Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование радикалобразующего соединения из Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование радикалобразующего соединения из Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872"

РГ6 од

| п АПР

РОССИЙСКАЯ АКАЛЕННЯ НАТК

ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА РАН_

..........1 г.

На правах рукописи

ШГНАЕВ КОНСТАНТИН БОРИСОВИЧ

УДК 577.352.38

ИССЛЕДОВАНИЕ РАДИКАЛОБРАЗТПЦЕГО СОЕДИНЕНИЯ ИЗ ВгеигЪааеПил сатота^етеБ АТСС £372

ОЗ.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ, диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена вовреиенном творческой ныэ радикалы бактерий" Института биохимии ин. Академии Наук.

коллективе "свобод-А.Н. Ба^а Российской

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Островский Д.Н.

Официальные сгаганэкты:

доктор биологических наук, Г.И. Эль-Реги-стан,

доктор биологических наук, И. Я. Лавкова.

Ведущая организация: Институт Химической Физики РАН

Защита диссертации состоится "//.." . 1993 . г. а

10 часов на заседании Специализированного Совета (К 002.96.01) по присуждении ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохинии ии. А.Н. Баха РАН (117071. Москва, Ленинский проспект, 33. корп. 2).

С диссертацией нохно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Мэсма, Ленинский проспект, 33, корп. 1). _

" Автореферат разослан -Я.-...1993 г.

Ученый секретарь Специализированного * Совета, доктор биологических наук

Молчанов

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Долгоживувие нитроксильные (имкноксильные) радикалы и соответствующие им гидроксиламины обладают чрезвычайно широким спектров биологической активности. В качестве спиновых не-ток и зондов широко используется в исследовании живых систен. Природа биологического действия данных веществ в значительной степени определяется их способностью взаимодействовать с эндогенныни коро-ткохивущими радикалани. Подобны» свойства делают нитроксилы перс-иектквнши кандидатам в фармакологические агенты.

Однако открытие у некоторых микроорганизмов актиноюшетной линии природных соединений способных легко окисляться с образованней долгожквутах нитроксилькых радикалов было неожиданным, хотя содержание N-0 фрагмент соединения (нитроны, оксимы, гидроксаматы) обнаруживались среди микробных метаболитов и ранее [НеИгшйз, 1981; Аристархова, 1989; КИ^ышга еЬ а1., 1989].

Физиологическая функция, метаболизм и особенно значение гид-роксилакикной (в окисленном состоянии нитроксильной) группы природных диалкилгидроксиламинов остаются неясными. По аналогии с близкими по химическому строению веществами эти соединения могут бить - кессенджерами (N0), ингибиторами радикальныхных процессов, регуляторами транспорта ионов металлов (десферрриоксамин В).

Изучение физико-химических и биологических свойств радикал-образующих соединений может имееть больше значение для поникания роги свободно-радикальных состояний биологических молекул в метаболизме, а также механизмов устойчивости бактерий к неблагоприятным условиям (замораживанию, высушиванию, окислительному стрессу).

Цель и задачи. Основная цель настоящей работы состояла в характеристике и изучении свойств радикалобразуюоего соединения из Вт. втлюл£а£епев АТСС 6872.

В связи с этим были поставлены следуювие задачи: 1. Проведение скрининга различных организмов на наличие ради-калобразующих соединений (РОС).

- г -

2. Характеристика выделенного из amxmiagen.es РОС. Опре-

с

деление его химического строения.

3. Изучение динамики накопления аннонигенина в зависимости от состава среды и при различных физиологических условиях роста бактериальной культуры.

4. Изучение взаимодействия аннонигенина с активными фориа.чи кислорода, а также возможности образования радикальной формы вещества в бактериальных клетках в условиях индуцированного окислительного стресса.

Научная новизна. Установлено, что соединение из Вт. алтапСа-¿епег способное при однозлектронном окислении превращаться в дол-гоживущий нитроксильный радикал является дизлкилгидроксилзминон, производным глутааинсвой и у-амино-/3-оксинас чяной кислоты. Изучены некоторые физкко-хикические свойства и предложена структура этого ргдикалобразумвего соединения (амнонигенина).

Пролгчонстрировгно взаимодействие амионигенина с активными форнани кислорода. Дана первичная характеристика некоторым продуктам окисления акнонтгенина.

. Обнаружено, что для синтеза аннонигенина в клетках бревибак-терий оптимальными являвтся высокая концентрация кислорода в среде культивирования и значения рН равные 8-9.

Подобраны условия прнхизненой внутриклеточной индукции и выявления нетодом ЭПР-спектроскопии радикальных форн аннонигенина.

Показано, что пунтирование норнальиого потока электронов с помощью редокс-медиаторов приводит, в условиях культуры к уменьшения содержание аннонигенина.

С использованием окрашенных комплексов железа и низкотемпературной ЗПР-рпектроскопии показано, что аннонигенин в нодельных си-

з«- г*

стенах ножат образовывать комплексы ионами Ке и С« .

Установлено, что в определенных условиях (инкубация с ионами железа и ортофосфата) большая часть исследуемого вещества связана с клеточными компонентами. Эти условия были промоделированы в системе содержащей иокы гелэза и хелаторы.

Практическая ценность работы. Полученные в настопзей работе результаты свидетельствуют, что аммонигенин мохет участвовать в антирадикальной защите как по механизму акцептирования активных форм кислорода так и благодаря хелатируювдм свойства*. Образование в бактериальной суспензии под действием хлорамина Б радикальной формы исследуемых соединений может быть моделью для исследования механизма фагоцитоза и радикального поражения микроорганизмов.

Апробация. Основные результаты работы были представлены на Школе "Биологические нембраны -89" (1989 г. ).ка конкурсе фундаментальных работ Института биохимии ин. А.Н. Баха'АН СССР 1990, на конкурсе молодых ученых Института биохимии им. А.Н. Баха АН СССР 1991, на международном конгрессе "Symposium on advantages in regulation of carbohydate metabolism" (Ieruaalem, 1991), на 17th TUPAC International symposium on the chemistry of natural products (New Delhi, 1Э90).

Структура к объём работы. Диссертационная работа состоит из введения обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и o6cysy;ai;:'T, Заключения, эыводов и списка цитируеьой литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирозана 31 рчсунком и 6 таблицами. Список цитируемой литератур.. и тчает { 7у' работы.

йуб-г'-ге мил. По теме диссертации опубликовано S раб^т.

Г'МТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ В качестве обь^та в работе исяользогатас.ч блггерий Brevibac-a.;r.o.iiasenes .'TCO S872 r< "371. Ky.^v.^Kpop-hKfe :~.ует?зяг.т в коле-ax JpjieHheüepa объемом 7SO -.л на качтс з сргдсх различного летая-: 30°С. Е."п,»'ясоу егбираля 1-2яТрй§уп?ро---^ш€:. Режим аэрации Mtiin-'t культири).jBcFHcri б pi3Jii.4r.:,K ооьс.чг.;:

При гэлучьнии чистого гкмонигеггннг л ля удапзнгш а''-;эногеннь,х катаз!;сзгр:ы£.к примесей испсж-зовались соответственно даузке 1x4 и фосфоцемлоз^. Окончательную очистку лрзсод::ли с использованием

высокоэффективной жидкостной хроматографии на обрашеной фазе.

Регистрацию сигналов ЭПР при комнатной тенпературе проводили в кварцевых ампулах 0,05 нл на радиоспектрометре РЭ-1306. При ^ низкотемпературных измерениях предварительно замороженный образец объёмом 0,2 мл помещалив кварцевый дьюар и охлаждали жидким азотом. В качестве внепнего стандарта интенсивности и развертки поля использовали образец Мпг*/М£0 (расстояние нежду линиями стандарта на спектрах 86,76) В ряде случаев в - концентрация ампонигенина выражали в относительных единицах, являвшихся отношением интенси-вностей первой линии спектра радикала ампонигенина и первой линии

внешнего стандарта с пересчетом на 1 г сырой биомассы. Аммонигеиин

—в

переводили в радикальную форму добавляя в образец к Fe(CN) - (10 -

3 о

- 5 X 10~ М). Пря измерении содержания амиояигенина в - бактериальных клетках к последним добавляли 50% метанол.

Спектры ЯНР на протонах и ядрах 19С записывались на спектрометрах Bruker WH-2S0 и АМ-300. Спектры ЯМР расшифрованы с помощью методики гоиоядерного двойного резонанса. Двумерные протонные спектры COST и HOEST сминали с использованием стандартных программ соответственно BRUKER COSYLR И BRUKER NOESTHO ДЛЯ ЭВМ Aspekt-2000.

Инфракрасные спектры снимались на приборе Specord sp-75 СГДРЭ после нанесения тонкой пленки раствора на пластинку из германия и подсушивании его на воздухе.

Соотношение элементов Н, с и N определяли на приборе Carlo Brba ЕЛ-1106. Пасс-спектры при бомбандировке электронами- получены в аппарате Varl&n МАТ-4А, а атомами Ar на спектрометре НН-1201-Э в глицериновой матрице.

Для генерации супероксидного радикала использовалась ксантин-оксидазная система описанная в работе (Morehouse et al.. 1987].

Для инициации реакции Фентона раствор Feso^ добавляли в снесь содержавшую амнонигенин (10_<М) и перикись водорода в концентрации

-4 —4

0,1-0,25/С . Конечная концентрация FeSO^ составляла 10 -5 X 10 М.

. Исследовалось действие следующих редокс-меднатороэ: бензил-виологен ("Реахин", СССР), менадионсулъфат, феназинметасульфат (Sigma США) добавляли к культурен бактерий в виде водного раствора, а плюмбагин (Aldrich, США) растворяли в декитилсульфокснде.

Для внутриклеточного окисления аннонигенина суспензию бреви-бактерий инкубировали с ФМС 30 мин после чего отмывали от невклю-чившегося редокс-медиатора и добавляли- к Fe(CK)'.

3 О

Для исследования связывания исследуемого вещества с клетками бревибактерий использовали меченный С14-аннонигенвн.

Среды для инкубации: И1 - 25 мМ "трис-Нс1 буфера рН 7,4 , 2нМ MgSO 0; то же и 25кМ ы&.К-фосфатный буфер (среда ИФ1 ); глюкоза

4 2

Z'/., 25мМ Na,к-фосфатный буфер (среда ИФ2); то те и FeSO^ (FeCl^) в концентрации 4 X Ю-6 - Ю-4 М (среда ИФЗ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Обнаружение , радикалобразующих соединений в различных организнах.

соединена.; легко окисляющиеся с образованней долгожигуотх нитроксильных радикалов из И. luteus (лкзодектоза) и из В. amrtoni-agenes АТСС 6872 (амнонигенин) были впервые обнаружены В.И. Б:;ню-ковын [Бинг.ков и др.. 1981). Баренбойм с соавтора««, также показал возникновение характерного длг. к'гтроксильчого раткаха сигнал ЗП? в сункярнон экстракте термофильных водорослей и кикроорганизнов, собргакмх в гид;;:теризлькьк источнг:г.ах Канчатки (Баренбойм и др. , 1P87J. Однако в исследовакых нами образцах смешанных популяций эо-дорослей и бактерий собранных из гидротеркальных источников и других водоенов Камчатки не обнаружено РОС даюшх сигналы характерные для нитроксильных радикалов. В то же время в некоторых из этих препаратов регистрируются синглетные сигналы с g фактором близким к 2,0. Так как эти сигналы не быш: специфичны для термофилов можно

предположить.,.что они принадлежат-семихинонам возникающим в ходе деградации различных бномолекул. Действительно широкие синглетные сигналы обнаружены при фернентации растительных образцов (УозЫока еь в.1., 1990] и уряда никрооргакиэмов [Бинвков, 1986]. Результаты Баренбойма, вероятно, обусловлены ферментативным и нефернентатив-нын окислением азотсодержащих веществ исследовавшихся препаратов.

Для выявления корреляции между систематическим положением и спосбностью синтезировать РОС был проведен скрининг большой группы видов, принадлежавих к различным таксонам в том числе и к микроорганизмам актиноницетной линии и грибам. ЭПР сигналы долгоживущих радикалов били обнаружены придобавлении феррицианидав экстрактах ряда нокардиоподобных микроорганизмов (актиномицетная линия).

Спектр радикала обнаругенного у коринебактерий практически идентичен спектру аммонигенина, что хорошо коррелирует с близким систематический положением Корине- и бревибактерий. Спектры радикалов из 51гер1о*усея говбо/1ахтз 112В. а также у НусоЪас1ег1\ип. этиевтгхиз и МусоЬас 1ег£иш /1е1 представляют собой секстет с соотношением компонентов 1: 4: 7: 7:4: 1 как и у радикала из Н. 1и£едо т. е., лизодектозы. Мультиплетные спектры зарегистрированы также в экстрактах из 51гехогкусез соде^ив и АсЧпотайига А-65, ко интенсивность сигнала была недостаточна для их характеристики. В экстракте культуры Шсготопазрога вр. 17723 выращенной на среде с добавками витамина и (жирные кислоты) независино от введения фер-ришынида калия наблюдался устойчивый синглетный сигнал.

Вцелон полученные данные согласуются с результатами скрининга на содержние РОС проведенный В.И. Бинюковым [Бинюков, 1986]. Сигналы радикальных соединений обнаружены в эхстрактах только нокардиоподобных бактерий - коринебактерий, актиноницетов, нихо-бактерий. .Подтверждено.также существование таксононически более широкой группы организмов у которых обнаружен сигнал хинонов.

2. Оизико-хнническая характеристика амконкгекина.

Для уточнения природа ядер зходящих в парамагнитный центр аммонигенина, были подобраны синтетические среды для роста бревн-бактерий , в которых либо источник азотистого питания был заменен на аналог, содержащий тяжелый изотоп N45 (сульфат аммония или глутамат) , либо источник углерода был заменен на дейтерированые продукты кислотного гидролиза клеток хлореллы выращенной на D^O. Возникающие в результате замещения изотопов характерные изменения спектра ЭПР связанные с отличием спиновых чисел для N1* (S=J ) и протия (Е=1/2) и таковых для N1S (S=l/2) и дейтрия (S=l! являются безусловным доказательством участия этих ядер в формировании парамагнитного центра исследуемого вещества (рис. 1а,б). На рисунке li приведен спектр изолированного соединения b'D20, показывающий отсутствие легкообкениваеющихся протонов в радикальном центре. О участии скелетных протонов в формировании последнего свидетельствует изменения ЭПР спектра аммонигенина полученного из клеток, выращенных на лейтерирозанной среде. Схема сверхтонкого взаимодействия (рис. 1г) удовлетворительно описывает наблюдаемые спектры при следующих константах сверхтонкой структуры: а(ы14)=1,9Гс, a(CH2)-=12,4 Гс, а(СН)=4,5 Гс, ДИ=58,7 Г с; а.(л")=20,8 Гс, л(СН)=12,4 Гс, а(СН)= 4,5 Гс. 6N =50,1 Гс.

^-ЯМР спектр в d^O содержит сигналы 14 необненивающихся протонов, олин кз которых находится в области резонанса протонов при углероде , связанной с кислородом (химический сдвиг 4,27 м. д.) , пять сгруппированы в области 3,0-3,4 м.д. и восень - в области 1.9-2.5 м.д. Спин-спиновая связь протонов была установлена при помощи двумерной спектроскопии Cosy, а пространственная сблигеность-- с использовании спектров noesy. Анализ спектра cosy показывает, что протоны образуют три не взаимодействующие друг с другой спино-новые системы : a J метиновьй проток Н2 и две пары ::етплепоъих протонов при СЗ и С4 ; б) метиновый протон Но и две пары нгтиленовых протонов при С7 и С8; с) группировка из двух пар нетиленозых протонов при СЮ к СИ (табл. 1).

II

и,

и _ св

.Хл-

, , , А\ А

■ и\ I Ш11 МП I I

и и и

1 III

Рис.1. Спектры Э® охиеленной парамагнитной форш радшсал-образущего соединения из бревиабактерий, выращенных на среде с "¡И4). 14н-(б) и 1411-субстратом (л, вещество в ' Б20), и схема сверхтонкого взаимодействия ддя "и- и "к- фо^аммонигенина (г).

Таблица 3. Параметры 1Н-ЯМР аннонигенкна.

•Протоны <5. К. д. Мудьтиплетность КССВ, Гц

Н2 3,33 дд ' 5,5; 8,5

Н4 2.45; 2,45 т ' 3

.....86...... 4.27 дд 5; 8,5

Н7 2.15; 2,0

Н8 . 2.35; 2,35 т 3

НЮ • 3.26; 3,26 т 5

ни 3.05; 3.05 . ддт 4,5; 12.5; 13.7

Спектр "с-ЯМР состоит из 12 сигналов. Из четц>ех сигналов не-протонированных атонов углерода, очевидно, принадлежат карбснилаи амндных групп (химический сдвиг "179,5 м.д. ) и один - карбоксильной группе (174,5 и.д. ). Два углерода образуют метиновые группы, один и них связан с кислородом (сигнал 72,1 н.д.), другой - с азотом (55,3 м.д.). Остальные углероды входят в состав метиленовых групп. Две из них связаны с атомомаки азота (54,2 и 36,4 н.д.), причем первая, вероятнее всего, с азотон, насущен электроотрицательную гругпу. Инфракрасный спектр подтверждает наличие карбонильной к п?птндасЯ груг.п. Данные элс-нектного анализа (Н= и,97'/., С = 37,51'/., N в 13,84?«) показывают, что ;:а один атоя азота в исследуемом веществе приходится по три лтсмэ углерода. По данный касс--спектрометрии при облучении быстрыми атомами, препарат анмоккге-::г ~олер-.у.т два рзгъсгва (31£ и 33* а).

■ Со- о1-;пнос--. генных получекгых этими методами наиболее соответствует строек::- - лэктон Ь-гидиокси-нС2-:сарбомоилзтклЗглютанкл--4-аиино-2-п:.,?схс1гЗутираяида, т.е., амконлгелин является дамерок глитамяновой кислоты и аяида г-зкгко-а-гидроксияэсляной кислоты. :»~мкнутым в лактонное кольцо и модифицированным по аминогруппе

глутамата группой.атомов формирующих радикальный центр (рис. 2).

«

fj. - . '• и» рч ' .

■А

Б

«а—>

Htc * • V

I■ м.

I

,Рис. 2.-"- Предполагаемая^ химическая■ структура аннонигенина. • " "" . А - конфориационяая модель; обозначения: атон углевода - , С # ), -азота - ( ©"}•> кислорода. - С О ) . В - пространственная формула. ."* 4

3. Окислйиц* и восэтановжмне аимокигешгаа а-коделыик ся стенах. -

• * ■ - ' ' ' -'Г"''" '

' •; Исходя из строения' яокёку ды аммонигевика н литературных дайнл .•V о окисления ед^ичтроим'льных радикалов других, содержав»« к-он* , фрагмент соединений наиболывий интерес представляет взаимодействие исследуемого вещества с активными фориаии. кислорода [Hinojosa, Jacks, 1986; Halliwell, 1985г Morehouse et аХ.,1987].

При генерация супероксидного аннок-радикала в ксантиноксидаз-ной системе в течении первых 20 мин наблюдалось возрастание кон-

центрации радикальной формы вещества и затем более медленное еб снижение (рис. 3). Присутствие СОД практически полностью ингибиро-вало реакцию окисления аммонигенина (рис 36), тогда как каталаза невлияя на концентрацию образующегося нитроксильного радикала, незначительно изменяет кинетику этой реакции (ряс. Зв). Результаты экспериментов с СОД и каталазой доказывают, что в ипользуемой нами системе окислителен аммонигенина является именно супероксид.

2Н-ЫОН + О ■" -► 2Я -НО' + Н О (3.1)

41 1 1 ( 2 2

я и

2 2

Окисление аммонигенина супероксидам происходит а сравнительно мягких условиях и основной причиной гибели его радикальной формы , вероятно, является реакция диспропорционироваиия :

2Я -N0'—+ Я -ИОН + К =№+0 (3.2) 1 I 1 I 1 I

Я ЯНН

2 2 2,

В этой реакции возникает нитрон (~с=\—»0) и регенерируется

I

гидрокснланин.

В системе Фентона, использовавшейся для генерации ОН" радикалов происходит быстрое окисление гидроксиламинной форны амнониге-до непарамагнитиых продуктов. Однако при низких концентрациях ке

и Н 0 (> Ю~э М) и соответственно меньшей интенсивности генерации 2 2

НО'' радикала удается зафиксировать ЭПР сигнал радикала анмонигени-на быстро замещающийся модифицированным спектром (рис. 4а). Этот спектр состоит из двенадцати линий и характеризуется следующими константами СТВ: а(мН)=14,2 Гс; я,(Нг)=6.7 Гс; а(Н)=4,5 Гс. Данной схеме сверхтонкого взаимодействия соответствет структура парамагнитного центра в котором один из метиновых протонов замещен на электроотрицательную вероятнее всего гидроксильную группу. Это подтверждается наиболее существенным изменением константы СТВ для нетиновой

группы (с 12,4 Гс у аммонигенина до 6,7 Гс у модифицированного радикала). В ходе дальнейшего окисления ОН' новый сигнал также исчезает."Образование модифицированного радикального продукта в системе Фентона, по-видимому, связано с поэтапным окислением

- и -

I Рис. Кинетика окисления изолированного акмояигенина суп ер-' оксидом в ксантин/ксантиноксидазкой системе. Реакционная . спесь ) содержала - 0,02 и/ил ксактиноксидазм 2 X Ю^М акнонигеиина (А), 'то хе и каталазу 0,08 иг/ил («) или СОД 0,5 иг/мл (□ ). Реакция 5инициировалась добавление« ксантина <0,2 аН), стрелка указывает на

Рис.4 .ЭПР спектры продуктов окисления аннонигенииа в системе ¿ентона (а), и $еррицианидои 48 ч (6).

аммонигенина, в которой основным промежуточным продуктом является

нитрон с двойной связь» между азотом и С-10, реагирувщий далее с ИО* по механизму присоединения к нитронной группе с образованием радикального аддукта. В ходе дальнейшего окисления приводящего к полнону замещении р-атомов водорода аимонигенина должен возникать радикал в котором нитроксильная. группа связана с-, третичными атомами углерода. Спектр таких нитроксилов представляет собой триплет с соотношением линий 1:1:1. Действительно при подборе условий в системе Фентона удаётся зафиксировать радикальный продукт ЭПР спектр которого содержит три выраженные линии.. После длительного окисления аммонигенина феррицианидом калия (50 нМ, 48 ч) спектр нитроксильной формы также полностью замещается триплетом с соотношением линий I :1 :1 (рис.36). При восстановлении этого препарата боргидридон натрия с последующей очисткой на дауэксе 1x4 и реокис-лением феррицианидом халия возникает ещё один тип модифицированных долгоживущих радикалов. Эти данные подтверждают та, что первичным продутом•окислительной транс$ормации аммонигенина является весьна лабильный нитрон (ы). лето дающий аддукты с различными радикалами.

4. Влияние физиологических условий на содержание аммонигенина

в бактериальных клетках

Изучение влияния на накопление аммонигенина температуры культивирования, осаотичкости и рН среды, г также интенсивности аэрации бактериальной культуры показало, что удельное содержание исследуемого вещества в клетках-продуцектах более всэго зависит от последних двух факторов (рис. 5). Как усиление аэрации культуры так и повыпекие рН до 8-9 вызывает увеличение содержания аммониге-генина коррелирующее .с увеличением выхода биомассы. Накопление исследуемого вещества в динамике роста бактериальной культуры такгв происходит симбатно увеличению клеточкой массы. Однако возрастание содержания аммонигенина, при повышении интенсивности аэрации, происходит скачкообразно, что можно обменить существованием пороговой концентрации кислорода являющейся положительным регулятором его биосинтеза.

Рис.5. Зависимость урожая биомассы (А) и накопления анкониге-нина (+) от условий культивирования" бревибактерий: А - зависимость от рН среды; Б - зависимость от интенсивности аэрации (последняя регулировалась изменением объёма среды) Клетки собраны в поздней логарифмической фазе (17 часов роста).

состав среды также существенно влияет на накопление аммониге-нина. Накопление аммонигенина существенно ингибировалось при культивировании бревибактерий на среде содержащей глюкозу. Причем в логарифмических клетках выращенных на этой среде и перенесённых в буфер (Трис-НС1 буфере рН 8,0. 5мМ ИвБО^) наблюдалось возрастание концентрации аммонигенина через 25-30 часов инкубации. Возобновлена е накопления акМонигенина в клетках, собранных в стационарной фазе роста, происходило лишь при добавлении к инкубационной среде глутаминовой кислоты. .Интересно, что замена глутаминовой кислоты на другие источники азота, (ш^Ж^, НН^БО^, мочевина) вызы-

вала лишь незначительное увеличение концентрации амнонигенина.

5. Исследование состояния аммонигенина при действии на клетки редокс-циклирующих агентов.

Взаимодействие аммонигенина с активныкми формами кислорода в модельных систенпах и зависимость его синтеза от аэрации позволяет предположить возможность участия этого соединения в антиоксидант-ной защите бактериальных клеток. Для проверки этого предположения н индуцировали в бактериях-продуцентах окислительный стресс, заведением в растущую культуру различных редокс-медиаторов таких как -плюнбагин, ненадион сульфат, феиазянметасульфат, (ФПС) и бензилвио-логен. Воздействие ксенобиотиков приводило к уменьшению содержания аннонигенина в бактериальных клетках корелируюшену с снижением выхода биомассы. Однако в условиях лри которых добавление ксенобиотиков несопровождается подавлением роста культуры клеток или после - -его возобновления некадкок сульфат и плюибагин вызывают увеличение концентрации аммонигекшг. Необходимо отметить, что добавление ФМС (20-120 икг/мл) в стационарнуа культуру также вызывало истощение аннонигенина хотя выход биомассы в этом случае почти не менялся.

На возможную протекторную роль исследуемого вещества указыва-

*

ет также то, что рост, нйсинтезирупщего аммонигенин, 6871 штамма "* бревибактерий полностью подавлялся сублетальными для 6872 штамма (30-40 мкг/мл) гонцектрацр*я*плюнбагяна.

Изиенеяие кбнш^АтраЦАи ,нсс.я£дувййго вещества при культивиро-' ванни,з присутствии ксено^йотиков, по-видимому, связано с окислительнойтрансформацией-ац«5»ЛГ%пина. Однако в интактных клетках радикальные форка послгдаего напрямую не регистрируется. Мы предположили, что причина этого явления кроется во зрененной растяжке эксперимента и низко- стабильности продуктов одно- и даухзлектон-ного окисления аммонигенина.

Действительно при переводе опыта из часозого в минутный диапазон и последовательном введении в суспезию бревиабактерий ФМС и непроникающего акцептора электронов феррицианида калия, что позволяет резко увеличить электроноакцепторные свойства среды, сигнал

от радикальной формы аннонигенина бил зарегистрирован. Этот сигнал убывает со временен по кинетике, зависящей от соотношения добавляемых акцепторов электронов и по своим характеристикам неотличается от ЭПР спектра изолированного препарата акмоиигенина (рис. 6). Длительный контакт клеток с высокими концентрациями акцепторов электронов вызывает практически полную трансформацию аннонигенина в непарамагнитные продукты.

Рис. 6. Кинетика внутриклеточного окисления аннонигенина. К суспензии клеток бревиабактерий добавляли 10 (а), 9( б) и 1 иМ ФМС (4) и 25(с,б) и 2,5нМ к [Ре(сы) ]

8 о

(4). Стрелкой указан'момент

- с ' .

добавлениж-феррицианида. За 100Х принято содержание радикальной формы (Е-формы), выявляемое в перяеабялизованных метанолом клатках. • .

Вероятность образования супероксидного радикала в системе с двумя переносчиками представляется нам очень низкой, так как по данньн ЭПР с-пектроскопик семихинонаг $прка ФМС быстпо реагирует с непроникаюцнн окислителей. Одкзхо в случае д-?Йствип ксенобиотика на растуду» культуру бревибаАТЕ.ий нельья :.ск.люч;пь ззаиьолгйствип исследуемого веь:стез с кислородна« радикалами. Дейстзителько, есля кроме ■ ФМС г растути клеткам добавить к? весь период культивирования (17 ч) ферриотанкд кат.хх некоторые симптош: отравления пропадают - снова появляется «чнконигекин и исчезает недавно обна-руженое соединение циклопирофосфчт (последний индуцируется в ответ на окислительньй стресс).

Образование супероксидных радикалов к каскад их превращений в Н^ , НО' , НОС1 и хлорамины в накрофагах лежит в основе уничтожения или чужеродных микрорганизмов. Использовав для приближения к условиям в макрофаге хлорамина Б мы показали, что это соединение окисляет аимопигенин до радикального состояния как в модельной системе так и внутри клетки. Интересно, что аналогичные результаты получены при обработке хлорамимином клеток Н. рЫе£. родственной возбудителям туберкулёза и проказы.

6. Изучение возможности связывания аимонигенина с ионами железа Образование тгнно-синих нерастворимых комплексов берлинской лазури и турнбулевой сини при смешивании соответственно ферроцианида и феррицианида с КеЭ+ и ?е2+ является стандартной аналитической реакцией для определения этих ионоз. Однако при последовательном добавлении к раствору аммон;:генина ионоз железа и затем феррн- или ферроцианида образования окрашенньс. продуктов непроисходит. При эквимолярных г.счцэкграци:::: лоное гклезг и аккснигенина также не разечвсэтся характерная окраска комплексов Ре"+с блеомицинон и

бензилгидроксамовой кислотой. В то же время присутствие аммониге-

„ 2»

нина не влияло на образование комплекса фенгнтролина с Ке .

Исходя из аналогии с близкими к нему по строению природными конплексонами (гидроксановыэ сидеоофоры), анконигенин был исследован в качестве переносчика ионов железа и других яеталов. Инкубация клеток бревибактерий в среде содержавшей ?е** или Си** и меченный С1* анконигенин и приводит к 15-202 уменьшению содержания метки в среде. Ионы Ре и Мп~ зызывают менее чем 102 связывание вещества. Частичное связывание амноиигениа в присутствии ионов металлов подтверждается такте данными ЭПР-спектросколии.

В клетках бревибактерий после длительной (40-50 ч.) инкубации в среде с фосфатом, глюкозой и КеБО^ (РеС1з) феррицианидом калия выявляется в 5-20 раз меньшая концентрация акконнгенина чем при инкубации в других средах. Однако из данных предстааленых. в таблице 2 видно, что концентрация выявляемого окислением аммонигенина

резко (в 40 раз) увеличивается через несколько часов после пермеа-билизации и при добавлении к суспензии клеток вместе с феррициани-нидон ионов Си**(в ряде случаев выявлению аимонигенина ускорялось в присутствии фосфатного буфера). Эти данные коррелируют с данными полученными - при физическом разделении суспензий перцеабилизованных метанолом бревибактерий инкубировавшихся до этого в средах с глюкозой и определенным соотношением ионов железа и ортофосфата. Из рисунка 7 видно, что в экстракт из этих клеток переходит лишь 3-М аимонигенина выявляемого при пермеабилизации.

Таблица 2. Зависимость окисления аммонигенина от типа ин-

кубационной среды и времени после пермеабилизации.

Время пос- Окисли-. Концентрация в-форны аимонигенина

ле пермеабилизации литель , трис--НС1 И1 ИФ1 Иф2 ИФЗ ИФЗ без ГЛЮКОЗЫ

15 нин ■' фцК • фцК,Сиг+ " 1,5". 2,9 1.2 1.2 ' 1.9 1.5 . 0,5 1.1 0.1 0,8 1.8 2.7

15 ч фцК фцК.Сй** - ' 1.1 1.4 2.5 5.2 0,5 2,6 • 0,15 4,0 . 4.9

Рис.7. Относительная доля аммонигенина в экстракте из бревибактерий , прединкубированных в течении 48ч в следующих средах :

1-25 иМ трис-HCi буфера рН 7,4;

2- среда ИФ1; 3 - 25 нМ трис-HCl буфера рН.7,4, 25 мМ фосфатного буфера и 2 X 10"*М FeCla;4- среда ИФЗ (4 X icfM РвС1з); 5 - среда

ИФЗ (2 X 10"*« FcCl^); 6 - среда

И53 (10~*М Feci ). Экстракт отдг-з

ляли от пёрмеабилизсзанных клеток через 20 мик после добавления мета кола. В качестве окислителей использовались i^lFeCCN)^] и CuSCK

"Скрытое" нэвыявлягное одним фцК вещество было также обнаружено в экспериментах с ксенобиотиками (менадионон и бензилвиологе-ном), а также в клетках выращенных на среде для накопления полифосфатов.

В целом наблюдаемые факты указывают в пользу существования в длительно культивируемых клетках бревибактерий "скрытого пула" вещества, вероятно, представляпегс ссбой тройной комплекс биополимер (предположительно полифосфат )-метал-амнонигенин. Низкая интенсивность фиксируемого при окислении феррицианидом сигнала радикальной формы акмояигенина в этой случае определяется либо меньшей доступностью гидроксилаяинной формы, либо изненениен времени спин-спиновой релаксации нитроксила (влияние парамагнитного иона).

Так как наиболее вероятным биополимером способный участвовать в образовании сложных комплексов является полифосфат при моделирования сСнару=2нг.их эффектов in vitro было иследовано окисление эя-нонигенина феррицианидом калия з растворах содержащих ионы железа

2+ 3+

(Fe или Ре ) в сочетании с полифосфатом или ЭДТА. Интенсивность ЗПР сигнала нитроксила при хомнатной тенпературе в этих системах во иного раз меньше чем в отсутстви комплексов. В системе с комплексом Fe34« полифосфата наибольшее снижение интенсивности сигнала нитроксильной формы наблюдается при низких значениях рН и эквимо-лярных концетрациях ионов железа и полифосфата. Причёл в присутствии ионов cuZ+ или фосфатного буфера величина ЗПР сигнала радикала приближается к контрольным (рис.8).

На низкотепературнон спектре раствора PeCl^ видны характерные для сольватированного хлорида железа широкие синглеты в высокоспиновой (g факторах 6,0-4,0) и в низкоспиновой области (g около 2,0) (рис.9 а). Введение в образец изолированного аммонигенина приводит .х появления узкого ассияетричного сигнала в высокоспиновой области (g фактор равен 4,3) (рис. 96). Этот сигнал нерегиструется как при окислении образца феррицианидом калия так и в случае смешивании с раствором железа радикальной формы вещества. Эти данные указывают

4 6

время, мин

Рис; 8. Кинетика окисления аинонигенинав различных реакционных си-стенах: а- 20нМ Трис-НСХ; 6- 20нИ фосфатного буфера, 0,5нМ РеС1а;

то же и 0,7нМ полифосфата (п=20); г - 0,5нИ УеС1 . 0,7кМ полн-фосфата и 0,02иН СиБСг; д- 0,5мМ РеС1з и 0,7кМ полифосфата, Все образцы окислялись 1кМ К Ре[СИ} .

д и

о. б

Рис.9. Кизкетегг- Ь лерстурнл; ЗП^ спектры комплексов Уэ4* с различньик

лкгащдки: 10-4Й КеС1 в з

Н^О (а.);" Ю-4 И РсП1з и ,акнонигенин (б)', 10~* М

РеС1 л 3 X Ю"4 М поли-

■в-

фосфата (Л).

на способность гидроксиламинной формы аммонигенина образовывать

3+

комплекс с ионон Ре .Комплекс полифосфата и Ре дает выраженный, но более широкий сигнал при 8=4,3 (рис.93). Добавление аммонигенина не вызывает существенных качественных изменений ЭПР спектра этого образца. По-видимому, конфигурация тройного комплекса, мало отличается от комплехса полифосфата и трехвалентного железа.

Анализ низкотемпературных спектров содержащих нитроксильнув или гядроксилананную форму аммонигенина и сиБО^ показал наличие двух типов комплексов меди. Дальнейшая характеристика этих координационных соединений затруднена, так как компоненты большинства буферных систем также образует комплексы с ионами меди и нельзя исключить их участие в качестве одного из лигандов в комплексе аммонигенина и Си2*.

ВЫВОДЫ

1. Скрининг 12 видов микроорганизмов на соединения переходящие в состояние долгонивуг?эго свободного радикала показал, что эти вещества обнаруживаются в группе нокардиоподобных бактерий.

2. Методом изотопного замещения показано наличие азота в парамагнитном центре радикалобразующего соединения из Вт. агдаогиа^епев (аммонигенин), спектр ЭПР которого описывается следующими константами СТС: 4(Н*4)=14,9 Гс; л(СН2)«=12.4 Гс; а(сн)=4,5;ДН=58,7.

3. Аммонигенин представляет собой производное глутакиновой кислоты, наиболее вероятной структурой которого является лактон" Н-

-идрокси-л-(2-карбомоил)-глютаиил-4-анино-2-гидроксибутирамида.

Молекулярная масса вещества равна 334 к Да.

4. Установлено, что накопление аммонигенина происходит на стадии активного роста бактериальной культуры и зависит от состава

г среды. Удельвое содержание аиионигекина резко увеличивается при при усилении аэрации и при повышении рН среды культивирования.

5. В модельных системах показано,, что аммонигенин окисляется су-пероксиднын я гидроксильным радикалами. При окислении вещества ОН' и фцК идентифицированы долгоживущие радикальные аддукты и нитроны.

6,- Установлено, что в присутствии 'редокс-медиаторов - фаназиккета-сульфата и K9[Fe(CN)ö] аммонигенин переходит в радикальную фор-ну in vivo и далее превращается в непарамагнитные продукты.

7. В модельных системах показана возможность образования комплексов исследуемого вещества и ионов переходных металлов (Fe, Cu), а также более сложных комплексов с участием полифосфатов. На существование подобных комплексов in vivo указывает , то что в определенных условиях большая часть аммонигенина связывается с клеточными компонентами.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ .

1. Островский Д.Н., Бинюсов В.И., Степанов С.И., Харатьян Е.Ф., Шуиаев К.Б.., Пашков A.C. В бактериях обнаружены производные гяу-таииновой кислоты и трегалозы, переходящие при потере электрона в состояние долгоживущих свободных радикалов.- ДАН СССР, 1990.,

Т.зю. кг. C.4Í3-4S6.

2. Бинюков В.И., Баздырева Н1. М. , Танцырев Г. Д. , Харатьян Е.Ф., Шашков A.C., Шунаев К.Б., Островский Д.Н. Характеристика выделенных из бравибактерий производных глутаииновой кислоты, переходящих при потере электрона в состояние долгоживугих свободных радикалов. - Биоорганическая химия, 1990, т. 16, N В, с. 1030-1087.

3. Степанов С.И., Бикюков .В. И., Таптьвсова С.Д.. Харатьян Е.6., •Кунаев К.Б., Островский Д.И. Взаимопревращения Н-, а-, и н-форк

лк: одектозы нового трисахарилз из мккрокока, способного образовывать долгожие;->.здй нктрсхсильньц') - Биэ?..::...-. 1991, т. 56, вьл. 5, с. 35C-t;¿¿.

4. Шунаев К. Б., < еаиЬков Е. И. , Игсатав В.В., ГЬнасеяко В. tí., Степангг С.И., Харатьян F..C. , 0<;трс.г.с.ий Д.Н. Выявление з клетках 5актер«и радикальна ¿ори аммон;;г>- и ллзодектозц в poj;;; компонентов новой редо^с-сч'-тгрмы. - Биокинпя , 1992 , т 57, ч:-,. 2 , с. 246-£52.

5. Stepanov S.I., Biniukov V.I., Kharatian E.F., Shumaev K.B., Ostrovsky D.N. Interconver3ion of radical and nitrone forms of lysodectose - a new trisacharide from Micrococcus lysodecticus. -

- BioFactors, 1991, v.3, N 1, p. 37-39.

6. Островский Д. H. , Сибельдина JI. А., Шипанова И.Н. , Степанов С. И., Харатьян Е.Ф., Шумаев К. б. Окислительный стресс вызывает у бактерий накопление дигликозклпирс^осфата.- ДАК СССР, 1991, т.320, Ы 2, с. 477-480.

7. Степанов С. И., Харатьян Е.Ф..Островский Д. Н. Степанова Н. В. . Бинюков В.И., Шунаев К.Б. 0 функциональной взаиносвязи трех форн лизодектозы в Micrococcus lysodeieiicvts. - Микробиология , 1992 , т. 61,вып. 3, с.369-376.

8. Островский Д.Н. , Оргель 0. Д. . Б.чн:о.<ов З.И., Таптьжова С. Д., Харатьян Е.Ф., ¡Пашков А.С.. Иунгсв К.Б. , Шипанова И.Н. - ДАН СССР, 1 992, т.325., N5, с. 1071-1076.

9. C.-.trovsky D. , Biniukov V. , Kharatian Е. , Sftachkov A., Stepp.-r.ov S., Shumasv K. Nov»l natural nitroxyle free radicals are isolated fr^m bacteria and indentified аз derivatives of carbohydrate and ami-io^cides t / 17 th IUPAC International symposium on the chemistry of natural products. New Delhi, 1990, P. 145.

10. Ostrovsky D., Biniu>ov v., Kharatian E., Stepanov S., Shash-kov A.,Shumaev K. Hydroxylamino, nitroxyl fre radicals and nitrone forms of a new trisacharide lysodectoae are possible members of a novel redox system in bacteria // Symposium on advantages in regulation of carbohydrate metabolism" Jerusalem, 1991, P. 56.