMV (CMV промотор), участок полиаденилирования SV40 (SV40 поли А), химерный интрон, участок начала репликации фага fl (fi orí) и ген устойчивости к ампициллину (AmpR).

Для подтверждения экспрессии гена метилазы Dam в трансфицированньгх клетках проводили тест на наличие Dam-метилазной активности. Для этого фрагмент ДНК, содержащий единственный сайт GATC, инкубировали с лизатом клеток dam+ и

dam Далее фрагмент очищали и подвергали гидролизу с использованием эндонуклеаз рестрикции Dpn I (гидролизует только метилированные сайты GATC) и Bs/EN II (гидролизует только неметилированные сайты GATC) В случае лизата клеток dam* при обработке фрагмента эндонуклеазой Dpn I на электрофореграмме было видно 2 полосы, соответствующие продуктам гидролиза, при обработке 5s/EN II, напротив, была видна полоса, соответствующая негидролизованному фрагменту Для лизата dam клеток наблюдалась противоположная картина Полученные результаты свидетельствовали о наличии в лизате dam* клеток ферментативной активности метилазы Dam (рис 2А)

Геномную ДНК, выделенную из трансфицированых клеток, обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Dpn I, BstEH II и Sau3A I (гидролизует все сайты GATC) Электрофореграмма разделения геномной ДНК из dam* клеток при обработке Dpn I показала наличие продуктов гидролиза ниже полосы, соответствующей негидролизованной ДНК, что свидетельствовало о наличии расщепления по метилированным сайтам GATC При обработке ДНК B.s'/EN II, помимо продуктов гидролиза наблюдалась полоса, соответствующая негидролизованной геномной ДНК, что свидетельствовало об отсутствии гидролиза метилированных сайтов Для геномной ДНК из клеток dam при обработке Dpn I наблюдалась полоса, соответствующая негидролизованной геномной ДНК, а при обработке BstEN II на электрофореграмме были видны продукты гидролиза При этом полоса негидролизованной геномной ДНК отсутствовала (Рис 2В) Полученные данные свидетельствовали о появлении метилированных сайтов GATC в геномной ДНК клеток, трансфицированных плазмидой pCI-dam

При обработке ДНК из клеток dam* эндонуклеазой рестрикции Dpn I средний размер продуктов гидролиза был больше по сравнению с продуктами гидролиза SauiA I, гидролизующей все сайты GATC Большая длина продуктов гидролиза Dpn I могла объясняться наличием неметилированных сайтов GATC, и, следовательно, избирательностью метилирования сайтов GATC в составе хроматина для метилазы Dam

I_I_I

ilam+ клетки clam- клетки

Мстилаза Dam

I-1-1_I_1_

Dpn I Dpn I BsiENII teENII Sau ЗА контроль контроль

Рис. 2. (А) Обнаружение метилированных сайтов GATC во фрагменте ДНК, инкубировавшемся с клеточным лизатом dam+ и dam клеток. Фрагмент обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Dpn I (гидролизует только метилированные сайты GATC) и ¿toEN II (гидролизует только неметилированные сайты GATC). Дорожка без добавления фермента содержала интактный фрагмент. (В) Обнаружение метилированных сайтов GATC в геномной ДНК dam+ клеток. Дорожки, обозначенные + и соответствуют геномной ДНК из dam' и dam' клеток, соответственно. Геномная ДНК была обработана Dpn I, 5-siEN II и &шЗА I (гидролизует все сайты GATC). Дорожки «Dpn I и fc/EN II контроль» соответствуют геномной ДНК, инкубировавшейся в буферных условиях для соответствующего фермента без добавления последнего (контроль на деградацию).

При обработке ДНК из клеток dam+ эндонуклеазой рестрикции Dpn I, на электрофореграмме присутствовала полоса негидролизованной геномной ДНК, а при

обработке As/EN II наблюдалось некоторое количество продуктов гидролиза Это может объясняться тем фактом, что при трансфекции <Лто-содержащая конструкция попадает не во все клетки Не получившая плазмиду часть клеток не будет содержать метилированных сайтов GATC Подобный эффект может наблюдаться и в том случае, если в хроматине существуют протяженные (десятки т п о ) участки, не доступные для метилазы Dam

Селективное клонирование фрагментов ДНК, содержащих Dam-метилированные сайты GATC, из длинных геномных последовательностей

Дальнейшей задачей исследования был анализ уровня метилирования сайтов GATC в длинных геномных последовательностях и построение метрической карты распределения сайтов GATC, подвергшихся метилированию В опубликованных работах, посвященных использованию метилазы Dam для анализа структуры хроматина, изучали уровень метилирования одного или нескольких сайтов GATC В нашей работе предполагалось определить уровень метилирования большого числа сайтов GATC, принадлежащих протяженной геномной области Для идентификации метилированных сайтов GATC (далее dam-сайты) мы модифицировали метод клонирования совпадающих последовательностей (NGSCC), ранее разработанный в нашей лаборатории Т JI Ажикиной и соавт (Azhikina et al, 2004) для идентификации и картирования неметилированных цитозинов Метод клонирования совпадающих последовательностей включает два этапа (рис 3) - получение библиотеки фрагментов геномной ДНК, обогащенной участками, несущими ёат-сайт, и отбор из этой библиотеки только тех фрагментов, которые принадлежат исследуемой протяженной области

На первом этапе проводили гидролиз геномной ДНК из клеток dam+ метилчувствительной эндонуклеазой рестрикции Dpn I, гидролизующей только метилированые сайты GATC Использовали также дополнительную «частощепящую» эндонуклеазу рестрикции Tru9 I, гидролизующую последовательность ТТАА Использование второй эндонуклеазы рестрикции позволяет уменьшить размер получающихся фрагментов до 1 т п о и менее Такой диапазон длин является оптимальным для проведения ПЦР амплификации Полученный гидролизат содержал

смесь фрагментов йрп \-Dpn I, йрп \-Tru91 и Тги9 \-Tru9 I Для дальнейшей работы необходимо было селективно выделить фракцию фрагментов Эрп 1-Тги9 I Для этого был использован подход с применением эффекта супрессии ПЦР (Оуа^Ьепко й а1, 1996) К образовавшимся после рестрикции концам фрагментов лигировали супрессионные адапторы, различные для Тги91 и Ирп I концов Оба супрессионных адаптера содержали каждый по две последовательности, идентичные праймерам, используемым при дальнейшей амплификации При этом последовательности внешних праймеров у обоих адаптеров были одинаковы, а последовательности внутренних праймеров различались При проведении первого раунда ПЦР с внешними праймерами такая конструкция обеспечивает экспоненциальную амплификацию только тех фрагментов, у которых к концам присоединены разные адапторы (Рис 3) У фрагментов с одинаковыми адаптерами на концах, на стадии отжига образуются стабильные дуплексы из последовательностей адаптеров, мешающие отжигу внешнего праймера В результате фрагменты Тги9 \-Trv91 и йрп I-Брп I не амплифицируются Полученная библиотека содержала набор всех Тги9I-йрп I фрагментов генома.

Для проведения второго этапа процедуры клонирования совпадающих последовательностей необходимо наличие последовательности, представляющей исследуемую область генома В качестве такой последовательности использовали смесь космид, несущих вставки, перекрывающие исследуемую нами области йЛРйНЗ- иРК1А хромосомы 19 человека Подготовка космидного образца аналогична описанной выше подготовке образца геномной ДНК Единственным отличием было использование вместо йрп I метилнезависимой эндонуклеазы рестрикции БаиЪА I, гидролизующей все сайты вАТС, независимо от статуса их метилирования

На втором этапе оставшиеся внутренние части супрессионных адаптеров удаляли гидролизом соответствующими эндонуклеазами рестрикции (£анЗА I и Тги9 I) В отличие от космидного набора фрагментов, образец геномной ДНК обрабатывали только эндонуклеазой рестрикции Тги9 I, поскольку существует вероятность наличия внутри фрагментов Орп \-Tru9 I сайтов в АТС, не подвергшихся Баш-метилированию

Геномная ДНК, Оат-метилированная Гидролиз по Орп I и Тги91

Космидная ДНК Гидролиз по Sau ЗА I и TruS 1

Нет ПЦР

-и *

□ Лигирование адапторов, соответствующих полученным рестриктным концам Ь Т ?

Нет ПЦР

Селективная амплификация фрагментов с разными концами

Удаление старых и добавление новых адапторов, различающихся для геномных и космидных фрагментов

Т 3

^-А_.1

Смешивание геномной и космидной ДНК, добавление СоМ, денатурация и ренатурация

Т 3

*

Селективная амплификация гетеродуплексов TD TS

Нет ПЦР

м

т

Нет ПЦР

Клонирование, секвенирование и картирование Оат-метилированных сайтов из определенного локуса генома

Рис. 3. Схема идентификации дат-сайтов методом клонирования совпадающих последовательностей.

К образовавшимся при расщеплении концам фрагментов из полученных библиотек геномной и космидной ДНК лигировали новые геномный и космидный супрессионные адаптеры, имеющие общие последовательности внешних праймеров и различающиеся последовательности внутренних праймеров

Ампликоны геномной и космидной ДНК смешивали в молярном соотношении 1 100 и подвергали совместной денатурации и ренатурации, после чего использовали в качестве матрицы для ПЦР с общим внешним праймером Так же, как и на предыдущей стадии, селективно амплифицировались фрагменты, содержавшие на концах разные адапторы, т е гетеродуплексы геномной и космидной ДНК Гетеродуплексы с космидным адаптером на Sau3A I конце и геномным — на Тги9 I содержали на Sau3A I конце некомплементарные одноцепочечные участки, поэтому амплифицировались лишь линейно Таким образом, происходил отбор фрагментов, общих для геномной и космидной ДНК, т е последовательностей, принадлежащих области GAPDHS-UPK1A хромосомы 19 человека. Полученная библиотека коротких фрагментов была клонирована в вектор pGEM-T (Proraega) Последовательности вставок определяли секвенированием

Картирование dam-сантов в области GAPDHS-UPK1A

Для картирования найденных dam-сайтов и определения их положения относительно охарактеризованных генов, EST и повторяющихся элементов генома использовали базы данных и программы UCSC Human Genome Browser (http //genome ucsc edu/cgi-bin/hgGateway) Учитывалось совпадение секвенированных последовательностей с последовательностями изучаемого фрагмента генома человека Каждое совпадение свидетельствовало о наличии метилированного сайта, в результате расщепления которого образовывался данный фрагмент Количество секвенированных фрагментов с данной последовательностью свидетельствовало об интенсивности метилирования данного сайта

В локусе GAPDHS-UPK1A было картировано 135 сайтов GATC, подвергшихся Dam-метилированию На основании повторяемости клонов в библиотеке Dam-метилированных фрагментов был сделан вывод о том, что такое

Рис. 4. Распределение Оат-метилированных сайтов ОАТС в локусе САРВН5~иРК1 А хромосомы 19 человека. Локус разделен на 36 фрагментов, содержащих по пять потенциально детектируемых методом клонирования совпадающих последовательностей сайтов вАТС. Высота столбцов соответствует количеству детекций метилированных сайтов ОАТС в каждом фрагменте. Короткие линии, соединяющие диаграмму и метрическую карту, представляют границы фрагментов на карте локуса. Известные гены локуса изображены горизонтальными стрелками, + и - обозначены гены, для которых показано наличие или отсутствие транскрипции в клетках НЕК293. Прямоугольниками обозначены отрезки локуса, для которых проводили анализ общей чувствительности к ДНК-азе I. Белыми прямоугольниками обозначены фрагменты, чувствительные к ДНК-азе I, черными - не чувствительные. Вертикальными отрезками на прямоугольниках обозначены участки, для которых определяли уровень ацетилирования гистона НЗ по лизину-9. Высота отрезка соответствует уровню ацетилирования.

количество найденных с1ат-сайтов является достаточным для достоверного описания их распределения в данном локусе

Всего было выявлено 55 индивидуальных сайтов ОАТС, подвергшихся Оат-метилированию Из них 29 были детектированы по одному разу, остальные были независимо детектированы 2 и более раз Обнаруженные ёат-сайты принадлежали как уникальным, так и повторяющимся элементам генома и входили в состав как интронов и экзонов генов, так и межгенных участков

Для графического представления результатов, учитывающего неравномерность распределения сайтов ОАТС в геноме, была построена гистограмма плотности дат-сайтов относительно плотности потенциально детектируемых сайтов ОАТС (Рис 4) Для этого изучаемый локус был разделен на отрезки, содержащие одинаковое число потенциально детектируемых сайтов ОАТС По оси ординат было отложено количество обнаруженных ёат-сайтов, картированных с составе каждого отрезка, с учетом повторных детекций К потенциально детектируемым сайтам мы отнесли те сайты ОАТС исследуемой области, которые входят в состав фрагментов ТТАА-ОАТС длиной 100-600 п о (фрагменты меньше 100 п о элиминировались на стадии приготовления библиотеки, длина вставок плазмид не превышала 600 по) Для построения диаграммы и соотнесения ее с метрической картой локуса использовали пакет программ, разработанный в нашей лаборатории И В Гайнетдиновым Построенная гистограмма показала неравномерность плотности Вата-метилирования изученной области генома и показала, что локус ОАРОНБ- \JPK\A содержит участки как предположительно открытого (с высокой плотностью метилирования), так и закрытого хроматина (с низкой плотностью метилирования)

Подтверждение структуры хроматина обнаруженных участков с повышенной и пониженной плотностью с1ат-сайтов альтернативными методами

Сравнение распределения с!ат-сайтов и общей чувствительности к ДНК-азе I для отдельных участков исследуемого локуса

Известно, что ДНК, находящаяся в составе открытого хроматина, обладает повышенной доступностью для гидролиза ДНК-азой I Для оценки степени

открытости хроматина мы применили метод общей чувствительности к ДНК-азе I (Hebbesetal, 1994) Схема метода выглядит следующим образом Из исследуемых клеток выделяют ядра, которые разделяют на несколько порций и обрабатывают их возрастающими количествами ДНК-азы I Контрольный образец ДНК-азой не обрабатывается Из ядер выделяют геномную ДНК, которую затем гидролизуют с использованием набора эндонуклеаз рестрикции для получения фрагментов исследуемых участков нужной длины Далее полученные продукты гидролиза разделяют электрофорезом в агарозном геле, переносят на гибридизационную мембрану и проводят гибридизацию с зондом к интересующему нас участку О степени чувствительности к нуклеазе интересующего участка судят по скорости исчезновения полосы, соответствующей исследуемому фрагменту, при возрастании количества ДНК-азы I Скорость исчезновения оценивают относительно контрольного фрагмента, расположенного в заведомо нечувствительной к ДНК-азе I области хроматина

Описанная выше процедура была проведена для ядер, выделенных из клеток НЕК293 (результаты были получены в двух независимых экспериментах) Для получения оптимальной для анализа длины исследуемых фрагментов использовали эндонуклеазы рестрикции EcoR I и Hind III В качестве контрольного фрагмента использовали участок, примыкающий к промоторной области гена HTERT и расположенный в нечувствительном к ДНК-азе I участке генома (Wang & Zhu, 2004) Для анализа было отобрано 7 фрагментов локуса из участков с повышенной или пониженной плотностью dam-сайтов, условно обозначенных D1-D7 Положение фрагментов в локусе указано на рис 4

Участки из областей с повышенной плотностью dam-сайтов расположены следующим образом

1) D1 - включает промоторную область гена ТМЕМ147 и внутренние области генов ТМЕМ147 и GAPDHS,

2) D2 - включает область 5 т п о выше точки начала транскрипции гена АТР4А,

3) D3 - содержит часто расположенные dam-сайты на расстоянии 16 т п о выше точки начала транскрипции гспз.АТР4А,

4) D5 - содержит промоторную и внутреннюю области гена KIAA0841,

5) Б6 - содержит промоторную область гена СОХ6В1 и внутреннюю область гена ЕТУ2 и 5'-область гена СОХ6В1;

Участки из областей с пониженной плотностью ёаш-сайтов:

1) 04 - участок области, не содержащей идентифицированных генов;

2) 07 - 3'-область гена СОХ6В1;

ЛНЬГячя I

D7 (8200 п.о.)н D6 (6200 п.о.)н

HTERT

2200 п.о.

Рис. 5. Гибридизация со смесью зондов, комплементарных участкам D6, D7 и HTERT геномной ДНК, выделенной из ядер, обработанных возрастающими количествами ДНК-азы I и расщепленной эндонуклеазами рестрикции EcoR I и Hind III. Первая дорожка не содержит ДНК-азы. HTERT - контроль, соответствующий закрытому хроматину.

Три участка, доступных для мети лазы Dam (Dl, D5 и D6), оказались чувствительными и к ДНК-азе I. Чувствительность к ДНК-азе I двух участков, не доступных для метилазы Dam (D4 и D7), была сравнима с контролем, т.е. они располагались в области с предположительно закрытой структурой хроматина. Два участка из областей с повышенным уровнем Dam-метилирования (D2 и D3) не проявили чувствительности к ДНК-азе I. Таким образом, для пяти из семи исследованных участков наблюдалось соответствие между доступностью для метилазы Dam и чувствительностью к ДНК-азе I.

Сравнение распределения йат-сайтов и уровня ацетилирования гистона 113 в отдельных участках исследуемой области

Известно, что для областей открытого хроматина характерно повышенное содержание ацетилированных гистонов. Наиболее изученной модификацией гистонов является ацетилироваиие лизина-9 гистона НЗ. Данная модификация может

выступать в качестве индикатора открытого состояния хроматина Для участков локуса, исследованных методом общей чувствительности к ДНК-азе I, был проведен анализ уровня ацетилирования гистона НЗ Анализ проводили методом иммунопреципитации хроматина с антителами к ацетилированному гистону НЗ с последующим анализом методом количественной ПЦР Для этого к анализируемым последовательностям подбирали по три пары праймеров - к началу, середине и концу участка. Анализируемым фрагментам были даны следующие обозначения D3C1, D3C2, D3C3 — для фрагмента ДНК, доступного для метил азы Dam, но не чувствительного к ДНК-азе I, D4C1, D4C2, D4C3, D7C1, D7C2, D7C3 - для фрагментов ДНК, которые по результатам Dam-метилирования и чувствительности к ДНК-азе I находятся в составе закрытого хроматина, D6C1, D6C2, D6C3 - для участка, находящегося по данным Dam-метилирования и чувствительности к ДНК-азе I в открытом хроматине (расположение фрагментов, исследованных методом иммунопреципитации хроматина, показано на рис 4)

Для контроля были подобраны праймеры к последовательностям ДНК, которые в клетках линии НЕК293 заведомо входили в состав либо открытого, либо закрытого хроматина В качестве контроля закрытого хроматина были выбраны 2 участка геномной ДНК - промоторная область и первый экзон гена НАМР, экспрессия которого отсутствует в клетках линии НЕК293, и расположенный с 5'-стороны от гена теломеразы участок ДНК (HTERT), для которого в клетках НЕК293 было показано закрытое состояние хроматина (Wang & Zhu, 2004) В качестве участка открытого хроматина была выбрана промоторная область гена «домашнего хозяйства» GAPDH

Измерение количества фрагментов ДНК, ассоциированных m vivo с ацетилированным гистоном НЗК9, проводили методом ПЦР в режиме реального времени Уровень ацетилирования гистонов, связанных с интересующими нас фрагментами, оценивали по величине обогащения данным фрагментом фракции иммунопреципитированной ДНК относительно уровня ацетилирования для положительного контроля GAPDH, принятого за 100%

Полученные данные представлены в виде диаграммы с высотой столбцов, отражающих уровень ацетилирования гистонов, ассоциированных с исследуемыми фрагментами (рис. 6). Как видно из диаграммы, эта величина для положительного контроля САР ОН более чем в 10 раз превышала значение для отрицательных

120 -|

100

во

40

20

гЬ

.I '"]

<? <£> ^ <у о"

„С4 „С? -О4 & „С? „с4 & _<? х> ^

о о* <*> & <у ол о ^ ^

Рис. 6. Анализ уровня ацетилирования гистона НЗК9 методом иммунопреципитации хроматина и ПЦР в режиме реального времени. Представленные результаты получены в трех независимых экспериментах. По оси ординат отложен относительный уровень ацетилирования НЗК9 для различных участков в % к области гена САРОН.

контролен НАМР и НТЕРТ, что свидетельствовало об адекватности использования иммунопреципитации хроматина с антителами к ацетилированному гистону НЗК9 для детекции различий между открытым и закрытым хроматином. Для предположительно закрытого хроматина фрагментов ДНК 04 и 07 уровень ацетилирования не превышал 8 %, за исключением образца 07С1, для которого эта величина составляла 17,5%. Для участков ДНК, находящихся в открытом хроматине по результатам Оат-метилирования и чувствительности к ДНК-азе, этот уровень превышал значения для закрытого хроматина более чем в 4 раза (за исключением

образца D6C2, для которого эта величина составляла 13,86%) Для участка ДНК (D3), доступного для метилазы Dam, но не чувствительного к ДНК-азе I, уровень ацетилирования не превышал 3,5% Таким образом, результаты, полученные с помощью иммунопреципитации хроматина, совпадали с данными, полученными методом общей чувствительности к ДНК-азе I В целом, наблюдалась корреляция между степенью доступности исследуемых участков для метилазы Dam и ДНК-азы I и уровнем ацетилирования ассоциированного с ними гистона НЗ

Анализ распределения открытых и закрытых участков хроматина

Проведенный нами анализ распределения сайтов GATC, подвергшихся Dam-метилированию, выявил участки с повышенной и пониженной плотностью dam-сайтов

Плотность dam-сайтов была увеличена 1) в области генов GAPDHS и ТМЕМ147, 2) во внутригенной области гена АТР4А, 3) на участке, примыкающем к промотору генаАТР4А (5 т п о от 5'-конца гена. АТР4А), 4) во внутригенной и промоторной областях гена KIAA0841, 5) в промоторном участке гена СОХ6В1, 6) на З'-конце гена UPK1A и в области с З'-стороны от гена UPK1A (умеренное метилирование), 7) в областях, не содержащих известных генов (область на расстоянии 16 т п о от 5'-конца гена А ТР4А и область на расстоянии 10 т п о от 5'-конца гена KIAA0841) Для области, не содержащей идентифицированных генов и находящейся на расстоянии 20 т п о от 5'-конца гена АТР4А и 7 т п о с 5'-стороны от гена KIAA0841, а также для 3'-конца гена СОХ6В1 и промоторной области гена UPK1A была показана пониженная плотность dam-сайтов

Таким образом, dam-сайты в основном концентрируются в промоторных и внутригенных участках Это согласуется с данными о том, что области, богатые генами, предпочтительно расположены в открытом хроматине, а области, не содержащие генов - в закрытом (Gilbert, 2004)

В состав области GAPDHS-UPK1A входит ген "домашнего хозяйства" СОХ6В1, который активно экспрессируется в клетках НЕК293 (Chalaya et al, 2006) Известно, что промоторные участки экспрессирующихся генов должны обладать открытой структурой хроматина для формирования комплекса инициации транскрипции Нами

было показано, что промотор СОХ6В1 находится в области с повышенным уровнем Dam-метилирования, т е в открытой области хроматина Для этого участка также характерна повышенная чувствительность к ДНК-азе I и повышенный уровень ацетилирования гистона НЗ по лизину-9 По результатам всех трех примененных нами методов анализа, З'-концевая область СОХ6В1 располагается в области закрытого хроматина, что согласуется с данными литературы о том, что по направлению к 3'-концу кодирующей области уровень активных модификаций гистонов существенно понижается (Liang, 2004)

Ранее в нашей лаборатории было показано, что ген UPKJA не экспрессируется в линии НЕК293 (Chalaya et al, 2006) По полученным нами данным, промотор UPK1A расположен в области с пониженной плотностью dam-сайтов, т е в потенциально закрытом хроматине Таким образом, данные по экспрессии этих двух генов согласуются с результатами по Dam-метилированию их промоторных участков

Результаты для трех примененных нами методов анализа хроматина в основном совпали, за исключением области, не содержащей известных генов и находящейся на расстоянии 16 т п о от 5'-конца гена A TP4А По данным доступности для метилазы Dam она расположена в области открытого хроматина, но степень ее общей чувствительности к ДНК-азе I и ацетилирования НЗ характерны скорее длч закрытого хроматина Одним из возможных объяснений этого противоречия может быть то, что данный участок представляет собой активный регуляторный элемент, связанный с белковым комплексом, ограничивающим доступность для ДНК-азы I, но не препятствующим Оат-метичированию Для активных регуляторных областей характерно отсутствие регулярного расположения нуклеосом, даже в ряде случаев отсутствие самих нуклеосом В последнем случае этот участок геномной ДНК не будет ассоциирован с ацетилированным гистоном НЗ и, соответственно, будет отсутствовать во фракции иммунопреципитированной ДНК Действительно, для данного фрагмента ДНК был показан самый низкий уровень ацетилирования гистона НЗ (3% против 8% для других участков в составе закрытого хроматина)

Подобным образом можно объяснить и пониженный уровень ацетилирования гистонов в области промотора гена СОХ6В1 по сравнению с 5'-кодирующей областью Действительно, недавно было показано, что максимальное количество

нуклеосом приходится на 5'-кодирующую область, а не на промотор активного гена (Barski et al, 2007, Heintzman et al, 2007)

Следует также отметить, что расщепление ДНК-азой I и Dam-метилирование затрагивают разные структурные элементы ДНК ДНК-аза расщепляет сахарофосфатный остов, находящийся в малой бороздке ДНК, тогда как метилирование аденина осуществляется по большой бороздке (Polaczek et al, 1997) Таким образом, эти два метода могут показывать как общие, так и разные особенности структуры хроматина.

Полученные нами данные позволяют утверждать, что подход с использованием метилазы Dam вполне может быть использован для исследования структуры хроматина т vivo в клетках млекопитающих Полученные с его помощью данные в основном согласуются с данными, получаемыми альтернативными методами, а наблюдающиеся иногда различия в результатах могут быть обусловлены объективно и тем самым дают возможность предполагать в соответствующих областях наличие структурных и функциональных особенностей, например присутствие не связанных с генами регуляторных элементов В целом результаты показывают, что предложенный подход может стать полезным инструментом для функционального анализа геномов

выводы

1 Разработан метод анализа распределения открытых и закрытых участков хроматина в протяженных участках генома млекопитающих с помощью метилазы Dam Е coli

2 Метод использован для исследования структуры хроматина в локусе GAPDHS-UPK1A хромосомы 19 человека в клетках линии НЕК293

3 Результаты Dam-метилирования 5'-регуляторных областей генов СОХ6В1 и UPK1A согласуются с данными по экспрессии этих двух генов

4 Показано, что доступность участков для Dam-метилирования коррелирует с их доступностью расщеплению ДНК-азой I и уровнем ацетилирования лизина-9 гистона НЗ Таким образом, ДНК преимущественно метилируется в участках открытого хроматина, и метилаза Dam может служить средством идентификации открытого хроматина т vivo

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ

Статьи:

1 S Bulanenkova. Е Snezhkov, L Nikolaev, Е Sverdlov Identification and mapping of open chromatin regions within a 140 kb polygenic locus of human chromosome 19 using E coh Dam methylase Genetica 2007, 130 83-92

2 СБ Акопов, И П Чернов, С С Буланенкова. Ю В Скворцова, А С Ветчинова, JIГ Николаев Методы идентификации эпигенетических элементов млекопитающих в длинных мультигенных геномных последовательностях Биохимия 2007,72 725-732

Тезисы конференций:

3 С С Буланенкова. Е В Снежков, JI Г Николаев, Е Д Свердлов Использование метил азы Dam Е coli для анализа структуры хроматина млекопитающих Цитология 2005, 47 797

4 С С Буланенкова, Е В Снежков, Л Г Николаев, Е Д Свердлов. Использование метилазы Dam Е coh для анализа структуры хроматина млекопитающих. Международная конференции «Генетика в России и мире», Москва, 2006, сборник тезисов докладов и стендовых сообщений, стр 24

5 ЕС Котова. С С Буланенкова. Е В Снежков, Л Г Николаев, Е Д Свердлов Использование метилазы Dam Е coli для анализа структуры хроматина млекопитающих XIX Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 7-9 февраля 2007 г, сборник тезисов докладов и стендовых сообщений, стр 38

6 С С Буланенкова. Е С Котова,_Е В Снежков, Л Г Николаев, Е Д Свердлов Использование метилазы Dam Е coli для анализа структуры хроматина млекопитающих Международная молодежная научно-методическая конференция «Проблемы молекулярной и клеточной биологии», Томск, 9-12 мая 2007 г, сборник тезисов докладов и стендовых сообщений, стр 33

7 SS Bulanenkova. Е S Kotova, E.V Snezhkov, L G Nikolaev, E D Sverdlov Identification and mapping of open chromatin regions within extended genome regions using £ coh Dam methylase Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics dedicated to 120th anniversary of Ml Vavilov, Kyiv, Ukraine, 20-22 September 2007 Abstract book, p 52

Подписано в печать 12 02 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 68 Тираж 100экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Буланенкова, Светлана Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6 I. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

1. Введение

2. Обзор литературы

1) Структура хроматина 10 Уровни организации хроматина

Нуклеосомный уровень организации хроматина

Хроматиновая фибрилла диаметром 30 нм

Структуры хроматина высшего порядка

Гетерогенность хроматина

Позиционирование нуклеосом

Система АТФ-зависимогоремоделирования

Модификации гистонов

Некодирующие РНК

Варианты гистонов

Негистоновые белки хроматина

Метилирование ДНК

Межвидовые различия геномов

Разные состояния хроматина

Особые структуры эукариотических хромосом

Функционирование хроматина

Дознан компенсация

Поддержание структуры хроматина

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование структуры хроматина млекопитающих при помощи метилазы Dam E. coli"

ПЦР на матрице первых цепей кДНК Анализ активности метилазы Dam в клеточном экстракте Выделение геномной ДНК Получение препаративных количеств космидной ДНК Гидролиз геномной и космидной ДНК эндонуклеазами рестрикции Гидролиз набора фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции. Отжиг адаптора и "подложки" Лигирование адаптеров Энзиматическое 5-фосфорилирование олигонуклеотидов Селективная амплификация Dpn/Sau Тш фрагментов Смена адапторов Процедура клонирования совпадающих последовательностей Создание ранжированного музея клонов Амплификация плазмидных вставок Анализ библиотеки клонов из ранжированного музея Анализ общей чувствительности к ДНКазе I Выделение ядер Обработка ядер ДНКазой Выделение ДНК из ядер Перенос по Саузерну Приготовление зонда для гибридизации Гибридизация нейлоновой мембраны с зондом 4. Результаты и обсуждение Обоснование работы Создание конструкции для экспрессии гена метилазы Dam Введение полученной конструкции в клетки линии 293Т 4 63 63 64 64 65 65 65 66 66 66 67 67 68 68 68 69 69 69 69 69 69 70 72 72 1Ъ 75 Подтверждение транскрипции бактериального гена Подтверждение наличия Daw-метилазной активности у лизата трансфицированных клеток Подтверждение Dam-метилирования геномной ДНК трансфицированных клеток Поиск метилированных сайтов GATC Анализ библиотеки Dpn I Тги91 фрагментов, принадлежащих локусу GAPDS-UPK1A хромосомы 19 человека Анализ профиля распределения метилированных сайтов GATC в локусе GAPDS-UPK1A хромосомы 19 человека 77 80 80 84 90 91 Проверка распределения Dam-сайтов в локусе методом общей чувствительности к ДНКазе I определенных участков исследуемого локуса 5. ВЫВОДЫ 6. СПИСОК_ЛИТЕРАТУРЫ 93 100 101 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ П.о. пар оснований Т.п.о. тысяч пар оснований Млн.п.о. миллион пар оснований. ДНКаза дезоксирибонуклеаза ПЦР полимеразно-цепная реакция АТР4А альфа субъединицы желудочной Н+/К+ АТФазы CAF-1 chromatin assembley factor, фактор сборки хроматина CMV цитомегловирус СОХ6В субъединицы VIb цитохромоксидазы с DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium DNMT поддерживающая метилтрансфераза dNTP дезоксинуклеозидтрифосфаты ETV2 ets variant gene 2 FCS эмбриональная сыворотка теленка GAPDS глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа HAT ацетилтрансфераза гистонов HDAC гистоновая деацетилаза HFD histone fold domain, домен гистонового фолда HMG high mobility group, белки группы высокой подвижности HP белок гетерохроматина hTERT- теломераза человека LCR locus control region, комплексный активатор транскрипции глобиновых генов LINE (Long Interspersed Element) длинный диспергированный повтор LMPCR ligation-mediated PCR LSD1 Lys-specific demethylase, лизин-специфическая деметилаза LTR (Long Terminal Repeat) длинный концевой повтор MAR/SAR matrix/scaffold attachment region, участки прикрепления к ядерному матриксу МАТ mating type, локус определения типа спаривания у дрожжей MBD methyl-binding domain, метилсвязывающий домен MMTV mouse mammary tumor virus, вирус опухоли молочных желез у мышей 6 MNase микрококковая нуклеаза ORC origin recognition complex, комплекс, узнающий ориджин репликации PRMT protein arginin methyltransferase, аргининовая метилтрансфераза SINE (Short Interspersed Element) короткий диспергированный повтор Sir silent information regulator, белок сайленсинга Su(var) белок-супрессор SV40 simian virus 40, обезьяний вирус 40 TD-PCR Terminal transferase- Dependent PCR UPK1A уроплакина 1A Xic X inactivation center, центр инактивации X хромосомы I. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В клеточном ядре геномная ДНК эукариот находится не в виде голой цепочки нуклеиновой кислоты, а представлена сложным и высокоупорядоченным комплексом ДНК и белков, названным хроматином. На цитологическом уровне в составе интерфазного хроматина различают участки гетерохроматина и эухроматина. Гетерохроматин рассматривается как транскрипционно неактивная форма, он остается конденсированным на всех стадиях клеточного цикла и характеризуется пониженной доступностью ДНК для регуляторных факторов. Напротив, транскрипционно активный хроматин деконденсирован и располагается в эухроматиновых участках в ядре. На молекулярном уровне эти два состояния различаются наборами негистоновых белков, модификациями гистонов и уровнем метилирования геномной ДНК [1]. Изменение уровня конденсации хроматина является важным механизмом регуляции клеточных функций, таких как транскрипция, репликация, репарация и других. Однако, несмотря на очевидную важность состояния хроматина для функционирования клетки, все исследования главным образом фокусируются на отдельных генах и примыкающих к ним участкам генома [2]. В то же время закономерности организации протяженных участков генома остаются изученными недостаточно. Это приводит к заметным пробелам в понимании координированной регуляции экспрессии ансамблей генов и участия в этой регуляции высших структур хроматина. Анализ структуры хроматина основан на различной доступности ДНК в составе хроматина для ДНК-модифицирующих агентов и последующей детекции этих модификаций. К основным модифицирующим агентам относят как агенты ферментативной природы (ДНК-аза, микрококковая нуклеаза, эндонуклеазы рестрикции) [3], так и неферментативные агенты [3-7]. Недостатком этих методик является то, что модификации, вносимые перечисленными выше агентами, приводят к гибели клеток, поэтому в большинстве случаев анализ проводится на изолированных ядрах, что неизбежно вызывает ряд артефактов, возникающих в процессе выделения ядра и хроматина. В последнее время появляются работы, связанные с экспрессией генов модифицирующих ферментов, в частности ДНК-азы I, в эукариотических клетках [8]. К числу таких in vivo методов также относится и использование бактериальной метилазы Dam, метилирующей аденин в последовательности GATC [9]. Данный метод применим только к тем организмам, у которых отсутствует эндогенное метилирование аденина в последовательности GATC. К числу таких организмов относятся Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster и Homo sapiens [10, 11]. В отличие от нуклеаз, экспрессия метилазы в дрожжах и дрозофиле не оказывала существенного влияния на жизнедеятельность организма, что значительно понижало уровень артефактов и делало анализ более достоверным [12, 13]. Метилаза Dam E.coli была успешно применена для анализа структуры хроматина у Saccharomyces cerevisiae и Drosophila melanogaster [9, 13-15]. Анализ в основном проводился для конкретных сайтов GATC в составе определенной последовательности, помещаемой в разное геномное окружение. Однако в литературе отсутствуют данные о применимости данного метода для анализа структуры хроматина млекопитающих. Поэтому проверка этой возможности и разработка методологии детекции сайтов GATC, доступных для действия метилазы, в протяженном локусе генома, представляет собой актуальную задачу. Цель данной работы заключается в разработке метода анализа структуры хроматина протяженных локусов генома млекопитающих на примере человека с использованием Dam-метилазы E.coli. В ходе работы планировалось решить следующие экспериментальные задачи. 1. Создание конструкции для экспрессии гена метилазы Dam E.coli в клетках человека. 2. Введение полученной конструкции в клетки человека и проверка экспрессии гена dam в клетках человека. 3. Проверка наличия метилированных сайтов GATC в геномной ДНК трансфицированных клеток. 4. Создание библиотеки фрагментов, получающихся в результате обработки геномной ДНК метилщепящей эндонуклеазой рестрикции и принадлежащих определенному участку генома. 5. 6. Анализ полученной библиотеки. Проверка полученных результатов альтернативным методом анализа структуры хроматина.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Буланенкова, Светлана Сергеевна

5. ВЫВОДЫ

1. Получена конструкция для экспрессии в клетках млекопитающих гена бактериальной метилазы Dam, способной метилировать аденин в последовательности GATC.

2. Показана экспрессия гена dam в клетках, трансфицированных экспрессирующей конструкцией.

3. Показано наличие метилирования геномной ДНК, выделенной из трансфицированных клеток, по сайту GATC.

4. Получена библиотека фрагментов, получающихся в результате обработки геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции Dpn I и Tru9 I и принадлежащих выбранному участку исследования.

5. Проведен анализ библиотеки Dpn I - Tru9 I фрагментов локуса GAPDS-UPK1A хромосомы 19 человека, полученных методом клонирования совпадающих последовательностей. Показано неравномерное распределение сайтов GATC, подвергшихся действию метилазы Dam. Уровень Dam-метилирования промоторных и внутригенных областей совпадает с уровнем экспрессии соответствующих генов.

6. Проведен независимый анализ структуры хроматина определенных участков исследуемого локуса методом общей чувствительности к ДНК-азе I. Для 5 из 7 исследовавшихся участков генома показано соответствие между уровнем чувствительности к ДНК-азе I и доступностью для метилазы Dam.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Буланенкова, Светлана Сергеевна, Москва

1. Vermaak, D., Ahmad, К. & Henikoff, S. (2003) Maintenance of chromatin states: an open-and-shut case, Curr Opin Cell Biol. 15, 266-74.

2. Dekker, J. (2003) A closer look at long-range chromosomal interactions, Trends Biochem Sci. 28,277-80.

3. Mymryk, J. S., Fryer, C. J., Jung, L. A. & Archer, Т. K. (1997) Analysis of chromatin structure in vivo, Methods. 12, 105-14.

4. Simpson, R. T. (1999) In vivo methods to analyze chromatin structure, Curr Opin Genet Dev. 9, 225-9.

5. McGhee, J. D. & Felsenfeld, G. (1979) Reaction of nucleosome DNA with dimethyl sulfate, Proc Natl Acad Sci USA. 76,2133-1.

6. Wellinger, R. E. & Sogo, J. M. (1998) In vivo mapping of nucleosomes using psoralen-DNA crosslinking and primer extension, Nucleic Acids Res. 26, 1544-5.

7. Pfeifer, G. P. & Tomaletti, S. (1997) Footprinting with UV irradiation and LMPCR, Methods. 11, 189-96.

8. Wang, X. & Simpson, R. T. (2001) Chromatin structure mapping in Saccharomyces cerevisiae in vivo with DNase I, Nucleic Acids Res. 29, 1943-50.

9. Singh, J. & Klar, A. J. (1992) Active genes in budding yeast display enhanced in vivo accessibility to foreign DNA methylases: a novel in vivo probe for chromatin structure of yeast, Genes Dev. 6,186-96.

10. Kudriashova, I. В., Kirnos, M. D. & Vaniushin, B. F. (1976) DNA-methylase activities from animal mitochondria and nuclei: different specificity of DNA methylation., Biokhimiia. 41, 196877.

11. Hattman, S., Kenny, C., Berger, L. & Pratt, K. (1978) Comparative study of DNA methylation in three unicellular eucaryotes, JBacteriol. 135, 1156-7.

12. Hoekstra, M. F. & Malone, R. E. (1985) Expression of the Escherichia coli dam methylase in Saccharomyces cerevisiae: effect of in vivo adenine methylation on genetic recombination and mutation, Mol Cell Biol. 5, 610-8.

13. Wines, D. R., Talbert, P. В., Clark, D. V. & Henikoff, S. (1996) Introduction of a DNA methyltransferase into Drosophila to probe chromatin structure in vivo, Chromosoma. 104, 332-40.

14. Gottschling, D. E. (1992) Telomere-proximal DNA in Saccharomyces cerevisiae is refractory to methyltransferase activity in vivo, Proc Natl Acad Sci USA. 89, 4062-5.

15. Boivin, A. & Dura, J. M. (1998) In vivo chromatin accessibility correlates with gene silencing in Drosophila, Genetics. 150, 1539-49.

16. Komberg, R. D. (1974) Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA, Science. 184, 868-71.

17. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F. & Richmond, T. J. (1997) Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution, Nature. 389, 251-60.

18. Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W. & Richmond, T. J. (2002) Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution, J Mol Biol. 319, 1097-113.

19. Spencer, V. A. & Davie, J. R. (1999) Role of covalent modifications of histones in regulating gene expression, Gene. 240, 1-12.

20. Wolffe, A. P. & Hayes, J. J. (1999) Chromatin disruption and modification, Nucleic Acids Res. 27,711-20.

21. Garcia-Ramirez, M., Dong, F. & Ausio, J. (1992) Role of the histone "tails" in the folding of oligonucleosomes depleted of histone YLl,JBiol Chem. 267, 19587-95.

22. Tse, C. & Hansen, J. C. (1997) Hybrid trypsinized nucleosomal arrays: identification of multiple functional roles of the H2A/H2B and H3/H4 N-termini in chromatin fiber compaction, Biochemistry. 36, 11381-8.

23. Dorigo, В., Schalch, Т., Bystricky, K. & Richmond, T. J. (2003) Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail, J Mol Biol. 327, 85-96.

24. Zheng, C. & Hayes, J. J. (2003) Intra- and inter-nucleosomal protein-DNA interactions of the core histone tail domains in a model system, J Biol Chem. 278, 24217-24.

25. Thoma, F., Koller, T. & Klug, A. (1979) Involvement of histone HI in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin, J Cell Biol. 83, 403-27.

26. Bartolome, S., Bermudez, A. & Daban, J. R. (1994) Internal structure of the 30 nm chromatin fiber, J Cell Sci. 107 (Pt 11), 2983-92.

27. Robinson, P. J., Fairall, L., Huynh, V. A. & Rhodes, D. (2006) EM measurements define the dimensions of the "30-nm" chromatin fiber: Evidence for a compact, interdigitated structure, Proc Natl Acad Sci USA. 103, 6506-11.

28. Dorigo, В., Schalch, Т., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R. & Richmond, T. J. (2004) Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber, Science. 306,1571-3.

29. Marsden, M. P. & Laemmli, U. K. (1979) Metaphase chromosome structure: evidence for a radial loop model, Cell. 17, 849-58.

30. Belmont, A. S. & Bruce, K. (1994) Visualization of G1 chromosomes: a folded, twisted, supercoiled chromonema model of interphase chromatid structure, J Cell Biol. 127, 287-302.

31. Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T. & Belmont, A. S. (2004) Visualization of early chromosome condensation: a hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure, J Cell Biol. 166, 775-85.

32. Shrader, Т. E. & Crothers, D. M. (1989) Artificial nucleosome positioning sequences, Proc Natl Acad Sci USA. 86, 7418-22.

33. Blank, T. A. & Becker, P. B. (1995) Electrostatic mechanism of nucleosome spacing, J Mol Biol. 252, 305-13.

34. Baldi, P., Brunak, S., Chauvin, Y. & Krogh, A. (1996) Naturally occurring nucleosome positioning signals in human exons and introns, J Mol Biol. 263, 503-10.

35. Stein, A. & Bina, M. (1999) A signal encoded in vertebrate DNA that influences nucleosome positioning and alignment, Nucleic Acids Res. 27, 848-53.

36. Cioffi, A., Dalai, Y. & Stein, A. (2004) DNA sequence alterations affect nucleosome array formation of the chicken ovalbumin gene, Biochemistry. 43, 6709-22.

37. Shen, С. H. & Clark, D. J. (2001) DNA sequence plays a major role in determining nucleosome positions in yeast CUP1 chromatin, J Biol Chem. 276, 35209-16.

38. Dalai, Y., Fleury, T. J., Cioffi, A. & Stein, A. (2005) Long-range oscillation in a periodic DNA sequence motif may influence nucleosome array formation, Nucleic Acids Res. 33, 934-45.

39. Cioffi, A., Fleury, T. J. & Stein, A. (2006) Aspects of large-scale chromatin structures in mouse liver nuclei can be predicted from the DNA sequence, Nucleic Acids Res. 34, 1974-81.

40. Lowary, P. T. & Widom, J. (1997) Nucleosome packaging and nucleosome positioning of genomic DNA, Proc Natl Acad Sci USA. 94, 1183-8.

41. Pennings, S., Allan, J. & Davey, C. S. (2005) DNA methylation, nucleosome formation and positioning, Brief Fund Genomic Proteomic. 3, 351-61.

42. Davey, C., Pennings, S. & Allan, J. (1997) CpG methylation remodels chromatin structure in vitro, J Mol Biol. 267, 276-88.

43. Pazin, M. J., Bhargava, P., Geiduschek, E. P. & Kadonaga, J. T. (1997) Nucleosome mobility and the maintenance of nucleosome positioning, Science. 276, 809-12.

44. Beato, M. & Eisfeld, K. (1997) Transcription factor access to chromatin, Nucleic Acids Res. 25, 3559-63.

45. Chen, C. & Yang, T. P. (2001) Nucleosomes are translationally positioned on the active allele and rotationally positioned on the inactive allele of the HPRT promoter, Mol Cell Biol. 21, 7682-95.

46. Sewack, G. F. & Hansen, U. (1997) Nucleosome positioning and transcription-associated chromatin alterations on the human estrogen-responsive pS2 promoter, J Biol Chem. 272, 3111829.

47. Vignali, M., Hassan, A. H., Neely, К. E. & Workman, J. L. (2000) ATP-dependent chromatin-remodeling complexes, Mol Cell Biol. 20,1899-910.

48. Reinke, H. & Horz, W. (2003) Histones are first hyperacetylated and then lose contact with the activated PH05 promoter, Mol Cell. 11, 1599-607.

49. Flavin, M., Cappabianca, L., Kress, C., Thomassin, H. & Grange, T. (2004) Nature of the accessible chromatin at a glucocorticoid-responsive enhancer, Mol Cell Biol. 24, 7891-901.

50. Fazzio, T. G. & Tsukiyama, T. (2003) Chromatin remodeling in vivo: evidence for a nucleosome sliding mechanism, Mol Cell. 12, 1333-40.

51. Schwanbeck, R., Xiao, H. & Wu, C. (2004) Spatial contacts and nucleosome step movements induced by the NURF chromatin remodeling complex, J Biol Chem. 279, 39933-41.

52. Kingston, R. E. & Narlikar, G. J. (1999) ATP-dependent remodeling and acetylation as regulators of chromatin fluidity, Genes Dev. 13, 2339-52.

53. Aalfs, J. D. & Kingston, R. E. (2000) What does 'chromatin remodeling* mean?, Trends Biochem Sci. 25, 548-55.

54. Eberharter, A. & Becker, P. B. (2004) ATP-dependent nucleosome remodelling: factors and functions, J Cell Sci. 117, 3707-11.

55. Cuthbert, G. L., Daujat, S., Snowden, A. W., Erdjument-Bromage, H., Hagiwara, Т., Yamada, M., Schneider, R., Gregory, P. D., Tempst, P., Bannister, A. J. & Kouzarides, T. (2004) Histone deimination antagonizes arginine methylation, Cell. 118, 545-53.

56. Eberharter, A. & Becker, P. B. (2002) Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. Second in review series on chromatin dynamics, EMBO Rep. 3, 224-9.

57. Furumatsu, Т., Tsuda, M., Yoshida, K., Taniguchi, N., Ito, Т., Hashimoto, M. & Asahara, H. (2005) Sox9 and рЗОО cooperatively regulate chromatin-mediated transcription, J Biol Chem. 280, 35203-8.

58. Berger, S. L. (1999) Gene activation by histone and factor acetyltransferases, Curr Opin Cell Biol. 11, 336-41.

59. Mutskov, V., Gerber, D., Angelov, D., Ausio, J., Workman, J. & Dimitrov, S. (1998) Persistent interactions of core histone tails with nucleosomal DNA following acetylation and transcription factor binding, Mol Cell Biol. 18, 6293-304.

60. Edmondson, D. G., Smith, M. M. & Roth, S. Y. (1996) Repression domain of the yeast.global repressor Tupl interacts directly with histones H3 and H4, Genes Dev. 10, 1247-59.

61. Garcia-Ramirez, M., Rocchini, C. & Ausio, J. (1995) Modulation of chromatin folding by histone acetylation, J Biol Chem. 270, 17923-8.

62. Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. M., Pazin, M. J., Davie, J. R. & Peterson, C. L. (2006) Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions, Science. 311, 844-7.

63. Hansen, J. C., Tse, C. & Wolffe, A. P. (1998) Structure and function of the core histone N-termini: more than meets the eye, Biochemistry. 37, 17637-41.

64. Marmorstein, R. (2001) Protein modules that manipulate histone tails for chromatin regulation, Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 422-32.

65. Bauer, U. M., Daujat, S., Nielsen, S. J., Nightingale, K. & Kouzarides, T. (2002) Methylation at arginine 17 of histone H3 is linked to gene activation, EMBO Rep. 3, 39-44.

66. Cheung, P. & Lau, P. (2005) Epigenetic regulation by histone methylation and histone variants, Mol Endocrinol. 19, 563-73.

67. Cowell, I. G., Aucott, R., Mahadevaiah, S. K., Burgoyne, P. S., Huskisson, N., Bongiorni, S., Prantera, G., Fanti, L., Pimpinelli, S., Wu, R., Gilbert, D. M., Shi, W., Fundele, R., Morrison, H.,

68. Jeppesen, P. & Singh, P. B. (2002) Heterochromatin, HP1 and methylation at lysine 9 of histone H3 in animals, Chromosoma. Ill, 22-36.

69. McBride, A. E. & Silver, P. A. (2001) State of the arg: protein methylation at arginine comes of age, Cell. 106, 5-8.

70. Ahmad, K. & Henikoff, S. (2002) Histone H3 variants specify modes of chromatin assembly, Proc Natl Acad Sci USA. 99 Suppl 4, 16477-84.

71. Duina, A. A. & Winston, F. (2004) Analysis of a mutant histone H3 that perturbs the association of Swi/Snfwith chromatin, Mol Cell Biol. 24, 561-72.

72. Krajewski, W. A. & Becker, P. B. (1998) Reconstitution of hyperacetylated, DNase I-sensitive chromatin characterized by high conformational flexibility of nucleosomal DNA, Proc Natl Acad Sci USA. 95, 1540-5.

73. Nowak, S. J. & Corces, V. G. (2000) Phosphorylation of histone H3 correlates with transcriptionally active loci, Genes Dev. 14, 3003-13.

74. Davie, J. R. & Murphy, L. C. (1990) Level of ubiquitinated histone H2B in chromatin is coupled to ongoing transcription, Biochemistry. 29, 4752-7.

75. Jason, L. J., Finn, R. M., Lindsey, G. & Ausio, J. (2005) Histone H2A ubiquitination does not preclude histone HI binding, but it facilitates its association with the nucleosome, J Biol Chem. 280, 4975-82.

76. Lee, H. L. & Archer, Т. K. (1998) Prolonged glucocorticoid exposure dephosphorylates histone HI and inactivates the MMTV promoter, Embo J. 17, 1454-66.

77. Poirier, G. G., de Murcia, G., Jongstra-Bilen, J., Niedergang, C. & Mandel, P. (1982) Poly(ADP-ribosyl)ation of polynucleosomes causes relaxation of chromatin structure, Proc Natl Acad Sci USA. 79, 3423-7.

78. Mersfelder, E. L. & Parthun, M. R. (2006) The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure, Nucleic Acids Res. 34, 2653-62.

79. Park, J. H., Cosgrove, M. S., Youngman, E., Wolberger, C. & Boeke, J. D. (2002) A core nucleosome surface crucial for transcriptional silencing, Nat Genet. 32, 273-9.

80. Cosgrove, M. S., Boeke, J. D. & Wolberger, C. (2004) Regulated nucleosome mobility and the histone code, Nat Struct Mol Biol. 11, 1037-43.

81. Li, G., Levitus, M., Bustamante, C. & Widom, J. (2005) Rapid spontaneous accessibility of nucleosomal DNA, Nat Struct Mol Biol. 12, 46-53.

82. Hyland, E. M., Cosgrove, M. S., Molina, H., Wang, D., Pandey, A., Cottee, R. J. & Boeke, J. D. (2005) Insights into the role of histone H3 and histone H4 core modifiable residues in Saccharomyces cerevisiae, Mol Cell Biol. 25, 10060-70.

83. Xu, F., Zhang, K. & Grunstein, M. (2005) Acetylation in histone H3 globular domain regulates gene expression in yeast, Cell. 121, 375-85.

84. Noma, K., Allis, C. D. & Grewal, S. I. (2001) Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries, Science. 293, 1150-5.

85. Braunstein, M., Sobel, R. E., Allis, C. D., Turner, В. M. & Broach, J. R. (1996) Efficient transcriptional silencing in Saccharomyces cerevisiae requires a heterochromatin histone acetylation pattern, Mol Cell Biol. 16, 4349-56.

86. Jenuwein, T. & Allis, C. D. (2001) Translating the histone code, Science. 293, 1074-80.

87. Strahl, B. D. & Allis, C. D. (2000) The language of covalent histone modifications, Nature. 403, 41-5.

88. Bernstein, E. & Allis, C. D. (2005) RNA meets chromatin, Genes Dev. 19, 1635-55.

89. Akhtar, A., Zink, D. & Becker, P. B. (2000) Chromodomains are protein-RNA interaction modules, Nature. 407,405-9.

90. Muchardt, C., Guilleme, M., Seeler, J. S., Trouche, D., Dejean, A. & Yaniv, M. (2002) Coordinated methyl and RNA binding is required for heterochromatin localization of mammalian HP 1 alpha, EMBO Rep. 3, 975-81.

91. Heard, E. (2004) Recent advances in X-chromosome inactivation, Curr Opin Cell Biol. 16, 247-55.

92. Schramke, V. & Allshire, R. (2003) Hairpin RNAs and retrotransposon LTRs effect RNAi and chromatin-based gene silencing, Science. 301, 1069-74.

93. Pusarla, R. H. & Bhargava, P. (2005) Histones in functional diversification. Core histone variants, Febs J. 272, 5149-68.

94. Kamakaka, R. T. & Biggins, S. (2005) Histone variants: deviants?, Genes Dev. 19, 295-310.

95. Catez, F., Yang, H., Tracey, K. J., Reeves, R., Misteli, T. & Bustin, M. (2004) Network of dynamic interactions between histone HI and high-mobility-group proteins in chromatin, Mol Cell Biol. 24, 4321-8.

96. Bianchi, M. E. & Beltrame, M. (2000) Upwardly mobile proteins. Workshop: the role of HMG proteins in chromatin structure, gene expression and neoplasia, EMBO Rep. 1,109-14.

97. Eissenberg, J. C. & Elgin, S. C. (2000) The HP1 protein family: getting a grip on chromatin, Curr Opin Genet Dev. 10, 204-10.

98. Grunstein, M. (1998) Yeast heterochromatin: regulation of its assembly and inheritance by histones, Cell. 93, 325-8.

99. Kass, S. U., Pruss, D. & Wolffe, A. P. (1997) How does DNA methylation repress transcription?, Trends Genet. 13, 444-9.

100. White, C. L., Suto, R. K. & Luger, K. (2001) Structure of the yeast nucleosome core particle reveals fundamental changes in internucleosome interactions, Embo J. 20, 5207-18.

101. Avramova, Z. V. (2002) Heterochromatin in animals and plants. Similarities and differences, Plant Physiol. 129, 40-9.

102. Arney, K. L. & Fisher, A. G. (2004) Epigenetic aspects of differentiation, J Cell Sci. 117, 4355-63.

103. Cleveland, D. W., Mao, Y. & Sullivan, K. F. (2003) Centromeres and kinetochores: from epigenetics to mitotic checkpoint signaling, Cell. 112,407-21.

104. LeBel, C. & Wellinger, R. J. (2005) Telomeres: what's new at your end?, J Cell Sci. 118, 2785-8.122. de Lange, T. (2005) Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres, Genes Dev. 19, 2100-10.

105. Fajkus, J. & Trifonov, E. N. (2001) Columnar packing of telomeric nucleosomes, Biochem Biophys Res Commun. 280, 961-3.

106. Nikitina, T. & Woodcock, C. L. (2004) Closed chromatin loops at the ends of chromosomes, J Cell Biol. 166, 161-5.

107. Sadaie, M., Naito, T. & Ishikawa, F. (2003) Stable inheritance of telomere chromatin structure and function in the absence of telomeric repeats, Genes Dev. 17, 2271-82.

108. Bottomley, M. J. (2004) Structures of protein domains that create or recognize histone modifications, EMBORep. 5, 464-9.

109. Di Mauro, E., Verdone, L., Chiappini, B. & Caserta, M. (2002) In vivo changes of nucleosome positioning in the pretranscription state, J Biol Chem. 277, 7002-9.

110. Truss, M., Candau, R., Chavez, S. & Beato, M. (1995) Transcriptional control by steroid hormones: the role of chromatin, Ciba Found Symp. 191, 7-17; discussion 17-23.

111. Nemeth, A. & Langst, G. (2004) Chromatin higher order structure: opening up chromatin for transcription, Brief Fund Genomic Proteomic. 2, 334-43.

112. Lorch, Y., Maier-Davis, B. & Romberg, R. D. (2006) Chromatin remodeling by nucleosome disassembly in vitro, Proc Natl Acad Sci USA. 103, 3090-3.

113. Syntichaki, P., Topalidou, I. & Thireos, G. (2000) The Gcn5 bromodomain co-ordinates nucleosome remodelling, Nature. 404, 414-7.

114. Krebs, J. E., Fry, C. J., Samuels, M. L. & Peterson, C. L. (2000) Global role for chromatin remodeling enzymes in mitotic gene expression, Cell. 102, 587-98.

115. Memedula, S. & Belmont, A. S. (2003) Sequential recruitment of HAT and SWI/SNF components to condensed chromatin by VP16, CurrBiol. 13, 241-6.

116. Gelbart, M. E., Bachman, N., Delrow, J., Boeke, J. D. & Tsukiyama, T. (2005) Genome-wide identification of Isw2 chromatin-remodeling targets by localization of a catalytically inactive mutant, Genes Dev. 19, 942-54.

117. Georgel, P. Т., Fletcher, Т. M., Hager, G. L. & Hansen, J. C. (2003) Formation of higher-order secondary and tertiary chromatin structures by genomic mouse mammary tumor virus promoters, Genes Dev. 17, 1617-29.

118. Gilbert, N. & Ramsahoye, B. (2005) The relationship between chromatin structure and transcriptional activity in mammalian genomes, Brief Funct Genomic Proteomic. 4,129-42.

119. Chambeyron, S. &Bickmore, W. A. (2004) Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription, Genes Dev. 18, 1119-30.

120. Hill, D. A., Peterson, C. L. & Imbalzano, A. N. (2005) Effects of HMGN1 on chromatin structure and SWI/SNF-mediated chromatin remodeling, J Biol Chem. 280, 41777-83.

121. Park, Y. J., Chodaparambil, J. V., Bao, Y., McBryant, S. J. & Luger, K. (2005) Nucleosome assembly protein 1 exchanges histone H2A-H2B dimers and assists nucleosome sliding, J Biol Chem. 280, 1817-25.

122. Thiel, G., Lietz, M. & Hohl, M. (2004) How mammalian transcriptional repressors work, Eur JBiochem. 271,2855-62.

123. Padjen, K., Ratnam, S. & Storb, U. (2005) DNA methylation precedes chromatin modifications under the influence of the strain-specific modifier Ssml, Mol Cell Biol. 25, 4782-91.

124. Hashimshony, Т., Zhang, J., Keshet, I., Bustin, M. & Cedar, H. (2003) The role of DNA methylation in setting up chromatin structure during development, Nat Genet. 34, 187-92.

125. Bachman, К. E., Park, В. H., Rhee, I., Rajagopalan, H., Herman, J. G., Baylin, S. В., Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. (2003) Histone modifications and silencing prior to DNA methylation of a tumor suppressor gene, Cancer Cell. 3, 89-95.

126. Mutskov, V. & Felsenfeld, G. (2004) Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9, Embo J. 23, 138-49.

127. Tamaru, H. & Selker, E. U. (2001) A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa, Nature. 414, 277-83.

128. Khan, A. U. & Hampsey, M. (2002) Connecting the DOTs: covalent histone modifications and the formation of silent chromatin, Trends Genet. 18, 387-9.

129. Forsberg, E. С. & Bresnick, E. H. (2001) Histone acetylation beyond promoters: long-range acetylation patterns in the chromatin world, Bioessays. 23, 820-30.

130. Haq'u, S., McQueen, K. J. & Peterson, K. R. (2002) Chromatin structure and control of betalike globin gene switching, Exp Biol Med (Maywood). 227, 683-700.

131. Burgess-Beusse, В., Farrell, C., Gaszner, M., Litt, M., Mutskov, V., Recillas-Targa, F., Simpson, M., West, A. &Felsenfeld, G. (2002) The insulation of genes from external enhancers and silencing chromatin, Proc Natl Acad Sci USA. 99 Suppl 4, 16433-7.

132. Belmont, A. (2003) Dynamics of chromatin, proteins, and bodies within the cell nucleus, Curr Opin Cell Biol. 15, 304-10.

133. Cremer, T. & Cremer, C. (2001) Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells, Nat Rev Genet. 2, 292-301.

134. Cockell, M. & Gasser, S. M. (1999) Nuclear compartments and gene regulation, Curr Opin Genet Dev. 9, 199-205.

135. Gilfillan, G. D., Dahlsveen, I. K. & Becker, P. B. (2004) Lifting a chromosome: dosage compensation in Drosophila melanogaster, FEBS Lett. 567, 8-14.

136. Lipford, J. R. & Bell, S. P. (2001) Nucleosomes positioned by ORC facilitate the initiation of DNA replication, Mol Cell. 7, 21-30.

137. Flanagan, J. F. & Peterson, C. L. (1999) A role for the yeast SWVSNF complex in DNA replication, Nucleic Acids Res. 27, 2022-8.

138. Gruss, C., Wu, J., Roller, T. & Sogo, J. M. (1993) Disruption of the nucleosomes at the replication fork, Embo J. 12, 4533-45.

139. Tagami, H., Ray-Gallet, D., Almouzni, G. & Nakatani, Y. (2004) Histone H3.1 and H3.3 complexes mediate nucleosome assembly pathways dependent or independent of DNA synthesis, Cell. 116, 51-61.

140. Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. В., Turner, В. M. & Almouzni, G. (1999) Duplication and maintenance ofheterochromatin domains, J Cell Biol. 147, 1153-66.

141. Verreault, A., Kaufman, P. D., Kobayashi, R. & Stillman, B. (1996) Nucleosome assembly by a complex of CAF-1 and acetylated histones H3/H4, Cell. 87, 95-104.

142. Shibahara, K. & Stillman, B. (1999) Replication-dependent marking of DNA by PCNA facilitates CAF-l-coupled inheritance of chromatin, Cell. 96, 575-85.

143. Mosammaparast, N., Ewart, C. S. & Pemberton, L. F. (2002) A role for nucleosome assembly protein 1 in the nuclear transport of histones H2A and H2B, Embo J. 21, 6527-38.

144. Verreault, A. (2000) De novo nucleosome assembly: new pieces in an old puzzle, Genes Dev. 14, 1430-8.

145. Ehrenhofer-Murray, A. E. (2004) Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair, Eur JBiochem. 271, 2335-49.

146. Meijsing, S. H. & Ehrenhofer-Murray, A. E. (2001) The silencing complex SAS-I links histone acetylation to the assembly of repressed chromatin by CAF-I and Asfl in Saccharomyces cerevisiae, Genes Dev. 15, 3169-82.

147. Milutinovic, S., Zhuang, Q. & Szyf, M. (2002) Proliferating cell nuclear antigen associates with histone deacetylase activity, integrating DNA replication and chromatin modification, J Biol Chem. 277, 20974-8.

148. Chuang, L. S., Ian, H. I., Koh, T. W., Ng, H. H., Xu, G. & Li, B. F. (1997) Human DNA-(cytosine-5) methyltransferase-PCNA complex as a target for p21WAFl, Science. 277, 1996-2000.

149. Rountree, M. R., Bachman, К. E. & Baylin, S. B. (2000) DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci, Nat Genet. 25, 269-77.

150. Moshkin, Y. M., Armstrong, J. A., Maeda, R. K., Tamkun, J. W., Verrijzer, P., Kennison, J. A. & Karch, F. (2002) Histone chaperone ASF1 cooperates with the Brahma chromatin-remodelling machinery, Genes Dev. 16,2621-6.

151. Felsenfeld, G., Clark, D. & Studitsky, V. (2000) Transcription through nucleosomes, Biophys Chem. 86, 231-7.

152. Kaplan, C. D., Laprade, L. & Winston, F. (2003) Transcription elongation factors repress transcription initiation from cryptic sites, Science. 301, 1096-9.

153. Nourani, A., Robert, F. & Winston, F. (2006) Evidence that Spt2/Sinl, an HMG-like factor, plays roles in transcription elongation, chromatin structure, and genome stability in Saccharomyces cerevisiae, Mol Cell Biol. 26, 1496-509.

154. Wang, A., Kurdistani, S. K. & Grunstein, M. (2002) Requirement of Hos2 histone deacetylase for gene activity in yeast, Science. 298, 1412-4.

155. Ferreiro, J. A., Powell, N. G., Karabetsou, N., Mellor, J. & Waters, R. (2006) Roles for Gcn5p and Ada2p in transcription and nucleotide excision repair at the Saccharomyces cerevisiae MET 16 gene, Nucleic Acids Res. 34, 976-85.

156. Orlando, V., Strutt, H. & Paro, R. (1997) Analysis of chromatin structure by in vivo formaldehyde cross-linking, Methods. 11, 205-14.

157. Sun, F. L., Cuaycong, M. H. & Elgin, S. C. (2001) Long-range nucleosome ordering is associated with gene silencing in Drosophila melanogaster pericentric heterochromatin, Mol Cell Biol. 21, 2867-79.

158. Suter, В., Livingstone-Zatchej, M. & Thoma, F. (1997) Chromatin structure modulates DNA repair by photolyase in vivo, Embo J. 16, 2150-60.

159. Kladde, M. P. & Simpson, R. T. (1994) Positioned nucleosomes inhibit Dam methylation in vivo, Proc Natl Acad Sci USA. 91, 1361-5.

160. Cheng, Т. H. & Gartenberg, M. R. (2000) Yeast heterochromatin is a dynamic structure that requires silencers continuously, Genes Dev. 14, 452-63.

161. Mueller, P. R. & Wold, B. (1989) In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR, Science. 246, 780-6.

162. Komura, J. & Riggs, A. D. (1998) Terminal transferase-dependent PCR: a versatile and sensitive method for in vivo footprinting and detection of DNA adducts, Nucleic Acids Res. 26, 1807-11.

163. Carter, N. P. & Vetrie, D. (2004) Applications of genomic microarrays to explore human chromosome structure and function, Hum Mol Genet. 13 Spec No 2, R297-302.

164. Lee Kang, S. H., Vieira, K. & Bungert, J. (2002) Combining chromatin immunoprecipitation and DNA footprinting: a novel method to analyze protein-DNA interactions in vivo, Nucleic Acids Res. 30, e44.

165. Low, D. A., Weyand, N. J. & Mahan, M. J. (2001) Roles of DNA adenine methylation in regulating bacterial gene expression and virulence, Infect Immun. 69, 7197-204.

166. Herman, G. E. & Modrich, P. (1982) Escherichia coli dam methylase. Physical and catalytic properties of the homogeneous enzyme, J Biol Chem. 257, 2605-12.

167. Maniatis, Т., Fritsch, E. F. & Sambrook. (1989) Molecular cloning: A Laboratory manual, 2nd edition edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

168. Inoue, H., Nojima, H. & Okayama, H. (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids, Gene. 96, 23-8.

169. Seibler, J. & Bode, J. (1997) Double-reciprocal crossover mediated by FLP-recombinase: a concept and an assay, Biochemistry. 36, 1740-7.

170. Feigner, P. L., Gadek, T. R., Holm, M., Roman, R., Chan, H. W., Wenz, M., Northrop, J. P., Ringold, G. M. & Danielsen, M. (1987) Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure, Proc Natl Acad Sci USA. 84, 7413-7.

171. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. Т., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J. & Klenk, D. C. (1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid, Anal Biochem. 150, 76-85.

172. Miller, J. H. (1972) Experiments in molecular genetics., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

173. Nakai, H., Storm, T. A. & Kay, M. A. (2000) Recruitment of single-stranded recombinant adeno-associated virus vector genomes and intermolecular recombination are responsible for stable transduction of liver in vivo, J Virol. 74, 9451-63.

174. Wang, S. & Zhu, J. (2004) The hTERT gene is embedded in a nuclease-resistant chromatin domain, J Biol Chem. 279, 55401-10.