Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование спектрально-кинетических свойств первичного донора электрона в реакционных центрах фототрофных бактерий

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование спектрально-кинетических свойств первичного донора электрона в реакционных центрах фототрофных бактерий"

АКАДЕШЯ НАУК СССР Институт биологической физики АН СССР

Ш правах рукописи

МЕЖОЗЕРНОВ Александр Николаевич

УДК 577. 3 : 541.144.7

Исследование спектрально-кинетических свойств первичного донора электрона в реакционных центрах фстотрсфкых баетерий

03.00.02 - Вмофизкка

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущине - 1930

Работа выполнена в Институте почвоведения и фотосинтеза АН СССР

Научный руководитель - доктор биологических наук В. А. Шувалов

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук А. ПЛос

кандидат биологических наук Н И. Щутшюва

Ведущая организация : Институт биохимии им. А. Е Баха АН СССР

Защита состоится "¡9 " реётигЯ 1Ш(3 г. в часов на заседании Специализированного совета К002. 61.01 в Институте биологической физики АН СССР, г. Яущино, Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоло ческой физики АН СССР.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Л В. Сложению

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЕ

Актуальность теш. Фотосинтез - это фундаментальный биологичес-ий процесс, обеспечивающей жизнь на Земле. Этим определяется акту-льность изучения теоретических и прикладных аспектов этого процес-з. Первичные процессы фотосинтеза -преобразования энергии света в пектрохимическую энергию разделенных аарядов- происходят со 100 % зантовой эффективностью в мембранных пигмент-белковых комплексах, азываемых реакционными центрами (РЦ). В основе этих процессов лета обнаруженная А. А. Красновским способность хлорофилла к обрати-зму фотовосстановлению и окислению,

К настоящему времени наиболее изучены РЦ несерных пурпурных «терий. ' Применение спектральных и биохимических методов позволи-> установить компоненты РЦ и кинетики переноса электрона мелду ¡ми (Dutton et al. , Parson et al., Feher et al. , Breton et al. , 'валов и др. , Рубин и др. , 1975-1988). Найдена трехмерная струк-■ра РЦ на основе рентгеноструктурных данных (Michel et al. , isenhofer et al., 1984-1986; Allen et al. , 1986-1989), она под -ердила структурную модель РЦ, основанную на спектральных данных (увалов и др. , 1976-1982).

В то зке время оставались неясными природа возбужденного состоял первичного донора и процесса его релаксации, роль молекул прожиточного акцептора в этом процессе. В частности, представляют ин-рес РЦ зеленой несерной бактерии Chloroflexus aurantiacus, отли-юшиесп от РЦ пурпурных бактерий составом пигментов, структурой лков, скоростями переноса электрона.

Целью работы является изучение спектрально - кинетических эйств первичного донора электрона в РЦ фототрофных бактерий. Для достижения были поставлены следующие задачи :

- выявить структуру спектров поглощения первичного донора гктрона в РЦ Rhodobacter sphaeroides R-26, Rhodopseudoronas vi-3is и G. aurantiacus, используя селективное лазерное возбуждение эффект выжигания спектральных провалов при температурах около 2 К;

- выяснить природу первичного доонора электрона и определить шговый выход разделения зарядов в РЦ С. aurantiacus при 293 К;

- исследовать влияние постоянного магнитного поля на относите-

сь

1ый выход триплетного состояния Р первичного донора электрона в G. aurantiacus и сравнить с аналогичными эффектами в РЦ пурпур: бактерий;

- изучить механизм образования триплетного состояния первично-

•а

го донора электрона 'Р в РЦ Rhodopseudomona?. viridis при 77 К ;

изучить реакции рекомбинации разделенных зарядок Р4<3д и Р+С в РЦ Rb. sphaeroides R-26 со встроенными искусственными хинонами.

Научная новизна. 1) Обнаружен широкий спектральный провал в с ласти полосы поглощения первичного донора в РЦ С. aurantiacus при К, не зависящий от длины волны воабуждения. 2) Выявлены узкие л; нии в спектре выжигания провала на фоне широкой полосы дА перниш го донора электрона в РД Rb. sphaeroides R-26 при 2 К и селектикнс лазерном возбуждении. 3) Определена величина молярного коэффицие! та зкстинкции üi87Q при образовании катион-радикала Р+ в РЦ С. aurantiacus, равная 115000 ± 15000 М-*см~*и совпадающая с д. Р в РЦ Rb. sphaeroides R-26. 4) Найдено влияние постоянного магнж ного поля на выход триплетного состояния первичного донора С'Р в 1

о

С. aurantiacus. 5) Обнаружено изменение выхода Р при восстановлении молекул бактериохлорофилла (Вхл) и бактериофеофитина (Бфео) 1-цепи и Бфео в М-цепи РЦ R. viridis при 77 К; получено независим« доказательство того, что п РЦ R.viridis состояние ЙР не может об зовываться непосредственно из синглетного возбужденного состоян Р*. 6) Определен квантовый выход образования в неактивной М цепи и оценено время переноса электрона с Р960 на молекулу Нм (2 псек). 7) Получены новые данные о свойствах рекомбинации ион-рад кальной пары Р+0д при встраивании ряда искусственных хинонос в Rb. sphaeroides R-26, и оценено время переноса электрона с молеку HL на молекулу хинона, встроенную на место СЗД. Результаты рабо позволяют более полно описать свойства первичного донора электрс в РЦ фототрофных бактерий и конкретизировать задачи дальнейших и следований.

Практическая значимость работы. Разработка методов выжигав провалов в спектрах поглошэния фотохимических систем с высон квантовым выходом, каковыми являются РЦ, важна для изучения т вичных этапов преобразования солнечной анергии в фотосинтетиче« системах и созданных на их основе биотехнологических устройет! запоминания информации. Встраивание искусственных хинонов с рг личными окислительна-восстановительными потенциалами в РЦ с af трагированными природными хинонами позволяет изменять знергетиче кую эффективность работы РЦ. Наш данные о свойствах первичш донора в реконструированных искусственными хинонами РЦ уже исло. зуктгея для создания преобразователей света на основе аффинной п] шивки РЦ на полупроводниковые электроды, а также систем для оп' ческой записи информации.

|Лробация работн. Основные результаты доложены на XII Беееоюз-ой конференции по когеррентной и нелинейной оптике (Москва, 985), на мевдународной школе ЕМЕО по зеленым фотосинтезируюшим актериям (Дания, Ниборг, 1987), на рабочем совещании "Лазерная пектроскопия сложных молекул" (Эст, ССР, Лохусалу, 1988), на V кон-еренции молодых ученых социалистических стран по биоорганической имии (Пущино, 1988).

Публикации, По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введена, обзора литературы (гл.1), постановки яадачи и выбора методов [¡следования (гл.2), описания объектов и методов исследовании (гл. ), наложения экспериментальных результатов и их обсуждения (гл. 4, , G и 7), заключения, выводов и списка цитированной литературы 216 источников, в том число. 1Я4 иностранных). Работа изложена на 13 страницах машинописного текста, включая 40 рисунков и Ь таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МКТОДН ИССЛЕДОВАНИЯ.

РЦ из бактерий Rb. sphaeroides R-SG и R. viridis выделяли по ме-)дам Дейера с соавторами и Торнбера соответственно, а РЦ из С. irantiacus - по методу Пирсон и Торнбера. В процессе выделения РЦ »ддерживали в восстановленном состоянии добавкой аскорбата Na гектралъные характеристики РЦ соответствовали описанным в литерале.

Экстракцию первичных хинонов из РЦ Rb. sphaeroides R-26 прово-[ли по методу Окамуры с соавторами.

Фотохимическую активность РЦ Rb. sphaeroides R-26 с удаленными иродными хинонами (РЩ-Q)) восстанавливали путем добавления к РЦ известной концентрацией етехиометрического количества спиртового створа экзогенного хинона в Трис HGl-буфере (pH 8,0-, 10 мМ), со-ржащем 0,1 % ЛДАО (конечная концентрация этанола <: 1 %). Синтез кусствснных хинонов проводили Е. Ю. Кац и 0. И. Еагабова.

Спектры поглощения измеряли на спектрофотометрах "СПЕКОРД О" (производство ГДР) и СФ-20 (ЛОМО).

Спектры выжигания провалов РД, кинетики светоиндуцированных '/енений поглощения первичного донора РЦ измеряли на собранном vfii лазерном однолучевом дифференциальном спектрофотометре с мик-зекундным временным разрешением (Гаиаго и др., 1987). В составе гановки находится оптический гелиевый криостат. В установке реа-зованы три схемы измерения: 1) без фосфороскопа для измерений "налов дА вдали от длины волны возбуждения; 2) с фосфороскопом

для измерений хА на длине водны возбуждения, исключающее регистра цию рассеянного света; 3) быстрое сканирование участков спектра I в ответ на один лазерный импульс в течение времени, короче, ч<

время рекомбинации разделенных зарядов Р+0д.

я

Влияние магнитного поля на выход 1Р регистрировали, помещая 1

вету с образцом в катушку Гельмгольца и подавая в цепь ток, обео чиващий напряженность магнитного поля до 0,065 Тл.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССУБ5ДОЙАНИЙ И Ш ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Изучение структур» пилосы поглощения первичного дино ■¿инаяуонн 1'Ц пурпурных Ьнт'ерт и зеленой несерной ба: терии С. аигаМлаоия.

Для выявления структуры полосы поглощения первичного доно злектрона РД Из. ?.р1|аого1с1ей К-26 и С. аигапиасиэ был иепользов метод выжигании спектральных провалов, позволяющий снять неодн родное уширение спектров поглощения и из полуширины вызкигаем бесфоношгой линии (БФЛ) рассчитать время релаксации возбувденно состояния Р* (Регропоу, 1983).

На рис.1 представлены дифференциальные (свет-темнота) спект образования в РЦ №. sphaeгoдdes й-26 при 1,9 К, вызванные л верными импульсами длительностью 30 псек и полушириной (д^) 2-3 при 905, 898, 87? и 870 нм. При возбуждении в области 0-0 перехс полосы Р, а также с длинноволновой и коротковолновой стороны него регистрируется широкая полоса ДА с а^ 400 Смещение дли волны возбуждения не вызывает изменения й^ полосы и смещения кон ра полосы. На частоте возбуждения не выявляется узких БФЛ. Оое

Рис.1 Спектры выжигания npcmaj полосы поглощения Р РЦ Rb. sphaai ides R-26 при 1,9 К (лазернс возбувдение показано стрелками)

ажигаемой полосы несколько асимметрична, но близка к гауссовой.

Независимо от нас группой Боксера с соавторами (Büxer et al. , 386,а,б) и Мича с соавторами (Meech et al. , 1986) также зарегист-*роваиы широкие провалы в спектрах Р в РЦ пурпурных бактерий, но темя релаксации Р* рассчитывалось иэ полуширины полосы Д А; являются, nD мнению авторов, однородно уширенной БФЛ Однако, найден-1Я недавно вибронная структура спектров поглощения Р в РД пурпур-вс бактерий (Shuvalov et al.,1988; Klevanik et al. ,1988) дает oc->вание считать это предположение некорректным. Согласно этим ра-гтам, широкий спектр поглощения Р при 1,7 К в РЦ R. viridis с отнятой цепью переноса электрона состоит из полос, отстоящих друг друга на 150 см-1 и отражающих злектрон-вибронное взаимодейс-ие. Причем БФЛ, соответствующая 0-0 переходу уширена вследствие когеррентного взаимодействия молекулы Р и В^.

Более чувствительная схема намерений с фосфороскопом, при кото-й сигналы дА в десятки раз меньше, чем при обычных измерениях овалов, позволила нам зарегистрировать на фоне шрокой полосы ДА рвичного донора РД Hb. sphaeroides R-26 узкую спектральную линию, горая не была ранее описана в литературе. Измерения проводили л селективном возбуждении на длине волны 865,6 нм (второй сток-з компонент ВКР циклогексана) и температуре 2 К (рис. 2). Редакция сигнала ДА в провале соответствует рекомбинации Р+0д . В ре-ттате модельных расчетов контура спектральной полосы с учетом гаратной функции прибора получена величина полуширины уровня по-(ка 10 ± 5 см-1, что соответствует времени релаксации возбуяден-■0 состояния Р* 1,4 ± 0,7 псек.

Узкий провал на фоне широкой полосы ДА в спектре выжигания про-

Рие.2. Спектр выжигания провала полосы Р РЦ КЬ. зрЬаего!<Зез 1?-26 при 2 К и возбуждении при 866,5 нм. На вставке показана кинетика ла86Б измеренная е помощью фосфороскопа.

- б -

вала первичного донора РЦ Rb.sphaeroides R-26 представляет собой вероятно, ВФЛ небольшой части РЦ, в то время как для большей част рц характерен широкий провал с &v> около 400 см~? Время релаксаци Р* 1,4 псек совпадает с результатами кинетических измерений време ни переноса электрона с первичного донора на молекулу Н^ в РЦ RI sphaeroides R-26 при гелиевых температурах (1,2 псек; Fleming t al. ,1988). Отсюда, регистрируемый нами процесс может отражать пе ренос электрона с молекулы Р непосредственно на молекулу Бфео То есть, существование узких линий в спектрах ДА молекулы Р nj температуре 2 К и селективном лазерном возбуждении в РЦ Rb. sphaei ides R-26 дает основание полагать, что в части РЦ возбужденная м< лекула первичного донора релаксирует по другому механизму. Вероя^ но, узость регистрируемой полосы объясняется тем, что БФЛ в эт< части РЦ не уширена за счет взаимодействия молекулы димера Р с о седней молекулой Бхл (^ ), как в нормальных РЦ (Shuvalov et а 1988). В этом случае перенос электрона с возбужденной молекулы на молекулу Бфео Н^ может происходить по механизму суперобме (Marcus, 1987).

На рис. 3 представлены спектры выжигания провала в полосе по лощения Р РЦ С. aurantiacus. Образец РЦ возбуждали при длинах во 870, 891, 899, 901,5 и 906 нм. Спектры дА регистрировали при 1,7 по схеме измерений, позволяющей записывать участок спектра ¿А один лазерный импульс. Выжигаемые провалы при 1,7 К в РЦ О. aurar acus так же, как и в РЦ пурпурных бактерий уширены и бесструктуг Возбуждение в области 0-0 перехода (около 90О нм) не приводит к явлению узких линий на частоте возбуадения. Независимо от дл! волны возбуждения выжигается широкий провал с около 360 см .

Рис.3. .Спектры выжигания про: ла в полосе поглощения Р РЦ t aurantiacus при 1,7 К (лазер ное возбуждение показана стр ками).

Ърма спектра асимметрична. В отличие от спектров РЦ ЯЬ. БрЬаего1йеэ

26, спектр ДА первичного донора РД С. аигапиасиэ при 1,7 К, види-

ю, частично уширен неоднородно, так гак при переходе от возбужде-

[ия широкополосным светом к монохроматическому полосы ДА умень--1 -1 иется с 450 см до 350 см .

В исследованиях 2-х производных спектров поглощения первичного ¡онора РД С. аигапиасиз при 1,7 К не выявлена вибронная структура юлосы Р РЦ С.аигапиасиэ (К1еуамк е! а1. , 1988). Хотя, она и не швляется, асимметричность провала указывает на ее существование | полосе Р РЦ с открытой цепью переноса электрона (рис.3), поэтому на может уширять ШЛ. Подавление структуры спектра может быть вязано с усилением в молекуле Р электрон-фононного взаимодейс-вия (Регзопоу, 1983), вследствие чего широкий провал представляет обой фононное крыло. Большое злектрон-фононное взаимодействие мо-вт бить связано либо со структурными особенностями молекулы Р, ибо с особенностями белкового окружения. В частности, на релакса-;ирз Р может влиять находящаяся около молекулы первичного донора в 'Ц С. аигапЫасиа отрицательно заряженный аминокислотный остаток ас-арагиновой кислоты в Ь-субъединице РЦ (ОусЫпШкоу еЬ а1. ,1988,а), тсутствующий в РЦ пурпурных бактерий.

2. Изменение молярного коэффициента зкстинкции первичного донора электрона в РЦ С. аигапиасиз.

В настоящее время нет прямых данных о структуре первичного до-ора электрона в РЦ С. аигапЫасиз. Мы не обнаружили также в лите-атуре величины молярного коэффициента зкстинкции первичного доко-а электрона (д£870) в этих РЦ.

Мы измерили величину д£ 870 первичного донора электрона в РЦ С. игапиасиБ. Измерение основано на изучении реакции восстановления осле одиночной вспышки света окисленного Р+ с помощью цитохрома _с з сердца лошади, для которого известен молярный коэффициент экс-инкции (20000 М см ; Уог^-агп, 1960). Тогда величина опре-еляется из соотношения: Д£870 =(аА870/ ^%до^а£р5БО> где лА870 и а550" изменения поглощения на длинах волн поглощения Р и цитохрома соответственно в ответ на лазерную вепышку;Д£5Б0 - изменение мо-ярного коэффициента зкстинкции цитохрома с.

Амплитуды сигналов и ЛА550 определены из кинетик, предс-

авленных на рис.4. Сигнал РЦ без добавок (рис. 4А,1) зату-

ает с характерным временем релаксации 60 мсек, и кинетика отража-т, согласно литературным данным, образование и рекомбинацию раз-

- 8 -

Рис. 4. Кинетика ДА РЦ С. aurantiacus под действием лазерного импульса с Я =694 нм. А - Кинетика 4 Aq7q. К 2 мкЫ РЦ последовательно добавляли 10 мМ аскорбата Na (1), 20 мкМ витамина Kg (2), 20 мкМ цитохрома с из сердца лошади (3). Б - Кинетика условия те же, что и в А(3). В - то же, что и в Е, но в секундном диапазоне времени (1), кинетика ЛА540 (2).

деленных зарядов Р+0д. Добавление избытка витамина Kg удлиняет км нетику релаксации AAB7Q (рис. 4А,2). Последующее добавление к РЦ экзогенного цитохроМа с снижает время релаксации со 150 мсек до 1 мсек (рис. 4А,3). При соотношении ( цит]/[ РЦ] =10 это время отражав восстановление фотоокисленного первичного донора цитохромом ( рис. 4А, 3) и совпадает с временем фотоокисления цитохрома _с пер вичным донором (рис. 4Б). Для определения начальной амплитуды ДА£ измерена кинетика ЛAg50 в секундном диапазоне времени (рис. 4В, 1).

Величина молярного коэффициента экстинкции первичного донора

РЦ С. aurantiacus составляет, исходя из приведенного соогновения -1 -1

115000 ± 150Q0 M см .Это практически совпадает с известной вели чиной ¿¡{q70 для РЦ Rb. spliaeroides R-26 (121000 ± 20000 М"1см"1).

Совпадение величин изменения коэффициентов молярной экстинкщ-и полуширин спектров поглощения Р при' 870 нм для РЦ С. aurantiaci и Rb. sphaeroides R-26 указывает на равенство дипольных сил полос Р в этих РЦ. Т.к. Р в РЦ Rb. sphaeroides R-26 является димером Б> а, то сходство дипольных сил полос поглощения Р в РЦ пурпурных бг торий и С. aurantiacus указывает на димерную структуру первичног донора электрона в РЦ С.aurantiacus. Вероятно, сильное элега рон-фононное взаимодействие в Р РЦ С. aurantiacus не связано с структурными особенностями самой молекулы.

Равенство значений Д€ для РЦ Rb. sphaeroides R-26 и С. aurai tiacus означает, что при равных величинах поглощения Ag70 конце1 рации Р870 также равны. Тогда при равном количестве поглощенных квантов отношение ÛAq^q для РЦ Rb. sphaeroi des R-26 и С. aurantiaci показывает отношение квантовых выходов образования Р+0д . Иамере] относительные квантовые выходы разделения зарядов при лазе]

ном возбуждении на длине волны 865,6 нм (2-й стоксов компонент В

- 9 -

Рис. 5. Кинетика ДА8Б0 РЦ С. aurantiacus (А) и Rb. sphaeroidos R-26 (Б) при селективном лазерном возбуждении. гЦ^ =865,6 нм; температура 293 К; в образцы добавлены 20 мкМ витаамина Kg (А), 10 мМ аскорбата Na (А,Б). Образцы выровнены по Agb0> à А850 не превышает 15 Z от максимальных ДА, измеренных на сильном свету. Пунктиром показан участок кинетики, где проявляется рассеянный свет лазерного импульса.

низкая интенсивность лагерного света, такая, чтобы ДА составляли не больше 15 X от максимальных дА и линейно зависели от количества квантов возбуждения. Сравнение ки-нетик на рис. 5 показывает, что относительные квантовые выходы разделения зарядов Р+<Зд в РЦ С. aurantiacus и Rb. sphae rendes R-26 равны в пределах погрешности измерений (± 5Z). Так как квантовый выход разделения зарядов в РЦ Rb. sphaeroides R-26 лежит в области 1,02 ± 0,04 (Wraight, Clayton, 1973), и отношение сигналов ДА05О для двух типов РЦ близко к 1, это означает, что квантовый выход разделения зарядов Р+0д для РЦ С. aurantiacus также лежит в области 1. Эта' величина отражает суммарный выход разделенных зарядов в цепи реакций Р* -— , поэтому квантовые выходы об-

разования Р+Н^ тага® равны для обоих типов РЦ и близки к 1. Несмотря на это, времена переноса электрона с возбужденного первичного донора на молекулу HL в РЦ С. aurantiacus и Rb. sphae roi des R-20 заметно различаются (Shuvalov et al., 1986,в; Breton et al.,1986,a). Вероятно, это связано со структурными особенностями белковой молекулы РЦ С. aurantiacus.

3. Изучение триплетнык состояний первичного донора электрона в РЦ С. aurantiacus, Rb.sphaeroides R-26 и R. viridis.

Согласно литературным данным, триплетное состояние первичного

о

¡онора электрона ( Р) образуется по ион-радикальному механизму в «зультате интеркомбинационной конверсии 1 [Р+Н[] -, - 3[ Р+Н[^ ]. [ля РЦ 0. aurantiacus не было данных о кинетике образования и ре-

4.

<АИ

r- . SM IM

о.« I \ — А

1

♦*«• \

ом I * »OK«

\ ~ Б

V

циклогексана). Использовалась

лакеап.ии *-р и о влиянии iioei энного магнитного поли на выход "К

Для создания уелсший, способствующих образованию состояния ;'Р в РЦ С. aurt-mtiaauf;, использовали интенсивный измерительный оьет (~ iOl1 арг/ом'л?). п качосто внепшого донора к РЦ допапляли аокоролт М.л и медиатор переноса ядоктрона дихлорфг-иолинд«х«'.нол. 1«у*ст. идис молекулу Од. Ни рас. CA «oiîa&aiiu кинетики дд щщ г^шккноынии il+ и "р, имс*кяцис четкое отличие но нремг'ии ролакг-апии tfir, ± х мсек и 1Я ± 3 мкеегс. соответственно). Тришютноо состояние '"V г. РЦ 1Л>. :-.plia«i oidos H-fi С релпксирует се ех.,дннм временем ¡7 t Z mkö.-k) . JV> -пилимому, предполагаемое нами упилг.ние пл^кт{юп- Фоиониого ктимо--действия молекулы Р ?, Pli аш ant iaous но влияет на релаксацию триплегного состояния первичного донора электрона,

Отношение амплитуды ДЛ^ с быстрой кинетикой релаксации, соответствующей образованию °Р, к амплитуде ûAgr.4, соответствующей образованию Р^д , составляет в РЦ С. aurant i acus около 0,20. Аналогичная величина получека для РЦ Rb. sphaeroides R-26 и близка к известным в литературе оценкам киантового выхода образования 3Р в РЦ пурпурных бактерий при комнатной температуре. То есть квантовый выход 3Р в РЦ С." aurant. iaeus близок к величине для РЦ пурпурных бактерий.

1.0

-1-1-1-1-1-1—г-

I -. ' •. •

в

c.m û c2u a bu cùî.î 0.060 та

«

♦

Рис. 6. Кинетика йА374 РЦ С. aurantiacus при лазерном возбуждении с Л =694 ни и 293 К. А: (1) -в присутствии 1 мМ аскорбата Na, слабый измерительный свет; (2) -10 мМ аскорбата Na. 10 мМ дихлорфенолиндо фенола, сильный измерительный свет. Б: Закипимиэд. wiiorjmuMjnr»

з ■ ■

выхода состояния Р от напряженности приложенного магнитного ноли; В: Зависимость константы релаксации этого состояния от напряженности магнитного поля в РЦ С.aurantiacus (о), Rb.sphaeroides R-26 «►), R.viridis (©).

ПОСТОЯННО)- М.ЧГШ1ГИ01-' Hö.üL: i iatl|:i№'Ш1и;;ТЫп ДО U.Olii' ТЛ i'HH^ICT выход в í'H i.aur;ilil. ¡mi:ii-; lia ± f. ¡truumhmop-'pj, П'ГНОСИТе.щ.но-

го выхода '-']' or напряженности магнитного ноля ир^де-гонлена на рис. GE. una сходна для трех типов VII. Для РЦ Hb, арикм оиЬ-а Н- "б и П. viridis эффект составляет Hí í 4 I и 2Z ± '-'Z соответственно, что согласуется с данными других работ для РЦ пурпурных бактерий (Rlankenship ri al-, ur;-V; Hoff <>t al.. ИГ/Г; Vidal Utah. ЮвГг. Knien« et al. , lwG).

Из рис. GB видно, что магнитное- поле по влияот па кинетику рп-лаксгщии состояния ''Г1, как i¡ РЦ <.:, аакт!, iaeus, так и в РЦ К'Ь. ■•-lA-aproUV'1". R-F.fi и $?. vir-Mi:"., Согласно prifüYi'e (Vidal al. , что ааначаот, что РП нахлдяп'я ь «»«-лтгмяиии P1I¡Q., а но РН, Од':' для ктщюгя («.-личина ежт.-нмн i.ухода 'Р в магнитном поле- оначигельно с.ышг. лналиа зависимости кг.аптопого nnxou.i '-'Р от тпряжоплпети ма) ниуного поля для рн пурпурных oakti'piiu привел Вернсра с соавторами i у." г r¡i;: i et. al., ii!"'-1,) ¡; n m.uiom, порядка й- }0 ' an еинглпт-

тринлотпом расщепления г. иоп-радикилыюи паре IP1H¡'). применяя вы воды атой работы к полученным роаудьтатам для РЦ С. aura A- i acut.. нами сделано заключение о том. что ь РЦ с. auraritiacus с-инглет-три-плотное растепление также составляет величину около 10 ' зв; иными словами, в этом отношении РЦ С. aurantiacus, в которых, вероятно, наблюдается сильное электрон-фононное взаимодействие, сходны с РЦ пурпурных бактерий.

4. Влияние селективного восстановления молекул Вхл и Бфео на относительный выход триплетного состояния первичного донора в РЦ R. viridis.

о

Хотя известно, что состояние WP образуется по ион-радикальному механизму, мы не обнаружили в доступной нам литературе независимого доказательства того, что оно не может образовываться непосредственно ир. синглетного возбувденного состояния Р*.

Чтби ото доказать, мы провели эксперименты по намерению относительного квантового выхода состояния "Р н РЦ R. viridis с восстановленными при длительном освещении при у" к по методу Oiuva !ov, Kl irnov, 19УП) молекулами I?xji и Рфеа

Освещение образца РЦ при 77 К и Е|~-400 мВ в течение часа белым светом интенсивностью 4-10изрг/см^с' приводит к фотонакоплению Бфео в L-цепи, что сопровождается снижением выхода состояния '~'Р до 13 % относительно исходного сигнала ДА (рис.7А,2).

Освещение РЦ £ мин красным светом при 293 К и замораживание до

1 / 1 А

1 г

»Л«

Рис.7. Кинетические кривые йА1Шб, обусловленные образованием триплетного состояния ЛР первичного донора в РД R. viridis (Е^--400 мВ и 77 К) при селективном восстановлении молекул Бхл и Бфео. А -1) РЦ заморожены в темноте; 2) после освещения белым светом 1 час при 77 К. Б - 1) РЦ заморожены в темноте; 2) после освещения 2 мин при 293 К; В) поело последующего освещения 1 час при 77 К. Стрелкой показано ьремя прихода лазерного импульса

77 К снижает выход 3Р до 71 (рис.7Б,2). Известно, что в таких условиях полностью восстанавливается комплекс (Бхл-Бфео) L-цепи, однако, триплетноо состояние 3Р регистрируется, что может отражать образование пары в М-цепи. Последующее освещение РЦ при 77 К

2 час бблым светом приводит к практически полному падению выхода 3Р (рис. 7В,й). Выцветание полосы при 790 нм в спектре поглощения в атом случае отражает восстановление молекулы Бфео М-цепи.

Зотонакопление молекулы Бфео" в РЦ R. vir-idis сопровождается появлением с коротковолновой стороны от 0-0 перехода полосы поглощения Р (1015 нм) небольшой полосы поглощения Бфео" (Shuvalov et al., 1987). Это запрещает миграцию энергии с возбужденной молекулы Р* на анион-радикал Бфео-. Вследствие этого, падение выхода 3Р при накоплении Бфео" (Н[ ) означает, что состояние 3Р не может образовываться непосредственно из синглетного состояния возбужденного первичного донора электрона, и, следовательно, идет по ион-радикальному механизму. На это также указывают наши данные о влиянии постоянного магнитного поля на выход 3Р в РЦ R. viridis (рис.6Б).

Из рие.7Б следует, что в неактивной цепи пигментов с малым

квантовым выходом происходит образование пары P+Hj^ . То есть r двух цепях реакций, ведущих к образованию состояния а) Р——— Р+Н|"—Зр и б) Р——3Р, квантовый выход ф1 реакции (б) меньше, чем величина ф^ реакции (а). Т.к.- квантовый выход образования состояния 3Р при 77 К огало 100 % (Hoff, 1981), можно предположить, что ф^ реакций (а) и (б) близки к 1. Исходя из наших данных (рис. 7Б,2), при полном восстановлении молекулы Нм выход 3Р составляет 7Z. Отсюда, с учетом того, что время жизни Р960+ в присутствии Н[ равно 20 псек (Holten et al. ,1978), время переноса электрона от Р960* на молекулу Нм равно около 220 псек. Величина квантового выхода образования и время переноса электрона на

молекулу Нм близки к соответствующим величинам, рассчитанным из данных измерений кинетики образования ®Р в наносекундном временном диапазоне (Kellog et al. ., 1989).

fi. Свойства первичного донора электрона в РЦ Rb. sphaoroidos R-26, реконструированных искусственными хинонами.

Изучение образования и рекомбинации разделенных зарядов между первичным донором и первичным и вторичным хиноном (0Д и Qß) актуально в связи с перспективами создания искусственных преобразователей света. Мы проследили за реакциями первичного донора электро-' на при удалении из РЦ Rb. sphaeroides R-26 молекулы QA и замене его на искусственные хиноны, производные 1,4-нафтохинона (NQ) и N-ме-гилродохинона (RQ и его изомер iRQ).

В РЦ Rb. sphaeroi des R-26 с встроенными экзогенными хинонами в цепи реакций PHLQA—i—^ P4H£ -Qa—Р+Нь0д квантовый выход образования Од равен отиоиению к?/(k_j+k2), где k_j- константа ре-{омбинации пары Р+Н[_ ; kg- константа переноса электрона с молеку-ш Н^ на молекулу Од. Зная время переноса электрона с молекулы Н^ ja молекулу встроенного UQ-2 (200 псек; Dutton et. al. , 1975.) и фемя рекомбинации ион-радикальной пары Р+Н[ в РЦ Rb. sphaeroides ?-2б (33 нсек; Shuvalov, Parson, 1981,6), находим, что величина ф 1ля встроенного экзогенного UQ-2 равна 0,985. Принимая эту величи-ty за 100 % для РЦ со встроенным хиноном, из величины отношения ДА 'Ц с встроенным хиноном к ДА нативных РЦ можно рассчитать кванто-ый выход образования Од в РЩ-Q) с встроенным хиноном, а отсюда : время.переноса электрона с молекулы Н^ на молекулу 0Д, в качест-е которой работает экзогенный хинон. Результаты расчета^ предста-ленные в таблице 1, показывают, что времена переноса электрона с L на QA в РЦ с встроенными хинонами больше, чем в нативных РЦ.

Таблица 1. Реконструкция фотохимической активности РЦ йэ, врЬаегохйез Я-26 экзогенными хинонами.

Встраиваемый хинон*

Время рекомбинации в реконструированных РЦ, мсек

Время переноса электрона с мо-

Относительный квантовый выход разделения заря- лекулы Н, на 0«,

+ - 1П и "

дов Р д, 1Сгисек

1) ио-2

2) 2-метил-ЫС>

3) 2-метил-З-бу-тиламино-ЫО

4) Й.З-дихлор-МО Ь) 2-хлор-З-бу-

тиламино-МО

6) производное 2,3-дихлор-МС) и аминосилана

7) ко-г

8)

100 1 4

Я2 ± 3

1,8 ± 0,2 6200 ± 300

70+: 4 60 ± 8 35 ± 7

0,985 0,93

0,83 0.66

0,915

0,97 0,57 0,88

2,0 9,78

26,7 67,0

6,84

4,02 98,1 17,7

^Отношение [ СЗЗ/С РЩ-О) 3=1

Вероятно, это связано с тем, что полностью не восстанавливаются взаимодействия экзогенного хинона и молекулы Н^.

Структура встраиваемых хинонов влияет на времена рекомбинации Р+0д . Так, например, присутствие атома С1 , имеющего злектроно-акцепторные свойства, во 2-м положении молекулы N0 замедляет рекомбинацию Р+0д , а аминогруппы, имеющей электронодонорные свойства, в 3-м положении - ускоряет рекомбинацию Р+0д .

Изменение длины бокового заместителя в 3 положении молекулы N0 не влияет на эффективность реконструкции функции 0Д и время рекомбинации Р+0д - Это показано, как для экзогенных хинонов с заместителями изопреноидной природы (1)0-1, иО-2, Щ-8, ИСК -В), так и для производных 2,3- дихлор-1,4-N0, имеющих в 3 положении алкиламинные группы рааличной длины. Этот факт1 представляется важным в связи с тем, что через такие молекулы РЦ могут быть аффш но иммобилизованы на электродах.

Таким образом, данные показывают, что место связнвиия 0Д, вероятно, неспецифично в отношении встраиваемой молекулы хинона.

ВЫВОДЫ.

1) В спектре поглощения первичного донора электрона в РЦ lib. sphaeroides R-26 с открытой цепью переноса электрона при температуре 1,9 К и селективном лазерном возбуждении зарегистрировано два типа спектральных провалов: широкий с полушириной 400 см_1и узкий с полушириной 10 см-1. Широкий провал, вероятно, отражает существование в большей части РД наряду с фононными крыльями и виб-ронной структурой бесфононной линии 0-0 перехода Р, уширенной благодаря некогеррентному взаимодействию возбужденной молекулы первичного донора с молекулой промежуточного Бхл. Узкий провал, по-видимому, отражает существующую в небольшой части РД релаксацию возбужденного первичного донора вследствие переноса электрона за время 1,4 ± 0,7 леек на молекулу Бфео по механизму суперобмена, исключающего участие в переносе электрона молекулы Бхл.

2) В спектре поглощения первичного донора РЦ С. aurantiacus при

температуре 1,7 К и селективном лазерном возбуждении выжигается ши-

-1

рокий провал с около 350 см : Бесструктурность провала, вероятно, отражает в отличие от РЦ пурпурных бактерий существование более сильного злектрон-фононного взаимодействия в молекуле первичного донора электрона вследствие структурных особенностей РЦ.

3) Величина молярного коэффициента экстинкции первичного донора в РЦ С. aurantiacus, равная 115000 ± 15000 М"1см"^ сходна с величиной ü£q70 в РЦ Rb. sphaeroides R-26 при одинаковой полуширине полос поглощения Р. Это указывает на равенство дипольных сил полосы Р в этих РЦ и на димерную структуру первичного донора в РЦ С. aurantiacus. Образование фотоокисленного первичного донора в РЦ С. aurantiacus происходит с квантовым выходом, б.та?,кш к 1, как в РЦ fib.sphaeroides К-KG.

4) Установлено, что квантовый выход образования триплетного

о

состояния Р в РЦ С. aurantiacus, время его релаксации и действие

о

постоянного магнитного поля на выход триплетного состояния Р сходно с соответствующими величинами в РЦ Rb. sphaeroides R-26. Вид за-

q

зисимости выхода триплетного состояния 1Р от приложенного магнитного поля позволяет предполагать, что в РЦ С. aurantiacus также, как 1 в РЦ Rb. sphaeroides R-26 величина синглет-триплетного расшепле-шя ион-радикальных пар 1[Р+Н^] и 3С Р+Н£] мала и составляет величи-iy около ю"7 эв.

5) Фотовосстановление молекул Бхл и Бфео в активной L-цепи, а :акже молекулы Бфео в неактивной М-цепи в РЦ R. viridis при 77 К

приводит к снижению выхода триплетного состояния первичного донора

о

Р. Учитывая, что в РЦ запрещена миграция энергии с возбужденного первичного донора на анион-радикал Бфео" L-цепи, это указывает на то, что триплетное состояние "^Р не молкт образовываться непосредственно из синглетного возбужденного состояния Р , и образуется по ион-радикальному механизму.

6) Зарегистрирован сигнал триплетного состояния первичного донора в присутствии восстановленных молекул Вхл и Бфео 1-цепи, который. вероятно, отражает разделение зарядов в неактивной М-цепи с квантовым выходом около 7%. Время переноса электрона от Р* на молекулу Нм составляет 220 псек.

") Показано, что производные нафтохинона и родохинона, перспективные с точки зрения аффинной пришивки РД на электрод, эффективно восстанавливают фотохимическую активность РЦ Rb. sphaeroides R-26, из которых удалены природные хиноны.' Разделение зарядов между первичным донором электрона и встроенным искусственным хино-ном происходит с квантовым выходом, сходным к нативным РЦ. Найдены времена переноса электрона от Н^ на QÄ в реконструированных РЦ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. 1) Ганаго А. О., Мелкозернов А. R., Шувалов В. А. Исследование реакционных центров из Фотосинтезирующей бактерии Rhodopseudomonas sphaeroides R-26 методом спектроскопии выжигания провалов. - Биофизика, 19вб, т. 31, вып. 3, с. 440-443. Я) Ганаго А. О. , Мелкооернов А. Н. , Шувалов В. А.

Лашрннй диффортщиал г.ниЛ спектрофотометр дДЯ исследовании кинс-

тик биологических процессов в микросекундном диапазоне. - J5 сб.: Приборы и .лабораторное оборудование для научных исследований по новым направлениям биологии и биотехнологии. - Лущино: ОНГИ НЦШ АН СССР, 1986, с. 54-56.

й) Ганаго А. 0. , Дробин В. М. , Мелкозернов А. II. , Трофимов Б. ¡1. , Шувалов. В. А. , Исмайлов М. А. Оптический криостат для исследования биологических объектов при температурах жидкого гелия. В сб.: Приборы и лабораторное оборудование для научных исследований но новым направлениям биологии и биотехнологии. - Пущина: ОНТИ НЦШ АН СССР, 1986, с.Б6-Б8.

4) Ганаго А. О., Дробин В. М. , Мелкооернов А. Н., Трофимов В. Н. , Шувалов В. А, Лазерный дифференциальный спектрофотометр для изучения фотохимических реакций при криогенных температурах. Журнал прикладной спектроскопии, 1987, т. 46, Ns4, с. 686-690.

fi) Шувалов В. А. , Шкуропатов А. Я. , Исмайлов М. А. , Шкуропатова В. А. , Мелкозернов A. К Селективное восстановление и модификация бактериохлорофиллов и бактериофеофитинов в реакционных центрах Rhodopseudomonas viridis. - Биологические мембраны, 1987, т. 4, М-10; е. 1026- 1035.

6) Кац Е. Ю. , Мелкозернов А. Н. , Вагабовн О. И. , Корсунекмй О. Ф. , Шувалов В. А. Электрохимичекое и фотохимическое изучение N-метилродохинонов как экзогенных акцепторов электрона для реакционных центров фотосинтеза бактерий Rhodobact.er sphaeroides R-26. - Молекулярная биология, 1987, т. 21, вып. Б, с. 1186-1192.

7) Кац Е. Ю. , Шкуропатов А. Я. , Вагабова О. И., - Мелкозернов А. а , Ганаго А. О., Шувалов В. А. Полярография фотовосстановления экзогенных хинонов реакционными центрами фототрофных бактерий Rhodopseudomonas sphaeroides R-26. - Биофизика, 19S8, т. 33, вып. 1, с. 66-70.

8) Ganago А. 0. , Gubanov V. S. , Klevanik А. V., Kfelkosernov А. N. ¡ Shkuropatov A. Ya , Shuvalov V. A. Comparative study of s;pectral asid kinetic properties of electron transfer in purple and green photosynthetic bacteria. - In: Green photosynthetic bacteria /Olson J. M. , Orme rod J.G. , Arnesz J. , Stackebrandt E. , Truper H.G. , eds. - New York etc.: Plenum Press, 1988, p. 109-117

■ 9) Ганаго A. 0., Клеваник А. В. , Мелкозернов A. H. , Шкуропатов А. Я. ,. Шувалов В. А. Исследование реакционных центров фотосинтези-руюшцх бактерий методом выжигании провала. - Труды рабочего семинара "Лазерная спектроскопия сложных молекул"*'(памяти P.A. Авар-маа), 26-28 апреля 1988, Лохусалу Эст. ССР, с. 24-25.

10) Мелкозернов А. Н. , Кац Е. Ю., Шкуропатов А. Я. , Шувалов В. А. Реконструкция фотохимической активности реакционных центров пурпурных бактерий экзогенными хинонами. - Тезисы догаадов 5-й конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии, 21-28 августа 1988 г. - Пущино, 1988, с. 28-29.

15.08.90 г. Зак. 2779Р Тир. 125 экз. Уч.изд.л.- 1.0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ НЦБЯ