Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование структурно-функциональной организации района локуса prune у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурно-функциональной организации района локуса prune у Drosophila melanogaster"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. VI. В. ЛОМОНОСОВА . БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Р Г Б ОД

П ПЧ'Т 'Ьо;>

и uni На правах рукописи

УДК 575.577

«ВРСЙСВ Максим Витальевич

Исследование структурно-функциональной организации района локуса prune у Drosophlla melanogaster

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

- г -

Работа выполнена на Кафедре молекулярной биофизики Московского фчзико-технического института и в Институте молекулярной генетики РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук В.Е.Адаторцев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н.А.Чуриков

кандидат биологических наук ■ В.Г.Лунин

Ведущая организация: Институт биологии развития РАН

Защита состоится " / " 1094 г. в /0 чао

на заседании Специализированного ученого совета Д.053.05.70 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова

С Диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 1094 г.

Учен. Л секретарь Совета

кандидат, химических наук В.Н.Каграманов

Актуальность темы. Район локуеа prune является одним из наиболее подробно исследованных цитологическими и генетическими методами участков генома D.melanogaster (Гвоздев и др., 1975; Perrimon et al., 1984). Однако, к началу работы мРНК, синтезируемые в районе, не были идентифицированы. Интересной особенностью гена prune является высокоспецифическое летальное взаимодействие его мутантных аллелей с аутосомкым геном Killer of prune (Sturtevant, 1956), который гомологичен гену-супрессору метаста-зирования миеломных клеток мыши (Rosengard et al., 1989). Клонирование ДНК и построение рестриктной карты района локуса prune (Алаторцев, 1987) позволило перейти к изучению функционирования генов района на молекулярном уровне.

Задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение транскрипции в районе локуеа prune, идентификация транскрипта prune, а также анализ нуклеотидных последовательностей синтезируемых мРНК и возможных открытых рамок считывания в них.

Научная новизна результатов исследования. Проведен анализ транскрипции в районе локуса prune, в ходе которого идентифицирована мРНК prune. Впервые клонирована соответствующая ей полноразмерная кДНК. Показано, что мРНК prune сплайсируется и кодирует белок, возможно имеющий трансмембранный домен. Изучена транскрипция гена prune, подверженного сильному эффекту положения мозаичного типа в инверсии In(lLR)pn2a. Найдено, что суммарное количество мРНК prune снижено по сравнению с нормой в два раза, в то же время аберрантных транскриптов гена prune не обнаружено. Впервые у насекомых описан кластер, генов цитохромов Р450. Он расположен дистальнее гена prune. Клонирована кДНК одного из генов кластера, названного согласно принятой номенклатуре C/P4D2. Определена его экзон-интронная структура.

Практическая ценность. Клонированная кДНК гена prune может быть использована для экспериментальной проверки предположения о его трансмембранной природе, изучения функций белка Prune и механизмов рп/К-рп взаимодействия. Проведенный анализ транскрилт-ной организации района локуса prune и отобранные в ходе работы кДНК позволяют изучать возможность участия продуктов соседних с prune транскриптов, и, в частности цитохромов Р450, в определении prune функции. Клонированные кДНК также могут быть использованы в качестве молекулярных зондов при картирования точки стыка эу-гетерохроматина в инверсии ln(iLR)pn2a.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Ежегодной научной конференции ШТИ (Москва, 1990), Ежегодных научных конференциях ИМГ РАН (Москва, 1992, 1993, 1994), Отчетной конференции по программе "Приоритетные направления генетики" (Москва, 1993) и 35 Научной конференции по дрозофиле (Чикаго, США, 1994).

Обьем диссертации. Материал диссертации изложен на 103 страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков и 4 таблицы. Список цитированной литературы состоит из 142 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование в плазмидах, скрининг библиотек кДНК, введение радиоактивной метки в ДНК, Саузерн- и Нозерн-гибридизации, определение нуклеотидной последовательности проводили по стандартным методикам (Sambrook et al., 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для изучения структурно-функциональной организации района локуса prune бьио необходимо: во-первых, идентифицировать мРНК, синтезируемые в районе в норме, во-вторых, проследить за возможными изменениями их транс!;рипции в случае рп мутаций, в-третьих, проанализировав нуклеотидные последовательности транскриптов, определить возможные функции синтезируемых белков.

1. Транскрипция в районе локуса prune.

Прежде чем приступать к исследованию транскрипции, было необходимо получить набор отдельных фрагментов ДНК, заведомо покрывающих область локуса prune. Ранее было определено приблизительное расположение гена prune между точками 40 и 60 тан по рестриктной карте (,,ис. 1) (Алаторцев 1987). Поэтому EcoRI-EcoRI рестрикты космид рА54 и рА402 (Алаторцев, 1987), содержащие ДНК из этой области, были переклонированы в вектор pTZ19R и использовались в дальнейшем в качестве молекулярных зондов для Нозерн- анализа и скрининга библиотек кДНК (рис.1).

Нозерн-анализ показал, что в исследуемом районе синтезируется несколько мРНК. В случае мутантных рп аллелей наблюдаются нарушения только для одной из мРНК, считываемой около точки с координатой 55 тпн (рис.1). Зонд рА402.6 гибридизуется с двумя транскриптами размерами 5 и 1.3 тпн на блоте с иммобилизованной

Рисунок 1. Молекулярная структура района гена prune. (А) Координаты района из работы (Алаторцев, 1987). (Б) Гены района. (В) Локализация, размеры и экзон-интронная структура транскрип-тов. RNA С, RNA D и RNA А - из работы (Gandhi et al., 1992), TcD12 и TcD20 - из работы (Teng et al., 1991). Транскрипты приведены под соответствующими генами. Транскрипт 1(1)90 не идентифицирован. (Г) Рестриктная карта. Показаны положения сайтов рестриктазы EcoRI (Haenlln et al.. 1985; Dura et al., 1987). Приведены размеры рестриктов, с которыми гибридизуется зонд pl. (Д) Фрагменты геномной ДНК, использованные для Нозерн-аналиэа и при скрининге библиотек кДНК.

А б

В г

20

_1_

30

I

игр!

в» s

arm m с

з.о

j_1_l.

40

_1_

30

«о

1(1)90 СГГШ Г runt

А 01 ТШЭ с 1.72 TltlJ cU о tfiV»c=> l'an»

10.0 1.0 2.2

I _Il Ii

-1—Ь>«И

H402.51 UH

UÏ«4.1J

I

j»«4.i

- о -

поли (А)+ РНК из мух с диким аллелем Гена /липе (рис. 2А дор. 2). Мажорная мРНК размером 1.8 тпн отсутствует ь линиях о мутациями рп1 и рп3. Вместо нее у мух, несущих рп3 мутацию, появляется мРНК величиной 1.3 тпн Грис.2А дор.З), а у мух с мутацией рп1 -две мРНК размерами 1.5 тпн и 1 тпн (рис.2А дор.4). В случае ал-леля рпг существенных изменений транскрипции не обнаружено (рис.2А дор.1).

Для дальнейшего анализа транскрипции был проведен скрининг двух библиотек кДНК, полученных на основе поли(А)+ РНК, выделенных из куколок Canton S и имаго Oregon RC. В качестве зондов использовались рестрикты, приведенные на рисунке 1. В ходе скрининга были отобраны три различные кДНК сб.1, cl.72 и cl, которые локализуются в районе гена prune (рис.1). Нозерн-анализ показал, что клонированные кДНК соответствуют трем различным МРНК.

кДНК cl (размером 1.5 тпн), которая находится в левой части района (рис.1), гибридизуется с двумя транскриптами: мажорным размером 1.75 тпн и минорным - 5 тпн (рис-.2Б). В случае мутаций рп1 и рп3 выявляется также слабая полоса, соответствующая транскрипту величиной 1.5 тпн. Мажорная мРНК размером 1.75 тпн присутствует без существенных различий в количестве в линиях с нормальным рп* и мутантвыми аллелями гена prune: рпг и рг3. Меньшее количество транскрипта на дорожке, соответствующей линии рп2, обусловлено меньшим количеством нанесенного материала.

В правой области района локализуется кДНК сб.1 (рис.1). Она гибридизуется с транскриптом размером 1 тпн из имаго независимо от рп мутаций (рис.2В). Картина транскрипции сб.1 в куколках аналогична.

Исследуемые рп мутации нарушают транскрипцию в районе около точки с координатой 55 тпк по рестриктной карте (Алаторцев, 1987), где локачизуется кДНК cl.72 (рис.1) размером 1.77 тпн. Она была отобрана на зонд рА402.6 из библиотеки кДНК. сконструированных на поли(А)+ РКК из имаго. Картина гибридизации cl.72 (рис.2Г) аналогична гибридизации рестрикта рА402.б (рис.2А). Следует отметить, что рп3 мутация, приводит не только к изменению размера транскрипта prune, но также и к уменьшению его количества по сравнеюю с нормой. Это хорошо заметно в случае гетерозиготных самок, одна из хромосом которых несет мутантный рп3, а другая нормальный рп* аллель. На рисунке 23 представлен автограф Слотаа содержащего разные количества иоди(А)+ ГНК из мух с

Рисунок 2. Нозерн-анаяиз района гена prune. Картина гибридизации ^Р-меченой ДНК (А) рестрикта рА402.6, (Б) кДНК cl, (В) кДНК сб.1, (Г) кДНК с1.72 с .Слотом, содержащим поли(А)+ РНК из имаго с 1 - рпг, 2 - рп*, 3 - рп3 и 4 - рп1 аллелями гена prune. (Д) Картина гибридизации згР-меченой кДНК cl.72 с блотом, содержащим разные количества поли(А)+ РНК из самок с генотипом рп*/рп3. Стрелками показаны положения мРНК алкогольдегидрогеназы размером 1.1 тпн и а-тубулина размером 1.8 тпн после гибридизации данных блотов с соответствующими зондами pASlO (Goldberg, 1980) и pTu56 (Blalojan et al., 1984).

12 3 4

Б

12 3 4

J3

12 3 4

; в*»

p-r -.-„'1

Г

2 3 4

Д

Ь, f.w-.

I: r" ;

генотипом pn+/pn3, после гибридизации с с1.72. Как и следовало ожидать, выявляются две мажорных мРНК размерами 1.8 и 1.3 тпн, первая из которых соответствует транскрипту дикого типа, а вторая - аберрантному рп3. Как видно, количество транскрипта размером 1.8 тпн больше, чем количество мРНК размером 1.3 тпн. Но-зерн-анализ транскрипции в куколках не выявил гомологичных cl.72 мРНК. По-видимому, мРНК размером 1.8 тпн транскрибируется на стадии имаго и отсутствует в куколках.

Таким образом, клонированные кДНК соответствуют трем различным транскриптам, считывающими с различных областей района (рис.1). Из них в случае рп- мутаций изменениям в размере и количестве подвергается только транскрилт cl.72. Можно предположить, что он и является транскриптом гена prune.

2. Определение и анализ нуклеотидной последовательности транскрипта гена prune.

Клонированная кДНК гена prune cl.72 и соответствующие фрагменты геномной ДНК рА54.15 и рА402.6 (рис.1) были секвенированы по двум цепям. Экзон-интронная структура и направление транскрипции были выведены из сравнения нуклеотидных последовательностей геномной и кДНК. Нуклеотидная последовательность транскрипта prune была проанализирована на присутствие протяженных открытых рамок считывания.

Транскрипт prune состоит из двух экзонов размером 252 и 1521 нуклеотидов, которые разделены интроном протяженностью 69 нуклеотидов (рис.3). Последовательности на границах интрон-экзон соответствуют консенсусу сплайсинга (Mount, 1982). Старт транскрипции находится в положении 139 и совпадает в четырех из семи нуклеотидов с консетусной последовательностью сайта копирования (Hultmark, 1S86). Сигнал полиаденилирования ААТААА (Proudfoot, 1Э76) присутствует за 41 нуклеотид до поли(А) хвоста, начинающегося после нуклеотида 1980.

В транскрипте prune обнаружена одна открытая рамка считывания (ОРС) длиной 1212 нуклеотидов, кодирующая полипептид с молекулярным весом 44kD. ОРС начинается в положении 343 на кодоне АТ6 и заканчивается в положении 1624, где расположен кодон ТАА. Окружение инициаторного кодона хорошо согласуется с консенсусом старта трансляции, выведенному для дрозофилы (Cavener, 1987). Поскольку размеры кДНК (1.77 тпн) и мРНК (1.8 тпн) приблизитель-

î taccaagtgctatacatcacatatacagcagaagtcaaaccaaaatggatgcgctgcctt 51 atcagctaaatgggatcagctgaaagcacagaatgtggaataaacccaattaatgtgatt 121 aagcttagtaaacgagCgACCACAGATTACATTAGTQCSTTACAAACAAATGCATTATAT

241 TCAATCGATAAATGTCACATCGAATCGATAC5CGCAACTGTTGAAATATATGGAA6CTAT 301 CAGCCGrTTGTTTTCCCAGCTTTTCCGAGATTTCCCTAACAAATGTGCTTTCTACGATTT 1 ' METCvsPheLôuArgPhe

361 TTGGCCCAGGCCAGGGGCACCTTGGGACGGgtnnngaat tctgaaaEcagcaccagaagtg

7 LeuAlaSlnAlaArgGlyThrLeuGlyArg

421 agaaggtcaagcactaatagggt t tete t tctcgcgcagCATCTGGCGGAGaCCTCACCA 17 HisLBuAlaGluAlaSèiPr'O

481 GTTGCCTGGGCTGCTGCTCCCGACGTTTCCGGCCGGAAATTACATCTGGTAAÏGGGCAAG 24 ValAlaTrpAlaAlaAlaProAspValSerGlyArgLysLeuHlsLeuValMetGlyAsn

541 6AATC6TGTGACTTGGACTCCGCCGTTTCGGCCGTCACTTTGGCTTTTGTCIACGCAGCG 44 GluSerCysAspLeuAspSerAlaValSerA 1 aVal ThrLeuA 1 aPhe Val ТуrA 1 aAj. a

601 TCATCGGGAGCACGACTATGTACCTATACTGAACATTCCTCGCCGGGACTACCCGTTGAA 64 SerSerßlyAlaArgLeuCysThr'TyrThrGluHlsSerSerProGlyLeuProValGlu

661 AACCGAGGTGGGCCACTTGTTTGTGAAATGTGGGATTGCCGAGCCCGTGTTGCTCTTCCG 84 AsnArgGlyGlyProLeuValCysGluMetTrpAspCysArgAlaArgVal AlaLeuPro

721 AGACGATATTCCCCGGGAAGTGGTCCAGGATGTGAACGTTATTCTCGTGGACCACCATGT 104 ArgArgTyrSerProGlySerGlyProGlyCysGlaArgTyrSerArgGlyProProCys

781 AAGCCCTGGGCGCCAAATGTTACTGAAATTTTGGATCACAGGCCCTTGGAGGACAGCAGT 124 LysProTrpAlaProAsnValTh]GlalleLeuAspHisArgProL«uGluAsp3«r3er

841 CCATCCTTCAAGCAGCTGCCAACACTCTGCCAACTGGACATAGATGCCTCGGTGGGTTCC 144 ProSerPbeLysGlnLeuProThrLeuCvsGli îLbuAsp 11 eAspA 1 aSeï Val GlvSer

901 TGCGCCACTCTGGTGGCCCAGCGGTATTTGGCAGAGG/iCCAACCCCGATCCACTAGCSTG 164 CysAlaThrLeuValAlaGlnArgTyrLeuAlaGlaAspGlnProArgSérThrSerVal

961 GCCCAGCTGCTGCACGCCACCATCGTGCTGGACACAATTAATTTTGCACCCGCGGCCAAG 184 AlaGlnLeuLeuHlsAlaThrlleValLeuAspThrlleAsnPheAlaProAlaAlaLys

1021 CGCTACGGGCCAAAGGACGAAGCCATGGTACAGAAGTTGGAGAGCGAGCTTAACCGTAAG 204 ArgTyrGlyProLysAspGluAlaMetValGlnLysLeuGluSerGluLeuAsnArgLys

1081 GACGCTCAAAGAAGTAGCCTTTTTGATGAGCTAGTGGCÎGCAAGGGCGGATATTAGTAAG 224 AspAlaGlnArgSerSerLeuPheAspGluLeuValAlaAlaArgAlaAspIleSerLys

1141 CTMCTCTCACCGAAGTTTTGCGCAAGGATATGAAGGTCTrGCAAACCGATCGTCAGGTG 244 LeuThrLeuThrGluValLeuArgLysAspMetLysValLeuGlnThrAspArgGlnVal

1201 GTTCCCTTAGCTGGAATGCCCATCCTAGTCAGAGATTTTGTGGAGAAAAGCGGCGCCGAA 264 ValProLeuAlaGlyMetProlleLôuValArgAspPheValGluLysSerGlyAlaGlu

1261 AAAGCCGTTCGCGAGTTTGGCQTGGAGAGTAACCTTTTGGTTATCCTGGGAATGTATGTA 284 LysAlaValArgGluPheSlyValGluSerAsnLeuLeuValIleLeuGlvMetTyrVal

1321 TCACGTGCCGATGGCCAGGTGCAGCGTGACCTGGCCTTGATCTCTCTCTCCGGCCAAGGC 304 SerProAlaAspGlyGlnValGlnArgAspLeuAlaLeuIleSerLtiuSerGlvGlriGly

1381 CAATTCGTTCMC(XSTCCAGCAAGCACTGATQBAGTC7AACuATCCAAAATTGGAGTTG 324 GlnPtwValSlnArgValQlnGlnAlaLeuMstGluSerAsnAspProLysUuSluLeu

144. CGAOTCACGAGGTGGACArcceCTTTATGGGCGGCTGCTTCTTGCGCCAACACAAOrrC 344 ArgProHlsGluValAspThrArgPheMetGlyGlyCysPheLeuArgGinHlsAsnVal

1501 CAGGCCArcAGAMGCACATCCTGC(X!ATTGITMGCGAGCGCTGCTTGAATGGGAAGCG 364 GlnAlaThrArgLysHlsIleLeuProIleValLysArgAlaLeuLeuGluTrpGluAla

1561 GATCACGTOTGCGATTGTGACGAGGTGTACTTCTTCAAGGAGMGCCGCAGCTGGGACTC 384 AspHlsAlaCysAspCysAspGluValTyrPhePheLysGluLysProGlnLeuGlyLeu

1621 TCTTAAGAAGAGATCAGGCCAAACGGAAGCTTAGACAAGACTTAGCIATAATTTTAGCGC 404 SerEnd

1681 AACCGTTATGTTACCAACGTTAAGCTTACACCAAAAAGACATAGCGAATTTCCCATTTAC 1741 GATAAATTGAC6AAGGCAAGCGAGTGAAATATGGAAGCAATCAGTATTCCAAATTTAAGT 1801 TACTTTGCAACCTTGGTAACATAAAGGCAAATTAGTTTCAGAGTATTCACACATTAAQCT 1861 CTATCCAGTTTCCTAGTTGTTTATATGGATTAAGCGArTATGTACAGGGTATACATGGGT 1921 AAAASAAAGCGTTATGATTAATAAAAAAAAGGACTACAACTGTGGCTCGGTATCGTCAGC

Рисунок 3. Нуклеотидная последовательность кДНК cl.72 и предположительная аминокислотная последовательность белка Prune. Строчными буквами показаны нуклеотиды, которые присутствуют только в геномных рестриктах РА54.15 и рА402.6. Прописными буквами показаны нуклеотиды присутствующие как в кДНК, так и в геномной ДНК. Предположительный сайт кэпирования и сигнал полиаде-нилирования подчеркнуты. Пунктирной линией подчеркнута предположительная трансмембранная спираль. После нуклеотида 1980 начинается псишШ хвост.

-liso одинаковы, то можно заключить, что кДНК с1.72 является полноразмерной копией транскрипта prune. Выведенная ОРС заведомо содержит полную аминокислотную последовательность белка, поскольку в нуклеотидной последовательности до старта трансляции находится стоп-кодон в этой же рамке. Анализ предполагаемой аминокислотной последовательности белка Prune с помощью программ DNASAN и GeneBra не выявил протяженных областей гомологии с известными последовательностями из банка SWISSPROT (Release-21). С использованием программы PC/Gene в N-концевой области белка был обнаружен участок из 17 аминокислот, характерных для трансмембранной спирали (рис.3). Он начинается от аминокислоты 51 и заканчивается на аминокислоте 67. Десять из семнадцати аминокислот в нем имеют высоклй параметр предпочтительного нахождения в трансмембранных доменах (Rao & Argos, 1986).

3. Транскрипция гена prune при эффекте положения мозаичного типа в инверсии InClLR)pnZa.

В перицентрической инверсииJn(lLR)pn2a район 2D-E, включающий гены prune и Pgd, перенесен к притнтромерному гетерохрома-тину, что и является причиной их сильной мозаичной.инактивации (Алаторцев и др., 1982-, Толчков и др., 1984). Не обнаружено каких-либо значительных изменений ДНК, например делеций (Алаторцев, 1988). Представляется интересным проанализировать характер возможных нарушений транскрипции инактивированных генов при эффекте положения.

Для исследования транскрипции района локуса prune в перестройке был проведен Нозерн-анализ поли(А)+ РНК из самок In(lLR)pnZa/FU6_. На рис.4А приведена картина гибридизации 32Р меченой кДНК с1.72 гена prune с РНК-блотом. На дорожках 1 и 2 нанесена поли(А)+ РНК из самок In(lLR)pn2a/FM6 и мух Oregon RC соответственно. При гибридизации с РНК гетерозиготных по инверсии самок использованный зонд выявляет только одну мажорную мРНК размером 1.8 тпн, также как и в случав линии Oregon RC. Это указывает на отсутствие, при эффекте положения новых транскриптов с измененными размерами. Возможно, происходит уменьшение числа молекул мРНК. Однако, проведение таких экспериментов непосредственно для линии In(lLR)pn2a/FU6 осложнено.тем обстоятельством, что изменение транскрипции гена prune в инверсии будет происходить на фоне нормально работающего гена с хромосомы FM6. Позто-

Рисунок 4. (А) Автограф Нозерн-блота после гибридизации с 32Р-меченой кДНК с1.72. На дорожках нанесена поли(А)+ РНК из мух 1 - Oregon RC и 2 - Iп( 1LR) pnZa/'FM6. Стрелками показаны положения МРНК алкогольдегидрогеназы размером 1.1 тпн и В-тубулина размером 1.8 тпн после гибридизации данных блотов с соответствующими зондами pASiO (Goldberg, 1080) и pTu56 (Blalojan et al., 1984). (Б-Л) Денситограммы блота после гибридизации с 32Р-мечен-ной кДНК с1.72, содержащего поли(А)+ РНК из линий с генотипом (Б-В) ln(1LR) рп2а/рп3 и (Г-Д) FMB/pn3. Указаны положения транс-криптов размерами 1.8 тпн и 1.3 тпн.

А

Б

В

Г Д

1 2

1.1—

1.8-

му, в результате скрещивания самок Inf1LR)pn2a/FM6 с самцами рпэ ' га получены сестры FMß/pn3 и ln(1LR)pnZa/pn3. У самок с генотипом Jn(lLR) рп2а/рп3 мРНК гена prune размером 1.8 тпн целиком определяется хромосомой In(lLR)pnZa, тогда как с гомологичной Х-хромосомы, несущей аллель рп3, транскрибируется мРНК размером 1.3 тпн. На рис.4Б-Д приведены результаты денситометрирования блота, содержащего по две дорожки с поли(А)+ РНК из линий In(lLR)pn2a/pn3 (рис.4Б-В) и FV6/pn3 (рис.4Г-Д), после гибридизации с cl.72. В случае линии ГЫб/рп3, использованной в качестве контроля, выявляются две мажорные мРНК размерами 1.8 тпн и 1.3 тпн. Такие же по размеру транскрипты обнаруживаются и у самок Jn(lLR)pn2a/pn3. Из гибридизации этого же блота с геном алко-гольдегидрогеназы (данные не приведены) следует, что количество транскрипта размером 1.3 тпн на каждой дорожке пропорционально количеству нанесенной на дорожку РНК. Для каждой дорожки вес пика, соответствующего транскрипту размером 1.8 тпн, нормировался на вес пика, соответствующего транскрипту размером 1.3 тпн. Таким образом определялось удельное количество транскрипта размером 1.8 тпн в каждом препарате. В результате было определено, что -транскрипция гена prune в инверсии In(lLR)pnSa подавлена примерно в два раза по сравнению с нормой.

Итак, в инверсии Int 1LR)рп2а обнаружено уменьшение суммарного количества транскрипта гена prune, в то же время присутствия аберрантных мРНК не зафиксировано. По-видимому, возможной причиной инактивации гена при эффекте положения являются нарушения транскрипционного характера: по крайней мере для трех различных генов Sgs-4 (Kornher а Kauffman, 1986), rosy (Rushlow ot al.. 1984) и prune (представленные здесь результаты) в трех разных перестройках наблюдается уменьшение валового количества соответствующей мРНК.

4. Кластер генов цитохромов P45Q семейства 4, расположенный дисгальнее гена prune

Как было показано выше (см.п.1.), рп1 и рп3 мутации приводят к незначительным нарушениям в транскрипции мРНК cl, которая находится рядом с МРНК prune. Следовательно, не исключено, что продукт cl также может быть вовлечен в реализацию prune Функции. Поэтому представляло интерес понять, какой аминокислотный продукт синтезируется с cl. С этой целью были секвенироьакы по двум

цепям кДНК cl и фрагменты'геномных рестриктов рА402.51, рА54.10 и PA54.5 (рисЛ). Определенная последовательность была проанализированы на присутствие протяженных открытых рамок считывания. Экзон-интроняая структура и направление транскрипции были выведены из сравнения нуклеотидных последовательностей геномной и кДНК.

На рисунке 5 приведена нуклеотидная последовательность кДНК с.1 и соответствующих фрагментов геномной ДНК. Последовательность, начиная с 1 по 149 нуклеотид включительно, отсутствуют в КДНК и определена только по геномной ДНК. Оказалось, что транскрипт состоит из четырех интронов и пяти зкзонов. Для всех инт-ронов последовательности около границ экзон-интрон соответствуют консенсусу сплайсинга (Mount, 1982). Сигнал полиаденилирования (Proudfoot, 1977) находится в положении 1862. За ним через 17 нуклеотидов следует поли(А) хвост.

Обнаружена одна ОРС протяженностью 1488 нуклеотидов, которая начинается на кодоне АТ6 в положении 61 и заканчивается на стоп-кодове TGA в положении 1804. До ATG в той же рамке присутствует стоп-кодон. Окружение иниииаторного кодоиа CACAATG совпадает в шести из семи нуклеотидов с консеисусной последовательностью (C/A)AA(A/C)ATG старта трансляции у дрозофилы (Cavener, 1987). ОРС кодирует полипептид размером 496 аминокислот и молекулярным весом 57.5 KD.

Был проведен поиск гомологий выведенной аминокислотной последовательности с последовательностями из банка SWISSPRQT (Release-21) при программной поддержке DMASAN и GeneBee. Оказалось, что белок, кодируемый мРНК cl, гомологичен цитохромам Р450 семейства 4. Уровень гомологии с цитохромами млекопитающих составляет около 30-35Z. На рисунке 6 приведено множественное выравнивание с тремя цитохромами Р450 семейства 4 из крысы, кролика и дрозофилы. Особенно высокая степень гомологии (58%) обнаруживается для гена CYP4D1 дрозофилы, который расположен дисталь-нее гена prune на 20 тпн (Gandhi et al., 1993). Следует отметить высокое соответствие, наблюдаемое для всех консервативных аминокислот из гемсвязывающего участка в С-концевом районе, характерных для Р450 (положения 442-454) (Nebert & Gonzalez, 1987). Также хорошее совпадение наблюдается и для консервативного района для семейства 4 (Nhamburo et al., 1989, Bxadfleld et al., 1991) (положения, 304-316). Согласно принятой номенклатуре (Hébert, et

CCCCAGCTATATATTATTTATAGTATCGTTCÄGTAGÄÄCGCGTTTCTCGTTCGACGCACA. б 0 !

11 ATGCTGGGTGTTGTTGGGGTGCTCCTCCTGGTGGCGTTCGCCACACTGCTGCTGTGGGAT 120 MLGVVÍ1VLLLVAFATLLLWD

.21 TTCCTCTGGCGCAGGCGGGGCAATGGTATÄTTGCCGGGTCCGCGGCCACTTCCCTTCCTG 180

flwrrrgngilpgprplpfl

81 GGCAACCTGCTCATGTATCGCGGTCTAGATCCTGAACgtgagtttgagttCcagciCatC 240 1 GNLLMYRGLDPEQ

41 gatacagtttgttatctggccaaatctattgcaatccataatcattcccaataataatct 300 ;

01 gcagAAATAATGGACTTTGTCAAGAAGAACCAGCGCAAGTACGGTCGCCTTTACAGGGTG 361 IMDFVKKNQRKYGRLYRV

61 TGGATTCTCCACCAGTTGGCCGTCTTCTCCACGGATCCCCGAGACATTGAGTTCGTCTTG 420 WILHQLAVFSTDPRDIEFVL

21 AGCAGCCAGCAGCATATAACCAAGAATAATCTGTACAkGCTACTTAkCTGCTGGCTGGGC 480 SSQQHITKNNLYKLLNCWLG

81 GATGGATTGCTCATGAGCACGGGCAGGAAGTGGCATGGACGCAGAAAGATCATCACGCCC 540 DGLLM STGRKWHGRRKI I T P

41 ACCTTCCACTTCAAGATTTTGGAACAGTTCGTCGAGATATTCGACCAACAAAGCGCCGTA 600 TFHFKILEQFVEIFDQQSAV

Ol ATGGTGGAGCAGCTTCAGTCGCGCCGCGACGGCATGACTCCCATTAACATCTTTCCGGTG 660 MVEQ LQSRRDGMTPINIFPV

61 ATTTGTCTCACTGCCCTGGATATAATCGCAGgtgagtttgccattagtcttataaatatt 720 ICLTALDIIAE

21 tataacagcttaatactcgccgtttagAAACTGCAATGGGCACAAAAATCAATGCCCfAÁ 780

tamgtkihaqk

81 AAAATCCCAATCTGCCCTATGTCCAGGCTGTCAATGAgtgagtgtaatgataggtcgaat 840 NPNLPYVQAVND

41 cccacagttctgatgaattcttccttgtgacagTGTCACCAACATCTTGATTAAACGTTT ■ 900

vtnilikrf

101 TATCCACGCTTGGCAGCGGGTGGACTGGATTTTCCGGCTAACGCAGCCAACAGAAGCTAA 960 IHAWQRVDWIFRLTQPTEAK

161 ACGCCAGGACAAAGCTATCAAGGTAATGCACGACTTTACCGAGAACATTATCCGTGAGCG 1020 rqdkai k vmhdfteniirer

.021 gcgtgaaacgctggttaacaactcgaaggaaacaaccccagaagaggaagttaatttctt 1080 retlvmnskettpeeevnfl

1081 GGGCCAAAAGCGACGG ATGGCTCTGCTGGATGTGCTGCTGCAGTCCACAATCGATGGCGC 11 GQKRRMALLDVLLQSTIDGA

1141 CCCGTTGAGCGATGAGGATATCCGCGAAGAGGTTGACACGTTTATGTTCGAGGGCCATGA 12 PLSDEDIRE EVDTFHFEGHD

1201 CACGACTACCTCGGCGATTTCATTCTGTTTATATGAAATCTCAAGGCATCCGGAGGTCCA 12 _X_T TSAISFCLYEISRHPEVQ

1261 ACAGCGTCTGCAGCAGGAGATCCGCGACGTCCTCGGCGAGGATCGAAAGAGCCCAGTTAC 13 QRLQQEIRDVLGEDRKSPVT

1321 CCTTCGTGATCTTGGTGAGCTGAAGTTTATGGAGAACGTAATTAAGGAGTCGCTGCGCCT 13 LRDLGELKFMENVIKESLRL

1381 GCACCCGCCAGTGCCCATGATCGGTCGCTGGTTCGCCGAGGATGTGGAAATACgtaagaa 14 HPPVPMIGRWFAEDVEIR

1441 gttccatatgagattcttcaatctcaggtaaacatattgctcttgtcagGTGGCAAACAT 15i

G К H

1501 ATTCCAGOAGGCACCAACTTTACGATGGGCATCTTTGTTCTTCTTCGTGATCCTGAGTAC 15 ' IPAGTNFTMGIFVLLRDPEY

1561 TTCGAGTCTCCCGATGAGTTCCGACCGGAAAGATTCGATGCGGATGTCCCGCAGATTCAT 16: FESPDEFRPERFDADVPQIH

1621 CCGTATGCGTACATTCCTTTCTCCGCTGGACCAAGAAACTGTATTGGCCAGAAGTTTGCC 16! P Y A Y I P FSAGPRNCIOOKF A

1681 ATGCTGGAAATGAAGAGCACCGTCAGCAAGCTGCTCCGGCACTTCGAGCTGCTGCCCTTG 17. MLEMKSTVSKLLRKFELLPL

1741 GGTCCTGAGCCCCGCCACTCGATGAACATCGTCTGCGGTCCGCCAACGGCGTTCATCTTG 181 GPEPRHSMNIVCGRPTAFIL

1801 GCCTGMACCGCGCGCCTAAGG AATTC ATTCTTGTGGGTCTATCCAGCTCT ATTTGCATA 181 A *

1861 GAATAAACGTGTATACAAGTATT 181

Рисунок 5. Нуклеотидная последовательность гена CYP4DZ. КДНК cl начинается с нуклеочида 150. Предположительный сайт по-лиаденилирования находится в положении 1862. Строчными буквами показаны последовательности интронов. Приведена соответствующая аминокислотная последовательность. Участки, содержащие консервативный район для семейства 4 и гемсвязываший домен, подчеркнуты. а консе озааивные аминокислоты выделены жирным шрифтом.

1 4 22 22

M L|"G|V V G VIL L L

V I[GJA I L A SAlL

A F L L S L F["L1V|L

A A L L G L L| L L L

V A F[Â]TjTlL L W DÎT]L[w]R REG N G I F V G L Ljljy H L K[FJK RLXDLISY FKAVQFY-LRR Qfw] L L К A L Ë К L К A® 00* -LRR Q[W|L L(R]A L Q Q

: 31 l p G p r p l p

34 m p g p p v l p

: sx i? P rs £ p f h w

' 51 f LiJ С t p S H W

! 59 к к и Q r к Y g

1 64 f M e t I S к D

> 78 W v e к F p r A

> 75 W v e к f p g A

2 89 f v I s S Q Q h

L 94 V V L G T L R F

2 107 V I L G R S D P

5 104 V V L G R s D P

FjL G

L JQG LITT

R[L]Y Q V L

n l l m y rro|l|d~p)-h g h h f 1[о]к рщн hsrefq-mh-q h--n l к--¡3]- r

0 I M D -fF|V M V К К 1ЩЕ L - Q Q I L К F - Q Q V L T

G R К W HlGjR R К GR К W H I К1R R К G|Q PJWÍF Q H]R[R~M L

G1K[K_WJF Q HIRJR M L

S]A V[M]V E Q L -£jR D L L R N M E V Q IIMIL D К W E

sfrl- rQTGHm T[P]i МЦ F)p VfT d[rJl к h|gjd sgfslydw^ -lvsodssl e v f q _

v s i[mJl dkwek — l d[d]Q d H[p]L еПГПн Y v sljl

T A С T M T И T

2 177 |l d i i - - a e t a m g t к 1 h A Q к m P h l p y v 0 a v и

1 184 m d t i - - с e t a m g v s i m a 0 s h a d s e y v q a v к

2 194 II d t i m к с a f s y q g s v Q l d s r h s Q s v X|Q a v g

5 188 |l d t V m к с a f s h Q б 5 v Q L d v - n s r s V t к A v e

H]V T(¥JlfL]lfirR T I S M УЩН[к R D]L MfÏÏlL V F AIR D L S ML i F F R

F I H[¥]w QfRlV M F N X L- YlR|F VRMIFHQS V R S[Â]f Y G И

WjTjFlR l t y n

Т'хЩ* MMS-S-DG

R Q OK A A E К|КА L S H RÎA L S S RA

I кППм

l k[vjl

с q l a с q i a

r r e t l v m m s к e

r r e e l x r e g s s

r к a q t - - — - - —

r к a q l

T T p|e E E|V M F LÎGlQ QESSNDDAD V|GJA Q Q -(ËlgfËlL E К V R R Q M -lEEEjb Q К A R К

К R R M A L К RfKlM a| F К R RJL D F

Ь D К RÍH L D

1 í v l l о s wi - в s] l dQQl l q s t|v -1d!e l d v l lft~a к m e щ l DfTlL l|f a к h EfP Gj

AfP L S D ED IREEVDTFMFEGHDTT R(P L SgTlD IREEVOTFM FITOS H D T T s s] L s d[qJ D ПЕЛ RÍX] E VDTFMFEGHDTT К S|L S D E p]LIR|ДIE VDTFMFEGHDTT

s fc llic

A X S FIC _AJ7TH]F] F

G VjS'W I GfT SJ V7 V

D2 324

D1 329

А2 335

А5 328

D2 354

D1 359

А2 363

А5 356

D2 384

D1 389

А2 393

А5 386

D2 413

D1 418

кг 423

А5 416

D2 441

D1 443

А2 450

А5 443

02 469

D1 476

А2 478

А5 471

Y E T- S R к p E V Q

Y N lU * T H p E A Q

Y A L A T H p E К Q

Y A L A T H p E H l£

q[r)l q q

к к с f e H [Rie R E

e|r|c r e

[T]L R D S Y E L

SW E H W D H

W F A К V L

E L S

E D V E I R

E D С E I isî

S P V T F P D

S P V T F P D

G E L К F M E N VjT К E

H Q[_L|H Y V D Xj C"V]K E D Q M P Y T T M С (I К E DQHPYTTMC[IKE

ET

E "

E S

Y F EjlT[FjS E К V W P N

sjTjvi p m

D E F R

К I ? К

E V F D

К V F D

P E R F D|- A[D]V[P]Q - IjH P Y A Y X

P E R F О] V V T T A E К L N Pj~Gl R FГ- T P G S A - R -ГН P|S|R F|- S PjDjSg]- R -[H

P Y A

Y_

a[FT

A Yl L

PFSAGPRKCIGQKFAMLE PFSAGPRNC IG_QKFAMLE P F SfG]GfX]R N С I G P F S| G [G] A"|R H С X G

к a

к Q

f a m П71 e f a mimie

и к

i к

L к

L к

H | F E L L~P]L G - P E[P~R]H S M N 10e G R P T A F l|T]A -

r 1г"т] l fw~~a~ t s f g t t rîfe Ь h p|d p t r ifp rfellpdptr iip

D R R T Y S

- S - T V S

P S W P M С

V A V A L -

V A V A L -

G R p T A F

A Y Q G P L

К S N N G I

К S К N G I

KjlT

S G

T T TfLTv-

S S R С

Рисунок 6. Множественное выравнивание между CYP4D2 (D2) и цитохромами Р450 семейства 4 из дрозофилы CYP4D1 (Dl) (Gandhi et al., 1992), кролика CYP4A5 (А5) (Yokotani et al.. 1991) и крысы CYP 4A2 (A2) (Kimura et al., 1989). Обведены аминокислоты в CYP4D2. которые присутствуют в любой из трех других последовательностях.

al., 1991), основанной на гомологии с другими генами Р450, обнаруженный цитохром Р450 может быть отнесен к подсемейству D семейства 4 и назван поэтому CYP4D2.

Интересно отметить, что в отличии от других генов семейства 4 с известной экзон-интронной структурой (С/Р4А2 и С/Р4А5), у CYP4D2 гемсвязывающий домен кодируется последовательностью целиком находящейся в последнем экзоне. Обнаружены одяоамииоклслот-ные делеции в построенном выравнивании между CYP4D1 и CYP4D2, большинство которых сосредоточены в последнем экзоне и окружают гемсвязывающий домен (рис.6). Это, а также не очень высокий уровень гомологии между ними, могут указывать на то, что, на самом деле, гены CYP4D1 и CYP4D2 принадлежат разным подсемействам. Один из возможных путей проверки высказанного предположения состоит в сравнении между собой зкзон-интронных структур этих генов, а также размеров и последовательностей интронов.

Таким образом, мРНК cl, лежащая рядом с геном prune, кодирует цитохром Р450 CYP4D2. Еще один ген, CYP4D1, из этого же подсемейства находится, согласно данным из работы (Gandhi et al., 1992), дистальнее на 20 тпн (рис.1). Известно, что гены ци-тохромов Р450 одного подсемейства могут располагаться на хромосоме кластерами (Nelson et al., 1993). Поэтому не исключено, что в изучаемом районе присутствуют еще другие гены цитохромоь Р450. Для того, чтобы проверить это предположение, был проведен Сау-зерн-анализ космидн рА402, которая содержит ДНК из области 15-55 тпн по рестриктной карте, находящейся дистальнее гена prune. Блот, полученный путем переноса рестрицировавной EcoRI ДНК кос-миды рА402 после электрофореза из геля (рис.7А), гибридизовался с фрагментом pi. Фрагмент pi - это Pstl-EcoRI рестрикт кДНК cl (рис.1). Он был выбран для гибридизации, поскольку содержит 3* часть гена CYP4D2, кодирующую консервативный среди Р450 гемсвязывающий домен. Зонд гибридизуется с четырьмя рестриктами размерами 10, 3.0, 2.2 и 1.0 тпн (рис.7Б). Наиболее интенсивный сигнал наблюдается с фрагментом 1.0 тпн. Это связано с тем, что он содержит последовательности из pi (рис.1). Менее интенсивна гибридизация с тремя другими фрагментами. Один из них, размер которого 3.0 тпн, содержит ген CYP4D1 (Gandhi et al., 1992). Другой рестрикт размером 2.2 тпн находится между генами prune и CYP4D2 (рис.1). В этом месте считываете« мРНК TcD£Ö (Teng et al.. 1991). Ее размер (1.8 тпн) приблизительно совпадает с размерами

го -

Рисунок 7. (А) Фотография геля после электрофореза рестри-

цированной Есо/?1 ДНК космиды рА402. (Б) Автограф этого же блота после гибридизации с 32Р-меченой ДНК р1 фрагмента кДНК с1.

А

Б

транскриптов генов CYP4D1 (1.7 тпн) и CÏP4D£ (1.75 тан). Можно предположить поэтому, что TcD20 также кодирует цитохром Р450. Наконец, третий участок гомологии обнаружен в рестрикте ра&мером 10.0 тпн (рис.1). Приблизительно в этом же месте была обнаружена мРНК А длиной 0.7 тпн (Gandhi et al., 1992). Однако, маловероятно, что она кодирует цитохром Р450, т.к. ее размер для этого недостаточен. По-видимому, в рестрикте размером 10 тпн находится ранее необнаруженный ген цитохрома Р450.

Таким образом, дистальнее гена prune лежит кластер из четырех генов Р450 семейства 4. Кластер генов цитохромов Р450 у насекомых описан впервые. Подобная организация цитохромов в виде кластера генов из одного подсемейства обнаружена ранее у других организмов (Nelson et al., 1993).

ОБСУЖДЕНИЕ

Настоящая работа посвящена изучению структурно-функциональной организации района локуса prune у Drosophlla mlanogaster. С этой целью было проведено транскриптное картирования района, в ходе которого была идентифицирована мРНК prurie и обнаружен кластер из четырех генов цитохромов Р450 семейства 4, расположенный дистальнее гена prune.

В исследуемом районе выявлены три различных транскрипта, синтезируемые с различных участков генома (рис.1). Полученные данные позволяют заключить, что мРНК cl.72 размером 1.8 тпн является транскриптом гена prune. Методом Нозерн-анализа показано, что при рп мутациях значительным изменениям в транскрипции подвержена только эта мРКК: в случае рп1 и рп3 такая мРНК отсутствует, а вместо нее появляются аберрантные молекулы меньшего размера, количество которых к тому же снижено по сравнению с нормой. Полученные данные хорошо согласуются с результатами изучения ДНК района гена prune у мух, несущих различные аллели рп (Tengetal., 1991а; Алаторцев, неопубликованные результаты). Именно рп1 и рп3 мутации сопряжены с инсерциями мобильных элементов в район локуса prune, и в этом случае транскрипт размером 1.8 тпн отсутствует. Мутация рп2, но всей видимости, точечная и поэтому не оказывает влияния на транскрипцию.

Опубликованные независимо данные по картированию мРНК prune (Teng et al., 1991a) соответствуют представленным здесь результатам. Кроме мРНК prune в цитируемой работе были выявлены ош~;

два транскрипта, TcD20 и TcD12, расположенные как показано на рисунке 1. Таким образом, непосредственно в области гена prune, протяженностью 10 тпн, считываются, по меньшей мере, пять, по-видимому, различных мРНК обвей длиной около 8 тпн.

Какую функцию выполняет белок Prune в клетке и какова природа рл/ТС-рп взаимодействия? Интересную гипотезу выдвинули Тенг е соавторами (Ten? et al., 1991b). Исходя из анализа гомологии белка Prune с аминокислотными последовательностями из банка NBRF Protein databank (Release 21.0), они предположили, что продукт гена prune является белком, активирующим GTPase (GAP). Как было показано ранее, Killer of prune - это мутация в гене шй (Dearolf et al., 1988а; Dearolf et al., 1988b), который кодирует нуклеотиддифосфаткиназу (Steeg et al., 1988; Bevllaqua et al., 1989; Wallet et al., 1990). Авторы предложили модель pn/K-pn взаимодействия, согласно которой нуклеотиддифосфаткиназа ШОК), продукт гена awd, и БАР, продукт гена prune, участвуют в регуляции активности одного и того же гипотетического Ras-подобного белка. GAP играет роль негативного регулятора Ras, переводя его из активной формы (Ras*G7P) в неактивную (Ras*GDP), тогда как NOK наоборот активирует Ras. Согласно модели, NDK способна фос-форилировать GDP, находящийся в связанном с Ras состоянии. Последнее является очень необычным и не укладывается в рамки существующих представлений (Ruggleri & McCormick, 1991).

Однако, критический подход к представленным Тенгом с соавторами результатам, а также данные, изложенные в настоящей работе, вынуждают высказать серьезные сомнения в справедливости вышеизложенной гипотезы.

Во-первых, отобранная авторами кДНК TcD37 гена prune размером 1.4 тпн меньше соответствующей мРНК (1.8 тпн) (Теrtg et al., 1991а и приведенные здесь результаты). Как следует из сравнения иуклеотидкых последовательностей кДНК с1.72 и TcD37, в последней отсутствует первый экзон транскрипта prune. Следовательно, кДНК TcD37, неполноразмерная копия мРНК prune, поэтому в ОРС из работы (Teng et al., 1091b) отсутствуют 40 аминокислот из Н-концевой части белка.

Во-вторых, сравнительный анализ последовательностей Тс037 и cl.72 (рис.3) выявляет следующие несоответствия между ними. Два цитозина присутствуют в положениях 473-474 у cl.72. тогда как в TcD37 только один. Сайт AGGCCT в положении 470 является сайтом

узнавания для рестриктазы Stul. Рестриктный анализ с1.72 выявляет StuT сайт в cl.72 в этом положении, что подтверждает правильность определенной нами последовательности с1.72. Еще два дополнительных GC находятся между нуклеотидами 596 и 597 (рис.3) в случае TcD37, а также TG в положениях 787-788 (рис.3) заменены на GCT в TcD37. Два последних изменения приводят к сдвигу рамки начиная с аминокислоты 63 до аминокислоты 126 (рис.3) по сравнению с TcD37. Таким образом, ОРС, выведенная из TcD37, короче на 40 аминокислот с N'-конца и отличается на протяжении 64 аминокислот от ОРС, определенной по cl.72. Нам не удалось обнаружить убедительной гомологии между аминокислотной последовательностью бычьего GAP и аминокислотной последовательностью, выведенной из cl.72.

В-третьих, уровень гомологии между GAP и определенной Тентом с соавторами аминокислотной последовательности белка Prune (Teng et al., 1991b) недостаточен, для чтобы рассматривать его как указание на функциональное сходство между ними (Davhoff et al., 1983). Серьезные сомнения в строгости гомологии также высказывались и в работе (Barnes & Burglln, 1992). Более того, ь выравнивании из статьи (Teng et al., 1991b) отсутствуют совпадения по всем 15 консервативным среди различных GAP аминокислотам (Wang et al., 1991).

Таким образом, гомология между GAP и белком' Prune не может быть, в силу своей невысокой достоверности, подтверждением модели Тенга с соавторами (Teng et al., 1991b). В отсутствии дополнительных генетических или биохимических данных в пользу последней было бы вернее считать, что ген prune кодирует белок с неизвестной функцией.

Изучение структурно-функциональной организации района предполагает соотнесение транскриптов с группами комплементации. Вовлечены ли помимо мРНК cl.72 другие синтезируемые в районе транскрипты в реализацию prune Функции? На такую возможность указывает тот Факт, что мРНК cl.72 и cl гибридиауются на Но-зерн-блотах с высокомолекулярным транскриптом (рис.2А, 2Б и 2Г), следовательно, не исключено считывание оСщей мРНК, содержащей последовательности из cl и el.72, со всей области. Крои« того, мРНК cl.72 и TcDl2, транскрибирующиеся в противоположных направлениях, перекрываются на 114 нуклеотидов своими 3' концевыми районами (рис.1) (Teng et al., 1991а), Следует особо отметить

аберрации в транскрипции мРНК el, TcD20 и TcD12 при рп мутациях. Транскрипт ci соответствует гену цитохрома Р450 CYP4D2. Как было предположено выше, TcD20 также кодирует цитохром Р450. Следовательно. по меньшей мере два гена из кластера цитохромов Р450, расположенного непосредственно дистальнее • мРНК с1.72, могут участвовать в определении prune Функции.

Могут ли гены цитохромов Р450 соответствовать какой-либо другой группе комплементации? Маловероятно, что это локус wapl. поскольку мутации по гену wapl сопровождаются перестройками ДНК, картирующимися дистальнее CYP4D1 (шт. по Gandhi et al., 1992). Возможно, что гены Р450 соответствуют группе 3, которая состоит из одной мутации 1(1)90. Однако, в работе (Gandhi et al., 1992) не было обнаружено супрессии летального фенотипа 1(1)90 при инъекции в эмбрионы дрозофилы фрагмента ДНК, содержащего ген CYP4D1 вместе с фланкирующими последовательностями. На наш взгляд, представляется наиболее вероятным, что кластер гомологичных генов не был выявлен генетическими методами в опытах по насыщению района летальными мутациями из-за вероятной замены одного неработающего гена функциональным продуктом другого гена.

- 25 -ВЫВОДЫ

1. В области расположения гена prune в Х-хромосоме дрозофилы картированы три различных мРНК. Среди них идентифицирована мРНК гена prune, транскрипция которой нарушается при рп мутациях: в случае мутактных аллелей рпх и рп3 транскрипт дикого типа отсутствует, а вместо него появляются мРНК меньшего размера. Клонированы и секвенированы кДНК гена ргилв и соответствующий фрагмент геномной ДНК. Транскрипт ртшх? сплайсируется и кодирует белок с возможным трансмембранным доменом.:

2. Показано, что наблюдаемая инактивация гена prune при эффекте положения мозаичного типа в инверсии In(lLR)pn2a сопровождается уменьшением в два раза суммарного количества соответствующей мРНК. Аберрантных мРНК гена pruna при этом не выявлено.

3. Дистальнее локуса prune обнаружен кластер из четырех генов цитохромов Р450 семейства 4 (CYP4). Клонированы и секвенированы кДНК одного из генов, названного C/P4D2, и соответствующий фрагмент геномной ДНК. Транскрипт гена CYP4D2 содержит пять зк-зонов. В отличие от других генов семейства 4 с известной эк-зон-интронной структурой, участок гена CYP4D2, кодирующий консервативный гемсвязывающии домен, не прерывается интроном.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Фролов М.В., Адаторцев .В.Е. Район локуса prune у Drosophlla mlanogaster является транскрипционно насыщенным. Генетика. 1993. т.29. стр.1460-1467.

2. Фролов У.В., Алаторцев В.Е. Транскрипция гена prune при эффекте положения мозаичного типа у Drosophila mlanogaster. Генетика. 1993. Т.29. стр.1573-1578.

3! Frolov M.V., Zverlov V.V., Alatortsev V.E. The tnRNA product of the Drosophlla gene prune is spliced and encodes a protein containing a putative transmembrane domain. Mol. Gen. Genet, 1994. v.242. pp.478-483.

4. Frolov M.V., Alatortsev V.E. A cluster of cytoctirome P450 genes in the X-chromosome of Drosophlla melanogaster. DNA & Cell Biol. 1994. In press.

tfq>ri / X/. 04 % J<tt«3 V //} } Uy) , foo Ж i