Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование процесса связывания и выведения кальция одиночными изолированными нейронами виноградной улитки

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование процесса связывания и выведения кальция одиночными изолированными нейронами виноградной улитки"

АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ РГ& 1]^ТИТУТ ФІЗИОЛОШ імені О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

2 1 МАР На правах рукопису

СНИ ЦАРІ В Владислав Анатолійович

ДОСЛІДЖЕННЯ ПРОЦЕСУ ЗВ'ЯЗУВАННЯ ТА ВИВЕДЕННЯ

КАЛЬЦІЮ

ПООДИНОКИМИ ІЗОЛЬОВАНИМИ НЕЙРОНАМИ ВИНОГРАДНОГО РАВЛИКА

Спеціальність: 03.00.02 - Біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Науковий керівник -академік П.Г.Костюк

Київ - J 993

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця АН України.

Наукові керівники: академік АН України П. Г. Костюк . к. б. н. Тепікін А. В.

Офіційні опоненти: ¿у? ¿С/ґ.

-----------.--------¿7^------;------—-----¿У' (/ --------- ----

Офіційний захист дисертації відбудеться 1994 р. о

/(¿¿’с? на засідаіШі СПЄдіаліз0ВаНої вченої ради Д-01.13.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця АН України за адресою м. Київ, вул. Богомольця, 4. •

Автореферат розісланий '2^'р.

З дисертацією можна познайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця АН України.

Вчений секретар .

спеціалізованої ради ■

доктор біологічних наук 3. О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальність проблеми. Цитоплазматична концентрація іонів кальцію ([Са2+]і) є, мабуть, найбільш універсальним показником активності для всіх типів клітин та має фундаментальне значення у багатьох аспектах клітинної сігналізації, наприклад, 1) формуванні потенціалу дії, 2) секреції, 3) скорочуванні м'язів, 4) активації ферментів, 5) підтримуванні просторових структур макромолекул. • Залежність внутрішньоклітинних процесів від [Са?+]і потр’ебує суворої .регуляції як стаціонарних концентрацій, так і потоків іонів кальцію у цитоплазмі та через плазматичну мембрану. Підтримування [Са2+]і на належному рівні здійснюється за допомогою кількох кальцій-регулюючих систем, які знаходяться у середині клітини або вбудовани у її поверхневу мембрану. У стані спокою ці системи підтримують [Са2+]і на дуже низькому рівні (10_8-Ю‘7М), а у період активації (наприклад, при виниканні потенціалу дії чи секреції) здійснюють транзієнтне збільшення концентрації цих іонов до кількох мікромолей. Припинення періоду активності супроводжується повертанням [Са2+]і до базального рівня та транспортуванням Са2'+ проти сильного електрохімічного градієнту з цитоплазми до зовнішньоклітинної середи.

Відомо багато механизмів, які регулюють [Са2+]і. Серед них найбільш загальними є: 1) . Са2-Ь-М§2+-залсжні АТРази - білки, які переносять Са2+ проти електрохімічного градієнту за рахунок гідролізу АТР, 2) №+/Са2+ обмінник, який переносить Са2+ проти градієнту завдяки електрохімічному градієнту N3+, • 3) низькомолекулярні органічні та неорганічні негативно заряджені у водному розчині сполуки, які знаходяться у клітині у' великих концентраціях: фосфат, цітрат, нуклеотіди, 4) кальцій-зв'язуючі'білки, наприклад, кальмодулін, кальсеквестрін, кальретикулін. Однак, процес виведення кальцію з клітини та динаміка його змін залишаються ще недостатньо вивченими. Ці питання стали предметом цього дослідження.

Мета роботи. Мета даної роботи полягала у дослідженні процесу та механизмів підтримання фіксованого рівня концентрації іонів кальцію та виведення іонов кальцію у зовнішньоклітинний розчин у нейронах виноградного равлика.

Головні задачі. 1. Визначити швидкість виведення іонів кальцію у зовнішньоклітинний розчин в поодинокому ізольованому нейроні: 2. Оцінити буферну ємність цитоплазми нейрона для кальцію.

Наукова новизна. 1. Разроблені два оригінальних методи дослідження поодиноких ізольованих клітин (методи краплини та фіксації кальцію). 2. Оптичними методами поміряна швидкість, виведення кальцію з нейронів у зовнішньоклітинний розчин при різних фізіологічних концентраціях [Са2+]і. 3. Методом фіксації кальцію визначена величина кальцієвого буферу цитоплазми нейрона.

Практична цінність даної роботи полягає у створенні нових інструментальних засобів вивчення нервової клітини та отриманні даних про обмін у ній іонів кальцію.

Апробація роботи. Основні положення роботи були викладені у доповіді на семінарі Інституту фізіологі ім. О. О. Богомольця АН України (1993 p.), засіданні Вченої ради Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця АН України (1993).

■ Об’єм та структура дисертації. Дисертація складається з введення, літературного огляду, описання методів та експериментальної частини, обговорення, 7 висновків та списку літератури з 132 найменувань. Робота викладена на 130 сторінках друкованого тексту та ілюстрована 19 малюнками.

За матеріалами дисертації опубліковано 4 роботи.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ.

Дослідження проводилися на неідентифікованих ізольованих нейронах Helix pomatia. Ізольовані" нейрони отримували за методом, який істотньо не відрізнявся від традиційно застосованого у нашій лабараторії [Тепикин та др., 1987]. Розчини, використані у роботі, готувалися на основі розчина слідуючого складу (піМ): NaCl - 100, KCl - 5, MgCl2 - 5, СаС12 - 10, Tpic-HCl - 20 (pH 7.4).

Принципові моменти методу вимірювання Са2+, що перетинають плазматичну мембрану, були слідуючими.

Ізольовані клітини перед початком експерименту переносили з розчину Рінгера у розчин зі зниженою концентрацією кальцію (тМ): СаС12 - 1, NaCl - 100, КСі - 5, MgCl2 - 1, трісНСІ - 35 [Тепикин та др., 1991; Tepikin et al., 1991]. Потім тонкою пластиковою пипеткою з отвором діаметром 200 mm клітину відбирали з чашки та переносили на покровне гідрофобізоване скло. Краплину розчину з клітиною об'ємом 1-2 ml покривали нефлуоресцуючим маслом. Після цього спеціальною тонкою мікропипеткою з отвором діаметром 50mm вводили розчин з абсорбціоним кальцієвим зондом Антіпірілазо Ш (АРШ) у концентрації 6 тМ (100 тМ NaCl, 5 тМ KCl, 1 тМ MgCl2,

35 шМ трісНСІ-буфер). Процедуру повторювали 3-4 рази; загальна кількість введеного розчину з АРІІІ було 10 ці. Потім, використовуючи набір пластикові« пипеток з діаметрами отворів 50, 20, 10. цт, формували каплі радіусом 120 - 140 рт з формою иолусферн об’ємом 4-7 пі, у центрі якої знаходилася клітина. Відношення об'ємів мікрокамера/клітина доводилося до 10/1.

Схема реєстрації флуоресценції зображена на мал. 1. Розділення потоків збуджуючого світла та флуоресценції досягалося за допомогою діхроїчного дзеркала 5А. Світло, яке пройшло крізь фільтр для

• збудження флуоресценції 2В, 2С, відхилялося діхроїчним дзеркалом та за допомогою високоапертурного об’єктива 4 фокусувалось на об'єкт 3; світло флуоресценції від об'єкта збиралося тимож об'єктивом, проходило крізь фільтри для виділення сігналу флуоресценції 2F та подавалося на фотопомножувач 9. У роботі використався об’єктив -планохромат х40 з числовою апертурою 0.95. Для візуального контролю препарата протягом експерімента використовували сферичне дзеркало 6 з діафрагмою (діаметр 1.5mm), яке розташовувалося у площині дійсного зображення мікроскопа. Для збудження флуоресценції використовували інтерференційні світофільтри 2В, 2С, а для виділенія сігнала флуоресценції зонда - интерференційний фільтр 2F. Джерелом світла була ксенонова лампа 1В. Інтенсивність флуоресценції міряли за допомогою діхроїчного дзеркала 5В то фото помножувача 9. Джерелом світла для дослідження змін абсорбції (1А) була лампа накалювання; для освітлення клітини використали червоний світофільтр (2А), реєстрацію абсорбції АРІІІ робили на хвилях 710nm та 780nm (використали інтерференційні світофільтри 2D, 2Е) за допомогою розщіпителя 7 та фотодіодів 8. .

Для визначення концентрації іонів- кальцію у цитоплазмі нейронів використався флуоресцентний зонд Fura-2 [Grinkiewich et al., 1985; Lipscombe et al., 1988].

Зміни концентрації [Cajo у зовнішньоклітинному розчині. визивали зміни концентрацій вільної та зв'язаної кальцієм форм АРІІІ, які мають різні поглинання світла на різних довжинах хвиль - 710 та 780пш.

Принципова схема для метода фіксації концентрації іонів кальцію у клітині, що ми запровадили, зображена на мал. 2. У нейрон . С, завантажений флуоресцентним зондом Fura-2 (для вимірювання внутриклітинної концентрації вільних іонів кальцію), вводилися один

двостовбурішй мікроелектрод (МІ) та один одностовбурний (М2). Лівий lía малюнку стовбур мікроелектроду МІ використався для керуємої компаратором А2 іонофоретичної ін'єкції іонів кальцію у цитоплазму клітини. Правий на малюнку стовбур мікроелектрода МІ (заповнений 2.5М КС1) служив індиферентним у схемі ін'єкції іонів кальцію та для пропускання струму крізь мембрану клітини у двуелектродній схемі. фіксації потенціалу; для вимірювання трансмембраного потенціалу використався мікроелектрод М2 (2.5М КС1). Фотопомкожувач РМ реєстрував флуоресценцію зонду Futa-2, фотострум перетворювався І-V конвертером (AI) у сігнал флуоресценції та реєструвался у терміналі 1. Цей сигнал порівнювався

з командним (термінал 2) за допомогою мікросхеми

Мал. 1. Оптична схема установки (опис v тексті).

A2, яка керувала струмом ін'єкції кальцію за допомогою оптоізолятора Oil. Операційні підсилювачі АЗ, А4 та оптоізолятор 012 використовувалися для вимірювання струму іонофоретичної ін'єкції.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ. .

Внутрішньоклітинна концентрація іонів кальцію зростала під час ін'єкції Са2+ та відразу після її закінчення починала релаксувати до початкового рівня. Зовнішньоклітинна концентрація кальцію [Cajo починала збільшуватися протягом ін'єкції та досягала стабільного рівня протягом кількох хвилин після її закінчення. При збільшенні [Са2+]і на 0.2-0.5дМ, що відповідає змінам [Са2+]і при фізіологічних реакціях нейронів [Kostyuk et al., 1989; Connor et al., 1986], швидкість виведення іонів кальцію складала 0.3-2.5pM/s (мал. 3).

50М 2nF

Мал. 2. Принципова схема установки лля дослідження за допомогою метода (Ьіксппії концентрації іонів кальцію у клітині. Опис у тексті.

Швидкість витіснення іонів кальцію з цитозолю була обчислена як похідна змін зовнішньоклітинної концентрації кальцію помножена на відношення об'ема каплі до об'єму клітини:

. У==(с1[Са]о/£Н)*(Ус1/Ус).

Залежність швидкості витіснення іонів кальцію від часу була

fCe¿+3|n. ііН в. 54 •

Д i/t.x

v.cM/. І С

Мал. 3. -Ін'єкція кальцію v нейрон. А. Концентрація вільного кальцію у цитоплазмі [Са2+)і. виміряна за Флуоресценціею зонду Fura-

2. В. Зміни зовнішньоклітинної концентрації кальцію (Calo, виміряні за зміною абсорбції барвника Antipvrvlazo ІП. АГ/і означає відносні зміни абсорбкіонного сігналу на довжині хвилі 710 nm. С. Швидкість виведення іонів кальцію, розрахована як похідна кривої В. D. Трансмембранний струм. Подвійний відрізок означає час ін’єкції кальцію. Об'єм нейрону був 0.5 пі. об'єм зовнішньоклітинного розчину - 5 пі. струм Ін'єкції - 15 пА. мембранний потенціал підтримувався на рівні -50mV.

аналогічна залежності від часу внутрішньоклітинного рівня вільних іонів кальцію.

Більша частина іонів кальцію, що були введені іонофоретично у сому нейрона, зв'язувалася у середині клітини, і тільки незначна частина (кілька процентів) виводилася у зовнішньоклітииний розчин. В експерименті, представленому на мал. З, у зовнішньоклітииний розчин було виведено 14% ін'єкованого кальцію. Під час першої ін'єкції доля виведеного Са2+ була мінімальною, та далі збільшувалася під час наступних ін'єкцій у той же самий нейрон.

Під час тривалого збільшення рівня вільного кальцію у нейроні за допомогою іонофоретичної ін'єкції швидкість виведення кальцію стабілізувалась і не змінювалась суттєво (Мал. 4). Стабілізована

Мал. 4. Тривале підтримування стабільного збільшеного рівня внутрішньоклітинного кальцію [Са2+1і у клітині шляхом регулювання струму ін'скпії. Середній струм ін'єкції складав ЮпА: трансмембранний потенціал Фіксувався на рівні -50піУ. АГ/І означає відносні зміни абсорбційного сігналу на довжині хвилі 710 nm. Подвійний відрізок означає час ін'єкції кальцію.

tCa2*lir>, М*

Д І/І ,Х

50s

швидкість виведення кальцію у цьому випадку була біля 0.7цМ/8. У цій же клітині підтримання внутрішньоклітинної концентрації кальцію на більш високому рівні (0.76|.іМ) приводило до більшої швидкості, виведення (1.9|лМ/в). Аналогічні швидкісті виведення (0.3-4.6|лМ/б) були отримані на інших клітинах, де зміни концентрації вільного кальцію були у фізіологічних межах (0.2-0.5дМ).

Якщо зовнішньоклітинний рівень вільного кальцію підтримувався на постійному рівні за допомогою іонофоретичної ін'єкції, швидкість виведення кальцію залишалася стабільною протягом всього періоду ін'єкції. Ця швидкість прямо корелювала зі збільшенням [Са2+]і у межах між 0.1-0.5рМ.

Добре відомим активатором кальцієвого звільнення з внутрішньоклітинних депо являється кофеін [Раїасіє еі аі., 1987; КоБіуик еї аі., 1989]. Доданий у зовнішньоклітинний розчин у концентрації 5тМ, кофеін сам не викликає спонтанного звільненняя іонів кальцію. Однак, якщо одночасно проводити ін'єкцію кальцію у клітину, то виникає викликаний кофеіном кальцієвий транзієнт, часто після закінчення ін'єкції. Оскільки концентрація Са2+ у зовнішньоклітинному середовищі була на дуже низькому рівні, такі транзієнти могли виникати тільки завдяки звільненню іонів кальцію з внутрішньоклітинних пулів. Паралельно з таким транзієнтом виникало швидке збільшення виведення кальцію з цитозолю. Після повернення до базального рівня, зовнішньоклітинний кальцій стабілізувався на підвищеному рівні порівняно з його рівнем до ін'єкції. Ці даннІ показують, іцо Са-залежне кофеін-індуковане звільнення кальцію з внутрішньоклітинних пулів викликає підсилення витиснення кальцію з нейрону у зовнішньоклітинний простір, та що швидкість такого виведення може бути дуже висока - до 5рМ/з. Протягом періоду кофеін'індукованного звільнення нейрон може втрачати значну ■ кількість (50-100рМ, п=5) запасенного кальцію.

• Фіксація кальцію.

Типовим приклад фіксації [Са2+]і зображено на лівій частині мал.

5. На ілюстрації летко розрізнити дві компоненти струму ін'єкції: великий за амплітудою транзієнт (виникаючий протягом збільшення [Са2+)і від попереднього фіксованого (або базального) рівня до нового рівня фіксації, та незначний постійний струм ін'єкції {необхідний для підтримання бажаного рівня [Са2+]і). Більша частина іонів кальцію, яка потрапляє у цитоплазму нейрона під час транзієнту струму ін'єкції,

виникаючого при фіксації [Са2+]і від меньшого її значення до більшого, очевидно, зв'язується внутрішньоклітинними буферними системами. Тому площа під цим транзієнтом, вираження як кількість двухвалентних катіонів поділенна на об'єм нейрона (С,рМ), попитій характеризувати величину цього буфера. Проведенні вимірювання показали, що величина С корелює з різнпцен меж рівнями, на якому підтримувалася [Са2+]і до та після

В

Ін.пА - 11.8

linj.nA

Ія.пА 11» linj.ni

s.;

Ач,

,Л

f"

488

Мал. 5. Фіксація кальнію у двух нейронах (А. В). Перша Фіксація на діаграмі А показує приклад переколивань. які є загальною особливістю процесу фікспиії піл час спроби поліпшення часового діапазону. На другій фіксації на діаграмі А стрілка вказує на перехід до фіксації до меньшого рівня. Зникнення струму ін'єкції кальцію Ііпі за час переходу пояснюється тим, шо клітині доводиться тільки витискати збитковий кальцій з цитоплазматичного буферу і v додатковій ін’єкції кальцію у цитоплазму нема необхідності. В. Фіксація кальцію на чотирьох послідовно збільшуючихся рівнях. Моменти початку фіксації кальцію співпадають з переднім Фронтом відповідних транзієнтів струму Фіксації. Трансмембранний потенціал, шо підтримується. -60mV.

початку фіксації на новому рівні. Проведена з урахуванням числа переносу для мікроелектрода числова оцінка показує, що величина даної цитоплазматичної кальцієвої ємності при зміні [Са2+]і на ЮОпМ в районі базального рівня складає 36±20дМ, (п=7) (мал. 6).

Після закінчення транзієнтного періоду струм ін'єкції Іііу стабілізувався на низькому рівні. Для зміни [Са2+]і на ЮОпМ цей струм складав тільки 50±9рА (п=7), що відповідає ін'єкції

0.39±0.2дМ/5 іонів Са2+. Величина Ііту не залежала від того, чи було нове значення [Са2+]і досягнено з більшого чи меньшого рівня.

У більшості досліджених клітин під час здіірення залежності стаціонарного значення струму фіксації від різниці між рівнем на якому фіксувалась концентрація кальцію та базальним рівнем, спостерігалась виразна кореляція між ними. Різниця значень чисел переносу для різних мікроелектродів не дозволяють статистично узагальнити результати, одержані для окремих нейронів, а тривалість експериментів по реєстрації одного стаціонарного значення Ііпі-[Са2+]і (десятки секунд) не дозволяє одержати досить багато данних для однієї клітини. Але для ряду клітин це одержати вдалось. Типова залежність отримана за даними малюнка 5 та іншим данним для різних нейронів, зображена на мал. 6В (Ін'єкційний струм 39+6рА був необхідний для зміни [Са2+]і на 100 пМ, п=6).

Одним з застосувань данного метода може бути пряме вимірювання змін кальцієвих потоків перетинаючих плазматичну мембрану клітини. Деполярізація клітини від потенціалу -60 тУ до -15 тУ приводила до суттєвого збільшення [Са2+]і у випадку відсутності фіксації і одночасно не супроводжувалась змінами цього рівня у випадку фіксації. Зменьшення Іігу у момент початку дегіолярізуючого зміщення відповідало збільшенню входу Са2+ крізь канали плазматичної мембрани. Проведені з урахуванням числа переносу оцінки показують, що під час перших секунд деполярізуючого зміщення від -60 до -15 тУ виникав струм 68±15 пА і у клітину входило 0.59±0.31(іМ Са2+.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ.

Метод каплі та швидкість виведення кальцію.

Швидкість виведення іонів кальцію при фізіологічно допустимих збільшеннях [Са2+]і в наших експеріментах дорівнювала приблизно 1 дМД. Стабільна швидкість виведення кальцію відповідає швидкості виведення кальцію, підрахованої для нейронів виноградного равлика

непрямим засобом [Hermann et al., 1982]. Пряме порівняння внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію та потока Са2+ крізь мембрану показали, що при фізіологічних змінах [Са2+]і 0.1-0.5 цМ швидкість виведення кальцію у нейронах равлика залежить від [Са2+]і. Аналогічні данні про швидкості виведення Са2+, отримані на ненейроних препаратах (панкреатичних ацінарних клітинах миші [Tepikin et al., 1992]). З цього можливо зробити висновок, що ця залежність, скоріш всього, є універсальним для більшості типів клітин.

60

10

а

з, « о

»0

Мал.6. А. Залежність плоті під кривою транзієнта струма ін’єкції (С) віл величини зміни концентрації кальцію (А[Са2+1Г-П: Результати одержані для типового нейрона при Фіксації рівня кальцію віл одного стаціонарного значення до другого. Величина змін АГСа2+ІГ-і визначалася як різниіія між концентрацією кальцію у нейроні - ГСа2+1і після та до початку Фіксації ло наступного значення. В. Залежність стаціонарного рівня стоума Фіксації кальцію (Ііпі) від величини зміни концентрації кальцію відносно базального рівня (А[Са2+1Г-Ь). Величина стаціонарного 'рівня ііпі визначалася як середне значення струма ін’єкції за час між закінченням транзієнта. який приводить до динного значенні»! концентрації кальцію, та початком слідуючого транзієнта. Величина А[Са2+1Г-Ь визначалося як різність концентрацій калшію меж рівнем Фіксації та базальним рівнем.

л и

* ■ 360 . •

. ■

4J* »“ . .. •

a,

• • •"> • * * *

, f ’• J3 ■ •

• 1 • • ".

• • • • 4

. • « л

■ " Є0

9 0

0 ПО 100 ІЛО . 700 760 0 1(70 700 900 *00

A!Cu2Vi.»m Д[Саг,],_и.пМ

Кофеін-індуковане звільнення кальиію.

Новий метод також дає можливість простежити зміни цитоплазматичної концентрації іонів кальцію, звільнених з внутрішньоклітинних пулів протягом комбінованої дії кофеіна та ін'єкусмого кальцію. У цьому випадку низька концентрація кальцію у зовнішньому розчині є перевагою, тому що внутрішньоклітинні пули є практично сипними джерелами збільшення рівня внутрішньоклітинної концентрації Са2+. Протягом кофеін-індукованого кальцій-залежного звільнення Са клітина втрачала значну кількість Са2+ - до 100 цМ, очевидно, завдяки помітному збільшенню швидкості виведення його з клітини (до 5 цМ/б).

Деякими авторами було показано, що під дією кофеіна можуть починатися періодичні коливання [Са2+]і у нервових клітинах [ЬірБсотЬе сі аі., 1988; К^уик еі аі., 1989]. Тепер стало можливим оцінити кількість кальцію, яка повинна входити у нейрон для того, щоб підтримати такі коливання. їх період у нейронах виноградного равлика був коло 100 б [КоБіуіік й аі., 1989]. Як показано вище, нейрон втрачав від 50 до 100 цМ Са2+ протягом одного кофеін-індукованого Са-залежного звільнення Са2+, яке може бути розглянено як один період таких коливань. Розділивши кількість виведеного за один період кальцію на довжину цього періоду, ми можемо отримати середню швидкість входу Са2+. Таким чином, вхід кальцію з швидкістю 0.5-1 цМ/в необхіден для того, щоб підтримати стабільність такої осциляторної поведінки.

Метод Фіксації кальцію. .

Представлена робота є також першою спробою використати широко відому методологію фіксації до процесів, зв'язаних з регулюванням концентрації вільного кальцію у цитозолі окремих клітин. Основна ідея полягає у тому, щоб за допомогою двох противодіючих систем, одна з яких - іонофоретична ін'єкція -збільшує [Са2+]і, шляхом ін'єкції Са2+ у цитоплазму, а друга -кальційрегулюючі системи нейрона - протидіє її збільшенню, зафіксувати концентрацію вільних іонів кальцію [Са2+]і на бажаємому рівні. У цьому випадку струм ін'єкції буде точно відображати роботу систем, які виводять Са2+ з цитозолю. Крім можливості вивчення роботи внутрішньоклітинних кальційрегулюючих механизмів, створення такого методу відкриває широке поле для дослідження

різних внутрішньоклітинних процесів, що залежать від [Са2+]і, в умовах фіксації її рівня у цитоплазмі окремої нативної клітини.

Плато струма Фіксації.

Після завершення перехідних процесів та стабілізації концентрації кальцію на заданому рівні, ін'єкціонний струм, необхідний для підтримання цього стану, був дуже малий по зрівнянню з тим, який звичайно використовується для мікроелектродної ін'єкції Са2+ [Hermann et al., 1982; Gorman et al., 1980]. При зміні концентрації [Ca2+]i на 100 nM порівняно з базальною, необхідний для цього струм іонів кальцію складав 50±9 рА, що відповідає входячему потоку іонів кальцію не більш 0.4 цМ/s.

Кількість іонів кальцію, ін' скованих за час початкового транзієнта, становила (при зміні [Са2+]і на ЮОпМ) 36±20 цМ що значно перевищує його кількість, необхідну для простого заповнення цитозоля. Таким чином, мабуть, ми маємо справу з вмиканням швидкого цитоплазматичного кальцієвого буферу [Meldolesi et al., 1988], буферная ємність якого приблизно відповідає приведеному вище значенню. По оцінкам, приведеним у роботі Zhou and Neher (1993), цей буфер можє складатись з розчинимих мобільних кальцій-зв'язуючих білків масою 7-20 kDa, та його ємність дорівнює 40 (відношення зв'язаного кальцію до вільного). В їх термінах наша буферна- ємність дорівнює 360. Таку різницю можливо пояснити тим, що ці автори завантажували цитоплазму великими (більш, ніж 1 цМ) концентраціями кальцію, і тому кальцієвий буфер знаходився ближче до насичення, ніж у наших експериментах (де концентрація [Са2+]і не перевищувала фізіологічних значень).

Деполярізація за час Фіксації кальцію.

Оцінки показують, що протягом перших секунд тривалої деполярізації мембрани до рівня -15 mV до нейрону потрапляє 0.23±12 цМ/s Са2-Ь. При продовженні деполярізації входячий струм іонів кальцію поступово зменьшується, причому у різних клітинах з різною швидкістью. В крайніх випадках маємо або практично повне зникнення його на протязі 30-40 секунд, або збереження його значення на протязі понад 100 секунд після початку деполярізації. Мабуть, це зв'язано з тим, що різні нейрони мають різні швидкості інактивації кальцієвих входячих струмів при тривалих деполярізаціях, що відображає їх різну функціональну приналежність.

У фізіологічному діапазоні змін [Са2+]і кількість Са2+, який потрапляє до нейрону крізь плазматичну мембрану при деполярізації мембрани та активації кальцієвих потенціал-керуємих каналів, достатньо добре відповідає його кількості, що усувається з цитозоля, * таким чином продуктивність роботи, звільняючих та усуваючих кальцій систем приблизно однакова, що дає можливість підтримувати ефективний кальцієвий баланс.

ВИСНОВКИ

1. Одночасні оптичні вимірювання зовнішньоклітинної концентрації кальцію за абсорбційним зондом Апгіругуїаго III та внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію за флуоресцентним зондом Риіа-2 у поодинокого ізольованого нейрона виноградного равлика в умовах іонофоретичної ін'єкції цих іонів крізь мікроедектрод показали, що швидкість виведення кальцію з клітини прямо корелює з цитоплазматичною концентрацією іонів кальцію в області змін [Са2+]і, перевищуючих базальну концентрацію. При збільшенні [Са2+]і за допомогою іонофореза на 0.2 0.5 рМ, швидкість виведення кальцію з нейрона складала 0.3-4.6 рМ/э.

2. На протязі кофеін-індукованого кальцій-залежного кальцієвого викиду з внутрішньоклітинних депо спостерігається підсилення виведення кальцію з клітини, швидкість якого досягає 5 цМ/б.

3. Використовуючи зворотній зв'язок між сигналом флуоресценції

зонда Рига-2 та струмом іонофоретичної ін'єкції кальцію у цитоплазму крізь мікроелектрод, здійснена фіксація рівня внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію. При цьому величина струма ін'єкції характеризує величину та кінетику роботи систем, які виводять Са2+ з цитозолю. Показано, що перехід до нового більш високого рівня [Са2+]і супроводжується короткочасним збільшенням

кальційін' єкуючого струму. Щоб збільшити [Са2+]і на 0.1 рМ, необхідно ін'єкувати за цей період 36±20 рМ кальцію. Зроблений висновок, що цей транзієнт необхіден для заповнення швидкого цитоплазматичного кальцієвого буферу, який повинен бути насиченим для досягнення нового більш високого рівня [Са2+]і.

4. За допомогою цього ж методу зміряна продуктивність роботи кальцій-регулюючих систем, які виводять кальцій з цитоплазми. Після короткочасного збільшення кальцій-ін'єкуючого струму та до закінчення фіксації його сила підтримується на постійному рівні, який є дуже малим за величиною (0.39±0.2 цМД для підтримання [Са2+]і

зміненим на 0.1 jrM). Ця величина характеризує роботу систем, які виводять кальцій та відповідає аналогічній кількості іонів кальцію, що витискуються з цитоплазми до зовнішньоклітинного розчину.

5. Прямо зміряна швидкість потрапляння іонів кальцію у клітину протягом деполярізуючих зміщень мембраного потенціалу. Швидкість потрапляння кальцію у клітину протягом перших секунд деполярізації до -15 mV була 0.59+0.31 (іM/s, що для клітини діаметром ІООщії дорівнює трансмембранному струму 400 рА.

6. Не знайдена активація Са-залежних калієвих каналів при збільшенні [Са2+]і, у кілька разів перевищуюча базальний рівень, що означає, що для активації цих каналів необхідне більш істотне збільшення концентрації іонів кальцію у безпосередній близкості від міста розташування цих каналів.

7. Запропонована інтегральна схема механнзмів, які ефективно підтримують гомеостаз іонів кальцію у цитозолі нервової клітини та регулюють амплітуду та тривалість внутрішньоклітинних кальцієвих сігналів при її активації.

Перелік робіт, які опубліковані за тематикою дисертаці:

1. Тепикин А.В., Сницарев В.А., Белан П.В. Використанние барвника

Антіпірілазо III для изученія висновока Са2+ з ізольованого нейрона моллюска Helix pomatia // Биолошческие мембрани. - 1991. - 8, N5, -С. 514-521. ' • .

2. Tepikin A.V., Kostyuk P.G., Snitsarev V.A., Belan P.V. Extrusion of calcium from a single isolated neuron of the snail Helix pomatia // J.Membrane Biol. 123, 43-47 (1991).

3. Belan P., Kostyuk P., Snitsarev V. and Tepikin A. Calcium clamp in isolated, neurones of the snail Helix pomatia. Journal of Physiology (1993), 462, pp. 47-58.

4. Belan P. V., Kostyuk P. G., Snitsarev V. A. and Tepikin A. V. Calcium

clamp in single nerve cells. Cell Calcium (1993) 14, 419-425. .

17 .

Заказ_/^_Тіф. _£^_зкз. 199 .Укрспецмонтажпроект