Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование ростстимулирующих свойств лизоэнзимного препарата Streptomyces recifensis variant lyticus

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование ростстимулирующих свойств лизоэнзимного препарата Streptomyces recifensis variant lyticus"

pf$ ОД АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ВІРУСОЛОГІЇ : ім. Д. К. ЗАБОЛОТНОГО

УДК 579.22:57.083

ЧОРНОГОР Наталія Павлівна

ДОСЛІДЖЕННЯ РІСТСТИМУЛЮЮЧИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ЛІЗОЕНЗИМНОГО ПРЕПАРАТУ STREPTOMYCES RECIFENSIS VARIANT LYTICUS

03.00.07 - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступ, кандидата біологічних наук

Київ - 1998

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в науково-дослідному інституті біології Дніпропетровського державного університету.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Бабекко Юлія Семенівна науково-дослідний інститут біології Дніпропетровського державного університету, гол. наук, співробітник

Науковий консультант: академік АНВШ України, доктор біологічних наук, професор Вінніков Альберт Іванович,

Дніпропетровський державний університет, зав. кафедрою мікробіології та вірусології

Офіційні опонент»: доктор біологічних наук, професор Захарова Ірина Яківна,

Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного, провідний наук, співробітник

доктор медичних наук, професор Кременчуцький Генадій Миколайович Дніпропетровська медична академія, зав. кафедрою мікробіології

Провідна установа: Київський державний університет ім Т. Шевченко

Захіст відбудеться « » ¿С/,>£¿¿^І998року оЮ. /^¿годині на засіданні

спеціалізованої Вченої радк Д 26.233.01 при Інституті мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою:

252143, м.Київ, вул.Заболотного, 6.154, ІМВім. Д.К. Заболотного

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного. . .

Автореферат розісланий «//» 7/Л;?І!^(І998року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В основі сучасних біотехнологічних виробництв лежить мікробний синтез різних речовин, які мають широке практичне застосування. Центральною ланкою у промисловому виробництві біологічно активних речовин є вирощування мікроорганізмів. Ефективність вирощування продуцентів невід’ємно пов’язана з проблемою підвищення їх життєдіяльності, з розробкою засобів інтенсифікації їх росту та підвищення продуктивності.

Відомо, що основні фактори, які впливають на pjcf та розвиток, мікроорганізмів, поділяються на дві групи: внутрішньоклітинні фактори, обумовлені структурою та специфічними особливостями організму; а також зовнішні фактори, до яких відносяться склад живильного середовища, фізико-хімічні умови культивування. У регулюванні росту мікроорганізмів велике значення належить екзогенним факторам, таким як амінокислоти, піримідини, вітаміни та споріднені сполуки, які здатні в невеликих концентраціях збільшувати швидкість росту та біосинтетичну активність. При вирощуванні продуцентів знайшли широке застосування в якості стимуляторів росту різноманітні по хімічній природі, походженню та механізму дії речовини.

Перспективними являються продукти життєдіяльності мікроорганізмів, які здатні впливати на ріст та метаболізм близькоспоріднених та віддалених видів. Широко вивчаються в цьому плані стрептоміцети, у яких виявлено ряд ауторегуляторів, а також різні по хімічній природі речовини, які здатні стимулювати ріст інших мікроорганізмів та тварин.'

Інтенсивний розвиток мікробіологічної промисловості, активне впровадження в неї останніх досягнень біотехнології визначають актуальність досліджень, які стосуються пошуку продуцентів нових біостимуля-торів, встановленню їх природи та ролі в активації життєдіяльності мікроорганізмів, а також розробці технологій виробництва таких препаратів.

На протязі декількох років співробітниками Дніпропетровського університету вивчається новий препарат, одержаний на основі біосинтезу S. recifensis var. lyticus, який має широкий спектр літичної дії за рахунок літичних ендопептидаз та глікозидаз. Показана перспективність його використання для дезінтеграції клітин мікроорганізмів та в якості терапевтичного засобу (Соколова, 1986; Гніломедова, 1986; Кілочок, 1988).

Мста та задачі дослідження. Мета даної роботи складалась з дослідження рістстимулюючих властивостей препарату літичних ферментів

S. recifensis var. lyticus та визначення нових галузей його практичного застосування. -

Задачі досліджень складали такі питання:

- визначення рістстимулюючої активності ферментного препарату

по відношенню до мікробних об’єктів; .

- вивчення впливу нативного та автоклавованого препарату на кінетику та параметри росту, мікроорганізмів;

- дослідження закономірностей біосинтезу бактеріолітичних ферментів та рістстимулюючого фактору у різних штамів продуцента;

- фракціонування, виділення та очищення рістстимулюючого фактору та вивчення його властивостей;

- дослідження впливу комплексного ферментного препарату на показники росту експериментальних тварин;

- вивчення імулотрошінх властивостей лізоензимного препарату.

Наукова новизна роботи. Отримані нові дані про здатність лізоензимного препарату стимулювати ріст мікроорганізмів, впливати на показники росту та імунологічний статус експериментальних тварнн. Встановлено, що ефективність препарату залежить від його концентрації у живильному середовищі, видових та штамових особливостей тест-культури, а також від умов культивування. Вперше показано, що натив-ний препарат не тільки збільшує швидкість росту та накопичення біомаси досліджених мікроорганізмів, а також впливає на кінетику їх росту.

Одержані дані про тісний зв’язок рістстимулюючого фактору з кислими білками. Розроблено засіб виділення та очищення біостимулятора. На основі УФ-спектрів поглинання та методу аффінної хроматографії встановлено його глікоиротеінову природу.

Практичне значення. Результати, отримані в дисертаційній роботі, вказують на перспективність використання лізоензимного препарату для стимуляції росту та збільшення виходу біомаси промислових мікроорганізмів. Вперше показана висока ефективність його застосування в якості кормової домішки при вирощуванні молодняка експериментальних тварин. Визначені дози препарату та схеми його використання. На основі цих даних були проведені науково-виробничі випробування препарату ГЗх у ряді тваринницьких господарств при вирощуванні норок. Результати були розглянуті міжвідомчою комісією по випробуванню та реєстрації ветеринарних фармакологічних препаратів у СРСР (протокол №3 від 21 травня 1991 р.).

Новий ферментний препарат лізорецифін (умовна назва) має комплекс цінних властивостей (антимікробна, протеолітична активність, рістстимулююча та імунотропна дія), які свідчать про можливість його використання в різних галузях народного господарства.

з

Особистий внесок здобувана. Дисертанту належать ідеї та розробка програми експериментальних досліджень, аналіз одержаних результатів. Автором особисто виконано дослідження впливу лізоензимного препарату на ріст, кінетику та параметри росту мікроорганізмів, а також рістстимулююча дія на тваринах. Виділення та очищення рістстимулюю-чого фактору проведено особисто за консультативною допомогою д. б. н. Віннікова А. І., к. б. н. Жерносекова, вивчення імунотропних властивостей лізоензимного препарату проведено автором за консультативною допомогою к. м. н. Свіріденко А. І.

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідавсь на VII та, VIII з’їздах Українського мікробіологічного товариства (Чернівці, 1989; Київ, 1993), на III-V Українському біофізичному з’їзді (Київ, 1995), на Всесоюзних конференціях «Мікроорганізми —стимулятори та інгібітори росту рослин та тварин» (Ташкент, 1989), «Мікробіологічні основи інтенсифікації рослинництва та тваринництва» (Алма-Ата, 1990), на конференціях молодих вчених (Тбілісі, 1987; Москва, 1989), на Міжнародних конференціях «Біотехнологія одержання кормового білку, екологічно чистих продуктів, підвищуючих урожайність, преміксів, ферментів та вітамінів кормового призначення» (Дніпропетровськ, 1995), «Мікроорганізми та їх метаболіти у народному господарстві» (Кишинів, 1996), а також на наукових конференціях Дніпропетровського державного університету (1987—1997 рр.).

Публікації. Основні результати досліджень опубліковані в 10 наукових працях.

Структура та об’єм роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, трьох розділів результатів власних досліджень, заключения, висновків та двох додатків.

Робота вміщує 16 рисунків та 26 таблиць. Дисертація викладена на 154 сторінках. Список використаних літературних джерел включає 244 найменувань, з яких 77 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ -і

Огляд літератури складається з двох розділів, що висвітлюють питання про вплив зовнішніх факторів на ріст та біосннтетичну активність мікроорганізмів при їх промисловому вирощуванні, а саме стимуляторів хімічної природи та стимуляторів мікробного походження. Наведено матеріали про спеціальні фактори росту та неідентифіковані стимулятори, ауторегулятори росту мікроорганізмів, критично проаналізовані різні

точки зору про літературні дані відносно здібності антибіотиків стимулювати ріст организмів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ '

Об’єктом дослідження був штам Streptomyces recifensis var. lyticus 2435 (Шинкаренко, 1979) та препарати літичних ферментів ГЗх та ГЮх, отримані на основі біосинтезу за дослідно-промисловими умовами.

Продуцент вирощували в глибинних умовах (220 об/хв) на оп-тимізованому ферментаційному середовищі (Кілочок, 1986).

Літичну активність визначали турбодиметричним методом (Isono, Takahashi, Jamadzaki, 1972). Реакційну суміш, яка містить 1 мл ферментного розчину та 1 мл клітин тест-культури (вихідна оптична иіільність реакційної суміші в 0,5 см кварцовій кюветі складала 0,5-0,6), інкубували на протязі ЗО хвилин при 55°С. За одиницю активності приймали таку кількість ферменту, яка знижувала оптичну щільність суспензії на 0,001 за 1 хвилину в 1 мл реакційної суміші при розведенні ферменту, здатному сприяти лізису клітини на 25-30%. В якості субстрату (тест-культури) бактеріолітичних ферментів використовували відмиті інтактні клітини S. aureus 209Р, M. lysodeikticus.

При визначенні рістстимулюючої активності продуцента, лізоензим-ного препарату, а також різних фракцій, які отримували при виділенні, використовували в якості тест-культури штам C. guilliermondii 249. Накопичення біомаси оцінювали оптичним методом на ФЕК-56 при 540 нм (кювета 0,5 см). За рістстимулюючу активність дослідних проб приймали величину приросту біомаси у порівнянні з контролем, яку виражали у відсотках. Питому активність фракцій, одержаних при ультрафільтрації, гелітфільтрації тгцафіній хроматографії, розраховували на 1 мг білку.

За умовну одиницю стимулюючої активності було прийнято мінімальну кількість препарату (або культуральної рідини), яке викликає збільшення приросту біомаси С. guilliermondii 249 у порівнянні з контролем на 30% при вирощуванні тест-культури на цукровому бульоні в глибинних умовах (220 об/хв) протягом 24 год при 28°С. При розрахунку рісттимулюючої активності використовували дані тих визначень, у яких приріст біомаси дріжджів коливається в межах 20-50%.

При вивченні впливу автоклавованого та нативного препарату на кінетику та параметри росту мікроорганізмів визначали фази затримки та експоненційного росту, обчислювали врожай, розраховували значення питомої швидкості росту (fi год"1), час подвоєння біомаси (Шлегель, 1987).

З метою виділення та очищення стимулятору використовували ряд

засобів (Скоупс, 1985). Водні розчини препарату фільтрували через ультрамембрани УАМ-50, 100, 150, 200 під тиском газоподібного азоту 1,5-2 атм.

Електродіаліз проводили на електрофоретичному приладі ЕФМ-2. Використовували електроди-накопичувачі з різною полярністю (+ та -). Гель-фільтрацію здійснювали на сефадексі 075 та G-100 (Pharmacia, Швеція). Врівноваження колонки та елюцію проводили ЇМ розчином NaCl.

Аффінну хроматографію проводили з використанням конканазалі-ну-А-сефарози в якості сорбенту (Pharmacia, Швеція). Колонку (2x5 см) урівноважували ЇМ розчином NaCl, який містив MgC^XMnC^, Ся.С]2 (по 1 ммолю). Елюцію глікопротеідів проводили 10%-ним МЄГИЛ-ГЛ'0-копіранозидом.

При використанні методів ультрафільтрації, електролізу, гель-фільтрації та аффінної хроматографії в отриманих фракціях визначали кількість білку та рістстимулюючу активність. Білок визначали методом Lowry е. а. (1951) або спектрофотометрично на СФ-26 по поглинанню при 280 им, рістстимулюючу активність —за % приросту біомаси. Вуглеводи визначали з використанням реактиву Антрона (Неменова, 1972).

Ультрафіолетові спектри рістстимулюючих фракцій, одержаних при гель-фільтрації, реєстрували на спектрофотометрі Spekord М-40 (ДДР), товщина поглинаючого шару—0,5 см.

При дослідженні впливу лізоензимного препарату на показники росту та імунологічний статус експериментальних тварин було використано щури лінії «Вістар» та миті лінії CBAxC57BL/Fj. В кожній серії іспитів групи компонували за принципом аналогів.

З метою оцінки впливу лізоензимного препарату на імунологічний статус експериментальних тварин використовували реакцію бластної трансформації лімфоцитів, основану на включенні міченого тимідину (Кисельова, 1958), визначали кількість антиген-реактивних клітин методом імунних розеток (Фрімел, 1987; Пастер та ін., 1989), кількість ан-татілоутворюючих клітин — методом локального гемолізу (Фрімел, 1987).

Статистичну обробку експериментальних даних проводили за Се-петлієвим (1968), з використанням довірчого коефіцієнту Ст’юдента.

*

ВПЛИВ ЛІЗОЕНЗИМНОГО ПРЕПАРАТУ НА РІСТ МІКРООРГАНІЗМІВ

Основні аспекти наших досліджень стосувались визначення ріст-стимулюючої активності ферментного препарату ГЮх на різних мікробних об’єктах та її залежності від умов культивування; вивчення впливу

нативного та автоклавованого препарату на кінетику та параметри росту мікроорганізмів.

Встановлено, що рістстимулююча дія лізоензимного препарату-розповсюджується на представників кокової групи бактерій, бацилярні форми, грамнегативні бактерії та дріжджі. Нативний препарат у концентрації від 0,02% до 0,16%, внесений у живильне середовище до інокуляції мікроорганізмами, збільшує накопичення біомаси. Величина приросту біомаси залежала від концентрації препарату у середовищі, а також від видових та штамових особливостей мікроорганізмів. Найбільший ефект стимуляції спостерігався при концентрації препарату 0,04-0,08%. Максимальний приріст біомаси було виявлено у дріжджів (60-80% від контролю). На прикладі Вас. ІЇіигїпдіетіз при вирощуванні на бульоні показано, що препарат не лише збільшує накопичення біомаси, але й стимулює формування життєздатних спор. Рістстимулююча активність препарату зберегалась і після термічної обробки (автоклавування).

Встановлено, що ефект стимуляції досліджуваного препарату в значній мірі залежить від умов культивування. Відомо, що аерація має важливе значення для накопичення біомаси мікроорганізмів. При вирощуванні на м'ясо-пептоному бульйоні в стаціонарних умовах (без перемішування) та на шутелі (110 об/хв) накопичення біомаси бактерій, у порівнянні з контролем, збільшується на 52,6-53% та 34-47,7%. Більш істотну різницю виявлено у дріжджів: в стаціонарних умовах препарат збільшує приріст біомаси на 367%, на шутелі—на 250%, але при активній аерації (220 об/хв) на фоні інтенсивного розмноження, ефект стимуляції знижується і складає лише 64% від контролю (табл. 1).

Таблиця 1 — Рістстимулююча ефективність автоклавованого препарату в залеж-ності від умов аерації мікроорганізмів, вирощених на живельному бульйоні

Накопичення Приріст

Тест-кльтура Умови культивування біомаси ОД540 біомаси,

. ‘ контроль дослід % ;

8. аигеїіБ 142 стаціонарне 0,38+0,01 0,58+0,05 52,6:

глибинне (шутель) 5,08±0,;1 7,5±0,3 47,7;

В. БиЬШІБ стаціонарне 0,3+0,12 0,46+0,06 53,0

В1727 глибинне (шутель) 4,75±0,42 6,35±0,65 34,0

С. стаціонарне 0,3±0,1 1,4+0,2 367,0

guillieгшondii глибинне (шутель) 1,8+0,2 6,3±0,4 250,0

249 глибинне (220 об/хв) 10,9±0,8 17,9+0,03 64,0

Певне значення має також живильне середовище та джерела вуглецевого живлення. При вирощуванні дріжджів в умовах недостатньої аерації (на шутелі) у синтетичному середовищі Рідер з різними джерелами вуглецевого живлення виявлено високу стимулюючу ефективність препарату. Накопичення біомаси збільшилось: на патоці —на 290%, на глюкозі—на 450%, на важкодоступному субстраті парафіну —на 830%. Але при активній аерації (220 об/хв), при інтенсивному розмноженні тсет-культур, приріст біомаси досягав лише 72-75% у порівнянні з коїггролем (табл. 2).

Таблиця 2 — Вплив автоклавованого препарату на накопичення біомаси дріжджів на середовищі Рідер в залежності від джерела вуглецевого живлення

Культура Джерело вуглецю Умови культивування Оптична щільність Приріст біомаси, %

контроль дослід

C. guil-liermon-dii 249 глюкоза глибинне (шутель) 1,92±0,1 9,9+0,4 450

парафін глибинне (шутель) глибинне (220 об/хв) 0,41 ±0,2 9,б±0,2 3,8±0,04 16,8+0,3 830 75

C. tropicalis 51 патока 4% глибинне (шутель) 1,5±0,4 5,8+0,2 290

парафін ¡глибинне (220 об/хв) 7,7+0,3 13,2+0,4 72

При вирощуванні різних видів дріжджів на м’ясо-пептоному бульйоні та пивному суслі в умовах активної аерації (220 об/хв) препарат в концентрації 0,08% виявив різний ефект стимуляції. На бульйоні ефект стимуляції досягав 65-100%, на пивному суслі—лише 7-25%. При вирощуванні Вас. thuringiensis на дріжджеполісахаридному середовищі ми спостерігали навіть зниження активності спороутворення. Це можна пояснити тим, що вгсазані середовища містять природні біостимулятори і додаткове внесення стимуляторів до таких середовищ мало ефективне, або негативно впливає на процес росту.

При вивченні впливу ферментного препарату ГІОх на кінетику та параметри росту мікроорганізмів на прикладі Candida tropicalis було встановлено, що автоклавований препарат у концентрації. 0,04% не впливає на довготривалість фаз розвитку, але питома швидкість росту, врожай та економічний коефіцієнт у досліджуваної культури були вищі, ніж у контролі. Вплив стимулятору було виявлено вже у лаг-фазі: за 9 год потайного періоду споживалось більше глюкози, ніж у контролі, відповідно більше знижувалися значення pH.

З метою розподілу ефектів, пов’язаних з дією літичних ферментів та стимулятору росту, подальші дослідження проводились у двох моди-

а

фікаціях: культури мікроорганізмів вирощували на живильному бульйоні в присутності нативного та автоклавованого препарату (табл. 3).

Таблиця 3 — Вплив автоклавованого та нативного ферментного препарату ПОх на параметри росту мікроорганізмів

Вид мікро- орга- нізму Кон- цент- рація препа- рату, % Автоклавований препарат Нативний препарат

тривалість фаз питома швидкість росту ц, под-1 при- ріст біо- маси, % тривалість фаз (в годинах) питома швидкість росту М, год"1 при- ріст біо- маси, %

лаг- лог- лаг- лог-

C.guil- 0(К) 12 12 0,129 — 12 12 0,129 —

licrmon- 0,04 12 12 0,139 80,4 12 12 0,207 56,3

dii 249 0,08 12 12 0,189 158,8 13 13 0,218 149,0

В. sub- 0(К) 3 9 0,154 — 3 9 0,154 —

tiiis 0,04 2 10 0,177 29,0 4 8 0,203 29,0

В 1727 0,08 2 10 0,169 53,0 4 8 0,209 45,1

V 0(К) 4 12 0,131 — 4 12 0,131 —

aucas 0,04 3 13 0,134 38,5 5 10 0,191 38,5

151 0,08 2 14 0,133 46,0 6 8 0,221 46,0

Встановлено, що дослідний препарат впливає на параметри росту мікроорганізмів; автоклавований препарат скорочує лаг-фазу у бактерій, збільшує питому швидкість їх росту та накопичення біомаси. Нативний препарат збільшує тривалість лаг-фази як у бактерій, так і у дріжджів. В дослідах з нативним препаратом показники питомої швидкості росту у дослідних бактерій та дріжджів вищі, ніж під впливом автоклавованого препарату.

У фазі експоненційного росту дріжджів нативний препарат викликає додаткову затримку росту (рис. 1), але завдяки більшій швидкості росту урожай досягає такого ж рівня, як і при дії автоклавованого препарату. На прикладі дріжджів чітко простежується те, що ефект стимуляції залежить також від дози препарату: при низьких концентраціях (0,04%) його дія виявляється тільки на почаітку фази експоненційного росту, коли є сприятливі умови живлення, аерації та невелика густота клітин. При концентрації 0,08-0,16%, препарат стимулює ріст клітин не лише в першій, але і в другій половині експоненційної фази.

- Тривалість культивування (в годинах)

Рисунок 1 — Вплив різних концентрацій автоклавованого (а) та нативного (б) препарату на динаміку росту С. диііііегтопсііі:

1 - контроль, 2 - концентрація препарату в живильному середопищі —0,04%, 3- 0,08% та 4- 0,16%

БІОСИНТЕЗ, ВИДІЛЕННЯ ТА ВЛАСТИВОСТІ РІСТСТИМУЛЮЮЧОГО ФАКТОРУ

В даній роботі ми мали можливість порівняти активність та динаміку біосинтезу рістстимулюючого фактора та літичних ферментів у вихідного штаму та селекціонованого 2Р-15, який було одержано на основі відбору ріфампіциностійких мутантів.

г 11000“]

250 - іоооо-

■ 9000-

200 - 8000-

• «ч 7000-

* X

\ 150 - Ч 6000 -

о • ^ 5000 -

< <

о 100 -е; 4000-

- 3000-

50 - 2000-

0 1000- 0г

Г 11000 -,

250 - юооо -

■ 9000 -

200 - 8000 -

в; ч 7000 -

% X

« 150 - \ 6000 -

О ° 5000 -

< <

О 100 -5 4000-

зооо-

50 - 2000 -

* 1000 -

0 - 0 л

■' А - 2

—*-3

Тривалість культивування (в годинах)

60 72

Рисунок 2 — Закономірності біосинтезу літичних ферментів та стимулятору росту селекціонованого 2Р-15 (а) і вихідного 2435 (б) штамів. Рістстимулююча активність - 1; літична активність (ЛА) по відношенню до тест-культур: 5. аигет - 2, М. Іузойеікіісиз - З

6

Результати проведених досліджень свідчать про те, що підвищення стафілолітичноГ активності у процесі селекції штаму корелює із збільшенням біосинтезу інших ферментів та стимулятора росту. Так, біосинтез стафілолітичних ферментів штаму 2Р-15 у порівнянні з вихідним зріс в 2 рази (5600 од/мл), глікозидазна активність підвищилась в 3,8 рази (8800 од/мл), а рістстимулююча—у 2,4 рази. Динаміка накопичення досліджених ферментів, а також стимулятора росту у вихідного та се-лекцінованого штамів схожі. Біосинтез рістстимулюючого фактору здійснюється тільки у фазі експоненційного росту, в зв’язку з чим пік його активностей попереджає на 12 годин максимум накопичення стафі-лолізинів та глікозидаз (48-60 год). Отримані дані мають важливе зна-, чення при визначенні часу завершення ферментації у промисловому виробництві комплексного лізоензимного препарату.

З метою виділення та очищення рістстимулюючого фактору з ферментного препарату Г10Х було випробувано ряд методів. У виборі методів ми виходили з припущення, що виявлений у складі комплексного лізоензимного препарату термостійкий стимулятор відноситься до низькомолекулярних біологічно активних речовин.

Відділити біостимулятор від основного пула білку нам вдалося при використанні методу гель-фільтрації на сефадексі С-75 з подальшою елюцією сольовими розчинами високої молярності (ЇМ розчином ЫаС1) (рис. 3). Було встановлено, що основна маса білку виходить двома великими піками, потім виходять фракції з низьким його вмістом. На цьому фоні виявлено ряд піків (Мг 26700 — 707В)з рістстимулюючою активністю (приріст біомаси дріжджей досягав 35-50%).

Отримані фракції І-ІУ були досліджені методом УФ-спектрофото-метрії. Встановлено, що значення оптичних щільностей для цих фракцій знаходяться в інтервалі 1,18-1,26, що вказує на їх схожий характер, а розширення смуг поглинання дозволили припустити наявність у виділених фракціях компоненту вуглеводної природи. В цих фракціях нами було виявлено вуглеводи, аміст яких коливався в межах 0,06-0,19 мг/мл.

При дослідженні об’єднаного препарату (І-ІУ фракції) використовували метод аффіної хроматографії на конканавалін-А-сефарозі. Встановлено, що стимулюючий фактор сорбується на колонці та елююється 10%-ним розчином метил;-/,, Б-глюкатранозида, що вказує на наявність в углеводній частині стимулятора росту термінальних Ь, Б-манозильних, £, В-глюкозильних або специфічно східних груп (рис. 4).

При послідовному використанні гель-фільтрації та аффінної хроматографії ступінь очищення рістстимулюючого фактору досягла 61-98 разів (табл. 4).

О 10 20 ЗО 40 50 60

Номер фракції

Рисунок 3 — Фракціонування лізоензимного препарату методом гель-фільтрації на колонці (1x40 см) з сефадексом С-75- Елюцію проводили ЇМ розчином ЫаС1. Вільний об’єм колонки 19,5 мл. Профілі елюціі білку (А280) 1. розподіл величин активності

рістстимулюючого фактору—2

280

6 ч? в\ ЗО

5 Я О я

4- о о 20

3 1- у а

2 а 10

1

0

І /І (І /І /І І І І І І І І и /

1

»*

/'М

и І

1 X І

'-------------

10

20 . ЗО 40

_ Номер фракції :

Рисунок 4 — Хроматографія на конканавдлін-А-сефарозі об’єднаних рістстимулюючих фракцій, отриманих після гель-фільтрації. Стрілкою вказано початок елювання. Профілі елюції білку (Агво) — 1, розподіл величин активності рістстимулюючого фактору—2

Таблиця 4 — Характеристика рістстимулюючих препаратів на різних етапах виділення та очищення

Метод отримання Номер Вміст Величина рісісіимулюючої активності Ступінь

препарату фрак- ції білка, мг/мл приріст біомаси, % приріст біомаси на 1 мг білка препарату, % очи- щення

Вихідний розчин лізоензимного препарату — 2,0 82 33 1

Гель-фільтрація на се- І 0,04 50 1000 ЗО

фадексі G 75 (елюція II 0,02 34 1360 41

1 М розчином NaCl) III 0,02 40 1600 49

IV 0,015 32 1767 52

Аффшна хроматографія І 0,01 28 2240 68

на кокканавалін-А- II 0,009 36 3200 98

сефарозі III 0,008 20 2000 61

IV 0,008 20 2000 61

На основі отриманих даних ми прийшли до висновку, що стимулятор росту, виявлений у дослідному ферментному препараті, має глікопротеінову природу. По даним електродіалізу він тісно зв’язаний з кислими білками.

ДОСЛІДЖЕННЯ РІСТСТИМУЛЮЮЧОЇ ТА ІМУНОТРОПНОЇ ДІЇ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТУ НА ТВАРИНАХ

Виявлення в складі ферментного препарату штаму S. recifensis var. lyticus 2435 крім літичних ферментів стимулятора росту послужило приводом для вивчення впливу цього препарату на показники росту та на імунологічний статус експериментальних тварин. Досліди проводили на молодих щурах лінії “Вістар”.

Встановлено, що препарат ГЗх має здатність стимулювати ріст молодих щурів. Залежність приросту маси тіла щурів від дози виявлена при двохтижневому вигодовуванні: при підвищенні дози препарату від 10 до 50 мг/кг ваги тварин загальний приріст маси тіла збільшився на 26,7%; 49,4% та 51%. При довготривалому годуванні (4 тижня) на 42,9%; 52,9% та 40,9% відповідно. Ефект стимулювання починає чітко виявлятися на 3-4-ому тижнях, але його вплив зберігається ще на протязі 4-6-ти тижнів (рис. 5). Максимальне збільшення приросту тіла в період активного росту щурів забезпечує препарат, в сумарній дозі 700 мг/кг ваги. При цьому він може бути введеним як у дозі 25, так і 50 мг/кг ваги на

добу на протязі 4-х або 2-х тижнів відповідно. В дослідах на півдорослих щурах було показано, що використання препарату більше 4х тижнів знижує приріст маси тіла щурів.

Відомо, що самки та самці можуть по різному реагувати на введення біологічно активних речовин. Так, самці контрольної групи на протязі всього експерименту відставали в рості від самок: середньодобовий приріст маси тіла складав 0,515 г проти 0,848 встановленого для самок. Але у всіх варіантах досліду приріст маси тіла у самців був вище, ніж у самок: при двохтижневому вигодовуванні препаратом у самців середньодобовий приріст маси тіла збільшився на 73,4-79%, при ;к5тирьохтижне-. вому вигодовуванні - у самців (при дозі 10 мг/кг та 25 мг/кг ваги) - на 96-101%, у самок (при дозі 50 мг/кг ваги) - тільки на 36,2%.

Вплив дослідженого препарату на імунологічний статус спочатку було виявлено на білих щурах лінії "Вістар", затравку яких проводили у дозах 10. 50 та 250 мг/кг ваги на протязі 2-х місяців. Через 2 тижня після закінчення цього курсу імунізацію контрольних та дослідних тварин проводили еритроцитами барана. Результати дослідів свідчать про імунотропні властивості препарату. Напрямок його дії залежить від дози: 250 мг/кг ваги виявляє імунодепресивний вплив, а 50 мг/кг ваги стимулює імунну відповідь: кількість антитілоутворюючих та імунних розет-коутгорюючих клітин досягає 184,5% та 190,8% у порівнянні з контролем.

Термін спостереження, тижні

Рисунок 5 — Динаміка приросту маси тіла молодих щурів в залежності від тривалості вигодовування та дози препарату ГЗх, внесеного до корму. Тривалість вигодовування: а—2 тижня; б—4 тижні; контроль—1; добова доза препарату 10 мг/кг—2; 25 мг/кг—3; 50 мг/кг ваги щурів —4.

іаблиця 5 — Вплив різних доз препарату ГЗх, введених per os експериментальним тваринам, на активність імунної відповіді, індукованої еритроцитами барана

Доза Показники імунних реакцій (М±от)

препарату, мг/кг ваги імунні розеткоутворюючі клітини Р антитілоутворюючі клітини Р

% % к К х Ю6 клітин % к К

о (Ю 13,0 ± 3,6 100,0 — 20,58 ±1,22 100,0 —

10 15,2 ± 1,7 116,7 > 0,05 21,79 ±3,42 105,9 > 0,05

50 24,8 ±2,8 190,8 < 0,05 37,96 ±3,83 184,5 < 0,001

250 4,6 ±0,8 35,4 < 0,001 15,18 ± 1,15 73,8 <0,01

На самцях гібридних мишей лінії СВАхС57ВЬ/Р(, які отримувалі препарат з кормом на протязі 4-х тижнів у дозі 50 мг/кг ваги, після ї: наступної імунізації виявлена більша активність реагування спленоцитії на фітогемаглютинін, що свідчить про більшу потенційну активністі клітин Г-лімфоцитарної системи у дослідних тварин (рис. 6).

с

и

©

о

К

О

РБТЛ

Індекс стимуляції

Рисунок 6 — Вплив лізоензимного препарату ГЗх, внесеного в корм в якості домішки в дозі 50 мг/кг ваги на добу на протязі 4-х тижнів, на імунологічну реактивність мишей

При скорочені тривалості вигодовування препаратом до 2-х тижнів під впливом антигенного стимулу у мишей також виявлено збільшення кількості антитілоутворюючих клітин у селезінці та титрів гемаглютинінів у сироватці крові. Про підвищення клітинного реагування

свідчать і гістологічні дослідження: в селезінці дослідних тварин виявлено значне збільшення лімфоїдної тканини.

Експериментальні дані про рістстимулюючу та імуностимулюючу активність нового біопрепарату були використані в якості вихідних при вивченні впливу препарату ГЗх на ефективність вирощування норок.

Таким чином, на підставі результатів власних досліджень, а також праць співробітників кафедри мікробіології та НДІ біології Дніпропетровського держуніверситету, можна зробити висновок, що ферментний препарат 5. recifensis var. lyticus 2435 має ряд цінних біологічних властивостей, які обумовлюють широкі можливості його практичного засто-, совування не тільки в якості лізуючого, а і в якості стимулятора росту мікроорганізмів та тварин.

ВИСНОВКИ

1. Препарат, синтезований S. recifensis var. lyticus 2435, являється комплексом літичних та супутніх ферментів з рістстимулюючою та імунотропною діями, що розширює сферу можливого його застосування.

2. Рістстимулююча активність препарату відносно досліджених тест-культур залежить від його концентрації в живильиому середовищі, видових особливостей мікроорганізмів, а також від умов культивування (складу живильного середовища, pH, температури, аерації).

3. Встановлено, що препарат впливає на параметри росту мікроорганізмів. Автоклавований препарат скорочує лаг-фазу у бактерій, збільшує питому швидкість росту та накопичування біомаси. Нативний препарат збільшує тривалість лаг-фази у бактерій, а також у дріжджів. У фазі експоненційного росту дріжджів викликає додаткову затримку росту, але завдяки більшій швидкості росту врожай досягає такого ж рівня, як при дії автоклавованого препарату.

4. Біосинтез рістстимулюючого фактору здійснюється тільки у фазі експоненцйного росту продуцента: пік його активності попереджує піки накопичення стафілолізинів, глікозидаз та протеолітичних ферментів.

5. Встановлено, що рістстимулююча активність ферментного препарату обумовлена наявністю в його складі я-ермостійкого фактору, тісно пов’язаного з кислими ; білками. В результаті; гель-фільтрації на сефа-дексі, елюції 1 М розчином хлориду натрія та аффінної хроматографії, стимулятор росту було виділено та очищено (ступінь очищення —61-98 разів).

6. Показано, що стимулятор росту,який має в своєму складі білок та вуглеводи, сорбується на конканавалін-А-сефарозі та єлкмсртлгя >5е-

тил-Ь-О-глюкопіранозидом, що вказує на його глікопропеінову природу.

7. Препарат, внесений в якості домішки до корму, стимулює ріс експериментальних тварин. Його ефективність залежить від дози, трива лості вигодування, віку та статі щурів.

8. Препарат впливає на імунологічний статус тварин. Напрямок йо го дії залежить від дози: при великих дозах (250 мг/кг ваги на добу! він виявляє імунодепресивну дію, при оптимальних - стимулюючу, як; проявляється в підвищенні активності реагування імунної системи як н< введення неспецифічного (ФГА), так і специфічного (еритроцити бара на) стимуляторів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Бабенко Ю. С., Кукушкина Н. В., Черногор Н. П., Куликова Т. Я. Крылова Л. Г. Ростстимулирующая активность лизоэнзимного ком плекса, синтезируемого Streptomyces recifensis var. lyticus 243і //Микробиол. Журн., K.: 1990.-Т. 52, №1.-С. 15-19.

2.Бабенко Ю. С., Кукушкина Н. В., Гниломедова Л. E., Черногор Н.П Применение комплекса литических ферментов Streptomyces recifensii subsp. lyticus 2435 для гидролиза биомассы и стимуляции роста микроорганизмов //Биотехнология, М.-1990.-№1.-С. 52-56.

3. Бабенко Ю. С., Кукушкина Н. В., Черногор Н.П., Жерносеков Д.Д., Феденко В. С. Обнаружение ростсгимулирующего фактора в составе комплексного лизоэнзимного препарата //Биотехнология, М.-1990,-№4.-С. 26-29.

4. Черногор Н. П., Бабенко Ю. С. Влияние условий культивирования микроорганизмов на проявление ростстимулирующей активности лизоэнзимного препарата из Streptomyces recifensis var. lyticus //Микробиол. Журн., K.: 1996.-Т. 58, №5.-С. 44-50.

5. Бабенко Ю. С., Черногор Н.П., Килочек Т. П., Соколова И. E., Жер-носекова И.В. Новый препарат стрептомицетного происхождения, повышающий иммунологическую резистентность организмов в условиях экологического загрязнения и радиационного поражения //Вестник ДГУ, сер. Биология. Днепропетровск.-1996.-С. 108-116.

6.Полож. решение пат. экспертизы по заявке №4853998/13 (081030) 23.07.90 МКИ C12N 9/зб- Способ получения комплекса литических ферментов /Бабенко Ю.С., Кукушкина Н.В., Куликова Т.Я., Крылова Л.Г., Черногор Н.П., Килочек Т.П.

7. Черногор Н.П. Влияние лизоэнзимного препарата шт. Streptomyces recifensis var. lyticus 2435 на закономерности и параметры роста мик-

м

роорганизмов //Биотехнология получения кормового белка.-Днепропетровск, 1995.-С. 33-39.

8.Бабенко Ю.С., Килочек Т.П., Соколова И.Е., Черногор Н.П., Жер-носекова И.В., Степченко Л.М. Свойства нового биопрепарата стрсп-томицетного происхождения и эффективность его использования в качестве кормовой добавки в животноводстве и птицеводстве //Биотехнология получения кормового белка.-Днепропетровск, 1995.-С. 3-39.

9. Черногор Н.П., Бабенко Ю.С. Ростстимулирующая активность нового ферментного препарата, синтезируемого //Микроорганизмы и их ме-раболитыв народном хозяйстве.-Кишинев.-1996.-С. 81-82.

10.Бабенко Ю.С., Килочек Т.П., Черногор Н.П., Соколова И.Е., Жер-носекова И.В. Лизорецифин —новый биопрепарат с антимикробным, ростстимулирующим действием и перспективы его практического использования //Микроорганизмы и их метаболиты в народном хозяй-стве.-Кишинев.-1996.-С. 71-72.

Черногор Н. П. Исследование ростстнмулирующих снойств лизоэизим-

ного препарата Streptomyces rccifcnsis variant lyticus.—Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07—микробиология.—Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев, 1998.

Диссертация посвящена исследованию лизоэнзимного препарата Streptomyces recifensis variant lyticus. В работе приведены данные о способности стимулировать рост и: накопление биомассы микроорганизмов, влиять на показатели роста и иммунологический статус экспериментальных животных. Установлено, что ростстимулирующис свойства препарата обусловлены наличием в его составе биостимулятора, который тесно связан с кислыми белками и имеет гликопротеидную природу. Препарат оказывает влияние па скорость и закономерности роста микроорганизмов. Эффективность действия препарата зависит от его концентрации в среде, видовых и штаммовых особенностей тест-культуры, а также от условий культивирования.

Показана высокая эффективность исследуемого ферментного препарата, используемого в качестве кормовой добавки. Установлены дозы препарата и схемы его применения, обеспечивающие увеличение привесов экспериментальных животных. Эти данные нашли практическое применение при проведении производственных испытаний препарата при выращивании норок.

Ключевые слова: лизоэнзимный препарат, биостимулятор, скорость роста микроорганизмов, кормовая добавка.