Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли фуриноподобных протеиназ и металлопротеиназы МТ1-ММР в патологических процессах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли фуриноподобных протеиназ и металлопротеиназы МТ1-ММР в патологических процессах"

На правах рукописи

Чеканов Алексей Владимирович

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ФУРИНОПОДОБНЫХ ПРОТЕИНАЗ И МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ МТ1-ММР В ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ

03.00.02-биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2006

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино и Институте им. Бернема, г. Сан-Диего.

Научные руководители: доктор физико-математических наук

Акатов Владимир Семенович доктор биологических наук Стронгин Александр Яковлевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор

Надеждина Елена Сергеевна кандидат биологических наук, Безлепкин Владимир Георгиевич

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится «31» мая 2006 года в 13.30_

на заседании диссертационного совета Д 002.093.01

при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по

адресу: 142 290, г. Пущино, ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142 290, г.Пущино, ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН

Автореферат разослан «_»_2006 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

Н.Ф. Ланина

Л ооб

* ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Протеолиз и участвующие в нем протеазы регулируют важнейшие этапы жизнедеятельности и метаболизма клетки. Протеиназы важны для всех живых организмов, включая вирусы, бактерии и эукариотические организмы. Кроме того, протеолиз является неотъемлемой частью, а в ряде случаев и причиной многих патологических процессов. Так вирулентные протеазы играют важную роль в инфекционных заболеваниях, вызываемых бактериями и вирусами. Многие вирусы, такие как ВИЧ, гепатит С, вирусы Лихорадки Западного Нила, Желтой Лихорадки, полиомиелита и гриппа содержат гены протеиназ, необходимые для жизненного цикла вируса, преодоления механизмов клеточной защиты и контроля над метаболизмом клеток. Секреторные протеиназы патогенных бактерий зачастую являются их важнейшими вирулентными факторами. Протеиназы активируют белковые токсины бактерий. Абнормальный протеолиз характерен для роста и метастазирования злокачественных опухолей.

Важность протеолиза в патологических процессах несомненна, и по мере увеличения количества информации в периодической научной литературе только продолжает расти. Открываются новые протеазы, уже известные интенсивно изучаются, и к ним создаются новые ингибиторы. Многие человеческие, бактериальные и вирусные протеиназы являются потенциальными мишенями для создания лекарственных препаратов. Однако, наши представления о протеиназах и о роли протеолиза в большинстве паталогических процессов далеко не полные, и это диктует необходимость продолжения исследований в этом направлении. Такие исследования не только расширяют научные знания, но и дают основу для создания новых способов диагностики и лечения инфекционных заболеваний.

Цели и основные задачи исследования. Цель нашей работы состояла в исследовании роли фуриноподобных протеиназ и металлопротекназы МТ1-ММР в патологических процессах. _

рос. ¡¡дцТ<м \>ТГ7л

2 С.-Псюроург

ОЭ 200^1кт У ОО

Основными задачами работы были:

1. Исследование взаимодействия человеческих фуриновых протеиназ с транспортными белками и ферментами, определяющими токсичность летального токсина сибирской язвы;

2. Изучение свойств вирусной фуриноподобной протеиназы N83, которая играет важную роль в инфекционном механизме вируса Лихорадки Западного Нила;

3. Исследование внутриклеточной функции матриксной металлопротеиназы МТ1-ММР в индукции хромосомной нестабильности и онкогенезе.

Научная новизна. Важность и новизна протеолитических функций фуриноподобных протеиназ и металлопротеиназы МТ1-ММР определяют значимость нашей работы.

1. Идентифицированы новые механизмы процессинга и интернализации летального токсина сибирской язвы, которые позволяют преодолеть дефицит процессирующих протеиназ в человеческой клетке-мишени.

2. Установлена субстратная специфичность и охарактеризована двухкомпонентная протеиназа К82В-М83, кодируемая вирусом Лихорадки Западного Нила.

3. Идентифицирован новый внутриклеточный протеолитический путь, приводящий к анеуплоидии и злокачественной трансформации клеток, в котором участвует металлопротеиназа МТ1-ММР.

Практическая ценность работы. Полученные нами данные могут быть использованы при создании новых эффективных и безопасных лекарственных препаратов для лечения сибирской язвы, ряда вирусных заболеваний и злокачественных новообразований.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на семинаре в институте Бернема (Сан-Диего,2006г.), на съезде Американского Онкологического Общества (Вашингтон,2006г.), на заседании секции ученого совета «Молекулярная, клеточная, радиационная биология» ИТЭБ РАН (Пущино, 2006г.).

Публикации. Результаты диссертационной работы опубликованы в 5 статьях в реферируемых международных нау чных журналах.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.

Работа изложена на_страницах, содержит три таблицы, 21 рисунок.

Библиография включает_ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Активация и эндоцитоз летального токсина сибирской язвы.

Летальный токсин Bacillus anthracis способен убивать макрофаги организма хозяина и за счет этого нейтрализовать иммунную систему.

По механизму действия токсины сибирской язвы являются бинарными. Летальный токсин сибирской язвы состоит из протективного антигена (РА) и летального фактора (LF). Первым этапом интоксикации является связывание РА с его рецепторами на поверхности хозяйской клетки. После связывания с клеточным рецептором, РА83 предшественник (83 - молекулярная масса РА) расщепляется про-протеинконвертазой фурином с образованием зрелой формы, названной РА63 (63 - молекулярная масса РА). Протеолитическая конверсия инициирует олигомеризацию РА63. Олигомер РА63 способен связывать LF. Образованный PA63-LF токсичный комплекс интернализуется клеткой. Вследствие конформационных перестроек РА63, под воздействием кислого pH в эндосомах, формируется пора - трансмембранный канал, сквозь который в цитозоль клетки транслоцируются токсичные факторы. LF является металлопротеиназой. В цитозоле LF инактивирует и гидролизует МАРК киназы, из которых наиболее известна Mekl, и за счет этого вызывает апоптоз клетки организма хозяина.

1.1. Расщепление РА83 протеинконвертазами.

Для того, чтобы определить протеолитический процессинг РА83 протеинконвертазами (PC), РА83 был гидролизован с использованием про-

протеинконвертаз фурина, РС7 и РАСЕ4. Эффективность гидролиза оценивалась по полноте превращения РА83 предшественника в зрелый белок РА63 (Рис. 1).

Рис.1. Расщепление РА83 про-

РА83-* РА63*

РА83 ***

протеинконвертазами (Вестерн блот). Образцы, в которые добавлен ингибитор dec-R.VK.R-стк, отмечены на рисунке

РА83-» РА«3»

РА83-1 РА63-»!

Активности, единиц

Эффективность гидролиза РА83 оказалась сравнимой для всех трех про-протеинконвертаз, хотя РС7 обладала несколько меньшей активностью. Ингибитор фурина, dec-RVKR-cmk, эффективно ингибировал все про-протеинконвертазы. Следовательно, несколько типов PC способны дублировать фурин в процессинге РА83 in vitro. Это дает основания предполагать, что инактивации одного фурина не достаточно для защиты клеток от летального действия токсина. Известно, что различные протеинконвертазы, включая РС1, РС2, РС5 и РС7, в дополнение к фурину, экспрессированы в альвеолах легких, селезенке, периферических макрофагах, и по всей видимости, они могут заменять фурин и также активировать токсин. Поэтому для надежной терапии сибирской язвы и блокирования активации РА83 необходима разработка лекарственных препаратов широкого спектра, способных ингибировать несколько про-протеинконвертаз одновременно, а не только фурин.

1.2. Эндоцитоз и расщепление РА.

Для повышения чувствительности детекции и специфичности идентификации РА, были использованы РА83 и РА63, меченые биотином. В экспериментах намеренно использовались повышенные концентрации РА63,

РА83 иЬРО цг/мл) для того, чтобы полностью насытить клеточные рецепторы РА и про-протеинконвертазы. Эти концентрации были в несколько раз выше, чем те, которые ранее были использованы в работах др> гих авторов.

Для того, чтобы инициировать интернализацию РА клетками, 11251 клетки глиомы человека инкубировались с мечеными биотином РА83 (РА83Ь) и ЬР (Ы"Ь). Затем выделялись ядерная и цитоплазматическая фракции клеток. Отсутствие загрязнения фракций было подтверждено с помощью окраски образцов на белковые маркеры, такие как нуклеопорин (ядерный маркер), И.аЬ5Ь (маркер ранних эндосом), кавсолин и С044 (маркеры цитоплазматической мембраны). Например, нуклеопорин-позитивная ядерная фракция была свободна от С044, кавеолина и ЯаЬ5Ь (Рис.2).

Рис.2. Анализ ядерных и цитоплазматических фракций, выделенных из 11251 клеток (Вестерн блот). ЦФ -цитоплазматическая фракция. ЯФ - ядерная фракция.

В ходе экспериментов была показана интернализация РА83 Ш51 клетками (Рис.3).

Рис.З. Интернализация летального токсина 11251 клетками (Вестерн блот) Контроля РА83Ь и 1ХЪ покачаны на рисунке справа * - неспецифическая полоса

Интернализованный РА83Ь был протеолитически процессирован с образованием, соответственно, РА63. Обе формы РА были идентифицированы в образцах цитоплазматической и ядерной фракций ЫЪ интернализовался

Ядерный Цитоплазм атические Эндосомальный

в X а маркер 1Ша маркеры Ц>а маркер и»

е в г 1 62 9 -о О 85 л 1Л & ... . .. . ,а 24

& я X

ЦФ ЯФ в в

22 ЦФ ЯФ

I АХ»—

£ §

ЦФ ЯФ

Цитоплазматическая

фракяяя

РА83 ЬР — -

РА 63*

РА83Ь + - +

РА83 - + -

ЬГЬ - + -

и " + - -

Ядерная фракция

без клеток

только в присутствии РА. Цитоплазматическая фракция содержала большее количество РА83 по отношению к ядерной фракции. Избыток РА83 в цитоплазматической фракции объясняется наличием в ней цитоплазматических мембран, которые содержат рецепторы со связанным РА83. Присутствие РА83 в ядерной фракции указывает на то, что интернализованные РА гептамеры содержат не только РА63, но еще и интактный РА83.

Для точной оценки этого предположения количественно оценивалась плотность полос РА83Ь и РАбЗЬ в образцах. В ядерной фракции 11251 клеток отношение РА63Ь/РА83Ь равнялось ~ 4:3. Эти данные позволяют предположить, что интернализованные смешанные гептамеры РА представлены четырьмя субъединицами РА63 и тремя субъединицами РА83.

1.3. Расщепление Мек интернализованным

Чтобы продемонстрировать расщепление Мек1 интернализованным и, и251 клетки инкубировались с РА83 дикого типа и мутантным РА83, РА63 и ЬР (1 цг/мл каждого). Мутантный РА83 (РА83-8]ЧКЕ-с1е1гаРР-Е308В) представляет собой белок, у которого сайт расщепления фурином ЯККЯ заменен негидролизуемой последовательностью $ККЕ. Затем клетки были лизированы и выделены цитоплазматическая и ядерная фракции. Полученные образцы цитоплазматической и ядерной фракций были проанализированы с помощью Вестерн блоттинга с антителами к Мек1. Использовались антитела к К1-концевому району Мек1, который отщепляется в результате ЬР зависимого гидролиза Мек1. Поэтому антитела узнают интактный Мек1, но не узнают укороченный Мек1, образующийся в результате протеолиза

На Рис.4 показано, что Мек1 накапливается только в цитоплазматической фракции. В этой фракции Мек1 киназа эффективно расщепляется интернализованным 1Л7. Таким образом, интернализация РА-Ы7 комплекса и251 клетками хорошо коррелирует с и-зависимым расщеплением Мек1. Оба варианта РА (РА83 и РА63) способствовали интернализации ЬР и последующему протеолизу Мек1. Как и ожидалось, каталитически инертный мутант ЬИ Е687С не протеолизовал Мек1.

Рис.4. Гидролиз Мек1 интернализованным летальным токсином в Ш51 клетках. Вестерн блот с окраской антителами специфичными к К-концевому фрагменту Мек1. Уменьшение интенсивности окраски полосы

свидетельствует об ГЛ7-зависимом гидролизе Мек1

В согласии с известными данными о механизмах интернализации и летального действия токсина сибирской язвы, расщепление клеточного Мек1 не наблюдалось в случае использования и в сочетании с РА83-5МКЕ-с1екаРР-Е308Б мутантом. Эти данные подтверждают, что расщепление РА83 фурином и конверсия РА83 в РА63 абсолютно необходимы для формирования гептамерной поры, связывания ЬР активированным РА63 и интернализации клетками токсичного РА-ЬБ комплекса.

1.4. Интернализация смешанных РА83-РА63 гептамеров мышиными макрофагами.

Для подтверждения полученных данных в дополнительной клеточной модели использовалась линия мышиных макрофаго-подобных ЯА>^264.7 клеток. Эти клетки обладают высокой чувствительностью к летальному токсину и широко используются в работах по изучению сибирской язвы.

Рис. 5. Ингибиюры ЬР и фурина защищают клетки КА\У246.7 (линия мышиных макрофагов) от летального действия токсина сибирской язвы Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью метаболической окраски МТТ.

Цитоплязматическая фракция Ядерная фракция

Мек1-»

РА83 - + - - + - - +

РА63 - + - - + -

РА83 вККЕ - + - - + -

ЬР - + + + - - + + + -

1ГЮ7С + - - - - +

В соответствии с результатами других работ, RAW264.7 клетки высоко чувствительны к совместному действию РА83 и LF (рис. 5). Необратимый пептидный ингибитор протеинконвертаз dec-RVKR-cmk (где dec, деканоил и cmk, хлорметилкетон) защищал клетки от смертельного действия бинарного PA-LF токсина. Гидроксаматный ингибитор металлопротеиназ GM6001, относительно высокая концентрация которого, как известно, оказывает ингибирующее действие на активность LF, также защищал клетки от летального действия токсина. Во избежаниие гибели клеток (RAW264.7) в опытах по эндоцитозу, клетки RAW264.7 инкубировались с РА и LF не более 3 часов. Через три часа РА83/63 и LF были обнаружены в ядерной фракции клеток RAW264.7 (Рис.6). В отличие от РА83/63 дикого типа, фурин-резистентный PA83-SNKE-deltaFF-E308D мутант не интернализовался клетками, и вследствие этого не поступал в ядерную фракцию.

Рис.6. Интернализация летального токсина клетками RAW264.7

(Вестерн блот). Контроля РА83Ь и LFb показаны на рисунке справа. * неспецифическая полоса.

Данные, полученные в экспериментах с 11251 клетками, хорошо согласуются с экспериментами по фракционированию RAW264.7 клеток. В этих экспериментах также показано, что Ц? интернализуется вместе с РА63 и РА83 и что и-РА комплекс доставляется во внутриклеточную фракцию, которая свободна от цитоплазматической мембраны.

Количественная оценка плотности полос, соответствующих РА83 и РА63, интернализованных клетками RAW264.7, дала следующие значения; соотношение РА63/РА83 было равно 4.4:2.6. Эти результаты позволяют предположить, что в КААУ264.7 клетках интернализованные, смешанные РА гептамеры состоят из 2-3 субъединиц РА83 и 4-5 субъединиц РА63.

Полученные данные указывают на то, что в состав РА-гептамера могут

Цитоплазматическаи фракция

РАВЗ^

LF".

РА6Г* РА83Ь РА83 SNKEb РАбЗЬ LFb РАМ

Ядерная фракция

+ - -- + -- - +

- + -

+ - -

Контроль без клеток

- +

входить не только РА63 субъединицы, но также и непротеолизованные субъединицы РА83. Согласно структурному анализу РА63 и его комплекса с клеточным рецептором СМ02, количество РА83 субъединиц в гептамере не может превышать 3. Количество РА83 субъединиц в функциональной препоре, способной связывать 1Л% может быть равно одной или двум. Связывания одной молекулы со смешанной гептамерной препорой ЬР-(РА83)2(РА63)3, или двух с ЬР2-(РА83)1(РА63)6 достаточно для формирования токсичного комплекса, способного убивать клетки, что и наблюдалось в экспериментах. Образование смешанных гептамеров позволяет преодолевать дефицит процессирующих токсин протеинконвертаз на поверхности клетки. Кровь животных, умерших от сибирской язвы, может содержать до 109 вегетативных бактерий на милилитр, и разумно предположить, что на последних стадиях инфекции количества секретируемого бактерией РА83 превосходят количество клеточных РС. Результатом недостатка РС может являться образование малого количества РА63 относительно РА83. Если бы только РА63 был необходим для формирования гептамера, процесс образования поры был бы самым критичным этапом при инфекции сибирской язвой. Можно предположить, что олигомеризация РА63 совместно с РА83 приводит к образованию смешанного гептамера и является механизмом, позволяющим формироваться функциональной препоре при ограниченных количествах про-протеинконвертаз клетки хозяина и соответственно РА63.

2. Характеристика N83 протеиназы из вируса Лихорадки Западного Нила.

Посттрансляционный протеолитический процессинг белка-предшественника вируса Лихорадки Западного Нила необходим для образования зрелых вирусных белков и сборки новых вирусных частиц. Фуриноподобные про-протеинконвертазы и вирусная сериновая протеиназа N83 участвуют в протеолитическом процессинге вирусного белка-предшественника. Ранние работы свидетельствуют о том, что вирусная протеиназа К82В-Ы83 участвует в гидролизе пептидных связей на границах между: №2А/Ы82В, КТ52В/К53, ^З/^А и Ы84В/№5 белками, а также в

9

гидролизе внутренних связей в белках С, N83 и №4А. Последовательности, которые расщепляются N83 в вирусном белке-предшественнике, чаще всего содержат аргинин в Р1 позиции, аргинин и лизин в Р2 позиции, глицин и серин в Р'1 позиции. Эти структурные особенности позволяют предположить, что субстратная специфичность N83 протеиназы напоминает специфичность фурина, который расщепляет структурный мотив ЮЖ/КЕД. Поскольку мутации сайтов расщепления N83 в вирусном белке-предшественнике приводят к утрате вирулентности вируса, каталитически активная N83 протеиназа совершенно необходима для жизненного цикла вируса Лихорадки Западного Нила и подобных ему флавивирусов. Важность N83 в жизненном цикле флавивирусов делает эту протеиназу мишенью для антивирусной терапии.

2,1 N53 расщепляет сайт фурина в белковых субстратах.

В вирусном полипротеиновом белке-предшественнике N83 чаще всего гидролизует последовательности, содержащие положительно заряженные аминокислотные остатки в положениях Р1 и Р2. Эта субстратная специфичность характерна также для катепсина В и фурина. В наших экспериментах N83 эффективно расщепляла флуоресцентные субстраты фурина Boc-R.VRR.-AMC и Руг^ТКЯ-АМС, в то время, как эффективность расщепления субстрата катепсина В была существенно ниже (см. табл. 1).

Таблица 1.

NS3 протеиназа гидролизует фурнновые флуоресцентные пептиды.

Субстрат Vmal, цМ/s Км, цМ 8"1 *ci1/Km,M-V

Z-RR-AMC 0.0031 146 0.062 424

Boc-RVRR-AMC 0.0037 41 0.073 1,791

Pyr-RTKR-AMC 0.05 43 1 23,000

Boc-AGPR-AMC Нет расщепления

Boc-QAR-AMC Нет расщепления

Boc-O-benzyl-EGR-pNA Нет расщепления

AMC, 7-амино-4-метилкумарин; Вое, четвертичный бутилоксикарбонил; pNA, р-нитроанилид; Руг, пироглутаминовая кислота; Z, бензилоксикарбонил

Константы Михаэлиса-Ментен, ^\пах и А^а/Кт, для гидролиза этих субстратов приведены в таблице 1. Присутствие в позиции Р2 аминокислоты, отличной от положительно заряженных аргинина или лизина, делает субстрат устойчивым к гидролизу N83.

В соответствии с гипотезой о фурино-подобной субстратной специфичности NS3, было показано, что NS3 протеиназа расщепляет фуриновый сайт RKKR167jS168TS в последовательности РА83. Подобно фурину, гидролиз по этому сайту превращает белок РА83 в зрелую форму РА63 (Рис. 7). В последовательности РА83 отсутствуют другие мотивы, которые могли бы расщепляться NS3.

Рис.7. N83 протеииаза заменяет фурин и способна гидролизовать РА83. Сайт расщепления фурина в последовательности РА83

подчеркнут.

РА83 SSNSRKKR,,71S1WTSAG

88- «мам» «ям* -4-РА83

84- *"—1* *-РА6Э

443422-

Ж ¿Г Ж

¿г

Чтобы подтвердить способность N83 протеиназы гидролизовать

последовательности из полипротеинового вирусного предшественника,

которые чувствительны к протеолизу фурином, был проанализирован гидролиз

пептида К^ТКНЗКЕБЮЗЬ94 из ргМ белка вируса Лихорадки Западного Нила

(сайт узнавания фурином подчеркнут). Известно, что во время секреторного

экспорта вирусных частиц, гликопротеин вирусной оболочки ргМ расщепляется

фурином. В результате этого расщепления образуется зрелый М белок, который

необходим для последующей реорганизации Е-гликопротеина и

инфекционности вируса. Пептид К83Т1Ш8Ш18Щ18Ь94 был гидролизован

протеиназой N83, и затем массы продуктов гидролиза были определены с

помощью МАЬРЬТОР масс-спектрометрии. В результате гидролиза пептид,

массой 1540 Ба, расщеплялся с образованием продукта К^ТИШИ*., массой

941 Оа. Таким образом было установлено, что расщепление происходит по

Я89^90 сайту. В качестве контроля N83 гидролиза использовался

А941>Ж£>988ТКС>ККЩ вв107 пептид, содержащий известный сайт расщепления

И

NS3 KRjGG107 из заякоренного капсидного С белка вируса Лихорадки Западного Нила. Как и предполагалось, NS3 протеиназа эффективно гидролизовала A94INRD98STKQKKR|GG107 пептид в ожидаемом Ri0S|G106 сайте.

Полученные данные подтверждают гипотезу, что NS3 протеиназа имеет субстратную специфичность, которая сходна со специфичностью фурина. Специфичность NS3, однако, более широка, чем специфичность фурина.

2.2. Вероятные белки-мишени NS3 протеиназы в клетках хозяина.

Для поиска потенциальных белков-мишеней NS3 протеиназы, мы использовали программу для предсказания белковых субстратов протеиназ (PoPS) (http://pops.csse.monash.edu.au). Если известна субстратная специфичность протеиназы, эта программа сканирует последовательности белков протеома человека и определяет участки последовательности, которые могли бы расщепляться протеиназой. Для поиска субстратов с помощью PoPS была сконструирована вырожденная матрица Р4-Р4' последовательностей узнавания NS3. Поскольку в мотиве для поиска субстратов NS3 в положении Р4 отсутствовали положительно заряженные аргинин и лизин, которые необходимы для узнавания данного сайта фурином, субстраты фурина не обнаруживались в нашем поиске. В результате анализа были идентифицированы 28 человеческих белков - потенциальных субстратов NS3 протеиназы. Все эти белки характеризовались высокой вероятностью расщепления NS3, среди них были обнаружены два белка мозга, которые могли бы быть связаны с биологической функцией вируса Лихорадки Западного Нила, который, как известно, вызывает нейропатологии и симптомы сходные с менингитом. Белками мозга были основной белок миелина (МВР) и белок миелина zero, которые необходимы для нормального функционирования нейронов. Нарушение нормальной функции этих белков приводит к дегенерации нейронов и неврологическим патологиям. Для того, чтобы подтвердить достоверность предсказаний программы PoPS, белок МВР был гидролизован с помощью NS3 протеиназы in vitro. Было показано, что МВР

обладает высокой чувствительностью к специфическому гидролизу NS3 протеиназой (Рис. 8).

А Основной белок миелина (МВР; 18,5 kDa)

msaniPSSR 8GSKYXATA8 ТМШМШОП. WUffiDTOILD SKSUrrOOOR sxpratioaeicv pnuctcrsm, рзштздин, oorkdshhf astkhthslf gKSHSKTQDx BPWHIIBII vtprtpppsq SKGR+OLSLSR rsHGAiGQRi OFSreSBASD ncsxaxence VMOGTLSKI IKLOtStDSBS osnant

в

NS3 зависимое расщепление МВР

kDa

so

Зв

22 1в в

N83 -

Алротииин -» Апропгинии -

Рис.8. Основной белок миелина (МВР) -предполагаемый субстрат для NS3 протеиназы в мозгу.

(A) Стрелками обозначены идентифицированные сайты расщепления NS3 в последовательности человеческого белка МВР.

(B) МВР (18.5 kDa) обладает высокой чувствительностью к гидролизу NS3 протеиназой вируса Лихорадки Западного Нила in vitro (соотношение фермент/субстрат 1:25-250).

(C) Апротинин (слева) и aofleKa-D-Arg-NH2 (справа) ингибируют NS3 зависимое расщепление МВР in vitro.

Знание субстратной специфичности протеиназы NS3 позволило идентифицировать потенциальные белки-мишени NS3 в человеческих клетках. Полученные экспериментальные данные показали, что МВР эффективно и специфично гидролизуется NS3 протеиназой. Не исключено, что протеолиз МВР за счет NS3 может иметь большое физиологическое значение при вирусной инфекции и вносить существенный вклад в патогенез Лихорадки Западного Нила.

2.3. Серпины и пептиды на основе D-аргинина как ингибиторы NS3.

Ингибиторы сериновых протеиназ (серпины) и пептиды на основе D-аргинина являются эффективными ингибиторами фурина. Поскольку полученные данные указывают на фурино-подобную субстратную специфичность NS3, было проверено, являются ли D-аргининовые пептиды и серпины ингибиторами вирусной протеиназы. Опыты показали, что наномолярные концентрации D-аргининовых пептидов с размером от 6 до 12 остатков эффективно ингибировали NS3 протеиназу in vitro.

Также было показано, что NS3 чувствительна к хорошо известному ингибитору фурина, а]-антитрипсину вариант Портланд. Апротинин (ингибитор трипсина) также эффект ивно ингибировал NS3 (К, = 26 нМ). Было показано, что апротинин и D-аргининовые пептиды эффективно ингибировали in vitro ИБЭ-зависимый гидролиз как флуоресцентных пептидных субстратов, так и белковых субстратов (например, МВР) (Рис. 8).

На основании того, что фурин и NS3 обладают сходной субстратной специфичностью, можно предположить, что существуют общие ингибиторы этих протеиназ. Понимание этого облегчило быструю идентификацию ингибиторов NS3 протеиназы. Было установлено, что пептиды на основе D-аргинина в наномолярных концентрациях эффективно ингибируют протеолитическую активность не только фурина, но также и NS3 протеиназы.

3. Онкогенный эффект МТ1-ММР и гидролиз перицентрина.

Из 25 известных человеческих матриксных металлопротеиназ (ММР), повышенная экспрессия матриксной металлопротеиназы мембранного типа 1 (МТ1-ММР) сильнее всего связана с развитием рака. Существуют свидетельства, что после доставки на цитоплазматическую мембрану МТ1-ММР, как и другие мембрано-связанные белки, интернализуется внутрь клетки. Полученные данные подтверждают, что МТ1-ММР доставляется в перицентросомальное пространство после презентации МТ1-ММР на поверхности клетки. Клатрин- и кавеолин-зависимые пути вовлечены в процесс интернализации и реутилизации МТ1-ММР. Для эндо- и экзоцитоза МТ1-ММР необходимо наличие микротрубочного цитоскелета клетки. Везикулы, содержащие МТ1-ММР используют микротрубочный цитоскелет как рельсы для транспортировки МТ1-ММР внутрь клетки. За счет этого часть интернализованной МТ1-ММР доставляется в перицентросомальное пространство. Экспериментальные данные показывают, что функционально активная МТ1-ММР аккумулируется в перицентросомальном пространстве. В центросомах при этом МТ1-ММР, по-видимому, гидролизует ряд центросомальных и перицентросомальных белков. Гидролиз одного из таких

I

I

I

белков, перицентрина, был подтвержден экспериментально. Перицентрин - это интегральный центросомальный белок, необходимый для нормального функционирования центросом и формирования веретена деления. Протеолиз перицентрина и нарушение его функции приводит к нарушению структуры веретена деления, хромосомным аберрациям и анеуплоидии.

3.1. Анализ пептидов, содержащих сайт узнавания МТ1-ММР из перицентрина человека, собаки и мыши.

Ранее было показано, что клеточная МТ1-ММР способна расщеплять перицентрин в собачьих (МОСК) и человеческих опухолевых клетках. В данной работе была поставлена задача точно определить сайт гидролиза перицентрина. Предварительные данные свидетельствовали, что МТ1-ММР расщепляет последовательность - ALRRLLGn56.lL! 157РО человеческого перицентрина. Сравнение последовательностей человеческого, мышиного и собачьего перицентрина показало, что последовательности из человеческого (А1Л1111ХОп5б!Ьп57рО) и собачьего (АЬРЖ1.Бгобв! 1-20б9рО) перицентрина содержат сайт расщепления МТ1-ММР, в то время как в последовательности мышиного перицентрина (АЬИНи^адГ^РО) присутствие 0948 инактивировало сайт расщепления.

Рис. 9. Расщепление пептидов т перицентрина МТ1-ММР протеиназой.

Масс-спектрометрический анализ (МАЬШ-ТОР).

Человеческий перицентрин АЫЖЫ/51156*ЬЕС

Собачий перицентрин Мышиный перицентрин

АЫЖЬЬЗ2068*!^

АЬВДЬЬС'

-МП-ММР Ш7 I-

Ммеа

Масса [МЯ)

Контрольный пептид 8вЮСР1ЛТА

♦ мп-ммр * мякшие £

11« |

инодАге ИИ

1,1.

Маем (НО)

Человеческий перицентрин

Масса (МЛ} * Масса (МЛ)

Собачий Мышиный

перицентрин перицентрин

Гидролиз синтетических пептидов in vitro подтвердил активность МТ1-ММР по отношению к человеческому и собачьему перипентринам (Рис.9).

Как и ожидалось, аминокислотная последовательность

ALRRLLD948L 919FG, соответствующая последовательности мышиного перицентрина, была устойчивой к гидролизу как человеческой, так и мышиной МТ1-ММР. Эти результаты согласуются с данными о субстратной специфичности МТ1-ММР, указывающими на то, что присутствие отрицательно заряженного остатка аспарагиновой кислоты в Р1 положении инактивирует сайт расщепления МТ1-ММР.

3.2. Расщепление D948G мутанта мышиного перицентрина МТ1-ММР.

Чтобы подтвердить результаты in vitro гидролиза пептидов, была мутирована последовательность ALRRLLD948L949FG мышиного перицентрина. Мутация привела к замене аспарагиновой кислоты на глицин (D948G). Полученный мутант в итоге содержал сайт расщепления МТ1-ММР ALRRLLG948IL949FG, идентичный последовательности человеческого перицентрина. Клетки U251 были трансфецированы плазмидами, содержащими гены мышиного перицентрина дикого типа и D948G мутанта.

Рис.10. Мутант перицентрина D948G гидролшуется внутриклеточной МТ1-ММР в клетках U251 глиомы человека.

Мышиным перииентрином 2 дикого типа и D948G мутантом были трансфецированы: контрольные клетки (контр/PER-M и кон rp/PER-D948G, соответственно), клетки экспрессирующие МТ1-ММР (MT/PER-M и MT/PER-D948G, соответственно), клетки в которых экспрессия МТ1-ММР подавлена с помощью siRNA (siM'I/ PER-M и siMT/PER-D948G, соответственно).

Мышиный Перицентрин ALRRLLD"" L"*'FG Человеческий Перицентрин ALRRLLG""» L""FG Мышиный D948G Мутант ALRRLLG*" » L"*FG

а,0>

> ///

//////

kDa ^ Ч? ^ f ^

2so шшт мм ШШ *" +1 й ШВ Щ Г Шт ЯР &

150

10064

/

£ 1 #

45 Ш

В эксперименте были использованы три типа U251 клеток: контрольные, которые синтезировали природный низкий уровень МТ1-ММР; МТ клетки, которые экспрессировали высокий уровень МТ1-ММР; siMT клетки, в которых синтез МТ1-ММР был подавлен siRNA конструктом.

Перицентрин дикого типа, как и мутант D948G, были оба стабильны в контрольных и siMT клетках. Расщепления мышиного перицентрина дикого типа не происходило в МТ клетках, которые экспрессируют МТ1-ММР протеазу. В то же время мутант перицентрина D948G интенсивно протеолизовался в МТ клетках. Суммарная молекулярная масса N-концевого и С-концевого фрагментов перицентрина (105 и 140 kDa) хорошо коррелирует с молекулярной массой интактного мышиного перицентрина (245 kDa). Эти результаты подтверждают эксперименты по in vitro гидролизу синтетических пептидов и свидетельствуют, что реконструкция сайта узнавания человеческой МТ1-ММР ALRRLLG948|L949FG превращает мышиный перицентрин в субстрат МТ1-ММР (Рис. 10).

Полученные экспериментальные данные подтверждают, что МТ1-ММР способна расщеплять перицентрин в человеческих клетках. Инактивация сайта расщепления МТ1-ММР предотвращает гидролиз перицентрина. Это характерно для мышей, в которых МТ1-ММР, по-видимому, играет только одну важную функцию - внеклеточного протеолиза в развитии опухолей. Для человека можно предположить две функции этого фермента - внеклеточную и внутриклеточную.

3.3. Определение хромосомной нестабильности в эпителиальных клетках молочной железы человека 184В5.

Нормальные клетки молочной железы человека 184В5 были трансформированы геном человеческой МТ1-ММР, посредством лентивирусного вектора. С помощью иммуноцитохимического анализа и проточной цитофлуорометрии было установлено, что произошло значительное увеличение генетической нестабильности в клетках 184В5, экспрессирующих рекомбинантную МТ1-ММР. Также были обнаружены многочисленные

аберрации хромосом в митотической фазе клеточного цикла (Рис. 11).

17

"Экспрессия МТ1-ММР приводит к нарушениям митоза и формированию злокачественного фенотипа клеюк.

Рис.11.

3.4. Модель рака молочной железы в иммунодефицитной (nude) мыши.

Клетки 184В5 экспрессирующие МТ1-ММР, были инокулированы в жировою подушку молочной железы мыши На 14 день после инъекции они образовали опухоль у всех 10 мышей экспериментальной группы Максимальный размер опухоли достигал 5 мм в диаметре (Рис.12) Контрольные клетки 184В5 дикого типа не образовывали опухоль (10 мышей в ] руппе) К четвертой неделе эксперимента опухоль исчезала

На гистологическом срезе опухоли, развившейся из клеток -репрессирующих МТ1-ММР, был обнаружен некроз в центре опухоли (Рис.13) Экспрессия МТ1-ММР была обнаружена на периферии опухоли

Рис.12.

Трансформированные VIT1-\1MP клетки 184В5

образуют опухоль в nude мышах.

Рис. 13. Некроз в центре опухоли. Окраска

гематоксилином эозином.

и

Окраска на маркер ангиогенеза СЭ105 присутствовала только за пределами опухоли На основании этих данных был сделан вывод об отсутствии ангиогенеза в опухоли

Чтобы показать онкогенную роль металлопротеиназы МТ1-ММР, исследовалось ее влияние на нормальные клетки человека со стабильным хромосомным набором Было показано, что экспрессия МТ1-ММР вызывает хромосомные аберрации в нормальных клетках молочной железы человека 184В5 и способна трансформировать их в опухолеобразуюшие клетки Однако, в использованной экспериментальной модели экспрессия одной только МТ1-ММР не является достаточным условием для развития полноценной злокачественной опухоли Отсутствие маркеров ангиогенеза и массивный некроз в центре опухоли свидетельствуют о необходимости экспрессии ангиогенных факторов для развития опухоли

Таким образом, в диссертации продемонстрирована внутриклеточная функция металлопротеиназы МТ1-ММР Экспрессия МТ1-ММР способна индуцировать анеуплоидию и онкогенез благодаря гидролизу перицентрина Гидролиз перицентрина, в свою очередь, приводит к нарушению нормальной функции центросом и веретена деления, вызывая хромосомную нестабильность По современным представлениям - один из главных факторов онкогенеза

выводы

Идентифицирован и охарактеризован новый механизм гетероолигомеризации протективного антигена летального токсина сибирской язвы, позволяющий преодолеть дефицит про-протеинконвертаз хозяйской клетки-мишени. Использование этого механизма позволяет возбудителю сибирской язвы успешно атаковать многие дополнительные типы клеток, дефицитных по про-протеинконвертазам.

Определена субстратная специфичность процессирующей протеиназы N83 вируса Лихорадки Западного Нила. Установлено, что эта протеиназа по субстратной специфичности наиболее близка к фуриноподобным протеинконвертазам. Знание этого феномена позволило нам идентифицировать ряд эффективных антагонистов фуриноподобной протеиназы N83.

Установлено, что основной белок миелина является субстратом вирусной протеиназы N83, его гидролиз может иметь важное значение в развитии симптомов энцефалопатии, вызываемых вирусом Лихорадки Западного Нила.

Установлена новая внутриклеточная функция матриксной металлопротеиназы МТ1-ММР. Эта функция связана с гидролизом интегрального центросомального белка перицентрина металлопротеиназой МТ1-ММР, что ведет к хромосомной нестабильности и превращению нормальных клеток в злокачественные.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Chekanov A.V., Remade A.G., Golubkov V.S., Akatov V.S., Sikora S., Savinov A.Y., Fugere M., Day R.. Rozanov D.V., Strongin A.Y. Both PA63 and PA83 are endocytosed within an anthrax protective antigen mixed heptamer: a putative mechanism to overcome a furin deficiency. // Arch. Biochem. Biophys., 2006, v. 446, p. 52-59.

2. Shiryaev S.A., Ratnikov B.I., Chekanov A.V., Sikora S., Rozanov D.V., Godzik A., Wang J., Smith J.W., Huang Z., Lindberg I., Samuel M.A., Diamond M.S., Strongin A.Y. Cleavage targets and the D-arginine-based inhibitors of the West Nile virus NS3 processing proteinase. // Biochem. J., 2006, v. 393, p. 503-511.

3. Golubkov V.S., Chekanov A.V., Doxsey S.J., Strongin A.Y. Centrosomal pericentrin is a direct cleavage target of membrane type-1 matrix metalloproteinase in humans but not in mice: potential implications for tumorigenesis. // J. Biol. Chem., 2005, v. 280, p. 42237-42241.

4. Golubkov V.S., Boyd S., Savinov A.Y., Chekanov A.V., Osterman A.L., Remacle A., Rozanov D.V., Doxsey S.J., Strongin A.Y. Membrane type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) exhibits an important intracellular cleavage function and causes chromosome instability. // J. Biol. Chem., 2005, v. 280, p. 25079-25086.

5. Remacle A.G., Rozanov D.V., Baciu P.C., Chekanov A.V., Golubkov V.S., Strongin A.Y. The transmembrane domain is essential for the microtubular trafficking of membrane type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP). // J. Cell. Sci., 2005, v. 118, p. 4975-4984.

» - 9 9 8 8

к исполнению 27/04'2006 Заказ №354

Исполнено 28/04/2006 Тираж- 80 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 \\>\¥\у.аиЮгеГега1 ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чеканов, Алексей Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общие представления о протеазах и их роли в биологических процессах.

2.1.1. Протеазы.

2.1.2. Протеазы: функции в нормальных и патологических процессах.

2.1.3 Про-протеинконвертазы: роль в нормальных и патологических процессах.

2.2. Роль протеаз в вирусных заболеваниях.

2.2.1. Механизм проникновения вирусов внутрь клеток.

2.2.2. Вирус Лихорадки Западного Нила.

2.2.3. Протеиназа NS3 - роль в жизненном цикле флавивирусов.

2.3. Роль протеолиза в бактериальных инфекционных заболеваниях.

2.3.1. Бинарные бактериальные токсины.

2.3.2. Токсины сибирской язвы.

2.3.3. Связывание РА с клетками мешенями.

2.3.4. Сборка токсина и эндоцитоз.

2.3.5. Транслокация EF/LF.

2.3.6. Ферментативная активность.

2.4. Роль центросом и металлопротеиназы МТ1-ММР в хромосомной нестабильности и туморогенезе.

2.4.1. Матриксная металлопротеиназа мембранного типа МТ1-ММР.

2.4.2. Центросома - органелла, отвечающая за генетическую стабильность.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Реагенты.

3.2. Антитела, белки и клеточные линии.

3.3. Разделение цитоплазматической и ядерной фракций.

3.4. Расщепление клеточного МЕК1 интернализованным LF.

3.5. Определение цитотоксичности LF.

3.6. Расщепление про-протеинконвертазами РА83.

3.7. Интернализация биотин-меченых РА и LF.

3.8. Иммунофлуоресцентная микроскопия.

3.9. in silico моделирование.

3.10. Клонирование генов и получение рекомбинантных плазмид.

3.11. Экспрессия и очистка белков.

3.12. Расщепление протеиназой NS3 белковых субстратов.

3.13. Гидролиз пептидов протеиназой NS3.

3.14. Определение протеолитической активности NS3 с помощью флюоресцентных пептидов.

3.15. Мутагенез и трансфекция клеток.

3.16. Получение рекомбинантного лентивирусного вектора и сборка вируса.

3.17. Инфекция рекомбинантным лентивирусом линии клеток 184В5 и получение клонов.

3.18. Определение хромосомной нестабильности.

3.19. Модель рака молочной железы в иммунодефицитных (nude) мышах.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Активация и эндоцитоз летального токсина сибирской язвы.

4.1.1. Расщепление РА83 про-протеинконвертазами.

4.1.2. Эндоцитоз и расщепление РА.

4.1.3. Расщепление Mekl интернализованным LF.

4.1.4. Интернализация смешанных РА83-РА63 гептамеров мышиными макрофагами.

4.1.5. Иммунофлуоресцентная микроскопия.

4.2. Характеристика NS3 протеиназы из вируса Лихорадки Западного Нила.

4.2.1. NS3 расщепляет сайт фурина в белковых субстратах.

4.2.2. Вероятные белки-мишени NS3 протеиназы в клетках хозяина.

4.2.3. Серпины и пептиды на основе D-аргинина как ингибиторы NS3.

4.3. Онкогенный эффект МТ1-ММР и гидролиз перицентрина.

4.3.1. Анализ пептидов, содержащих сайт узнавания МТ1-ММР из перицентрина человека, собаки и мыши.

4.3.2. Расщепление D948G мутанта мышиного перицентрина МТ1-ММР.

4.3.3. Определение хромосомной нестабильности в эпителиальных клетках молочной железы человека 184В5.

4.3.4. Модель рака молочной железы в иммунодефицитной nude) мыши.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. Альтернативный механизм активации и эндоцитоза летального токсина сибирской язвы.

5.2. Белковые субстраты и ингибиторы NS3 протеиназы из вируса Лихорадки Западного Нила.

5.3. Роль МТ1-ММР в хромосомной нестабильности и онкогенезе.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование роли фуриноподобных протеиназ и металлопротеиназы МТ1-ММР в патологических процессах"

Протеолиз и участвующие в нем протеиназы регулируют важнейшие этапы жизнедеятельности и метаболизма клетки. Протеиназы важны для всех живых организмов, включая вирусы, бактерии и эукариотические организмы. Кроме того, протеолиз является неотъемлемой частью, а в ряде случаев и причиной многих патологических процессов. Так вирулентные протеазы играют важную роль в инфекционных заболеваниях, вызываемых бактериями и вирусами. Многие вирусы, такие как ВИЧ, гепатит С, вирусы Лихорадки Западного Нила, Желтой Лихорадки, полиомиелита и гриппа содержат гены протеиназ, необходимые для жизненного цикла вируса, преодоления механизмов клеточной защиты и контроля над метаболизмом клеток. Секреторные протеиназы патогенных бактерий зачастую являются их важнейшими вирулентными факторами. Протеиназы активируют белковые токсины бактерий. Абнормальный протеолиз характерен для роста и метастазирования злокачественных опухолей.

Цель нашей работы состояла в исследовании роли фуриноподобных протеиназ и металлопротеиназы МТ1-ММР в патологических процессах.

Первой задачей нашей работы являлось исследование взаимодействия человеческих фуриновых протеиназ с транспортными белками и ферментами, определяющими токсичность летального токсина сибирской язвы. Эта система включает: токсин сибирской язвы, рецепторы токсина, находящиеся на поверхности человеческих клеток, и человеческие фуриновые протеиназы, необходимые для процессинга компонентов токсина и его последующей интернализации человеческой клеткой.

Второй задачей было изучение свойств вирусной фуриноподобной протеиназы NS3, которая играет важную роль в инфекционном механизме вируса Лихорадки Западного Нила. Для изучения двухкомпонентной сериновой протеиназы, кодируемой геномом вируса, мы использовали рекомбинантную протеиназу, модельные белки и субстраты, что позволило нам избежать работы с высокоинфекционным и опасным вирусом.

Изучение протеолитического механизма, определяющего онкогенный эффект матриксной металлопротеиназы МТ1-ММР, стало третьей задачей нашего исследования. Нами были идентифицированы новые внутриклеточные белковые субстраты мембранной металлопротеиназы МТ1-ММР. В результате МТ1-ММР зависимого внутриклеточного гидролиза центросомальных белков возникают нарушения митотического веретена деления, что приводит к генетической нестабильности, хромосомным аберрациям и анеуплоидии. Анеуплоидия, по современным представлениям, является одним из главных факторов злокачественной трансформации клеток.

Важность протеолиза в патологических процессах несомненна, и по мере увеличения количества информации в периодической научной литературе только продолжает расти. Понимание того, как функционируют протеиназы в живых организмах, способствует разработке новых методов детекции, прогноза и лечения многих заболеваний. Идентифицированные в данной работе свойства и функциональные параметры фуриноподобных протеиназ и мембранной металлопротеиназы МТ1-ММР не были известны ранее. Полученные нами данные могут быть использованы при создании новых эффективных и безопасных ингибиторов сибирской язвы, ряда вирусных заболеваний и злокачественных новообразований.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Чеканов, Алексей Владимирович

6. выводы

1. Идентифицирован и охарактеризован новый механизм гетероолигомеризации протективного антигена летального токсина сибирской язвы, позволяющий преодолеть дефицит про-протеинконвертаз хозяйской клетки-мишени. Использование этого механизма позволяет возбудителю сибирской язвы успешно атаковать многие дополнительные типы клеток, дефицитных по про-протеинконвертазам.

2. Определена субстратная специфичность процессирующей протеиназы NS3 вируса Лихорадки Западного Нила. Установлено, что эта протеиназа по субстратной специфичности наиболее близка к фуриноподобным протеинконвертазам. Знание этого феномена позволило нам идентифицировать ряд эффективных антагонистов фуриноподобной протеиназы NS3.

3. Установлено, что основной белок миелина является субстратом вирусной протеиназы NS3, его гидролиз может иметь важное значение в развитии симптомов энцефалопатии, вызываемых вирусом Лихорадки Западного Нила.

4. Установлена новая внутриклеточная функция матриксной металлопротеиназы МТ1-ММР. Эта функция связана с гидролизом интегрального центросомального белка перицентрина металлопротеиназой МТ1-ММР, что ведет к хромосомной нестабильности и превращению нормальных клеток в злокачественные.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чеканов, Алексей Владимирович, Пущино

1. Fuller R.S., Brake A .J., Thorner J. Intracellular targeting and structural conservation of a prohormone-processing endoprotease // Science. 1989, v. 246, p. 482-486.

2. Bresnahan P.A., Leduc R., Thomas L., Thorner J., Gibson H.L., Brake A.J., Barr P.J., Thomas G. Human fur gene encodes a yeast KEX2-like endoprotease that cleaves pro-beta-NGF in vivo IIJ Cell Biol 1990, v. 111, p. 2851-2859.

3. Rockwell N.C., Krysan D.J., Komiyama Т., Fuller R.S. Precursor processing by kex2/furin proteases // Chem Rev. 2002, v. 102, p. 4525-4548.

4. Thomas G. Furin at the cutting edge: from protein traffic to embryogenesis and disease // Nat Rev Mol Cell Biol. 2002, v. 3, p. 753-766.

5. Nakayama K. Furin: a mammalian subtilisin/Kex2p-like endoprotease involved in processing of a wide variety of precursor proteins // Biochem J. 1997, v. 327, p. 625-635.

6. Brinton M.A. The molecular biology of West Nile Virus: a new invader of the western hemisphere // Annu Rev Microbiol. 2002, v. 56, p. 371-402.

7. Stadler К., Allison S.L., Schalich J., Heinz F.X. Proteolytic activation of tick-borne encephalitis virus by furin // J Virol. 1997, v. 71, p. 8475-8481.

8. Devriese P.P. On the discovery of Clostridium botulinum // J Hist Neurosci. 1999, v. 8, p. 43-50.

9. Aktories K., Barth H. Clostridium botulinum C2 toxin—new insights into the cellular up-take of the actin-ADP-ribosylating toxin // Int J Med Microbiol. 2004, v. 293, p. 557-564.

10. Montecucco C., Papini E. Cell penetration of bacterial protein toxins // Trends Microbiol. 1995, v. 3, p. 165-167.

11. Turton K., Chaddock J.A., Acharya K.R. Botulinum and tetanus neurotoxins: structure, function and therapeutic utility // Trends Biochem Sci. 2002, v. 27, p. 552-558.

12. Finkelstein R.A., Boesman M., Neoh S.H., LaRue M.K., Delaney R. Dissociation and recombination of the subunits of the cholera enterotoxin (choleragen) // J Immunol. 1974, v. 113, p. 145-150.

13. Gill D.M., Pappenheimer A.M., Brown R., Kurnick J.T. Studies on the mode of action of diphtheria toxin. VII. Toxin-stimulated hydrolysis of nicotinamide adenine dinucleotide in mammalian cell extracts // J Exp Med. 1969, v. 129, p. 1-21.

14. Collier R.J., Kandel J. Structure and activity of diphtheria toxin. I. Thiol-dependent dissociation of a fraction of toxin into enzymicallyactive and inactive fragments IIJ Biol Chem. 1971, v. 246, p. 14961503.

15. Smith H. Discovery of the anthrax toxin: the beginning of studies of virulence determinants regulated in vivo // Int J Med Microbiol. 2002, v. 291, p. 411-417.

16. Aktories K., Barmann M., Ohishi I., Tsuyama S., Jakobs K.H., Habermann E. Botulinum C2 toxin ADP-ribosylates actin // Nature. 1986, v. 322, p. 390-392.

17. Baseman J.B., Pappenheimer A.M., Gill D.M., Harper A.A. Action of diphtheria toxin in the guinea pig IIJ Exp Med. 1970, v. 132, p. 11381152.

18. Vitale G., Bernardi L., Napolitani G., Mock M., Montecucco C. Susceptibility of mitogen-activated protein kinase kinase family members to proteolysis by anthrax lethal factor // Biochem J. 2000, v. 352, p. 739-745.

19. Stanley J.L., Smith H. Purification of factor I and recognition of a third factor of the anthrax toxin IIJ Gen Microbiol. 1961, v. 26, p. 4963.

20. Guidi-Rontani C. The alveolar macrophage: the Trojan horse of Bacillus anthracis // Trends Microbiol. 2002, v. 10, p. 405-409.

21. Green B.D., Battisti L., Koehler T.M., Thorne C.B., Ivins B.E. Demonstration of a capsule plasmid in Bacillus anthracis II Infect Immun. 1985, v. 49, p. 291-297.

22. Pezard C., Berche P., Mock M. Contribution of individual toxin components to virulence of Bacillus anthracis // Infect Immun. 1991, v. 59, p. 3472-3477.

23. Smith H., Keppie J. Observations on experimental anthrax; demonstration of a specific lethal factor produced in vivo by Bacillus anthracis И Nature. 1954, v. 173, p. 869-870.

24. Mourez M. Anthrax toxins // Rev Physiol Biochem Pharmacol. 2004, v. 152, p. 135-164.

25. Bradley K.A., Mogridge J., Mourez M., Collier R.J., Young J.A. Identification of the cellular receptor for anthrax toxin // Nature. 2001, v. 414, p. 225-229.

26. Scobie H.M., Rainey G.J., Bradley K.A., Young J.A. Human capillary morphogenesis protein 2 functions as an anthrax toxin receptor И Proc Natl AcadSci USA. 2003, v. 100, p. 5170-5174.

27. Santelli E., Bankston L.A., Leppla S.H., Liddington R.C. Crystal structure of a complex between anthrax toxin and its host cell receptor II Nature. 2004, v. 430, p. 905-908.

28. Gordon V.M., Klimpel K.R., Arora N., Henderson M.A., Leppla S.H. Proteolytic activation of bacterial toxins by eukaryotic cells isperformed by furin and by additional cellular proteases // Infect lmmun. 1995, v. 63, p. 82-87.

29. Milne J.C., Furlong D., Hanna P.C., Wall J.S., Collier R.J. Anthrax protective antigen forms oligomers during intoxication of mammalian cells IIJ Biol Chem. 1994, v. 269, p. 20607-20612.

30. Beauregard K.E., Collier R.J., Swanson J.A. Proteolytic activation of receptor-bound anthrax protective antigen on macrophages promotes its internalization // Cell Microbiol. 2000, v. 2, p. 251-258.

31. Lacy D.B., Mourez M., Fouassier A., Collier R.J. Mapping the anthrax protective antigen binding site on the lethal and edema factors И J Biol Chem. 2002, v. 277, p. 3006-3010.

32. Arora N., Leppla S.H. Residues 1-254 of anthrax toxin lethal factor are sufficient to cause cellular uptake of fused polypeptides // J Biol Chem. 1993, v. 268, p. 3334-3341.

33. Wesche J., Elliott J.L., Falnes P.O., Olsnes S., Collier R.J. Characterization of membrane translocation by anthrax protective antigen 11 Biochemistry. 1998, v. 37, p. 15737-15746.

34. Mogridge J., Cunningham K., Collier R.J. Stoichiometry of anthrax toxin complexes // Biochemistry. 2002, v. 41, p. 1079-1082.

35. Lacy D.B., Lin H.C., Melnyk R.A., Schueler-Furman O., Reither L., Cunningham K., Baker D., Collier R.J. A model of anthrax toxin lethal factor bound to protective antigen // Proc Natl Acad Sci USA.2005, v. 102, p. 16409-16414.

36. Melnyk R.A., Hewitt K.M., Lacy D.B., Lin H.C., Gessner C.R., Li S., Woods V.L., Collier R.J. Structural determinants for the binding of anthrax lethal factor to oligomeric protective antigen IIJ Biol Chem.2006, v. 281, p. 1630-1635.

37. Abrami L., Liu S., Cosson P., Leppla S.H., van der Goot F.G. Anthrax toxin triggers endocytosis of its receptor via a lipid raft-mediated clathrin-dependent process IIJ Cell Biol. 2003, v. 160, p. 321-328.

38. Liu S., Leppla S.H. Cell surface tumor endothelium marker 8 cytoplasmic tail-independent anthrax toxin binding, proteolytic processing, oligomer formation, and internalization IIJ Biol Chem. 2003, v. 278, p. 5227-5234.

39. Blaustein R.O., Koehler T.M., Collier R.J., Finkelstein A. Anthrax toxin: channel-forming activity of protective antigen in planar phospholipid bilayers // Proc Natl Acad Sci USA. 1989, v. 86, p. 2209-2213.

40. Miller С.J., Elliott J.L., Collier RJ. Anthrax protective antigen: prepore-to-pore conversion И Biochemistry. 1999, v. 38, p. 1043210441.

41. Benson E.L., Huynh P.D., Finkelstein A., Collier R.J. Identification of residues lining the anthrax protective antigen channel // Biochemistry. 1998, v. 37, p. 3941-3948.

42. Krantz B.A., Trivedi A.D., Cunningham K., Christensen K.A., Collier R.J. Acid-induced unfolding of the amino-terminal domains of the lethal and edema factors of anthrax toxin // JMol Biol. 2004, v. 344, p. 739-756.

43. Zhang S., Udho E., Wu Z., Collier R.J., Finkelstein A. Protein translocation through anthrax toxin channels formed in planar lipid bilayers // Biophys J. 2004, v. 87, p. 3842-3849.

44. Krantz B.A., Finkelstein A., Collier R.J. Protein Translocation through the Anthrax Toxin Transmembrane Pore is Driven by a Proton Gradient IIJ Mol Biol. 2006, v. 355, p. 968-979.

45. Leppla S.H. Anthrax toxin edema factor: a bacterial adenylate cyclase that increases cyclic AMP concentrations of eukaryotic cells // Proc Natl Acad Sci USA. 1982, v. 79, p. 3162-3166.

46. Klimpel K.R., Arora N., Leppla S.H. Anthrax toxin lethal factor contains a zinc metalloprotease consensus sequence which is required for lethal toxin activity // Mol Microbiol. 1994, v. 13, p. 1093-1100.

47. Kochi S.K., Schiavo G., Mock M., Montecucco C. Zinc content of the Bacillus anthracis lethal factor // FEMS Microbiol Lett. 1994, v. 124, p. 343-348.

48. Pellizzari R., Guidi-Rontani C., Vitale G., Mock M., Montecucco C. Anthrax lethal factor cleaves MKK3 in macrophages and inhibits the LPS/lFNgamma-induced release of NO and TNFalpha // FEBS Lett. 1999, v. 462, p. 199-204.

49. Chopra A.P., Boone S.A., Liang X., Duesbery N.S. Anthrax lethal factor proteolysis and inactivation of МАРК kinase /IJ Biol Chem. 2003, v. 278, p. 9402-9406.

50. Zucker S., Pei D., Cao J., Lopez-Otin C. Membrane type-matrix metalloproteinases (MT-MMP) // Curr Top Dev Biol. 2003, v. 54, p. 1-74.

51. Itoh Y., Seiki M. MT1-MMP: a potent modifier of pericellular microenvironment IIJ Cell Physiol. 2006, v. 206, p. 1-8.

52. Hotary K.B., Allen E.D., Brooks P.C., Datta N.S., Long M.W., Weiss S.J. Membrane type I matrix metalloproteinase usurps tumor growth control imposed by the three-dimensional extracellular matrix // Cell. 2003, v. 114, p. 33-45.

53. Seiki M. Membrane-type 1 matrix metalloproteinase: a key enzyme for tumor invasion // Cancer Lett. 2003, v. 194, p. 1-11.

54. Shiomi Т., Okada Y. MT1-MMP and MMP-7 in invasion and metastasis of human cancers // Cancer Metastasis Rev. 2003, v. 22, p. 145-152.

55. Zucker S., Vacirca J. Role of matrix metalloproteinases (MMPs) in colorectal cancer // Cancer Metastasis Rev. 2004, v. 23, p. 101-117.

56. Soulie P., Carrozzino F., Pepper M.S., Strongin A.Y., Poupon M.F., Montesano R. Membrane-type-1 matrix metalloproteinase confers tumorigenicity on nonmalignant epithelial cells // Oncogene. 2005, v. 24, p. 1689-1697.

57. Holmbeck K., Bianco P., Yamada S., Birkedal-Hansen H. MT1-MMP: a tethered collagenase // J Cell Physiol. 2004, v. 200, p. 11-19.

58. Hornebeck W., Emonard H., Monboisse J.C., Bellon G. Matrix-directed regulation of pericellular proteolysis and tumor progression // Semin Cancer Biol. 2002, v. 12, p. 231-241.

59. Kajita M., Itoh Y., Chiba Т., Mori H., Okada A., Kinoh H., Seiki M. Membrane-type 1 matrix metalloproteinase cleaves CD44 and promotes cell migration IIJ Cell Biol. 2001, v. 153, p. 893-904.

60. Deryugina E.I., Ratnikov B.I., Strongin A.Y. Prinomastat, a hydroxamate inhibitor of matrix metalloproteinases, has a complex effect on migration of breast carcinoma cells // Int J Cancer. 2003, v. 104, p. 533-541.

61. Hernandez-Barrantes S., Bernardo M., Toth M., Fridman R. Regulation of membrane type-matrix metalloproteinases // Semin Cancer Biol 2002, v. 12, p. 131-138.

62. Itoh Y., Seiki M. MT1-MMP: an enzyme with multidimensional regulation // Trends Biochem Sci. 2004, v. 29, p. 285-289.

63. Osenkowski P., Toth M., Fridman R. Processing, shedding, and endocytosis of membrane type 1-matrix metalloproteinase (MT1-MMP) // J Cell Physiol 2004, v. 200, p. 2-10.

64. Wang X., Ma D., Keski-Oja J., Pei D. Co-recycling of MT1-MMP and MT3-MMP through the trans-Golgi network. Identification of DKV582 as a recycling signal /IJ Biol Chem. 2004, v. 279, p. 93319336.

65. Uekita Т., Itoh Y., Yana I., Ohno H., Seiki M. Cytoplasmic tail-dependent internalization of membrane-type 1 matrix metalloproteinase is important for its invasion-promoting activity // J Cell Biol. 2001, v. 155, p. 1345-1356.

66. Jiang A., Lehti K., Wang X., Weiss S.J., Keski-Oja J., Pei D. Regulation of membrane-type matrix metalloproteinase 1 activity by dynamin-mediated endocytosis // Proc Natl Acad Sci USA. 2001, v. 98, p. 13693-13698.

67. Doxsey S., McCollum D., Theurkauf W. Centrosomes in Cellular Regulation И Annu Rev Cell Dev Biol. 2005, v 21., p. 411-434.

68. Doxsey S., Zimmerman W., Mikule K. Centrosome control of the cell cycle // Trends Cell Biol. 2005, v. 15, p. 303-311.

69. Nigg E.A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? II Nat Rev Cancer. 2002, v. 2, p. 815-825.

70. Fukasawa К. Centrosome amplification, chromosome instability and cancer development // Cancer Lett. 2005, v. 230, p. 6-19.

71. Pihan G.A., Purohit A., Wallace J., Malhotra R., Liotta L., Doxsey S.J. Centrosome defects can account for cellular and genetic changes that characterize prostate cancer progression // Cancer Res. 2001, v. 61, p. 2212-2219.

72. Pihan G., Doxsey S.J. Mutations and aneuploidy: co-conspirators in cancer? // Cancer Cell. 2003, v. 4, p. 89-94.

73. Giet R., Petretti C., Prigent C. Aurora kinases, aneuploidy and cancer, a coincidence or a real link? // Trends Cell Biol. 2005, v. 15, p. 241250.

74. Duensing S. A tentative classification of centrosome abnormalities in cancer // Cell Biol Int. 2005, v. 29, p. 352-359.

75. Duensing A., Duensing S. Guilt by association? p53 and the development of aneuploidy in cancer // Biochem Biophys Res Commun. 2005, v. 331, p. 694-700.

76. Park S., Leppla S.H. Optimized production and purification of Bacillus anthracis lethal factor // Protein Expr Purif. 2000, v. 18, p. 293-302.

77. Doxsey S.J., Stein P., Evans L., Calarco P.D., Kirschner M. Pericentrin, a highly conserved centrosome protein involved in microtubule organization // Cell. 1994, v. 76, p. 639-650.

78. Deryugina E.I., Soroceanu L., Strongin A.Y. Up-regulation of vascular endothelial growth factor by membrane-type 1 matrix metalloproteinase stimulates human glioma xenograft growth and angiogenesis// Cancer Res. 2002, v. 62, p. 580-588.

79. Rozanov D.V., Golubkov V.S., Strongin A.Y. Membrane type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) protects malignant cells from tumoricidal activity of re-engineered anthrax lethal toxin // Int J Biochem Cell Biol. 2005, v. 37, p. 142-154.

80. Ramirez D.M., Leppla S.H., Schneerson R., Shiloach J. Production, recovery and immunogenicity of the protective antigen from a recombinant strain of Bacillus anthracis // JInd Microbiol Biotechnol. 2002, v. 28, p. 232-238.

81. Ratnikov В., Deryugina E., Leng J., Marchenko G., Dembrow D., Strongin A. Determination of matrix metalloproteinase activity using biotinylated gelatin II Anal Biochem. 2000, v. 286, p. 149-155.

82. Fugere M., Limperis P.C., Beaulieu-Audy V., Gagnon F., Lavigne P., Klarskov K., Leduc R., Day R. Inhibitory potency and specificity ofsubtilase-like pro-protein convertase (SPC) prodomains // J Biol Chem. 2002, v. 277, p. 7648-7656.

83. Pannifer A.D., Wong T.Y., Schwarzenbacher R., Renatus M., Petosa C., Bienkowska J., Lacy D.B., Collier R.J., Park S., Leppla S.H., Hanna P., Liddington R.C. Crystal structure of the anthrax lethal factor I I Nature. 2001, v. 414, p. 229-233.

84. Petosa C., Collier R.J., Klimpel K.R., Leppla S.H., Liddington R.C. Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen // Nature. 1997, v. 385, p. 833-838.

85. Bieth J.G. Theoretical and practical aspects of proteinase inhibition kinetics II Methods Enzymol. 1995, v. 248, p. 59-84.

86. Deryugina E.I., Bourdon M.A., Reisfeld R.A., Strongin A. Remodeling of collagen matrix by human tumor cells requiresactivation and cell surface association of matrix metalloproteinase-2 // Cancer Res. 1998, v. 58, p. 3743-3750.

87. Stawowy P., Fleck E. Proprotein convertases furin and PC5: targeting atherosclerosis and restenosis at multiple levels // J Mol Med. 2005, v. 83, p. 865-875.

88. Mousa S.A., Shakibaei M., Sitte N., Schafer M., Stein C. Subcellular pathways of beta-endorphin synthesis, processing, and release from immunocytes in inflammatory pain // Endocrinology. 2004, v. 145, p. 1331-1341.

89. Klimpel K.R., Molloy S.S., Thomas G., Leppla S.H. Anthrax toxin protective antigen is activated by a cell surface protease with the sequence specificity and catalytic properties of furin // Proc Natl Acad Sci USA. 1992, v. 89, p. 10277-10281.

90. Komiyama Т., Swanson J.A., Fuller R.S. Protection from anthrax toxin-mediated killing of macrophages by the combined effects of furin inhibitors and chloroquine // Antimicrob Agents Chemother. 2005, v. 49, p. 3875-3882.

91. Liu S., Schubert R.L., Bugge Т.Н., Leppla S.H. Anthrax toxin: structures, functions and tumour targeting // Expert Opin Biol Ther. 2003, v. 3, p. 843-853.

92. Banks D.J., Barnajian M., Maldonado-Arocho F.J., Sanchez A.M., Bradley K.A. Anthrax toxin receptor 2 mediates Bacillus anthracis killing of macrophages following spore challenge // Cell Microbiol. 2005, v. 7, p. 1173-1185.

93. Popov S.G., Villasmil R., Bernardi J., Grene E., Cardwell J., Popova Т., Wu A., Alibek D., Bailey C., Alibek K. Effect of Bacillus anthracis lethal toxin on human peripheral blood mononuclear cells // FEBSLett. 2002, v. 527, p. 211-215.

94. YusofR., Clum S„ Wetzel M., Murthy H.M., Padmanabhan R. Purified NS2B/NS3 serine protease of dengue virus type 2 exhibits cofactor NS2B dependence for cleavage of substrates with dibasic amino acids in vitro И J Biol Chem. 2000, v. 275, p. 9963-9969.

95. Henrich S., Cameron A., Bourenkov G.P., Kiefersauer R., Huber R., Lindberg I., Bode W., Than M.E. The crystal structure of the proprotein processing proteinase furin explains its stringent specificity // Nat Struct Biol. 2003, v. 10, p. 520-526.

96. Yamshchikov V.F., Trent D.W., Compans R.W. Upregulation of signalase processing and induction of prM-E secretion by theflavivirus NS2B-NS3 protease: roles of protease components // J Virol 1997, v. 71, p. 4364-4371.

97. Elshuber S., Allison S.L., Heinz F.X., Mandl C.W. Cleavage of protein prM is necessary for infection of BHK-21 cells by tick-borne encephalitis virus // J Gen Virol 2003, v. 84, p. 183-191.

98. Yamshchikov V.F., Compans R.W. Processing of the intracellular form of the west Nile virus capsid protein by the viral NS2B-NS3 protease: an in vitro study // J Virol 1994, v. 68, p. 5765-5771.

99. Boyd S.E., Pike R.N., Rudy G.B., Whisstock J.C., Garcia de la Banda M. PoPS: a computational tool for modeling and predicting protease specificity // JBioinform Comput Biol 2005, v. 3, p. 551-585.

100. Chernoff G.F. Shiverer: an autosomal recessive mutant mouse with myelin deficiency // JHered. 1981, v. 72, p. 128.

101. Lutton J.D., Winston R., Rodman T.C. Multiple sclerosis: etiological mechanisms and future directions // Exp Biol Med (Maywood). 2004, v. 229, p. 12-20.

102. Pedraza L. Nuclear transport of myelin basic protein // JNeurosci Res. 1997, v. 50, p. 258-264.

103. Seiwa C., Kojima-Aikawa K., Matsumoto I., Asou H. CNS myelinogenesis in vitro: myelin basic protein deficient shiverer oligodendrocytes // J Neurosci Res. 2002, v. 69, p. 305-317.

104. Kacprzak M.M., Peinado J.R., Than M.E., Appel J., Henrich S., Lipkind G., Houghten R.A., Bode W., Lindberg I. Inhibition of furin by polyarginine-containing peptides: nanomolar inhibition by nona-D-arginine H J Biol Chem. 2004, v. 279, p. 36788-36794.

105. Cameron A., Appel J., Houghten R.A., Lindberg I. Polyarginines are potent furin inhibitors И J Biol Chem. 2000, v. 275, p. 36741-36749.

106. Jean F., Stella K., Thomas L., Liu G., Xiang Y., Reason A.J., Thomas G. alpha 1-Antitrypsin Portland, a bioengineered serpin highly selective for furin: application as an antipathogenic agent // Proc Natl AcadSci USA. 1998, v. 95, p. 7293-7298.

107. Moayeri M., Leppla S.H. The roles of anthrax toxin in pathogenesis // Curr Opin Microbiol. 2004, v. 7, p. 19-24.

108. Bardwell A.J., Abdollahi M., Bardwell L. Anthrax lethal factor-cleavage products of МАРК (mitogen-activated protein kinase) kinases exhibit reduced binding to their cognate MAPKs // Biochem J. 2004, v. 378, p. 569-577.

109. Park J.M., Greten F.R., Li Z.W., Karin M. Macrophage apoptosis by anthrax lethal factor through p38 MAP kinase inhibition // Science.2002, v. 297, p. 2048-2051.

110. Gordon V.M., Rehemtulla A., Leppla S.H. A role for PACE4 in the proteolytic activation of anthrax toxin protective antigen // Infect Immun. 1997, v. 65, p. 3370-3375.

111. Collier R.J., Young J.A. Anthrax toxin // Annu Rev Cell Dev Biol.2003, v. 19, p. 45-70.

112. Chambers T.J., Nestorowicz A., Amberg S.M., Rice C.M. Mutagenesis of the yellow fever virus NS2B protein: effects on proteolytic processing, NS2B-NS3 complex formation, and viral replication // J Virol. 1993, v. 67, p. 6797-6807.

113. Falgout В., Miller R.H., Lai C.J. Deletion analysis of dengue virus type 4 nonstructural protein NS2B: identification of a domain required for NS2B-NS3 protease activity IIJ Virol. 1993, v. 67, p. 2034-2042.

114. Jan L.R., Yang C.S., Trent D.W., Falgout В., Lai C.J. Processing of Japanese encephalitis virus non-structural proteins: NS2B-NS3 complex and heterologous proteases // J Gen Virol. 1995, v. 76, p. 573-580.

115. Lobigs M. Flavivirus premembrane protein cleavage and spike heterodimer secretion require the function of the viral proteinase NS3 // Proc Natl Acad Sci USA. 1993, v. 90, p. 6218-6222.

116. Droll D.A., Krishna Murthy H.M., Chambers T.J. Yellow fever virus NS2B-NS3 protease: charged-to-alanine mutagenesis and deletionanalysis define regions important for protease complex formation and function// Virology. 2000, v. 275, p. 335-347.

117. Falgout В., Pethel M., Zhang Y.M., Lai C.J. Both nonstructural proteins NS2B and NS3 are required for the proteolytic processing of dengue virus nonstructural proteins // J Virol. 1991, v. 65, p. 24672475.

118. Preugschat F., Yao C.W., Strauss J.H. In vitro processing of dengue virus type 2 nonstructural proteins NS2A, NS2B, and NS3 // J Virol. 1990, v. 64, p. 4364-4374.

119. Bauvois B. Transmembrane proteases in cell growth and invasion: new contributors to angiogenesis? // Oncogene. 2004, v. 23, p. 317329.

120. Holmbeck K., Bianco P., Chrysovergis K., Yamada S., Birkedal-Hansen H. MTl-MMP-dependent, apoptotic remodeling of unmineralized cartilage: a critical process in skeletal growth // J Cell Biol 2003, v. 163, p. 661-671.

121. Le Roy C., Wrana J.L. Clathrin- and non-clathrin-mediated endocytic regulation of cell signalling // Nat Rev Mol Cell Biol 2005, v. 6, p. 112-126.

122. Nabi I.R., Le P.U. Caveolae/raft-dependent endocytosis // J Cell Biol. 2003, v. 161, p. 673-677.

123. Remacle A., Murphy G., Roghi C. Membrane type I-matrix metalloproteinase (MT1-MMP) is internalised by two different pathways and is recycled to the cell surface П J Cell Sci. 2003, v. 116, p. 3905-3916.

124. Remacle A.G., Rozanov D.V., Baciu P.C., Chekanov A.V., Golubkov V.S., Strongin A.Y. The transmembrane domain is essential for the microtubular trafficking of membrane type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) // J Cell Sci. 2005, v. 118, p. 49754984.

125. Zimmerman W.C., Sillibourne J., Rosa J., Doxsey S.J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry // Mol Biol Cell. 2004, v. 15, p. 3642-3657.